JP4937460B2 - ペスチウイルス変異体及びそれを含有するワクチン - Google Patents
ペスチウイルス変異体及びそれを含有するワクチン Download PDFInfo
- Publication number
- JP4937460B2 JP4937460B2 JP2001122200A JP2001122200A JP4937460B2 JP 4937460 B2 JP4937460 B2 JP 4937460B2 JP 2001122200 A JP2001122200 A JP 2001122200A JP 2001122200 A JP2001122200 A JP 2001122200A JP 4937460 B2 JP4937460 B2 JP 4937460B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bvdv
- pestivirus
- rna
- virus
- stem
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
- C12N2770/24322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
- C12N2770/24334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
- C12N2770/24361—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/24362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
- C12N2770/24361—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/24364—Methods of inactivation or attenuation by serial passage
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、小さいプラークサイズにより表される減少した複製能を有する、弱毒化ペスチウイルス変異体に関する。そのようなウイルスは、ウシのウイルス性下痢、古典的なブタの発熱及びヒツジのボーダー病の抑制における生ワクチンとして有用である。本発明は、特に、ウシのための生ワクチンにおいて有用な、宿主における複製を減少させるため遺伝子操作された弱毒化ウシウイルス性下痢ウイルスに関する。
【0002】
ペスチウイルスは、世界中で、経済的に重要な動物の疾患を引き起こしている。ペスチウイルス属は、フラビウイルス科に属し、ウシウイルス性下痢ウイルス(bovine viral diarrhea virus)(BVDV)、古典的ブタ発熱ウイルス(classical swine fever virus)(CSFV)、及びボーダー病ウイルス(border disease virus)(BVD)という3つの種を含む。ウシ及びヒツジからの単離物を含む第4の異なるペスチウイルス群の存在が最近記載され、現在この付加的な種をBVDV−2と呼ぶことが一般的に認められている。従って、古典的なBVDV株はBVDV−1と名付けられている。Becherら,Virology 209(1):200−206(1995)を参照のこと。
【0003】
BVDV−1及びBVDV−2はいずれも、ウシにおける急性感染(下痢、発熱、出血性症候群)、並びに(感染が妊娠中に起こった場合には)流産、胎児の奇形及び仔ウシの持続感染を引き起こす。持続感染した動物は、ウイルスの主要な貯蔵所となり、そのような動物は致命的な粘膜病(MD)で死亡する場合がある。
【0004】
以前はブタコレラ(hog cholera)ウイルスと呼ばれていた古典的ブタ発熱ウイルス(CSFV)は、古典的ブタ発熱(CSF)又はブタコレラ(HC)の原因ウイルスである。ボーダー病ウイルス(BVD)は、典型的にはヒツジに見出され、ボーダー病(BV)を引き起こす。BVDによる仔ヒツジの子宮内感染の後には、ウシにおけるMDと類似の症状が起こることも示されている。ペスチウイルスの概説については、Field Virology、Fieldら(編)(Lippincott−Raven、Philadelphia)1059〜1073頁のThielら、The pestiviruses(1996)を参照のこと。
【0005】
生存ウイルス又は死滅ウイルスに基づくワクチン、並びにウイルスタンパク質を発現する組換え発現系のワクチンが、BVDV及びCSFVについて開発されており、現在使用されている。現在使用されている生ワクチンは、宿主において複製する多少弱毒化された株を含有する。弱毒化は、(準最適温度における)同種又は異種の細胞培養物における複数回の継代により達成されている。しかしながら、これらの株は、依然として、経胎盤感染をきたし、それにより胎児の死亡、成長奇形、及び子孫における持続感染を引き起こす場合がある。
【0006】
強い弱毒化をもたらす明確な変異を有する生ワクチン株は、現世代のワクチンの欠点を回避するであろう。最近、全長感染性DNAコピーが、BVDV(Meyerら,J.of Virology 70:8606−8613(1996))及びCSFV(Meyerら,J.of Virology 70:1588−1595(1996))について構築された。それらの利用可能性は、研究者らが、BVDV又はCSFVの弱毒化株を開発するため逆遺伝子操作を実施することを可能にする。しかし、安全かつ効率的なワクチン株を得るために、ゲノムのいずれの領域を修飾すべきであり、そして修飾することができるか、は依然として不明である。
【0007】
ペスチウイルス感染の安全かつ効率的な予防及び治療の重要性のため、高い免疫誘導能を有する特異的に弱毒化された生ワクチン、及び宿主における複製能の有意な減少をもたらす弱毒化の明確な基礎が強く必要とされている。
【0008】
従って、本発明の基礎となる技術的問題は、防御免疫を誘導する能力を有する弱毒化生ワクチンとして使用するための、安全な特異的に弱毒化されたペスチウイルスを提供することである。
【0009】
前記の技術的問題の解決は、ペスチウイルスゲノムの5’非翻訳領域(NTR)に変異を含有する弱毒化ペスチウイルスを提供する本発明により達成される。
【0010】
より具体的には、本発明は、ペスチウイルスゲノムの5’非翻訳領域(NTR)のステム−ループla及びlbを含有する領域に一つ又は複数の変異を含有するペスチウイルスであって、その変異が小さいプラークサイズ表現型を引き起こすものであり、ウイルスポリタンパク質の発現が同種の内部リボソーム結合部位(IRES)の調節下にあり、GUAUなる配列がペスチウイルスゲノムの5’末に存在する、ペスチウイルスに関する。
【0011】
一本鎖RNAの相補的な塩基は、対を形成し、ヘアピンとも呼ばれるステム−ループ構造を形成することができる。la及びlbと名付けられた(又は、それぞれB1’及びB1と名付けた著者もいる)そのような2つのステム−ループ構造が、ペスチウイルスの5’非翻訳領域にあらわれ、その後にはIRES因子が存在している。BVDVの5’NTRの二次構造を示している図1Bを参照のこと。BVDVの場合、ステム−ループ構造Ia及びIbは、おおよそ、BVDVゲノムのヌクレオチド1〜73を含む。本発明により、これらのステム−ループ構造を含有する領域はウイルス複製にとって必須ではないことが発見された。
【0012】
IRES因子は、ペスチウイルスポリタンパク質の翻訳開始が起こる場所であり、5’NTR及びオープンリーディングフレーム(ORF)の5’末端領域に位置している。ペスチウイルスIRESの5’ボーダーは、ヌクレオチド75の近傍であり、5’末端のステム−ループIa及びIbはIRES活性にとって必要でない。Chonら,Virology 251:370−382(1998)を参照のこと。IRESの3’末が、ポリタンパク質のAUG開始コドンまで延びていることは、一般的に同意されている。
