JP4945133B2 - ４−フェノキシキナゾリン誘導体放射性化合物 - Google Patents

Description

本発明は、新規な４−フェノキシキナゾリン誘導体、及びこれを含む、腫瘍疾患をイメージングによって検出する放射性薬剤や、体内から腫瘍細胞にダメージを与えうる内用放射線治療薬剤等の医薬に関する。

チロシンキナーゼは、細胞の分化と増殖などの細胞内のシグナル伝達機構に関与し、各種成長因子の結合シグナルを細胞内に伝達する開始因子として重要な役割を果たす酵素である。近年の研究からチロシンキナーゼの遺伝子の一部が変異し、癌化を誘発することが明らかとなっている（非特許文献１）。また、多くの癌において、各種成長因子の結合とは無関係にその活性上昇が認められている（非特許文献２、非特許文献３）。チロシンキナーゼは受容体型と非受容体型に分類され、その阻害剤に抗癌剤としての期待が持たれている（非特許文献４、非特許文献５）。

受容体型チロシンキナーゼの一つである上皮由来増殖因子受容体チロシンキナーゼ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ、ＥＧＦＲ−ＴＫ）は、胃癌、食道癌、喉頭癌、大腸癌、膀胱癌、卵巣癌、甲状腺癌、脳腫瘍などのほとんどの上皮系癌において多量に発現し、その活性の上昇が確認されている（非特許文献６、非特許文献７）。従って、ＥＧＦＲ−ＴＫ阻害剤は腫瘍治療剤として有用であると考えられる。

近年、ＥＧＦＲ−ＴＫを標的とした阻害剤が次々と開発された。第一世代のチロシンキナーゼ阻害剤は、Ｇａｚｉｔらにより開発されたチロホスチン誘導体である（非特許文献８）。チロホスチン誘導体は優れたＥＧＦＲ−ＴＫ阻害剤として期待されたが、その後、さらに構造活性相関の研究が進みＰＤ１５３０３５が開発された（非特許文献９）。現在、ＰＤ１５３０３５の誘導体であるＺＤ１８３９（市販名イレッサ）が、新しい作用機序の抗癌剤として認可を受け、臨床使用が開始されている（非特許文献１０）。

一方、ＥＧＦＲ−ＴＫの異常な活性上昇は癌化の初期においても見られ、癌の早期発見に有用であると考えられる。従ってＥＧＦＲ−ＴＫは癌の特性診断を可能とする分子イメージング薬剤の標的としての条件を満たしていると考えられる。このようなＥＧＦＲ−ＴＫを標的とした薬剤を放射性化合物とし、イメージング剤へと応用する試みとして４−アニリノキナゾリン骨格を持つ化合物（特許文献１）及び４−（フェニルアミノ）キナゾリン骨格を持つ化合物（特許文献２）があるが、これらはインビトロにおけるＥＧＦＲ−ＴＫ阻害活性は検討されているものの、インビボでの検討はなされておらず、生体内での安定性や、有効性については不明であった。
特表２００３−５００４５０ 特表２００４−５２５９１９ 蛋白質 核酸 酵素，４２，１４６７〜１４６９（１９９７） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６６，３１５〜３２１（１９９６） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６４，２９１〜２９７（１９９６） Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，３４８２〜３４８７（１９９５） Ｎａｔｕｒｅ，３７９，６４５〜６４８（１９９６） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８３，５１４１〜５１４４（１９８６） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０１，３４７〜３５５（１９９１） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０１，３４７〜３５５（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５，１０９３〜１０９５（１９９４） Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１９，１７７ａ，（２０００）

本発明はＥＧＦＲ−ＴＫを標的として結合する放射性化合物を有効成分として含有する腫瘍イメージング剤や、体内から癌細胞にダメージを与えうる内用放射線治療薬剤を提供することを目的とする。

本発明者は、ＥＧＦＲ−ＴＫに対して阻害活性を有する化合物について、新規な構造として４−フェノキシキナゾリン誘導体に着目し、この誘導体の放射性ヨウ素化合物を合成した。その作用を検討したところ、インビトロ実験においてＥＧＦＲ−ＴＫに対する高い阻害活性が認められ、担癌マウスにおけるインビボ体内分布実験において癌に特異的な集積、並びに高い癌対組織比が達成された。

また、ＥＧＦＲ−ＴＫ発現量の異なる複数の腫瘍細胞株の検討から、ＥＧＦＲ−ＴＫ発現量に応じた集積を示すことが明らかになった。これらの結果から、腫瘍疾患の画像化、手術や薬剤による治療効果の判定及び治療に有用であることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、一般式（１）

