JP4915986B2 - Cyclic peptides having metal ion binding ability and nanotube-forming ability, nanotubes composed of peptides using the same, and methods for producing them. - Google Patents

Description

本発明は、金属イオンと結合する単位分子の環状ペプチドと、それらの環状ペプチドが連結することで形成されるナノスケールの中空繊維（本明細書中では、ナノチューブと称する）のナノ素材の技術に関するものである。   The present invention relates to a technology of a nanomaterial of a cyclic peptide of a unit molecule that binds to a metal ion and a nanoscale hollow fiber (referred to herein as a nanotube) formed by linking these cyclic peptides. Is.

これまで大きな物質を削ってナノメートルスケールにまで微細化していく「トップダウン」型アプローチを用いて、半導体素子や大規模集積回路（LSI）を作製する技術開発が盛んに行われてきた。しかしながらその技術にも限界があり、20nm以下の微細構造を作ることが困難となっている。
そこで近年、分子の自己組織化を利用し、規則的な微細構造を作り上げる研究が急速に進展している。このような自己組織化を利用した「ボトムアップ」型アプローチを模倣する代表的な例として生物の細胞があり、これをモデルシステムとした生体分子による新規材料開発の研究が大変注目を集めている。 Up to now, there has been a great deal of technological development to fabricate semiconductor devices and large-scale integrated circuits (LSIs) using a “top-down” approach in which large materials are cut down to the nanometer scale. However, there is a limit to the technology, and it is difficult to make a fine structure of 20 nm or less.
Therefore, in recent years, research for creating a regular microstructure using molecular self-organization has been progressing rapidly. Biological cells are a typical example of imitating such a “bottom-up” approach using self-organization, and research on the development of new materials using biomolecules using this as a model system is attracting a great deal of attention. .

生体を作るタンパク質や核酸などの生体分子で材料を作る利点としては、外部からエネルギーを加えることなく自己組織化的に材料が構築されることから無駄のない製造システムであること、そして物質自体が生分解性であることなどが挙げられ、地球環境や生物に対して負荷が少ないといえる。
特にタンパク質は、構成する天然アミノ酸（Ｌ−体アミノ酸）の種類が２０種類存在するため、形成される構造や機能は多種多様である。
さらに化学合成法を利用した場合は、タンパク質配列中に非天然アミノ酸やＬ−体アミノ酸の鏡像異性体であるＤ−体アミノ酸を導入することも可能となり、タンパク質を利用したナノテクノロジーは、今後様々な分野において重要になってくると考えられる。 The advantages of creating materials with biomolecules such as proteins and nucleic acids that make up living organisms are that the materials are constructed in a self-organized manner without applying energy from the outside, and that the materials themselves are Because it is biodegradable, it can be said that the burden on the global environment and organisms is small.
In particular, since there are 20 types of natural amino acids (L-form amino acids) constituting proteins, the structures and functions formed are diverse.
Furthermore, when chemical synthesis methods are used, it is possible to introduce unnatural amino acids and D-amino acids that are enantiomers of L-amino acids into protein sequences, and nanotechnology using proteins will be various in the future. It will be important in various fields.

生体高分子であるタンパク質は、２０種類の天然アミノ酸（Ｌ−体アミノ酸、比較的単純な有機分子）から構成され、アミノ酸の中には金属イオンと配位結合するものが存在する。
金属イオンと配位することが可能なアミノ酸としては、ヒスチジン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸などがそうであり、実際にある種のタンパク質はこれらのアミノ酸を利用し、種々の金属イオンと配位結合することで細胞内において機能を果たしている。
近年、有機材料と無機材料を組み合わせた機能性複合新素材の開発や応用の研究が盛んに行われているが、タンパク質と無機材料とのハイブリッド材料の構築には金属イオンと配位するアミノ酸を用いることが重要であり、タンパク質の構造や機能の多様性を考慮すると、これまでにない新しいハイブリッド材料の創出が期待される。 Proteins that are biopolymers are composed of 20 kinds of natural amino acids (L-form amino acids, relatively simple organic molecules), and some amino acids coordinate with metal ions.
Examples of amino acids that can coordinate with metal ions include histidine, cysteine, aspartic acid, and glutamic acid. In fact, certain proteins use these amino acids to coordinate with various metal ions. By doing so, it functions in the cell.
In recent years, research and development of new functional composite materials combining organic and inorganic materials have been actively conducted, but for the construction of hybrid materials of proteins and inorganic materials, amino acids coordinated with metal ions are used. It is important to use them, and considering the diversity of protein structures and functions, it is expected to create new hybrid materials that have never existed before.

またタンパク質の立体構造は、主に比較的規則的な二次構造から構成されており、その主なものはαヘリックス構造、及びβシート構造である。
αヘリックス構造は、配列中の連続した領域でアミノ酸残基ｎのＣＯとアミノ酸残基ｎ＋４のＮＨがそれぞれ水素結合（αヘリックス型水素結合）することで形成される。
またβシート構造は、隣り合うβストランドと呼ばれるほとんど伸びきった領域間で、αヘリックスと同様に向かい合ったアミノ酸残基のＣＯ（ＮＨ）とＮＨ（ＣＯ）が水素結合（平行、または逆平行βシート型水素結合）形成することにより、二次構造となり安定化している。
このような二次構造を基本ブロックとして、タンパク質分子同士が相互作用することが知られている。例えば、筋肉を構成するミオシン、狂牛病などの原因と思われるアミロイド線維など、ナノメートルスケールの規則的な繊維状超分子構造を形成することが知られている。 The three-dimensional structure of the protein is mainly composed of a relatively regular secondary structure, the main of which is an α helix structure and a β sheet structure.
The α-helix structure is formed by hydrogen bonding (α-helix type hydrogen bonding) of CO of amino acid residue n and NH of amino acid residue n + 4 in a continuous region in the sequence.
In addition, the β sheet structure has a hydrogen bond (parallel or antiparallel β) between the amino acid residues CO (NH) and NH (CO) facing each other in the same way as the α helix between the almost extended regions called adjacent β strands. By forming (sheet-type hydrogen bonds), the secondary structure is stabilized.
It is known that protein molecules interact with each other using such a secondary structure as a basic block. For example, it is known to form a regular fibrous supramolecular structure on the nanometer scale, such as myosin that constitutes muscles, amyloid fibrils that are thought to cause mad cow disease, and the like.

これまでアミロイド線維を形成するタンパク質に、システイン残基を利用して金コロイドを化学修飾し、さらに金または銀でメッキすることで、導電性ナノワイヤーを作製する手法が知られている（例えば、非特許文献１。）。
また、連続したヒスチジン残基を有するペプチド様高分子から形成されるナノチューブに金属イオンを配位させ、還元剤で還元することでナノワイヤーを作製する手法が知られている（例えば、非特許文献２。）。
これらの手法は、どちらの手法も繊維状構造体の表面を金属で被覆するためにワイヤーの直径が数百ナノメートルと太くなり、従来の微細加工技術よりも優れた新技術とはいい難い。 To date, proteins that form amyloid fibrils are chemically modified using colloidal gold using cysteine residues, and then plated with gold or silver to produce conductive nanowires (for example, Non-patent document 1.).
In addition, a technique for producing nanowires by coordinating metal ions to nanotubes formed from peptide-like polymers having continuous histidine residues and reducing them with a reducing agent is known (for example, non-patent literature). 2.).
Neither of these methods is a new technology superior to the conventional microfabrication technology because both methods increase the diameter of the wire to several hundred nanometers in order to coat the surface of the fibrous structure with metal.

またＤＮＡを構成するヌクレオチドの塩基部分を有機化学合成で金属イオンと配位可能な塩基に改良し、ニ本鎖ＤＮＡ内部に最大５個の銅イオンを配列させた例が報告されている（例えば、非特許文献３。）。しかしながら、５個以上の金属イオンを一次元的に配列させることはできていない。   In addition, examples have been reported in which the base portion of nucleotides constituting DNA is improved to a base capable of coordinating with metal ions by organic chemical synthesis, and a maximum of five copper ions are arranged inside double-stranded DNA (for example, Non-Patent Document 3.). However, five or more metal ions cannot be arranged one-dimensionally.

昨今の半導体プロセス技術の動向をみると、半導体内機能素子間の配線において、その配線の幅はますます小さなものが要求されている。また金属錯体の性質をハイブリッドした新しい機能性物質の開発も盛んに行われているが、生体分子と無機材料を融合したハイブリッド材料の構築は、工業的または産業的利用が期待されるにもかかわらず、いまだ確立されていないのが現状である。   Looking at the recent trend of semiconductor process technology, the wiring width between the functional elements in the semiconductor is required to be smaller and smaller. Development of new functional substances that hybridize the properties of metal complexes is also actively underway, but the construction of hybrid materials that fuse biomolecules and inorganic materials is expected to be industrial or industrial use. However, the current situation has not yet been established.

Scheibel, T. et. al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 4527-4532.Scheibel, T. et. Al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 4527-4532. Banerjee, I. A. et. al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 14678-14682.Banerjee, I. A. et. Al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 14678-14682. Tanaka, K. et. al. (2003) Science 299, 1212-1213.Tanaka, K. et.al. (2003) Science 299, 1212-1213.

本発明が解決しようとする課題は、規則的な微細構造で中空構造を有するナノメートルスケールのナノチューブを提供することである。また、当該ナノチューブに様々な特性・機能を持たせるために金属イオンをナノチューブ内部に配列化することである。   The problem to be solved by the present invention is to provide a nanometer-scale nanotube having a regular microstructure and a hollow structure. Further, in order to give the nanotubes various properties and functions, metal ions are arranged inside the nanotubes.

そのために、ペプチドで構成されるナノチューブの内部に金属イオンを配列することが可能で、かつ、幅数ナノメートルから十数ナノメートル、さらには長さ数マイクロメートル規模のナノチューブを自己組織化的に形成させるための新規な環状ペプチドの配列を同定すること、また、当該配列を成す環状ペプチドのナノチューブ形成条件を確立すること、及び環状ペプチドの環内部に金属イオンを配位させることが可能なナノチューブの形成条件を確立させることが本発明の目的とするところである。   For this purpose, it is possible to arrange metal ions inside nanotubes composed of peptides, and self-organize nanotubes with a width of several nanometers to several tens of nanometers and even a few micrometers in length. Nanotube capable of identifying a sequence of a novel cyclic peptide to be formed, establishing conditions for forming a nanotube of the cyclic peptide constituting the sequence, and coordinating a metal ion inside the ring of the cyclic peptide It is an object of the present invention to establish the formation conditions.