【0013】
本明細書の実施例は、BVDVに関するものであるが、本発明は、全てのペスチウイルスに適用可能であると企図される。これは、特に、BVDV、CSFV及びBDVが、構造的かつ血清学的に相互に関連しているためである。ペスチウイルス間の全体的な遺伝学的関連性は、この属のウイルスのゲノム間の配列相同性の程度が60〜70%であることから極めて明確である。より重要なこととして、ペスチウイルスの5’NTRの一次構造及び二次構造は、類似している。即ち、この領域のステム−ループ構造は同一である。Dengら,NucleicAcids Res.,21:1949−1957(1993);Becherら,J.Virol.72:5165−5173(1998);及びPestovaら,Genes & Development 12:67−83(1998)を参照のこと。
【0014】
「変異」という用語は、親の野生型ウイルスと比較して核酸配列の変化が存在することを意味し、それは、ヌクレオチドの置換、挿入及び/又は欠失でありうる。(一つ又は複数の)変異は、ウイルスが、典型的な野生型株と比較して小さいプラークサイズ表現型を表すようなものである。変異は、ペスチウイルスゲノムの5’NTRの、ステム−ループIa及びIbを含有する領域に作成される。従って、IRESは影響を受けず、ウイルスポリタンパク質は依然として翻訳されうる。従って、変異を導入されたウイルスは、ワクチンとして使用した場合、弱毒化ウイルスの最大の免疫原性を可能にする、完全なペスチウイルスタンパク質を産生することができる。他方、5’NTRステム−ループIa及びIb領域の変異とは別の、ウイルスタンパク質の非機能性又は非発現をもたらす、ペスチウイルスゲノムのポリタンパク質領域に起こる変異も、本発明により企図される。そのようなペスチウイルス変異体は、マーカーワクチンとして機能することができる。
【0015】
「小さいプラークサイズ」表現型とは、ペスチウイルスが、同一の条件下で、親の野生型ウイルスよりも平均して少なくとも約50%小さいプラークを表すことを意味する。そのような減少したプラークサイズは、増殖制限表現型の指標となり、従って侵襲性の有意な減少の指標となる。プラークサイズは、以下の方法により決定されうる。宿主細胞系(特に、BVDVの場合MDBK)に、全長cDNA感染性クローンからin vitroで合成された2μgのRNAをトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞の10倍段階希釈物を、2×106個の未処理細胞と共に6穴プレートに播く。37℃で4時間インキュベートした後、接着した細胞に、0.6%低融点アガロース及び5%ウマ血清を含有する半固体培地を重層する。37℃で6日間インキュベートした後、アガロース重層物を除去し、例えば免疫染色によりプラークを可視化することができる。プラークサイズを測定し、次いで平均プラークサイズを決定することができる。
【0016】
典型的には、前記のアッセイによるペスチウイルスの平均プラークサイズは、約3〜4ミリメートルである。従って、本発明の場合、小さいプラークサイズ表現型を有すると見なすためには、前記のプラークアッセイに基づく変異体の平均プラークサイズが、0.2mmと2.0mmの間、好ましくは0.5mmと1.5mmの間、より好ましくは0.7mmと1.2mmの間、最も好ましくは約0.8mmであるべきである。
【0017】
本発明の変異体は、同種のIRESを有するべきである。これは、変異体が、自己のものであっても他のペスチウイルスのものであってもよいペスチウイルスIRESを有するべきであることを意味する。従って、変異型BVDVは、BVDVのIRES因子又はCSFVもしくはBDVのIRES因子を有することができる。しかしながら、好ましくは、本発明のペスチウイルス変異体は、自己のIRES因子を含有する(即ち、BVDV変異体はBVDVのIRESを有し、CSFVはCSFVのIRESを有する等)。
【0018】
ペスチウイルス変異体のゲノムの5’末は5’−GUAUなる配列を有することが必要である。この配列は、複製に必要であり、この配列が存在しない場合には複製が大きく減少し、従ってワクチン製造が不可能となることが、本発明者らにより見出された。しかし、IRESの前に存在する完全な領域(即ち、ステム−ループIa及びIb)が欠失した場合には、5’−GUAU配列が存在する場合ですら、複製が大きく減少することも本発明者らにより見出された。(これは、GUAU配列を含有しているがBVDVステム−ループIa及びIbは含有しないBVDV−HCVキメラの複製能が、劇的には改変されないことを示したFrolovら,RNA,4:1418−1435(1998)と対照的である。)従って、そのような変異体は、本発明において企図されない。
【0019】
好ましくは、本発明のペスチウイルスは、5’NTRのステム−ループIa、又はステム−ループIa及びIbに一つ又は複数の変異を有する。これらのステム−ループ構造は、IRESの5’側の領域にあり、図1Bに示されている。保存配列モチーフ5’−GUAUがゲノムRNAの5’末に保持されていれば、ステム−ループIaの様々な部分の置換もしくは欠失、又はIaの全部及びIbの一部の欠失を有する5’NTR配列は、親ウイルスよりは程度が低いが、複製を維持することが、本発明者らにより見出された。他方、Ibのループ領域が完全に欠失すると、複製能はほぼ完全に失われる。
【0020】
好ましくは、複数の変異がペスチウイルスの5’NTRに作成される。複数の変異を有するウイルスは、例えば置換又は挿入の場合、ただ一つの変異を有するウイルスよりも遺伝学的に安定であることが知られている。
【0021】
より好ましくは、本発明のペスチウイルスは、一つ又は複数のヌクレオチドの欠失を有する。特に、ステム−ループIaのヌクレオチド5〜28(本明細書において使用される番号付けは、CP7−9Aとして図1Aに示されている配列と同一であるが、ヌクレオチド44の後のA残基が4個少ないBVDV−1 CP7−5A株に基づいている)を欠失させ、所望の複製能の減少を有する変異体を得ることが可能である。さらにより好ましいのは、Δ2−31(換言すると、5’にGUAUを有しているステム−ループIaの欠失)及びΔ5−57(換言すると、ステム−ループIaのヌクレオチド1〜4に見出されるGUAUが保持されている、ステム−ループIa及びステム−ループIbの一部の欠失)のような、比較的大きい欠失を有する変異体である。他の好ましい変異体は、ヌクレオチド5〜73が欠失している(即ち、IRESの5’側にGUAU配列のみを残しステム−ループIa及びIbが欠失している)が、GUAUとIRESの5’末との間にAU又はCCUなる配列が挿入されているものである。即ち、これらの変異体における5’末端配列は、GUAUAU又はGUAUCCUのいずれかである。図6D、クローンM1及びM2を参照のこと。欠失変異体のうちで最も好ましいは、Δ2−31である。
【0022】
好ましくは、ステム−ループIbのループ部分(即ち、BVDV−1 CP7株の場合ヌクレオチド44の下流の領域)が本発明の変異体に存在する場合、5個のアデノシン(A)残基のみがその中に存在する。驚くべきことに、本発明者らは、5個のA残基が、このループ領域において遺伝学的に安定なBVDVをもたらすことを見出した。当然、遺伝学的安定性は生ワクチンにとって重要である。
【0023】
好ましくは、本発明のペスチウイルスは、BVDV−1又はBVDV−2である。
【0024】
本発明に係るペスチウイルスは、いわゆる「逆遺伝学」技術を使用して調製されうる。in vitroにおけるペスチウイルスのRNAの遺伝子操作は現在のところ可能でない。しかし、ウイルスのRNAからcDNAを合成し、当分野において既知の技術によりプラスミドへクローニングすることは可能である。cDNAクローンはin vitroでRNAを転写し、細胞内で感染性ウイルスを生成させることができるため、そのような構築物は、感染性クローンとして知られている。感染性クローンを使用して、変異型ウイルスを作出するためDNAを操作することが可能である。この技術は逆遺伝学と呼ばれる。
