JP4920173B2 - 較正マイクロアレイ - Google Patents
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Description
本発明は、診断的分析法、とりわけ定量的な免疫学的測定法(イムノアッセイ)で用いられるマイクロアレイの機能を改善する方法に関する。
免疫学的測定法とは、リガンド結合分析法であって、アナライトの特定の結合領域に対する抗体の特異的な認識を利用している。免疫学的測定法は、通常、リガンド(抗体、他のたんぱく質、ハプテンなど)を固相(支持材)に固定化させることを含み、これは、特定すべきアナライトにより認識される。特異的に標識された検出剤を用いることにより、水性サンプル中のアナライトを検出し、定量化することができる。サンプル中に存在するアナライト量は、結合した標識検出剤の関数であって、競合アッセイに反比例し、非競合アッセイに正比例する。
本発明は、検量システムの正確性を改善するために、内部検量線をマイクロアレイの一部として用いることができるという認識に基づいている。内部検量線により、1つのマイクロアレイ内でアレイを検量すると同時に、サンプル中の標的アナライトの未知の濃度を特定することができる。
(i)第1のアナライトに対する親和性を有する第1のリガンドを含む1つまたはそれ以上の反応領域と、異なる既知濃度を有する固定化された第2のアナライトを含む一連の第2の反応領域と、を備えたデバイスにサンプルを接触させるステップと、
(ii)結合しないすべての第1のアナライトを取り除くステップと、
(iii)検出可能に標識され、第1のアナライトに対する親和性を有する第2のリガンドを含むデバイスと、第2のアナライトに対する親和性を有する第3のリガンドとを接触させるステップと、
(iv)結合しない第2および第3のアナライトを取り除くステップと、
(v)支持材に結合した第2および第3のリガンドを測定するステップと、を有し、
第3のリガンドの測定結果を用いて、検量線を決定し、サンプル中に存在する第1のアナライトの量を特定する。第1および第2のアナライトは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
図面を参照しながら本発明を説明する。
本発明は、従来式のマイクロアレイデバイスを利用する。これらは、通常、シリコン、プラスチック、セラミック、またはガラスなどの適当な支持材料を有し、その上に個別の反応領域が設けられ、各領域は固定化アナライト(検体、被分析物)を含む。適当なデバイスが英国特許公開公報第2324866号に開示されており、その内容が参考としてここに一体に統合される。
<1つのバイオチップ(マイクロアレイ)におけるヒトIgMの上昇濃度の検出>
この実験において、精製ヒトIgMの上昇濃度を含む個別テスト領域(Discrete Test Region DTR)毎に20nl容量が、pH9.5で0.5MのNaClを含む50mMのカーボネイト緩衝液中のバイオチップに直接的に適用された。適用された濃度範囲は、DTR毎に、0、0.07、0.15、0.30、0.60、1.25、2.5、5、10、20、40ngが適用された。その後、検定剤、抗ヒトIgMペルオキシダーゼ標識抗体が添加された。トリス緩衝剤、トゥィーン20(Tween 20)洗浄剤を含む生理食塩水、および化学ルミネセンス現像液を用いて洗浄するステップの後、ヒトIgMの検量線がバイオチップ上で検出される。図1は、実施例1を示す。グラフ表示(a,b)および視覚的描写(a’,b’)は、バイオチップ上の精製ヒトIgMの(標準)検量線を示す。a,a’で指定されたものは、GOPS活性化表面を示し、b,b’で指定されたものは、ICPTES活性化表面を示す(英国特許公開出願第2324866号)。相対発光量を縦軸に、DTR毎のng単位の精製ヒトIgM量を横軸にプロットして、このグラフを得た。
<1つのバイオチップにおけるヒトIgMの上昇濃度の検出>
この実験においては、精製ヒトIgMの増大濃度を含む、DTR毎に10nlの容量が、pH9.5で0.5MのNaClを含む50mMのカーボネイト緩衝液中のバイオチップに直接的に適用された。適用された濃度範囲は、DTR毎に、0、0.042、0.085、0.17、0.34、0.68、1.36、5.46、10.92、21.85ngが適用された。TBSTおよび化学ルミネセンス現像液による洗浄ステップの後、検定剤、抗ヒトIgGペルオキシダーゼ標識抗体を添加して、バイオチップ上のヒトIgGの検量線を得た。
グラフ表示(a)および視覚的描写(a’)は、1つのバイオチップ上のGOPS活性化表面における精製ヒトIgGに対する(標準)検量線を示す。
<1つのバイオチップにおけるヒトFSHの上昇濃度の検出>