（式中、Ｒ^１は、放射性ヨウ素原子を示す。）で表される放射性化合物、これを含有する医薬、及びその製造法を提供するものである。

別の表現をとる場合、本発明は、
（１）一般式（１）（式中、Ｒ^１は放射性ヨウ素原子を示す。）で表される放射性化合物、
（２）放射性ヨウ素原子が、Ｉ−１２３、Ｉ−１２４、Ｉ−１２５及びＩ−１３１から選ばれたものである上記放射性化合物、
（３）上記（１）、（２）いずれか１項に記載の放射性化合物を含有する医薬、
（４）画像診断用イメージング剤である上記（３）記載の医薬、
（５）腫瘍疾患領域の画像診断用イメージング剤である上記（４）記載の医薬、
（６）シングルフォトン断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）用の腫瘍疾患領域の画像診断用イメージング剤である上記（５）記載の医薬、
（７）ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の腫瘍疾患領域の画像診断用イメージング剤である請求項５記載の医薬、
（８）内用放射線治療薬である上記（３）記載の医薬、
（９）一般式（２）
（式中、Ｒ^２は、ヨウ素原子、トリアルキルスズ基またはトリアルキルシリル基を示す。）で表される４−フェノキシキナゾリン誘導体、
（１０）一般式（２）（式中、Ｒは、ヨウ素原子、トリアルキルスズ基またはトリアルキルシリル基を示す）で表される４−フェノキシキナゾリン誘導体にアルカリ金属放射性ヨウ素化物を反応させることを特徴とする一般式（１）（式中、Ｒ^１は、放射性ヨウ素原子を示す。）で表される放射性ヨウ素化合物の製造法、
である。

４−フェノキシキナゾリン骨格を持つ本発明の放射性化合物（１）は、ＥＧＦＲ−ＴＫを標的とする、腫瘍の画像診断及び治療に有用である。

一般式（１）中、放射性ヨウ素原子としては、ＳＰＥＣＴ装置を用いた組織のイメージングに適したＩ−１２３、イメージングとともに内用放射線治療にも適したＩ−１３１が望ましいが、その他に、基礎実験に広く用いられているＩ−１２５、ポジトロン放出核種であるが医療施設内に小型サイクロトロンを設置しなくとも供給が可能なＩ−１２４等も使用可能である。

本発明の放射性化合物（１）は、例えば次の反応式に従って製造される。

（式中、Ｒ^１は放射性ヨウ素原子、Ｒ^２はヨウ素原子、トリアルキルスズ基またはトリアルキルシリル基を示す。）

すなわち、一般式（２）で表される４−フェノキシキナゾリン誘導体にアルカリ金属放射性ヨウ化物を反応させることにより一般式（１）で表される放射性化合物が製造される。

一般式（２）中、Ｒ^２で示されるトリアルキルスズ基としては、トリ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）スズ基が挙げられ、トリブチルスズ基が特に好ましい。トリアルキルシリル基としては、トリ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）シリル基が挙げられ、トリメチルシリル基が特に好ましい。

一般式（２）の化合物は、例えば次の反応式に従って製造することができる。

（式中、Ｒ^２ａは、ヨウ素原子を示し；Ｒ^２ｂは、トリアルキルスズ基又はトリアルキルシリル基を示す。）

すなわち、モルフォリン（３）に１−ブロモ−３−クロロプロパンを反応させて化合物（４）を得られる。また、６，７−ジエトキシキナゾリン−４（３Ｈ）−オン（５）にメチオニンを反応させ、化合物（６）とし、続いて、６位の水酸基のアセチル保護化を行い、化合物（７）を得られる。さらに化合物（７）をクロル化して化合物（８）とし、続いて、３−ヨードフェノール存在下で４位のフェノキシ化を行うことで化合物（９）が得られる。続いて、化合物（９）と化合物（４）を反応させることで化合物（２ａ）を得られる。得られた化合物（２ａ）をトリアルキルスズ化又はトリアルキルシリル化することにより化合物（２ｂ）が得られる。

化合物（２）の放射性ヨウ素化に用いられるアルカリ金属放射性ヨウ化物としては、放射性ヨウ素のナトリウム化合物、放射性ヨウ素のカリウム化合物等が挙げられる。

化合物（２）とアルカリ金属放射性ヨウ化物との反応は、化合物（２）が化合物（２ａ）である場合と、化合物（２ｂ）である場合とで異なる。すなわち、化合物（２ａ）とアルカリ金属放射性ヨウ化物との反応は、酸性条件下で加熱することにより、非放射性ヨウ素原子が放射性ヨウ素原子に変換される。化合物（２ｂ）とアルカリ金属放射性ヨウ化物との反応は、酸性条件下で反応させ、さらに酸化剤を反応させることにより行なわれる。酸化剤としてはクロラミン−Ｔ、過酸化水素水、過酢酸等が用いられる。

得られた放射性化合物（１）を放射性医薬品として用いる場合には、未反応の放射性ヨウ素イオン及び不溶性の不純物を、メンブランフィルター、種々の充填剤を充填したカラム、ＨＰＬＣ等により精製することが望ましい。

かくして得られた本発明の放射性化合物（１）は、優れたＥＧＦＲ−ＴＫ阻害活性を有し、また、ＥＧＦＲ発現腫瘍に特異的に集積することから、腫瘍治療薬又は腫瘍診断薬として有用である。例えば７−エトキシ−４−（３−［^１２５Ｉ］ヨードフェノキシ）−６−（３−モルフォリノプロポキシ）キナゾリン（以下（［^１２５Ｉ］−ＰＹＫと略す。この非放射性ヨード体をＰＹＫと略す）を、ＥＧＦＲ−ＴＫの亢進した癌細胞を移植した担癌モデルマウスに尾静脈より投与すると、［^１２５Ｉ］ＰＹＫは、投与１時間後で癌に４．４％集積し、その後、投与６時間後で３．６％、投与１２時間後で１．７％、投与２４時間後で１．５％と投与後早期における癌への高い取込みとその後の緩やかな消失が確認された。また、他の組織からは、癌よりも早い消失が認められた。その結果、画像コントラストの指標である癌対組織比が上昇した。［^１２５Ｉ］ＰＹＫの癌対血液、筋肉比は、投与１時間後で６．８、４．６、投与２４時間後で、５７．０、４５．５と良好な値を示した。一方、主要な組織に対する癌対組織比は、投与１時間後ではいずれも低い値であったが、投与２４時間後では、癌対肝臓、癌対腎臓、癌対肺比がそれぞれ３．０、４．３、８．５と良好な値を示した。この様に［^１２５Ｉ］ＰＹＫは、所期の目的である癌集積量の増加と長時間にわたる癌集積の保持に成功し、癌診断薬剤として基本的性質を持つことが確認された。