本発明者らは、ペプチドに関して鋭意研究を行い、実験を繰り返し行った結果、１２残基のアミノ酸で構成された環状ペプチドを常温常圧下で中性付近（ｐＨ６〜ｐＨ８）の水溶媒もしくは水／アルコール混合溶媒中で自己組織化させることにより、幅数ナノメートルから十数ナノメートル、長さ数マイクロメートルに至るナノチューブが形成されること、また環状ペプチドの環内部に向いている２つのアミノ酸側鎖に金属イオンが配位結合されること、かつ自己組織化的にナノチューブが形成されることの知見を得て、本発明を完成した。   As a result of intensive studies on peptides and repeated experiments, the present inventors have found that cyclic peptides composed of 12-residue amino acids can be converted to neutral (pH 6 to pH 8) aqueous solvents or water / By self-assembly in an alcohol mixed solvent, nanotubes with a width of several nanometers to a few dozen nanometers and a length of several micrometers are formed, and two amino acid sides facing the inside of the cyclic peptide ring The present invention was completed by obtaining the knowledge that metal ions are coordinated to the chain and that nanotubes are formed in a self-organized manner.

前述の課題を達成するために、本発明の第１の観点に係る環状ペプチドは、１２残基のアミノ酸から構成され、１残基目のN末端と１２残基目のC末端がペプチド結合した環状ペプチドにおいて、３残基のアミノ酸が連続してL−体もしくはD−体である連続領域が２つ存在し、かつ、前記連続領域が隣接すること無く配された配列で、それ以外のアミノ酸はL−体とD−体が交互に配された配列からなり、３残基のアミノ酸が連続した前記連続領域では真ん中のアミノ酸残基の側鎖のみ環状ペプチドの環内部を向き、L−体とD−体が交互に配されたアミノ酸残基の側鎖は全て環状ペプチドの環外部を向く構造を形成し、側鎖が環状ペプチドの環内部を向く２つのアミノ酸残基が、His, Cys, Aspの中から選択された何れかであり、自己組織化によりナノスケールオーダの径を有する管状構造を形成可能である、ことを特徴とする。 In order to achieve the above-mentioned object, the cyclic peptide according to the first aspect of the present invention is composed of 12 amino acids, and the N-terminal of the first residue and the C-terminal of the 12th residue are peptide-bonded. In the cyclic peptide, there are two consecutive regions in which the amino acid of 3 residues is continuously L-form or D-form, and the sequence is arranged without adjoining the other amino acids. Consists of a sequence in which L-forms and D-forms are arranged alternately, and in the continuous region where 3 amino acid residues are continuous, only the side chain of the middle amino acid residue faces the inside of the ring of the cyclic peptide, and the L-form The side chains of amino acid residues with alternating D-forms all form a structure facing the outside of the cyclic peptide ring, and the two amino acid residues whose side chains face the inside of the cyclic peptide ring are His, Cys , One selected from Asp. A tubular structure having a kale order diameter can be formed .

ここで、上記の本発明の第１の観点に係る１２残基の環状ペプチドの配列において、１つ目の３残基のアミノ酸が連続した前記連続領域の最初のアミノ酸を１番目として、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12 と示される配列からなり、（X3、X4、X5、X6）と（X9、X10、X11、X12）の組合せで、それぞれ側鎖に同じ電荷を有するアミノ酸（Asp、Glu、Lys、Arg）の中から選択されたもの）が配され、かつ、互いの組合せが逆の電荷になるように配されていることが好ましい。 Here, in the sequence of the 12-residue cyclic peptide according to the first aspect of the present invention, the first amino acid in the continuous region in which the first three-residue amino acids are consecutive is defined as X1- X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12 and the combination of (X3, X4, X5, X6) and (X9, X10, X11, X12) , Amino acids (selected from among Asp, Glu, Lys, and Arg) having the same charge in each side chain are arranged, and the combinations are arranged so that the respective combinations have opposite charges. preferable.

上記の１２残基の環状ペプチドのアミノ酸配列は、具体的には、Gln(L体)-His(L体)-Glu(L体)-Glu(D体)-Glu(L体)-Glu(D体)-Gln(L体)-Asp(L体)-Lys(L体)-Lys(D体)-Lys(L体)-Lys(D体)（配列番号１）で示される。   Specifically, the amino acid sequence of the above-mentioned 12-residue cyclic peptide is Gln (L-form) -His (L-form) -Glu (L-form) -Glu (D-form) -Glu (L-form) -Glu ( D form) -Gln (L form) -Asp (L form) -Lys (L form) -Lys (D form) -Lys (L form) -Lys (D form) (SEQ ID NO: 1).

上記の１２残基の環状ペプチドのアミノ酸配列は、具体的には、Lys(L体)-Asp(L体)-Gln(L体)-Glu(D体)-Glu(L体)-Glu(D体)-Glu(L体)-His(L体)-Gln(L体)-Lys(D体)-Lys(L体)-Lys(D体)（配列番号２）で示される。   Specifically, the amino acid sequence of the above-mentioned 12-residue cyclic peptide is Lys (L form) -Asp (L form) -Gln (L form) -Glu (D form) -Glu (L form) -Glu ( D form) -Glu (L form) -His (L form) -Gln (L form) -Lys (D form) -Lys (L form) -Lys (D form) (SEQ ID NO: 2).

また、本発明の第２の観点の環状ペプチドは、前述の第１の観点の環状ペプチドにおいて、金属イオンが環内部に向いているアミノ酸側鎖と配位結合されていることを特徴とする。   The cyclic peptide according to the second aspect of the present invention is characterized in that in the cyclic peptide according to the first aspect described above, a metal ion is coordinated with an amino acid side chain facing the inside of the ring.

ここで、金属イオンが環内部に向いているHis及びAspの２つのアミノ酸側鎖と配位結合されていることが好ましい。また、この金属イオンは、２価の銅イオンであることが更に好ましい。   Here, it is preferable that the metal ion is coordinate-bonded to two amino acid side chains of His and Asp that face the inside of the ring. The metal ion is more preferably a divalent copper ion.

また、本発明の第３の観点からは、前述の第１の観点の環状ペプチドを用いて自己組織化によりナノスケールオーダの径を有する管状構造を形成させたことを特徴とするナノチューブが提供される。   From the third aspect of the present invention, there is provided a nanotube characterized in that a tubular structure having a diameter of nanoscale order is formed by self-assembly using the cyclic peptide of the first aspect described above. The

上述した如く、本発明に係る環状ペプチドは、１２残基のアミノ酸から構成され、１残基目のN末端と１２残基目のC末端がペプチド結合を形成し、直鎖状の構造ではなく、環状のペプチド構造となっていることが特徴である。また３残基が連続してL体またはD体アミノ酸である領域が２つ連続せずに存在し、それ以外のアミノ酸はL体及びD体アミノ酸が交互に配された配列からなることを特徴とする（図１（ｂ）を参照）。
このようにアミノ酸の光学異性体を上手く配置することで、同種の光学異性体が３残基連続した領域では真ん中のアミノ酸残基側鎖のみ環状ペプチドの環内部を向くことになり、また交互に光学異性体が配置している領域はアミノ酸残基側鎖が全て環外部を向くという特徴的な環状構造を形成する。
As stated above, the cyclic peptides according to the present invention is composed of a 12 residue amino acid, 1 N-terminal and 12 C-terminal residues th residue eyes form a peptide bond, rather than the structure of the linear It is characterized by a cyclic peptide structure. In addition, there are two consecutive regions in which 3 residues are L-form or D-form amino acids, and the other amino acids consist of a sequence in which L-form and D-form amino acids are alternately arranged. (See FIG. 1 (b) ).
Thus, by arranging the amino acid optical isomers well, in the region where the same type of optical isomers are three consecutive residues, only the middle amino acid residue side chain faces the inside of the ring of the cyclic peptide. The region in which the optical isomer is arranged forms a characteristic cyclic structure in which all side chains of amino acid residues face the outside of the ring.

金属イオンを環状ペプチドの環内部に配位させるための、かつ環状ペプチドが自己組織化的にナノチューブを形成するような配列は、図２（a）に示すように、１つ目のL体またはD体アミノ酸が３残基連続した領域の最初のアミノ酸を１番目としてX1-His（またはCys）-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11と示される配列のうち、X2、X3、X4、X5とX8、X9、X10、X11の組み合わせで側鎖に同じ電荷をもつアミノ酸（Asp、Glu、Lys、Arg）で、かつ互いが逆の電荷になるように配置する。さらに溶解度を高めるためとペプチド濃度を吸光度により測定するためにX1とX6にGlnまたはAsnまたはTyrを配し、X7には金属イオンを配位するために、His, Cys, Arg, Lys, Glu, Gln, Asp, Asnの中から選択されたアミノ酸を配置させる。なお、好ましくは、X7には、AspまたはGluまたはHisを配置させるのがよい。   An arrangement for coordinating a metal ion inside the ring of the cyclic peptide and in which the cyclic peptide forms a nanotube in a self-assembled manner is shown in FIG. 2 (a). X1-His (or Cys) -X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11 Among them, X2, X3, X4, X5 and X8, X9, X10, X11 are amino acids having the same charge on the side chain (Asp, Glu, Lys, Arg) and arranged so that they are opposite to each other To do. In order to further increase the solubility and to measure the peptide concentration by absorbance, Gln or Asn or Tyr is arranged in X1 and X6, and in order to coordinate a metal ion to X7, His, Cys, Arg, Lys, Glu, An amino acid selected from Gln, Asp, Asn is arranged. Preferably, Asp, Glu, or His is arranged in X7.

