JP4926060B2 - 免疫をモデュレーションするための突然変異したＨＩＶＮｅｆ - Google Patents

Description

本発明は、ワクチンを調製するためのヒトまたはサル免疫不全ウイルスのアクセサリータンパク質の免疫抑制機能の使用に関する。特に本発明はＮｅｆタンパク質を含むワクチン組成物に関する。

２０年より長い科学的研究がＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）に対するワクチンを発見することに捧げられてきたけれども、ＨＩＶと戦うための納得できる予防手段はまだ発見されるに至っていない。従って、抗ＨＩＶワクチンの２０より多くの臨床試験が開始されそして今日、それらのどれも感染を防止するのに十分な活性性を示していない。

Ｎｅｆ（ネガティブ調節因子）は、ＨＩＶまたはＳＩＶの２７〜３５ｋＤａ調節タンパク質である。その種々の機能のなかでも、Ｎｅｆは、特にヒトにおけるＡおよびＢ型（ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ）のクラスＩ ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）分子（ＭＨＣ−Ｉ）の発現のダウンレギュレーションに関与している。Ｎｅｆのこの性質は突然変異に対して感受性であることが示されているが、しかしながら、アミノ酸位置９３におけるＨＩＶ−１ Ｎｅｆの突然変異は、そのＭＨＣ−Ｉダウンレギュレーション性をモデュレーションするのに効果がないことが証明された（Ali et al. (2003) J. Immunol. 171:3999-4005）。Ｎｅｆは、Ｔヘルパー細胞の表面で普通に発現されるＣＤ４分子のダウンレギュレーションにも関与している。さらに、Ｎｅｆは、成熟クラスＩＩＭＨＣ分子の発現もダウンレギュレーションし、そして未成熟クラスＩＩＭＨＣ分子の発現をアップレギュレーションする。すべてのこれらのレギュレーションは、正常な細胞内輸送（cellular trafficking）に関するＮｅｆ干渉及び特にエンドサイトーシス−分解経路に関するＮｅｆ干渉の結果である（Le Gall et al.(1998) Immunity 8:483-495）。

Ｎｅｆは、ＨＩＶまたはＳＩＶの抗原の１つとして、単独で又は例えばＷＯ ０１／００２３２もしくはＷＯ ０３／０１１３３４に記載されているような他の抗原と組み合わせて、いくつかのワクチン組成物中に含まれた。しかしながら、これらのアプローチは、いずれも活性であることが証明されなかった。Ｎｅｆ投与の結果として、ＨＩＶまたはＳＩＶに対する活性な免疫応答の欠如は、まだ同定されていないＮｅｆの機能に関係しているかも知れず、これに対してＨＩＶまたはＳＩＶに対する活性なワクチンの発生は、おそらくＮｅｆに対して活性な免疫応答を生じさせることを必要とする。

従って、本発明の目的は、Ｎｅｆタンパク質に対するＨＩＶまたはＳＩＶの免疫抑制性に関する。

本発明の他の目的は、Ｎｅｆタンパク質における免疫抑制ドメインの同定に関する。

本発明のさらなる目的は、修飾されたＮｅｆタンパク質を含む医薬組成物またはワクチン組成物を提供することである。

本発明は、該タンパク質の免疫抑制性をモデュレーションするための、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸の突然変異の使用、特にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの使用に関する。

Ｉｎ ｖｉｖｏでは、Ｎｅｆタンパク質は、特に、ＨＩＶ（ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２などの）に感染した個体またはＳＩＶに感染した類人猿において見出される。

本明細書で意図した、突然変異は、Ｎｅｆタンパク質に故意に生じさせた少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入または欠失、あるいはＮｅｆタンパク質の大部分（即ち、同定されたＮｅｆタンパク質の少なくとも約８０％）に対して与えられたＮｅｆタンパク質における少なくとも１つのアミノ酸の自然に起こる置換、挿入または欠失に関する。

本発明に従えば、与えられたタンパク質は、免疫系が存在している生物の免疫系を阻害しやすいならば、免疫抑制性を保持すると言われる。特に、該与えられたタンパク質の免疫抑制性は、Mangeney & Heidmann(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:14920-5およびMangeney et al.(2001)J. Gen. Virol. 82:2515-8に記載の一般的手順に従って測定することができる。即ち、該与えられたタンパク質を発現する、または特に与えられたタンパク質を細胞内空間もしくは細胞外空間に分泌する安定な腫瘍細胞系を樹立しそしてマウスに移植し、そして腫瘍のサイズ（Ａ_{ｐｒｏｔｅｉｎ}）を、該与えられたタンパク質を発現しないもしくは特に該与えられたタンパク質を分泌しない腫瘍細胞系を移植されたマウスから得られた腫瘍のサイズ（Ａ_ｎｏｎｅ）と、数日後に比較する。与えられたタンパク質を発現するもしくは特に分泌する腫瘍のサイズが、非発現腫瘍もしくは特に非分泌腫瘍のサイズより有意に大きければ、与えられたタンパク質は、免疫抑制性であるといわれる。与えられたタンパク質の免疫抑制性は、その免疫抑制指数［（Ａ_{ｐｒｏｔｅｉｎ}−Ａ_ｎｏｎｅ）／Ａ_ｎｏｎｅ］により特徴付けることもできる。与えられたタンパク質の免疫抑制指数が正であるならば、与えられたタンパク質は免疫抑制性であると言われ、そしてその免疫抑制指数がゼロに等しいかもしくは負であるならば、与えられたタンパク質は本質的に免疫抑制活性を持たないと言われる。

本発明は、ＨＩＶまたはＳＩＶの免疫抑制性とＮｅｆタンパク質との間の本発明者により確立された関係から生じる。換言すれば、本発明は、細胞内機能および細胞外機能の両方であることがさらに示されるＮｅｆタンパク質の免疫抑制機能の同定から生じる。さらに本発明者は、Ｎｅｆの免疫抑制機能は、ＣＤ４もしくはＭＨＣ−ＩのＮｅｆで誘導されるダウンレギュレーションとは独立していることを示した。

従って、好ましい態様では、本発明は、得られる突然変異したタンパク質が突然変異していないＮｅｆタンパク質に比べて実質的に保存されたＣＤ４および／またはＭＨＣ−Ｉダウンレギュレーション機能を示すとの条件下の、該タンパク質の免疫抑制性をモデュレーションするための、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸の突然変異の使用に関する。

本明細書で意図した表現「実質的に保存されたＣＤ４および／またはＭＨＣ−Ｉダウンレギュレーション機能」は、与えられたＮｅｆタンパク質のＣＤ４および／またはＭＨＣ−Ｉダウンレギュレーション機能の少なくとも６０％、特に少なくとも８０％が本発明に従う突然変異を有する対応するＮｅｆタンパク質において保存されていることを意味する。

ＣＤ４およびＭＨＣ−Ｉのダウンレギュレーションは、前記与えられたタンパク質をコードする増加する量の核酸でトランスフォーメーションされそして蛍光抗ＣＤ４もしくは抗ＭＨＣ−Ｉ抗体と接触させられたＣＤ４もしくはＭＨＣ−Ｉ発現細胞の蛍光を測定することにより決定することができる。このような方法は、当業者に周知されておりそして特に下記の実施例に記載されている。

免疫抑制タンパク質の免疫抑制ドメインは、該タンパク質に対するその免疫抑制活性を与える責任を担う該タンパク質の領域であると定義され、そして特にそれはその突然変異が該タンパク質の免疫抑制性をモデュレーションしやすいすべてのアミノ酸から構成される。

本明細書で意図した、与えられたタンパク質の「免疫抑制性をモデュレーションする」という表現は、該タンパク質の免疫抑制性を増加または減少させることに関する。

好ましい態様では、本発明は、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制性を阻害するための、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸の突然変異の上記した使用に関する。この態様に従えば、このＮｅｆタンパク質は免疫抑制性を示す。

本発明で意図した、与えられたタンパク質の免疫抑制性の阻害は、実質的に免疫抑制活性を持たない、即ち、ゼロに等しいかもしくは負である免疫抑制指数を有するタンパク質を生じさせる。