本発明放射性化合物（１）を放射性薬剤として用いる場合には、医薬用の担体として、アスコルビン酸等の安定化剤；酸、塩基等のｐＨ調整剤；リン酸緩衝液等の緩衝剤；生理食塩液等の等張剤等を利用することができる。

本発明の放射性薬剤は、静脈注射による投与が最適であるが、その他一般的な非経口的手段によって投与が可能である。その投与量は、患者の体重、年齢、性別及びＳＰＥＣＴ装置に代表される測定機器等の諸条件によって適宜決められる。一般的に、診断薬の場合、Ｉ−１２３の放射能として３７ＭＢｑ〜３７０ＭＢｑ、治療薬の場合Ｉ−１３１の放射能として３７ＭＢｑ〜３７００ＭＢｑの範囲である。

次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制約されるものではない。

実施例１（ＰＹＫの合成）
３−モルフォリノプロピルクロライド（４）の合成
１−ブロモ−３−クロロプロパン（３．６ｇ、２２．９ｍｍｏｌ）をベンゼン（１０ｍｌ、無水）に加え、次いでモルフォリン（３、３．０ｇ、３４．４ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。その後、室温で１時間撹拌した後、３時間還流（１２０℃）した。冷後、析出結晶をろ過し、結晶をメチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で洗った。有機層を３Ｍ 塩酸（２０ｍｌ）で抽出後、４０％水酸化ナトリウム水溶液でアルカリに転溶し、ＭＴＢＥ（３０ｍｌ）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒を減圧留去し、残渣をメタノールを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製し、化合物（４）を無色の液状物として得た。

Ｙｉｅｌｄ；４２．８％ ＭＳ；ｍ／ｚ １６３ ｆｏｕｎｄ １６３
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）；３．７１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，４Ｈ，ｍｏｌｐｈｏｌｉｎｏ），３．６１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ，ｐｒｏｐｙｌ），２．４８（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ，ｐｒｏｐｙｌ），２．４４（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，４Ｈ，ｍｏｌｐｈｏｌｉｎｏ），１．９５（ｍ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ，ｐｒｏｐｙｌ）

７−エトキシ−６−ヒドロキシキナゾリン−４（３Ｈ）−オン（６）の合成
化合物（５）６，７−ジエトキシキナゾリン−４（３Ｈ）−オン（９．２ｇ、３９．４ｍｍｏｌ）をメタンスルホン酸（６０ｍｌ）に少量ずつ溶解した。次いで、Ｄ，Ｌ−メチオニン（７．０５ｇ、４７．３ｍｍｏｌ）を加え、４時間還流（１００℃）した。その後、反応液を室温まで冷却し、氷冷水（２００ｍｌ）を加え、氷浴中で４０％水酸化ナトリウム水溶液で中和した。析出した結晶をろ取水洗し、さらに少量のメタノールで洗い乾燥させ化合物（６）を得た。これは精製せずに次の実験に用いた。

６−アセトキシ−７−エトキシキナゾリン−４（３Ｈ）−オン（７）の合成
化合物（６）（７．３ｇ、３５．４ｍｍｏｌ）をピリジン（６ｍｌ）に加え、さらに無水酢酸（４０ｍｌ）を加えて３時間還流（１００℃）した。反応液を室温まで冷却し、氷冷水（１５０ｍｌ）に注ぎ、析出結晶をろ取した。メタノールから再結晶して化合物（７）を得た。

Ｙｉｅｌｄ；６１．８％ ｍ．ｐ．；２５８〜２６０℃ ＭＳ；ｍ／ｚ ２４８ ｆｏｕｎｄ；２４８
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）；８．０７（ｓ，１Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），７．７３（ｓ，１Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），７．２４（ｓ，１Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），４．１９（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_３ＣＨ_２Ｏ），２．３０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ_３ＣＯ），１．３３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３ＣＨ_２Ｏ）

６−アセトキシ−４−クロロ−７−エトキシキナゾリン（８）の合成
化合物（７）（２．０ｇ、８．０６ｍｍｏｌ）を塩化ホスホリル（３０ｍｌ）に加え、３時間還流（１２０℃）した。反応液を室温まで冷却した後、氷浴中で氷冷水（２００ｍｌ）中に投じ、クロロホルムで抽出した。有機層を１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（２００ｍｌ）で２回水洗後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣を酢酸エチルエステルを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製し、化合物（８）を得た。

Ｙｉｅｌｄ；８９．６％ ｍ．ｐ．；１１０〜１１４℃ ＭＳ；ｍ／ｚ ２６６ ｆｏｕｎｄ ２６６
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）；８．９３（ｓ，１Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），７．８８（ｓ，１Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），７．４０（ｓ，１Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），４．２５（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_３ＣＨ_２Ｏ），２．３９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ_３ＣＯ），１．５０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３ＣＨ_２Ｏ）