また同様に図２（b）に示すように、１つ目のL体またはD体アミノ酸が３残基連続した領域の最初のアミノ酸を１番目としてY1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-His（またはCys）-Y8-Y9-Y10-Y11と示される配列のうち、Y1、Y9、Y10、Y11とY4、Y5、Y6、Y7の組み合わせで側鎖に同じ電荷をもつアミノ酸（Asp、Glu、Lys、Arg）で、かつ互いが逆の電荷になるように配置する。さらに溶解度を高めるためとペプチド濃度を吸光度により測定するためにY3とY8にGlnまたはAsnまたはTyrを配し、Y2には金属イオンを配位するために、His, Cys, Arg, Lys, Glu, Gln, Asp, Asnの中から選択されたアミノ酸を配置させる。なお、好ましくは、Y2には、AspまたはGluまたはHisを配置させるのがよい。   Similarly, as shown in FIG. 2 (b), the first amino acid in the region where the first L-form or D-form amino acid sequence is 3 residues is taken as the first, Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6- Of the sequences shown as Y7-His (or Cys) -Y8-Y9-Y10-Y11, Y1, Y9, Y10, Y11 and Y4, Y5, Y6, Y7 amino acids with the same charge on the side chain (Asp , Glu, Lys, Arg) and arranged so that they have opposite charges. In order to further increase solubility and to measure peptide concentration by absorbance, Y3 and Y8 are arranged with Gln or Asn or Tyr, and Y2 is coordinated with a metal ion, His, Cys, Arg, Lys, Glu, An amino acid selected from Gln, Asp, Asn is arranged. Preferably, Y2 is arranged with Asp, Glu, or His.

具体的には、図３（ａ）（ｂ）に示すように、１つ目のL−体アミノ酸が３残基連続した領域の最初のアミノ酸を１番目として、以下の１），２）の配列番号の配列の環状ペプチドである。
１）配列番号１（以下、略称名：cyclic p-Aを用いる。）
Gln(L体)-His(L体)-Glu(L体)-Glu(D体)-Glu(L体)-Glu(D体)-Gln(L体)-Asp(L体)-Lys(L体)-Lys(D体)-Lys(L体)-Lys(D体)
２）配列番号２（以下、略称名：cyclic p-Bを用いる。）
Lys(L体)-Asp(L体)-Gln(L体)-Glu(D体)-Glu(L体)-Glu(D体)-Glu(L体)-His(L体)-Gln(L体)-Lys(D体)-Lys(L体)-Lys(D体) Specifically, as shown in FIGS. 3 (a) and 3 (b), the first amino acid in the region in which the first L-amino acid has three consecutive residues is the first, and the following 1) and 2) It is a cyclic peptide of the sequence of SEQ ID NO.
1) SEQ ID NO: 1 (hereinafter abbreviated name: cyclic pA is used)
Gln (L) -His (L) -Glu (L) -Glu (D) -Glu (L) -Glu (D) -Gln (L) -Asp (L) -Lys ( L form) -Lys (D form) -Lys (L form) -Lys (D form)
2) SEQ ID NO: 2 (hereinafter abbreviated name: cyclic pB is used)
Lys (L form) -Asp (L form) -Gln (L form) -Glu (D form) -Glu (L form) -Glu (D form) -Glu (L form) -His (L form) -Gln ( L form) -Lys (D form) -Lys (L form) -Lys (D form)

この環状ペプチドでは、L体アミノ酸が３残基連続する領域が２領域存在し、配列番号１ではAsp(L体)とHis(L体)が、配列番号２ではHis(L体)とAsp(L体)がそれぞれ環状ペプチドの環内部に側鎖が向いており、それ以外のアミノ酸側鎖は環外部に向いた構造をとっている。
それぞれの環状ペプチドの配列において、環内部に向いているアミノ酸残基はHis(L体)とAsp(L体)であるが、これらはL体やD体の光学異性体に限らず金属イオンと配位結合をすることが知られており、特にHis残基が強く特異的に金属イオンと配位結合することから、His残基側鎖を環内部に向けさせることが重要である。
このように設計された環状ペプチドは１個の金属イオン（特異的に２価の銅イオン）を配位結合で環内部にトラップすることが可能となる。実際に本発明に係る環状ペプチド配列は環内部に金属イオンを配位し、トラップしていることが確認されており、人工設計による環状ペプチドでは世界初である。 In this cyclic peptide, there are two regions in which three L-form amino acids are continuous, Asp (L-form) and His (L-form) in SEQ ID NO: 1, and His (L-form) and Asp (in SEQ ID NO: 2). Each of the L-forms has a structure in which the side chain faces the inside of the ring of the cyclic peptide, and the other amino acid side chains face the outside of the ring.
In each cyclic peptide sequence, the amino acid residues facing the inside of the ring are His (L-form) and Asp (L-form), but these are not limited to the optical isomers of L-form and D-form, and metal ions. It is known to form a coordination bond. Particularly, since the His residue is strongly and specifically coordinated to a metal ion, it is important to direct the His residue side chain to the inside of the ring.
The cyclic peptide designed in this way makes it possible to trap one metal ion (specifically a divalent copper ion) inside the ring by coordination bond. In fact, it has been confirmed that the cyclic peptide sequence according to the present invention coordinates and traps a metal ion inside the ring, and this is the world's first artificially designed cyclic peptide.

また、配列番号１と配列番号２の環状ペプチドは、それぞれ単独でも、かつ互いを混合しても、ある特定の溶媒条件に静置しておくだけで自己組織化的にナノチューブを形成することが可能である。一般的にタンパク質の立体構造はαヘリックス構造やβシート構造を呼ばれる二次構造が組み合わされて形成しており、配列番号１単独でも、また配列番号２単独でも、さらに両配列を混合しても、平行型または逆平行型βシート構造の水素結合を形成し、ナノチューブを形成するように設計されていることが特徴である。   In addition, the cyclic peptides of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 can form nanotubes in a self-organized manner by being left alone in a specific solvent condition, either individually or mixed with each other. Is possible. In general, the three-dimensional structure of a protein is formed by combining secondary structures called α-helix structure and β-sheet structure. Even if SEQ ID NO: 1 alone, SEQ ID NO: 2 alone, or both sequences are mixed It is characterized by being designed to form hydrogen bonds of parallel or anti-parallel β-sheet structure to form nanotubes.

しかし、配列番号１や配列番号２のアミノ酸配列では、アミノ酸側鎖の立体障害や静電相互作用を考慮すると、配列番号１単独または配列番号２単独でナノチューブを形成する場合は平行型βシート構造、両配列を混合した場合でナノチューブを形成する場合は逆平行型βシート構造がエネルギー的に安定であると考えられる。   However, in the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, in consideration of steric hindrance of amino acid side chains and electrostatic interaction, when a nanotube is formed by SEQ ID NO: 1 alone or SEQ ID NO: 2 alone, a parallel β sheet structure When the nanotubes are formed by mixing both arrays, the antiparallel β sheet structure is considered to be stable in terms of energy.

さらにナノチューブ形成条件下で金属イオンを共存させておくと、環状ペプチドは金属イオンを環内部に配位させ、かつナノチューブを形成することができる。こうすることで１個の金属イオンをナノチューブ内に約５Å間隔で一次元的に配列させることが可能となる。本発明は人工環状ペプチドが金属イオンと配位し、かつナノチューブを形成し、金属イオンをチューブ内に配列させた最初の報告例である。   Furthermore, when a metal ion is allowed to coexist under the nanotube formation conditions, the cyclic peptide can coordinate the metal ion inside the ring and form a nanotube. By doing so, one metal ion can be arranged one-dimensionally in the nanotube at intervals of about 5 mm. The present invention is the first reported example in which an artificial cyclic peptide coordinates with a metal ion, forms a nanotube, and arranges the metal ion in the tube.

本発明に係るナノチューブを形成する環状ペプチドは、光学異性体であるL体及びD体アミノ酸の並びを設計することにより、金属イオンと配位結合する特定のアミノ酸を環内部に配向させ、特定の金属イオンを配位させることができるという効果を有する。
また、溶媒をある特定の条件にすることで、環状ペプチドが自己組織化的にナノチューブを形成すること、また金属イオンをナノチューブ内に一次元的に配列させることができるという特徴を有している。
これらのナノチューブを構成する環状ペプチドは、金属イオンと配位結合する特殊なアミノ酸を新たに開発・合成しなくても天然に存在するアミノ酸が利用でき、従来の固相合成により容易に高収率で得ることができるという特徴を有している。 The cyclic peptide forming the nanotube according to the present invention is designed by aligning a specific amino acid coordinated with a metal ion inside the ring by designing the arrangement of L- and D-form amino acids that are optical isomers. An effect is that metal ions can be coordinated.
In addition, the cyclic peptide can form nanotubes in a self-organized manner, and metal ions can be arranged one-dimensionally in the nanotube by setting the solvent to a specific condition. .
The cyclic peptides that make up these nanotubes can use naturally occurring amino acids without newly developing and synthesizing special amino acids that coordinate with metal ions. It has the characteristic that it can be obtained.

また、これらのナノチューブは、中性付近（ｐＨ６〜ｐＨ８）の水溶液と０％＜濃度＜９０％のアルコール濃度の混合溶液中で、常温常圧下でペプチドの自己組織化能力を利用して製造されるため、エネルギーの添加が不要なことや環境負荷が少ないという効果を有する。   These nanotubes are produced by utilizing the ability of peptides to self-assemble at room temperature and normal pressure in a mixed solution of near neutral (pH 6 to pH 8) and 0% <concentration <90% alcohol concentration. Therefore, there is an effect that addition of energy is unnecessary and environmental load is small.

さらに金属イオンをナノチューブ内に一次元的に配列化できることから、還元剤を用いて還元することによりペプチドという絶縁体にコートされた極細の導電性ワイヤーや、金属イオンの特性を利用した高分子磁性体などの分子デバイスを作ることができるという効果を有する。   Furthermore, since metal ions can be arranged one-dimensionally in nanotubes, they can be reduced with a reducing agent to form ultrafine conductive wires coated with an insulator called peptide, or polymer magnetism using the characteristics of metal ions. It has an effect that a molecular device such as a body can be made.

以下、本発明のナノチューブを形成する環状ペプチドの作製方法、及び環状ペプチド内部への金属イオンの配位とナノチューブの形成について、図面を参照しつつ、最良の形態を詳細に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は以下の実施例に示した具体的な用途や形状・寸法などには限定されるものではない。   BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the best mode of a method for producing a cyclic peptide for forming a nanotube of the present invention, the coordination of metal ions inside the cyclic peptide and the formation of the nanotube will be described in detail with reference to the drawings. However, the technical scope of the present invention is not limited to the specific applications, shapes and dimensions shown in the following examples.