免疫抑制性を欠いたＮｅｆタンパク質は抗ＨＩＶまたは抗ＳＩＶワクチンの製造のために特に有利である。実際に、本発明に従う免疫抑制性を欠いたＮｅｆタンパク質を含有するワクチン組成物は、ＨＩＶまたはＳＩＶ感染を阻止するのに特に活性である。何故ならば、それらは、免疫応答を強く刺激しそして特にＮｅｆタンパク質に対して指向させられた抗体の産生およびＮｅｆタンパク質を発現する感染した細胞に対する細胞性免疫応答の誘発を強く刺激するからである。従って、免疫応答のこの刺激は、ＨＩＶまたはＳＩＶ感染の初期工程の期間中Ｎｅｆが生物中に放出されるとき又は感染した細胞により発現されるときＮｅｆのその後の免疫抑制作用を阻止する。従って、Ｎｅｆに対して誘発された免疫応答から生じるＮｅｆタンパク質により伝えられる免疫抑制の不存在は、ＨＩＶまたはＳＩＶ早発感染サイクル（precocious infectious cycles）が活性となるのを阻止しそして免疫系によるウイルスの排除を促進する。

特に、本発明に従うワクチン組成物は、免疫系から抗ＨＩＶまたは抗ＳＩＶ応答を誘導するのに先行技術のＮｅｆ含有組成物よりも活性である。何故ならば、突然変異していないＮｅｆはそれ自体において免疫系の阻害剤であることが本明細書で開示されているからである。

他の好ましい態様では、本発明は、ウイルス疾患の予防および／または処置を意図した医薬またはワクチンの製造のための、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインにおいて突然変異したＮｅｆタンパク質またはそのフラグメント（但し該フラグメントは、該Ｎｅｆタンパク質の突然変異した免疫抑制ドメインを含むものとする）を得るための上記した使用に関する。

本明細書で意図したウイルス疾患は、ウイルス感染から生じるすべての疾患または症候群、例えばＡＩＤＳを包含する。さらに、本発明に従うワクチンは予防的または治療的に使用されることを意味する。

さらに他の好ましい態様では、本発明は、Ｎｅｆタンパク質の構造が実質的に保存されている上記した使用に関する。

その免疫抑制ドメインにおいて突然変異したＮｅｆタンパク質の構造のその天然対応物に対する実質的な保存は、例えば、該突然変異したＮｅｆタンパク質の円二色性スペクトル、ＲＭＮスペクトル、Ｘ線回折パターンまたは任意の他の物理化学的性質を、それが由来する天然のＮｅｆタンパク質のそれと、当業者に周知の方法に従って比較することにより決定することができる。本明細書で意図した突然変異したＮｅｆタンパク質が由来する天然のＮｅｆタンパク質は免疫抑制活性を示すことに留意されるべきである。

さらなる好ましい態様では、本発明は、Ｎｅｆタンパク質のエピトープ、特に立体配座エピトープ（conformational epitopes）が実質的に保存されている上記した使用に関する。特に、Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープが保存されている。

さらに詳しくは、本発明は、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインの外側に位置したエピトープ、特に立体配座エピトープが実質的に保存されている上記した使用に関する。

その免疫抑制ドメインにおいて突然変異したＮｅｆタンパク質のエピトープの、その天然対応物に対する実質的な保存は、例えば、天然のＮｅｆタンパク質に結合することが知られている抗体が、対応するＮｅｆ突然変異体にも結合するということを調べることにより決定することができる。

他のさらなる好ましい態様では、本発明は、Ｎｅｆタンパク質のその免疫抑制性以外の細胞内機能的性質が実質的に保存されている、上記した使用に関する。

さらに好ましくは、本発明は、Ｎｅｆタンパク質のＣＤ４および／またはＭＨＣ−Ｉダウンレギュレーション機能が実質的に保存されている、上記した使用に関する。

Ｎｅｆタンパク質のその免疫抑制性以外の細胞内機能的性質は、該タンパク質が細胞の内側に内包されている（hosted）ときにのみ作用性である（operative）タンパク質の非免疫抑制機能に関する。このような機能は、注目すべきことにＣＤ４およびＭＨＣ−Ｉ発現のダウンレギュレーションを含む。

与えられたタンパク質によるＣＤ４およびＭＨＣ−Ｉ発現のダウンレギュレーションは、該与えられたタンパク質をコードする増加する量の核酸でトランスフォーメーションされそして蛍光抗ＣＤ４もしくは抗ＭＨＣ−Ｉ抗体と接触させられたＣＤ４もしくはＭＨＣ−Ｉ発現細胞の蛍光を測定することにより決定することができる。このような方法は、当業者に周知されておりそして特に下記の実施例に記載されている。

本発明は、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制性を解消するための方法であって、
− 少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換または挿入により該Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインを突然変異させ、
− 該免疫抑制活性の解消を、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫抑制アッセイにより調べること、
を含む方法にも関する。

Ｉｎ ｖｉｖｏ免疫抑制性アッセイは上記したアッセイに対応する。

上記した方法の好ましい態様は、Ｎｅｆタンパク質の構造および／またはエピトープ、特にＮｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインの外側に位置したエピトープが実質的に保存されていることを調べるさらなる工程を含む。

上記した方法の他の好ましい態様は、Ｎｅｆタンパク質の構造および／またはエピトープ、特に免疫抑制ドメインの外側に位置したエピトープ、および／またはＣＤ４および／またはＭＨＣ−Ｉダウンレギュレーション機能が実質的に保存されていることを調べるさらなる工程を含む。

Ｎｅｆタンパク質の構造および／またはエピトープ、および／またはＣＤ４および／またはＭＨＣ−Ｉダウンレギュレーション機能の実質的な保存は、上記したとおりに決定することができる。

本発明は、特に、薬学的に許容される担体と共に、Ｎｅｆタンパク質もしくはそのフラグメントを含むまたはＮｅｆタンパク質もしくはそのフラグメントから構成されるタンパク質またはポリペプチドを、活性物質として含む医薬組成物またはワクチン組成物であって、
● 該Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換および／または挿入により突然変異されており、但し該Ｎｅｆタンパク質は実質的に免疫抑制活性を持たないものとし、そして
● 該フラグメントは、該Ｎｅｆタンパク質の突然変異した免疫抑制ドメインを含みそして実質的に免疫抑制活性を持たない、
医薬組成物またはワクチン組成物に関する。

特に、前記フラグメントのそれぞれＮ末端端部（N-terminal end）およびＣ末端端部（C-terminal end）に隣接した配列は、それが由来するＮｅｆタンパク質における当該フラグメントのそれぞれＮ末端端部およびＣ末端端部に隣接した配列と同一であることができる。

上記した医薬組成物またはワクチン組成物の特定の態様では、Ｎｅｆタンパク質のフラグメントを含むタンパク質またはポリペプチドは、前記フラグメントのそれぞれＮ末端端部および／またはＣ末端端部に隣接した配列が、それが由来するＮｅｆタンパク質における当該フラグメントのそれぞれＮ末端端部および／またはＣ末端端部に隣接した配列とは異なるようなものである。

さらに詳しくは、上記した医薬組成物またはワクチン組成物の他の態様では、Ｎｅｆタンパク質のフラグメントを含むタンパク質またはポリペプチドは、
● 前記フラグメントのＮ末端端部に隣接した配列が、それが由来するＮｅｆタンパク質における当該フラグメントのＮ末端端部に隣接した配列とは異なるか、または
● 前記フラグメントのＣ末端端部に隣接した配列が、それが由来するＮｅｆタンパク質における当該フラグメントのＣ末端端部に隣接した配列とは異なるか、または
● 前記フラグメントのＮ末端端部およびＣ末端端部に隣接した配列が、それが由来するＮｅｆタンパク質における当該フラグメントのＮ末端端部およびＣ末端端部に隣接した配列とは異なる、
ようなものである。

本発明に従う突然変異したＮｅｆタンパク質またはそのフラグメントは免疫抑制が欠如していると言われる。

本発明は、薬学的に許容される担体と共に、Ｎｅｆタンパク質もしくはそのフラグメントを含むまたはＮｅｆタンパク質もしくはそのフラグメントから構成されるタンパク質またはポリペプチドを、活性物質として含む医薬組成物またはワクチン組成物であって、
● 該Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換および／または挿入により突然変異されており、但し該Ｎｅｆタンパク質は実質的に免疫抑制活性を持たないものとし、そして該Ｎｅｆタンパク質のＣＤ４および／またはＭＨＣ−Ｉダウンレギュレーション機能が実質的に保存されているものとし、そして
● 該フラグメントは、該Ｎｅｆタンパク質の突然変異した免疫抑制ドメインを含みそして実質的に免疫抑制活性を持たない、
医薬組成物またはワクチン組成物に関する。