【0025】
BVDV及びCSFVの感染性クローンは既知であり(前記の2つのMeyerらの参考文献を参照のこと)、同技術に基づきBDV感染性クローンを構築することは可能であると予想される。感染性クローンは、ウイルスの増殖に適した細胞培養物へとトランスフェクトされうる。例えば、BVDVの感染性クローンは、(MDBK細胞のような)ウシ腎細胞へ、CSFVの感染性クローンはブタ腎細胞(例えば、PK−15又はSK−6)へトランスフェクトされうる。BDVクローンも、同様に、ヒツジ又はウシの細胞へトランスフェクトされうるであろう。
【0026】
感染性クローンを使用すれば、部位特異的突然変異導入技術のような標準的な技術を使用して、本発明に従い5’NTR内のヌクレオチドを置換、挿入又は欠失させることが可能である。減少した複製能は、比感染価(specific infectivity)(即ち、RNA1μg当たりのプラーク形成単位(PFU)数)又は適切な細胞培養物中のTCID50を測定することにより、変異体を用いて測定されうる。小さいプラーク表現型は、本明細書中の前記のプラークアッセイにより決定されうる。
【0027】
本発明は、ペスチウイルス変異体を含むワクチンも包含する。「ワクチン」という用語は、本明細書において使用されるように、動物において免疫学的反応を誘導する少なくとも一つの免疫学的活性成分と、必須ではないが、活性成分の免疫学的活性を増強する付加的な成分とを含む薬学的組成物をさす。ワクチンは、薬学的組成物に典型的な付加的な成分も含む。
【0028】
本発明のペスチウイルス変異体は、有効用量の生存弱毒化ペスチウイルス、即ち、侵襲性ペスチウイルスによる攻撃に対する免疫を、予防接種された動物において誘導するであろう量のペスチウイルスを含み、かつ薬学的に許容される担体又は希釈剤、例えば生理食塩水を含むワクチンへと製剤化されうる。免疫とは、本明細書において、非予防接種群と比較した際の、予防接種後の動物集団における有意な程度に高いレベルの防御の誘導と定義される。正確な用量は、実務者により決定されうる。ウシワクチンのための典型的な生存ウイルスの用量は、例えば、1回当たり5log10TCID50と7log10TCID50の間である。
【0029】
ワクチン目的のため十分な量のウイルス変異体を作製するためには、適当な細胞培養物中で、そして例えばローラーボトル内、又はマイクロキャリアーを含む、もしくは含まない発酵槽内で、変異体を増殖させることができる。
【0030】
ワクチン組成物中の担体には、安定剤、保存料及び緩衝剤が含まれうる。適当な安定剤は、例えばSPGA、(ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、デキストラン、グルタメート又はグルコースのような)炭水化物、(粉乳、血清アルブミン、カゼイン、又は植物もしくは微生物等のようなその他の起源のタンパク質のような)タンパク質、又はそれらの分解産物である。適当な緩衝剤は例えばアルカリ金属リン酸塩である。適当な保存料は、チメロサル(thimerosal)、メルチオラート(merthiolate)及びゲンタマイシンである。希釈剤には、水、(緩衝生理食塩水のような)水性緩衝液、アルコール及び(グリセロールのような)ポリオールが含まれる。
【0031】
所望により、本発明に係る生ワクチン組成物は、アジュバントを含有していてもよい。アジュバント活性を有する適当な化合物及び組成物の例には、これらに限定されないが、アルミニウムの水酸化物、リン酸化物、又は酸化物、例えばBayol(登録商標)もしくはMarcol(登録商標)のような鉱油、又はビタミンEアセタートのような植物油に基づく水中油型又は油中水型の乳濁液、及びサポニンが含まれる。
【0032】
本発明に係るワクチンは、免疫感作を受ける動物にとって病原性である一つ又は複数の他の微生物由来の他の免疫原も含有しうる。例えば、ウシの場合、付加的な免疫源は、ウシロタウイルス、ウシRS(respiratory syncytial)ウイルス、ウシ1型ヘルペスウイルス、ウシコロナウイルス、3型パラインフルエンザウイルス、ウシパラミクソウイルス、***ウイルス及びパスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella hemolytica)のうちの一つ又は複数に由来しうる。ブタの場合、そのような組み合わせワクチンは、***ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、エリシペラス・ルシオパチエ(Erysipelas rhusiopathiae)及びアクチノバチルス・プルーロニューモニエ(Actinobacillus pleuropneumoniae)を含みうる。ヒツジの場合、付加的な免疫源は、トキソプラズマ及びクラミジア・プシタチ(Chlamydia psittaci)に由来するものでありうる。
【0033】
ワクチンは、溶液、懸濁液の形態であってもよいし、又は凍結乾燥もしくは凍結された形態であってもよく、標準的な技術を使用して調製されうる。生存ペスチウイルスの調製、及びアジュバントを含む又は含まない他の免疫原とのその製剤化は、いずれも常法であり、生存弱毒化ペスチウイルスを、薬学的に許容される担体又は希釈剤と混合し、そして場合により他の免疫原と混合し、そして場合によりアジュバントと混合することを含む。ワクチン組成物の調製は、特に、「Handbuch der Schutzimpfungen in der Tiermedizin」(Mayr,A.ら編、Verlag Paul Parey、Berlin and Hamburg、Germany、1984)及び「Vaccine for Veternary Applications」(Peters,A.R.ら編、Butterworth−Heinemann Ltd.,1993)に記載されている。例えば、これに限定されないが、ワクチンは以下のようにして調製されうる。本発明に係る変異型ペスチウイルスを含有する細胞培養上清を、安定剤と混合し、続いて混合物を凍結乾燥させるか、又は他の方法により脱水する。次いで、予防接種の前に、該混合物を水性又は非水性の溶液で再水和する。
【0034】
本発明は、動物におけるペスチウイルス感染の予防及び治療に特に有用なワクチン又は薬学的組成物を提供する。従って、本発明のさらなる態様は、本発明に係るワクチンを、そのような予防又は治療の必要がある動物へ投与することを特徴とする、動物におけるペスチウイルス感染の予防及び治療のための方法に関する。本発明のワクチンは、筋肉内注射もしくは皮下注射により、又は鼻腔内、気管内、口腔内、皮膚、経皮、もしくは皮内への投与を介して投与されうる。好ましくは、BVDVワクチンの場合、予防接種は鼻腔内又は筋肉内に行われ、筋肉内が最も好ましい。BVDVの生ワクチンは、好ましくは、乳牛において、約6ヶ月齢と最初の受精との間に投与される。
【0035】
本発明は、以下の実施例を参照することによりさらに特徴決定されるが、実施例は本発明を制限するものではないことを理解されたい。
【0036】
実施例1:BVDVの感染性cDNAクローンの生成及び得られたCP7−5Aウイルス
(A)BVDVの感染性cDNAクローンの生成
ウシウイルス性下痢ウイルスCP7株のゲノムのcDNAクローニングの後、全長cDNAクローンpA/BVDVを構築した(Meyerら,J.Virol.70:8606−8613に詳述されている)。5’近位の21〜23ヌクレオチド(nt)及び3’末端の33nt(他のBVDV株の公開された配列と比較した場合)を含むCP7ゲノムRNAの5’末端配列は決定されなかった。その代わりに、異種のBVDV−1 NADL株の各末端配列を、pA/BVDVへ導入した。