[ペプチド合成]
配列番号１及び配列番号２の環状ペプチドの合成は、固相合成法に基づきペプチド合成機（peptide synthesis system, Pioneer ; Applied Biosystems）で行った。固相合成で用いた支持体レジンはPAL-PEG-PS樹脂（Applied Biosystems）で、N_α−アミノ基の保護に9-fluorenylmethoxycarbonyl（Fmoc）保護基が付加されており、ヒスチジン残基、（C末端でない）グルタミン残基の側鎖にtrityl（Trt）保護基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基（L−体、D−体）の側鎖にt-butoxy（OtBu）保護基、リジン残基（L−体、D−体）側鎖にt-butoxycarbonyl（tBoc）保護基がそれぞれ付加されたアミノ酸を使用し、C末端のアミノ酸にglutamic acid 1-allyl esterを用いた。 [Peptide synthesis]
Synthesis of the cyclic peptides of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 was performed with a peptide synthesizer (peptide synthesis system, Pioneer; Applied Biosystems) based on a solid phase synthesis method. The support resin used in the solid-phase synthesis is PAL-PEG-PS resin (Applied Biosystems), with a 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) protecting group added to protect the N _α -amino group, and a histidine residue (C Trityl (Trt) protecting group on the side chain of glutamine residue (not terminal), t-butoxy (OtBu) protecting group on the side chain of glutamic acid residue (L-form, D-form), lysine residue (L-form, D-form) An amino acid having a t-butoxycarbonyl (tBoc) protecting group added to the side chain was used, and glutamic acid 1-allyl ester was used as the C-terminal amino acid.

このグルタミン酸残基側鎖に支持体レジンがカップリングし、脱保護反応の際に支持体レジンが取り除かれてグルタミン残基となる。これらのアミノ酸（ペプチド研究所）がアミノ酸のカップリングに使用され、カップリング試薬としてN-[(Dimethylamino)-1H-1,2,3-triazole[4,5-6]pyridine-1-ylmethylene]-N-meth-ylmet-hanaminium hexafluorophosphate N-oxide（HATU）（Applied Biosystems）を用いた。
環状化にはAllyl基を脱保護するためTetrakis (triphenylphosphine) palladium（Fluka）を触媒に混合溶液（5% Acetic acid（nacalai tesque）、 2.5% 4-Methylmorpholine（NMM） （Fluka）、Chloroform（Fluka））を、また活性剤として7-Azobenzotriazol-1-yloxytris (pyrrolidino) phosphonium-hexafluorophosphate (PyAOP) (Applied Biosystems)を使用した。 The support resin is coupled to the glutamic acid residue side chain, and the support resin is removed during the deprotection reaction to form a glutamine residue. These amino acids (Peptide Institute) are used for coupling amino acids, and N-[(Dimethylamino) -1H-1,2,3-triazole [4,5-6] pyridine-1-ylmethylene] as a coupling reagent -N-meth-ylmet-hanaminium hexafluorophosphate N-oxide (HATU) (Applied Biosystems) was used.
For cyclization, Tetrakis (triphenylphosphine) palladium (Fluka) is used as a catalyst for deprotection of the Allyl group (5% Acetic acid (nacalai tesque), 2.5% 4-Methylmorpholine (NMM) (Fluka), Chloroform (Fluka) ) And 7-Azobenzotriazol-1-yloxytris (pyrrolidino) phosphonium-hexafluorophosphate (PyAOP) (Applied Biosystems) as an active agent.

ペプチド保護基の脱保護反応は、混合溶液A（0.25ml エタンジチオール（EDT）、0.25ml 精製水、9.5ml トリフルオロ酢酸（TFA））中で1時間半かけて室温で行った。その後、脱保護されたペプチドはt-butyl methyl ether （MTBE）で抽出し、遠心回収後、真空乾燥により得た。   The deprotection reaction of the peptide protecting group was carried out in mixed solution A (0.25 ml ethanedithiol (EDT), 0.25 ml purified water, 9.5 ml trifluoroacetic acid (TFA)) at room temperature for 1.5 hours. Thereafter, the deprotected peptide was extracted with t-butyl methyl ether (MTBE), collected by centrifugation, and then vacuum-dried.

ペプチドの精製はDevelosil ODS column （Nomura Chemical）を用いてreverse-phase high-pressure liquid chromatography（RP-HPLC，日立製作所製）によって行った。
流速は10ml/minで、溶出の際のグラジエントは溶離液Bの濃度を20分で5%から20%に変化させて行った。使用した溶離液Aは精製水（0.1% TFA）、溶離液Bはアセトニトリル（0.1% TFA）である。HPLCによって精製されたペプチドの確認は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（matrix-assisted laser desorption ionization ; MALDI）法を用いて飛行時間型質量分析機（AXIMA-CFR，島津製作所製）で行った。 The peptide was purified by reverse-phase high-pressure liquid chromatography (RP-HPLC, manufactured by Hitachi, Ltd.) using a Develosil ODS column (Nomura Chemical).
The flow rate was 10 ml / min, and the gradient during elution was performed by changing the concentration of eluent B from 5% to 20% in 20 minutes. The eluent A used was purified water (0.1% TFA), and the eluent B was acetonitrile (0.1% TFA). Peptides purified by HPLC were confirmed with a time-of-flight mass spectrometer (AXIMA-CFR, manufactured by Shimadzu Corporation) using a matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) method.

[環状ペプチドによるナノチューブ形成反応]
環状ペプチドを秤量し、精製水を加え溶かしてこれを1mMのペプチドストック溶液とし、またCuCl₂・2H₂Oを秤量し、精製水を加え溶かして1mMのCu²⁺ ストック溶液とする。さらに2-[4-(2-Hydroxy-ethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid（HEPES）緩衝液（pH7.5）を調整する。ペプチドストック溶液からそれぞれ一定量分取し、HEPES緩衝液、Cu²⁺ストック溶液とMethanolを加えて、ペプチド濃度がそれぞれ50μM、Cu²⁺濃度が50μM、Methanol濃度が55%または75%になるよう調製し、ナノチューブ形成反応を開始した。 [Nanotube formation reaction by cyclic peptide]
The cyclic peptide is weighed, and purified water is added to dissolve it to make a 1 mM peptide stock solution. CuCl ₂ · 2H ₂ O is weighed, and purified water is added to dissolve to make a 1 mM Cu ²⁺ stock solution. Further, 2- [4- (2-Hydroxy-ethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) buffer solution (pH 7.5) is prepared. Remove a certain amount from each peptide stock solution and add HEPES buffer, Cu ²⁺ stock solution and methanol to make the peptide concentration 50 μM, Cu ²⁺ concentration 50 μM, and Methanol concentration 55% or 75%, respectively. And the nanotube formation reaction was initiated.

[円ニ色性（CD）分光測定]
環状ペプチド溶液を約200ml分取し、それを光路長0.1cmの円筒型石英セルに入れ、250nm〜190nmの遠紫外領域のCD（Jasco J-720 spectropolarimeter、日本分光）測定を行った。 [Circular dichroism (CD) spectroscopy]
About 200 ml of the cyclic peptide solution was collected, put into a cylindrical quartz cell having an optical path length of 0.1 cm, and CD (Jasco J-720 spectropolarimeter, JASCO) measurement in the far ultraviolet region of 250 nm to 190 nm was performed.

[蛍光光度計を用いたチオフラビンT結合アッセイ]
13μlの各環状ペプチド試料、35μl の200μMチオフラビンTストック溶液、652μlの 50mMリン酸緩衝溶液（pH7.0）を素早く混合し、全溶液（700μl）を蛍光測定用石英セルに入れた後、蛍光光度計（Jasco FP-6500 spectrofluorometer，日本分光製）にセットして10秒間の蛍光強度の時間変化を測定した。測定時の励起光波長は450nm、蛍光波長は485nmである。 [Thioflavin T-binding assay using a fluorimeter]
13 μl of each cyclic peptide sample, 35 μl of 200 μM thioflavin T stock solution, 652 μl of 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.0) are quickly mixed, the whole solution (700 μl) is placed in a quartz cell for fluorescence measurement, and then the fluorescence intensity It was set on a meter (Jasco FP-6500 spectrofluorometer, manufactured by JASCO Corporation), and the temporal change in fluorescence intensity for 10 seconds was measured. The excitation light wavelength at the time of measurement is 450 nm, and the fluorescence wavelength is 485 nm.

[原子間力顕微鏡（AFM）による観察]
各試料から2μl分取し、それを雲母基板（約1cm四方）上へ滴下し、約1分間吸着させた。その後、基板洗浄のためにマイクロピペットを用いて50μl精製水を傾けた基板の上端から滴下し、これを2回行った後、室温にて完全に乾燥させ、AFM（SPM-9500J2，島津製作所製）観察を行った。 [Observation with atomic force microscope (AFM)]
2 μl was taken from each sample and dropped onto a mica substrate (about 1 cm square) and adsorbed for about 1 minute. Then, using a micropipette to wash the substrate, 50 μl of purified water was dropped from the top of the tilted substrate, this was performed twice, and then completely dried at room temperature. AFM (SPM-9500J2, manufactured by Shimadzu Corporation) ) Observed.

[核磁気共鳴（NMR）測定]
測定に用いる溶媒として、90％H₂O/10％D₂O、100％D2O、および45％D₂O/55％CD₃ODの3種類を用意し、それぞれ5mM Tris-d₁₁・HCl、0.173mM TSP-d₄溶液となるように調整し、さらに、cyclic p-Aおよびcyclic p-Bが77μM、cyclic p-Aのみが154μM、またはcyclic p-Bのみが154μMとなるように調整した。測定試料として、調整溶液400μlまたは500μlをWILMAD社製標準試料管に挿入したものを用意した。測定はBruker社製NMR分光器、DMX-750を用いて25℃で行い、¹Hの周波数が750.03MHzとなるようにチューニングした。各測定において、スペクトル幅を10000Hz、FID取り込み時間を1.64秒に設定し、積算を512回行った。90％H20/10％D2O溶液の場合は、FIDを取り込む直前にwatergateパルスシーケンスを用いて溶媒であるH₂O由来のシグナルを抑えた。各スペクトルの化学シフトは、TSP-d₄由来ピークのピークトップが0ppmとなるように補正した。 [Nuclear magnetic resonance (NMR) measurement]
Three types of solvents, 90% H ₂ O / 10% D ₂ O, 100% D ₂ O, and 45% D ₂ O / 55% CD ₃ OD, are prepared for measurement, each containing 5 mM Tris-d ₁₁ · HCl, The solution was adjusted to be a 0.173 mM TSP-d ₄ solution, and further adjusted so that cyclic pA and cyclic pB were 77 μM, only cyclic pA was 154 μM, or only cyclic pB was 154 μM. As a measurement sample, a solution prepared by inserting 400 μl or 500 μl of the adjustment solution into a standard sample tube manufactured by WILMAD was prepared. The measurement was performed at 25 ° C. using a Bruker NMR spectrometer, DMX-750, and tuned so that the frequency of ¹ H was 750.03 MHz. In each measurement, the spectral width was set to 10000 Hz, the FID uptake time was set to 1.64 seconds, and integration was performed 512 times. In the case of the 90% H20 / 10% D2O solution, a signal derived from H ₂ O as a solvent was suppressed using a watergate pulse sequence immediately before incorporating the FID. The chemical shift of each spectrum was corrected so that the peak top of the TSP-d ₄ derived peak was 0 ppm.

