JP4945779B2 - 方法 - Google Patents

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Description

【0001】
発明の属する技術分野
本発明は、核酸を用いる型別(typing)の方法、特に遺伝子型別の改善された方法に関する。
【0002】
発明の背景
型別(例えば、遺伝子型別)は、医学的な診断、予後、及び治療において特に有益であろう。例えば、感染症の原因である病原菌の特定により、投薬による正確な治療ができる。病原菌は、今や、型別により(例えば、特定の病原菌を特徴づける遺伝子の署名パターンを特定することにより)、容易に特定され得ることが明らかとなっている。遺伝子又は個体の核酸配列における1以上の可変領域を型別することにより、特定の病気、状態、又は症候群になりやすい傾向の指標(marker)を明らかにでき、それらに対する最善の治療法も指摘できる。型別法は、また、遺伝子分析(例えば、多型又は対立遺伝子変異の型別において)、組織の型別、又は、環境監視及び汚染試験などにおいて有用である。
【0003】
細菌種又はウイルス種の検出のために、あるいはDNA配列における突然変異又は多型のために慣用されている分析法には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法の使用が含まれる。この方法は、特定のターゲットDNA配列の選択的な増幅ができるよう設計され、それは用いられる増幅プライマーの性質により決められる。そのような選択的増幅ができるためには、DNA配列についてのある予備的な知識が要求され、それによりアンプリマー(amplimer)として知られる、2つのオリゴヌクレオチドプライマー配列の構築が可能になる。1のアンプリマーは、ターゲットDNAの1のストランドの5’末端において又はその近辺でハイブリダイズし、その他のアンプリマーは、第2のストランドの5’末端において又はその近辺でハイブリダイズする。DNAポリメラーゼ及びDNA前駆体(すなわち、dATP、dCTP、dGTP、及びdTTP)の存在下において、プライマーは、ターゲットDNAセグメントの個々のストランドに相補的な新しいDNA鎖の合成を開始できる。熱安定性ポリメラーゼに使用により、容易に繰り返され又は循環される手順が可能となる。新たに合成されたDNA鎖は、その後のサイクルにおけるさらなるDNA合成のための鋳型として機能する。反応混合物は、ポリメラーゼにより形成された2本鎖DNAを分離させるために、約90℃の温度にされる。反応温度は、1本鎖DNAがプライマーにアニールできるように、約50℃乃至70℃まで下げられ、そしてDNA合成が再度行われる。合成されたDNAは、2つのプライマーの間で伸長する。好ましくは、用いられるDNAポリメラーゼは好熱性、すなわちTaqポリメラーゼである。30サイクルのDNA合成の後には、PCRの生成物は特定のターゲット配列の約10個のコピーを含むであろう。典型的なPCR反応サイクルは、それゆえ、プライマー伸長による別個のストランドの合成、ストランドの分離、プライマーのアニール、新たなストランドの合成、である。
【0004】
連鎖反応は、それゆえ、温度を上昇及び下降させることによってのみ持続させることができる。
【0005】
型別(例えば、遺伝子型別)は、PCRに基づく技術を用いて、例えば対立遺伝子特異的プライマー(Okamotoら、Journal of General Virology、73巻、673−679頁、1992年;A.Widellら、Journal of medical Virology、44巻、272−279頁、1994年)を用いて実施される。
【0006】
現在のところ、複合型PCRが、核酸配列における変異の所定のパネルについての核酸試料の選抜に用いられ得る。この方法は、ゲル電気泳動の使用が必須なので、日常の診断においてはなお煩雑である。代替の方法は、標識化ヌクレオチド又はプライマーの使用に頼るものであり、これは錯体検出の方法又は装置を要求するであろう。それゆえ、2以上の可変領域又は位置に関して核酸を分析することができ、典型的にはゲル電気泳動を必要とせず、及び好ましくは標識化ヌクレオチド又はプライマーを使用しない、型別方法へのニーズが存在する。
【0007】
血清に基づく検出法(Viazovら、Journal of Virological Methods、48巻、81−91頁、1994年;M.Schroter、Journal of Medical Virology、57巻、230−234頁、1999年)、ラインプローブ法(L.Stuyver、Journal of General Virology、74巻、1093−1102頁、1993年、L.Stuyver、Transfusion、36巻、552−558頁、1996年)、制限断片長多型(McOmishら、Transfusion、33巻、7−13頁、1993年;S.Buoro、Intervirology、42巻、1−8頁、1999年)を含む型別のためのその他の方法が、当該技術分野において周知である。しかしながら、シークエンス法は、引き続き、当該技術分野において、型別のための“最も基準となる検査(gold standard)”方法とみなされている。従って、上記の欠点を避けるシークエンス法に基づく型別方法は、当該技術分野における大きな進歩を意味するであろう。
【0008】
PCRは、また、病原菌(すなわち、細菌やウイルス)の検出に広く用いられている。しかしながら、慣用的なPCR分析は、診断への用途に限定され、そして一般には、病原菌又は特定の配列が存在するか否かを示唆するのみである。多くの感染症、例えば、C型肝炎などのウイルス性感染症においては、感染させる微生物は多くのことなるサブタイプ(sub−type)を生じることがあり、例えば、HCVウイルスについては少なくとも7つのサブタイプ(又は遺伝子型)が知られている。そのような環境において、感染させる微生物の大まかな“類”(又は、属あるいは種)が存在することを評価するだけでなく、さらにどのようなサブタイプが存在するかも評価することは、有益である。
【0009】
同様に、ゲノムの研究により、今日、多くのその他の病気又は疾患が、遺伝的変異(例えば、突然変異、対立遺伝子変異)、又は多型(例えば、一塩基多型(SNPs))と関連があること、及び、そのような変異の存在が、病気又は疾患になりやすい傾向又は危険性を示唆し、又はある個人が当該病気又は疾患のための治療に対して効果があるかどうかさえ示唆又は予期し得ること、が明らかになってきている(後者の効果は、“薬理ゲノム学”と呼ばれる)。従って、臨床科学において、そのような変異の分析(型別)は重要であるといえる。
【0010】
微生物のサブタイプ及び臨床的に有益な多型(又はその他の遺伝的変異)は、しばしば遺伝的変異の組合せ(すなわち、ゲノム等の複数(つまり、2以上)の位置又は領域における変異)により特徴づけられる。従って、そのような状況での型別の目的においては、1より多くの変異(多型)を“型別”(又は同定)する必要がある。言い換えれば、そのパターンが調査されるゲノムにおける1より多くの領域に及ぶ多型パターン(遺伝的変異のパターン)を型別(又は、調査あるいは同定)する必要がある。(“多型パターン”という語は、本明細書において、2以上の(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、又はそれ以上の)任意の型の遺伝的変異(例えば、突然変異、対立遺伝子変異、任意の多型等)のパターン又は組合せを広く含むものとして、用いられる)。変異は、1以上の核酸残基の挿入又は欠失であり得ることは理解されるであろう。
【0011】
従って、多くの微生物、病気、又は病気になりやすい傾向において、存在する病原菌又は遺伝的変異の正確な型の同定は、適切な診断あるいは予後を行うために必要とされ、これを達成するためには、1より多い遺伝的に変異の位置又は領域を調査する必要がある。上述のように、PCRは特定のDNA配列の増幅及び/又は同定において非常に有用な手段であるが、慣用的なPCR技術を用いて複数の遺伝的変異に基づく核酸分子の遺伝子型を測定するには、繰り返されかつ多数の別個の反応が実施されることが要求される。これらを慣用的な技術及び手法(例えば、電気泳動又は標識化技術)を用いて実施することは、煩雑であり、時間がかかり、しかも高価である。それゆえ、正確かつ確実であり、分析時間が短く、素早くかつ簡易に実施できる型別分析法へのニーズが存在する。本発明は、このニーズに対応するものである。
【0012】
発明の詳細な記載
特に、今回、ターゲット核酸における複数の可変部位についての型別(配列)情報を得るための単純で、確実で、かつ正確な方法が明らかとなった。この方法は、可変部位において又はその近辺に結合するよう設計された2以上の特定のプライマーを用いるプライマー伸長反応系を用い、当該プライマー伸長反応を鋳型の核酸配列にアニールされたそれぞれのプライマーにおいて順次にあるいは同時に行われるようにし、前記プライマー伸長反応におけるヌクレオチドの取込みパターンを検出すること、により実施され得る。ヌクレオチドの取込みパターンは、前記可変部位についての型別情報を提供する。
【0013】
従って、本発明の当該新規方法は、複合化(multiplexing)のアプローチ(すなわち、複数の反応の同時又は並行実施を利用するアプローチ)と複数のプライマー伸長の結果を検出するための(すなわち、ヌクレオチドの取込みパターンを検出するための)特定の戦略を組合せるものである。
【0014】
本方法は、特にオートメーション、例えば、反応と試薬の調合工程がマイクロタイタープレートの形式において行われる系におけるオートメーションに適している。本方法は、特に、微生物種及びそれらのサブタイプの同定に適しているが、例えば、組織の型別又は臨床の用途における多型の型別等のその他の型別手法における用途もまた見出し得る。
【0015】
以下でさらに詳細に述べるように、本発明は、好ましくは“sequencing−by−synthesis”方法に基づくものである(例えば、Melamedeの米国−A−4,863,849号を参照)。この語は、プライマー検出ポリメラーゼ伸長反応におけるヌクレオチド取込みの検出を利用する配列決定方法を定義するために当該技術分野において用いられる語である。4つの異なるヌクレオチド(すなわち、A、G、T、又はCヌクレオチド)は、周期的に又は連続的に(好ましくは、公知の順番で)加えられ、取込みは種々の方法で直接的にあるいは間接的に検出され得る。この検出により、どのヌクレオチドが取込まれたかが明らかとなり、それゆえ配列の情報が明らかとなる。すなわち、鋳型ターゲット配列における隣の塩基と(通常の規則のA−T及びC−Gの塩基対形成による)ペアを形成するヌクレオチド(塩基)が添加される場合、それは成長する相補的ストランド(すなわち、伸長プライマー)中にポリメラーゼによって取込まれ、そしてこの取込みは検出可能なシグナルをもたらす。ここで、シグナルの性質は選択する検出方法に依存する。
【0016】
従って、本発明は、1以上の核酸分子を型別する方法を提供するものであり、当該方法は、
同時に又は順次に2以上のプライマー伸長反応を行い、各プライマーが前記核酸分子における相違する予め定められた部位で結合し、及びヌクレオチドの取込みパターンを定め、前記核酸分子を型別するために1以上の参照パターンと任意に比較される前記核酸分子のテストパターン(すなわち“指紋”)を得ること、を含む。
【0017】
好ましくは、プライマー伸長反応は同時に起こり、すなわち全てのプライマーがアニールされ、一度にプライマー伸長が可能である。もちろん、個々のプライマーは、それぞれ、鋳型における隣のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドが反応混合物に添加された場合のみ、伸長され得ることは明らかであろう。従って、各ヌクレオチドの添加では、必ずしも全てのプライマーが実際に伸長されるわけではなく(1つも伸長されない場合もあり得る)、“同時に”という語は当該事実を考慮して解釈されなければならない。
【0018】
本発明の方法は、その配列が可変である2以上の部位(“可変部位”)を含む核酸分子を型別するために用いることができ、それぞれの前記プライマーは可変部位に又はその近くにある部位で結合する。異なるヌクレオチドを順次添加してプライマー伸長反応を行うことができる(これについては、さらに後述する)。
【0019】
また、本発明の方法は、その配列が可変である1以上の部位(“可変部位”)を含む2以上の核酸分子を型別するために用いることができ、それぞれの前記プライマーは可変部位に又はその近くにある部位で結合する。異なるヌクレオチドを順次添加してプライマー伸長反応を行うことができる(これについては、さらに後述する)。この実施態様は、関連する遺伝子における可変部位についての情報を得ることが望まれる場合、例えば、静脈血栓症を発病する危険因子であるファクターVライデン(Factor V Leiden)及びプロトロンビン(FII)のSNPsにおいて、特に有用である。
【0020】
本明細書において、“型別(typing)”という語には、分析されるべき核酸分子(すなわち、“テスト”又はターゲット核酸)の配列を分析する任意の方法が含まれる。より詳細には、本発明の型別方法には、ターゲット核酸分子における遺伝的又は配列の変異(例えば、ゲノム変異)を検出し、同定し、又は分析するための方法が含まれる(上述のように、これらの対象は、例えば突然変異、対立遺伝子変異、多型等であることができる)。従って、本発明の方法には、核酸分子を同定し又は区別する方法が含まれる。本発明の型別方法は、核酸分子における遺伝的変異を検出することを利用するものであるから、遺伝子型別(genotyping)の方法としても見なすことができる。核酸分子自身が型別され得ること、及び核酸分子における所定の可変部位が型別され得ることもまた理解されるであろう。
【0021】