上記した医薬組成物またはワクチン組成物の好ましい態様では、Ｎｅｆタンパク質の突然変異した免疫抑制ドメインの配列は、Ｎｅｆタンパク質の第１αヘリックスのＮ末端から第２αヘリックスのＣ末端まで延びているアミノ酸配列に含まれる。

Ｎｅｆタンパク質の構造は、特にArold et al. (1997) Structure 5: 1361-72およびGrzesiek et al.(1997) Protein Science 6:1248-63に記載されている。Ｎｅｆタンパク質の二次構造エレメント、特にそのαヘリックスの命名法は、Arold et al. (1997)およびGrzesiek et al.(1997)に従うＮｅｆタンパク質のコアドメインの構造的説明に基づいている。

上記した医薬組成物またはワクチン組成物の他の好ましい態様では、Ｎｅｆタンパク質の突然変異した免疫抑制ドメインの配列は、該Ｎｅｆタンパク質の配列の位置８０のアミノ酸から位置１５０のアミノ酸まで、特に位置８１のアミノ酸から位置１４０のアミノ酸までの範囲の配列、特に：
● ＨＩＶ−１Ｎｅｆタンパク質の配列の、位置８０のアミノ酸から位置１２０のアミノ酸まで、さらに詳しくは位置８１のアミノ酸から位置１１８アミノ酸までの範囲の配列、又は
● ＨＩＶ−２Ｎｅｆタンパク質の配列の、位置１０４のアミノ酸から位置１５０のアミノ酸まで、特に位置１０４のアミノ酸から位置１４０のアミノ酸までの範囲の配列、
に含まれる。

Ｎｅｆタンパク質配列は、当業者により容易にアクセスされうる。例として、いくつかのＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２又はＳＩＶＮｅｆタンパク質配列は図４に示される。

さらに好ましくは、上記した医薬組成物またはワクチン組成物において、ＨＩＶ−１Ｎｅｆタンパク質の突然変異した免疫抑制ドメインの配列は、該Ｎｅｆタンパク質の配列の位置９０のアミノ酸から位置１１３のアミノ酸まで、特に位置９０のアミノ酸から位置１１２のアミノ酸までの範囲の配列に含まれる。

上記した医薬組成物またはワクチン組成物の特定の態様では、Ｎｅｆタンパク質の突然変異した免疫抑制ドメインの配列は、配列番号１の位置８０のアミノ酸から位置１２０のアミノ酸まで、特に配列番号１の位置８１のアミノ酸から位置１１７のアミノ酸まで、さらに詳しくは配列番号１の位置９０のアミノ酸から位置１１２のアミノ酸までの範囲のアミノ酸配列に相同的な配列に含まれる。

配列番号１は、Wain-Hobson et al. (1985) Cell 40: 9-17により記載されたＮｅｆタンパク質のアミノ酸配列に相当する（ＨＩＶ−１株ＬＡＩ）。

本発明に従えば、２つの配列は、もしそれらを、例えば、Altschul et al. Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389に定義された如きアルゴリズムを使用することによりまたは当業者に周知されそしてThompson et al., Nucleic Acids Res. (1994) 22:4673-4680に記載されたClustal W softwareを使用することによりアラインメントさせることができるならば、相同的であると言われる。

特に、２つの配列は、もし該２つの配列間のアミノ酸同一性百分率が約３５％に等しいか又は約３５％より大きいならば、相同的であると言われる。

例として、図４は、Clustal W softwareで得られる、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２またはＳＩＶに由来するいくつかのＮｅｆタンパク質の配列アラインメントを表す。配列番号１の位置８１のアミノ酸から位置１１８のアミノ酸までの範囲のアミノ酸配列に相同的である配列は、ボックスで囲まれている。

上記した医薬組成物またはワクチン組成物の他の特定の態様では、Ｎｅｆタンパク質の突然変異した免疫抑制ドメインの配列は、該Ｎｅｆタンパク質の長さ２６もしくは２７アミノ酸の配列に含まれ、該長さ２６もしくは２７アミノ酸の配列のＮ末端端部はペンタペプチドＡＸ_１ＤＸ_２Ｓでありそして該長さ２６もしくは２７アミノ酸の配列のＣ末端端部はアミノ酸Ｌである（式中、Ｘ_１は、任意のアミノ酸、特にＩ、Ｖ、Ｌ、ＦまたはＲを表し、そしてＸ_２は任意のアミノ酸、特にＭ、ＬまたはＦを表す）。

このような配列の例は図４に示される。

本発明のさらに別の特定の態様では、上記した医薬組成物またはワクチン組成物は、下記の配列：

（式中、
Ｘ_１はＩ、Ｌ、Ｖ、ＦまたはＲを表し、
Ｘ_２はＭ、ＬまたはＦを表し、
Ｘ_３はＨ、ＤまたはＦを表し、
Ｘ_４はＦまたはＬを表し、
Ｘ_５はＩまたはＬを表し、
Ｘ_６はＥとは異なる任意のアミノ酸を、特にＲを表し、
Ｘ_７はＫ、ＱまたはＲを表し、
Ｘ_８はＧを表すかまたはアミノ酸を表さず、
Ｘ_９はＥ、ＤまたはＲを表す）
を含むＮｅｆタンパク質もしくはそのフラグメントを含むかまたは該Ｎｅｆタンパク質もしくはそのフラグメントから構成されるタンパク質またはポリペプチドを、活性物質として含む。

配列番号３は、Ｎｅｆの免疫抑制ドメインを含む。

このような配列の例は図４に示される。

本発明の特に好ましい態様に従えば、上記した医薬組成物またはワクチン組成物は、配列番号１の位置９３のアミノ酸に相同的なアミノ酸が、Ｅとは異なるアミノ酸、特にＷ、Ｆ、Ｍ、Ｙ、Ｒ、ＨまたはＫ、さらに詳しくはＲ、ＨまたはＫ、好ましくはＲにより置き換えられている、Ｎｅｆタンパク質もしくはそのフラグメントを含むまた該Ｎｅｆタンパク質もしくはそのフラグメントから構成されるタンパク質またはポリペプチドを、活性物質として含む。

配列番号１の位置９３のアミノ酸に相同的なアミノ酸は、上記したタンパク質またはポリペプチドの配列を配列番号１とアラインメントさせ（例えば、Clustal W softwareを使用して）そして配列番号１の位置９３のアミノ酸とアラインメントしているアミノ酸を選ぶことにより決定することができる。例として、図４は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２またはＳＩＶに由来するいくつかのＮｅｆタンパク質について配列番号１の位置９３のアミノ酸に相同的なアミノ酸を表す。有利には、配列番号１アミノ酸の位置９３のアミノ酸に相同的なアミノ酸の単一の置換が、実質的に免疫抑制を欠いたＮｅｆ突然変異体を生じさせる。

本発明の他の特に好ましい態様に従えば、上記した医薬組成物またはワクチン組成物は、ＨＩＶ−１Ｎｅｆタンパク質の配列の位置９３のアミノ酸が、Ｅとは異なる任意のアミノ酸、特にＷ、Ｆ、Ｍ、Ｙ、Ｒ、ＨまたはＫ、さらに詳しくはＲ、ＨまたはＫ、好ましくはＲにより置き換えられている、ＨＩＶ−１Ｎｅｆタンパク質もしくはそのフラグメントを含むまたは該ＨＩＶ−１Ｎｅｆタンパク質もしくはそのフラグメントから構成されるタンパク質又はポリペプチドを、活性物質として含む。

本発明のなお他の特に好ましい態様に従えば、上記した医薬組成物またはワクチン組成物は、配列番号１の位置９３のアミノ酸に相同的なアミノ酸が、Ｅとは異なる任意のアミノ酸、特にＷ、Ｆ、Ｍ、Ｙ、Ｒ、ＨまたはＫ、さらに詳しくはＲ、ＨまたはＫ、好ましくはＲにより置き換えられているＮｅｆタンパク質を、活性物質として含む。

例として、図６Ｂに示されたとおり、ＨＩＶ−１Ｎｅｆの位置９３に相同的な位置は、ＳＩＶ株ｍａｃ２３９Ｎｅｆ（配列番号２２）における位置１２５に相当しそしてＲによるＳＩＶ株ｍａｃ２３９Ｎｅｆの位置１２５におけるＥの置換は、免疫抑制欠如Ｎｅｆ突然変異体（配列番号２３）を生じさせる。

本発明の最も好ましい態様に従えば、上記した医薬組成物またはワクチン組成物は、活性物質として、配列番号２に相当する突然変異したＮｅｆタンパク質を含む。

本発明のさらに他の好ましい態様では、上記した医薬組成物またはワクチン組成物は、Ｎｅｆタンパク質が該医薬組成物またはワクチン組成物に含まれているとき、Ｎｅｆタンパク質の構造は実質的に保存されていることを特徴とする。

本発明のさらなる好ましい態様では、上記した医薬組成物またはワクチン組成物は、Ｎｅｆタンパク質が該医薬組成物またはワクチン組成物に含まれているとき、Ｎｅｆタンパク質のエピトープ、例えばＢ細胞もしくはＴ細胞エピトープ、特に立体配座エピトープが実質的に保存されていることを特徴とする。

さらに詳しくは、本発明は、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインの外側に位置したエピトープ、特に立体配座エピトープが実質的に保存されているエピトープが実質的に保存されている、上記した医薬組成物またはワクチン組成物に関する。

本発明の他のさらなる好ましい態様では、上記した医薬組成物またはワクチン組成物は、Ｎｅｆタンパク質が該医薬組成物またはワクチン組成物に含まれているとき、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制性以外の細胞内機能的性質が実質的に保存されていることを特徴とする。

さらに好ましくは、本発明は、Ｎｅｆタンパク質のＣＤ４および／またはＭＨＣ−Ｉダウンレギュレーション機能が実質的に保存されている、上記した医薬組成物またはワクチン組成物に関する。

本発明は、上記した医薬組成物又はワクチン組成物において定義されたタンパク質またはポリペプチドにも関する。

特に、本発明は、配列番号２または配列番号３１により表されるタンパク質に関する。

本発明は、上記した如きタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を活性物質として含む医薬組成物またはワクチン組成物にも関する。

本発明は、上記した医薬組成物またはワクチン組成物において定義されたタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列にも関する。

特に、本発明は、配列番号２または配列番号３１により表されるタンパク質をコードする核酸配列に関する。

本発明は、ＨＩＶ感染などのウイルス疾患の予防および／または処置を意図した医薬またはワクチンの製造のための、上記したタンパク質もしくはポリペプチドまたは上記した核酸の使用にも関する。

本発明の好ましい態様では、活性物質として上記したタンパク質またはポリペプチドを含む上記した医薬または上記した医薬組成物もしくはワクチン組成物は、特にｇｐ４１、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、ｇｐ１６０、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏ、Ｒｅｖ、ＲＴ、ＶｐｕまたはＴａｔから選ばれる、少なくとも１つのＨＩＶタンパク質もしくはリポペプチドまたはそのフラグメントも含む。

本発明の好ましい態様では、活性物質として上記した如きタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を含む上記した医薬または上記した医薬組成物もしくはワクチン組成物は、特にｇｐ１２０、ｇｐ１４０、ｇｐ１６０、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、ＲＴ、ＶｐｕまたはＴａｔをコードする核酸から選ばれる、ＨＩＶタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸またはそのフラグメントも含む。

活性物質として上記した如きタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を含む上記した医薬または上記した医薬組成物もしくはワクチン組成物の他の好ましい態様では、核酸はネイキッド（naked）であるかまたは特にカナリア痘ウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはハシカウイルスベクターから選ばれるベクターに含まれる。

本発明は、上記したタンパク質またはポリペプチドの使用であって、
− 上記した該タンパク質またはポリペプチドに対して指向させたポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体またはそのフラグメント、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ）’_２フラグメント、
− 上記した該タンパク質またはポリペプチドに対して指向させたｓｃＦｖポリペプチド、
− 上記した該タンパク質またはポリペプチドに対して指向させたアプタマー、
− 上記した該タンパク質またはポリペプチドに対して指向させた結合ペプチド、
の製造のための上記したタンパク質またはポリペプチドの使用にも関する。

上記した抗体もしくは抗体のフラグメント、ｓｃＦｖポリペプチド、アプタマーまたは結合ペプチドの製造方法は特に当業者に周知されている。結合ペプチドに関して、それらはリボソームまたはファージディスプレー法などの当業者に周知の方法に従って製造することもできる。

本発明は、本発明に関与する上記したタンパク質またはポリペプチドに対して指向させた抗体もしくはそのフラグメント、ｓｃＦｖポリペプチド、アプタマーまたは結合ペプチド（但し該抗体もしくはそのフラグメント、ｓｃＦｖポリペプチドまたはアプタマーは、本発明に関与する上記したタンパク質またはポリペプチドとは異なるタンパク質またはポリペプチドに結合しないものとする）にも関する。

本明細書で意図した、上記した抗体もしくはそのフラグメント、ｓｃＦｖポリペプチド、アプタマーまたは結合ペプチドは、本発明に従うタンパク質またはポリペプチドに特異的に結合する、換言すれば、それらは本発明に従うタンパク質またはポリペプチドに対して特異的なリガンドである。特に、これらのリガンドの特異性は、それらが本発明に従うタンパク質またはポリペプチドに結合するが、突然変異により本発明に従う該タンパク質またはポリペプチドが得られるタンパク質には結合しないようなものである。

本発明は、Ｎｅｆタンパク質の突然変異体を製造するための方法であって、
− 第１工程で、該Ｎｅｆタンパク質の配列の位置８０のアミノ酸から位置１５０のアミノ酸までの範囲の配列を少なくとも１つのアミノ酸の欠失、挿入または置換により突然変異させ、
− 第２工程において、第１工程で得られた突然変異したＮｅｆタンパク質の免疫抑制性を調べそして免疫抑制性を欠いている突然変異体を選ぶ、
Ｎｅｆタンパク質の突然変異体を製造するための方法にも関する。

この方法に従って得られた突然変異体は、免疫抑制欠失突然変異体である。

Ｎｅｆタンパク質の突然変異体を製造するための上記した方法の好ましい態様では、第３工程において、第２工程で得られた突然変異したＮｅｆタンパク質のＣＤ４および／またはＭＨＣ−Ｉダウンレギュレーション機能を調べ、そして前記Ｎｅｆタンパク質に対して実質的に保存されたＣＤ４および／またはＭＨＣ−Ｉダウンレギュレーション機能を有する突然変異したＮｅｆタンパク質を選ぶ。

Ｎｅｆタンパク質の突然変異体を製造するための上記した方法の他の好ましい態様では、突然変異した配列は：
− ＨＩＶ−１タンパク質の配列の、位置８０のアミノ酸から位置１２０のアミノ酸まで、さらに詳しくは位置９０のアミノ酸から位置１１２のアミノ酸まで、または
− ＨＩＶ−２Ｎｅｆタンパク質の配列の位置１０４のアミノ酸から位置１５０のアミノ酸まで、
の範囲にある。

Ｎｅｆタンパク質の突然変異体を製造するための上記した方法の他の好ましい態様では、Ｎｅｆタンパク質の配列を、該Ｎｅｆタンパク質をコードする核酸配列の指定突然変異誘発（directed mutagenesis）により突然変異させる。

Ｎｅｆタンパク質の突然変異体を製造するための上記した方法の他の好ましい態様では、突然変異したＮｅｆタンパク質の免疫抑制性を、上記したMangeney Heidmann(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:14920-5およびMangeney et al.(2001)J. Gen. Virol. 82:2515-8に記載の一般的手順に従って調べ、特に上記した免疫抑制指数を測定しそしてゼロに等しいかまたは負である免疫抑制指数を有する突然変異したＮｅｆタンパク質を選ぶ。

与えられたタンパク質によるＣＤ４およびＭＨＣ−Ｉ発現のダウンレギュレーションは、該与えられたタンパク質をコードする増加する量の核酸でトランスフォーメーションされそして蛍光抗ＣＤ４または抗ＭＨＣ−Ｉ抗体と接触させられたＣＤ４およびＭＨＣ−Ｉ発現細胞の蛍光を測定することにより決定することができる。このような方法は、当業者に周知されておりそして特に下記の実施例に記載されている。

本発明は、上記した方法により製造されやすいＮｅｆタンパク質の突然変異体、および薬学的に許容される担体と共にＮｅｆタンパク質の該突然変異体を含む医薬組成物にも関する。

本発明は、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインを含むまたはＮｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインから構成される新規なタンパク質またはポリペプチドであって、但し該タンパク質またはポリペプチドにおける免疫抑制ドメインのそれぞれＮ末端端部および／またはＣ末端端部に隣接した配列は、もし存在するならば、それが由来するＮｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインのそれぞれＮ末端端部および／またはＣ末端端部に隣接した配列とは異なるものとする、新規なタンパク質またはポリペプチドにも関する。

さらに詳しくは、上記した新規なタンパク質またはポリペプチドの態様では：
● 免疫抑制ドメインのＮ末端端部に隣接した配列は、それが由来するＮｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインのＮ末端端部に隣接した配列とは異なり、
● 免疫抑制ドメインのＣ末端端部に隣接した配列は、それが由来するＮｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインのＣ末端端部に隣接した配列とは異なり、または
● 免疫抑制ドメインのそれぞれＮ末端端部およびＣ末端端部に隣接した配列は、それが由来するＮｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインのそれぞれＮ末端端部およびＣ末端端部に隣接した配列とは異なる。

本発明の特定の態様では、上記した新規なタンパク質またはポリペプチドは、ＣＤ４および／またはＭＨＣ−Ｉダウンレギュレーション機能を示す。

上記した新規なタンパク質もしくはポリペプチドを構成するかまたは上記した新規なタンパク質もしくはポリペプチドに含まれるＮｅｆ免疫抑制ドメインは、天然に存在するＮｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインに対して突然変異されていてもよくまたは突然変異されていなくてもよい。

従って、上記した新規なタンパク質またはポリペプチドは、一般的な場合に、それが含むＮｅｆ免疫抑制ドメイン又はそれを構成するＮｅｆ免疫抑制ドメインは、一般に免疫抑制性を示す天然に存在するＮｅｆタンパク質から突然変異なしに誘導されるならば、免疫抑制性であることができる。

新規なタンパク質またはポリペプチドは、その天然の形態に対して突然変異されているＮｅｆ免疫抑制ドメインを含むことができまたはこのＮｅｆ免疫抑制ドメインから構成されることもできる。この突然変異は、Ｎｅｆ免疫抑制ドメインの免疫抑制性に関してサイレントであることができ、これは、一般的な場合に、それがＮｅｆ免疫抑制ドメインの免疫抑制性に影響を与えないことを意味し、またはこの突然変異が免疫抑制ドメインを免疫抑制欠失させることができることを意味し、Ｎｅｆ免疫抑制ドメインに影響を与える上記した突然変異の場合がそうである。

さらに、ある特定の場合に、免疫抑制ドメインは、免疫抑制性を欠いた天然に存在するＮｅｆ変異体に由来することもできる。

上記した新規なタンパク質またはポリペプチドの好ましい態様では、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインの配列は、Ｎｅｆタンパク質の第１αヘリックスのＮ末端から第２αヘリックスのＣ末端まで延びているアミノ酸配列に含まれる。

上記した新規なタンパク質またはポリペプチドの他の好ましい態様では、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインの配列は、該Ｎｅｆタンパク質の配列の位置８０のアミノ酸から位置１５０のアミノ酸まで、特に位置８１のアミノ酸から位置１４０のアミノ酸までの範囲の配列、特に：
● ＨＩＶ−１Ｎｅｆタンパク質の配列の、位置８０のアミノ酸から位置１２０のアミノ酸まで、さらに詳しくは位置８１のアミノ酸から位置１１８のアミノ酸までの範囲の配列、または
● ＨＩＶ−２Ｎｅｆタンパク質の配列の、位置１０４のアミノ酸から位置１５０のアミノ酸まで、特に位置１０４のアミノ酸から位置１４０のアミノ酸までの範囲の配列、
に含まれる。

さらに好ましくは、上記した新規なタンパク質またはポリペプチドにおいて、ＨＩＶ−１Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインの配列は、該Ｎｅｆタンパク質の配列の、位置９０のアミノ酸から位置１１３のアミノ酸まで、特に位置９０のアミノ酸から位置１１２のアミノ酸までの範囲の配列に含まれる。

上記した新規なタンパク質またはポリペプチドの他の好ましい態様では、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインの配列は、配列番号１の位置８０のアミノ酸から位置１２０のアミノ酸まで、特に配列番号１の位置８１のアミノ酸から位置１１７のアミノ酸まで、さらに詳しくは配列番号１の位置９０のアミノ酸から位置１１２のアミノ酸までの範囲のアミノ酸配列に相同的な配列に含まれる。

上記した新規なタンパク質またはポリペプチドの特に好ましい態様では、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインの配列は、該Ｎｅｆタンパク質の長さ２６もしくは２７アミノ酸の配列、該Ｎｅｆタンパク質のＮ末端端部、に含まれ、該長さ２６もしくは２７アミノ酸の配列のＮ末端端部はペンタペプチドＡＸ_１ＤＸ_２Ｓでありそして該長さ２６もしくは２７アミノ酸の配列のＣ末端端部はアミノ酸Ｌである（式中、Ｘ_１は、任意のアミノ酸、特にＩ、Ｖ、Ｌ、ＦまたはＲを表し、そしてＸ_２は任意のアミノ酸、特にＭ、ＬまたはＦを表す）。

本発明の好ましい態様では、上記した新規なタンパク質またはポリペプチドを構成するまたは上記した新規なタンパク質またはポリペプチドに含まれるＮｅｆ免疫抑制ドメインは、突然変異されておらず、このようなドメインは突然変異されていないと言われ、そして天然に免疫抑制性のＮｅｆタンパク質に由来する。有利には、このような突然変異していないドメインを含むまたはこのような突然変異していないドメインから構成される新規なタンパク質またはポリペプチドは免疫抑制性である。

他の好ましい態様では、新規なタンパク質またはポリペプチドは、下記のＨＩＶ−１Ｎｅｆフラグメント：

または該ＨＩＶ−１Ｎｅｆフラグメントと少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは９０％の同一性を示す相同的なペプチド配列の１つから構成される。

本発明は、該ＨＩＶ−１Ｎｅｆフラグメントまたは相同的なペプチド配列を含む新規なタンパク質またはポリペプチドであって、但し該タンパク質またはポリペプチドにおけるＨＩＶ−１ＮｅｆフラグメントのそれぞれＮ末端端部および／またはＣ末端端部に隣接した配列が、もし存在するならば、それらが由来するＨＩＶ−１ＮｅｆフラグメントのそれぞれＮ末端端部および／またはＣ末端端部に隣接した配列とは異なるものとする、新規なタンパク質またはポリペプチドにも関する。

他の好ましい態様では、新規なタンパク質またはポリペプチドは下記のＨＩＶ−２Ｎｅｆフラグメント：

または該ＨＩＶ−２Ｎｅｆフラグメントと少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは９０％の同一性を示す相同的なペプチド配列の１つから構成される。

本発明は、該ＨＩＶ−２Ｎｅｆフラグメントまたは相同的なペプチド配列を含む新規なタンパク質またはポリペプチドであって、但し、該タンパク質またはポリペプチドにおけるＨＩＶ−２ＮｅｆフラグメントのそれぞれＮ末端端部および／またはＣ末端端部に隣接した配列が、もし存在するならば、それが由来するＮｅｆタンパク質のＨＩＶ−２ＮｅｆフラグメントのそれぞれＮ末端端部および／またはＣ末端端部に隣接した配列とは異なるものとする、新規なタンパク質またはポリペプチドにも関する。

上記した新規なタンパク質またはポリペプチドの他の特に好ましい態様では、免疫抑制ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換および／または挿入により突然変異させられており、そして特に配列番号１の位置９３のアミノ酸に相同的なアミノ酸が、Ｅとは異なる任意のアミノ酸、特にＷ、Ｆ、Ｍ、Ｙ、Ｒ、ＨまたはＫ、さらに特定的にはＲ、ＨまたはＫ、好ましくはＲにより置き換えられている。有利には、このような新規なタンパク質またはポリペプチドは、免疫抑制活性を欠いている。

上記した新規なタンパク質またはポリペプチドのなお他の特に好ましい態様では、ＨＩＶ−１Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインは、該ＨＩＶ−１Ｎｅｆタンパク質の位置９０のアミノ酸を、Ｅとは異なる任意のアミノ酸、特にＷ、Ｆ、Ｍ、Ｙ、Ｒ、ＨまたはＫ、さらに詳しくはＲ、ＨまたはＫ、好ましくはＲにより置換することにより突然変異させられている。

本発明は、核酸が上記した新規なタンパク質又はポリペプチドをコードすることを特徴とする核酸にも関する。

本発明は、上記した新規なタンパク質又はポリペプチドのペプチド模倣物にも関する。

本発明は、Ｎｅｆタンパク質の位置８０のアミノ酸から位置１５０のアミノ酸までの範囲の配列に対して、特に：
● ＨＩＶ−１Ｎｅｆタンパク質の配列の、位置８０のアミノ酸から位置１２０のアミノ酸まで、さらに詳しくは位置９０のアミノ酸から位置１２０のアミノ酸までの範囲の配列に対して、又は
● ＨＩＶ−２Ｎｅｆタンパク質の配列の、位置１０４のアミノ酸から位置１５０のアミノ酸まで範囲の配列に対して、
指向させた抗体もしくはそのフラグメント、ｓｃＦｖポリペプチド、アプタマーまたは結合ペプチドにも関する。

本発明は、上記した新規なタンパク質またはポリペプチドに対して指向させた抗体もしくはそのフラグメント、ｓｃＦｖポリペプチド、アプタマーまたは結合ペプチドであって、但し該抗体もしくはそのフラグメント、ｓｃＦｖポリペプチドまたはアプタマーは、免疫抑制ドメインが上記した該新規なタンパク質またはポリペプチドの免疫抑制ドメインに相当するＮｅｆタンパク質に結合しないものとする、抗体もしくはそのフラグメント、ｓｃＦｖポリペプチド、アプタマーまたは結合ペプチドにも関する。

本明細書で意図した上記した抗体もしくはそのフラグメント、ｓｃＦｖポリペプチド、アプタマーまたは結合ペプチドは、本発明に従う新規なタンパク質またはポリペプチド（即ち、本発明に従うＮｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインを含むタンパク質またはポリペプチド）に対して特異的である。特に、これらの抗体もしくはそのフラグメント、ｓｃＦｖポリペプチドまたはアプタマーは、その自然の環境においてＮｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインに結合しない、即ち、これらの抗体もしくはそのフラグメント、ｓｃＦｖポリペプチドまたはアプタマーは、天然のＮｅｆタンパク質に結合しない。

本発明は、薬学的に許容される担体と共に、活性物質として、上記した新規なタンパク質もしくはポリペプチド、または該新規なタンパク質もしくはポリペプチドをコードする上記した核酸を含む医薬組成物またはワクチン組成物にも関する。

本発明は、免疫系の阻害を必要とする病理、例えばアレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶の予防または処置を意図する医薬の製造のための、Ｎｅｆタンパク質もしくはそのフラグメントを含むまたはＮｅｆタンパク質もしくはそのフラグメントから構成されるタンパク質もしくはポリペプチドであって、免疫抑制活性を示す該タンパク質もしくはポリペプチドの使用にも関する。

有利な態様では、本発明は、免疫系の阻害を必要とする病理、例えばアレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶の予防または処置を意図する医薬の製造のための、免疫抑制性を示す上記した新規なタンパク質またはポリペプチドの上記した使用に関する。

本発明は、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制活性を阻害しやすい化合物をスクリーニングするための、Ｎｅｆタンパク質もしくはそのフラグメントを含むまたはＮｅｆタンパク質もしくはそのフラグメントから構成されるタンパク質またはポリペプチドの使用にも関する。

本発明は、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制活性を阻害しやすい化合物をスクリーニングするための、上記した新規なタンパク質またはポリペプチドの使用にも関する。

有利には、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制活性を阻害しやすいこのような化合物は抗ウイルス剤として使用することができる。

本明細書で意図した、スクリーニングするべき化合物は、いかなる化学的性質であってもよい。特に、スクリーニングするべき化合物は化合物ライブラリーに含まれる。

上記した新規なタンパク質またはポリペプチドの上記した使用の好ましい態様では、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインの配列は突然変異していない配列に相当する。

本発明は、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制活性を阻害しやすい化合物にも関する。このような化合物は、特にウイルス疾患、例えばＨＩＶもしくはＳＩＶ感染の予防または処置を意図した、医薬組成物の製造のために有用でありうる。

これらの化合物の免疫抑制阻害活性は、化合物の不存在下または存在下に与えられたＮｅｆタンパク質の免疫抑制指数を測定することにより決定することができる。化合物は、該化合物の存在下の与えられたＮｅｆタンパク質の免疫抑制指数が、該化合物の不存在下の同じＮｅｆタンパク質の免疫抑制指数に比べて減少しているとき、免疫抑制阻害活性を有すると言われるであろう。

本発明は、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制活性を阻害しやすい化合物をスクリーニングするための、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインのリガンド、例えば抗体もしくはそのフラグメント、ｓｃＦｖポリペプチド、アプタマーまたは結合ペプチドの使用にも関する。

本発明は、下記の工程：
− Ｎｅｆタンパク質もしくはＮｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインを含むそのフラグメント、または上記した新規なタンパク質もしくはポリペプチドを、スクリーニングするべき化合物と接触させ、
− 該Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインもしくは該Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインを含むそのフラグメントの免疫抑制ドメインまたは上記新規なタンパク質もしくはポリペプチドの免疫抑制ドメインに結合する化合物を選び、
− 場合により、選ばれた化合物がＮｅｆタンパク質の免疫抑制活性を阻害することを調べる、
工程を含むＮｅｆタンパク質の免疫抑制活性を阻害しやすい化合物をスクリーニングするための方法にも関する。

本発明の好ましい態様では、上記したスクリーニング法は、下記の工程：
− Ｎｅｆタンパク質もしくはＮｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインを含むそのフラグメント、または上記した新規なタンパク質もしくはポリペプチドを、スクリーニングするべき化合物および免疫抑制ドメインのリガンド、例えば抗体、ｓｃＦｖポリペプチド、アプタマーまたは結合ペプチドと接触させ、
− 該Ｎｅｆタンパク質もしくはＮｅｆフラグメントまたは上記した新規なタンパク質もしくはポリペプチドへのリガンドの結合を阻止しそして該リガンドに結合しない化合物を選び、
− 場合により、選ばれた化合物がＮｅｆタンパク質の免疫抑制活性を阻害することを調べる、
工程を含む。

本発明は、Ｎｅｆタンパク質もしくはそのフラグメントに結合する化合物を選びそして該選ばれた化合物が該Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制活性を阻害することを調べる、Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制活性を阻害しやすい化合物のスクリーニング方法にも関する。

本発明は、本発明の上記したスクリーニング方法に従って選ばれる化合物にも関する。

実施例
実施例１
野生型ＮｅｆおよびＥ９３ＲＮｅｆ突然変異体をコードする遺伝子のクローニング
高フィデリティPfx Platinum polymerase（Invitrogen）および下記のプライマー：

によるＰＣＲによりｐＣＤＮＡ３−ＮｅｆからＨＩＶ−１株ＬＡＩＮｅｆを回収した（Peden K., Emerman M. and Montaginier L.1991, Virology 185(2):661-672）（O.Schwartz, Institut Pasteur, France）。

増幅産物をＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そして同じ酵素で開かれたｐＳｅｃＴａｇ２Ａベクター（Invitrogen）にライゲーションした。次いでベクターの輸出シグナル配列（export signal sequence）の前に置かれたＮｅｆを、下記のプライマー：