[cyclic p-Aとcyclic p-Bの混合によるナノチューブ形成条件の決定]
cyclic p-Aとcyclic p-Bを混合した時のナノチューブ形成条件をCDとチオフラビンT結合アッセイで評価した。これまでに報告されている環状ペプチドから成るナノチューブは、環状ペプチド同士の主鎖間でβシート型水素結合を形成していることが確認されていることから、CDスペクトルが時間経過とともに典型的なβシート構造のスペクトルに転移すると予想される。またナノチューブの構造がβシート構造だとすると、同様の構造を有するアミロイド線維と同じ性質を持つと考えられ、アミロイド線維に特異的に結合するチオフラビンTにも同様に結合し、ナノチューブ形成と同時に485nmのチオフラビンTの蛍光強度が増加することが予想される。 [Determination of nanotube formation conditions by mixing cyclic pA and cyclic pB]
Nanotube formation conditions when cyclic pA and cyclic pB were mixed were evaluated by CD and thioflavin T binding assay. Nanotubes composed of cyclic peptides reported so far have been confirmed to form β-sheet type hydrogen bonds between the main chains of the cyclic peptides. It is expected to shift to the spectrum of β sheet structure. If the nanotube structure is a β-sheet structure, it is considered to have the same properties as amyloid fibrils having a similar structure, and also binds to thioflavin T, which specifically binds to amyloid fibrils, and 485 nm thioflavin simultaneously with nanotube formation. It is expected that the fluorescence intensity of T will increase.

図４（a）は、各時間における217nmのCD強度のメタノール濃度依存性を示したものである。一般的にβシート構造のCDスペクトルは、約217nmで負の極大を示す。図４（a）から、日にちが経つとともに40％〜65％の領域のメタノール濃度において217nmのCD強度が負に増加し、50％前後で極小値をとっていることが分かる。これは、40％〜65％メタノール濃度領域においてcyclic p-Aとcyclic p-Bはβシート構造へ構造転移していることを示している。   FIG. 4 (a) shows the methanol concentration dependence of the CD intensity at 217 nm at each time. In general, the CD spectrum of the β sheet structure shows a negative maximum at about 217 nm. FIG. 4 (a) shows that the CD intensity at 217 nm increases negatively with the methanol concentration in the region of 40% to 65% with the passage of time, and takes a minimum value around 50%. This indicates that cyclic p-A and cyclic p-B have undergone a structural transition to a β-sheet structure in the 40% to 65% methanol concentration region.

また図４（b）は各時間におけるチオフラビンTの蛍光強度のメタノール濃度依存性を示したものであるが、一日後には40％〜90％メタノール濃度において485nmの蛍光強度が増加し、その後はほとんど蛍光強度の変化がないことが確認できる。また、75％前後のメタノール濃度でもっとも蛍光強度が増加している。これは、40％〜90％メタノール濃度領域においてアミロイド線維と同様のβシート構造を形成していることと、75％前後のメタノール濃度でもっとも多くのチオフラビンTが凝集体に結合していることを示している。しかしながら、CD測定から得られたもっともβシート構造に転移するメタノール濃度（50％前後）と蛍光測定から得られたメタノール濃度（75％前後）は、大きく異なっている。そこで溶液内にどのような凝集体形成されているか確認するため、7日後の試料溶液を全てAFMで観察した（図５を参照）。   FIG. 4 (b) shows the methanol concentration dependency of the fluorescence intensity of thioflavin T at each time. The fluorescence intensity at 485 nm increased from 40% to 90% methanol concentration after one day, and thereafter It can be confirmed that there is almost no change in fluorescence intensity. Moreover, the fluorescence intensity increases most at a methanol concentration of around 75%. This indicates that a β-sheet structure similar to amyloid fibrils is formed in the 40% to 90% methanol concentration region, and that most thioflavin T is bound to the aggregate at a methanol concentration of around 75%. Show. However, the methanol concentration (approximately 50%) transferred to the β-sheet structure obtained from the CD measurement is greatly different from the methanol concentration (approximately 75%) obtained from the fluorescence measurement. Therefore, in order to confirm what aggregates were formed in the solution, the sample solutions after 7 days were all observed by AFM (see FIG. 5).

その結果、0％＜濃度＜40％のメタノール濃度領域ではごく小さな繊維状凝集体が確認でき、40％〜65％のメタノール濃度領域では長さが5μm前後の太い繊維、65％以上のメタノール濃度では長さが5μm前後の細い繊維が確認された。これらのことから、75％前後のメタノール濃度で形成した細い繊維は、さらに繊維同士でより合わさることがないため、その分チオフラビンTが結合可能な繊維表面が多く存在し、多くのチオフラビンTが結合する結果、蛍光強度を増加させたと考えられる。また、50％前後のメタノール濃度で形成した太い繊維は、細い繊維同士がより合わさって会合しやすく、すぐに太い繊維を形成するため、チオフラビンTの結合表面が減少し、CDの結果からもっとβシート構造をとっているにもかかわらず、蛍光強度が低く出ていると考えられる。以上のCD、蛍光、AFM測定の結果から、cyclic p-Aとcyclic p-Bを混合した時のナノチューブ形成条件は中性付近（pH6〜8）の水溶液と0％＜濃度＜90％のメタノールとの混合溶液であり、その中でも長く太いナノチューブは40％〜65％前後のメタノール濃度、長くて細いナノチューブは65％以上のメタノール濃度である。また、メタノール濃度0％では繊維状の凝集体は形成しないことが確認できた。   As a result, very small fibrous aggregates can be confirmed in the methanol concentration region of 0% <concentration <40%, thick fibers having a length of about 5 μm in the methanol concentration region of 40% to 65%, and methanol concentration of 65% or more. Then, thin fibers with a length of around 5 μm were confirmed. For these reasons, fine fibers formed with a methanol concentration of around 75% do not further combine with each other, so there are many fiber surfaces to which thioflavin T can bind, and many thioflavin T bonds. As a result, it is considered that the fluorescence intensity was increased. In addition, the thick fibers formed at a methanol concentration of around 50% are more easily joined together by the thin fibers, forming a thick fiber immediately, so that the binding surface of thioflavin T is reduced, and the CD results indicate that β Despite the sheet structure, the fluorescence intensity is considered to be low. From the above CD, fluorescence, and AFM measurement results, the nanotube formation conditions when cyclic pA and cyclic pB are mixed are a mixture of an aqueous solution near neutrality (pH 6-8) and methanol with 0% <concentration <90%. Among them, long and thick nanotubes have a methanol concentration of about 40% to 65%, and long and thin nanotubes have a methanol concentration of 65% or more. It was also confirmed that no fibrous aggregate was formed at a methanol concentration of 0%.

[ナノチューブ形成におけるアルコール効果]
さらに、cyclic p-Aとcyclic p-Bを混合した時のナノチューブが、メタノール以外のアルコールでも形成されるかどうか、チオフラビンT結合アッセイで評価した。アルコールをプロパノールにし、各時間におけるチオフラビンTの蛍光強度のプロパノール濃度依存性を調べた結果を図６に示す。メタノールの時と同様に一日後には30％〜90％メタノール濃度において485nmの蛍光強度が増加し、その後はほとんど蛍光強度の変化がないことが確認できる。これはプロパノールでもアミロイド線維様の構造が形成されていることを示しており、βシート構造を形成しながらナノチューブが形成していると考えられる。AFMでもメタノールの時と同じような形態のナノチューブが観察されている。したがって、メタノールよりも比誘電率が低いプロパノールでも0％＜濃度＜90％の濃度範囲でナノチューブ形成が確認されていることから、メタノールとプロパノールの中間の比誘電率をもつエタノールでも同様のアルコール濃度範囲でナノチューブが形成されることは想定でき、ナノチューブ形成条件は常温常圧下で、中性付近（pH６〜pH８）の水溶液とアルコール（メタノール、エタノール、プロパノール）濃度が０％＜濃度＜９０％の領域における混合溶液であると言える。 [Alcohol effect in nanotube formation]
Furthermore, it was evaluated by thioflavin T-binding assay whether nanotubes formed by mixing cyclic pA and cyclic pB were also formed by alcohols other than methanol. FIG. 6 shows the results of examining the propanol concentration dependence of the fluorescence intensity of thioflavin T at each time with propanol as the alcohol. As in the case of methanol, it can be confirmed that the fluorescence intensity at 485 nm increases at a methanol concentration of 30% to 90% after one day, and that there is almost no change in the fluorescence intensity thereafter. This shows that an amyloid fibril-like structure is formed even with propanol, and it is considered that nanotubes are formed while forming a β-sheet structure. In AFM, nanotubes with the same morphology as in methanol were observed. Therefore, propanol, which has a relative dielectric constant lower than that of methanol, has been confirmed to form nanotubes in a concentration range of 0% <concentration <90%. Therefore, ethanol having a relative dielectric constant between methanol and propanol has the same alcohol concentration. It is assumed that nanotubes are formed in the range, and the nanotube formation conditions are normal temperature and normal pressure, and the concentration of aqueous solution near neutral (pH 6 to pH 8) and alcohol (methanol, ethanol, propanol) is 0% <concentration <90%. It can be said that it is a mixed solution in the region.