７−エトキシ−６−ヒドロキシ−４−（３−ヨードフェノキシ）キナゾリン（９）
３−ヨードフェノール（５．０ｇ、２２．７ｍｍｏｌ）を加温（５０℃）し、溶解させた後、水酸化カリウム（０．４２ｇ、７．４９ｍｍｏｌ）を加えて完全に溶かした。次に化合物（８）（０．５６ｇ、２．１０ｍｍｏｌ）を１０分程度かけて加え、一晩還流（９０℃）した。反応物をクロロホルムで抽出し、有機層を２回水洗し、硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチルエステルを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製し、化合物（９）を得た。

Ｙｉｅｌｄ；７１．２％ ｍ．ｐ．；２１４〜２１６℃ ＨＲＭＳ；ｍ／ｚ ４０７．９９７１ ｆｏｕｎｄ ４０７．９９７８
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）；１０．３０（ｓ，１Ｈ，ＯＨ），８．４８（ｓ，１Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），７．７３（ｔ，１Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），７．６８（ｄ，１Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），７．４８（ｓ，１Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），７．３０（ｍ，３Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），４．２５（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_３ＣＨ_２Ｏ）１．４４（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３ＣＨ_２Ｏ）

７−エトキシ−４−（３−ヨードフェノキシ）−６−（３−モルフォリノプロポキシ）キナゾリン（２ａ）［ＰＹＫ］の合成
化合物（９）（０．６０ｇ、１．４７ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、無水、１５ｍｌ）に加え、次いで炭酸カリウム（１．０ｇ、７．２４ｍｍｏｌ）を加えた。その後、モルフォリノプロピルクロライド（化合物（４）、０．３０ｇ、１．８３ｍｍｏｌ）を加えて、３．５時間還流（９０℃）した。反応液を室温まで冷却し、氷冷水（５０ｍｌ）を加え、酢酸エチルエステルで抽出（５０ｍｌ×１、２０ｍｌ×２）した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒を減圧留去し、残渣を酢酸エチルエステルを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離後、さらに２−プロパノールから再結晶して化合物（２ａ）を得た。

Ｙｉｅｌｄ；３８．１％ ｍ．ｐ．；１３５〜１３７℃ ＨＲＭＳ；ｍ／ｚ ５３５．０９６８ ｆｏｕｎｄ ５３５．０９６６ ^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）； ８．５４（ｓ，１Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），７．５９（ｔ，１Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），７．５６（ｄ，１Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），７．４３（ｓ，１Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），７．１８（ｍ，３Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），４．２０（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ，ｐｒｏｐｙｌ），４．１７（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_３ＣＨ_２Ｏ），３．６６（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，４Ｈ，ｍｏｌｐｈｏｌｉｎｏ），２．５３（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ，ｐｒｏｐｙｌ），２．４３（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，４Ｈ，ｍｏｌｐｈｏｌｉｎｏ），２．０６（ｍ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ，ｐｒｏｐｙｌ），１．４９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３ＣＨ_２Ｏ）

実施例２（７−エトキシ−６−（３−モルフォリノプロポキシ）−４−（３−トリブチルスタニルフェノキシ）キナゾリン（２ｂ）の合成）
化合物（２ａ）（０．１５ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、ビス（トリブチルチン）（０．４９ｇ、０．８４ｍｍｏｌ），及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（０．０２ｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を無水トルエン（２５ｍｌ）に加え、一晩還流（１４０℃）した。冷後、セライトを用いてろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣をクロロホルム／メタノール（１５／１ ｖ／ｖ）を溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製し、化合物（２ｂ）を黄色油状物として得た。

Ｙｉｅｌｄ；３５．８％ ＨＲＭＳ；ｍ／ｚ ６９９．３０５８ ｆｏｕｎｄ ６９９．３０５４
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）；８．６０（ｓ，１Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），７．６０（ｓ，１Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），７．４９−７．１５（ｍ，５Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），４．２７（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ，ｐｒｏｐｙｌ），４．２５（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_３ＣＨ_２Ｏ），３．７５（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，４Ｈ，ｍｏｌｐｈｏｌｉｎｏ），２．６３（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ，ｐｒｏｐｙｌ），２．５４（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，４Ｈ，ｍｏｌｐｈｏｌｉｎｏ），２．１５（ｍ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ，ｐｒｏｐｙｌ），１．５５（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ_３ＣＨ_２Ｏ），１．４２−０．８６（ｍ，２７Ｈ，Ｂｕ_３）

実施例３（［^１２５Ｉ］ＰＹＫの合成）
密栓バイアル中で化合物（２ｂ）（５０μｌ、０．５ｍｇ／ｍｌエタノール溶液）に０．１Ｍ 塩酸（２５μｌ）、［^１２５Ｉ］ヨウ化ナトリウム（１．０μｌ、３．７ＭＢｑ）、３０ｗ／ｖ％過酸化水素水（１０μｌ）を順に加え、室温で１５分間反応させた。目的物をＨＰＬＣにて分離精製し、各種化合物の対応非標識体のＨＰＬＣリテンションタイムと完全に一致することで目的標識体であることを確認した。なお、全ての標識体の放射化学的純度は９５％以上、比放射能は約７４ＴＢｑ／ｍｍｏｌであった。
溶出溶媒；メタノール／０．０１Ｍクエン酸水溶液（５５／４５ ｖ／ｖ）
ＨＰＬＣリテンションタイム；１５．５分 標識率；９７．５％

