JP4911894B2 - Composition for oral administration for preventing rheumatoid arthritis - Google Patents

Description

本発明は関節リウマチの治療剤組成物に関し、さらに詳しくは抗リウマチ作用を有する抗体を含有する関節リウマチの治療・予防効果を有する組成物に関する。   The present invention relates to a therapeutic composition for rheumatoid arthritis, and more particularly to a composition having an effect of treating or preventing rheumatoid arthritis, comprising an antibody having an anti-rheumatic action.

関節リウマチは手や足の関節の発赤、疼痛、腫れ、に始まり、関節の破壊、変形に進み、痛みとともに関節の機能麻痺に至る炎症性の関節の疾患である。その薬物療法には炎症を止めるために、副腎皮質ホルモン剤、免疫抑制剤、酸性抗炎症剤、有機金化合物、抗サイトカイン抗体その他の薬剤の組み合わせによる治療が行われている。これらの薬物療法はいずれも所謂、対症療法である。   Rheumatoid arthritis is an inflammatory joint disease that begins with redness, pain and swelling of the joints of the hands and feet, progresses to destruction and deformation of the joints, and leads to functional paralysis of the joints with pain. In the drug therapy, in order to stop inflammation, treatment with a combination of corticosteroids, immunosuppressants, acidic anti-inflammatory agents, organic gold compounds, anti-cytokine antibodies, and other drugs is performed. These drug therapies are so-called symptomatic treatments.

関節リウマチの病因は今日、一般的には不明とされているが、関節軟骨の主成分であるII型コラーゲンに対する自己免疫が関係するという学説に基づく研究がなされている。   The etiology of rheumatoid arthritis is generally unknown today, but studies based on the theory that autoimmunity to type II collagen, the main component of articular cartilage, is involved.

食事中には、多くの抗原物質があるが、通常、経口摂取では、これらの抗原にたいする抗体産生が起こらない。この現象は経口免疫寛容と称される。   There are many antigenic substances in the diet, but antibody production against these antigens usually does not occur when taken orally. This phenomenon is called oral tolerance.

抗体産生は、抗体産生の促進に働くリンパ球（ヘルパーＴ細胞、Ｔｈ）と、抑制的に働くリンパ球（サプレッサーＴ細胞、Ｔｓ）により調節されている。サプレッサーＴ細胞が優位な状態では抗体産生は抑制されることから、II型コラーゲンに対する自己抗体の産生を抑制するために、II型コラーゲンに対するサプレッサーＴ細胞を賦活する意図で、動物由来のII型コラーゲン由来のペプチド、II型コラーゲンの変性物を投与する試みがなされている。この例として、例えば特許文献１〜３が挙げられ、これらはいずれも経口免疫寛容を意図した特許である。   Antibody production is regulated by lymphocytes (helper T cells, Th) that work to promote antibody production and suppressive lymphocytes (suppressor T cells, Ts). Since antibody production is suppressed when suppressor T cells are dominant, animal-derived type II collagen is intended to activate suppressor T cells against type II collagen in order to suppress autoantibody production against type II collagen. Attempts have been made to administer a modified peptide derived from type II collagen. Examples of this include Patent Documents 1 to 3, which are all patents intended for oral tolerance.

本発明者らは、関節リウマチの予防・治療に資するため、病因の解明をおこなってきた。関節リウマチの病因は、内的要因として、患者の体質的、遺伝的要因として、関節リウマチ患者では経口免疫の破綻があること、外的要因として、食物中の異種動物由来のII型コラーゲン、および、細菌内毒素の消化管からの吸収が原因となっているという仮説のもとに研究を開始した。   In order to contribute to the prevention and treatment of rheumatoid arthritis, the present inventors have elucidated the etiology. The etiology of rheumatoid arthritis is an internal factor, a constitutional and genetic factor of the patient, a breakdown of oral immunity in patients with rheumatoid arthritis, an external factor such as type II collagen derived from different animals in food, and The research started under the hypothesis that bacterial endotoxin absorption is caused by the digestive tract.