[cyclic p-A、cyclic p-Bへの金属イオンの配位]
cyclic p-A、cyclic p-Bが各種遷移金属イオンと配結合をするかどうか、ナノチューブを形成しない条件（アルコール0％）で、金属イオンの滴定実験を行った。添加する遷移金属イオンは、Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Ni²⁺である。cyclic p-A、cyclic p-BにはそれぞれHisとAspの２つの配位子しか存在せず、もし遷移金属イオンが環状ペプチドと配位結合するならば、cyclic p-A１分子とcyclic p-B１分子で金属イオンを挟み込んだ形になることがもっとも安定であると考えられる。
その結果、cyclic p-Aとcyclic p-Bは金属イオンを介してお互いが近くなり、βシート構造を形成すると考えられるため、CDで変化を追跡した。その結果を図７に示す。 [Coordination of metal ions to cyclic pA and cyclic pB]
Whether or not cyclic pA and cyclic pB are coordinated with various transition metal ions, a titration experiment of metal ions was performed under the condition that nanotubes are not formed (alcohol 0%). Transition metal ions to be added are Cu ²⁺ , Zn ²⁺ , Cd ²⁺ , Co ²⁺ , and Ni ²⁺ . Cyclic pA and cyclic pB each have only two ligands, His and Asp. If the transition metal ion is coordinated to a cyclic peptide, the cyclic p-A1 molecule and the cyclic p-B1 molecule are metals. It is considered to be most stable to have an ion sandwiched between them.
As a result, cyclic pA and cyclic pB are considered to be close to each other via a metal ion and form a β-sheet structure, and the change was tracked by CD. The result is shown in FIG.

図７（a）はCu²⁺滴定実験の結果を示しており、Cu²⁺濃度が増加するとともにβシート構造のスペクトルに転移していることが分かる。
図７（b）は217nmのCD強度をCu²⁺濃度に対してプロットした滴定曲線であるが、Cu²⁺濃度〜50μM付近で変化がなくなっていることが確認できる。cyclic p-Aとcyclic p-Bの濃度は50μMずつなので、化学量論は大体cyclic p-A：cyclic p-B：Cu²⁺=1：1：1である。この結果からcyclic p-A、cyclic p-BはCu²⁺と配位結合していると考えられる。 FIG. 7 (a) shows the results of a Cu ²⁺ titration experiment, and it can be seen that as the Cu ²⁺ concentration increases, the spectrum shifts to a β-sheet structure.
FIG. 7 (b) is a titration curve in which the CD intensity at 217 nm is plotted against the Cu ²⁺ concentration, and it can be confirmed that there is no change near the Cu ²⁺ concentration to about 50 μM. Since the concentrations of cyclic pA and cyclic pB are 50 μM each, the stoichiometry is approximately cyclic pA: cyclic pB: Cu ²⁺ = 1: 1: 1. From this result, it is considered that cyclic pA and cyclic pB are coordinated to Cu ²⁺ .

同様にZn²⁺で滴定した結果を図７（c）に示すが、Cu²⁺とは異なりZn²⁺濃度が増加してもβシート構造へは転移せず、ランダムコイル様のCDスペクトルで変化がないことが分かる。またCd²⁺（図７（d））、Co²⁺（図７（e））、Ni²⁺（図７（f））でもZn²⁺と同様の結果を得ているため、Cu²⁺以外の遷移金属はcyclic p-A、cyclic p-Bとは配位結合していないと考えられる。 Similarly, the result of titration with Zn ²⁺ is shown in Fig. 7 (c). Unlike Cu ²⁺ , the Zn ²⁺ concentration does not shift to the β-sheet structure, and the random coil-like CD spectrum is used. You can see that there is no change. The Cd ²⁺ (FIG. ^{7 (d)), Co 2+} ( FIG. 7 (e)), Ni ²⁺ because Newsletter (FIG. 7 (f)) Similar results as Zn ^2+, Cu ²⁺ It is considered that other transition metals are not coordinated to cyclic pA and cyclic pB.

Cu²⁺は配位子と平面四配位をもっとも安定に形成し、Zn²⁺、Cd²⁺は正四面体配位、Co²⁺、Ni²⁺は正八面体配位（配位子によっては正四面体配位）を形成することが知られている。静電相互作用、立体障害、歪みの少ない主鎖の安定な水素結合により、cyclic p-Aとcyclic p-Bは逆平行βシート構造を形成すると考えられ、この構造を形成した場合、遷移金属イオンの配位子となりうる２つのHis、２つのAspは平面四角形のそれぞれ頂点に位置する。このことから、Cu²⁺がもっとも環状ペプチドに配位しやすいと考えられ、金属イオンの特異的選択性を生み出していると思われる。また逆にCu²⁺しかcyclic p-A、cyclic p-Bに配位しないことから、設計通りにcyclic p-Aとcyclic p-Bが金属イオンを介してお互いが近くなりβシート構造を形成していると推測できる。 Cu ²⁺ forms the most stable planar tetracoordination with the ligand, Zn ²⁺ and Cd ²⁺ are tetrahedral coordination, Co ²⁺ and Ni ²⁺ are octahedral coordination (depending on the ligand) Are known to form (tetrahedral coordination). Cyclic pA and cyclic pB are thought to form an antiparallel β-sheet structure due to electrostatic interaction, steric hindrance, and stable hydrogen bonding of the main chain with less distortion. When this structure is formed, the coordination of transition metal ions Two His and 2 Asp that can be children are located at the vertices of the plane quadrangle. From this, it is considered that Cu ²⁺ is most easily coordinated with the cyclic peptide, and seems to have produced specific selectivity of metal ions. Conversely, since only Cu ²⁺ coordinates to cyclic pA and cyclic pB, it can be inferred that cyclic pA and cyclic pB are close to each other via metal ions as designed to form a β-sheet structure.

[Cu²⁺が配位する残基のNMRによる同定]
これまでの実験結果から、cyclic p-A、cyclic p-BとCu²⁺が配位結合していることが確認できたが、実際にHisとAspにCu²⁺が結合しているかどうか、NMRを用いてアミノ酸残基レベルで確認を行った。77μMのcyclic p-A、77μMのcyclic p-Bを混合し、Cu²⁺が0、3.5、7、30、70μMになるように調整した溶液の一次元NMRを図８に示す。低磁場領域で見られる6.87ppmと7.05ppmの２つの鋭いピークはcyclic p-A、cyclic p-BのHisのδH、7.75ppmと7.81ppm付近の２つの鋭いピークはcyclic p-A、cyclic p-BのHisのεHであるが、Cu²⁺が3.5μM入るとそれらのピークは著しく減少し、30μM以上ではHisのピークは消失している。また高磁場側で見られる2.45〜2.8ppmのピークはAspのβH 、3.05〜3.2ppmのピークはHisのβHであるが、これらのピークも同様にCu²⁺濃度の増加とともに各ピークは消失している。 [Identification of residues coordinated by Cu ²⁺ by NMR]
From the experimental results so far, it was confirmed that cyclic pA, cyclic pB and Cu ²⁺ were coordinated, but whether or not Cu ²⁺ was actually bonded to His and Asp was confirmed using NMR. Confirmation was made at the amino acid residue level. FIG. 8 shows one-dimensional NMR of a solution prepared by mixing 77 μM cyclic pA and 77 μM cyclic pB and adjusting Cu ²⁺ to 0, 3.5, 7, 30, and 70 μM. Two sharp peaks at 6.87 ppm and 7.05 ppm seen in the low magnetic field region are cyclic pA, δH of cyclic pB His, and two sharp peaks near 7.75 ppm and 7.81 ppm are His p of cyclic pA, cyclic pB However, when Cu ²⁺ is added at 3.5 μM, these peaks remarkably decrease, and at 30 μM or more, the His peak disappears. The peak of 2.45 to 2.8 ppm seen on the high magnetic field side is Asp βH, and the peak of 3.05 to 3.2 ppm is His βH. These peaks also disappear as the Cu ²⁺ concentration increases. ing.

しかしながら7.6ppm付近のGln、Lysに由来するピーク、及び8.0〜8.8ppmのアミドプロトンのピークは、Cu²⁺濃度が増加してもCu²⁺によるピークの幅広化（ブロードニング）が起こっているだけでピークの消失はない。同様に高磁場側でも、1.6ppm〜2.4ppmのLysのβHやδH、Gln及びGluのβHやγHのピーク、そして3.0ppm付近のLysのεHのピークもブロードニングするだけでピークの消失はない。Cu²⁺は常磁性であるために環状ペプチドと相互作用していなくてもNMRスペクトルは著しくブロードニングを起こすが、ある残基と相互作用する場合は、その残基のピークが他の残基と比べて距離が近いために極度にブロードニングを起こし、ピークの消失を引き起こす。このことから、設計通りにCu²⁺は特異的にHisとAspに結合していることが分かる。またHisやAspが環状ペプチドの環の外を向いているとすると、同じように外を向いている他のアミノ酸ともCu²⁺との距離が近くなるため、他のアミノ酸のピークも消失するはずであるが、それが見られないため、HisとAspの側鎖は環状ペプチドの環内部を向いていると考えられる。 However near 7.6 ppm Gln, peaks derived from Lys, and the peak of the amide protons of 8.0~8.8ppm the peak broadening of by even Cu ²⁺ increases the Cu ²⁺ concentration (broadening) is going There is no disappearance of the peak. Similarly, on the high magnetic field side, 1.6 β to 2.4 ppm Lys βH and δH, Gln and Glu βH and γH peaks, and Lys εH peak around 3.0 ppm are also broadened, and no peaks disappear. . Since Cu ²⁺ is paramagnetic, the NMR spectrum significantly broadens even if it does not interact with the cyclic peptide, but if it interacts with one residue, the peak of that residue is the other residue. As the distance is shorter than that, it causes extreme broadening and the disappearance of the peak. This shows that Cu ²⁺ specifically binds to His and Asp as designed. Also, assuming that His or Asp is facing out of the ring of the cyclic peptide, the other amino acids facing in the same way are closer to Cu ²⁺ and the other amino acid peaks should disappear. However, since it is not seen, it is thought that the side chains of His and Asp are facing the inside of the ring of the cyclic peptide.

次にcyclic p-A単独、cyclic p-B単独でもCu²⁺と配位結合するかどうか、同様に一次元NMR測定を行った。図９にcyclic p-A単独（図９（a））の時とcyclic p-B単独（図９（b））の時の結果を示す。cyclic p-A単独では2.6ppm〜2.8ppmのAspのβH、3.05ppm〜3.2ppmのHisのβH、6.85ppmのHisのδH、そして7.75ppmのHisのεHがそれぞれCu²⁺を等量添加するとピークが消失している。またcyclic p-B単独でも同様に2.4ppm〜2.8ppmのAspのβH、3.05ppm〜3.2ppmのHisのβH、7.05ppmのHisのδH、そして7.8ppmのHisのεHがCu²⁺を等量添加するとピークが消失している。これらのことから、cyclic p-A単独、cyclic p-B単独でもHisとAspの部位でCu²⁺と配位結合していることが確認された。 Next, one-dimensional NMR measurement was performed in the same manner to determine whether Cu ^{p 2+} alone or cyclic pB alone could coordinate with Cu ²⁺ . FIG. 9 shows the results for cyclic pA alone (FIG. 9 (a)) and cyclic pB alone (FIG. 9 (b)). With cyclic pA alone, 2.6 ppm to 2.8 ppm Asp βH, 3.05 ppm to 3.2 ppm His βH, 6.85 ppm His δH, and 7.75 ppm His εH each peak when equal amounts of Cu ²⁺ are added. Disappeared. Similarly with cyclic pB alone, 2.4 ppm to 2.8 ppm Asp βH, 3.05 ppm to 3.2 ppm His βH, 7.05 ppm His δH, and 7.8 ppm His εH add Cu ²⁺ in equal amounts. The peak disappears. From these results, it was confirmed that either cyclic pA alone or cyclic pB alone was coordinated to Cu ²⁺ at the His and Asp sites.

さらにナノチューブを形成する条件（55％メタノール存在下）で、cyclic p-Aとcyclic p-Bを等量に混合し、実際にCu²⁺を環状ペプチドの環内部に配位させながらナノチューブを形成しているかどうか、NMRを用いて確認した。図１０（a）に示すように、Cu²⁺がない場合はナノチューブ形成から2時間後と24時間後のスペクトルを比較すると、スペクトルの形は変化せず、強度が著しく減少していることがわかる。この強度の減少は高分子量凝集体形成によるもので、ナノチューブの形成を示しており、HisとAspの各ピークの消失は見られない。 Furthermore, under the conditions for forming nanotubes (in the presence of 55% methanol), whether cyclic pA and cyclic pB are mixed in equal amounts, and whether carbon nanotubes are actually formed while coordinating Cu ²⁺ inside the cyclic peptide ring , Confirmed by NMR. As shown in FIG. 10 (a), in the absence of Cu ²⁺ , comparing the spectra after 2 hours and 24 hours after nanotube formation, the shape of the spectrum does not change and the intensity is significantly reduced. Recognize. This decrease in strength is due to the formation of high molecular weight aggregates, indicating the formation of nanotubes, and the disappearance of the His and Asp peaks is not observed.

しかし、図１０（b）に示すように、Cu²⁺が存在する場合は、ナノチューブ形成から2時間後のスペクトルではHisとAspの各ピークがすでに消失し、それ以外のアミノ酸のピークは残ったままである。さらに24時間後になると、2時間後のスペクトルの形のまま、強度が減少していることが確認された。これらの結果から、Cu²⁺は環状ペプチドの環内部のHisとAspに配位結合しながらナノチューブを形成していると考えられる。 However, as shown in FIG. 10 (b), when Cu ²⁺ is present, the peaks of His and Asp have already disappeared in the spectrum after 2 hours from the nanotube formation, and the other amino acid peaks remain. There is. After 24 hours, it was confirmed that the intensity decreased in the form of the spectrum after 2 hours. From these results, it is considered that Cu ²⁺ forms a nanotube while coordinating with His and Asp inside the ring of the cyclic peptide.

[Cu²⁺存在下でのcyclic p-A単独、cyclic p-B単独、cyclic p-Aとcyclic p-Bの混合のナノチューブ形成]
図１１に各環状ペプチドのCu²⁺存在下での１日後のCDスペクトルとAFM画像を示す。図１１（a）は各メタノール濃度におけるcyclic p-A単独のCDスペクトルを示しており、0％メタノール濃度ではランダムコイル様スペクトルを示しているが、55％、75％メタノール濃度では極小値が〜222nm付近を示した同じようなβシート構造様スペクトルを示している。AFMで形成されたナノチューブの形態を調べてみると、高さ6〜9nmで長さ5μm前後のナノチューブが観察された。また図１１（b）は各メタノール濃度におけるcyclic p-B単独のCDスペクトルを示しており、0％メタノール濃度ではランダムコイル様スペクトルを示し、cyclic p-Aと同様に55％、75％メタノール濃度では極小値が〜222nm付近を示したβシート構造様スペクトルを示している。cyclic p-Bの場合も形成されたナノチューブの形態をAFMで調べてみると、高さ2〜3nmで長さ数百nm〜十数μmのナノチューブが観察された。これらの結果はcyclic p-Aとcyclic p-Bを混合した時のナノチューブ形成条件（40％〜65％前後では太いチューブ、65％以上では細いチューブ）でcyclic p-A単独でも、またcyclic p-B単独でもCu²⁺を環内部に配位させながら、ナノチューブを形成することを示している。 [Nanotube formation of cyclic pA alone, cyclic pB alone, or a mixture of cyclic pA and cyclic pB in the presence of Cu ²⁺ ]
FIG. 11 shows the CD spectrum and AFM image of each cyclic peptide in the presence of Cu ²⁺ after 1 day. FIG. 11 (a) shows the CD spectrum of cyclic pA alone at each methanol concentration, showing a random coil-like spectrum at 0% methanol concentration, but a minimum value of around 222 nm at 55% and 75% methanol concentrations. A similar β-sheet structure-like spectrum is shown. When the morphology of the nanotubes formed by AFM was examined, nanotubes with a height of 6-9 nm and a length of around 5 μm were observed. FIG. 11 (b) shows the CD spectrum of cyclic pB alone at each methanol concentration, showing a random coil-like spectrum at 0% methanol concentration, and minimal values at 55% and 75% methanol concentrations as with cyclic pA. The β-sheet structure-like spectrum is shown around ˜222 nm. In the case of cyclic pB, when the morphology of the formed nanotubes was examined by AFM, nanotubes with a height of 2 to 3 nm and a length of several hundred nm to several tens of μm were observed. These results Cyclic pA and Cyclic (thick tubes 40% to 65% or so, a thin tube at 65% or higher) nanotube formation conditions when pB mixed with Cyclic pA alone, the addition of even Cu ²⁺ with Cyclic pB alone It shows that nanotubes are formed while coordinating inside the ring.

図１１（c）に示すようにcyclic p-Aとcyclic p-Bを混合した場合では、0％メタノール濃度ではランダムコイル様スペクトルを示し、55％、75％メタノール濃度では極小値が〜217nm付近を示したβシート構造スペクトルを示していることが分かる。またAFMでは、高さ10〜40nmで長さ十数μm前後のナノチューブが観察された。このナノチューブは、Cu²⁺が存在しない時に形成するナノチューブ（高さ10〜15nm、長さ5μm前後）よりも太く、長いナノチューブである。このことからCu²⁺と環状ペプチドとの相互作用がナノチューブ形成に影響を与え、ナノチューブ形成を促進したと考えられる。 As shown in FIG. 11 (c), when cyclic pA and cyclic pB are mixed, a random coil-like spectrum is shown at 0% methanol concentration, and a minimum value is around 217 nm at 55% and 75% methanol concentrations. It can be seen that the sheet structure spectrum is shown. In AFM, nanotubes with a height of 10 to 40 nm and a length of around a dozen μm were observed. These nanotubes are thicker and longer than those formed when Cu ²⁺ is not present (height 10-15 nm, length around 5 μm). This suggests that the interaction between Cu ²⁺ and the cyclic peptide affected the nanotube formation and promoted the nanotube formation.

それぞれの環状ペプチドの静電相互作用や立体障害を考えると、cyclic p-A単独やcyclic p-B単独でのナノチューブはおそらく平行βシート構造を形成していると考えられるが、平行βシート構造で形成される水素結合は歪んでいるために、短い繊維や細い繊維のように比較的未熟な繊維しか形成できないのかもしれない。しかし、cyclic p-Aとcyclic p-Bを混合した場合では、静電相互作用や立体障害を考慮すると、おそらく逆平行βシート構造を形成していると考えられ、逆平行βシート構造で形成される水素結合は歪みが少なく、安定に太く、長い繊維が形成すると考えられる。
以上、本発明の好ましい実施形態を図示して説明してきたが、本発明の技術的範囲を逸脱することなく種々の変更が可能であることは理解されるであろう。 Considering the electrostatic interaction and steric hindrance of each cyclic peptide, the nanotubes of cyclic pA alone and cyclic pB alone probably form a parallel β sheet structure, but are formed with a parallel β sheet structure. Since hydrogen bonds are distorted, only relatively immature fibers such as short fibers and thin fibers may be formed. However, when cyclic pA and cyclic pB are mixed, considering electrostatic interaction and steric hindrance, it is likely that an antiparallel β sheet structure is formed, and hydrogen bonds formed with the antiparallel β sheet structure Is considered to be stable, thick and long, with little distortion.
While preferred embodiments of the invention have been illustrated and described, it will be appreciated that various changes can be made without departing from the scope of the invention.

本発明に係る環状ペプチドを用いて形成したナノチューブは、ナノチューブそのものをナノ材料やナノ素材をして利用できる。金属イオン、本発明では特にCu²、をナノチューブ内部に金属錯体として内包することが可能であり、イオンチャンネルなどの物質輸送材、また細胞膜へナノチューブが貫通する報告もあることから抗菌物質としての利用、また金属イオンを還元剤で還元することで絶縁体コートされた導電路としての利用、金属の磁性を利用した高分子磁性体などの分子デバイスへの応用などが考えられる。 The nanotubes formed using the cyclic peptide according to the present invention can be used by using the nanotubes themselves as nanomaterials or nanomaterials. Metal ions, especially Cu ² in the present invention, can be encapsulated inside the nanotubes as metal complexes, and there are reports of substance transport materials such as ion channels and nanotubes penetrating into cell membranes. In addition, use as a conductive path coated with an insulator by reducing metal ions with a reducing agent, and application to molecular devices such as polymer magnetic materials using metal magnetism are conceivable.