【0037】
(B)感染性cDNAクローンpCP7−5Aの生成
BVDV CP7の真正感染性cDNAクローンを確立するため、このウイルスの5’及び3’の末端配列を決定した。ウイルスゲノムRNAのライゲーションの後、ネスティッドRT−PCRアッセイ(ゲノムの3’末に位置するセンスプライマー及びゲノムの5’NTRに位置するアンチセンスプライマーを使用)により、予想サイズのcDNA断片を特異的に増幅し、続いてそれを細菌ベクターへクローニングした。配列分析により、未知の5’末端の21ntが、BVDV−1 NADL株及びOsloss株の配列と9個の位置で異なっていることが明らかとなった(図1A)。驚くべきことに、BVDV CP7の5’及び3’の末端配列の決定のため分析された10個のクローンは、ヌクレオチド44位の後のA残基数に関して顕著なばらつきを顕示した。以前に報告されたCP7全長cDNAクローンpA/BVDVは、この位置に8個のA残基を含んでいたが、本研究において得られたcDNAクローンには9個から26個のA残基が存在した。CP7ゲノムの3’末端の33ntに関しては、BVDV NADLの3’末端と比較した場合、6個のヌクレオチドの差異が見出されたが、BVDV Osloss株の配列とは2個のヌクレオチドしか異なっていなかった。
【0038】
本明細書に記載のBVDV CP7全長cDNAクローンは、pA/BVDV(前記参照を参照のこと)、並びにウイルスcDNAの直上流にNheI部位及びSP6 RNAポリメラーゼプロモーターを含有するサブゲノムcDNAクローンHHD19(Trauzら,J.Virol.73,9422−9432に詳述されている)に基づき構築された。HHD19は、構造タンパク質をコードするゲノム領域並びにp7及びNS2を欠いている。HHD19の5’末端の21塩基及び3’末端の33塩基は、BVDV Osloss配列に由来していた。pA/BVDV由来のXhoI(CP7−5A配列のnt222〜227)/ClaI(CP7−5A配列のnt11075〜11080)断片を、予めXhoI及びClaIで消化されたプラスミドHHD19に挿入し、プラスミドpCP7−Osを得た。真正5’末端及び44位の下流の9個、20個、及び26個のA残基を保持するCP7全長cDNAクローンの構築のため、RNAライゲーション/RT−PCRの後に得られた各cDNAクローンを、Ol200R(CP7−5A配列のnt235〜252に相当)及びOlCP7−SP6(5’−TACGCTAGCATTTAGGTGACACTATAGTATACGAGGTTAGGCAAGTTC−3’;下線領域はCP7−5A配列のnt1〜22に相当する;NheI部位より後に存在するSP6 RNAポリメラーゼプロモーターはCP7特異的配列の直上流に位置する)を用いたPCRの鋳型として使用した。最後に、pCP7−OsのNheI/XhoI断片を、44位の後に9個、20個、及び26個のA残基を保持するCP7特異的NheI/XhoI断片と交換し、全長cDNAクローンpCP7−9A、pCP7−20A及びpCP7−26Aを得た。
【0039】
cDNA構築物pCP7−9A、pCP7−20A及びpCP7−26Aからin vitroで転写された全長RNAのトランスフェクションの後、感染性BVDVを回収した。RNAの転写のため、全長cDNAクローンをSmaIで完全に消化し、フェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。1マイクログラムの直鎖化されたプラスミドDNAを、標準的な条件を使用して、20μlでSP6 RNAポリメラーゼで転写した。鋳型DNAの分解のため、反応混合物を5UのDNaseIで37℃で1時間消化し、その後フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行った。転写されたRNAの測光定量を、光度計で実施した。各RNAの質及び計算量を、アガロースゲル電気泳動の後、試料の臭化エチジウム染色により調節した。トランスフェクションに使用されたRNA転写物は、>60%の全長RNAを含有していた。MDBK細胞(アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville、Md.、USAより入手)を、電気穿孔によりトランスフェクトした。トランスフェクションのため、直径10cmのプレートからの集密細胞を、Ca2+及びMg2+を含まない0.4mlのPBSに再懸濁させ、パルス(950μF及び180V)直前に、2μgのin vitro転写されたRNAと混合した。トランスフェクトされた細胞を2つの6穴プレートに播き、10%ウマ血清を含有する培地で2mlに調整した。細胞のトランスフェクションの後、子孫ウイルスの産生が、細胞病理の発生により示された。トランスフェクトされた細胞の感染は、Erns、E2及びNS3/NS2−3に対するモノクローナル抗体を使用した免疫蛍光分析(IFA)、及び回収された感染性ウイルスの継代により確認された。
【0040】
5’NTR変異体の遺伝学的安定性を調査するため、得られたウイルスpCP7−9A、pCP7−20A及びpCP7−26Aを、MDBK細胞において繰り返し継代し、10回の継代の後、プライマーOl200R及びOlCP7−SP6を使用したRT−PCR分析及びそれに続くクローニングされたcDNA断片の配列分析により、5’NTR断片の長さを決定した。各異型について、12個の独立のクローンの配列を決定した。ヌクレオチド配列分析により、44位の下流のA残基の複数の挿入(及び欠失)が示され、CP7−26Aの場合には最大54個のAが観察された(図2)。このことは、各異型が遺伝学的に不安定であることを証明している。
【0041】
この現象をさらに特徴決定するため、44位の下流の54個のA残基のストレッチを保持する全長cDNAクローン(pCP7−54A)を構築した。pCP7−54Aから転写されたRNAのトランスフェクションにより、感染性ウイルスが回収され、それをMDBK細胞において10回継代し、次いで5’NTRのヌクレオチド配列分析を行った。興味深いことに、A残基の欠失は、調査した12個のクローンのうち11個に検出された。44位の後にわずか5個のA残基が見出されたものもあった(図2)。次の工程として、本発明者らは、前記の例えばpCP7−9Aの構築の場合と同一のクローニング法を使用して、44位の後に5個のA残基を保持する全長cDNAクローンpCP7−5Aを構築した。pCP7−5Aから転写されたRNAのトランスフェクションにより、感染性ウイルスCP7−5Aが回収された。
【0042】
(1)44位の後に5個のA残基を有するウイルスが遺伝学的に安定であることを証明する実験の説明
MDBK細胞において繰り返し継代を行った後、pCP7−5Aの遺伝学的安定性を調査した。10回の継代の後、プライマーOl200R及びOlCP7−SP6を使用したRT−PCR分析及びそれに続くクローニングされたcDNA断片の配列分析により、5’NTR断片の長さを決定した。配列分析により、調査した12個のクローンが全て、44位の後に5個のA残基を保持することが明らかとなった(図2)。このことは、pCP7−5Aが、BVDV CP7の遺伝学的に安定な異型であることを証明しているが、他の異型の5’NTRにはA残基の複数の挿入及び欠失が急速に起こった。変動しやすいA残基数の他には、分析した5’NTRクローンに差異は観察されなかった。
【0043】
実施例2:5’NTR変異型ウイルスを生成させるための材料及び方法