この実験においては、ヒトFSHの増大濃度を含む、DTR毎に20nlの容量が、pH9.5で0.5MのNaClを含む50mMのカーボネイト緩衝液中のバイオチップに直接的に適用された。濃度は、0、0.32、0.64、1.28、2.6mIU/DTRであった。TBSTおよび化学ルミネセンス現像液による洗浄ステップの後、検定剤および抗ヒトFSHペルオキシダーゼ標識抗体を添加すると、ヒトFSHの4つの上昇濃度がバイオチップ上で同時に検出された。図3は、実施例3の結果を示す。
<バイオチップ上の1列のサンプルに含まれる高精製ヒトIgE検量用試料、総IgE、および特異的IgEの同時検出>
この実験においては、10nlの反応領域の2列がDTRを構成する。第1列は、3つのDTRからなり、特に対象となるアナライト、すなわちピーナッツおよび草木花粉混合物に対する総IgE、および特異的IgEと結合するリガンドを含む。第2列の反応領域は、骨髄腫ヒトIgE検量用試料から精製され、DTR毎に、0、50、200、700、1000、2000IgEkU/Lの増大濃度を有する6つのDTRにより構成される。このリガンドおよびIgE検量用試料は、pH9.5で50mMのカーボネイト緩衝液中のバイオチップに適用された。
サンプル1:草木花粉およびピーナッツ陽性サンプル:
総IgE:968kU/L
草木花粉IgE:88kUA/L
ピーナッツIgE:62kUA/L
サンプル2:ピーナッツ陽性サンプル:
総IgE:717.5kU/L
草木花粉IgE:0kUA/L
ピーナッツIgE:99.5kUA/L
サンプル3:草木花粉陽性サンプル:
総IgE:883kU/L
草木花粉IgE:128kUA/L
ピーナッツIgE:0kUA/L
サンプル4:樹木花粉陽性サンプル:
総IgE:415kU/L
草木花粉IgE:0kUA/L
ピーナッツIgE:0kUA/L
図4は、実施例4の結果を示す。
Claims (10)
- 支持材であって、
離散的な複数の第1の反応領域アレイであって、それぞれが固定化された第1のアナライトまたは第1のアナライトに対する親和性を有するリガンドを含む第1の反応領域アレイと、
支持材に固定化された既知の異なる濃度の第2のアナライトを含む3ないし20個の第2の反応領域と、を備え、
第2の反応領域は、検量線を決定するために用いられ、
前記反応領域は、同一の支持材上に配置され、同一の流体サンプルと接触しないようにする壁または障壁により分離されないことを特徴とする支持材。 - 請求項1に記載の支持材であって、
第1および第2のアナライトは、抗原または抗体であることを特徴とする支持材。 - 請求項1または2に記載の支持材であって、
第2のアナライトは、共有結合により支持材に固定化されたことを特徴とする支持材。 - 請求項1ないし3のいずれか1に記載の支持材であって、
第2のアナライトは、たんぱく質または抗体に結合可能なペプチドであることを特徴とする支持材。 - 請求項1ないし4のいずれか1に記載の支持材であって、
支持材は、約1cm2であることを特徴とする支持材。 - 請求項1ないし5のいずれか1に記載の支持材であって、
第2のアナライトの濃度は、2×10−4ngから40ng/DTRであることを特徴とする支持材。 - 請求項1ないし6のいずれか1に記載の支持材であって、
5ないし15個の第2の反応領域があることを特徴とする支持材。 - 請求項1ないし7のいずれか1に記載の支持材であって、
7ないし10個の第2の反応領域があることを特徴とする支持材。 - サンプル中の第1のアナライトの量を測定する分析方法であって、
(i)第1のアナライトに対する親和性を有する第1のリガンドを含む1つまたはそれ以上の第1の反応領域と、既知の異なる濃度を有する固定化された第2のアナライトを含む3ないし20個の一連の第2の反応領域と、を備えたデバイスにサンプルを接触させるステップと、前記反応領域は、同一の支持材上に配置され、同一の流体サンプルと接触しないようにする壁または障壁により分離されず、
(ii)結合しないすべての第1のアナライトを取り除くステップと、
(iii)ステップ1の前記デバイスに、検出可能に標識され、第1のアナライトに対する親和性を有する第2のリガンド、および検出可能に標識され、第2のアナライトに対する親和性を有する第3のリガンドを接触させるステップと、
(iv)結合しない第2および第3のリガンドを取り除くステップと、
(v)支持材に結合した第2および第3のリガンドを測定するステップと、を有し、
第3のリガンドの測定結果を用いて、検量線を決定し、サンプル中に存在する第1のアナライトの量を特定することを特徴とする方法。 - 請求項9に記載の方法であって、
このデバイスは、請求項1ないし8のいずれか1に記載の支持材であることを特徴とする方法。
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