従って、本発明における“遺伝子型別”には、ターゲット核酸分子の遺伝子型を決定することが含まれる。本明細書において、“遺伝子型”は、本発明の方法において調査又は分析される遺伝的変異の特定の組合せ又はパターンと見なすことができ、それは当該核酸分子により示される(すなわち、発現される)。従って、遺伝子型は、調査される特定の遺伝子座において発見される特定の対立遺伝子(すなわち変異体)の組合せ(又はパターン)を含み得る。
【0022】
すなわち、遺伝子型はターゲット核酸における複数の遺伝的変異(又は“可変部位”)の組合せ又はパターンである。遺伝子型を含む又は遺伝子型からなる遺伝的変異は、本発明の方法における調査のために選択されるものであることができる(その他の遺伝的変異も分子に存在するかもしれないが、それらは調査されない)。上述したように、本明細書において、“複数の”という語は、2以上(すなわち、3、4、5、6、7、8、9、10、又はそれ以上)を意味し、さらに遺伝的変異(又は“可変部位”)は、多型(例えば、SNPs)、挿入、欠失、突然変異、超可変領域、可変モチーフ、又は対立遺伝子変異などであり得る。本発明の方法では、2以上、好ましくは3以上、例えば3−7の可変部位が、同時に調査される。そのような2の可変部位が互いに、例えば50ヌクレオチドで、好ましくは30ヌクレオチドの範囲内、好ましくは20ヌクレオチドの範囲内で近接しない限り、それぞれの可変部位を型別するために別個のプライマーが要求されるであろう。それぞれのプライマーは1以上の可変部位についての型別情報の発生に役割を果たすであろうから、それゆえ、プライマーは実質的にそれ‘自身’に可変部位を有するであろう。
【0023】
好ましくは、ターゲット核酸はDNAであり得るが、RNA(例えば、mRNA)の型別もまた本発明の範囲内である。RNA試料の型別を望む場合には、当該方法は、RNAテンプレートからcDNAを発生させる工程を付加的に含むことができ、好ましくはそれには逆転写酵素が用いられる。さらに、所望ならば、プライマー伸長反応は、RNAテンプレート上において直接実施される。
【0024】
従って、ターゲット核酸は、所望の又は都合の良い任意の形態の、単離された又は合成された任意の核酸であることができる。それゆえ、それは、本発明の方法による分析に直接用いられるゲノムDNA又は単離mRNAであることができ、あるいは、上述のcDNAのような(例えば合成により)それらから誘導された核酸生成物(又は、それに相当するもの)、又は増幅生成物(例えば、PCRアンプリコン)、クローン又はライブラリー生成物等であることができる。
【0025】
核酸分子は、核酸を含む任意の材料であり得る任意の適切な供給源から得られ、又は誘導されることができ、全ての生物学的及び臨床学的試料、すなわち生物の任意の細胞あるいは組織試料、又は任意の体液あるいはそれらから誘導される調製物、さらに細胞培養物、細胞調製物、細胞可溶化物等が、可能な供給源として含まれる。また、環境試料、例えば土壌及び水試料又は食物試料も含まれる。試料は、新たに調製されることができ、又は任意の適切な方法(例えば、貯蔵)で事前処理され得る。
【0026】
従って、核酸の代表的な供給源には、例えば、食物及び関連する物、臨床学的試料及び環境試料が含まれる。しかしながら、供給源は、一般には、生物学的試料であり、それらには任意のウイルスの又は細胞の物質が含まれることができ、例えば、全ての原核あるいは真核細胞、ウイルス、バクテリオファージ、マイコプラズマ、プロトプラスト、及びオルガネラが含まれる。それゆえ、そのような生物学的物質には、全ての種類の哺乳類及び非哺乳類動物の細胞、植物細胞、ラン藻を含む藻類、菌類、細菌類、原生動物等が含まれ得る。従って、代表的な供給源には、血漿、血清、及びバフィーコート等の血液及び血液誘導物、尿、糞便、髄液又はその他の体液、組織、細胞培養物、細胞浮遊液が全て含まれる。
【0027】
核酸は、調査のために、任意の適切な形態で提供され、好ましくは、(例えば、緩衝液等における)水溶液試料等の試料に含まれるであろう。核酸は、型別方法のために調整されることができ、所望ならば、単離、精製、クローニング、複製、増幅等の当該技術分野における周知技術によって調製され得る。
【0028】
本発明の方法の実施において、予め定められた部位においてターゲット核酸に結合する2以上のプライマー(“伸長プライマー”)が提供され、各プライマーの結合部位はことなっており、それにより複数の異なるプライマー伸長反応が実行される。伸長プライマーは、それらの伸長生成物がターゲット核酸における配列可変性(すなわち、遺伝的変異)の部位(例えば、遺伝子座又は領域)と重なる(あるいは、それを含む)ように、設計又は選択される。すなわち、当該プライマーは、可変部位において、又はその近辺(例えば、1乃至40、1乃至20、1乃至10、又は1乃至6塩基の範囲内)において、ターゲット核酸に結合する。上述のように、そのような可変部位は、ターゲット核酸の遺伝子型を構成する。
【0029】
当該方法を実施するために、少なくとも2の、好ましくは少なくとも3の伸長プライマーが要求される。しかしながら、プライマーの数は、選択によって、例えば、検討中の系の複雑さ及び所望される情報の詳細に依存して、変更することができる。それゆえ、例えば、3、4、5、又は6、あるいはそれ以上の伸長プライマー(例えば、3乃至15、あるいは3乃至10)が用いられ得る。
【0030】
従って、“可変部位”という語は、遺伝子型において異なり得る核酸分子の部位(例えば、遺伝子座又は領域)に関して適用する。先に定義したように、可変部位は、多型又はモチーフ等であることができる。型別に用いられる核酸標識は、通常、保存/半保存領域及び可変領域の両方を含む。従って、それぞれの“型(type)”は、配列変異の領域を含むであろう。ここで、この領域(すなわち、前記部位における配列又は塩基の同一性)は、その他の型と相違することができる。本発明の方法において、少なくとも2の潜在的な可変部位が調査され、そして、1のターゲット核酸分子が型別される場合には、当該核酸分子は2以上の(すなわち、複数の)可変部位を含むことになる。2以上のターゲット核酸分子が型別される場合には、前記核酸分子はそれぞれ1以上の可変部位を含むことになる。
【0031】
任意の所望される組合わせの可変部位が本発明の方法により分析され得ることは、当該技術分野における当業者には明らかであろう。可変部位は、単一遺伝子、コード領域、非コード領域、及び核酸分子に限定されるべきではなく、ターゲットゲノムにおける任意の場所で見出し得る。さらに、可変部位は任意の長さで良く、状況に応じ1乃至20ヌクレオチド、好ましくは1乃至10ヌクレオチドの長さであることも、当該技術分野における当業者には明らかであろう。しかしながら、典型的には、可変部位は、そこにおいてターゲット核酸の配列が可変であり得る、単一の又はいくつかの(例えば、1−6、例えば、1、2、3、4、5、又は6の)ヌクレオチドを含み得る。従って、例えば、C型肝炎ウイルス(HCV)のようなウイルスは、サブタイプの間に保存される領域であるが、それにもかかわらずサブタイプの間で変化し得る部位を含む領域を含み得る。従って、そのような可変部位(典型的には、それらは1乃至3ヌクレオチドの長さである)は、種々のサブタイプ間を区別するために用いられ得る。HCVでは、そのような可変部位を含む保存領域は5’非翻訳領域(5’UTR)であり、好ましくは、これは、以下の実施例1でさらに述べるように、本発明の遺伝子型分析方法において用いられ得る。
【0032】
その他の微生物もまた、それらのゲノム中に、可変部位を含む同様のそのような領域を含んでおり、それらも同様に本発明の方法において用いられ得る。その他の型別の用途(例えば、多型の型別)において、同じように多型領域を含む配列可変性領域が、同様に特定され得る。例えば、レニン−アンギオテンシノゲン−アルドステロン系におけるSNPsは、遺伝子の保存領域におけるプライマーの位置を用いて、判断され得る。プライマーは、SNP部位に又はその近くに位置することができる。図5は、3つの異なる伸長プライマーの位置を示しており、ここでプライマーの3’末端は、SNPの位置から4塩基、5塩基、又は10塩基である。SNPはEU6(ACE T3409C)である。
【0033】
本発明の実施のためには、プライマーの結合部位が、調査対象である核酸分子の全ての可能な変異体(遺伝子型)において利用可能であるべきであるということは、明らかであろう。それゆえ、そのようなプライマーの結合部位は、異なる変異体に共通の領域、又は異なる変異体間に実質的に保存される領域において存在することが好ましい。これは、上述のように、プライマーの結合部位が保存/半保存領域に存在するように選択することにより、容易に達成できる。
【0034】
プライマー伸長反応は、好ましくは、ヌクレオチドを反応混合物(すなわち、ポリメラーゼ、及びプライマー/テンプレート混合物)に順次添加することにより実施され得る。有利には、異なるヌクレオチドが既知の順番で、好ましくは予め定められた順番で添加される。以下の実施例1に記載される本発明の適切な実施態様では、4つの異なるヌクレオチド(すなわち、A、G、T、及びCのヌクレオチド)は、予め定められた添加の順番で順次添加される。従って、ヌクレオチドを予め定められた添加の順番で順次添加することは、本発明の好ましい特徴を形成する。それゆえ、添加の順番は、型別される核酸及び用いられるプライマーに合わせて調整され得る。それゆえ、添加の順番は、必ずしも循環的(例えば、ATGCATGC)である必要はなく、例えばCGCTAGAであることもできる、ということが
わかるであろう。
【0035】
それぞれのヌクレオチドが添加されると、ヌクレオチドの取込みが起こったか否かが決定され得る。
【0036】
好ましくは、以下でより詳細に述べるように、取込まれた各ヌクレオチドの量(すなわち、どれくらいの量か)がさらに決定され得る。このようにして、ヌクレオチドの取込みパターンが決定され得る。すなわち、ヌクレオチドの取込みパターンを決定する工程には、ヌクレオチドが取込まれたか否か、及びどのヌクレオチドが取込まれたか、を決定(すなわち検出)することが含まれ得る。好ましくは、この工程には、また、取込まれた各ヌクレオチドの量を決定することも含まれる。そのような定量的な実施態様は(ここで、ヌクレオチドの取込みは定量的に評価される)、本発明の好ましい特徴を表す。
【0037】
このようにして、“パターン”又は“指紋”をターゲット核酸について得ることができる。このパターンは、当該核酸分子について同定される特定の可変部位における塩基の同定(すなわち、配列)を含む。すなわち、当該パターンは、ターゲット核酸の遺伝子型に対応する。従って、遺伝子型は、得られたパターンを、参照パターン(又は、“標準パターン”)又は参照パターンのパネル(すなわち、1以上、例えば2以上、例えば1乃至20、1乃至15、1乃至10、1乃至6、又は1乃至3)と比較することにより容易に同定でき得る。参照パターンは、公知の遺伝子型(例えば、公知の微生物のサブタイプ、又は公知の多型パターン)を有する参照核酸分子について、本発明で用いる伸長プライマーを用いてヌクレオチドの取込みパターンを決定することにより容易に得ることができる。
【0038】
また、“参照パターン”は、後述の実施例で示すように、可変部位についての知見から理論的に得ることもできる。従って、得られたパターンと参照パターンを必ずしも実際に比較する必要がない場合もあり、所望の型別/配列の情報を得られたパターンから読み取ることもできる。いったん、各可変部位についての伸長プライマーが選択され、ヌクレオチドの添加の順番が定められると、プライマー伸長反応からの理論的アウトプットを決定することができる。図6に、2つの可変部位を個別に配列決定した結果からの理論的アウトプット、及び両方の伸長プライマーを同時に伸長する組合せを示す。理論的参照パターンを、ヘテロ接合体として存在する2つの可変部位について示す。用いたプライマーは、示した配列の3’に結合する。
【0039】
従って、ターゲット核酸分子について得られたパターンを同定(又は認識)することにより、当該分子の遺伝子型が同定(認識)され得る。好ましくは、テストパターンと参照パターンは、パターン認識用ソフトウェアを用いて比較され得る。
【0040】
本発明の実施のために、まず、当該技術分野において公知である任意の適切な増幅方法により、核酸分子を増幅することが、有利であり又都合が良い。その場合、ターゲット核酸は、アンプリコンであろう。適切なin vitro増幅技術には、適切なプライマーの指揮下で反応に存在する核酸を増幅する任意の方法が含まれる。従って、アンプリコン法は、好ましくは、PCR、又はそれらの種々の改良法(例えばネスト化プライマーの使用)であることができるが、この方法に限定されるものではない。自律(self−sustained)配列複製(3SR)、NASBA、Q−betaレプリカーゼ増幅系、及びリガーゼ連鎖反応(LCR)等の、その他の増幅手段もまた用いられ得ることは、当該技術分野における当業者には明らかであろう(例えば、Abramson及びMyers、Current Opinion in Biotech.、4巻、41−47頁、1993年、を参照)。
【0041】
PCRを核酸の増幅に用いる場合、適切なプライマーは、前述したとおり、核酸配列における目的の領域(すなわち、可変部位を含む領域)が増幅されるように選択される。また、全てのDNA配列の無差別な増幅のためにPCRを用いることもでき、これにより、調査のための試料(すなわち、総DNA)における原則的に全ての配列の増幅が可能となる。リンカー−プライマーPCRは、無差別増幅に特に適しており、そして、ターゲットDNA断片の末端に連結する、適切な突出し(overhanging)末端を有する2本鎖オリゴヌクレオチドリンカーが用いられる。この場合、増幅は、リンカーの配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて実行される。また、試料における全てのDNAを増幅するために、完全にランダムなオリゴヌクレオチドプライマーをDOP(縮重プライムオリゴヌクレオチド)−PCRと共に用いることができる。本発明の方法により型別される可変部位が、ゲノムの別個の(discrete)エリアに存在する場合には、複合型PCRを用いて、可変部位を含むゲノムから核酸配列を増幅することができる。それゆえ、複数の断片が、単一のPCR反応において増幅され得る。