ヘアピンIaのヌクレオチド配列及び推定RNA二次構造の両方を、様々な位置で改変するため、pCP7−5Aの5’末端の30nt内の第一の変異のセットを設計した。ヘアピンIaは、CP7ゲノムのnt1〜10のnt21〜30の相補的配列との塩基対形成により形成されるステムを含み、残りの10nt(11〜20)は頂部ループを形成する。変異体SL−1、SL−2及びSL−3のRNAは、それぞれヌクレオチド2、6〜7、及び14〜17を欠いている。さらに、2〜4位(SL−4)、5〜7位(SL−5)、10〜13位(SL−6)及び27〜29位(SL−7)にヌクレオチド置換を含有するいくつかの変異体を構築した。SL−8、SL−9、デルタ2−31、デルタ5−57及びデルタ5−73のRNAは、ヌクレオチド1〜24、2〜29、2〜31、5〜57及び5〜73を欠いている。(改変された)ヘアピンIaの推定RNA二次構造を図5Aに示す。5’NTRに変異を保持する全てのCP7全長cDNAクローンの構築は、遺伝学的に安定なcDNAクローンpCP7−5Aに基づいていた。変異型cDNAの生成は、連続的な2工程で実施した。第一に、pCP7−5Aを鋳型として使用して、センスプライマーOl−SL1、Ol−SL2、Ol−SL3、Ol−SL4、Ol−SL5、Ol−SL6、Ol−SL7、Ol−SL8、Ol−SL9、Ol−デルタ2−31、Ol−デルタ557又はOl−デルタ5−73(それぞれ、NheI部位及びSP6 RNAポリメラーゼプロモーターの後に存在する変異を導入された各配列を包含する)及びアンチセンスプライマーOl200Rを用いたPCRにより、CP7の5’末端配列に各変異を導入した。第二の工程において、得られたクローンのNheI/XhoI断片を、予めNheI及びXhoIで消化されたpCP7−5Aへ導入した。センスプライマーの配列は以下の通りである。
【0044】
【化1】
5’NTRに変異を保持する全てのCP7全長cDNAクローンについて、ヌクレオチド配列決定により完全な5’NTRの配列を確認した。変異を保持するcDNAクローンから転写された全長ゲノムRNAのトランスフェクションにより、感染性ウイルスが回収された。RNAの転写及びMDBK細胞のトランスフェクションは、前記と同様にして実施された。
【0045】
実施例3:変異体の特性の説明
BVDV5’NTR変異体の特性の比較分析のため、変異体の全セットを使用した転写/翻訳実験を、平行して実施し、数回繰り返した。これらの分析には、各ゲノムRNAの比感染価の決定、IFA、及びトランスフェクション後のウイルス収量の決定、並びに平均プラークサイズ、増殖速度及び回収された変異型ウイルスの収量の決定が含まれていた。
【0046】
MDBK細胞(前記と同様)の2μgのゲノムRNAによるトランスフェクションの後、トランスフェクトされた細胞の10分の1を、RNAの比感染価及び回収されたウイルスのプラークサイズを決定するためのプラークアッセイに使用した。トランスフェクトされた細胞の10倍段階希釈物を、2×106個の未処理MDBK細胞と共に、6穴プレートに播いた。37℃で4時間インキュベートした後、接着した細胞に、0.6%低融点アガロース(Gibco−BRL)及び5%ウマ血清を含有する半固体培地を重層した。変異型ウイルスは、免疫染色により可視化される小さいプラーク(0.5〜1.4mm)を産生した。37℃で6日間インキュベートした後、アガロース重層物を除去し、細胞をPBSで洗浄し、次いでアセトン−メタノール(1:1)で−20℃で1時間固定した。BVDV E2−特異的モノクローナル抗体の混合物と共に2時間インキュベートした後、単層をPBS−0.05%Tween20で2回洗浄し、次いでペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン(PBS−0.05%Tween20中1/500;Sigma−Aldrich Chemie GmbH、Steinheim、Germany)と共にインキュベートした。1時間後、単層をPBSで2回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質である3−アミノ−9−エチル−カルバゾール(Sigma−Aldrich Chemie GmbH)を使用することによりプラークを可視化した。
【0047】
比感染価とは、RNA1μg当たりのプラーク形成単位(PFU)数をさす。このパラメータを、明確な量のin vitro転写されたゲノムRNAをMDBK細胞にトランスフェクトした後、独立に産生されたウイルスプラークの数を計数することにより決定した。CP7−5A、CP7−9A、CP7−20A及びCP7−26Aについて、感染価は、2.4×105PFU/μgと6.0×105PFU/μgの間であったが、CP7−54A及びCP7−Tから転写されたRNAについては、それぞれ8.0×104PFU/μg及び8.0×102PFU/μgが得られた(図3は、代表的な実験の結果を示している)。推定ヘアピンIa及びIbを含む領域に置換又は欠失を有する他の全ての5’NTR変異体の比感染価が、親構築物CP7−5Aと比較した場合、有意に減少していた。SL−2、SL−3、SL−5、SL−6、SL−7、SL−8、デルタ2−31、及びデルタ5−57の比感染価は、5.2×103PFU/μg〜6.4×104PFU/μgの間であり、適度な量の感染性子孫ウイルスの回収が可能であった(下記参照)。対照的に、SL−1、SL−4、SL−9及びデルタ5−73については、比感染価が検出レベルに近いか、又はそれ未満であった。これらの差異は、Erns、E2、及びNS3に対するMabを使用した免疫蛍光により24hp.t.に決定された、BVDV抗原を発現する細胞の量と良好に相関していた(図3、5、及び6を参照のこと)。全ての変異体の比感染価及びIFAの結果が、図3、5、及び6に示されている。少なくとも2倍減少した感染価を有する変異体(例えば、SL−2、SL−3、SL−5、SL−6、SL−7、SL−8、デルタ2−31、及びデルタ5−57)は、弱毒化されていると予想され、従って生ワクチンとして有用であろう。
【0048】
さらに、トランスフェクション後の異なる時点で得られたウイルス力価を、全ての5’NTR変異体について決定した(図4、5、及び6)。示された期間の後、細胞培養上清の一部(200μl)を取り出し、MDBK細胞における力価測定のため使用した。ウイルス収量は、50%組織培養感染用量(TCID50)/mlの力価として決定された。CP7−5Aと比較した場合、トランスフェクション後1日目に得られたウイルス力価は、全ての5’NTR変異体について少なくとも8倍減少していた。各差異は、24hp.t.に決定された比感染価及びBVDV抗原陽性細胞の割合と良好に相関していた。
【0049】
CP7−5A、SL−2、SL−3、SL−5、SL−6、SL−7、SL−8、デルタ2−31、及びデルタ5−57のin vitro転写されたRNAから回収された子孫ウイルスを、トランスフェクトされた細胞の希釈物を使用したMDBK細胞におけるプラークアッセイにより特徴決定した。転写物に由来する親ウイルスCP7−5Aは、2.7mmという平均サイズを有するプラークを形成した。各変異体は、比較的小さいプラークを産生した。SL−2、SL−5、及びSL−7は、1.2〜1.4mmの範囲の平均サイズを有するプラークを産生し、SL−3、SL−6、SL−8、デルタ2−31及びデルタ5−57により生成したプラークは≦0.8mmの平均サイズを有していた。個々の変異体の平均プラークサイズは、図7に示されている。小さいプラーク表現型は、全ての5’NTR変異体の重要な特性であり、各ウイルスの増殖が阻止されており、従ってそれらが生ワクチンウイルスとして使用されうることを証明している。実用上の目的のためには、そのような変異体は、好ましくは、少なくとも105TCID50/mlの力価に増殖する。変異型ウイルスをMDBK細胞で継代した後、例えばデルタ2−31及びデルタ5−57が>106TCID50の力価に達することを、我々は証明した。これらの継代されたウイルス変異体のプラーク表現型は、トランスフェクション直後に観察されたものと同一である(前記参照)。
【0050】