により増幅させた。

産物をＡｇｅＩおよびＭｌｕＩで消化し、そして同じ酵素で消化されたレトロウイルスベクターｐＤＦＧ−ＭｏＴＭｔａｇ（Mangeney Heidmann(1998) Proc. Natl. Acad.U.S.A. 95:14920-5）にライゲーションしてＨＩＶ−Ｎｅｆの輸出されたバージョン（exported version）（配列番号１７）を発現するｐＤＦＧ−ｅｘｐＮｅｆ（配列番号１６）を得た。

次いで突然変異Ｅ９３Ｒを３つの下記のフラグメントのライゲーションによりｐＤＦＧ−ｅｘｐＮｅｆに導入して、Ｅ９３ＲＮｅｆの輸出されたバージョン（配列番号１９）を発現するｐＤＦＧ−ｅｘｐＮｅｆＥ９３Ｒ（配列番号１８）を得た：
１）ベクターのＡｇｅＩ−ＭｌｕＩフラグメント
２）プライマー：

により得られそしてＡｆｌＩＩで消化されたＰＣＲ産物；
３）プライマー

により得られそしてＡｆｌＩＩおよびＭｌｕＩで消化されたＰＣＲ産物

次いでＮｅｆおよび突然変異体Ｅ９３Ｒを、下記のプライマー

によりｐＤＦＧ−ｅｘｐＮｅｆベクターから回収した。

産物をＳａｌＩおよびＭｌｕＩで消化しそして、ＸｈｏＩおよびＭｌｕＩで消化されたｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＴ（Blaise et al.(2003)Proc. Natl. Acad.Sci.100:13013-8）にライゲーションして、それぞれＮｅｆ（配列番号１）を発現するｐｈＣＭＶ−Ｎｅｆ（配列番号２０）およびＥ９３ＲＮｅｆ（配列番号２）を発現するｐｈＣＭＶ−ＮｅｆＥ９３Ｒ（配列番号２１）を得た。

同様に、輸出シグナル配列を有するＮｅｆおよびＥ９３ＲＮｅｆ突然変異体をコードする配列を、それぞれｐＤＦＧ−ｅｘｐＮｅｆおよびｐＤＦＧ−ｅｘｐＮｅｆＥ９３Ｒから抽出しそしてｐｈＣＭＶに挿入してｐｈＣＭＶ−ｅｘｐＮｅｆ（配列番号１４）およびｐｈＣＭＶ−ｅｘｐＮｅｆＥ９３Ｒ（配列番号１５）を得た。

実施例２
野生型ＮｅｆおよびＥ９３ＲＮｅｆ突然変異体の免疫抑制指数の決定
ＮｅｆおよびそのＥ９３Ｒ突然変異体の免疫抑制指数を、Mangeney & Heidmann(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:14920-5およびMangeney et al.(2001)J. Gen. Virol. 82:2515-8に記載の一般的手順に従って測定した。

簡単に言えば、ＭＣＡ２０５細胞を、それぞれ、プラスミドｐＤＦＧ−ｅｘｐＮｅｆおよびｐＤＦＧ−ｅｘｐＮｅｆＥ９３Ｒ、または場合によりプラスミドｐｈＣＭＶ−ｅｘｐＮｅｆおよびｐｈＣＭＶ−ｅｘｐＮｅｆＥ９３Ｒにより安定にトランスフォーメーションした。次いで、野生型Ｎｅｆ、Ｅ９３ＲＮｅｆ突然変異体を発現するが外因性タンパク質を発現しない１０^６個のＭＣＡ細胞を、Ｂａｌｂ／ｃマウスに注射しそして腫瘍面積を１日おきに測定した。７〜８日後に、免疫抑制指数を決定した。

タンパク質の免疫抑制指数を、（Ａ_{ｐｒｏｔｅｉｎ}−Ａ_ｎｏｎｅ）／Ａ_ｎｏｎｅ（式中、Ａ_{ｐｒｏｔｅｉｎ}およびＡ_ｎｏｎｅは、それぞれ、関心のあるタンパク質（即ち、ＮｅｆまたはＥ９３ＲＮｅｆ突然変異体）を発現しそして外因性タンパク質を発現しないＭＣＡ細胞で得られた最大腫瘍面積である）として計算した。

結果を図１に示す。見られるとおり、Ｎｅｆの免疫抑制指数は約０．６であり、これはＮｅｆ発現腫瘍のサイズは普通の腫瘍より１．６倍大きいことを示し、従ってＮｅｆは抗腫瘍免疫応答を阻害する免疫抑制タンパク質であることを証明する。対照的に、Ｅ９３ＲＮｅｆ突然変異体の免疫抑制指数は負であり、従ってこの突然変異体は、免疫抑制活性を持たないことおよびこのＮｅｆ突然変異体を発現する腫瘍は、免疫系により普通の腫瘍よりも容易に認識されそして排除されることを証明する。

実施例３
ＮｅｆおよびそのＥ９３Ｒ突然変異体によるＣＤ４発現のダウンレギュレーション
ＨｅＬａ細胞を、１μｇのＣＭＶ−ＣＤ４（Janvier et al. (2001) J.Virol.75:3971-6）および指示された量のｐｈＣＭＶ−ＮｅｆまたはｐｈＣＭＶ−ＮｅｆＥ９３Ｒで共トランスフェクションした。次いでＣＤ４発現を、ＰＣ５カップリングした抗ヒトＣＤ４抗体（ＩＭ２６３６，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）を使用するＦＡＣＳにより測定した。図２に示された結果は、野生型ＮｅｆおよびＥ９３ＲＮｅｆ突然変異体は、同様な程度にＣＤ４発現をダウンレギュレーションすることを示す。これは、Ｅ９３ＲＮｅｆ突然変異体の構造は、野生型Ｎｅｆの構造に対して変わらないことを示唆する。

実施例４
ＮｅｆおよびそのＥ９３Ｒ突然変異体によるＭＨＣ−Ｉ発現のダウンレギュレーション
２９３Ｔ細胞を、１μｇのＣＭＶ−ＨＬＡ Ａ２（Le Gall et al.(2000) J.Virol.74:9256-66）および指示された量のｐｈＣＭＶ−ＮｅｆまたはｐｈＣＭＶ−ＮｅｆＥ９３Ｒで共トランスフェクションした。ＭＨＣ−Ｉ発現を、ＰＥカップリングした抗ヒトＭＨＣ−Ｉ抗体 Ｗ６／３２（eBioscience）によるＦＡＣＳにより測定した。

図３に示された結果は、野生型ＮｅｆおよびＥ９３ＲＮｅｆ突然変異体は、同様な程度にＭＨＣ−Ｉ発現をダウンレギュレーションすることを示す。これは、Ｅ９３ＲＮｅｆ突然変異体の構造は、野生型Ｎｅｆの構造に対して変わらないことも示唆する。

実施例５
野生型Ｎｅｆの免疫抑制ドメインの位置の決定
Ｎｅｆの三次元構造に基づいて、Ｎｅｆの免疫抑制ドメインの位置を決定するために、ＨＩＶ−１株ＬＡＩのＮｅｆタンパク質の３つのフラグメントをデザインした。
１）残基番号１から残基番号８９まで延びているフラグメント、
２）残基番号８０から残基番号１２０まで延びているフラグメント、
３）残基番号１１３から残基番号２０６まで延びているフラグメント、

フラグメント２は推定免疫抑制ドメインを含むが、フラグメント番号１および３は、このドメインを含まない。フラグメント２は、ＨＩＶ−１Ｎｅｆタンパク質の既知のコア構造（PBD entry 1EFN）に従って、Ｎｅｆの推定免疫抑制ドメインを含有する全体の２つのα−ヘリカルドメインを含むように、Ｎｅｆの推定免疫抑制ドメインから両方に延びている。

テンプレートとしてｐＣＤＮＡ３ベクター（pedon K., Emerman M. and Montagnier L. 1991, Virology 185(2): 661-672）にクローニングされたＮｅｆ遺伝子および下記のプライマー対：
● フラグメント１では：

● フラグメント２では：

● フラグメント３では：

を使用するＰＣＲにより、前記フラグメントをコードするＤＮＡｓを発生させた。

ＰＣＲ生成物をＳｆｉＩおよびＭｌｕＩで消化しそして同じ酵素で開いたｐＤＦＧ−ｅｘｐＮｅｆにクローニングして、フラグメントをヒトＩｇκ軽鎖の細胞外移行シグナルペプチドと遺伝子融合させた。従って、得られた構築物はＨＩＶ−１Ｎｅｆの細胞外に局在したフラグメントを発現した。それらを、実施例２に記載のｉｎ ｖｉｖｏ免疫抑制アッセイにおいて使用した。正の指数（＋）は、考慮されたフラグメントがｉｎ ｖｉｖｏ免疫抑制性を有するが、ゼロより少ないかまたはゼロに等しい（−）指数は、考慮されたフラグメントがこのような性質を欠いていることを示す。

図５に説明されたとおり、ＨＩＶ−１Ｎｅｆの残基９０から残基１２０まで延びているフラグメントはｉｎ ｖｉｖｏでの免疫抑制性を示す。従ってこのフラグメントは、Ｎｅｆの免疫抑制ドメインを含む。フラグメント１および３は、この免疫抑制ドメインをアミノ酸９０〜１１２にさらに減少させることができることを示す。

実施例６
追加の野生型Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制指数の決定
Ｎｅｆの免疫抑制指数を、ＨＩＶ−１株Ａ１Ｎｅｆ（配列番号２８）およびＨＩＶ−２株ＳＴ Ｎｅｆ（配列番号２９）について実施例２に記載のようにして決定した。

予想されるとおり、結果は、これらのＮｅｆタンパク質も免疫抑制性である（図６Ａ）ことを示す。

実施例７
ＳＩＶＮｅｆおよびそのＥ１２５Ｒ突然変異体の免疫抑制指数の決定
実施例２に記載のとおりＳＩＶ株ｍａｃ２３９野生型Ｎｅｆ（配列番号３０）およびそのＥ１２５Ｒ突然変異体（配列番号３１）について免疫抑制指数を決定した。ＳＩＶｍａｃ２３９ＮｅｆにおけるＥ１２５Ｒ突然変異は、ＨＩＶ−１ ＬＡＩの上記したＥ９３Ｒ突然変異に相同的でありそして実施例１に記載の手順と同様な手順に従って導入された。

結果は、ＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質は、免疫抑制活性を有するが、Ｅ→Ｒ突然変異体は、このような活性を完全に欠いていることを示す（図６Ｂ）。

野生型Ｎｅｆ（白色柱）およびそのＥ９３Ｒ突然変異体（グレーの柱）の免疫抑制指数（鉛直軸）を表す。 示された量（水平軸、μｇ）の野生型Ｎｅｆ発現ベクター（黒丸、普通の線）またはＥ９３ＲＮｅｆ突然変異体発現ベクター（白丸、点線）でトランスフォーメーションされたＨｅＬａ細胞によるＣＤ４発現のダウンレギュレーション（鉛直軸、任意の単位）を表す。 示された量（水平軸、μｇ）の野生型Ｎｅｆ発現ベクター（黒丸、普通の線）またはＥ９３ＲＮｅｆ突然変異体発現ベクター（白丸、点線）でトランスフォーメーションされた２９３Ｔ細胞によるＭＨＣ−Ｉ発現のダウンレギュレーション（鉛直軸、任意の単位、左がＮｅｆ、右がＥ９３ＲＮｅｆ突然変異体）を表す。 独立したＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶ単離物からのＮｅｆアミノ酸配列のClustal W softwareにより発生させた配列アラインメントを示す。免疫抑制ドメインを含むＮｅｆタンパク質の配列の部分はボックスで囲まれている。配列番号１（ＮＥＦ＿ＨＩＶＢ１）のＥ９３に対応するまたは相同性のアミノ酸は太字で示される。星印は、アミノ酸が保存されている位置を表し、単一点はアミノ酸が実質的に保存されている位置を表しそして二重点はアミノ酸が類似した物理化学的性質を有する位置を表す。 ＨＩＶ−１株ＬＡＩＮｅｆおよびそのフラグメントの３つ（１〜８９、８０〜１２０および１１３〜２０６）の免疫抑制指数を表す。ＨＩＶ−１株ＬＡＩの部分配列は、いくつかのアミノ酸の位置およびフラグメントの位置で図の頂部に示されている。野生型Ｎｅｆおよび各フラグメントの免疫抑制活性の存在（＋）または不存在（−）は右に示される（免疫抑制指数）。 図６ＡはＨＩＶ−１株Ａ１Ｎｅｆ（左欄）およびＨＩＶ−２株ＳＴＮｅｆ（右欄）の免疫抑制指数（鉛直軸）を表す。 図６Ｂは、ＳＩＶ株ｍａｃ２３９Ｎｅｆ（左欄）および対応するＥ１２５Ｒ突然変異体（右欄）の免疫抑制指数（鉛直軸）を表す。

Claims (8)

1. 薬学的に許容される担体と共に、
   ● 突然変異したＮｅｆタンパク質であって、該突然変異したＮｅｆタンパク質が実質的に免疫抑制活性を持たず、該突然変異したＮｅｆタンパク質のＣＤ４および／またはＭＨＣ−１ダウンレギュレーション機能は保存されている、突然変異したＮｅｆタンパク質、または
   ● 該突然変異したＮｅｆタンパク質のフラグメントであって、該フラグメントが実質的に免疫抑制活性を持たない、該突然変異したＮｅｆタンパク質のフラグメントを活性物質として含む医薬組成物またはワクチン組成物であって、ここで
   −該突然変異したＮｅｆタンパク質は野生型Ｎｅｆタンパク質で構成され、ここで該野生型Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインがＲ、ＨまたはＫによる、
   配列番号１、配列番号２７５、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９の一つの位置９３のアミノ酸、または
   配列番号２７６の位置９４のアミノ酸、または
   配列番号２８１の位置９６のアミノ酸、または
   配列番号２８０の位置１０３のアミノ酸、または
   配列番号２８７の位置１２４のアミノ酸、または
   配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２８９および配列番号２９０の一つの位置１２５のアミノ酸の置換により突然変異しており、そして
   −該フラグメントはＲ、ＨまたはＫによる、
   配列番号１、配列番号２７５、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９の一つの位置９３のアミノ酸、または
   配列番号２７６の位置９４のアミノ酸、または
   配列番号２８１の位置９６のアミノ酸、または
   配列番号２８０の位置１０３のアミノ酸、または
   配列番号２８７の位置１２４のアミノ酸、または
   配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２８９および配列番号２９０の一つの位置１２５のアミノ酸の置換により突然変異している該野生型Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインを含み、
   野生型Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインの配列は
   配列番号１、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０および配列番号２８１からなる群より選択される野生型ＨＩＶ−１Ｎｅｆタンパク質の配列の位置８０のアミノ酸から位置１２０のアミノ酸にわたる配列において、または
   配列番号２８６、配列番号２８５、配列番号２８７、配列番号２８８、配列番号２８９および配列番号２９０からなる群より選択される野生型ＨＩＶ−２Ｎｅｆタンパク質の配列の位置１０４のアミノ酸から位置１５０のアミノ酸にわたる配列において含まれる、
   医薬組成物またはワクチン組成物。
2. 野生型Ｎｅｆタンパク質の免疫抑制ドメインが、Ｒによる、
   配列番号１、配列番号２７５、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９の一つの位置９３のアミノ酸、または
   配列番号２７６の位置９４のアミノ酸、または
   配列番号２８１の位置９６のアミノ酸、または
   配列番号２８０の位置１０３のアミノ酸、または
   配列番号２８７の位置１２４のアミノ酸、または
   配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２８９および配列番号２９０の一つの位置１２５のアミノ酸の置換により突然変異している、請求項１記載の医薬組成物またはワクチン組成物。
3. 配列番号２からなる突然変異したＮｅｆタンパク質を活性物質として含む、請求項１または２に記載の医薬組成物またはワクチン組成物。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質またはフラグメントをコードする核酸を活性物質として含む、医薬組成物またはワクチン組成物。
5. ウイルス疾患の予防および／または処置を意図した医薬またはワクチンの製造のための、請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質もしくはフラグメントまたは請求項４に記載の核酸の使用。
6. ウイルス疾患が、ＨＩＶ感染である、請求項５記載の使用。
7. 配列番号２または配列番号３１により表されるタンパク質。
8. 配列番号２または配列番号３１により表されるタンパク質をコードする核酸。

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