【0042】
本発明の方法では、いくつかの領域(例えば、異なる可変部位を含む領域)が分析されることができるように、いくつかの配列を増幅することが必要とされ得る。それゆえ、いくつかの適切な増幅プライマーは、ターゲット核酸におけるいくつかの配列の選択的増幅ができるように、合成される必要があり得る。それゆえ、複数の異なる核酸分子が反応混合物に存在し得ることが明らかであろう。
【0043】
増幅反応において用いられる1以上の増幅プライマーは、その後、“伸長プライマー”として用いられ得るが、好ましくは、これは異なるプライマーである。
【0044】
増幅及び伸長の工程において用いられるオリゴヌクレオチド増幅及び伸長プライマーの配列及び長さが、それぞれ、ターゲット核酸の配列、増幅又は伸長生成物の所望の長さ、プライマーのさらなる(例えば、固定化のための)機能、及び、増幅及び/又は伸長に用いられる方法に依存することは、明らかであろう。適切なプライマーは、当該技術分野において周知の原理及び技術を適用して容易に設計され得る。
【0045】
好ましくは、上述のように、伸長プライマーは、ターゲット核酸の可変部位の近くに(例えば、1−40、1−20、1−10、又は1−6塩基の範囲内、好ましくは1−3塩基の範囲内)、又はそれに実質的に隣接してあるいは正確に隣接して結合し、そして、それらは、当該核酸の保存又は半保存領域と相補的である。ある特定の実施態様では、実施例1に例示するように、全てのプライマーは、ターゲット核酸における可変部位と実質的に隣接して(すなわち、隣接して又は可変部位の3塩基の範囲内で)結合する。その他の実施態様では(例えば、実施例3を参照)、プライマーは、1のものがその可変部位の非常に近くであり、もう1つがある距離(例えば、4−10ヌクレオチドの距離)離れており、及び第3のプライマーがその(第1の)可変部位から7以上(例えば、8−16ヌクレオチドの距離)であるように、ずれる。図7は、この原則を表している。
【0046】
本発明の方法の実施ためには、保存又は半保存領域の配列の知見が、適切な相補的伸長プライマーの設計のために必要とされる。伸長プライマーが各可変部位に提供され、それぞれが、可変部位における又はその近くの部位に特異的である。特異性は、相補的塩基対形成の効力により達成される。本発明の全ての実施態様において、プライマーの設計は、当該技術分野で周知の原理に基づくことができる。伸長又は増幅プライマーが、結合部位に対して完全に相補的である必要はないが、結合特異性の改良のためには好ましい。
【0047】
伸長プライマーは、ターゲット核酸のセンス鎖又はアンチセンス鎖と結合するように設計され得る。
【0048】
本発明の好ましい実施態様では、伸長プライマーは、予め定められた態様のヌクレオチドの添加においてそれぞれの可変部位の型別が別々に起こるような方法によって、可変部位の近くでターゲット核酸に結合するように設計される。従って、所定の可変部位の分析が、その他の可変領域又は保存領域からの正の取込みシグナルによって複雑になることはない。実施例1に示すように、テストパターンを解釈し、当該プライマー以外におけるヌクレオチドの取込みからのシグナルも可能であるが、好ましくは、1のプライマーが可変部位で伸長されている場合には、他のプライマーは反応しないであろう。従って、ヌクレオチドの取込みが1の可変部位で行われる場合、その他の可変部位ではヌクレオチドの取込みが無いのが好ましい。例えば、図6に示す理論的パターンにおいて、伸長プライマーは、その他の地点で同時にプライマーの伸長が起こっても(例えば、ヌクレオチドAの第2の実行)、ヌクレオチドの予め定められた順次の添加においてそれぞれの可変部位が別々に型別されるように、位置される。この好ましい実施態様では、伸長プライマーがその可変部位に到達すると、当該可変部位のみが配列決定される。すなわち、その他のプライマー伸長反応の鋳型における隣の塩基は、反応混合物に添加されるヌクレオチドと相補的ではないので、その他のプライマーは伸長されない。従って、プライマーは、ヌクレオチドの添加の順番に応じて設計されるべきである。いったん3’末端が固定されると、プライマー設計ソフトウェアが、プライマーの実際の配列を決定するために用いられ得る。好ましくは、Pyrosequencing Primer Design Software(パイロシーケンシングプライマーデザインソフトウェア)が用いられる。
【0049】
図7は、伸長プライマーが可変部位(Xとして示す)から異なる距離で位置する、複合型プライマー伸長反応の単純化したセットを示すものである。これは、ヌクレオチド添加の予め定められたパターンが実行されることを可能にし、ここで可変部位は独立に配列決定される。予想されるように、異なる可変部位の上流のヌクレオチド配列における変異は、そのようなずれた態様においては当該プライマーをアニールする必要はないが、ヌクレオチド添加のパターンのみによって、プライマーが異なる時間においてそれらの可変部位に接近し及び/又は配列決定するに十分であるようにできること、を意味する。従って、全てのプライマーは、可変部位からの同様な距離(又は、1のプライマー伸長反応が2つの可変部位を型別するために用いられる場合における、第1の可変部位)において(例えば、それらに実質的に隣接する場所において)アニールすることができるが、可変部位の範囲内及びすぐ上流のヌクレオチドが変異する場合、ヌクレオチド添加の順番は、可変部位に沿ったプライマー伸長の順番を制御するであろう。
【0050】
本発明における“プライマー伸長”反応には、全ての形態の、鋳型を用いた、ポリメラーゼに触媒される、核酸合成反応が含まれる。プライマー伸長反応についての条件及び試薬は、当該技術分野において周知であり、任意の標準的な方法、試薬、酵素等が、当該工程において用いられる(例えば、Sambrookら編集、Molecular Cloning:a laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory出版、1989年、を参照)。従って、最も基本的な態様におけるプライマー伸長反応は、プライマー、デオキシヌクレオチド(dNTPs)、及び適切なポリメラーゼ酵素(例えば、T7ポリメラーゼ、クレノウ酵素、又はシークエナーゼ Ver2.0(USB USA)、又は実際に使用可能な任意の適切なポリメラーゼ酵素)の存在下において実施される。上述のように、RNAテンプレートについては、逆転写が用いられ得る。条件は、当該技術分野において周知の方法を考慮して、自由に選択され得る。
【0051】
従って、プライマーは、ヌクレオチドの存在下においてプライマー伸長反応を受け、ここで、ヌクレオチドは、プライマーの位置のすぐ隣(3’)の塩基と相補的である場合のみ取込まれる。ヌクレオチドは、ポリメラーゼ酵素により核酸鎖又は核酸分子に取込まれることができる任意のヌクレオチドであることができる。従って、例えば、ヌクレオチドは、デオキシヌクレオチド(dNTP、デオキシヌクレオシド三リン酸)又はジデオキシヌクレオチド(ddNTP、ジデオキシヌクレオシド三リン酸)であることができる。従って、以下のヌクレオチドがプライマー伸長反応において用いられ得る:グアニン(G)、シトシン(C)、チミン(T)、又はアデニン(A)デオキシ−又はジデオキシ−ヌクレオチド。それゆえ、ヌクレオチドは、dGTP(デオキシグアノシン三リン酸)、dCTP(デオキシシチジン三リン酸)、dTTP(デオキシチミジン三リン酸)、又はdATP(デオキシアデノシン三リン酸)であることができる。後述するように、dATPの適切な類似体(analogues)、さらにdCTP、dGTP、及びdTTPについての類似体も、用いられ得る。活性化基あるいは検出可能基を含む修飾ヌクレオチド、放射標識化あるいは蛍光標識化ヌクレオチド三リン酸も、また、プライマー伸長反応において用いられ得る。本明細書において、“ジデオキシヌクレオチド”という語には、3’のヒドロキシル基が修飾され又は存在しない全ての2’−デオキシヌクレオチドが含まれる。ジデオキシヌクレオチドは、ポリメラーゼの存在下においてプライマーに取込まれることができるが、その後に起こる重合反応には関わることができず、従って、“連鎖停止剤”として機能することができない。
【0052】
ヌクレオチドがターゲット塩基と相補的ならば、プライマーは、1ヌクレオチド分伸長され、そして無機リン酸が放出される。後述するように、好ましい方法において、無機リン酸は、添加されたヌクレオチドの取込みを検出するために検出され得る。ある可変部位については、1のヌクレオチドの添加で、十分な型別の情報が生じることもあろう。しかしながら、大半の可変部位については、いくつかの隣接するヌクレオチドのデータが必要とされるであろう。伸長プライマーは、可変領域における隣の塩基を決定するための繰り返し手順において、全く同じように働くことができ、それにより可変部位全体を配列決定することができる。上述したように、異なるヌクレオチドが、順次に、好ましくは既知の順番で添加されることにより、それぞれの伸長プライマーについてどのヌクレオチドが取込まれるのかが明らかとされ得る。さらに、可変部位がホモポリマー的である場合(すなわち、2以上の同一の塩基を含む場合)、相補的塩基の取込まれるヌクレオチドの数は、ホモポリマー性領域に存在するその数を反映するであろう。従って、各ヌクレオチド添加について取込まれるヌクレオチドの数を決定することは、この情報を明らかとし、それゆえヌクレオチドの取込みパターンに寄与するであろう。
【0053】
それゆえ、プライマー伸長手順には、前述のようにプライマーのアニール、ヌクレオチドの添加、ポリメラーゼに触媒されるプライマー伸長反応の実施、前記ヌクレオチドの取込みが存在するか否かの検出(好ましくは、さらに、取込まれた各ヌクレオチドの量の測定)、及びヌクレオチド添加やプライマー伸長工程等をさらに1回以上繰り返すこと、が含まれる。上述したように、単一の(すなわち、個々の)ヌクレオチドは、選択により、同一のプライマー−テンプレート混合物、又はプライマー−テンプレート混合物の別個のアリコット等に連続的に添加され得る。
【0054】
プライマー伸長手順における、繰り返しの又は連続的な(反復の)ヌクレオチド添加を行うためには、それまでに添加されたヌクレオチドは除去されなければならない。これは、洗浄によって、より好ましくは、ヌクレオチド分解酵素(例えば、WO98/28440に詳細に記載されている)を用いることによって、達成され得る。
【0055】
従って、本発明の原則的な実施態様では、任意の取込まれない又は過剰のヌクレオチドを分解するためにヌクレオチド分解酵素が用いられる。従って、ヌクレオチドが添加されたが取込まれない場合(これは、ターゲット塩基と相補的でないことにより起こる)、又は、取込みが起こった後もなお、添加された任意のヌクレオチド(すなわち、過剰のヌクレオチド)が残っている場合には、その後、そのような取込まれなかったヌクレオチドは、ヌクレオチド分解酵素を用いて容易に除去され得る。このことは、WO98/28440において詳細に記載されている。
【0056】
本明細書において、“ヌクレオチド分解酵素”という語には、特異的に又は非特異的にヌクレオチド(少なくともヌクレオシド三リン酸(NTPs)、所望ならば、二リン酸及び一リン酸を含む)を分解できる任意の酵素が含まれ、さらに、ヌクレオシドトリホスファターゼ活性又はその他のNTP分解活性が存在することを条件に、そのような酵素の任意の組合せ又は混合物が含まれる。連鎖停止ヌクレオチドが用いられる場合(例えば、ジデオキシヌクレオチドが用いられる場合)には、ヌクレオチド分解酵素はそのようなヌクレオチドも分解すべきである。好ましくは、ホスファターゼ活性を有するヌクレオチド分解酵素が本発明において用いられる。しかしながら、任意のヌクレオチド又はヌクレオシド分解活性を有する任意の酵素、例えば、リン酸基以外の位置(例えば、塩基又は糖の残基)においてヌクレオチドを開裂させる酵素、もまた用いられることができる。従って、ヌクレオシド三リン酸分解酵素が、本発明において必須である。ヌクレオシド二リン酸及び/又は一リン酸分解酵素は随意的なものであり、ヌクレオシド三リン酸分解酵素と併用して用いられ得る。
【0057】
好ましいヌクレオチド分解酵素はアピラーゼであり、これはヌクレオシドジホスファターゼ及びヌクレオシドトリホスファターゼのいずれでもあり、
NTP → NDP+Pi、及び
NDP → NMP+Pi
の反応を触媒する(ここで、NTPはヌクレオシド三リン酸、NDPはヌクレオシド二リン酸、NMPはヌクレオシド一リン酸、及び、Piは無機リン酸である)。アピラーゼは、シグマ・ケミカル・カンパニーから入手することができる。その他の可能なヌクレオチド分解酵素には、ブタ膵臓ヌクレオシド三リン酸ジホスフォリドロラーゼ(diphosphorydrolase)が含まれる(LeBelら、J.Biol.Chem.、255巻、1227−1233頁、1980年)。さらなる酵素は、文献中に記載されている。
【0058】
ヌクレオチド分解酵素は、好ましくは、ポリメラーゼ(すなわち、プライマー伸長)反応工程に含まれ得る。従って、例えば、ポリメラーゼ反応は、ヌクレオチド分解酵素の存在下において実施される。あまり好ましいことではないが、そのような酵素は、ヌクレオチドの取込み(又は、非取込み)が起こった後に、すなわちポリメラーゼ反応工程の後に添加されることもできる。
【0059】
従って、ヌクレオチド分解酵素(例えば、アピラーゼ)は、任意の適切な方法により、ポリメラーゼ反応混合物(すなわち、ターゲット核酸、プライマー、及びポリメラーゼ)に添加され得る。例えば、反応の開始の前あるいはそれと同時に、又はポリメラーゼ反応が行われた後に、例えば、反応を開始するために試料/プライマー/ポリメラーゼにヌクレオチドを添加する前に、又はポリメラーゼとヌクレオチドが試料/プライマー混合物に添加された後に、添加され得る。
【0060】
好ましくは、ヌクレオチド分解酵素は、単に、ヌクレオチドの添加により開始され得るポリメラーゼ反応の反応混合物に含まれ得る。
【0061】
本発明において、ヌクレオチドの取込みの検出は、例えば、その後に検出され得る標識化ヌクレオチドの取込みにより、又は伸長配列に結合可能な標識化プローブを用いることにより、等の多数の方法により、実行することができる。
【0062】
本方法は、標準的な検出方法(例えば、ヌクレオチドの取込みを分析又は測定するための電気泳動法あるいは質量分析法)と併用してサンガー配列決定法を用いて実施され得る。しかしながら、伸長反応が定量的である(すなわち、ヌクレオチドの取込みは定量的に評価され得る)という事実に基づき、シーケンシング−バイ−シンセシス法(sequencing−by−synthesis method)を用いるのが好ましい。上述したように、シーケンシング−バイ−シンセシス法は、米国−A−4,863,849号に十分に開示されており、それは、例えば、分光学的に又は蛍光検出技術により(例えば、ヌクレオチド取込み工程の後に、添加されたヌクレオチド供給源に残っているヌクレオチドの量を測定することにより)、活性化されたヌクレオチドの取込みを測定又は検出できる多くの方法を開示するものである。シーケンシング−バイ−シンセシス法において、ヌクレオチドの取込みパターンの決定は、プライマー伸長と同時に行われる。シーケンシング−バイ−シンセシス法についての1つの仮の定義としては、単一の活性化(すなわち標識化)ヌクレオチドが、プライムテンプレート(primed template)中に取込まれ又は取込まれず、任意の適切な手段により取込みが検出される、方法であるといえる。この工程は、異なる活性化ヌクレオチドの添加により繰り返され、取込みが再び検出される。これらの工程が繰り返され、取込まれたヌクレオチドの合計から配列を推定することができる。しかしながら、シーケンシング−バイ−シンセシスの好ましい方法は、ピロリン酸の検出に基づく方法である。
【0063】
それゆえ、好ましくは、PPiの放出を(好ましくは、発光検出により、特に生物発光検出により)検出することにより、ヌクレオチドの取込みが検出される。
【0064】
PPiは、多くの異なる方法により測定されることができ、酵素を用いる多くの方法が文献に記載されている(Reevesら、Anal.Biochem.、28巻、282−287頁、1969年;Guilloryら、Anal.Biochem.、39巻、170−180頁、1971年;Johnsonら、Anal.Biochem.、15巻、273頁、1968年;Cookら、Anal.Biochem.、91巻、557−565頁、1978年;及び、Drakeら、Anal.Biochem.、94巻、117−120頁、1979年)。
【0065】
ピロリン酸の放出を同定するためにルシフェラーゼとルシフェリンを併用するのが好ましい。なぜなら、発生する光量は、実質的に放出されるピロリン酸の量に比例し、そして今度は、その量は取込まれるヌクレオチドの量に直接的に比例するからである。光量は、ルミノメーター(luminometer)等の適切な光検出装置により、容易に算出することができる。従って、発光による検出法は、定量的な評価ができるという利益をもたらす。
【0066】
PPiの放出を検出するためのルシフェリン−ルシフェラーゼ反応は、当該技術分野において周知である。特に、酵素であるATPスルフリラーゼ及びルシフェラーゼに基づくPPiの放出を連続的に観測するための方法が既に開発されており(Nyren及びLundin、Anal.Biochem.、151巻、504−509頁、1985年;P.Nyren、Enzymatic method for continuous monitoring of DNA polymerase activity、Anal.Biochem.、167巻、235−238頁、1987年)、そしてELIDA(酵素による発光計測無機リン酸検出法)と呼ばれている。PPiを検出するためのELIDA法の使用は、本発明において好ましい。しかしながら、当該方法は、例えば、より熱安定性のルシフェラーゼを用いることにより(Kaliyamaら、Biosci.Biotech.Biochem.、58巻、1170−1171頁、1994年)、及び/又はATPスルフリラーゼを用いることにより(Ondaら、Bioscience,Biotechnology and Biochemistry、60:10、1740−42頁、1996年)、改良され得る。この方法は、以下の反応に基づくものである。
【0067】
Figure 0004945779
【0068】
WO98/13523及びWO98/28448も、また、参照することができ、これらは、ピロリン酸検出に基づく配列決定方法に関するものであり、本発明において用いることができるPPi検出方法を開示するものである。
【0069】
酵素であるATPスルフリラーゼ及びルシフェラーゼに基づくPPi検出反応では、(放出されるPPiに対応する)シグナルは光として認識される。光の発生は、Pyrogram(登録商標)として知られている曲線として観測され得る。光は、ルシフェラーゼの作用により、生成物、ATP(これは、PPiと、ATPスルフリラーゼにより媒介されるAPS(以下参照)の間の反応により生成する)上において発生する。アピラーゼ等のヌクレオチド分解酵素が用いられる場合、この光の発生は、その後、ヌクレオチド分解酵素の作用(ルシフェラーゼに対する基質であるATPの分解)により“消滅”する。上昇曲線の傾きは、DNAポリメラーゼ(PPi放出)の活性度、及びATPスルフリラーゼ(PPiからのATPの発生、それによるルスフェラーゼに対する基質の提供)の活性度についての指標として理解することができる。シグナルの高さは、ルシフェラーゼの活性度に依存し、そして、上昇曲線の傾きは、上述のように、ヌクレオチド分解酵素の活性度の指標である。ホモポリマー性領域に関するPyrogram(登録商標)で以下に説明するように、ピークの高さは、また、所定のヌクレオチド添加工程において取込まれるヌクレオチドの数についての指標である。従って、ヌクレオチドが添加される場合に、放出されるPPiの量は、どのくらいの数の(すなわち、量)のヌクレオチドが取込まれるかに依存するであろう。そして、これは傾きの大きさに反映されるであろう。
【0070】
好ましくは、ポリメラーゼ反応工程にPPi検出酵素(すなわち、選択された酵素による検出システムにおいてPPi検出を達成するために必要な酵素であって、ELIDAの場合においては、ATPスルフリラーゼ及びルシフェラーゼであろう)を含むことによって、本発明の方法は、各ヌクレオチドが取込まれることによるシグナルが発生し、それを検出しながら、伸長反応をリアルタイムで連続的にモニターするために容易に適応されることができる。
【0071】
従って、PPi検出酵素(PPi検出反応に必要とされる任意の酵素基質又はその他の試薬と共に)は、ポリメラーゼ反応混合物に単に含まれることができる。
【0072】
PPiに基づく配列決定法においてこれまでに見られてきた潜在的な問題は、連鎖伸長反応に用いられるdATPが、ルシフェラーゼ酵素に対する基質として働くことにより、その後のルシフェラーゼに基づく検出反応を阻害することである。これは、デオキシアデノシン三リン酸の代わりに、ポリメラーゼに対する基質として働くことができるが、PPi検出酵素に対する基質として働くことができないdATP類似体を用いることによって、減少させ又は避けることができる。そのような改良は、WO98/13523に詳細に記載されている。
【0073】
“働くことができない”という語には、検出酵素に対する質の悪い基質である、又は実質的に基質として働くことができない、すなわち、PPi検出反応において、実質的に阻害とならない(すなわち、無視できる程度の)、又は深刻な阻害とならないような、類似体も含まれる。
【0074】
従って、本発明のさらに好ましい特徴は、酵素によるPPi検出反応を阻害しないが、それにも関わらず、ポリメラーゼにより成長するDNA鎖の中に正常に取込まれ得るdATP類似体の使用である。“正常に取込まれる”とは、ヌクレオチドが通常の、本来の塩基対形成により取込まれることを意味する。ルシフェラーゼがPPi検出酵素である、本発明の好ましい実施態様において、本発明に用いられる好ましい類似体は、デオキシATPの[1−チオ]三リン酸(又は、α−チオ三リン酸)類似体であり、好ましくは、デオキシアデノシン[1−チオ]三リン酸、又は公知であるデオキシアデノシンα−チオ三リン酸(dATPαS)である。dATPαSは、dCTP、dGTP、及びdTTPの類似体と同様に、アマシャムファルマシア社(Amersham Pharmacia)から購入することができる。dATPをdATPαSに置換することによって、dATPαSとルシフェラーゼの間の相互作用がないことによる低いバックグラウンドシグナルで、ポリメラーゼによる効果的な取込みができることが、実験から明らかとなった。dATPに代えてヌクレオチド類似体を用いることにより、ルシフェラーゼに対する基質として働くdATPの能力により生じるバックグラウンドが排除されるので、誤ったシグナルが減少する。特に、dATPの阻害に起因するルシフェリン−ルシフェラーゼ系からの光の発生によるバックグラウンドシグナルが実質的に減少する状態において、ポリメラーゼによる効果的な取込みが達成され得る。その他のヌクレオチドのdNTPαS類似体もまた、そのたのdNTPの代わりに用いることができる。
【0075】
シーケンシング−バイ−シンセシス法においてこれまでに見られてきたもう1つの潜在的な問題は、誤ったシグナルが発生し、ホモポリマー性伸長(すなわち、CCC)を正確に配列決定すろことが困難であるということである。これは、いったん伸長プライマーが鋳型核酸にアニールされた後に、1本鎖核酸結合タンパク質(SSB)を添加することによって、解消できる。シーケンシング−バイ−シンセシスにおけるSSBの使用は、Pyrosequencing ABのWO00/43540に記載されている。
【0076】
本発明の方法において、複数の核酸分子が型別される場合、異なる量の鋳型核酸が存在し得ることは、明らかであろう。特定の実施態様における添加により取込まれるヌクレオチドの数を定量し得るためには、単一のヌクレオチドの取込みに対応する各プライマーについて参照シグナルが発生するように、プライマーとヌクレオチドの配合を設定するのが好ましい。参照シグナルは、その他のプライマー伸長反応におけるヌクレオチドの取込みが存在しない場合に発生する。参照シグナルによって、同じ鋳型に関するシグナルの較正が可能となる。参照ピークを図9に示す。変異部位におけるシグナルの高さは、正確さを増大するために参照シグナルと関連づけることができる。
【0077】
PPi放出の検出によるヌクレオチドの取込みを検出する工程により、放出されるリン酸の量、従って取込まれるヌクレオチドの量を示すシグナルがもたらされる。本発明の方法において、2以上の別個のプライマーが、プライマー伸長反応において順次に又は同時に用いられ得る。従って、各ヌクレオチド添加に対してプライマーが同時に添加される場合には、0、1、又はそれ以上のヌクレオチドが、成長するDNA鎖中に取込まれ得る。それゆえ、リン酸検出工程において生じるシグナルは、鋳型DNAに結合する全てのプライマーの組合せについてのプライマー伸長工程で取込まれるヌクレオチドの数の指標となるであろう。シグナルのサイズ(すなわち、各ピークの高さ)は、それゆえ、取込まれるヌクレオチドの数と直接的に関連づけられことができる。特定の実施態様では、プライマーは、1乃至20、好ましくは1乃至10(例えば1乃至5)、最も好ましくは1乃至4のサイクルのヌクレオチド添加を受けることのみを必要とする。
【0078】
本発明の1の実施態様では、2以上のプライマーが、ターゲット核酸における可変部位の隣り又は近くにおいて、(同時に)ハイブリダイズする。各プライマーは、1又は(可能ならば)それ以上の可変部位の型別において役割を果たす。上述のように、その後、プライマー伸長が実行され、そして、添加されたヌクレオチドがターゲット塩基と相補的な場合のみ、各プライマーについてプライマー伸長が生じる。従って、2のプライマーが同時に用いられる場合、任意の所定のヌクレオチド添加によって、0、1、又は2以上(これはホモポリマー性領域に対する場合)のヌクレオチドの取込みが起こり得る。プライマー伸長反応は、反応混合物においてハイブリダイズする全てのプライマーについて同時に実行される。従って、検出されたヌクレオチド取込みは、ハイブリダイズする全てのプライマーについての累積状況(cumulative picture)を与える。このようにして、ヌクレオチドの取込みパターンが、直接的に決定される。好ましくは、伸長反応が可変部位に沿って拡張する場合には、ヌクレオチドの取込みはその部位においてのみ起こる。
【0079】
本発明のさらなる実施態様では、プライマーは、プライマー伸長反応に順次に添加され得る。
【0080】
この場合、ヌクレオチドの取込みパターンは、各プライマーについてそれぞれ別個に決定されることができ、その後、累積の状況/パターンを得るために“合算”される。本発明の当該実施態様における改良バージョンでは、第1のプライマーは、ターゲット核酸とハイブリダイズし、プライマー伸長反応を受け、そして、これは可変部位が配列決定された後に連鎖停止剤の添加により停止される。連鎖停止剤は、当該技術分野において周知であり、ジデオキシヌクレオチドを含む。その後、第2のプライマーが第2の可変部位を配列決定するために添加され、当該配列決定は、再び連鎖停止剤の添加により停止される。この方法は、目的となる全ての可変領域が配列決定されるまで繰り返され得る。
【0081】
上記及び実施例1においても記載されている特に好ましいさらなる実施態様では、伸長プライマーは鋳型とハイブリダイズし、当該プライマーは同時に伸長される。当該プライマーは、プライマー伸長が可変部位において順次に生じることができるように設計される。すなわち、プライマー伸長は、各プライマーについて同時に起こるが、可変部位においては次々に起こり、一方、その他のプライマーは、保存/半保存領域において伸長され、又は、より好ましくは、相補的でないヌクレオチドの添加により全く伸長されない。ヌクレオチド添加のパターンは、好ましくは、プライマーの伸長が可変部位において順次に起こるように予め定められる。プライマーは、可変部位に隣接して、又は可変部位から1乃至40、1乃至20、1乃至10、1乃至5ヌクレオチドで結合し得る。