増殖キイネティクスの決定のため、個々の変異型RNAでトランスフェクトされた細胞からの上清を力価測定し、次いで、0.05というMOIで(6穴プレートにおいて)1×106個のMDBK細胞へ感染させるため使用した。室温で1時間吸着させた後、細胞をPBSで6回洗浄し、次いで10%ウマ血清を含有する培地を重層し、その後4日間にわたりインキュベートした。示された期間の後、細胞培養上清の一部(200μl)を取り出し、MDBK細胞における力価測定に使用した。ウイルス収量は、50%組織培養感染性用量(TCID50)/mlの力価として決定された。CP7−5A及び5’NTR変異体のピーク力価は、感染後3日目に達成された。変異体SL−2、SL−3、SL−5、SL−6及びSL−7は、ピーク力価が約10倍減少していたが、変異体デルタ2−31及びデルタ5−57が達したピーク力価は、CP7−5Aと比較して約100倍低かった(図8A)。33℃及び40.5℃における増殖曲線の確立は、CP7−5Aも、いずれの変異体も、少なくともこれらの温度に関しては温度感受性表現型を表わさないことを示した。これらの結果は、増殖キイネティクスの差異が、観察されたプラークサイズと相関していることを証明している。さらに、変異型ウイルスの増殖の制限は、個々のRNAについて検出された比感染価の減少を反映している(図7;図5及び6も参照のこと)。そのような増殖を制限されたウイルスは、生ワクチンウイルスとして使用されうる。
【0051】
ウイルスRNA合成の分析のため、1×106個のMDBK細胞に、0.05というMOIで転写物由来ウイルスを感染させ、増殖キイネティクスの決定に使用された細胞と平行して処理した。全細胞RNAを感染後2日目に調製し、ノーザンブロット分析のため使用した。5マイクログラムのグリオキシル化RNAを、5.5%ホルムアルデヒドを含有するリン酸緩衝1.0%アガロースゲル中で分離し、Duralon−UV膜(Stratagene、Heidelberg、Germany)へ転写した。プローブの放射性標識、ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は、記載されている通りであった(J.Virol.72:8697−8704)。cDNAクローンpA/BVDV由来の2.5kbのNotI−NsiI断片をプローブとして使用した。ウイルスゲノムRNAをオートラジオグラフィーにより可視化し、バンドの強度をホスホールイメージャー(phosphorimager)を用いて決定した(図8B)。CP7−5AのRNAは、いずれの変異型ウイルスのRNAよりも多量であった。その次に多量であったのはSL−7のRNAであり、SL−2、SL−3、SL−5、及びSL−6のRNA量は比較的少なかった。その複製動態に基づき予想されるように、デルタ2−31及びデルタ5−57のRNAは、最も少量であった。感染後3日目に調製されたRNAのノーザンブロット分析は、極めて類似した結果をもたらした。検出されたウイルスRNAの量は、得られたウイルス力価と相関していた、と結論付けることができる。
【0052】
遺伝学的安定性を調査するため、MDBK細胞において各変異体を繰り返し継代した。3回目の組織培養継代物由来のRNAを使用して、前記のRNAライゲーション/RT−PCR法により5’及び3’の末端配列を増幅し、細菌ベクターへクローニングした。各変異体について、少なくとも10個の独立のクローンを特徴決定した。配列分析により、変異体SL−2、SL−3、SL−5、SL−6、SL−7、SL−8、デルタ2−31及びデルタ5−57の分析したゲノム領域には、二次変異が存在しないことが示された。対照的に、SL−1、SL−4、SL−9、及びデルタ5−73については、復帰又は二次変異が見出された。遺伝学的安定性は、遺伝子操作された生ウイルスワクチンのための重要な要件であると考えられる。
【0053】
Δ5−73のトランスフェクション上清の2回の組織培養継代の後、比較的高い感染性ウイルスの力価(>105/ml)が得られた。12個の独立のクローンに由来する5’末端配列の分析により、ゲノムの5’末端近傍に2nt(M1)又は3nt(M2)の重複を有する変異体の出現が示された(図6D)。これらの結果は、ウイルスRNAの5’末端に配列モチーフ5’−GUAUが残存しているのであれば、ヘアピンIa及びIbがペスチウイルスの複製にとって必要でないことを示唆している。
【0054】
デルタ5−73RNAでのトランスフェクションの後に出現した変異型ウイルスM1又はM2の5’末端配列を含有するCP7−5A由来cDNAクローンから転写されたRNAのトランスフェクションの後、2つの付加的な変異体が生成し、R1及びR2と名付けられた。変異型ウイルスR1及びR2は、5’GUAUを依然として含有しているが、ヘアピンIa及びIbは欠いている。R1及びR2の比感染価は、親構築物CP7−5Aと比較した場合、有意に減少していた。R2を用いて、さらなる分析を実施した。R2は、小さいプラーク表現型を表した(平均サイズ<1.2mm)。ウシ細胞において達したR2のピーク力価は、CP7−5Aと比較して、>10倍低かった。さらに、蓄積したRNAの量は有意に減少していた。
【0055】
実施例4:デルタ2−31、デルタ5−75及びR2の遺伝学的安定性に関するさらなる研究
遺伝学的安定性をさらに研究するため、変異型ウイルス、デルタ2−31、デルタ5−75及びR2を、MDBK細胞において10回継代した。10回目の組織培養継代物からのRNAを使用して、記載されたRNAライゲーション/RT−PCR法により5’及び3’の末端配列を増幅し、細菌ベクターへクローニングした。3個の各変異体についての少なくとも4個のクローンの配列分析により、分析した5’NTRの部分に二次変異が存在しないことが示された。さらに、10回の組織培養継代の後得られた変異型ウイルス、デルタ2−31、デルタ5−75及びR2を用いて実施されたプラークアッセイにより、小さいプラーク表現型の安定性が明らかとなった。ウシ細胞において達したこれらの変異体の力価は、>1000.000/mlであった。
【図面の簡単な説明】
【図1】ペスチウイルス、特にBVDV−1 CP7株の5’配列。(A)4つのペスチウイルス種の代表的な株の5’末端配列のアラインメント。BVDV−1 CP7については、10個の独立のクローンからコンセンサス配列を決定した。その他の配列は、GenBank/EMBLデータベースから抽出した(BVDV−1 Osloss、BVDV−1 NADL、CSFV Alfort−T、CSFV Brescia、BDV X818、BVDV−2 890)。保存ヌクレオチドはアスタリスクで示されている。(B)BVDV−1 CP7−9Aの5’NTRの推定RNA二次構造。モデリングは、コンピュータプログラムRNAFOLD、MFOLD及びFOLDDANALYZEを用いて実施された。さらに、提唱された構造は比較配列分析に基づいている。開始コドンAUGが示されている。
【図2】ウシ細胞におけるBVDV5’NTR変異体の伝播における44位の下流のA残基の複数の挿入及び欠失。操作された全長RNAによるトランスフェクションの後、回収されたBVDV変異体CP7−9A、CP7−20A、CP7−26A、CP7−54A及びCP7−5Aを、MDBK細胞において繰り返し継代した。10回の継代の後、12個の独立のクローンの配列分析により、各変異体について、5’NTR配列及び44位の後のA残基数を決定した。
【図3】CP7−5A、CP7−9A、CP7−20A、CP7−26A、CP7−54A及びCP7−Tへの操作された全長RNAの感染後(p.t)24時間におけるMDBK細胞の免疫蛍光(IF)分析(拡大率×100)。BVDV CP7変異型RNAの比感染価が示されている。
【図4】感染後24、48及び72時間におけるBVDV5’NTR変異体CP7−5A、CP7−9A、CP7−20A、CP7−26A、CP7−54A及びCP7−Tについて得られたウイルス力価。放出されたウイルスの力価がMDBK細胞において決定された。