実施例４（ＰＹＫのＥＧＦＲ−ＴＫリン酸化阻害能の測定）
合成した新規誘導体について、ＥＧＦＲ−ＴＫリン酸化阻害能を測定した。測定はビオチン化ＥＧＦＲ−ＴＫリン酸化ペプチドを基質として用いるＰｒｏｍｅｇａ社製の測定キットならびに［γ‐３２Ｐ］ＡＴＰを用いて行った。阻害活性は１０μＭ〜１００ｐＭの濃度の薬物存在下でリン酸化能を測定し、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値として求めたのＥＧＦＲ−ＴＫリン酸化阻害能を測定した。同時に代表的なＥＧＦＲ−ＴＫ選択的阻害剤であるＰＤ１５３０３５を用いて比較した。

ＰＴＫアッセイ５Ｘ緩衝液（５．０μｌ）、ＰＴＫビオチン化ペプチド基質（２．５μｌ）、２．５ｍＭ バナジン酸ナトリウム（２．５μｌ）、ＡＴＰ混合溶液｛０．５ｍＭ ＡＴＰ、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（７．４ｋＢｑ）｝（２．５μｌ）及び被験物質の１０％ＤＭＳＯ溶液（７．５μｌ）を加え全量２０μｌとし、３０℃で５分間インキュベートした。続いて、ＥＧＦＲ ＰＴＫ 緩衝溶液（４０ｍＭ イミダゾール塩酸塩、４０ｍＭ β−グリセロリン酸、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）を（５．０μｌ）を加え、３０℃で１５分間インキュベートした。続いて、７．５Ｍグアニジン塩酸塩（１３μｌ）加え、１４０００×ｇで１０秒間遠心した。反応液１３μｌをＳＡＭ^２（登録商標）メンブランにスポットし、２Ｍ塩化ナトリウム水溶液（２００ｍｌ）で３０秒間、１回、３分間、２回洗い、次に１％リン酸を含む２Ｍ塩化ナトリウム水溶液（２００ｍｌ）で３分間、２回洗い、最後にイオン交換水（１００ｍｌ）で３０秒間、１回洗った。ＳＡＭ^２（登録商標）メンブランを乾燥後、クリアゾルＩシンチレーター（ナカライテスク社製）を１０ｍｌ加え、液体シンチレーションカウンターで放射能を測定した。コントロールは被験物質の代わりに１０％ＤＭＳＯ溶液を加えた際の放射能を測定した。被検化合物を添加した際の放射能をコントロールに対するパーセントとして計算し、コントロールの５０％を示す濃度をＩＣ_５０値とした（表１）。

ＰＹＫは対照に用いたＰＤ１５３０３５と同程度の高いＥＧＦＲ−ＴＫリン酸化阻害活性を示した。また、この結果より、ＰＹＫは優れたＥＧＦＲ−ＴＫリン酸化阻害活性を持ち、新規ＳＰＥＣＴ用ＥＧＦＲ−ＴＫ活性診断用薬剤としての可能性を持つことが確認された。

実施例５（Ａ４３１膜画分に対する［^１２５Ｉ］ＰＹＫの結合親和性の検討）
Ａ−４３１癌細胞膜画分の調製
Ａ−４３１癌細胞をコンフルエントに達するまで培養後、トリプシン処理によりディシュから回収した後、細胞液を遠心分離（４００ ｘ ｇ，５ｍｉｎ，室温）した。次いで、氷冷下で沈殿にＰＢＳ（−）を２ｍｌ加え、シリンジで細胞を破砕した。その後、等量の０．２ｍＭリン酸／０．３２Ｍスクロース緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、再度遠心分離（８００ ｘ ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）し上清を得た。上清を超遠心分離（７５０００ ｘ ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）し、得られた沈殿に２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、２５℃，１５分間インキュベートした。再度超遠心分離（７５０００ ｘ ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）を行い、沈殿を細胞膜画分とし、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁して用いた。タンパク量は、ＢＳＡを標準試料としたローリー法で測定した。

［ ^１２５ Ｉ］ＰＹＫのＥＧＦＲ−ＴＫに対する結合親和性
Ａ−４３１癌細胞膜画分を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁し、ＥＧＦ添加後２５℃ １０分間インキュベートした。次いで、全結合量を測定するためにＤＭＳＯを、非特異的結合量を測定するためにＰＤ１５３０３５（終濃度１０μＭ）をそれぞれ１００μｌ加えた。さらに、［^１２５Ｉ］ＰＹＫのＤＭＳＯ溶液５０μｌ及び終濃度１ｎＭ〜２００ｎＭとなるように調製した非標識ＰＹＫを５０μｌ加えて全量１ｍｌとし、２５℃で６０分間インキュベートした。反応終了後、直ちに反応液を０．５％ポリエチレンイミン溶液に３０分間以上浸したグラスフィルター（ＧＦ／Ｂ、ワットマン社製）を用いて吸引濾過し０．５％トリトンＸ−１００ ０．２ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）３ｍｌでフィルターとチューブを洗浄した。γカウンターでフィルターの放射能を測定し、［^１２５Ｉ］ＰＹＫとチロシンキナーゼとの全結合量と非特異的結合量を求め、全結合量と非特異的結合量の差を特異的結合量とした。得られた特異的結合量曲線から、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ解析法によりＫｄ値及びＢｍａｘ値を算出した（図１）。

Ａ−４３１細胞膜画分に対するＰＹＫのＫｄ値は、５１．３ｎＭ、Ｂｍａｘ値は、２７．０ｐｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであり、ＰＹＫはＥＧＦＲ−ＴＫに対して高い親和性を示すことが確認できた。さらに、結合部位の交叉性を知るうえで重要なＨｉｌｌ係数は、１．０２となりＰＹＫの結合部位は一つで、他の結合部位に相互作用がないことを確認した。また、本実験に用いたＥＧＦＲ−ＴＫ選択的阻害剤ＰＤ１５３０３５は、細胞膜内に存在するチロシンキナーゼのＡＴＰ結合部位に作用することで阻害活性を示すことから、ＰＹＫも同部位に結合していると考えられた。

実施例６（［^１２５Ｉ］ＰＹＫの体内分布変化）
［^１２５Ｉ］ＰＹＫの詳細な生体内分布とＥＧＦＲ−ＴＫ特異性に関して、担癌マウスを用い、投与１、６、１２、２４時間後での体内分布を調べた。なお、本実験では、ＥＧＦＲ−ＴＫがよく発現しており担癌モデルマウスとしてよく用いられ、作成の容易なＡ−４３１癌細胞を用いた。

Ａ−４３１細胞担癌モデルマウスの作成
Ａ−４３１癌細胞は、５％ＦＣＳならびに、ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液を含むＤＭＥＭ培養液で５％ＣＯ_２存在下３７℃で常法に従い培養した。培地交換は２日に一回行い、コンフルエント状態になるまで培養した後、実験に用いた。コンフルエント状態に達したものをトリプシン処理し、細胞を採取した。細胞は、培養時に使用した培地で最適な濃度に懸濁し、２００μｌ当たり１×１０^７個になるように細胞を調製した。得られた細胞懸濁液２００μｌを生後４週間のＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ系雄性ヌードマウス（２０〜２５ｇ）の大腿部に皮下注射し、２週間飼育した。

［ ^１２５ Ｉ］ＰＹＫのＡ４３１癌組織への集積性
Ａ−４３１癌細胞担癌マウスに［^１２５Ｉ］ＰＹＫを尾静脈より投与し、１、６、１２、２４時間後に屠殺後、癌および各臓器を採取し、重量並びに放射能を測定比較した。測定結果より各臓器１ｇ当たりの放射能を全投与量に対するパーセント（％ ｄｏｓｅ／ｇ ｔｉｓｓｕｅ）として算出し、［^１２５Ｉ］ＰＹＫの各種癌への集積について比較検討した（表２）。

［^１２５Ｉ］ＰＹＫは、投与１時間後で癌に４．４％集積し、その後、投与６時間後で３．６％、投与１２時間後で１．７％、投与２４時間後で１．５％と投与後早期における癌への高い取込みとその後の緩やかな消失が確認された。また、他の組織からは、癌よりも早い消失が認められた。その結果、画像コントラストの指標である癌対組織比が上昇した。［^１２５Ｉ］ＰＹＫの癌対血液、筋肉比は、投与１時間後で６．８、４．６、投与２４時間後で、５７．０、４５．５と良好な値を示した（図２Ａ）。一方、主要組織に対する癌対組織比は、投与１時間後ではいずれも低い値であったが、投与２４時間後では、癌対肝臓、癌対腎臓、癌対肺比がそれぞれ３．０、４．３、８．５と良好な値を示した（図２Ｂ）。

実施例７（ｉｎ ｖｉｖｏにおける癌集積量がＥＧＦＲ−ＴＫ発現量及びＥＧＦＲ−ＴＫリン酸化活性と相関すること）
各種癌細胞の培養
各種癌細胞は、７５ｃｍ^２ディシュ中に１．０×１０^６個添加し、５％ＣＯ_２存在下３７℃で常法によって培養した。培地はＡ−４３１、Ａ−３７５、Ｃ−６癌細胞はＤＭＥＭ、Ｄｕ−１４５、Ｍｅ−１８０、ＰＣ−３、ＮＡＬＭ−６癌細胞はＲＰＭＩ１６４０にＡ−４３１は５％ＦＣＳ、その他の細胞は１０％ＦＣＳならびに、ペニシリンーストレプトマイシン混合溶液を加えたものを用いた。

各種癌細胞膜画分の調製
（接着系細胞の場合）
コンフルエントに達するまで培養した各種癌細胞を、トリプシン処理によりディシュから回収した後、細胞液を遠心分離（４００ ｘ ｇ，５ｍｉｎ，室温）した。次いで、氷冷下で沈殿にＰＢＳ（−）を２ｍＬ加え、シリンジで細胞を破砕した。その後、等量の０．２ｍＭリン酸／０．３２Ｍスクロース緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、再度遠心分離（８００ ｘ ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）により上清を得た。上清を超遠心分離（７５０００ ｘ ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）し、得られた沈殿に２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、２５℃，１５分間インキュベートした。再度超遠心分離（７５０００ ｘ ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）を行い、沈殿を細胞膜画分とし、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁して用いた。タンパク量は、ＢＳＡを標準試料としたローリー法で測定した。
（浮遊系細胞の場合）
トリプシン処理を行わずに細胞をディシュから回収し、以下、接着系細胞と同様の操作を行った。

各種癌細胞におけるＥＧＦＲ−ＴＫ発現量の測定
各種癌細胞膜画分を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁し、ＥＧＦ添加後２５℃ １０分間インキュベートした。次いで、全結合量を測定するためにＤＭＳＯを、非特異的結合量を測定するためにＰＤ１５３０３５（終濃度１０μＭ）をそれぞれ１００μｌ加えた。さらに、［^１２５Ｉ］ＰＹＫのＤＭＳＯ溶液５０μｌ及び終濃度１ｎＭ〜２００ｎＭとなるように調製した非標識ＰＹＫを５０μｌ加えて全量１ｍｌとし、２５℃で６０分間インキュベートした。反応終了後、直ちに反応液を０．５％ポリエチレンイミン溶液に３０分間以上浸したグラスフィルター（ＧＦ／Ｂ、ワットマン社製）を用いて吸引濾過し０．５％トリトンＸ−１００ ０．２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．２）３ｍｌでフィルターとチューブを洗浄した。γカウンターでフィルターの放射能を測定し、［^１２５Ｉ］ＰＹＫとチロシンキナーゼとの全結合量と非特異的結合量を求め、全結合量と非特異的結合量の差を特異的結合量とした。得られた特異的結合量曲線から、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ解析法によりＫｄ値及びＢｍａｘ値を算出した（表３）。

各種癌細胞におけるＥＧＦＲ−ＴＫリン酸化活性の測定
ＰＴＫアッセイ５×緩衝液（５．０μｌ）、ＰＴＫビオチン化ペプチド基質（２．５μｌ）、２．５ｍＭバナジン酸ナトリウム（２．５μｌ）、ＡＴＰ混合溶液｛０．５ｍＭ ＡＴＰ、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（１８．５ｋＢｑ）｝（２．５μ）を加え、コントロールには１％ＤＭＳＯ溶液を、非特異的なリン酸化の測定には、ＥＧＦＲ−ＴＫ選択的阻害剤ＰＤ１５３０３５（終濃度１０μＭ）７．５μｌを加え、３０℃、５分間インキュベートした。続いて、各種癌細胞膜画分１μｇを加え、３０℃、１５分間インキュベートした。その後、７．５Ｍグアニジン塩酸塩（１３μｌ）を加え、１４０００×ｇで１０秒間遠心した。反応液１３μｌをＳＡＭ^２（登録商標）メンブランにスポットし、２Ｍ塩化ナトリウム水溶液（２００ｍｌ）で３０秒間、１回、３分間、２回洗い、次に１％リン酸を含む２Ｍ塩化ナトリウム水溶液（２００ｍｌ）で３分間、２回洗い、最後にイオン交換水（１００ｍｌ）で３０秒間、１回洗った。ＳＡＭ^２（登録商標）メンブランを乾燥後、クリアゾルＩシンチレーター（ナカライテスク社製）を１０ｍｌ加え、液体シンチレーションカウンターで放射能を測定した。コントロールからＰＤ１５３０３５を前処置した際の放射能を引いた値をＥＧＦＲ−ＴＫの特異的なリン酸化活性とし、ユニットに換算して各種癌細胞におけるＥＧＦＲ−ＴＫリン酸化活性を算出した（表４）。１ユニットは、３０℃、１分間に１ｐｍｏｌのリン酸基をＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩに転換するための酵素量とした。

各種癌細胞担癌モデルマウスの作成
各種癌細胞を前述の方法で培養し、コンフルエント状態に達したものをトリプシン処理し、細胞を採取した。細胞は、各種癌細胞の培養時に使用した培地で最適な濃度に懸濁した。各種癌細胞懸濁液２００μｌ当たり１×１０^７個になるように細胞を調製した。得られた細胞懸濁液２００μｌを生後４週間のＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ系雄性ヌードマウス（２０〜２５ｇ）の大腿部に皮下注射し、Ａ−３７５癌細胞は２週間、Ｃ−６、ＰＣ−３癌細胞は３週間、Ｍｅ−１８０、Ｄｕ−１４５癌細胞は４週間飼育した。

［ ^１２５ Ｉ］ＰＹＫの各種癌への集積性
各種癌細胞担癌マウスに［^１２５Ｉ］ＰＹＫを尾静脈より投与し、２４時間後に屠殺後、癌および各臓器を採取し、重量並びに放射能を測定比較した。測定結果より各臓器１ｇ当たりの放射能を全投与量に対するパーセント（％ ｄｏｓｅ／ｇ ｔｉｓｓｕｅ）として算出し、［^１２５Ｉ］ＰＹＫの各種癌への集積について比較検討した（表５）。

［^１２５Ｉ］ＰＹＫは、各種担癌モデルマウスにおいて主要臓器への集積に大きな差はみられなかった。一方、［^１２５Ｉ］ＰＹＫの標的組織である癌への集積量は、Ａ−４３１で、１．５１％、Ｄｕ−１４５、Ｍｅ−１８０、ＰＣ−３、Ａ−３７５、Ｃ−６でそれぞれ１．１４％、０．７０％、０．４３％、０．３９％、０．１１％と癌により様々であった。