【0082】
所望ならば、いったんプライマーが可変部位において伸長されれば、連鎖停止剤(例えば、ジデオキシヌクレオチド)は、当該プライマーの連鎖伸長反応を特異的に停止するために添加され得る。ヌクレオチド取込みのシグナルは、プライマー伸長反応の間において全てのプライマーについて発生し、得られるパターンに寄与するということは、明らかであろう。それにもかかわらず、好ましくは、パターンの異なる領域は、1の可変部位のみに関するものである。
【0083】
本発明のさらに改良された実施態様では、連鎖停止剤が、同時にハイブリダイズするプライマーによって、dNTPの代わりに又はdNTPと共に用いられ得る。この場合、各プライマーからのプライマー伸長が順次に起こるように、すなわち、ヌクレオチドが、まず第1のプライマーから取込まれ、次のプライマーからのヌクレオチド取込みが起こる前に、第1の伸長反応が完了するように、プライマーは選択又は設計される。この実施態様では、また、ヌクレオチドが予め定められた順番で添加されることが要求される。
【0084】
実際には、いわゆる“知的な(intelligent)”プライマー設計が、所望の又は予め選択された(すなわち、予め定められた)態様において本発明の方法を実行するために用いられ得る。これは、用いられる伸長プライマーの数及びそれらの配列の設計、のいずれについても適用され得る。“知的な”プライマー設計は、最も好ましくは、個々のの可変部位の配列決定が分離して実行され得るような、ヌクレオチド添加の“知的な”順番により行われる。そのような、プライマーの‘知的な’設計及びヌクレオチド添加の順番は、実施例においてより詳細に記載される。
【0085】
本発明の方法は、好ましくは、単一の反応容器において行われることができ、“同時の”又は“順次の”いずれかのプライマー伸長態様が用いられる。従って、例えば、全ての伸長プライマーは、一緒に又は順次に、単一反応容器に添加され得る。
【0086】
プライマー伸長反応が実施されるためには、好ましくは、核酸分子は、それが増幅されているか否かに関わらず、1本鎖の形態で供給される。核酸分子は、当該技術分野において公知である任意の適切な技術(例えば、Sambrookら、supra)により、例えば、核酸を加熱することにより、又は、ホルムアミド、尿素、ホルムアルデヒド等の化学変性剤の存在下における加熱によって、又は、アルカリの使用によって、鎖分離(strand separation)され得る。
【0087】
しかしながら、これは絶対的に必須なものではなく、2本鎖核酸分子は、(例えば、鎖置換活性を有する適切なポリメラーゼと共に)鋳型として用いられ得る。
【0088】
予備的な増幅工程が用いられる場合には、核酸がどのように増幅されるかに関わらず、増幅反応の全ての成分は、本発明の型別分析が行われる前に、除去され、純粋な核酸が得られることが必要である。例えば、取込まれないヌクレオチド、PCRプライマー、及びPCR反応からの塩は除去される必要がある。核酸を精製するための方法は、当該技術分野において周知であるが(Sambrookら、supra)、好ましい方法は、核酸分子を固定化し、洗浄及び/又は沈降の手法によって不純物を除去することである。
【0089】
それゆえ、所望ならば、ターゲット核酸は固定化の手段で提供されることができ、それは、増幅核酸を生成するために用いられるヌクレオチド塩基又はプライマーのいずれかを経て、増幅の間に導入され得る。
【0090】
固定化を促進するために、本発明について用いられる増幅プライマーは、直接的に又は間接的に固定化の手段を有することができる。従って、例えば、プライマーは、直接的に又は間接的に固定支持体へ結合することができる配列と相補的な配列を有することができ、又は、結合パートナーを経る固定支持体への直接又は間接的な結合に適した部位を有することができる。
【0091】
多くの適切な、DNAの固定化のための支持体及びヌクレオチドをそれらに結合させる方法が、当該技術分野において周知であり、広く文献に記載されている。従って、例えば、マイクロタイターウェル(microtitre well)、チューブ、ディップスティック、粒子、ファイバー、又はキャピラリーの形態の支持体を用いることができ、それらは、例えば、アガロース、セルロース、アルギナート、テフロン、ラテックス、又はポリスチレンから作られ得る。好ましくは、支持体は、磁性粒子、例えば、Dynal AS(オスロ、ノルウェー)により製造され、DYNABEADSの商標の下で販売されている超常磁性ビーズを含むことができる。例えば、Nilssonらの文献(Anal.Biochem.、224巻、400−408頁、1995年)に記載されているような、クリップ(clips)は、微小実験システムを提供するための固体支持体として用いられ得る。
【0092】
固体支持体は、プライマーとの連結又はオリゴヌクレオチドの捕捉のために、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、又はアミノ基等の官能基を有し得る。これらは一般に、そのような官能基の1つを有するポリマーの表面コーティングで支持体を処理することにより、例えば、ヒドロキシル基はポリウレタンとポリグリコール又はセルロース誘導体によって、カルボキシル基はアクリル酸又はメタクリル酸のポリマー又はコポリマーによって、さらに、アミノ基はアミノアルキル化ポリマーによって提供される。米国特許第4,654,267号には、多くのそのような表面コーティングの導入について記載されている。
【0093】
また、支持体は、連結のためのその他の部位を有することもでき、それは例えば、アビジン又はストレプタビジン(これらはヌクレオチド配列のビオチンと結合する)、DNA結合タンパク質(例えば、プライマー又はオリゴヌクレオチド中の存在し得るlacオペレーター配列と結合するlac Iリプレッサータンパク質)、又は抗原あるいは抗体断片(ヌクレオチド配列におけるジゴキシゲニン等のハプテンに結合する)などである。ストレプタビジン/ビオチンの結合システムは、ビオチンが比較的容易にヌクレオチド配列中に取込まれ得るということにより、さらにビオチン標識化ヌクレオチドの商業的入手可能性により、分子生物学において広く一般に用いられている。これは、本発明におけるターゲット核酸分子の固定化のための、1つの好ましい方法を代表する。ストレプタビジンでコートされたDYNABEADSは、Dynal ASから商業的に入手可能である。
【0094】
上述のように、固定化は、好ましくは増幅の後に行われる。増幅の後の固定化を促進するために、増幅プライマーの1つ又は両方が固定化の手段を与えられる。そのような手段には、上述のように、支持体上に有る対応する結合パートナーと結合する1組の結合パートナーが含まれ得る。従って、固定化のための適切な手段には、ビオチン、ハプテン、又は、DNA結合タンパク質と結合する(lacオペレーターのような)DNA配列、が含まれる。
【0095】
増幅生成物の固定化が実施されない場合、増幅反応の生成物は、例えば、単にホルムアミド溶液(変性溶液)に入れることにより分離され、及び、例えば、電気泳動法により又はチップ技術を用いる分析により分離され得る。固定化は、伸長反応のための1本鎖鋳型を生じさせる迅速かつ簡便な方法を提供する。固定化の代わりとして、その他の方法を用いることができ、例えば、非対称PCR、エキソヌクレアーゼプロトコル、又は2本鎖鋳型における急速変性/アニール化プロトコルが1本鎖DNAを得るために用いられ得る。そのような技術は、当該技術分野において周知である。
【0096】
本発明の方法により、個体(例えば、臨床試験下の患者、型別のための組織試料、又は同定のための微生物)から派生する1以上の核酸分子の型別(遺伝子型別)が可能となる。従って、本発明の方法は、種における異なる遺伝子型を区別することができる。これは、1の微生物(細菌)について多くの遺伝子型が存在し得る(例えば、現在、C型肝炎ウイルスには7つの既知の遺伝子型が存在する)、微生物種の同定の分野において特に有用である。
【0097】
本発明の方法は、特定のDNAの存在により特徴づけられる病理状態、特に、例えばヘルペス、肝炎、HIVによるウイルス感染のような潜伏感染病の診断において、特に有益である。また、注入微生物試料を得ることが困難であり、又は、P.falciparumやChlamydia種の場合のように、その後の特性決定のための単離微生物の生体外における培養が困難である、細菌感染、原生動物感染、及び真菌感染を特徴づけ又は型別し、さらに定量するために本方法を用いることができる。また、本発明の簡易性及びスピードにより、梅毒や髄膜炎等の病気を引き起こすその他の病理因子の検出にも用いられ得る。注入微生物試料が容易に得られる場合であっても、本方法のスピードを一晩の培養と比較すれば、本発明の方法は、慣用的な技術よりも好ましいということができる。
【0098】
本発明の方法は、個体における1以上の遺伝子又は2以上の遺伝子内の2以上の一塩基多型(SNPs)の分析にも用いることができる。多くの病気及び健康状態は、同一の遺伝子内における、又は別個の遺伝子内における多型の組合せと関連づける(結び付ける)ことができる。例えば、WO00/22166において、いくつかの遺伝子におけるSNPsの組合せは、心循環器疾患の可能性を予測するために用いられ得る多型パターンを与え、それにより個体対する詳細な予後診断を可能にし、そして、特定の治療計画が心機能の状態の改善に有効かどうかを予測できることが示唆されている。従って、本発明の方法は、個体の特定の遺伝子型における迅速な予後診断に用いることができ、それにより、テイラード治療(tailored therapy)を行うことができる。実施例2に、RAAS系において、複合型の遺伝子型別がSNPsについて実行できることを示す。この実施例では、1の核酸は2のSNPs(EU7)を含み、2のさらなる核酸はそれぞれ1のSNP(EU8及びEU11)を含む。
【0099】
本発明の方法は、可変部位の正確な配列を決定する(すなわち、配列決定手法に基づいて)、電気泳動法、及び好ましくは標識化ヌクレオチド及び/又はプライマーなどのコストが高くかつ煩雑な手法を避ける、及び、多数の試料を短時間で分析できる、という利点を有する。
【0100】
プライマー伸長反応は、反応混合物に添加されるヌクレオチドに関連する、ヌクレオチドの取込みの指標となる“パターン”又は“指紋”を生じさせる。当該パターンは、ターゲット核酸分子内の2以上の可変部位におけるヌクレオチドの取込みを検出するために設計されたプライマーに対するヌクレオチド取込みの累積状況(cumulative picture)である。ターゲット核酸分子の型別を可能にするために、同じ可変部位と伸長プライマーによる参照パターンが用いられる。各遺伝子型は異なるパターンを生じるはずであり、理論的に決定され得る参照パターンと比較することにより同定が促進される。
【0101】
本発明の方法は、適切なプライマー結合部位の決定及び相補的な伸長プライマーの設計から得られるさらなる既知配列の情報(例えば、保存/半保存領域の既知配列)と共に、可変部位の位置及び性質の知見に依存する。本発明の方法の使用では、可変領域の任意の組合せが型別方法において用いられ得る。本発明の方法は遺伝子における複数の可変部位に限られず、非コード領域についても適用可能であることは、当該技術分野における当業者には明らかであろう。パターンは、1以上の同じ遺伝子における可変部位、関連遺伝子における可変部位、異種遺伝子における可変部位、又は非コード領域における可変部位について、得ることができる。
【0102】
本発明は、また、本発明の方法を実施するためのキットを含む。これらは、通常、1以上の以下の構成成分、
任意に、in vitro 増幅のためのプライマー;プライマー伸長反応のための2以上のプライマー;増幅のための及び/又はプライマー伸長反応(上述)のためのヌクレオチド;増幅及び/又はプライマー伸長反応のためのポリメラーゼ酵素;及び、プライマー伸長を検出するための手段(例えば、上記で概説及び定義した、ピロリン酸の放出を検出する方法)、
を含む。
【0103】
特定の実施態様では、当該キットは、また、ヌクレオチド添加の順番に対する指令を含む。
【0104】
本発明は、これより、図を参照しつつ非限定的な実施例により説明される。
【0105】
実施例1
血清試料
HCV陽性の退役軍人からの72の血清を、スタンフォード退役軍人病院から入手した。10のHCV陽性の血清をイランから入手した。
【0106】
オリゴヌクレオチドの合成及び精製
オリゴヌクレオチドであるHCV−PCR−OUTF(5’−CCCTGTGAGGAACTWCTGTCTTCACGC)、HCV−PCR−OUTR(5’−GCTCATGRTGCACGGTCTACGAGACCT)、HCV−PCR−INF(5’−TCTAGCCATGGCGTTAGTAYGAGTGT)、BHCV−PCR−INR(5’−ビオチン−CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT)、HCV−SEQF1(5’−GGAACCGGTGAGTACACCGGAAT)、HCV−SEQF2(5’−GACYGGGTCCTTTCTTGGA)、HCV−SEQF3(5’−ATTTGGGCGTGCCCCCGC)は、全て、MWG Biotech社(ハイポイント、NC州、米国)により合成され、HPLCで精製されたものである。
【0107】
RNAの抽出、cDNAの合成、及び増幅
RNAは、AmbionのトータリーRNA分離キット(www.ambion.com、Ambion(ヨーロッパ)Ltd.、ケンブリッジ、英国)、を用いて、100μlの患者血清から抽出した。cDNAは、Invitrogen(www.invitrogen.com、Invitrogen Ltd.、ペイズリー、英国)からのSuperscript(登録商標)全増幅システムのキットを用いて合成した。第1ストランドcDNA合成には、70℃で10分間培養しその後少なくとも1分間氷冷した、1μlの0.5μg/μlオリゴ(dT)ランダムプライマーと5μlのRNAを含む、RNA/プライマー混合物を用いた。2μlの10X PCRバッファー(200mMのトリス−HCl(PH8.4)、500mMのKCl)、2μlのMgCl25mMとdNTP10mM混合物及び0.1MのDTTを含む反応混合物をそれぞれのRNA/プライマー混合物に添加し、穏やかに混ぜ、短時間の遠心分離により捕集し、その後、42℃で5分間培養した。Superscript II 転写酵素の200ユニットを各チューブに加え、40℃で50分間培養した。反応は、70℃で15分間培養させて停止し、その後、氷冷した。核酸は、短時間の遠心分離により捕集した。1μlのRNアーゼを各チューブに添加し、37℃で20分間培養した。その他のPCRは、HCV−PCR−OUTF及びHCV−PCR−OUTRのPCRを用い、1μlのcDNAにおいて行った。外部PCRは500,000倍に希釈され、1μlのそれを、プライマーHCV−PCR−INF及びHCV−PCR−INRを用いる内部PCRにおける鋳型として用いた。
【0108】
鋳型(テンプレート)の調製
ビオチニル化PCR生成物は、ストレプタビジンでコートされた超常磁性ビーズであるDYNABEADS(登録商標)M280−ストレプタビジン(Dynal Biotech ASA、オスロ、ノルウェー)上に固定化した。1本鎖DNAは、固定化PCR生成物を0.1M NaOH中で3分間の培養の後に、上澄みを除去することにより得た。5pmolの配列決定プライマーHCV−SEQF1、HCV−SEQF2、及びHCV−SEQF3を、固定化ストランドとハイブリダイズさせた(Ronaghiら、Analytical Biochemistry、242巻、84−89頁、1996年に記載されている)。
【0109】
プライマー伸長反応
プライム化DNA鋳型は、0.5μgのSSB(Amersham Pharmacia Biotech、米国)、及びパイロシーケンシング(登録商標)基質及び酵素(www.pyrosequencing.com、Pyrosequencing AB、Uppasala、スウェーデン)を含むマイクロタイタープレートに置いた。ヌクレオチドは、完全自動化された、マイクロタイタープレートに基づくPSQ(登録商標)パイロシーケンシング(登録商標)装置を用いて調合した。配列決定の手順は、予め特定された4つの異なるヌクレオチドの添加における、プライマー鎖の段階的伸長により実施した。鋳型は、上述の3つの伸長プライマーとハイブリダイズさせた。配列決定の進行を、パイロシーケンシング(登録商標)タグソフトウェア(Pyrosequencing AB、Uppasala、スウェーデン)を用いてリアルタイムで観測し、サブタイピング(subtyping)は手動で行った。
【0110】
89人の異なる患者からのHCV陽性血液血清を集め、HCV RNAを、上述のように抽出した。cDNA合成の後、PCRを行い、5’URからの236塩基の長領域を増幅した。磁性ビーズにおけるPCR生成物の捕捉及び鋳型の調製の後に、シーケンシング−バイ−シンセシスを行った。
【0111】
結果
HCV型別方法の原理
上述のHCV型別方法の原理を、図1に概説する。このモデル系において、伸長プライマーは、ターゲット試料DNAにハイブリダイズし、これは磁性ビーズに固定化される。
【0112】
伸長プライマーは、可変領域に隣接する保存領域へ特異的にハイブリダイズする。ここでの実験では、HCVに対する3つの配列決定プライマーを用いた。HCVゲノムに対するプライマー及びそれらのアラインメント(alignment)を図2に示す。
【0113】
各プライマーの特異的伸長から得られるシグナルは、取込まれたヌクレオチドの数に直接関連する。それゆえ、得られた“指紋”は、可変領域の配列から理論的に推定され得る参照指紋と対比することにより、個体の遺伝子型を同定するために用いられ得る。可変領域の配列から理論的に算出された参照指紋を、図3に示す。これらは、図4に示す結果を型別するために用いられ得る。ここで、図4aはHCV1aについての指紋であり、図4bはHCV1bについての指紋であり、図4cはHCV2aについての指紋であり、図4dはHCV2bについての指紋であり、図4eはHCV3aについての指紋であり、図4fはHCV3bについての指紋である。それゆえ、本発明の方法を用いることにより、HCV感染の遺伝子型別をすることが可能となる。本発明の方法により、77の血清が分析された。35%がHCV1aに感染しており、29%がHCV1bに感染しており、21%がHCV2aに感染しており、4%がHCV2bに感染しており、1%がHCV3aに感染しており、10%がHCV3bに感染していた。イランから得た10の試料を分析し、以下の結果が得られた。すなわち、1a、1;1b、3;2a、3;3a、2;及び、3b、1であった。
【0114】
実施例2
RAAS系におけるSNPの型別
鋳型及びプライマー
ゲノムDNAは、標準的な方法により分離し、PCR鋳型は、以下の表に示す特定のプライマーと共に生じさせた。
【0115】
【表1】
Figure 0004945779
【0116】
以下の配列決定プライマーを、複合反応において用いた。
【0117】
Figure 0004945779
【0118】
PCR増幅
ターゲット核酸分子は、PCR(標準的PCR又は複合型PCRのいずれか)により増幅した。
【0119】
単一PCR:50μlのPCR反応を、各SNP特異的断片及び試料について用いた。全ての断片は、以下のプロトコールに従って、AmpliTaq Gold キット(PE バイオシステム)及び1.5mMのMgClを用いて増幅した(表1)。
【0120】
【表2】
Figure 0004945779
【0121】
5μlのゲノムDNA(2ng/μl)を45μlのPCR混合物に添加した。
【0122】
PCRサイクル条件:95℃で5分間、50x(95℃15秒、57℃30秒、72℃45秒)、72℃で5分間、4℃、である。
【0123】
4の増幅プライマーを用いる複合型PCR:50μlのPCR反応を、Eu4及びEu8のSNP特異的断片を用いて行った。全ての試料は、QuiagenからのHotStarTaq Master Mix キットを用い、以下のプロトコールに従って、最終濃度2.0mMまでQ−溶液及びMgClを添加し、増幅させた(表3)。
【0124】
【表3】
Figure 0004945779
【0125】
10μlのゲノムDNA(2ng/μl)を40μlのPCR混合物に添加した。
【0126】
PCRサイクル条件:95℃で15分間、35x(94℃30秒、55℃1分、72℃2分)、72℃で10分間、4℃、である。
【0127】
6の増幅プライマーを用いる複合型PCR:50μlのPCR反応を、Eu3、Eu6、及びEu10のSNP特異的断片を用いて行った。全ての試料は、QuiagenからのHotStarTaq Master Mix キットを用い、以下のプロトコールに従って、最終濃度2.0mMまでQ−溶液及びMgClを添加し、増幅させた(表4)。
【0128】
【表4】
Figure 0004945779
【0129】
10μlのゲノムDNA(2ng/μl)を40μlのPCR混合物に添加した。
【0130】
PCRサイクル条件:95℃で15分間、35x(94℃30秒、59℃1分、72℃2分)、72℃で10分間、4℃、である。
【0131】
試料調製
25μlのPCR生成物(複合型PCR生成物又はプールされた標準PCR生成物)は、10μlのDynabeads(登録商標、Dynal Biotech ASA、supra)(10μg/μl)及び25μlの2xBWバッファー(10mMのトリス−HCl PH7.57、2MのNaCl、1mMのEDTA、及び1%のトゥイーン20)の添加により、固定化した。15pmolの配列決定プライマーを、アニーリングバッファー(20mMのトリス−酢酸 PH7.51、5mMのMgAc)及び80℃で2分間培養された混合物に添加した。試料は、その後、室温に冷やされた。所望ならば、2.2μgのSSB(Amersham Pharmacia Biotech、supra)は、この時点で添加され得る。
【0132】
プライマー伸長
プライム化DNA鋳型は、パイロシーケンシング(登録商標)基質及び酵素(PSQ96(登録商標)プレート、Pyrosequencing AB、supra)を含むマイクロタイタープレートに置いた。ヌクレオチドは、完全自動化された、マイクロタイタープレートに基づくPSQ(登録商標)パイロシーケンシング(登録商標)装置を用いて調合した。配列決定の手順は、予め特定された4つの異なるヌクレオチドの添加における、プライマー鎖の段階的伸長により実施した。鋳型は、上述の伸長プライマーとハイブリダイズさせた。配列決定の進行を、パイロシーケンシング(登録商標)タグソフトウェアを用いてリアルタイムで観測した。
【0133】
結果
上述のHCV型別方法の原理を、図7に概説する。このモデル系において、伸長プライマーは、ターゲット試料DNAにハイブリダイズし、これは磁性ビーズに固定化される。
【0134】
ここでの実験では、“単一パターン”を示すために単独で、又は複合パターンを示すために組合せて、RAAS系に対する3つの配列決定プライマーを用いた。
【0135】
各プライマーの特異的伸長から得られるシグナルは、取込まれたヌクレオチドの数に直接関連する。それゆえ、得られた“指紋”は、可変領域の配列から理論的に推定され得る参照指紋と対比することにより、個体の遺伝子型を同定するために用いられ得る。SNPsの配列から理論的に算出された参照指紋を、図8に示す。8aはSNPのEu4(ACE G2215A)についての理論的アウトプット、8bはSNPのEu8(ATG C521T)についての理論的アウトプット、8cはSNPのEu4及びEu8の同時分析についての理論的アウトプットであり、多型の位置を枠で囲んである。8dはSNPのEu10(ATP T573C)についての理論的アウトプット、8eはSNPのEu6(ACE T3409C)についての理論的アウトプット、8fはSNPのEu3(ACE T1237C)についての理論的アウトプット、及び、8gはSNPのEu10、Eu6及びEu3の同時分析についての理論的アウトプットである。SNPのEu4、Eu10、Eu6は、ヘテロ接合体として示しており、SNPのEu8はホモ接合体G、及びSNPのEu3はホモ接合体Aとして示す。これらの“参照”パターンは、図9に示した結果を型別するために用いられ得る。9aはSNPのEu4(A/G)についての配列データであり、9bはSNPのEu8(G/G)についての配列データであり、及び、9cはSNPのEu4(A/G)とEu8(G/G)の組合せについての配列データ(これは、理論的アウトプット8cに関連する)であり、枠はSNPの位置を表している。9d、9e、9fは、それぞれ、SNPのEu10(C/T)、Eu6(C/T)、及びEu3(A/A)ついての配列データのプロットであり、そして、9gはこれら3つのSNPの組合せについての複合的な配列データであり、多型の位置を枠で囲んである。パターン9gは、図8gに関連する。
【0136】
実施例3
RAAS系における4つのSNP、すなわち、Eu7、Eu8(2つのSNPを含む)、及びEu11についてのトリプレックス(3重)遺伝子型別。
【0137】
鋳型及びプライマー
【表5】
Figure 0004945779
【0138】
配列決定プライマー
Figure 0004945779
【0139】
PCR増幅、試料調整、及びプライマー伸長反応は、実施例2と同様に実施したが、ただし、Eu11については、表2のプロトコールによって増幅した。
【0140】
【表6】
Figure 0004945779
【0141】
5μlのゲノムDNA(2ng/μl)を45μlのPCR混合物に添加した。
【0142】
Eu11についてのPCRサイクル条件:95℃で5分間、50x(95℃315秒、52℃30秒、72℃45秒)、72℃で5分間、4℃、である。
【0143】
結果
ここでの実験では、RAAS系に対する3つの配列決定(“伸長”)プライマーを用い、各プライマーの特異的伸長から得られるシグナルは、取込まれたヌクレオチドの数に直接関連する。理論的参照パターンを図10の示すが、これは図11に示す遺伝子型を決定するために用いることができる。10a、10b、及び10cは、SNPのEu8(G/G)、Eu7(C/C、T/T)、及びEu11(A/G)について得られた理論的アウトプットであり、図10dはそれらの複合の理論的アウトプットである。これは、図11に示す実際に得られた結果と相関がある。多型の位置は枠で囲んである。この個体の遺伝子型は、Eu8がG/G、Eu7がC/C及びT/T、及びEu11がA/Gである。パイログラム(pyrogram)は、上述のように(例えば、プライマーのアニールの後にSSBを添加することにより)減少され得る、いくつかのヌクレオチド取込みのバックグラウンドを示す。
【0144】
実施例4
ヒト凝固因子(ファクター)V、プロトロンビン、及びプラスミノーゲン活性化因子インヒビターにおけるSNP型別。
【0145】
イントロダクション
血栓症は、複雑な(多因子の)特性である。含まれる遺伝子は、一般には、感受性遺伝子であり、その相違は、点変異ではなく、多型の特殊な形態(対立遺伝子)である。疾患は、好ましくない組合せにおける特異的対立遺伝子の頻度の増加が存在することにより生じる。
【0146】
ここ10年から15年の間に、いくつかの遺伝子における変異が、静脈血栓症について発見されてきている。これには、ファクターV(FV)、プロトロンビン(FII)、及びプラスミノーゲン活性化因子インヒビター(PAI1)等の遺伝子が含まれる。
【0147】
凝固因子V(FV)及びプロトロンビン(FII)は、共に、ヒト凝固カスケードにおける必須の構成要素であり、これは最終的に欠失を食いとめる。プロトロンビンは、このカスケードの凝固酵素トロンビンへの転化の第1段階において、タンパク質分解的に開裂する。凝固因子Vは、プロトロンビンからトロンビンへの活性化を触媒する凝固因子Xに対する補因子として機能する。これらの遺伝子における点変異は、血栓症及び止血の過程における機能障害を引き起こし得る。そのようなものの1つは静脈血栓症であり、主にヨーロッパ系の人々を悩ませている。変異である、ファクターVライデン(FV:G1691A)及びG20210−A プロトロンビン変異体(FII:G20210A)は、静脈血栓症の発病における2つの最も重要な遺伝的危険因子である。このヨーロッパ人の傾向は、これら2つの変異体による特徴づけによって、ある程度まで説明されている。静脈血栓症に対するこれら2つの確立した危険因子に加えて、さらに、その他の遺伝的変異の役割についてなお検討されている(Martnelliら、1998年;De Stefanoら、1999年;Reesら、1999年;Hessnerら、1999年)。
【0148】
いくつかの前向き研究により、線維素溶解容量が血栓症の危険の重要な決定因子であることが立証されている。多くの研究により、心筋梗塞の生存者は血漿プラスミノーゲン活性化因子インヒビター−1(PAI−1)の濃度の増加によって、線維素溶解活性の機能障害を有することが確認されている。PAI1遺伝子のプロモーター領域における、単一のグアノシン挿入/欠失多型(一般に、4G/5Gと呼ばれる)は、血漿PAI−1活性度と結びつくことが明らかになっている(Dawsonら、1993年;Erikssonら、1995年)。
【0149】
プライマー
3組のPCRプライマーを設計した。ヒト凝固因子Vのエキソン10及びイントロン10にわたる断片は162bpの長さであり、エキソン14及びイントロン14にわたるプロトロンビン断片は211bpの長さであり、及び、PAI1のプロモーター領域における断片は152bpの長さである。各組における1のプライマーを、その後の磁性ビーズ/セファロースビーズへの固定化ができるように、ビオチニル化した。さらに、ファクターVライデンSNP、G20210Aプロトロンビン変異体、及びPAI1の4G/5G欠失に近接してハイブリダイズするように、3つの配列決定プライマーを設計した(図12参照)。
【0150】
PCRプライマー
Figure 0004945779
【0151】
配列決定プライマー
Figure 0004945779
【0152】
PCR増幅
50μlのPCR反応を、以下のプロトコールに従い、QuiagenからのHotStarTaq Master Mix キットを用いて行った(表5)。
【0153】
【表7】
Figure 0004945779
【0154】
5μlのゲノムDNA(2ng/μl)を45μlのPCR混合物に添加した。
【0155】
PCRサイクル条件:95℃で5分間、50x(95℃30秒、67℃45秒、72℃60秒)、72℃で5分間、4℃、である。
【0156】
試料調製及びプライマー伸長
実施例2に記載のように行った。
【0157】
結果
各SNP又は欠失を個別に型別することによって得られた理論的アウトプットを図13a、13b、及び13cに示す。これらはそれぞれ、4G/5G欠失(C/C)、SNPのG20210Aプロトロンビン(C/T)、SNPのG1691AファクターVライデン(A/G)についてのPAI1遺伝子型を表している。これら3つのSNPの複合分析についての複合的な理論的アウトプットを図13dに示し、ここには欠失又はSNPの位置も示している。図13e乃至13jは、その後実際のデータが得られた6つの遺伝子型について見込まれる理論的アウトプットを表している(図14参照)。図14に示すパイログラムは、これらの遺伝子のヒト個体群において存在し得る6つの可能な遺伝子型である。14aは遺伝子型PAI1 C/C、プロトロンビン C/C、及びファクターV G/Gから得られた結果であり、14bは遺伝子型PAI1 del/del、プロトロンビン C/C、及びファクターV A/A、14cは遺伝子型PAI1 del/C、プロトロンビン T/T、及びファクターV G/G、14dは遺伝子型PAI1 C/C、プロトロンビン T/C、及びファクターV G/G、14eは遺伝子型PAI1 C/del、プロトロンビン C/C、及びファクターV G/G、及び、14fは遺伝子型PAI1 C/C、プロトロンビン C/C、及びファクターV A/Gから得られた結果である。図14aは13eに、図14bは13fに、図14cは13gに、図14dは13hに、図14eは13iに、図14fは13jに、対応する。
【0158】
実施例5
CYP2D6のSNP分析
イントロダクション
CYP2D6遺伝子は、計9つの遺伝子ファミリーから成るシトクロムP450遺伝子スーパーファミリーの一員である。これらの遺伝子ファミリーの中の4つは、摂食により体内に入るほとんどの異質化学物質の代謝及び排出を担っている。ヒトCYP2D遺伝子座は、染色体22q13.1にマッピングされている(Goughら、1993年)。CYP2D6遺伝子は、酵素である、デブリソキン4−ヒドロキシラーゼをコード化し、それは、40以上の薬物、中でも、神経安定剤、抗鬱剤、抗不整脈剤、ベータ−ブロッカー、及びオピノイドの代謝に影響を与える。酵素は、活性度における極可変性(個人間及び異人種間)により特徴づけられる。CYP2D6の遺伝子型及と触媒機能は緊密に連関しており、そして、遺伝子型別は、個体の有用な薬物の決定についての重要な道具となり得る。50以上の対立遺伝子が同定されており、それらの多くは非機能性酵素をコード化している。対立遺伝子は、多くの変異、すなわち、SNPs、一塩基対の挿入又は欠失、完全遺伝子の欠失、及び、遺伝子重複、により定義される。本実施例において分析される配列は以下のものである。
【0159】
G1846T: GCCAACCACTCC G/T GT
G1934A: G/A GACGCCCCTTCG
T1795del: GCAG(T)GGGTGACCG
G1749C: G/C CTCCACCTTGCG
プライマー
【表8】
Figure 0004945779
【0160】
図15に、複合型方法についての、CYP2D6核酸断片におけるプライマーの局在性、すなわち、断片2162及び61118を示す。
【0161】
PCR増幅
ネスト化PCR増幅を行った。第1及びネスト化の50μlPCR反応のいずれにおいても、QuiagenからのHotStarTaq Master Mix キットを用い、以下のプロトコールに従って行った(表7)。
【0162】
【表9】
Figure 0004945779
【0163】
PCR 1.
1μlのゲノムDNA(10ng/μl)を49μlのPCR混合物に添加した。
【0164】
PCRサイクル条件:
PCR法、第1PCR(断片4142)
95℃で15分間、25x(95℃45秒、66℃45秒、72℃60秒)、72℃で5分間、4℃。
【0165】
PCR法、第2PCR
95℃で5分間、20x(95℃45秒、T45秒、72℃45秒)、72℃で5分間、4℃。
【0166】
、断片 61118は61℃
2162は63℃
試料調製
実施例2に記載のように行った。SSBは、ハイブリダイゼーションの後に、プライマー/鋳型混合物に添加した。0.55μgのSSBを断片2162へ、及び2.2μgを断片61118へ添加した。配列決定プライマーの量は、断片2162では、各15pmolであり、及び、断片61118では、プライマー182及び183が5pmol、プライマー143が70pmolであった。
【0167】
プライマー伸長
実施例2に記載のように行った。
【0168】
結果
複合型分析における断片61118についての2つの理論的アウトプットを図16a及び16bに示す。16aは遺伝子型G1934A(A/G)、G1749C(C/G)、T1795del(欠失無し)、及びG1846T(T/G)を示しており、16bはG1795delがT残基の欠失を示す点で異なっている。
【0169】
図17は、パイログラムより立証された遺伝型からの実際の結果であり、G1934A(G/G)、G1749C(G/G)、T1795del(欠失無し、従ってT/T)、及びG1846T(G/G)である。これは図16に示した遺伝子型とは異なっている。
【0170】
これは複数の伸長プライマーを用いて、核酸の1の断片における複数のSNP及び欠失を型別可能であることを実証するものである。
【0171】
実施例6
血清試料
HCV陽性の退役軍人からの72の血清を、スタンフォード退役軍人病院から入手した。5のHCV陽性の血清をイランから入手した。
【0172】
オリゴヌクレオチドの合成及び精製
オリゴヌクレオチドであるHCV−PCR−OUTF(5’−CCCTGTGAGGAACTWCTGTCTTCACGC)、HCV−PCR−OUTR(5’−GCTCATGRTGCACGGTCTACGAGACCT)、HCV−PCR−INF(5’−TCTAGCCATGGCGTTAGTAYGAGTGT)、BHCV−PCR−INR(5’−ビオチン−CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT)、HCV−SEQF1(5’−GGAACCGGTGAGTACACCGGAAT)、HCV−SEQF2(5’−GACYGGGTCCTTTCTTGGA)、HCV−SEQF3(5’−ATTTGGGCGTGCCCCCGC)は、全て、MWG Biotech社(ハイポイント、NC州、米国)により合成され、HPLCで精製されたものである。
【0173】
RNAの抽出、cDNAの合成、及び増幅
RNAは、50μlの血清から抽出した。cDNAは、BHCV−PCR−INR及びHCV−PCR−INFを用いて異なる患者から得たHCVcDNAにおいて、AMV逆転写酵素を用いて合成、270塩基の長さの生成物を生じた。
【0174】
ビオチニル化PCR生成物は、ストレプタビジンでコートされた超常磁性ビーズであるDYNABEADS(登録商標)M280−ストレプタビジン(Dynal A.S.、オスロ、ノルウェー)上に固定化した。1本鎖DNAは、固定化PCR生成物を0.1M NaOH中で3分間の培養の後に、上澄みを除去することにより得た。5pmolの配列決定プライマーHCV−SEQF1、HCV−SEQF2、及びHCV−SEQF3を、固定化ストランドとハイブリダイズさせた。
【0175】
プライマー伸長反応
プライム化DNA鋳型は、0.5μgのSSB(Amersham Pharmacia Biotech、米国)、及びパイロシーケンシング(登録商標)基質(www.pyrosequencing.com、Pyrosequencing AB、Uppasala、スウェーデン)を含むマイクロタイタープレートに置いた。及び、酵素は、完全自動化された、マイクロタイタープレートに基づくPSQ(登録商標)パイロシーケンシング(登録商標)装置を用いて調合した。配列決定の手順は、予め特定された4つの異なるヌクレオチドの添加における、プライマー鎖の段階的伸長により実施した。鋳型は、上述の3つの伸長プライマーとハイブリダイズさせた。配列決定の進行を、パイロシーケンシング(登録商標)SNPソフトウェア(Pyrosequencing AB、Uppasala、スウェーデン)を用いてリアルタイムで観測し、サブタイピング(subtyping)は手動で行った。
【0176】
結果
型別方法の原理
上述のHCV型別方法の原理を、図1に概説する。このモデル系において、伸長プライマーは、ターゲット試料DNAにハイブリダイズし、これは磁性ビーズに固定化される。
【0177】
伸長プライマーは、可変領域に隣接する保存領域へ特異的にハイブリダイズする。
【0178】
各プライマーの特異的伸長から得られるシグナルは、取込まれたヌクレオチドの数に直接関連する。それゆえ、得られた“指紋”は、可変領域の配列から理論的に推定され得る参照指紋と対比することにより、個体の遺伝子型を同定するために用いられ得る。可変領域の配列から理論的に算出された参照指紋を、図3に示す。これらは、図4に示す結果を型別するために用いられ得る。ここで、図4aはHCV1aについての指紋であり、図4bはHCV1bについての指紋であり、図4cはHCV2aについての指紋であり、図4dはHCV2bについての指紋であり、図4eはHCV3aについての指紋であり、図4fはHCV3bについての指紋である。それゆえ、本発明の方法を用いることにより、HCV感染の遺伝子型別をすることが可能となる。本発明の方法により、77の血清が分析された。35%がHCV1aに感染しており、29%がHCV1bに感染しており、21%がHCV2aに感染しており、4%がHCV2bに感染しており、10%がHCV3aに感染しており、1%がHCV3bに感染していた。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、プライマー伸長反応において、同時に複数のプライマー(複合型)を用いる核酸の型別のための1の方法を概説したものである。
【図2】 図2は、C型肝炎ウイルス(HCV)の7つの遺伝子型における5’非翻訳領域(5’−UTR)の配列を示すものである。ここで、矢印は増幅プライマー及び伸長プライマーの位置を示し、太字のヌクレオチドはプライマー伸長反応により配列決定される可変部位を示している。
【図3】 図3は、検討されるHCVの7つの遺伝子型について得られるであろう理論的な見取り図(trace)である(発生する光(ヌクレオチドの取込みを示唆する)対時間(及びヌクレオチド添加))。理論上において用いた実験条件及び伸長プライマーは、実施例1に記載されている。3つの別個の伸長プライマーを、理論上、プライマー伸長反応混合物において同時に用いた。無機ピロリン酸PPiは、ヌクレオチドが取込まれた場合に反応を触媒するDNAポリメラーゼにおいて放出される。PPiは、ATPスルフリラーゼ及びルシフェラーゼを用いる共役酵素反応により、観測される。結果として生じる光は、CCD検出器又はルミノメーターにより測定される。
【図4】 図4は、異なるHCV遺伝子型を含む6つの試料について得られた図である(発生する光(ヌクレオチドの取込みを示唆する)対時間(及びヌクレオチド添加))。実験条件及び用いたプライマーは、実施例1に記載されている。伸長するプライマーへのヌクレオチドの取込みによりPPiの放出が起こり、これは、ATPスルフリラーゼ及びルシフェラーゼを用いる共役酵素反応により検出される。伸長の成功の結果として生じる光は、CCDカメラ又はルミノメーターにより測定される。
図4aは、HCV遺伝子型1aについて得られた図である。
図4bは、HCV遺伝子型1bについて得られた図である。
図4cは、HCV遺伝子型2aについて得られた図である。
図4dは、HCV遺伝子型2bについて得られた図である。
図4eは、HCV遺伝子型3aについて得られた図である。
図4fは、HCV遺伝子型3bについて得られた図である。
【図5】 図5は、ACE遺伝子(アンギオテンシン転換酵素)からのSNP Eu6についての、3つの可能なプライマー結合位置を示すものである。図5aは、SNPの位置から4ヌクレオチド離れて3’末端で鋳型と結合するプライマー(箱で囲まれたヌクレオチド)を示しており、図5bは、SNPの位置から5ヌクレオチド離れて3’末端で鋳型と結合するプライマーを示しており、図5cでは、プライマーはSNPの位置から10ヌクレオチド離れて結合している。全ての図において、SNP部位における2つの可能な変異体を示す(鋳型鎖におけるG/A)。
【図6】 図6は、2つのSNP位置に対する、パイロシーケンシング(登録商標)反応からの理論的アウトプットを示す。理論的アウトプットは、反応に投入されたヌクレオチド対ピーク高さ(パイロシーケンシング(登録商標)反応から放出される光と相関する)として、プロットされている。図6aは、G/ACAGの配列決定に対するアウトプットであり、この場合、プライマーは、多型位置に隣接するであろう。示した理論的アウトプットは、ヘテロ接合体に対するものである(すなわち、個体は、SNP Aの1のコピー及びSNP Gの1のコピーを有する)。図6bは、TGAAC/TAに対する理論的アウトプットである。従って、プライマーは、SNPから4ヌクレオチド離れて結合している。また、示したパターンは、ヘテロ接合個体(C/T)の結果である。図6cは、1のプライマー伸長反応混合物における2の個別の配列決定反応についての蓄積結果である。
【図7】 図7は、単純化された複合型分析を示すものであり、ここで、伸長プライマーは、それらの3’末端が多型の位置から異なる距離の位置するように設計される。これは、決定されるヌクレオチドの添加の“知的な”順番の設計を可能にし、SNP(Xとして示す)が独立に配列決定されることを可能にする。従って、伸長プライマーは、投入の順番に対応して設計されるべきである。
【図8】 図8は、RAAS系に存在する5つのSNP、すなわち、Eu4(ACE G2215A)、Eu8(ATG C521T)、Eu10(ATP T573C)、Eu6(ACE T409C)、及びEu3(ACE T1237C)、に対する理論的アウトプットである。理論的アウトプットは、図7と同様にプロットされている。伸長プライマーは、Eu4について分析される配列がG/A CTGCCTG、EU8についてはCACCA/G TGG、Eu10についてはC/TCCGATAGGGC、Eu6についてはACTTC/TG、及びEu3についてはAGACA/GGGCであるように位置する。
図8a及び図8bは、SNPであるEu4及びEu8が、標準的な1のプライマーのみの反応において型別される場合に得られると見込まれる理論的アウトプットである。SNPヌクレオチド取込みの位置を枠で囲んでいる。
図8aは、個体がヘテロ接合体(A/G)の場合の理論的アウトプット、図8bは、個体がホモ接合体である場合に見込まれるアウトプットである。図8cは、2つのSNPが、同じ反応(複合型)において同時に配列決定される場合に見込まれるアウトプットである。多型の位置を枠で囲んでいる。
図8d、8e、及び8fは、Eu10、Eu6、及びEu3をそれぞれ独立に配列決定することにより得られる理論的結果である。SNPのEu10及びEu6はヘテロ接合体(それぞれ、C/T及びC/T)として、Eu6はホモ接合体(A/A)として示してある。3つのSNPについての理論的パターンは図8gにおいて結合され、SNPの位置は枠で囲んである。
【図9】 図9は、得られた結果を図として示している(発生する光(ヌクレオチドの取込みを示唆する)対時間、及び異なる鋳型とプライマーの組合せを含む7つの反応に対するヌクレオチドの取込み)。実験条件及び用いられるプライマーは、実施例2に記載されている。伸長するプライマーへのヌクレオチドの取込みによりPPiの放出が起こり、これは、ATPスルフリラーゼ及びルシフェラーゼを用いる共役酵素反応により検出される。伸長の成功の結果として生じる光は、CCDカメラ又はルミノメーターにより測定される。
図9aは、Eu4について得られた図である。
図9bは、Eu8について得られた図である。
図9cは、同時に配列決定されたEu4及びEu8について得られた図である。
図9dは、Eu10について得られた図である。
図9eは、Eu6について得られた図である。
図9fは、Eu3について得られた図である。
図9gは、同時に配列決定されたEu10、Eu6、及びEu3について得られた図である。
【図10】 図10は、RAAS系に存在するEu8、Eu7、及びEu11に対する理論的アウトプットである。理論的アウトプットは、図7と同様にプロットされている。分析される配列は、EU8についてはCACCA/GTGGACAG、Eu7についてはT/CGGCCGGGTCACGAG、及びEu11についてはGAGCA/GTTAGである。それゆえ、断片Eu7は2つの多型部位を含む。
図10aは、Eu8(G/G)についての理論的図である。
図10bは、Eu7(C/C及びT/T)についての理論的図である。
図10cは、Eu11(A/G)についての理論的図である。
図10dは、Eu7、Eu8、及びEu11についての複合型理論的図である。
【図11】 図11は、実施例3で定義される複合反応について得られた結果を図(発生する光対ヌクレオチド添加)として示している。多型の位置を枠で囲み、参照ピーク(矢印)を示している。型別された個体についての遺伝子型は、Eu8がG/G、Eu7がC/C及びT/T、及びEu11がA/Gである。
【図12】 図12は、3つの別個の核酸断片である、プラスミノーゲン活性化因子インヒビターI遺伝子、プロトロンビン遺伝子、及びファクターV遺伝子、についてのプライマー設計を示す概略図である。の記号がついた矢印は配列決定プライマーに対応し、外側の矢印はPCRプライマーに対応する。ビオチン化プライマーは、Bで示してある。目的の遺伝子における多型に位置は、Xの記号が付けられている。
【図13】 図13は、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1(4G/5G 欠失)、プロトロンビン(G20210A)、及びファクターV(G169A)に対するパイロシーケンシング(登録商標)反応から見込まれるアウトプットである。理論的アウトプットは、図7と同様にプロットされている。PAI1について分析された配列は、(C)ACGTGであり、プロトロンビンについてはGCTC/TGCTGA、及びファクターVについてはAGGCA/GAGGAAである。
図13aは、PAI1(C/C、欠失無し)についての理論的図である。
図13bは、プロトロンビン(C/T)についての理論的図である。
図13cは、ファクターV(A/G)についての理論的図である。
図13dは、1の複合反応における3つのSNPの組合せについての理論的図である。
図13eは、遺伝子型PAI1 C/C(欠失無し)、プロトロンビンC/C、及びファクターV G/Gについての理論的図である。
図13fは、遺伝子型PAI1の2重欠失(double deletion)、プロトロンビンC/C、及びファクターV A/Aについての理論的図である。
図13gは、遺伝子型PAI1 del/C(欠失無し)、プロトロンビンT/T、及びファクターV G/Gについての理論的図である。
図13hは、遺伝子型PAI1 C/C(欠失無し)、プロトロンビンT/C、及びファクターV G/Gについての理論的図である。
図13iは、遺伝子型PAI1 C/del、プロトロンビンC/C、及びファクターV G/Gについての理論的図である。
図13jは、遺伝子型PAI1 C/C(欠失無し)、プロトロンビンC/C、及びファクターV A/Gについての理論的図である。
【図14】 図14は、6つの反応について得られた結果を図(発生する光対ヌクレオチド添加)として示している。物質と方法は実施例4に記載されている。
図14aは、遺伝子型PAI1 C/C(欠失無し)、プロトロンビンC/C、及びファクターV G/Gについて得られた図であり、図13eに示した理論的パターンに対応するものである。
図14bは、遺伝子型PAI1の2重欠失、プロトロンビンC/C、及びファクターV A/Aについて得られた図であり、図13fに示した理論的パターンに対応するものである。
図14cは、遺伝子型PAI1 del/C、プロトロンビンT/T、及びファクターV G/Gについて得られた図であり、図13gに示した理論的パターンに対応するものである。
図14dは、遺伝子型PAI1 C/C(欠失無し)、プロトロンビンT/C、及びファクターV G/Gについて得られた図であり、図13hに示した理論的パターンに対応するものである。
図14eは、遺伝子型PAI1 C/del、プロトロンビンC/C、及びファクターV G/Gについて得られた図であり、図13iに示した理論的パターンに対応するものである。
図14fは、遺伝子型PAI1 C/C(欠失無し)、プロトロンビンC/C、及びファクターV A/Gについて得られた図であり、図13jに示した理論的パターンに対応するものである。
【図15】 図15は、CYP2D6遺伝子についての、プライマーの局在性を示すものである。特に強調された多型を有する遺伝子の断片を、当該図の上部に見ることができる。ネスト化PCRプライマーにより増幅された61118及び2162断片は、図の下部にある。複合化反応において用いられる伸長プライマーを、61118及び2162断片の上に示す。
【図16】 図16は、CYP2D6遺伝子の2つの遺伝子型について得られた理論的アウトプットを表している。図は、上述のようにして算出した。
図16aは、G1934A(A/G)、G1749C(C/G)、T1795del(欠失無し)、及びG1846T(T/G)について得られた理論的アウトプットである。
図16bは、G1934A(A/G)、G1749C(C/G)、T1795del T/欠失、及びG1846T(T/G)について得られた理論的アウトプットである。
【図17】 図17は、実施例5から得られた結果を図(発生する光対添加されたヌクレオチド)として示している。実験条件は、実施例5に記載されている。型別された個体の遺伝子型は、G1934A G/G、G1749C G/G、T1795delT/T(欠失無し)、及びG1846T G/Gである。また、この遺伝子型についての理論的アウトプットのプロットを示す。

Claims (14)

  1. 1以上の核酸分子を型別する方法であって、当該方法が2以上の伸長プライマーを同時に前記核酸分子へハイブリダイズさせてから、プライマー伸長反応を行い、各プライマーが前記核酸分子における相違する予め定められた部位で結合し、及びシーケンシング−バイ−シンセシス法(sequencing−by−synthesis)によりヌクレオチドの取込みパターンを決定し、前記核酸分子を型別するために1以上の参照パターンと任意に比較される前記核酸分子のテストパターンを得ること、
    を含む、方法。
  2. 核酸が2以上の可変部位を含む、請求項1に記載の方法。
  3. ターゲット核酸内における複数の可変部位についての型別の情報を得るための方法であって、2以上の伸長プライマーを同時に前記核酸分子へハイブリダイズさせてからプライマー伸長反応を行い、各プライマーが前記ターゲット核酸分子における相違する予め定められた部位で結合し、シーケンシング−バイ−シンセシス法により前記プライマー伸長反応から決定されたヌクレオチドの取込みパターンが、前記可変部位についての型別の情報を提供すること、
    を含む当該方法。
  4. ヌクレオチドが予め定められた順番で順次に反応混合物に添加される、請求項1乃至3のいずれか1に記載の方法。
  5. ヌクレオチドの取込みが定量的に測定される、請求項1乃至4のいずれか1に記載の方法。
  6. ヌクレオチドの取込みが1の可変部位で起こる場合に、その他の可変部位ではヌクレオチドの取込みが起こらない、請求項2乃至5のいずれか1に記載の方法。
  7. プライマーが鋳型核酸にアニールされた後に、1本鎖結合タンパク質が反応混合物に添加される、請求項1乃至のいずれか1に記載の方法。
  8. プライマー伸長反応が同時に起こる、請求項1乃至のいずれか1に記載の方法。
  9. 3以上の可変部位が型別される、請求項2乃至のいずれか1に記載の方法。
  10. 3以上の伸長プライマーが用いられ、そして3以上のプライマー伸長反応が同時に又は前記プライマーから逐次に行われる、請求項2乃至のいずれか1に記載の方法。
  11. 微生物種、サブタイプ又は遺伝子型を同定し、又は病気又は疾患、又は病気又は疾患になり易い傾向、又はそれらの治療に対する効果と関連する遺伝的変異を個人において同定する方法であって、当該方法が、2以上の伸長プライマーを同時に前記微生物又は前記個人由来の前記核酸分子へハイブリダイズさせてからプライマー伸長反応を行い、各プライマーが前記核酸分子における相違する予め定められた部位で結合し、シーケンシング−バイ−シンセシス法により前記プライマー伸長反応から決定されたヌクレオチドの取込みパターンによって前記微生物種、サブタイプ又は遺伝子型を同定し、又は個人において遺伝的変異を同定することが可能となること、を含む当該方法。
  12. 請求項1乃至11のいずれか1に記載の方法であって、前記ヌクレオチドの取込みパターンは、前記プライマー伸長と同時に、周期的又は連続的に前記プライマー伸長反応に異なるヌクレオチドを加え、及び加えたヌクレオチドが取込まれたか否かを検出することにより決定される、前記方法。
  13. 請求項1乃至12のいずれか1に記載の方法であって、前記ヌクレオチドの取込みパターンは、ピロリン酸の放出を検出することにより決定される、前記方法
  14. 請求項13に記載の方法であって、前記ピロリン酸の放出はATP酵素スルフリラーゼ及びルシフェラーゼを用いて検出される、前記方法。
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