【図5】ヘアピンIa変異体。(A)BVDVヘアピンIa変異のコンピュータにより推定されたRNA二次構造、並びにCP7−5A、SL−1、SL−2、SL−3、SL−4、SL−5、SL−6、SL−7、SL−8及びSL−9への全長RNAの感染後(p.t.)24時間におけるMDBK細胞のIF分析(拡大率×100)。モデリングは、コンピュータプログラムRNAFOLD及びMFOLDを用いて実施された。ヘアピンIa内の欠失したヌクレオチド(Δ)及び置換されたヌクレオチドが示されている。(B)MDBK細胞におけるBVDV変異型RNAの比感染価、並びに24、48及び72hp.t.において得られたウイルス力価。
【図6】ヘアピンIa及びIbの欠失。(A)BVDV CP7−5A及び欠失変異体Δ2−31、Δ5−57及びΔ5−73の5’NTRの概略図。(B)感染後24時間におけるMDBK細胞のIF分析(拡大率×100)。(C)MDBK細胞における比感染価、並びに24、48及び72hp.t.において得られたウイルス力価。(D)CP7−5A、Δ5−73、並びにΔ5−73RNAでトランスフェクトされた細胞由来の上清の継代後に進化した変異型ウイルスM1及びM2の5’末端配列。M1及びM2については、挿入されたヌクレオチドが強調されている。
【図7】6日p.t.におけるBVDV5’NTR変異体により産生されたプラーク。
(A)MDBK細胞におけるCP7−5A、SL−2、SL−3、SL−5、SL−6、SL−7、SL−8、Δ2−31及びΔ5−57のプラークサイズ。(B)例として、CP7−5A、SL−7及びSL−8により生成したプラークが示されている。
【図8】(A)0.05というMOIで感染させたMDBK細胞において決定された、BVDV CP7−5A、並びに変異型BVDV株SL−2、SL−3、SL−5、SL−6、SL−7、Δ2−31及びΔ5−57の増殖曲線。放出されたウイルスの力価が4日間にわたり決定された。(B)0.05というMOIでBVDV CP7−5A及び示された変異型BVDV株を感染させたMDBK細胞由来の全RNAのノーザンブロット分析。感染細胞は、増殖速度を決定するために使用された細胞と平行して処理された。RNAは、感染後48時間目に抽出された。ブロットを、BVDV CP7特異的cDNA断片とハイブリダイズさせた。キロ塩基(kb)のRNAラダーサイズが左側に示されている。バンドの強度は、ホスホールイメージャーを用いて決定された。ウイルスゲノムRNAの相対量がブロットの下に示されている。
Claims (8)
- ペスチウイルスゲノムの5’非翻訳領域(NTR)のステム−ループla及びlbを含有する領域に一つ又は複数の変異を含有するペスチウイルスであって、その変異が、野生型ウイルス株が3〜4mmの平均プラークサイズを生じる場合と同一の条件下で平均プラークサイズが0.2mmと2.0mmの間であるプラークサイズ表現型をもたらすものであり、ウイルスポリタンパク質の発現が同種の内部リボソーム結合部位(IRES)の調節下にあり、ゲノムの5’末の配列がGUAUである、ペスチウイルス。
- 5’NTRに複数の変異を有することを特徴とする、請求項1に記載のペスチウイルス。
- 変異が一つ又は複数のヌクレオチドの欠失であることを特徴とする、請求項1に記載のペスチウイルス。
- 変異がステム−ループlaの欠失であることを特徴とする、請求項3に記載のペスチウイルス。
- 変異がステム−ループla及びステム−ループlbの一部の欠失であることを特徴とする、請求項4に記載のペスチウイルス。
- 5’末端配列がGUAUAU又はGUAUCCUであることを条件として、変異がステム−ループla及びlbの欠失であることを特徴とする、請求項4に記載のペスチウイルス。
- ステム−ループlbのループ部分が存在する場合、ループが5個のアデノシン(A)残基からなることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載のペスチウイルス。
- BVDV−1又はBVDV−2であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載のペスチウイルス。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP00201421.5 | 2000-04-21 | ||
EP00201421 | 2000-04-21 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002325575A JP2002325575A (ja) | 2002-11-12 |
JP4937460B2 true JP4937460B2 (ja) | 2012-05-23 |
Family
ID=8171371
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001122200A Expired - Fee Related JP4937460B2 (ja) | 2000-04-21 | 2001-04-20 | ペスチウイルス変異体及びそれを含有するワクチン |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7037508B2 (ja) |
EP (1) | EP1149901B1 (ja) |
JP (1) | JP4937460B2 (ja) |
AT (1) | ATE322541T1 (ja) |
BR (1) | BR0101523A (ja) |
CA (1) | CA2342305C (ja) |
DE (1) | DE60118456T2 (ja) |
DK (1) | DK1149901T3 (ja) |
ES (1) | ES2261329T3 (ja) |
MX (1) | MXPA01003968A (ja) |
PT (1) | PT1149901E (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7244434B2 (en) | 2002-08-13 | 2007-07-17 | Intervet International B.V. | Replicons of pestviruses that do not express C and or E1 protein and infectious viral particles containing same, that can be used in vaccines |
JP2006071631A (ja) * | 2004-08-06 | 2006-03-16 | Bl:Kk | フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスの検出法およびそのイムノクロマトグラフィーにおける使用 |
US8063195B2 (en) * | 2009-05-22 | 2011-11-22 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Mutations in a toll-like receptor motif in the NS4B of classical swine fever virus strain brescia influences virulence in swine |
KR20180042167A (ko) * | 2015-08-31 | 2018-04-25 | 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 | 선천성 진전을 위한 페스티바이러스 백신 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999055366A1 (en) * | 1998-04-24 | 1999-11-04 | Washington University | Chimeras of hepatitis c virus and bovine viral diarrhea virus |