また、本発明に係る環状ペプチドは、その構成に天然アミノ酸を利用し、かつナノチューブ形成のために外部からのエネルギーを加えることがなく、自己組織化的に形成されることからも、環境調和材料としても利用可能である。   In addition, the cyclic peptide according to the present invention uses a natural amino acid in its structure, and is formed in a self-organizing manner without applying external energy for forming a nanotube. Can also be used.

さらに、金属イオンと配位するアミノ酸を環状ペプチド内部へ向ける数や配置を設計することは可能であり、種々の金属イオンや有用な物資をナノチューブ内部に内包、配列化することも可能となる。   Furthermore, it is possible to design the number and arrangement of the amino acid coordinated with the metal ion toward the inside of the cyclic peptide, and it is possible to enclose and arrange various metal ions and useful materials inside the nanotube.

光学異性体アミノ酸を使用した８残基及び１２残基環状ペプチドの設計模式図Design schematic diagram of 8-residue and 12-residue cyclic peptides using optical isomer amino acids 金属イオンを環内部には良い結合させるための、１２残基環状ペプチドの設計模式図Schematic diagram of a 12-residue cyclic peptide for binding metal ions to the inside of the ring 配列番号１Gln(L体)-His(L体)-Glu(L体)-Glu(D体)-Glu(L体)-Glu(D体)-Gln(L体)-Asp(L体)-Lys(L体)-Lys(D体)-Lys(L体)-Lys(D体)と、配列番号２Lys(L体)-Asp(L体)-Gln(L体)-Glu(D体)-Glu(L体)-Glu(D体)-Glu(L体)-His(L体)-Gln(L体)-Lys(D体)-Lys(L体)-Lys(D体)の配列をもつ環状ペプチドの説明図SEQ ID NO: 1 Gln (L form) -His (L form) -Glu (L form) -Glu (D form) -Glu (L form) -Glu (D form) -Gln (L form) -Asp (L form)- Lys (L form) -Lys (D form) -Lys (L form) -Lys (D form) and SEQ ID NO: 2 Lys (L form) -Asp (L form) -Gln (L form) -Glu (D form) -Glu (L form) -Glu (D form) -Glu (L form) -His (L form) -Gln (L form) -Lys (D form) -Lys (L form) -Lys (D form) Illustration of cyclic peptide with cyclic p-Aとcyclic p-Aを混合した時の217nmにおけるCD強度のメタノール濃度依存性（a）と、チオフラビンTの蛍光強度のメタノール濃度依存性（b）Dependence of cyclic p-A and cyclic p-A mixture on methanol concentration of CD intensity at 217 nm (a) and thioflavin T fluorescence intensity on methanol concentration (b) 各メタノール濃度でのcyclic p-Aとcyclic p-Aの混合溶液のAFM画像AFM image of the mixed solution of cyclic p-A and cyclic p-A at each methanol concentration cyclic p-Aとcyclic p-Aを混合した時のチオフラビンTの蛍光強度のプロパノール濃度依存性Dependence of thioflavin T fluorescence intensity on propanol concentration when cyclic p-A and cyclic p-A are mixed 0％メタノールにおけるcyclic p-Aとcyclic p-Aの混合溶液への各種遷移金属イオン（（a）Cu²⁺；スペクトル、（b）Cu²⁺；滴定曲線、（c）Zn²⁺、（d）Cd²⁺、（e）Co²⁺、（f）Ni²⁺）の滴定実験の結果Various transition metal ions to a mixed solution of cyclic pA and cyclic pA in 0% methanol ((a) Cu ²⁺ ; spectrum, (b) Cu ²⁺ ; titration curve, (c) Zn ²⁺ , (d) Cd ^{2 +} , (E) Co ²⁺ , (f) Ni ²⁺ ) titration experiment results 0％メタノールにおける各Cu²⁺濃度でのcyclic p-Aとcyclic p-Aの混合溶液の一次元NMRスペクトルOne-dimensional NMR spectrum of a mixed solution of cyclic pA and cyclic pA at each Cu ²⁺ concentration in 0% methanol 0％メタノールにおける各Cu²⁺濃度でのcyclic p-A単独溶液（a）とcyclic p-B単独溶液（b）の一次元NMRスペクトルOne-dimensional NMR spectra of cyclic pA single solution (a) and cyclic pB single solution (b) at each Cu ²⁺ concentration in 0% methanol 55％メタノールにおけるCu²⁺非存在下（a）とCu²⁺存在下（b）でのcyclic p-Aとcyclic p-Aの混合溶液の2時間後と24時間後の一次元NMRスペクトルOne-dimensional NMR spectra of mixed solutions of cyclic pA and cyclic pA in 55% methanol in the absence of Cu ²⁺ (a) and Cu ²⁺ (b) after 2 and 24 hours Cu²⁺存在下でのcyclic p-A単独（a）、cyclic p-B単独（b）、cyclic p-Aとcyclic p-Aの混合溶液（c）の各メタノール濃度におけるCDスペクトルとAFM画像CD spectrum and AFM image at each methanol concentration of cyclic pA alone (a), cyclic pB alone (b), and mixed solution of cyclic pA and cyclic pA (c) in the presence of Cu ²⁺

Claims (5)

１２残基のアミノ酸から構成され、１残基目のN末端と１２残基目のC末端がペプチド結合した環状ペプチドにおいて、
３残基のアミノ酸が連続してL−体もしくはD−体である連続領域が少なくとも２つ存在し、かつ、前記連続領域が隣接すること無く配された配列で、
それ以外のアミノ酸はL−体とD−体が交互に配された配列からなり、
３残基のアミノ酸が連続した前記連続領域では真ん中のアミノ酸残基の側鎖のみ環状ペプチドの環内部を向き、L−体とD−体が交互に配されたアミノ酸残基の側鎖は全て環状ペプチドの環外部を向く構造を形成し、
１２残基の環状ペプチドのアミノ酸配列が、Gln(L体)-His(L体)-Glu(L体)-Glu(D体)-Glu(L体)-Glu(D体)-Gln(L体)-Asp(L体)-Lys(L体)-Lys(D体)-Lys(L体)-Lys(D体)（配列番号１）で示されることを特徴とする環状ペプチド。 In a cyclic peptide consisting of 12 amino acids and having a peptide bond between the N-terminus of the first residue and the C-terminus of the 12th residue,
A sequence in which at least two continuous regions in which three amino acid residues are consecutively in the L-form or D-form, and the continuous regions are arranged without being adjacent to each other,
The other amino acids consist of a sequence in which L-form and D-form are arranged alternately,
In the continuous region where three amino acids are continuous, only the side chain of the middle amino acid residue faces the inside of the ring of the cyclic peptide, and all side chains of amino acid residues in which L-form and D-form are alternately arranged Form a structure that faces the outside of the cyclic peptide,
The amino acid sequence of a 12-residue cyclic peptide is Gln (L form) -His (L form) -Glu (L form) -Glu (D form) -Glu (L form) -Glu (D form) -Gln (L ) -Asp (L isomer) -Lys (L isomer) -Lys (D isomer) -Lys (L isomer) -Lys (D isomer) (SEQ ID NO: 1) １２残基のアミノ酸から構成され、１残基目のN末端と１２残基目のC末端がペプチド結合した環状ペプチドにおいて、
３残基のアミノ酸が連続してL−体もしくはD−体である連続領域が少なくとも２つ存在し、かつ、前記連続領域が隣接すること無く配された配列で、
それ以外のアミノ酸はL−体とD−体が交互に配された配列からなり、
３残基のアミノ酸が連続した前記連続領域では真ん中のアミノ酸残基の側鎖のみ環状ペプチドの環内部を向き、L−体とD−体が交互に配されたアミノ酸残基の側鎖は全て環状ペプチドの環外部を向く構造を形成し、
１２残基の環状ペプチドのアミノ酸配列が、Lys(L体)-Asp(L体)-Gln(L体)-Glu(D体)-Glu(L体)-Glu(D体)-Glu(L体)-His(L体)-Gln(L体)-Lys(D体)-Lys(L体)-Lys(D体)（配列番号２）で示されることを特徴とする環状ペプチド。 In a cyclic peptide consisting of 12 amino acids and having a peptide bond between the N-terminus of the first residue and the C-terminus of the 12th residue,
A sequence in which at least two continuous regions in which three amino acid residues are consecutively in the L-form or D-form, and the continuous regions are arranged without being adjacent to each other,
The other amino acids consist of a sequence in which L-form and D-form are arranged alternately,
In the continuous region where three amino acids are continuous, only the side chain of the middle amino acid residue faces the inside of the ring of the cyclic peptide, and all side chains of amino acid residues in which L-form and D-form are alternately arranged Form a structure that faces the outside of the cyclic peptide,
The amino acid sequence of a 12-residue cyclic peptide is expressed as Lys (L form) -Asp (L form) -Gln (L form) -Glu (D form) -Glu (L form) -Glu (D form) -Glu (L ) -His (L-form) -Gln (L-form) -Lys (D-form) -Lys (L-form) -Lys (D-form) (SEQ ID NO: 2) 金属イオンが環内部に向いているHis及びAspの２つのアミノ酸側鎖と配位結合されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の環状ペプチド。 The cyclic peptide according to claim 1 or 2 , wherein the metal ion is coordinated to the two amino acid side chains of His and Asp facing the inside of the ring. 請求項１〜３のいずれかの環状ペプチドを用いて自己組織化によりナノスケールオーダの径を有する管状構造を形成させたことを特徴とするナノチューブ。 A nanotube having a diameter of nanoscale order formed by self-assembly using the cyclic peptide according to any one of claims 1 to 3 . 請求項１〜３のいずれかの環状ペプチドを用いて自己組織化によりナノスケールオーダの径の管状構造を形成し、かつ、管状構造内部に金属イオン若しくは銅イオンを配列化させたことを特徴とするナノチューブに対して、還元剤を用いて還元して作製される導電性ワイヤー。

A tubular structure having a diameter of nanoscale order is formed by self-assembly using the cyclic peptide according to any one of claims 1 to 3, and metal ions or copper ions are arranged inside the tubular structure, A conductive wire produced by reducing a nanotube with a reducing agent.