各種担癌モデルマウスにおける［ ^１２５ Ｉ］ＰＹＫの癌集積量とＥＧＦＲ−ＴＫリン酸化活性との相関性
次に、各種癌のＥＧＦＲ−ＴＫリン酸化活性及びＥＧＦＲ−ＴＫ発現量であるＢｍａｘ値とインビボでの［^１２５Ｉ］ＰＹＫの癌集積量との相関性を検討した（図３）。
［^１２５Ｉ］ＰＹＫの癌集積量は、Ｂｍａｘ値と高い相関性が認められ（Ｒ^２＝０．８９）、ＥＧＦＲ−ＴＫリン酸化活性とも同様に良好な値が得られた（Ｒ^２＝０．７２）。従って、［^１２５Ｉ］ＰＹＫは、インビボにおいてもＥＧＦＲ−ＴＫを発現する様々な癌に適用可能であると考えられ、［^１２５Ｉ］ＰＹＫの癌集積量よりＥＧＦＲ−ＴＫリン酸化活性を推定可能なことから、ＥＧＦＲ−ＴＫを標的とする分子イメージング薬剤としての可能性が示唆された。

実施例８（［^１２５Ｉ］ＰＹＫのオートラジオグラム）
癌集積量ならびに癌対組織比が最も高かったＡ−４３１担癌モデルマウスを用いて投与１、６、１２、２４時間後におけるオートラジオグラムを作成し、［^１２５Ｉ］ＰＹＫの画像による評価を行った。
Ａ−４３１癌細胞懸濁液２００μｌ（１×１０^７個）を生後４週間のＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ系雄性ヌードマウス（２０〜２５ｇ）の背部に皮下注射し、２週間飼育した。そして、［^１２５Ｉ］ＰＹＫを尾静脈より投与し（１．１ＭＢｑ／２００μｌ）、１、６、１２、２４時間後にそれぞれ屠殺し、胴体をドライアイス／ヘキサン中で凍結させた。１時間後に胴体を背骨に沿って縦切りにし、ｏ，ｃ，ｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄで土台に固定させ、−３０℃程度で１２時間凍結させた。その後、ミクロトームを用いて３０μｍの凍結切片とし、スライドガラスに貼り付けた。得られた切片をフィルムに密着させ、暗室にて１週間感光させ後、現像液で５分、現像停止液で２分、定着液で１０分間現像処理した後、画像処理をして、オートラジオグラムを得た（図４）。

［^１２５Ｉ］ＰＹＫ投与１、６時間後のオートラジオグラムでは、明らかな［^１２５Ｉ］ＰＹＫの癌への集積が確認されたが、主要組織においても高い集積を示した。しかし、投与１２時間後においては、臓器が判別できる程度まで非標的組織から［^１２５Ｉ］ＰＹＫの消失が認められ、また、投与２４時間後においては、［^１２５Ｉ］ＰＹＫの標的組織である癌への高い集積と他の臓器、特に、画像診断薬剤の多くに見られる肝臓、腎臓などの代謝系の臓器や肺・胃といった体積の大きな臓器への高い集積も認められず、鮮明な画像を得ることができた。

以上のように、検討した各種癌において［^１２５Ｉ］ＰＹＫは、高い癌集積性と非標的組織からの速やかな消失を示し、良好な癌対組織比が得られた。さらに、Ａ−４３１担癌モデルマウスのオートラジオグラムでは明瞭な画像が得られたことから、［^１２５Ｉ］ＰＹＫの臨床への応用が十分可能であることが示唆された。

Ａ４３１癌細胞の膜画分ＥＧＦＲ−ＴＫに対する［^１２５］ＰＹＫの結合特性を検討した実験結果を示す図である。 ［^１２５Ｉ］ＰＹＫの担腫瘍マウス体内分布において、腫瘍と血液または周辺臓器の集積（％ dｏｓｅ／ｇ ｔｉｓｓｕｅ）における比を、癌対臓器比として算出し、その経時的変化を示した図である。 各種癌細胞のＥＧＦＲ−ＴＫリン酸化活性及びＥＧＦＲ−ＴＫ発現量であるＢｍａｘ値とインビボでの［^１２５Ｉ］ＰＹＫの癌集積量との相関性を検討した実験結果を示す図である。 Ａ−４３１担癌モデルマウスにおける［^１２５Ｉ］ＰＹＫのオートラジオグラムを経時的に示した図(写真)である。図において、矢印は腫瘍を示す。

Claims (10)

1. 一般式（１）
   （式中、Ｒ^１は放射性ヨウ素原子を示す。）で表される放射性化合物。
2. 放射性ヨウ素原子が、Ｉ−１２３、Ｉ−１２４、Ｉ−１２５及びＩ−１３１から選ばれたものである請求項１記載の放射性化合物。
3. 請求項１〜２のいずれか１項に記載の放射性化合物を含有する医薬。
4. 画像診断用イメージング剤である請求項３記載の医薬。
5. 腫瘍疾患領域の画像診断用イメージング剤である請求項４記載の医薬。
6. シングルフォトン断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）用の腫瘍疾患領域の画像診断用イメージング剤である請求項５記載の医薬。
7. ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の腫瘍疾患領域の画像診断用イメージング剤である請求項５記載の医薬。
8. 内用放射線治療薬である請求項３記載の医薬。
9. 一般式（２）
   （式中、Ｒ^２は、ヨウ素原子、トリアルキルスズ基またはトリアルキルシリル基を示す。）で表される４−フェノキシキナゾリン誘導体。
10. 一般式（２）
    （式中、Ｒ^２は、ヨウ素原子、トリアルキルスズ基またはトリアルキルシリル基を示す。）で表される４−フェノキシキナゾリン誘導体にアルカリ金属放射性ヨウ素化物を反応させることを特徴とする一般式（１）
    （式中、Ｒ^１は、放射性ヨウ素原子を示す。）で表される放射性ヨウ素化合物の製造法。