EP0965639A1 (en) * | 1998-06-05 | 1999-12-22 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Attenuated pestiviruses |
-
2001
- 2001-04-17 EP EP01201388A patent/EP1149901B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-17 ES ES01201388T patent/ES2261329T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-17 DE DE2001618456 patent/DE60118456T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-17 DK DK01201388T patent/DK1149901T3/da active
- 2001-04-17 PT PT01201388T patent/PT1149901E/pt unknown
- 2001-04-17 AT AT01201388T patent/ATE322541T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-04-19 US US09/839,796 patent/US7037508B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-04-19 BR BR0101523A patent/BR0101523A/pt not_active Application Discontinuation
- 2001-04-20 CA CA 2342305 patent/CA2342305C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-04-20 JP JP2001122200A patent/JP4937460B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-04-20 MX MXPA01003968A patent/MXPA01003968A/es active IP Right Grant
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE60118456D1 (de) | 2006-05-18 |
US20020086033A1 (en) | 2002-07-04 |
EP1149901A1 (en) | 2001-10-31 |
BR0101523A (pt) | 2001-11-20 |
JP2002325575A (ja) | 2002-11-12 |
ES2261329T3 (es) | 2006-11-16 |
US7037508B2 (en) | 2006-05-02 |
DK1149901T3 (da) | 2006-07-31 |
DE60118456T2 (de) | 2006-08-24 |
EP1149901B1 (en) | 2006-04-05 |
CA2342305C (en) | 2010-11-09 |
MXPA01003968A (es) | 2003-08-20 |
ATE322541T1 (de) | 2006-04-15 |
PT1149901E (pt) | 2006-08-31 |
CA2342305A1 (en) | 2001-10-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3681369B2 (ja) | キメラおよび/または増殖制限されたフラビウイルス | |
JP4656794B2 (ja) | 無毒性の免疫原性フラビウイルスキメラ | |
WO2006074986A2 (en) | Prrs vaccines | |
JP2009291203A (ja) | 感染性ウシウイルス性下痢ウイルスクローン | |
JP2004520406A (ja) | 弱毒生ワクチン | |
KR20030026931A (ko) | 키메라 아르테리바이러스-유사 입자 | |
AU2005279303B2 (en) | Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle | |
CA2811243C (en) | Bvdv vaccine | |
JP3602759B2 (ja) | 弱毒型のウシウィルス性下痢性ウィルス | |
US7521058B2 (en) | Non-spreading pestivirus | |
KR100909846B1 (ko) | Bvdv 바이러스-유사 입자 | |
JP4937460B2 (ja) | ペスチウイルス変異体及びそれを含有するワクチン | |
CA2363493C (en) | Attenuated forms of bovine viral diarrhea virus | |
JP2008519594A (ja) | 変異体ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス | |
US20230203536A1 (en) | Coronavirus rna replicons and use thereof as vaccines | |
US11351240B2 (en) | Chimeric yellow fever ZIKA virus strain | |
Ortego Alonso et al. | Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into avirus-like particle | |
Bohmer | Engineering of a chimeric SAT2 foot-and-mouth disease virus for vaccine production |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20061222 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080421 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101130 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110228 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110920 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111130 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
RD13 | Notification of appointment of power of sub attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7433 Effective date: 20111215 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120214 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120222 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150302 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |