JP4944446B2 - Effectiveness prediction method of anticancer drug treatment - Google Patents
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Description
本発明は、個々のがん患者に対して、抗がん剤治療が有効か否か、とりわけ有効であることを高確率で予測することができる抗がん剤治療の有効性予測方法に関する。 The present invention relates to a method for predicting the effectiveness of anticancer drug treatment, which can predict with high probability whether or not anticancer drug treatment is effective for individual cancer patients.
がんの治療方法の一つとして、抗がん剤治療方法がある。しかし、がんの病態は、その種類、発症部位あるいは進行度等により様々であり、こうした多様性と患者個人の応答性の違いは、抗がん剤治療が有効な患者だけでなく、有効でない患者も多く存在する原因となっている。抗がん剤が効かない患者に抗がん剤を投与し続けることは、その抗がん剤の副作用による悪い面だけがクローズアップされることになり、患者には苦痛を強いるだけに成りかねない。
このため、抗がん剤治療に踏み切る場合、その抗がん剤が対象となる患者に効くか効かないかを、治療前に知ることが求められている。
One method for treating cancer is an anticancer drug treatment method. However, the pathology of cancer varies depending on its type, site of onset, or degree of progression, and this difference in diversity and individual patient responsiveness is not only effective in patients with anticancer drug treatment but also ineffective. Many patients also cause it. Continuing to administer an anti-cancer drug to a patient who does not respond to the anti-cancer drug will close up only the bad side caused by the side effects of the anti-cancer drug and may only cause pain to the patient. Absent.
For this reason, when taking an anticancer drug treatment, it is required to know before treatment whether the anticancer drug is effective or not.
現在、抗がん剤に対する感受性を予測する方法としては、例えば特許文献１に、感受性の違いが遺伝子多型にあるとして、被検細胞のＢＣＲＰの遺伝子多型を同定する、被検細胞の抗がん剤に対する感受性判定方法が開示されている。
At present, as a method for predicting the sensitivity to an anticancer agent, for example,
ＢＣＲＰは、ＡＢＣトランスポータの１つで、抗がん剤の耐性に関与していることが知られており、またこのＢＣＲＰの発現の個人差が一塩基多型にあることが知られている。このようなことから、特許文献１に開示の感受性判定方法は、患者由来のガン細胞からＤＮＡの塩基配列を調べ、ＢＣＲＰの遺伝子多型を同定し、感受性、副作用の程度を判定するという方法である。
BCRP is one of the ABC transporters, and is known to be involved in the resistance of anticancer drugs, and it is known that individual differences in the expression of BCRP exist in single nucleotide polymorphisms. . Therefore, the sensitivity determination method disclosed in
また、特許文献２に、培養がん細胞株の抗がん剤感受性と該細胞のインタクトな状態における遺伝子発現プロファイルに基づき抗がん剤適合性マーカー遺伝子を特定し、特定した抗がん剤適合性マーカー遺伝子と該遺伝子を利用した未知検体の抗がん剤適合性予測方法が開示されている。
Further,
この方法では、検体中のがん細胞において、相対的発現量が高い遺伝子群の特定の抗がん剤に対して相関が高い遺伝子群と一致する率が高ければ、該検体はその抗がん剤に対して適合性であると予測し、検体中のがん細胞において相対的発現量が高い遺伝子群が特定の抗がん剤に対して相関が高い遺伝子群と全く一致しなければ、該検体はその抗がん剤に対して適合性が低いと予測するものである。 In this method, if a cancer cell in a specimen has a high rate of coincidence with a gene group having a high correlation with a specific anticancer agent of a gene group having a high relative expression level, the specimen is treated with the anti-cancer. If a gene group that is highly expressed in cancer cells in a sample does not match a gene group that has a high correlation with a specific anticancer drug, The specimen is expected to be less compatible with the anticancer drug.
しかし、この方法で適合と判定されたものであっても、抗がん剤治療が実際に有効であるか否かは８０％程度であるといわれている。有効性が８０％というのは、治療に踏み切るにあたっての指標としては、決して高いといえない。かなりの確実性をもって有効であるといった指標が与えられることが患者にとっては重要である。 However, even if it is determined to be compatible by this method, it is said that whether or not anticancer drug treatment is actually effective is about 80%. An efficacy of 80% is never high as an index for taking treatment. It is important for patients to be given an indication that they are effective with considerable certainty.
一方、がん抑制遺伝子産物であるｐ５３やＲＢタンパク質（網膜芽細胞腫タンパク、Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ）が、細胞周期制御に関与することが知られ、細胞周期タンパク質とがんとの関係について、近年、研究が進められている。 On the other hand, p53 and RB protein (retinoblastoma protein), which are tumor suppressor gene products, are known to be involved in cell cycle control. Recently, research has been conducted on the relationship between cell cycle proteins and cancer. Is underway.
特許文献３には、細胞周期関連タンパク質を少なくとも２種以上測定し、細胞周期プロファイリングを行なうことにより、薬剤耐性試験及び予後診断が可能となるということは示唆されているが、その具体的方法、効果については一切開示されていない。
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、患者がためらうことなく抗がん剤治療に踏み切れるように、特定の抗がん剤治療が有効であることを高確率で予測できる抗がん剤治療の有効性予測方法を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and its purpose is that a specific anticancer drug treatment is effective so that the patient can proceed to the anticancer drug treatment without hesitation. It is an object of the present invention to provide a method for predicting the effectiveness of an anticancer drug treatment capable of predicting the above with high probability.
本発明者らは、実際に患者から採取された腫瘍細胞について、細胞周期関連タンパク質のプロファイリングを種々検討し、さらに実際に抗がん剤治療を行なったときの効果との関係を鋭意検討した結果、本発明を完成した。 The present inventors conducted various studies on cell cycle-related protein profiling for tumor cells actually collected from patients, and further intensively investigated the relationship with the effects of actual anticancer drug treatment. The present invention has been completed.
すなわち、本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法は、 患者から採取した乳がん細胞における、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の活性値と発現量との比であるＣＤＫ比活性と、第１閾値とを比較する工程；及びＣＤＫ比活性が第１閾値以上である場合に、前記患者の抗がん剤治療の有効性が高いと予測する工程；を含み、前記ＣＤＫは、ＣＤＫ１又はＣＤＫ２である。
前記ＣＤＫがＣＤＫ１の場合、前記比較工程においてさらに、患者から採取した乳がん細胞におけるＣＤＫ２の発現量と第２閾値とを比較するとともに、患者から採取した乳がん細胞におけるＣＤＫ４の発現量と第３閾値とを比較し、前記予測工程においてさらに、ＣＤＫ１比活性が第１閾値未満であり、且つＣＤＫ２の発現量が第２閾値以上であり、且つＣＤＫ４の発現量が第３閾値以上である場合に、前記患者の抗がん剤治療の有効性が高いと予測し、ＣＤＫ１比活性が第１閾値未満であり、且つＣＤＫ２の発現量が第２閾値未満であり、且つＣＤＫ４の発現量が第３閾値未満である場合に、前記患者の抗がん剤治療の有効性が低いと予測することができる。ここで、前記閾値は、ＣＤＫ１比活性、ＣＤＫ２の発現量、及びＣＤＫ４の発現量について、複数の所定のがん細胞に対して所定の抗がん剤が投与されたときの抗がん剤治療結果に基づいて、抗がん剤治療結果が有効であった場合を選択できるように設定されることが好ましい。
また、前記ＣＤＫがＣＤＫ２の場合、前記比較工程においてさらに、患者から採取した乳がん細胞における、ＣＤＫインヒビターであるｐ２１の発現量と、第２閾値とを比較し、前記予測工程において、ＣＤＫ２比活性が第１閾値未満であり、且つｐ２１の発現量が第２閾値未満である場合に、前記患者の抗がん剤治療の有効性が中程度であると予測し、ＣＤＫ２比活性が第１閾値未満であり、且つｐ２１の発現量が第２閾値以上である場合に、前記患者の抗がん剤治療の有効性が低いと予測することができる。ここで、前記閾値は、ＣＤＫ２比活性、及びｐ２１の発現量について、複数の所定のがん細胞に対して所定の抗がん剤が投与された抗がん剤治療結果に基づいて、抗がん剤治療結果が有効であった場合を選択できるように設定されることが好ましい。
本発明の有効性予測方法において用いられる前記細胞は、抗がん剤治療の前に患者から採取した乳がん細胞であることが好ましい。
That is, the method for predicting the effectiveness of the anticancer drug treatment of the present invention comprises a CDK specific activity which is a ratio of an activity value and an expression level of cyclin-dependent kinase (CDK) in breast cancer cells collected from a patient, Comparing with a threshold; and predicting that the anticancer drug treatment is highly effective for the patient when the CDK specific activity is not less than the first threshold, wherein the CDK is CDK1 or CDK2. is there.
When the CDK is CDK1, the comparison step further compares the expression level of CDK2 in the breast cancer cells collected from the patient with the second threshold value, and also compares the expression level of CDK4 in the breast cancer cells collected from the patient with the third threshold value. The CDK1 specific activity is less than the first threshold, the expression level of CDK2 is greater than or equal to the second threshold, and the expression level of CDK4 is greater than or equal to the third threshold. The anticancer drug treatment is expected to be highly effective for the patient, the CDK1 specific activity is less than the first threshold, the expression level of CDK2 is less than the second threshold value, and the expression level of CDK4 is less than the third threshold value In this case, it can be predicted that the effectiveness of the anticancer drug treatment of the patient is low. Here, the threshold is the anticancer agent treatment when a predetermined anticancer agent is administered to a plurality of predetermined cancer cells with respect to the CDK1 specific activity, the expression level of CDK2, and the expression level of CDK4. It is preferable to set so that the case where the anticancer drug treatment result is effective can be selected based on the result.
When the CDK is CDK2, the expression level of the CDK inhibitor p21 in the breast cancer cells collected from the patient is further compared with the second threshold value in the comparison step, and the CDK2 specific activity is determined in the prediction step. When the expression level of p21 is less than the first threshold value and less than the second threshold value, it is predicted that the effectiveness of the anticancer drug treatment of the patient is moderate, and the CDK2 specific activity is less than the first threshold value. When the expression level of p21 is equal to or higher than the second threshold, it can be predicted that the effectiveness of the anticancer drug treatment of the patient is low. Here, the threshold is determined based on the anticancer drug treatment result obtained by administering a predetermined anticancer drug to a plurality of predetermined cancer cells with respect to the CDK2 specific activity and the expression level of p21. It is preferable to set so that the case where the cancer treatment result is effective can be selected.
The cells used in the efficacy prediction method of the present invention are preferably breast cancer cells collected from a patient before anticancer drug treatment.
本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法は、実際の抗がん剤治療効果の有無との相関性が大変高く、本発明の予測方法で有効と判定される場合は、ほぼ１００％近く抗がん剤治療が有効な場合に限られるので、抗がん剤治療に踏み切るか否かの指標として優れている。 The effectiveness prediction method of the anticancer drug treatment of the present invention has a very high correlation with the presence or absence of the actual anticancer drug treatment effect, and is almost 100% when judged effective by the prediction method of the present invention. Since it is limited only when anticancer drug treatment is effective, it is excellent as an index for determining whether or not to proceed with anticancer drug treatment.
本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法は、患者から採取した腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、選択されたパラメータに対応する閾値とを比較する工程；及び前記比較工程の結果に基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する工程を含む。 The method for predicting the effectiveness of the anticancer drug treatment of the present invention is at least selected from the group consisting of the activity value, the expression level, and the ratio between the activity value and the expression level of a cyclin-dependent kinase of a tumor cell collected from a patient. Comparing one parameter with a threshold corresponding to the selected parameter; and predicting the efficacy of the anticancer drug treatment of the patient based on the result of the comparing step.
本発明の方法で予測する治療の有効性には、術前療法、術後療法の双方が含まれる。術前療法では、原発巣が存在する状態で抗がん剤を投与し続けた結果、原発巣が縮小ないし消失する場合が有効となり、術後療法では、腫瘍の摘出手術を行なった後に抗がん剤を投与し続けた結果、再発しない場合が有効となる。術後療法では、目に見えない転移などに対して、抗がん剤が有効であるかどうかが再発の有無となって現れる。 The effectiveness of the treatment predicted by the method of the present invention includes both preoperative and postoperative therapy. Preoperative therapy is effective when the primary lesion shrinks or disappears as a result of continued administration of anticancer drugs in the presence of the primary lesion, and postoperative therapy is effective after tumor removal surgery. It is effective when the drug does not recur as a result of continuing to administer the cancer drug. In postoperative therapy, whether or not an anticancer drug is effective for invisible metastasis, etc. appears as the presence or absence of recurrence.
本発明の予測方法に用いられる試料となる細胞は、患者から採取した腫瘍細胞である。術後療法の場合、手術により摘出された腫瘍組織から腫瘍細胞を得ることができる。術前療法の場合には、患者の腫瘍組織から生検した腫瘍細胞などを用いることができる。 The cell used as the sample used in the prediction method of the present invention is a tumor cell collected from a patient. In the case of post-operative therapy, tumor cells can be obtained from tumor tissue removed by surgery. In the case of preoperative therapy, tumor cells biopsied from a patient's tumor tissue can be used.
サイクリン依存性キナーゼとは、サイクリンと結合して活性化される酵素群の総称で、その種類に応じて、細胞周期の特定時期で機能している。 Cyclin-dependent kinase is a general term for a group of enzymes that are activated by binding to cyclin, and functions at a specific time in the cell cycle depending on the type of enzyme.
ここで、細胞が増殖を開始し、ＤＮＡ複製、染色体の分配、核***、細胞質***などの事象を経て、２つの娘細胞となって出発点に戻るまでのサイクルである細胞周期は、図１に示すように、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期の４期に分けられる。Ｓ期はＤＮＡの複製期であり、Ｍ期は***期である。Ｇ１期は有糸***の完了からＤＮＡ合成の開始までの間で、Ｍ期にはいるための準備点検期である。Ｇ１期にある臨界点（動物細胞ではＲ点）をすぎると、細胞周期は始動し、通常途中でとまることなく、一巡する。Ｇ２期は、ＤＮＡ合成の終了から有糸***の開始の間である。細胞周期の主なチェックポイントは、Ｇ１期からＳ期にはいる直前、Ｇ２期から有糸***への入り口である。特にＧ１期チェックポイントはＳ期開始の引き金をひくため、重要である。Ｇ１期のある点をすぎると、細胞は増殖シグナルがなくなっても、増殖を停止することなく、Ｓ→Ｇ２→Ｍ→Ｇ１と細胞周期を進行させるからである。尚、増殖を停止した細胞で、Ｇ１期のＤＮＡ含量をもった休止期（Ｇ０）があり、細胞周期からはずれた状態にある。増殖誘導により細胞周期内のＧ１期よりやや長い時間の後にＳ期へ進行することができる。 Here, the cell cycle, which is a cycle from when a cell starts to proliferate, through two events such as DNA replication, chromosome distribution, nuclear division, cytokinesis, and to return to the starting point, is shown in FIG. As shown, it is divided into four periods of G1, S, G2, and M periods. The S phase is the DNA replication phase, and the M phase is the division phase. The G1 period is from the completion of mitosis to the start of DNA synthesis, and is a preparatory check period for entering the M period. When the critical point in the G1 phase (the R point in animal cells) is passed, the cell cycle starts, and usually makes a round without stopping in the middle. The G2 phase is between the end of DNA synthesis and the start of mitosis. The main check point of the cell cycle is the entrance to the mitosis from the G2 phase immediately before entering the G1 phase to the S phase. The G1 checkpoint is particularly important because it triggers the start of the S period. This is because if the cell passes a certain point in the G1 phase, the cell progresses in the order of S → G2 → M → G1 without stopping proliferation even if the proliferation signal is lost. The cells that have stopped growing have a resting phase (G0) with a DNA content in the G1 phase, and are in a state deviated from the cell cycle. It can progress to S phase after a little longer time than G1 phase in a cell cycle by proliferation induction.
本発明の方法で用いられるサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）としては、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、サイクリンＡ依存性キナーゼ、サイクリンＢ依存性キナーゼ、及びサイクリンＤ依存性キナーゼなどが挙げられ、がんの種類、抗がん剤の種類に応じて適宜選択される。つまり、がんには種々の種類があり、各患者のがん細胞がもっている細胞周期に関連する性格が抗がん剤治療の有効性に大いに関係するからである。 Examples of the cyclin-dependent kinase (CDK) used in the method of the present invention include CDK1, CDK2, CDK4, CDK6, cyclin A-dependent kinase, cyclin B-dependent kinase, and cyclin D-dependent kinase. The type is appropriately selected according to the type of anticancer agent. In other words, there are various types of cancer, and the character related to the cell cycle of each patient's cancer cells is greatly related to the effectiveness of anticancer drug treatment.
本明細書における「がん」は、上皮細胞がん、造血器由来のがん、肉腫などを含む。がんの種類としては、例えば、乳がん、胃がん、大腸がん、食道がん、前立腺がん、白血病、骨肉腫等が挙げられる。 “Cancer” in the present specification includes epithelial cell cancer, hematopoietic cancer, sarcoma and the like. Examples of the type of cancer include breast cancer, stomach cancer, colon cancer, esophageal cancer, prostate cancer, leukemia, osteosarcoma and the like.
本明細書における「抗がん剤」とは、上述のがんに対して抗腫瘍効果のある化学物質のことをいう。 The “anticancer agent” in the present specification refers to a chemical substance having an antitumor effect against the above-mentioned cancer.
本明細書における「抗がん剤治療」とは、上述の抗がん剤を生体に投与することにより生体の悪性腫瘍を治療することである。 The term “anticancer agent treatment” in the present specification refers to treating a malignant tumor in a living body by administering the above-described anticancer agent to the living body.
乳がんに対する抗がん剤治療としては、例えばCMF（シクロフォスファミド、メトトレキシエート、フルオロウラシルの３剤を併用して投与する療法）、ドセタキセル、パクリタキセル等のタキサン系抗がん剤、CE（シクロフォスファミド、エピルビシンの２剤を併用して投与する療法）、AC（ドキソルビシン、シクロフォスファミドの２剤を併用して投与する療法）、CAF（フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロフォスファミドの３剤を併用して投与する療法）、FEC(フルオロウラシル、エピルビシン、シクロフォスファミドの３剤を併用して投与する療法)、トラスツズマブとパクリタキセルの２剤を併用して投与する療法、カペシタビン等が挙げられ、胃がんに対する抗がん剤治療としては、例えばFAM（フルオロウラシル、ドキソルビシン、マイトマイシンCの３剤を併用して投与する療法）、FAP（フルオロウラシル、ドキソルビシン、シスプラチンの３剤を併用して投与する療法）、ECF（エピルビシン、シスプラチン、フルオロウラシルの３剤を併用して投与する療法）、マイトマイシンCとテガフールの２剤を併用して投与する療法、フルオロウラシルとカルムスチンの２剤を併用して投与する療法等が挙げられ、大腸がんに対する抗がん剤治療としては、例えばフルオロウラシルとロイコボリンの２剤を併用して投与する療法、マイトマイシンとフルオロウラシルの２剤を併用して投与する療法等が挙げられ、卵巣がんに対する抗がん剤治療としては、例えばTP（パクリタキセル、シスプラチンの２剤を併用して投与する療法）、TJ（パクリタキセル、カルボプラチンの２剤を併用して投与する療法）、CP（シクロフォスファミド、シスプラチンの２剤を併用して投与する療法）、CJ（シクロフォスファミド、カルボプラチンの２剤を併用して投与する療法）等が挙げられる。 As an anticancer drug treatment for breast cancer, for example, CMF (a therapy administered in combination with cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil), taxane anticancer drugs such as docetaxel and paclitaxel, CE (cyclo Therapies administered in combination of phosphamide and epirubicin), AC (therapy combined with doxorubicin and cyclophosphamide), CAF (fluorouracil, doxorubicin and cyclophosphamide) ), FEC (therapy combined with fluorouracil, epirubicin, and cyclophosphamide), therapy combined with trastuzumab and paclitaxel, capecitabine, etc. As an anticancer drug treatment for gastric cancer, for example, FAM (fluorouracil, doxorubici , Therapy administered in combination with 3 drugs of mitomycin C), FAP (therapy administered in combination with 3 drugs of fluorouracil, doxorubicin, and cisplatin), ECF (administration of 3 drugs in combination with epirubicin, cisplatin, and fluorouracil) Therapies), therapies administered in combination of mitomycin C and tegafur, therapies administered in combination of fluorouracil and carmustine, and the like. Examples of anticancer drug treatment for colon cancer include, for example, fluorouracil. And leucovorin are used in combination, and mitomycin and fluorouracil are used in combination. Anticancer drug treatment for ovarian cancer includes, for example, TP (paclitaxel, cisplatin) Therapies administered in combination with two drugs), TJ (paclitaxel, carboplatin) Therapies administered in combination), CP (therapies administered in combination with cyclophosphamide and cisplatin), CJ (therapies administered in combination with cyclophosphamide and carboplatin), etc. It is done.
判定の指標とするのは、ＣＤＫの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比から選択される１つ又は２つのパラメータである。活性値と発現量の比は、ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量で示されるＣＤＫ比活性であってもよいし、ＣＤＫ発現量／ＣＤＫ活性値の値であってもよい。 The determination index is one or two parameters selected from the CDK activity value, the expression level, and the ratio between the activity value and the expression level. The ratio between the activity value and the expression level may be a CDK specific activity represented by CDK activity value / CDK expression level, or may be a value of CDK expression level / CDK activity value.
上記のパラメータを所定の閾値と比較することにより抗がん剤治療が有効か否か判定できる。ここで活性値、発現量および活性値と発現量の比から選択されるパラメータとは、抗がん剤の種類、がんの種類により適宜選択されるパラメータである。このパラメータは、過去に抗がん剤治療が行われ、その結果が判明しているがん患者から抗がん剤治療の前に摘出されて保存されていた腫瘍細胞について、CDKの活性値と発現量を測定し、それぞれのパラメータについて、抗がん剤治療結果を解析し、抗がん剤治療結果と相関のあるパラメータを抗がん剤の有効性判定に用いるパラメータとして選択したものである。 Whether the anticancer drug treatment is effective can be determined by comparing the above parameters with a predetermined threshold. Here, the parameter selected from the activity value, the expression level, and the ratio between the activity value and the expression level is a parameter that is appropriately selected depending on the type of anticancer agent and the type of cancer. This parameter is the CDK activity value for tumor cells that were previously removed from anticancer drug treatment and stored prior to anticancer drug treatment. The amount of expression was measured, the results of anticancer drug treatment were analyzed for each parameter, and parameters correlated with the results of anticancer drug treatment were selected as parameters used for determining the effectiveness of anticancer drugs. .
閾値と比較するパラメータは、所定のCDKにおける１つのパラメータであってもよいし、２つのパラメータの組合せであってもよい。２つのパラメータを選択する場合、それぞれにおけるパラメータをそれぞれの閾値と比較する。 The parameter to be compared with the threshold value may be one parameter in a predetermined CDK or a combination of two parameters. When selecting two parameters, each parameter is compared with a respective threshold value.
判定の指標となるＣＤＫは、１種類であってもよいし（第１の有効性予測方法）、２種類以上であってもよい（第２の有効性予測方法）。 There may be one type of CDK as an index for determination (first effectiveness prediction method), or two or more types (second effectiveness prediction method).
２種類以上のＣＤＫを採用する場合、複数のCDKについて、それぞれにおけるパラメータをそれぞれの閾値と比較し、各キナーゼの比較結果の組み合わせにより、有効性を予測してもよい（第２−１の有効性予測方法）。この場合、閾値と比較するパラメータの種類は、複数のＣＤＫにおいて、同じ種類のパラメータ（例えば発現量）を用いてもよいし、異なる種類のパラメータ（例えば一方のＣＤＫについては発現量を比較し、他方のＣＤＫについては活性値を比較する）を用いてもよい。 When two or more types of CDKs are employed, the effectiveness of each of the plurality of CDKs may be predicted by comparing the respective parameters with respective threshold values and combining the comparison results of the respective kinases (2-1 effective Sex prediction method). In this case, the type of parameter to be compared with the threshold may be the same type of parameter (for example, expression level) in a plurality of CDKs, or different types of parameters (for example, the expression level for one CDK may be compared, For the other CDK, the activity value may be compared).
また、複数種類のＣＤＫを採用する場合において、まず第１の有効性予測方法で、第１のＣＤＫに基づいて予測し、第１の有効性予測方法で有効性が疑われると判定された腫瘍細胞に関して、第１のＣＤＫとは異なるＣＤＫについて、活性値、発現量および活性値と発現量との比から選択されるパラメータと、該パラメータに対応する閾値と比較することによって、有効性を予測してもよい（第２−２の有効性予測方法）。第２−２の有効性予測方法で、第１ＣＤＫと異なるＣＤＫは、１種類のＣＤＫ（第２ＣＤＫ）であってもよいし、複数種類のＣＤＫ（第３、第４・・・ＣＤＫ）を用いてもよい。複数種類のＣＤＫを用いる場合、それぞれのＣＤＫについて、各ＣＤＫの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、該パラメータに対応する閾値とを比較し、これらの比較結果の組み合わせに基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する。 In addition, in the case of employing a plurality of types of CDKs, a tumor that is first predicted based on the first CDK by the first effectiveness prediction method and is determined to be suspected of being effective by the first effectiveness prediction method For a cell, for a CDK different from the first CDK, efficacy is predicted by comparing the parameter selected from the activity value, the expression level and the ratio of the activity value to the expression level with a threshold value corresponding to the parameter. It may be possible (the 2-2 effectiveness prediction method). In the effectiveness prediction method 2-2, the CDK different from the first CDK may be one type of CDK (second CDK) or a plurality of types of CDKs (third, fourth,... CDK). May be. When using a plurality of types of CDKs, for each CDK, at least one parameter selected from the group consisting of the activity value of each CDK, the expression level, and the ratio between the activity value and the expression level, and a threshold value corresponding to the parameter And predicting the effectiveness of the anticancer drug treatment of the patient based on a combination of these comparison results.
第２のＣＤＫについて、有効性の判定に用いるパラメータは、上記群から選ばれる。パラメータは１つだけ選択してもよいし、２つのパラメータを選択して、それぞれの閾値と比較してもよい。また、異なるＣＤＫとして複数種類のＣＤＫ、すなわち第２、さらには第３、第４のＣＤＫについて測定する場合、判定に使用するパラメータは、全て同種のパラメータ（例えば発現量）を用いてもよいし、異なる種類のパラメータ（例えば第２のＣＤＫは発現量とし、第３のＣＤＫは活性値とするなどの組合わせ）を用いてもよい。 For the second CDK, the parameter used to determine effectiveness is selected from the above group. Only one parameter may be selected, or two parameters may be selected and compared with respective threshold values. Further, when different CDKs are measured for a plurality of types of CDKs, that is, the second, third, and fourth CDKs, the same parameters (eg, expression levels) may be used for the determination. Different types of parameters (for example, a combination of the second CDK as the expression level and the third CDK as the activity value) may be used.
本発明の第２の有効性予測方法は、予測の正答率を上げる点で有効である。さらに第２−２の予測方法により、第１の予測方法で有効であると判定されない場合であっても、抗がん剤治療が有効な場合が少なくないので、第２の有効性予測方法を採用する意義がある。
また、抗がん剤治療の効き方にも、さらに病状が悪化することを防止するレベルと、腫瘍を縮小させて、病状を快方に向かわせることができるレベルとに分類することができ、第２の有効性予測方法、特に第２−２の有効性予測方法により、抗がん剤治療の効き方のレベルを加味した予測を行なうこともできる。
The second effectiveness prediction method of the present invention is effective in increasing the correct answer rate of prediction. Furthermore, even if it is not determined that the first prediction method is effective by the second prediction method, the anticancer drug treatment is often effective. There is significance to adopt.
In addition, the effect of anticancer drug treatment can be classified into a level that prevents further deterioration of the medical condition and a level that can reduce the tumor and make the medical condition better. Prediction taking into account the level of effectiveness of anticancer drug treatment can also be performed by the second effectiveness prediction method, particularly the effectiveness prediction method 2-2.
本発明の有効性予測方法は、ＣＤＫだけでなく、さらにサイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫインヒビター）の発現量を、対応する閾値と比較し、前記ＣＤＫの比較結果と、前記ＣＤＫインヒビターの比較結果との組み合わせに基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測してもよい（第３の有効性予測方法）。ＣＤＫインヒビターは、サイクリン・ＣＤＫ複合体に結合し、その活性を阻害する因子群で、ＩＮＫ４ファミリーとＣＩＰ／ＫＩＰファミリーに分類される。本発明の有効性予測方法では、ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーが好ましく用いられ、特にｐ２１が好ましく用いられる。ｐ２１は、細胞増殖サイクルにおけるＧ１期及びＧ２期チェックポイントの双方で進行を阻害するインヒビターで、損傷したＤＮＡの修復のための時間を与えることができる。 The method for predicting the effectiveness of the present invention comprises comparing not only CDK but also the expression level of a cyclin-dependent kinase inhibitor (CDK inhibitor) with a corresponding threshold, and the comparison result of the CDK and the comparison result of the CDK inhibitor Based on these combinations, the effectiveness of the anticancer drug treatment of the patient may be predicted (third effectiveness prediction method). CDK inhibitors are a group of factors that bind to the cyclin / CDK complex and inhibit its activity, and are classified into the INK4 family and the CIP / KIP family. In the effectiveness prediction method of the present invention, the CIP / KIP family is preferably used, and in particular, p21 is preferably used. p21 is an inhibitor that inhibits progression at both the G1 and G2 checkpoints in the cell growth cycle and can provide time for repair of damaged DNA.
第３の有効性予測方法は、ＣＤＫを所定パラメータについて閾値と比較した結果と、ＣＤＫインヒビターの発現量を閾値と比較した結果の組み合わせに基づいて、抗がん剤治療の有効性を予測してもよいし、第１段階でＣＤＫを所定パラメータについて閾値と比較し、有効性を予測判定した（第１の有効性予測方法）後、有効であると判定されなかった腫瘍細胞について、第２段階でＣＤＫインヒビターの発現量を閾値と比較し、有効である可能性が高いものを選び出すようにしてもよい。 The third effectiveness prediction method predicts the effectiveness of anticancer drug treatment based on a combination of a result of comparing CDK with a threshold for a predetermined parameter and a result of comparing the expression level of a CDK inhibitor with a threshold. In addition, after the CDK is compared with a threshold value for a predetermined parameter in the first step and the effectiveness is predicted and determined (first effectiveness prediction method), the second step is performed for the tumor cells that are not determined to be effective. Then, the expression level of the CDK inhibitor may be compared with a threshold value, and the one that is highly likely to be effective may be selected.
尚、ＣＭＦ投与の治療有効性予測因子として、Ｈｅｒ２やｐ２１が報告されている。Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ（ＩＢＣＳＧ）のトライアルでは、Ｈｅｒ２が過剰発現している乳がん患者に対してＣＭＦ投与が無効であることが示され、ｐ２１に関しては、ｐ２１高発現患者群における無病生存率が、低発現患者群よりも有意に悪いことが報告されている。しかし、Ｈｅｒ２，ｐ２１ともにＣＭＦ療法に対する効果の低い患者群に予測する因子であり、積極的に治療効果のある患者群を予測する因子の報告例はない。一方、本発明の予測方法は、有効であることを積極的に示すもので、しかも閾値を厳格にすることで、１００％に近い有効性を期待できる場合を提示することができる。 Here, Her2 and p21 have been reported as predictors of therapeutic efficacy of CMF administration. A trial of The International Breast Cancer Study Group (IBCSG) showed that CMF administration was ineffective for breast cancer patients overexpressing Her2, and for p21, the disease-free survival rate in the p21 high-expressing patient group It is reported to be significantly worse than the low-expression patient group. However, both Her2 and p21 are factors that are predicted for a patient group having a low effect on CMF therapy, and there are no reported examples of factors that positively predict a patient group that has a therapeutic effect. On the other hand, the prediction method of the present invention positively shows that it is effective, and it is possible to present a case where effectiveness close to 100% can be expected by tightening the threshold value.
本発明の有効性予測方法において、閾値は、抗がん剤の種類、がんの種類により適宜設定される値である。具体的には所定のがんに対して所定の抗がん剤を投与した抗がん剤治療結果と上記のパラメータとの関係を、多くの抗がん剤治療結果について調べ、多数の抗がん剤治療結果と相関のあるパラメータに関して、その抗がん剤治療結果が有効であった場合を選択できるように設定された値である。好ましくは抗がん剤治療結果が全て有効であった場合のみを選択できるように閾値を設定する。このように、実際の臨床治療結果に基づいて閾値の設定が行われるため、確度の高い有効性の判定が可能となる。閾値の設定に用いる臨床治療結果の数を増加させることにより、有効性判定の確度を向上させることができる。なお、抗がん剤治療結果としては、所定の抗がん剤治療を続けることにより生じた腫瘍サイズの変化や、抗がん剤投与を５〜６年続けて再発の有無を調べた結果等が挙げられる。 In the effectiveness prediction method of the present invention, the threshold value is a value that is appropriately set depending on the type of anticancer agent and the type of cancer. Specifically, we investigated the relationship between the above-mentioned parameters and the results of anti-cancer drug treatment with a given anti-cancer agent administered to a given cancer. It is a value set so that the parameter correlated with the cancer treatment result can be selected when the anticancer treatment result is effective. Preferably, the threshold value is set so that only the case where all the anticancer drug treatment results are effective can be selected. Thus, since the threshold is set based on the actual clinical treatment result, it is possible to determine the effectiveness with high accuracy. By increasing the number of clinical treatment results used for setting the threshold, the accuracy of effectiveness determination can be improved. In addition, as a result of anticancer drug treatment, changes in tumor size caused by continuing prescribed anticancer drug treatment, results of examining the presence or absence of recurrence after continuing anticancer drug administration for 5 to 6 years, etc. Is mentioned.
ＣＤＫ活性値とは、試料中に含まれるＣＤＫにより基質に導入されたリン酸量に基づく値であり、リン酸量を測定する際に用いられた標識物（例えば３２Ｐ、蛍光）の標準品の測定値から定量的に計算される値（単位をU（ユニット）で表す）である。具体的には、検体の細胞可溶化液から活性型ＣＤＫを含む試料を調製し、３２Ｐ標識したＡＴＰ（γ−〔３２Ｐ〕−ＡＴＰ）を用いて、基質タンパク質に３２Ｐを取り込ませ、標識されたリン酸化基質の標識量を測定し、標準品で作成された検量線をもとに定量する方法がある。また放射性物質の標識を用いない方法としては、特開２００２−３３５９９７号に開示の方法が挙げられる。この方法は、検体の細胞可溶化液から、目的の活性型ＣＤＫを含む試料を調製し、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）と基質を反応させて、該基質タンパク質のセリン又はスレオニン残基にモノチオリン酸基を導入し、導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質又は標識酵素を結合させることによって基質タンパク質を標識し、標識されたチオリン酸基質の標識量（標識蛍光物質を用いた場合には蛍光量）を測定し、標準品で作成された検量線に基づいて定量する方法である。
The CDK activity value is a value based on the amount of phosphoric acid introduced into the substrate by CDK contained in the sample, and is a standard product of a label (for example, 32 P, fluorescence) used when measuring the amount of phosphoric acid. It is a value (unit is represented by U (unit)) that is quantitatively calculated from the measured value. Specifically, a sample containing active CDK was prepared from a sample cell lysate, and 32 P was incorporated into the substrate protein using 32 P-labeled ATP (γ- [ 32 P] -ATP). There is a method in which the amount of labeled phosphorylated substrate is measured and quantified based on a calibration curve prepared with a standard product. Moreover, as a method not using the label of the radioactive substance, a method disclosed in JP-A-2002-335997 can be mentioned. In this method, a sample containing a target active CDK is prepared from a cell lysate of a specimen,
活性測定に供する試料は、検体の細胞可溶化液から目的のＣＤＫを特異的に採集することにより調製する。この場合、目的のＣＤＫに特異的な抗ＣＤＫ抗体を用いて調製してもよいし、特定のサイクリン依存性キナーゼ（例えばサイクリンＡ依存性キナーゼ、サイクリンＢ依存性キナーゼ、サイクリンＥ依存性キナーゼ）活性測定の場合には、抗サイクリン抗体を用いて調製する。いずれの場合も活性型ＣＤＫ以外のＣＤＫが試料に含まれることになる。例えばサイクリン・ＣＤＫ複合体にＣＤＫインヒビターが結合した複合体も含まれる。また、抗ＣＤＫ抗体を用いた場合には、ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体などが含まれる。従って、活性値は、活性型、不活性型、各種競合反応が混在する状態下で、リン酸化された基質の単位（Ｕ）として測定される。 A sample to be used for activity measurement is prepared by specifically collecting a target CDK from a sample cell lysate. In this case, it may be prepared using an anti-CDK antibody specific for the target CDK, or a specific cyclin-dependent kinase (eg, cyclin A-dependent kinase, cyclin B-dependent kinase, cyclin E-dependent kinase) activity In the case of measurement, it is prepared using an anti-cyclin antibody. In either case, a CDK other than the active CDK is included in the sample. For example, a complex in which a CDK inhibitor is bound to a cyclin / CDK complex is also included. Further, when an anti-CDK antibody is used, CDK alone, a complex of CDK and cyclin and / or a CDK inhibitor, a complex of CDK and other compounds, and the like are included. Therefore, the activity value is measured as a unit (U) of a phosphorylated substrate in a state where an active type, an inactive type, and various competitive reactions coexist.
ＣＤＫ発現量とは、細胞可溶化液から測定される目的のＣＤＫ量（分子個数に対応する単位）であって、タンパク質混合物から目的のタンパク質量を測定する従来公知の方法で測定できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法などを使用してもよいし、特開２００３−１３０８７１号に開示の方法で測定することもできる。目的のタンパク質（ＣＤＫ）は、特異的抗体を用いて捕捉すればよい。例えば、抗ＣＤＫ１抗体を用いることにより、細胞内に存在するＣＤＫ１のすべて（ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体を含む）を捕捉できる。 The CDK expression level is the target CDK level (unit corresponding to the number of molecules) measured from the cell lysate, and can be measured by a conventionally known method for measuring the target protein level from a protein mixture. For example, an ELISA method, a Western blot method, or the like may be used, and measurement may be performed by the method disclosed in JP-A No. 2003-130871. The target protein (CDK) may be captured using a specific antibody. For example, by using an anti-CDK1 antibody, it is possible to capture all of CDK1 present in cells (including CDK alone, a complex of CDK and cyclin and / or CDK inhibitor, a complex of CDK and other compounds).
細胞可溶化液は、腫瘍細胞を含む組織などの生体試料を用いて調製することができる。具体的には、生体試料に緩衝液を添加し、緩衝液中の生体試料をホモジナイズして細胞膜内又は核膜内に存在する物質を緩衝液中に遊離させる。得られたホモジネートを遠心分離して採取される上清を細胞可溶化液とすることができる。この細胞可溶化液には、細胞膜内又は核膜内に存在するタンパク質などの分子が含まれている。遠心分離前及び／又は遠心分離後に、タンパク質の生成や抽出などの処理を行なっていてもよい。上述の緩衝液には、界面活性剤、プロテアーゼインヒビターなどを適宜添加してもよい。 The cell lysate can be prepared using a biological sample such as a tissue containing tumor cells. Specifically, a buffer solution is added to the biological sample, and the biological sample in the buffer solution is homogenized to release substances present in the cell membrane or the nuclear membrane into the buffer solution. The supernatant obtained by centrifuging the obtained homogenate can be used as a cell lysate. This cell lysate contains molecules such as proteins present in the cell membrane or the nuclear membrane. Processing such as protein production or extraction may be performed before centrifugation and / or after centrifugation. A surfactant, protease inhibitor, or the like may be appropriately added to the above buffer solution.
尚、ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量（ＣＤＫ比活性）、又はＣＤＫ発現量／ＣＤＫ活性値で示される比は、細胞に存在しているＣＤＫのうち、活性を示すＣＤＫの割合に相当し、測定対象である腫瘍細胞が固有のものとして示す増殖状態に基づくＣＤＫ活性レベルといえ、測定に供する試料の調製方法に依存しない。測定試料調製方法、特に生検材料から調製される細胞可溶化液は、実際に採取された組織中に含まれる非細胞性組織、例えば細胞外基質の多寡による影響をうけやすい。従って、ＣＤＫ活性値と発現量との比を用いることにより、測定試料調製時に不可避の影響を控除することができ、タンパク質に着目した判定方法であっても、高精度に有効性を判定することができる。 The ratio indicated by CDK activity value / CDK expression level (CDK specific activity) or CDK expression level / CDK activity value corresponds to the ratio of CDK showing activity among CDKs present in cells. The level of CDK activity is based on the proliferation state that the tumor cells of interest show as unique, and does not depend on the preparation method of the sample to be measured. Cell lysates prepared from a measurement sample preparation method, particularly from a biopsy material, are easily affected by the number of non-cellular tissues, eg, extracellular matrix, contained in the actually collected tissue. Therefore, by using the ratio between the CDK activity value and the expression level, it is possible to subtract the inevitable influence when preparing a measurement sample, and even with a determination method focusing on proteins, the effectiveness can be determined with high accuracy. Can do.
ＣＤＫインヒビター発現量とは、細胞可溶化液から測定される目的のＣＤＫインヒビター量（分子個数に対応する単位）であって、タンパク質混合物から目的のタンパク質量を測定する従来公知の方法で測定できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法などを使用してもよい。目的のタンパク質（ＣＤＫインヒビター）は、特異的抗体を用いて捕捉すればよい。目的のタンパク質と特異的に結合できるものであれば、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。例えば、ｐ２１を捕捉する場合、抗ｐ２１モノクローナル抗体、抗ｐ２１ポリクローナル抗体のいずれも用いることができる。 The expression level of the CDK inhibitor is the target CDK inhibitor amount (unit corresponding to the number of molecules) measured from the cell lysate, and can be measured by a conventionally known method for measuring the target protein amount from the protein mixture. For example, an ELISA method or a Western blot method may be used. The target protein (CDK inhibitor) may be captured using a specific antibody. As long as it can specifically bind to the target protein, it may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. For example, when capturing p21, either an anti-p21 monoclonal antibody or an anti-p21 polyclonal antibody can be used.
はじめに、下記実施例で用いた測定方法について説明する。
〔測定方法〕
（１）ＣＤＫ活性の測定
目的とする腫瘍細胞を含む組織から調製した検体（細胞可溶化液）から、１．５ｍｌ容量のエッペンドルフチューブに、５００μｌの溶解緩衝液中に溶解物の全タンパク質量が１００μｇとなる量を加えて試料を調製した。
活性測定しようとするＣＤＫに特異的抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社のポリクローナル抗ＣＤＫ１抗体又はポリクローナル抗ＣＤＫ２抗体）２μｇ及び２０μｌのプロテインＡをコートしたセファロースビーズ（バイオラッド社製）を、上記サンプルに加えて４℃で１時間反応させた後、ビーズを緩衝液（０．１％ＮＰ−４０、５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．０）で３回洗浄し、１５μｌのキナーゼ緩衝液中に再懸濁させて、目的のＣＤＫが結合したビーズを含む試料を得た。
First, the measurement methods used in the following examples will be described.
〔Measuring method〕
(1) Measurement of CDK activity From the specimen (cell lysate) prepared from the tissue containing the target tumor cells, the total protein amount of the lysate in 500 μl of lysis buffer was added to a 1.5 ml Eppendorf tube. A sample was prepared by adding an amount of 100 μg.
Sepharose beads (manufactured by Bio-Rad) coated with 2 μg and 20 μl of protein A specific antibody (polyclonal anti-CDK1 antibody or polyclonal anti-CDK2 antibody from Santa Cruz Biotechnology Co., Ltd.) to be measured for CDK were added to the above sample. After reacting for 1 hour at 4 ° C., the beads were washed 3 times with buffer (0.1% NP-40, 50 mM Tris-HCl, pH 7.0) and resuspended in 15 μl kinase buffer. A sample containing beads to which the target CDK was bound was obtained.
この試料においては、ＣＤＫ単体、サイクリン結合した活性型ＣＤＫ、活性型ＣＤＫとＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとＣＤＫインヒビターの複合体の全て（以下、これらを区別しないときは「ＣＤＫ群」という）がＣＤＫ特異的抗体により捕捉され、ビーズに結合した状態となっている。このような試料中のＣＤＫ群の活性を、下記方法により測定した。 In this sample, all of CDK alone, cyclin-bound active CDK, active CDK and CDK inhibitor complex, and CDK and CDK inhibitor complex (hereinafter referred to as “CDK group” when these are not distinguished) It is captured by a CDK-specific antibody and is bound to the beads. The activity of the CDK group in such a sample was measured by the following method.
ＣＤＫ１及びＣＤＫ２に対応する基質であるヒストンＨ１（アップステイトバイオテクノロジー製）１０μｇ、５ｍＭのアデノシン５’−Ｏ−（８−チオ３リン酸）（ＡＴＰ−γＳ、シグマ社製）、及び緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を含む基質溶液を調製し、この基質溶液を上記ＣＤＫ含有試料に加えて５０μｌとし、３７℃で１０分間振とうしてインキュベートした。下記式に示すように、基質のセリン又はスレオニン残基が、活性型ＣＤＫによりリン酸化され、モノチオリン酸化基質が得られる。
Histone H1 (manufactured by Upstate Biotechnology) 10 μg, 5
反応後、２０００ｒｐｍで２０秒間遠心して、ビーズを沈殿させ、モノチオリン酸を溶解した上澄み液１８μｌを採取した。この上澄み液１８μｌに、１５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ９．２、５ｍＭのＥＤＴＡを含む結合緩衝液１５μｌを加えた。さらに、１０ｍＭのヨードアセチルビオチン溶液（１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で暗所において９０分間室温にてインキュベートすることにより、モノチオリン酸化基質のチオリン酸中の硫黄をビオチン化標識した。ヨードアセチルビオチンとチオリン酸との反応の停止は、６−メルカプトエタノールの添加により行った。 After the reaction, the mixture was centrifuged at 2000 rpm for 20 seconds to precipitate beads, and 18 μl of a supernatant solution in which monothiophosphoric acid was dissolved was collected. To 18 μl of this supernatant, 15 μl of binding buffer containing 150 mM Tris-HCl, pH 9.2, 5 mM EDTA was added. Furthermore, the monothiophosphorylated substrate, sulfur in thiophosphate, was biotinylated by incubating in 10 mM iodoacetylbiotin solution (100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA) in the dark for 90 minutes at room temperature. . The reaction between iodoacetylbiotin and thiophosphoric acid was stopped by adding 6-mercaptoethanol.
ビオチン標識されたチオリン酸化基質０．４μｇを、スロットブロッターを用いてＰＶＤＦ膜上に添加し、吸引した。得られた膜を１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間ブロックし、アビジン−ＦＩＴＣ（ベクター製）を３７℃で１時間反応させた。その後、膜を５０ｍＭ ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で１０分間３回洗浄した。洗浄後、膜上のイメージを蛍光イメージアナライザー（バイオラッド社製）により分析した。活性は、検量線に基づいて算出した。 0.4 μg of biotinylated thiophosphorylated substrate was added onto the PVDF membrane using a slot blotter and aspirated. The obtained membrane was blocked with 1% bovine serum albumin (BSA) for 30 minutes, and avidin-FITC (manufactured by Vector) was reacted at 37 ° C. for 1 hour. The membrane was then washed 3 times for 10 minutes with 50 mM TBS (25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl). After washing, the image on the membrane was analyzed with a fluorescence image analyzer (Bio-Rad). The activity was calculated based on a calibration curve.
尚、検量線は、既存量のタンパク質（ビオチン標識免疫グロブリン）をPVDF膜上に吸着させ、上記と同様の方法でＦＩＴＣ標識し、タンパク質の蛍光強度を蛍光イメージアナライザー（バイオラッド社製）で測定することにより作成した。従って、測定されるCDK活性１Uは、前記タンパク質１ngのときの蛍光量と同等の蛍光強度を示す値をいう。 For the calibration curve, an existing amount of protein (biotin-labeled immunoglobulin) is adsorbed on a PVDF membrane, FITC-labeled in the same manner as described above, and the fluorescence intensity of the protein is measured with a fluorescence image analyzer (manufactured by Bio-Rad). Created by. Therefore, the measured CDK activity 1U refers to a value indicating a fluorescence intensity equivalent to the amount of fluorescence when the protein is 1 ng.
（２）ＣＤＫ発現量の測定
ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に浸漬して初期化したＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）をセットしたスロットブロッターの各ウェル（２×２×３ｍｍ、許容量１００μｌ）に、目的の腫瘍細胞を含む組織から調製した細胞可溶化液を５０μｌずつ注入した。各ウェルには、タンパク質が総量で５〜１５μｇずつ含まれている。
(2) Measurement of CDK expression level Each well (2 × 2 ×) of a slot blotter in which a PVDF membrane (manufactured by Millipore) initialized by immersion in TBS (25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl) was set. The cell lysate prepared from the tissue containing the target tumor cells was injected in an amount of 50 μl each into 3 mm and an allowable amount of 100 μl). Each well contains 5 to 15 μg of protein in total.
注入後、ウェルの底面、すなわちメンブレンの裏面から負圧約１５０ｍｍＨｇで約５０秒間吸引し、膜に試料を吸着させた。 After the injection, the sample was adsorbed on the membrane by sucking from the bottom of the well, that is, the back of the membrane at a negative pressure of about 150 mmHg for about 50 seconds.
次いで、試料に特異的に結合するウサギ抗ＣＤＫ１抗体又はウサギ抗ＣＤＫ２抗体（一次抗体）の溶液を、各ウェルに注入し、室温で約３０分間静置した後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約５０秒間吸引して、その後、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。 Next, a solution of a rabbit anti-CDK1 antibody or a rabbit anti-CDK2 antibody (primary antibody) that specifically binds to the sample is injected into each well and allowed to stand at room temperature for about 30 minutes, and then from the bottom of the well at a negative pressure of 500 mmHg. The solution was aspirated for 50 seconds, and then washed with TBS (25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl).
次に、ビオチン化した抗ウサギ抗体（二次抗体）の溶液を各ウェルに注入し、室温で約３０分間静置した後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約５０秒間吸引して、その後、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。 Next, a biotinylated anti-rabbit antibody (secondary antibody) solution is injected into each well, allowed to stand at room temperature for about 30 minutes, and then sucked from the bottom of the well at a negative pressure of 500 mmHg for about 50 seconds, and then TBS. Washed with (25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl).
ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン試薬を４０μｌずつ注入し、約３０分間室温で静置して、二次抗体をＦＩＴＣで標識した。ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約５０秒間吸引して、その後、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。 40 μl of FITC-labeled streptavidin reagent was injected at a time and allowed to stand at room temperature for about 30 minutes, and the secondary antibody was labeled with FITC. Suction was performed from the bottom of the well at a negative pressure of 500 mmHg for about 50 seconds, and then washed with TBS (25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl).
ＰＶＤＦメンブレンをプレートから取外して蒸留水で洗浄し、２０％メタノールに５分間浸漬した。次いで、約１５分間室温で乾燥させた後、膜に吸着されたタンパク質の蛍光強度を、イメージアナライザ（バイオラッド社）によって分析、測定し、予め作成した検量線をもとに、ＦＩＴＣ標識されたタンパク質（ＣＤＫ１又はＣＤＫ２又はＣＤＫ４）を定量（ＣＤＫ個数に対応する量を標準タンパク質の重量（ｎｇ）で換算）した。このようにして測定されるＣＤＫ量は、細胞中に存在しているＣＤＫ群（ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体など）の総量である。 The PVDF membrane was removed from the plate, washed with distilled water, and immersed in 20% methanol for 5 minutes. Next, after drying at room temperature for about 15 minutes, the fluorescence intensity of the protein adsorbed on the membrane was analyzed and measured by an image analyzer (BioRad), and FITC-labeled based on a calibration curve prepared in advance. The protein (CDK1, CDK2, or CDK4) was quantified (the amount corresponding to the CDK number was converted to the weight (ng) of the standard protein). The amount of CDK measured in this way is the total amount of CDK groups (CDK alone, a complex of CDK and cyclin and / or CDK inhibitor, a complex of CDK and other compounds, etc.) present in the cell. is there.
尚、検量線は、０．００５％のＮＰ−４０及び５０μｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＴＢＳ中に、５種類の濃度の純品の組換えＣＤＫタンパク質の溶液を、上記と同様に処理したウェルに５０μｌずつ注入し、上記と同様の方法でＦＩＴＣ標識し、蛍光強度を測定して、蛍光強度と量の関係を表すことにより標準曲線を作成した。 The calibration curve was obtained for wells treated in the same manner as described above with pure recombinant CDK protein solutions at 5 different concentrations in TBS containing 0.005% NP-40 and 50 μg / ml BSA. 50 μl each was injected, FITC labeled by the same method as described above, fluorescence intensity was measured, and a standard curve was created by expressing the relationship between fluorescence intensity and amount.
（３）ＣＤＫ比活性の算出
上記で測定したＣＤＫ活性及びＣＤＫ発現量の測定値から、下記式により、ＣＤＫ比活性（ｍＵ／ｎｇ）を算出した。
ＣＤＫ比活性＝ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量
(3) Calculation of CDK specific activity The CDK specific activity (mU / ng) was calculated from the measured values of the CDK activity and the CDK expression level measured above by the following formula.
CDK specific activity = CDK activity value / CDK expression level
（４）ｐ２１の発現量
ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭｐ２１ＷＡＦ１ ＥＬＩＳＡキット（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて定量した。
ＷＡＦ１スタンダード（２０ユニット／ｍｌのｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅされたＷＡＦ１）を、検体である細胞可溶化液で段階的に希釈したｗａｆ１試料液（ＷＡＦ１スタンダードと検体の混合液）を調製する。なお、各試料液において、細胞可溶化液は４倍以上希釈されたものとなっている。
ＷＡＦ１に特異的なウサギポリクローナル抗体（一次抗体）を固定した９６穴プラスチックウエルに、上記ＷＡＦ１試料液及びＷＡＦ１スタンダードのみをそれぞれ１００μｌ／ウェルで加える。ウェルプレートをシールし、室温で２時間インキュベートして、一次抗体と反応させた。
洗浄用バッファー（２０倍濃縮液２５ｍｌを、４７５ｍｌの脱イオン水に加えて調製）、３回洗浄した後、検出用抗体（ビオチン化抗ＷＡＦ１モノクローナル抗体）を１００μｌ／ウェルを加え、ウェルプレートをシールして、室温で１時間、反応させた。
各ウェルを洗浄用バッファーで３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン希釈液１００μｌ／ウェルを加え、緩やかに攪拌し、プレートをシールして、室温で３０分間反応させた後、未反応のペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを除去した。
各ウェルを洗浄用バッファーで３回洗浄した後、各ウェルに、基質溶液（色素源基質）１００μｌ加え、室温で３０分間、暗所で反応させる。３０分後、各ウェルに、停止液（２．５Ｎ硫酸）１００μｌ加えて、反応を停止させ、各ウェルの吸光度を、プレートリーダーを用いて、４５０／５４０ｎｍで計測した。
ＷＡＦ１スタンダードよりなる検量線から、ＷＡＦ１試料液中のｐ２１ＷＡＦ１濃度を計算した。
(4) Expression level of p21 Quantified using the CALBIOCHEMp21WAF1 ELISA kit (EMD Bioscience).
A WAF1 sample solution (WAF1 standard and sample mixture) is prepared by stepwise diluting WAF1 standard (20 units / ml lyophilized WAF1) with a cell lysate as a sample. In each sample solution, the cell lysate is diluted 4 times or more.
Only the WAF1 sample solution and the WAF1 standard are added at 100 μl / well to a 96-well plastic well to which a rabbit polyclonal antibody specific to WAF1 (primary antibody) is fixed. The well plate was sealed and incubated for 2 hours at room temperature to react with the primary antibody.
Washing buffer (prepared by adding 25 ml of 20-fold concentrated solution to 475 ml of deionized water) After washing 3 times, add 100 μl / well of detection antibody (biotinylated anti-WAF1 monoclonal antibody), and seal well plate The reaction was allowed to proceed for 1 hour at room temperature.
Wash each well 3 times with washing buffer, add 100 μl / well of peroxidase-conjugated streptavidin dilution, gently agitate, seal the plate, react at room temperature for 30 minutes, and then react with unreacted peroxidase. Streptavidin was removed.
After washing each well 3 times with washing buffer, 100 μl of substrate solution (chromogenic substrate) is added to each well and allowed to react at room temperature for 30 minutes in the dark. After 30 minutes, 100 μl of stop solution (2.5 N sulfuric acid) was added to each well to stop the reaction, and the absorbance of each well was measured at 450/540 nm using a plate reader.
The p21WAF1 concentration in the WAF1 sample solution was calculated from a calibration curve composed of the WAF1 standard.
〔実施例１：乳がん細胞のＣＤＫ１比活性に基づく予測判定と抗がん剤治療有効性との関係〕
（１）腫瘍細胞及び検体（細胞可溶化液）の調製
測定用腫瘍細胞として、２５人の乳がん患者の手術のより摘出されたがん組織で、５〜６年保存されたものを使用した。尚、摘出手術前には、抗がん剤治療は行なわれていなかったものである。
これらの２５人の患者は、表１に示すように、摘出手術後、ＣＭＦ群の投与治療を受け、２５人中、Ｎｏ．１〜１６は再発せず、Ｎｏ．１７〜２５が再発した。
[Example 1: Relationship between prediction determination based on CDK1 specific activity of breast cancer cells and effectiveness of anticancer drug treatment]
(1) Preparation of tumor cells and specimen (cell lysate) As tumor cells for measurement, cancer tissues excised by surgery of 25 breast cancer patients and stored for 5 to 6 years were used. In addition, the anticancer drug treatment was not performed before the extraction operation.
As shown in Table 1, these 25 patients received CMF group treatment after excision surgery. Nos. 1-16 did not recur, no. 17-25 relapsed.
上記乳がん細胞Ｎｏ．１〜２５のそれぞれについて、０．１ｗ／ｖ％ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）（カルビオケム社製）、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム及び１００μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社）を含む溶解緩衝液中で、電動ホモジナイザを用いて上記乳がん細胞をホモジナイズし、細胞溶解液を調製した。
不溶物を１５０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心除去し、検体となる上清（細胞可溶化液）を得た。
The above breast cancer cell No. For each of 1 to 25, 0.1 w / v% Nonidet P-40 (NP-40) (manufactured by Calbiochem), 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA, 50 mM sodium fluoride, 1 mM The above breast cancer cells were homogenized using an electric homogenizer in a lysis buffer containing sodium orthovanadate and 100 μl / ml protease inhibitor cocktail (Sigma) to prepare a cell lysate.
Insoluble matter was removed by centrifugation at 15000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. to obtain a supernatant (cell lysate) as a specimen.
（２）ＣＤＫ１比活性と術後再発の有無との相関関係
（１）で調製した細胞可溶化液について、上記測定方法に従って、ＣＤＫ１活性及びＣＤＫ発現量を測定し、比活性を求めた。
(2) Correlation between CDK1 specific activity and presence / absence of postoperative recurrence For the cell lysate prepared in (1), CDK1 activity and CDK expression level were measured according to the above measurement method to determine specific activity.
各検体のＣＤＫ１比活性を、図２に示す。閾値（カットオフ値）として９０を設定した場合、比活性が９０以上の８例（Ｎｏ．１，６，９，１１〜１５）は、ＣＭＦ治療が有効であると判定された。表１より、この８例の患者はいずれも再発が確認されなかった。以上より、ＣＤＫ１比活性を測定し、所定の閾値と比較することによって、上記８例（Ｎｏ．１，６，９，１１〜１５）の患者はＣＭＦによる治療が有効であると予測できることがわかった。 The CDK1 specific activity of each specimen is shown in FIG. When 90 was set as the threshold value (cut-off value), it was determined that CMF treatment was effective in 8 cases (No. 1, 6, 9, 11 to 15) having a specific activity of 90 or more. From Table 1, no recurrence was confirmed in any of these 8 patients. From the above, it can be seen that by measuring CDK1 specific activity and comparing it with a predetermined threshold, it is possible to predict that the patients in the above 8 cases (No. 1, 6, 9, 11 to 15) are effectively treated with CMF. It was.
〔実施例２：乳がん細胞のＣＤＫ２及びＣＤＫ４発現量に基づく予測判定と抗がん剤治療の有効性との関係〕
実施例１で比活性が９０未満であった患者（患者Ｎｏ．２〜５，７，８，１０及び１６〜２５）のがん細胞を用いて、ＣＤＫ２及びＣＤＫ４の発現量（ｎｇ／μｇ ｌｙｓａｔｅ）を測定した。結果を図３に示す。
[Example 2: Relationship between prediction determination based on CDK2 and CDK4 expression levels of breast cancer cells and effectiveness of anticancer drug treatment]
Expression levels of CDK2 and CDK4 (ng / μg lysate) using cancer cells of patients (patient Nos. 2-5, 7, 8, 10, and 16-25) whose specific activity was less than 90 in Example 1 ) Was measured. The results are shown in FIG.
ＣＤＫ２の閾値を０．１９、ＣＤＫ４の閾値を３に設定した。ＣＤＫ２の発現量が閾値以上且つＣＤＫ４の発現量が閾値以上の場合は、ＣＭＦ治療が有効であると予測した。また、ＣＤＫ２の発現量が閾値未満又はＣＤＫ４の発現量が閾値未満の場合は、ＣＭＦ治療の有効性が低いと予測した。図３及び表１より、２例の例外を除いて、ＣＤＫ２の発現量が閾値以上且つＣＤＫ４の発現量が閾値以上の場合、ＣＭＦ治療後いずれも再発がなく、ＣＭＦ治療が有効であったと確認された。また、２例の例外を除いて、ＣＤＫ２の発現量が閾値未満又はＣＤＫ４の発現量が閾値未満の場合、ＣＭＦ治療後いずれも再発が認められ、ＣＭＦ治療の有効性が低かったことが確認された。以上より、ＣＤＫ１の比活性に基づく予測によって有効性が判定されない場合であっても、ＣＤＫ２及びＣＤＫ４の発現量に基づいて予測することによって、抗がん剤治療の有効性を高確率で判定できることがわかった。 The CDK2 threshold was set to 0.19, and the CDK4 threshold was set to 3. When the expression level of CDK2 was not less than the threshold value and the expression level of CDK4 was not less than the threshold value, it was predicted that CMF treatment was effective. Moreover, when the expression level of CDK2 was less than the threshold value or the expression level of CDK4 was less than the threshold value, it was predicted that the effectiveness of CMF treatment was low. 3 and Table 1, with the exception of two cases, when CDK2 expression level is equal to or higher than the threshold value and CDK4 expression level is equal to or higher than the threshold value, no recurrence was observed after CMF treatment, and CMF treatment was confirmed to be effective. It was done. In addition, with the exception of two cases, when CDK2 expression level was less than the threshold or CDK4 expression level was less than the threshold, recurrence was observed after CMF treatment, confirming that the effectiveness of CMF treatment was low. It was. From the above, even if the effectiveness is not determined by prediction based on the specific activity of CDK1, the effectiveness of anticancer drug treatment can be determined with high probability by making a prediction based on the expression levels of CDK2 and CDK4. I understood.
〔実施例３：マウス異種移植片におけるＣＤＫ２及びｐ２１に基づく予測性判断と抗がん剤治療有効性との関係〕
（１）検体（細胞可溶化液）の調製
５種類のヒト由来乳がん培養細胞（細胞Ａ〜Ｅ）を、マウスの背中の皮下に移植し、２１〜２８日間飼育して、乳がん細胞を生着させた。このようにして得られた、表２に示す乳がん細胞の担がんマウスＮｏ．１〜５０について、背中から２．５ｍｍ×２．５ｍｍの組織片（約５０ｍｇ）を切り取り、０．１ｗ／ｖ％ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）（カルビオケム）、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム及び１００μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社）を含む溶解緩衝液中で、電動ホモジナイザを用いて、上記乳がん細胞をホモジナイズし、細胞溶解液を調製した。
不溶物を１５０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心除去し、検体となる上清（細胞可溶化液）を得た。
[Example 3: Relationship between predictive judgment based on CDK2 and p21 in mouse xenografts and efficacy of anticancer drug treatment]
(1) Preparation of specimen (cell lysate) Five types of human-derived breast cancer cultured cells (cells A to E) are transplanted subcutaneously on the back of a mouse and reared for 21 to 28 days to engraft the breast cancer cells. I let you. The thus obtained breast cancer cell-bearing mice No. 1 shown in Table 2 were used. 1 to 50, a 2.5 mm × 2.5 mm tissue piece (about 50 mg) was cut from the back, 0.1 w / v% nonidet P-40 (NP-40) (Calbiochem), 50 mM Tris-HCl (
Insoluble matter was removed by centrifugation at 15000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. to obtain a supernatant (cell lysate) as a specimen.
（２）ＣＤＫ２比活性の測定及び判定
（１）で調製した細胞可溶化液について、上記ＣＤＫ活性の測定及びＣＤＫ発現量の測定方法に従って、ＣＤＫ２活性及びＣＤＫ２発現量を測定し、ＣＤＫ２比活性を求めた。
(2) Measurement and determination of CDK2 specific activity For the cell lysate prepared in (1), according to the measurement method of CDK activity and CDK expression level, the CDK2 activity and CDK2 expression level are measured. Asked.
（３）ｐ２１発現量の測定
（１）で調製した細胞可溶化液について、上記ｐ２１発現量の測定方法に従って、測定した。
(3) Measurement of expression level of p21 The cell lysate prepared in (1) was measured according to the method for measuring the expression level of p21.
（４）担がんマウスの抗がん剤治療結果
担がんマウスＮｏ．１〜５０に、パクリタキセルを２０ｍｇ／ｋｇ（マウス体重）／日で、１日１回、５日間、投与し、投与開始から１１日目までの腫瘍サイズを測定した。腫瘍サイズの変化に応じて、Ｎｏ．１〜５０のマウスを、タイプＩ、タイプＩＩ及びタイプＩＩＩのいずれかに分類した。
タイプＩのマウスは、抗がん剤に対する感受性が高いと確認されたマウスであり、このタイプのマウスへパクリタキセルを投与することにより、腫瘍はほぼ消失する。タイプＩＩのマウスは、抗がん剤に対する感受性は中程度であると確認されたマウスであり、このタイプのマウスへパクリタキセルを投与することにより腫瘍サイズの増大が抑制される。タイプＩＩＩのマウスは、抗がん剤の感受性が低いと確認されたマウスであり、このタイプのマウスへパクリタキセルを投与しても腫瘍サイズは増大し続ける。
(4) Anticancer drug treatment results of cancer-bearing mice From 1 to 50, paclitaxel was administered at a dose of 20 mg / kg (mouse body weight) / day once a day for 5 days, and the tumor size from the start of administration to the 11th day was measured. In accordance with the change in tumor size, no. 1-50 mice were classified as either type I, type II or type III.
Type I mice are mice that have been confirmed to be highly sensitive to anticancer drugs, and tumors are almost eliminated by administering paclitaxel to these types of mice. Type II mice are mice that have been confirmed to be moderately sensitive to anticancer drugs, and administration of paclitaxel to this type of mice suppresses the increase in tumor size. Type III mice are mice that have been confirmed to be less sensitive to anticancer drugs, and tumor size continues to increase even when paclitaxel is administered to this type of mice.
（５）抗がん剤治療判定及び正誤率
（２）で測定されたＣＤＫ２比活性について、カットオフ値４００に設定して、「Ｈｉｇｈ」（４００以上）及び「Ｌｏｗ」（４００未満）のいずれであるかを判定した。また、（３）で測定されたｐ２１発現量について、カットオフ値８に設定して、「Ｈｉｇｈ］（８以上）及び「Ｌｏｗ」（８未満）のいずれであるかを判定した。
さらに、ＣＤＫ２比活性及びｐ２１発現量に基づいて、図４に示すフローチャートに従って、それぞれのマウスが、薬剤感受性が高いタイプＩ、薬剤感受性が中程度のタイプＩＩ、及び薬剤感受性が低いタイプＩＩＩのいずれに該当するかを予測判定した。それぞれの測定値とともに予測判定結果を、表２に示す。
(5) Anti-cancer drug treatment determination and accuracy rate The CDK2 specific activity measured in (2) is set to a cut-off value of 400, and either “High” (400 or more) and “Low” (less than 400) Was determined. The p21 expression level measured in (3) was set to a cutoff value of 8, and it was determined whether it was “High” (8 or more) or “Low” (less than 8).
Further, based on the CDK2 specific activity and the expression level of p21, according to the flowchart shown in FIG. 4, each mouse is classified as either type I with high drug sensitivity, type II with moderate drug sensitivity, or type III with low drug sensitivity. Whether it falls under is predicted. Table 2 shows the prediction determination results together with the respective measured values.
尚、閾値としては、５０例のパラメータ測定値から抗がん剤治療有効性との関係で正答率が最も高くなるカットオフ値を設定した。 In addition, as a threshold value, the cutoff value from which the correct answer rate becomes the highest in relation to the anticancer drug treatment effectiveness was set from the parameter measurement values of 50 cases.
表２では、（５）においてＣＤＫ２及びＣＤＫインヒビターを用いた有効性の予測結果（表２中、「予測判定」）と、（４）において実際に抗がん剤を投与した結果（表２中、「抗がん剤治療結果」）とが同じ場合は「正」と示し、異なっている場合は「誤」と示した。 Table 2 shows the results of prediction of efficacy using CDK2 and CDK inhibitor in (5) ("Predictive judgment" in Table 2), and results of actual administration of anticancer drugs in (4) (in Table 2). , “Anti-cancer drug treatment result”) is the same as “correct”, and “difficult” is indicated when they are different.
表２に示すように、ＣＤＫ２比活性が閾値（４００）以上（「Ｈｉｇｈ」と判定される）マウスは全てタイプＩに分類され、閾値未満（「Ｌｏｗ」と判定される）マウスは、いずれもタイプＩＩ又はタイプＩＩＩに分類された。従って、ＣＤＫ２の比活性と閾値とを比較することにより、抗がん剤治療が有効であることを１００％の確率で予測することができた。 As shown in Table 2, mice whose CDK2 specific activity is greater than or equal to the threshold (400) (determined as “High”) are all classified as Type I, and any mice that are less than the threshold (determined as “Low”) Classified as type II or type III. Therefore, by comparing the specific activity of CDK2 and the threshold, it was possible to predict with 100% probability that the anticancer drug treatment was effective.
また、ｐ２１発現量が閾値（８）未満（「Ｌｏｗ」と判定される）マウスは、Ｎｏ．８のマウス（タイプＩＩＩに分類されている）以外、タイプＩ又はタイプＩＩに分類された。ｐ２１発現量が閾値以上のマウスは、Ｎｏ．３７，３８，４１，４２，４７，４８以外、タイプＩＩＩに分類された。従って、ｐ２１発現量と閾値とを比較することにより、抗がん剤治療によって腫瘍が消滅あるいは縮小することを高確率で予測することができた。 In addition, mice whose p21 expression level is less than the threshold (8) (determined as “Low”) Other than 8 mice (classified as type III), they were classified as type I or type II. Mice whose p21 expression level is greater than or equal to the threshold are No. Other than 37, 38, 41, 42, 47, 48, it was classified into type III. Therefore, by comparing the expression level of p21 with the threshold value, it was possible to predict with high probability that the tumor would disappear or shrink due to the anticancer drug treatment.
また、図４のフローチャートに従って抗がん剤治療の有効性を予測した結果は、（４）による実際の抗がん剤治療の結果と、高確率で整合していた。即ち、表２及び表３に示すように、５０例中、間違ったのは７例（正答率８６％）であったが、特に抗がん剤治療が有効であると判定されるタイプＩ及びＩＩについては、３６例中、間違ったのは１例だけで、正答率９７％であった。 Moreover, the result of predicting the effectiveness of the anticancer drug treatment according to the flowchart of FIG. 4 was highly consistent with the result of the actual anticancer drug treatment according to (4). That is, as shown in Tables 2 and 3, 7 out of 50 cases were correct (correct answer rate 86%), but type I and anticancer drug treatment were judged to be particularly effective. Regarding II, only one of the 36 cases was wrong, and the correct answer rate was 97%.
以上のように、ＣＤＫ２とＣＤＫインヒビターの２種類を用いて、閾値と比較することによって、抗がん剤治療の有効性を、高確率で予測することができた。 As described above, the effectiveness of anticancer drug treatment could be predicted with a high probability by comparing the threshold value using two types of CDK2 and CDK inhibitor.
本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法は、個々の患者について、抗がん剤治療が有効である場合に有効であると判定するもので、有効であると判定された場合には、高確率で有効な治療が期待できるので、抗がん剤治療を行なうか否かの、有用な判断指標として、医療現場で利用できる。 The method for predicting the effectiveness of anticancer drug treatment according to the present invention is determined to be effective when anticancer drug treatment is effective for individual patients. Since effective treatment can be expected with high probability, it can be used in the medical field as a useful judgment index for determining whether or not to perform anticancer drug treatment.
Claims (6)
ＣＤＫ比活性が第１閾値以上である場合に、前記患者の抗がん剤治療の有効性が高いと予測する工程；を含み、
前記ＣＤＫは、ＣＤＫ１又はＣＤＫ２である、抗がん剤治療の有効性予測方法。 Comparing the CDK specific activity, which is the ratio of the cyclin-dependent kinase (CDK) activity value and the expression level, in the breast cancer cells collected from the patient with a first threshold; and the CDK specific activity is greater than or equal to the first threshold; Predicting that the anticancer drug treatment of the patient is highly effective in some cases,
The method for predicting the effectiveness of anticancer drug treatment, wherein the CDK is CDK1 or CDK2.
前記比較工程においてさらに、患者から採取した乳がん細胞におけるＣＤＫ２の発現量と第２閾値とを比較するとともに、患者から採取した乳がん細胞におけるＣＤＫ４の発現量と第３閾値とを比較し、
前記予測工程においてさらに、ＣＤＫ１比活性が第１閾値未満であり、且つＣＤＫ２の発現量が第２閾値以上であり、且つＣＤＫ４の発現量が第３閾値以上である場合に、前記患者の抗がん剤治療の有効性が高いと予測し、ＣＤＫ１比活性が第１閾値未満であり、且つＣＤＫ２の発現量が第２閾値未満であり、且つＣＤＫ４の発現量が第３閾値未満である場合に、前記患者の抗がん剤治療の有効性が低いと予測する、請求項１に記載の抗がん剤治療の有効性予測方法。 The CDK is CDK1;
In the comparison step, the expression level of CDK2 in the breast cancer cells collected from the patient is compared with the second threshold value, and the expression level of CDK4 in the breast cancer cells collected from the patient is compared with the third threshold value.
In the prediction step, when the CDK1 specific activity is less than the first threshold, the expression level of CDK2 is not less than the second threshold value, and the expression level of CDK4 is not less than the third threshold value, When the anti-cancer treatment is predicted to be highly effective, the CDK1 specific activity is less than the first threshold, the expression level of CDK2 is less than the second threshold value, and the expression level of CDK4 is less than the third threshold value The method for predicting the effectiveness of anticancer drug treatment according to claim 1, wherein the effectiveness of the anticancer drug treatment of the patient is predicted to be low.
前記比較工程においてさらに、患者から採取した乳がん細胞における、ＣＤＫインヒビターであるｐ２１の発現量と、第２閾値とを比較し、
前記予測工程において、ＣＤＫ２比活性が第１閾値未満であり、且つｐ２１の発現量が第２閾値未満である場合に、前記患者の抗がん剤治療の有効性が中程度であると予測し、ＣＤＫ２比活性が第１閾値未満であり、且つｐ２１の発現量が第２閾値以上である場合に、前記患者の抗がん剤治療の有効性が低いと予測する、請求項１に記載の抗がん剤治療の有効性予測方法。 The CDK is CDK2,
In the comparison step, the expression level of p21, which is a CDK inhibitor, in the breast cancer cells collected from the patient is compared with the second threshold value,
In the prediction step, when the CDK2 specific activity is less than the first threshold and the expression level of p21 is less than the second threshold, the effectiveness of the anticancer drug treatment of the patient is predicted to be moderate. The anti-cancer agent treatment of the patient is predicted to be less effective when the CDK2 specific activity is less than the first threshold and the expression level of p21 is greater than or equal to the second threshold. Effectiveness prediction method of anticancer drug treatment.
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