経口免疫の破綻とは以下の状態である。経口摂取された抗原に対しては、経口免疫寛容が正常の免疫応答であるが、内因的、体質的、環境的要因により、正常な免疫寛容を誘導し得なくなり、自己抗体を産生するにいたるという考えである。この仮説の検証のために、マウスにおけるコラーゲン関節炎に関して、類似抗原および細菌内毒素の関節炎誘発活性について、マウスを用いて検討した。ＤＢＡ/１系マウスはII型コラーゲン関節炎を容易に発症する遺伝形質を有するマウスである。このマウスにニワトリ由来II型コラーゲン、あるいは熱変性させたものを経口的に与えると、マウスの血液中にはマウスのII型コラーゲンに対する抗体が産生されるとともに、関節炎が発症した。この関節炎は細菌内毒素（別称リポポリサッカライドまたはLPS）の併用で増悪した。またニワトリ由来II型コラーゲンを除いた、細菌内毒素のみの長期投与でも関節炎を発症した（非特許文献１）。   The breakdown of oral immunity is as follows. Oral tolerance is a normal immune response to antigens taken orally, but due to intrinsic, constitutional, and environmental factors, normal tolerance cannot be induced and autoantibodies are produced. This is the idea. For the verification of this hypothesis, the arthritis-inducing activity of similar antigens and bacterial endotoxins was examined using mice for collagen arthritis in mice. A DBA / 1 mouse is a mouse having a genetic trait that easily develops type II collagen arthritis. When these mice were orally given chicken-derived type II collagen or heat-denatured, antibodies against mouse type II collagen were produced in the blood of the mice and arthritis developed. This arthritis was exacerbated by the combination of bacterial endotoxin (also known as lipopolysaccharide or LPS). Arthritis also developed after long-term administration of bacterial endotoxin alone, excluding chicken-derived type II collagen (Non-patent Document 1).

これらの結果はII型コラーゲンに対する抗体とともに、細菌内毒素による免疫系の非特異的賦活ないし疲弊が関節リウマチの発症に関与すること、さらに、経口免疫寛容が正立しない場合のあることを示している。この実験においては、前記特許文献１〜３で示された、免疫寛容を意図して調整した熱変性II型コラーゲンについても免疫寛容を誘導できないことがあることが示された。
特開平０７−１３８１８７号公報 特開平０９−０５９１７６号公報 特開平０９−２５５５８１号公報 K. Terato et al. Br. J. Rheum. 35,828-838, 1996 These results, together with antibodies to type II collagen, indicate that nonspecific activation or exhaustion of the immune system by bacterial endotoxins is involved in the development of rheumatoid arthritis, and that oral tolerance may not be upright. Yes. In this experiment, it was shown that heat tolerance could not be induced even for heat-denatured type II collagen prepared for the purpose of immune tolerance shown in Patent Documents 1 to 3 described above.
JP 07-138187 A JP 09-059176 A JP 09-255551 A K. Terato et al. Br. J. Rheum. 35,828-838, 1996

本発明の課題は、関節リウマチの予防・治療および再発予防機能を有する組成物を提供することである。   An object of the present invention is to provide a composition having a function of preventing and treating rheumatoid arthritis and preventing recurrence.

本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、II型コラーゲン、グラム陰性腸内細菌死菌体の各々またはこれらの混合物をワクチンとしてウシ、ヤギ、羊、鶏を免疫し、抗体を産生させ、その抗体を、ウシ、ヤギ、羊の場合は乳として分泌させ、鶏は鶏卵黄抗体として分泌させ、それらの抗体を、食品または医薬品の組成物とすることにより、課題を達成できることを見出し、本発明に到達した。すなわち、それらの抗体を含有する食品または医薬品を摂取することにより、食品由来のII型コラーゲン、口腔や腸内において細菌によって産生される内毒素を、各々に対応する抗体と反応させることにより不活性化ないしは消化管からの吸収を防止できること、その結果として、関節リウマチを予防し、ないしは病態を改善し治療に役立つことを見出し、本発明に到達した。   As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors immunized cattle, goats, sheep, and chickens with vaccines each of type II collagen, gram-negative enterobacterial bacterial cells, or a mixture thereof, In the case of cows, goats and sheep, the antibody is produced and secreted as milk, and the chicken is secreted as chicken egg yolk antibody. These antibodies are used as food or pharmaceutical compositions to achieve the task. We have found out that we can do it and have reached the present invention. In other words, by ingesting foods or medicines containing these antibodies, it is inactive by reacting food-derived type II collagen, endotoxins produced by bacteria in the oral cavity or intestine with the corresponding antibodies. It has been found that it is possible to prevent absorption from the gastrointestinal tract or gastrointestinal tract and, as a result, prevent rheumatoid arthritis, or improve the pathological condition and be useful for treatment.

すなわち、本発明は下記のとおりである。
１）抗リウマチ作用を有する抗体を有効成分とする関節リウマチ治療剤組成物、
２）抗リウマチ作用を有する抗体が抗II型コラーゲン抗体である前記１）に記載の関節リウマチ治療剤組成物、
３）抗II型コラーゲン抗体が、抗ニワトリII型コラーゲン抗体、抗ウシII型コラーゲン抗体、抗ブタII型コラーゲン抗体の少なくともいずれかである請求項２に記載の関節リウマチ治療剤組成物、
４）抗リウマチ作用を有する抗体が抗細菌内毒素抗体である請求項１に記載の関節リウマチ治療剤組成物、
５）抗リウマチ作用を有する抗体が、抗II型コラーゲン抗体と抗細菌内毒素抗体を任意の割合で混合したものである請求項１に記載の関節リウマチ治療剤組成物、および
６）抗II型コラーゲン抗体および抗細菌内毒素抗体の少なくともいずれかを含有し、総抗体量として０．１質量％以上を含有する請求項１に記載の関節リウマチ治療剤組成物。 That is, the present invention is as follows.
1) a composition for treating rheumatoid arthritis comprising an antibody having an anti-rheumatic activity as an active ingredient,
2) The rheumatoid arthritis therapeutic composition according to 1) above, wherein the antibody having an anti-rheumatic action is an anti-type II collagen antibody,
3) The composition for treating rheumatoid arthritis according to claim 2, wherein the anti-type II collagen antibody is at least one of an anti-chicken type II collagen antibody, an anti-bovine type II collagen antibody, and an anti-pig type II collagen antibody,
4) The composition for treating rheumatoid arthritis according to claim 1, wherein the antibody having antirheumatic activity is an antibacterial endotoxin antibody,
5) The composition for treating rheumatoid arthritis according to claim 1, wherein the antibody having antirheumatic activity is a mixture of an anti-type II collagen antibody and an antibacterial endotoxin antibody at an arbitrary ratio, and 6) anti-type II The therapeutic agent composition for rheumatoid arthritis according to claim 1, comprising at least one of a collagen antibody and an antibacterial endotoxin antibody, and a total antibody amount of 0.1% by mass or more.

本発明によれば、それを含有する食品や医薬品等として摂取され、食品由来のII型コラーゲンや口腔内、腸内において細菌の産生する毒素と、組成物中の抗体が反応することにより、関節炎の発症を抑制し、関節リウマチの予防ないしは治療用に用いことのできる関節リウマチ治療剤組成物を提供することができる。   According to the present invention, arthritis is caused by a reaction between a type II collagen derived from food or a food-derived pharmaceutical containing it, a toxin produced by bacteria in the oral cavity or intestine, and an antibody in the composition. It is possible to provide a therapeutic composition for rheumatoid arthritis that can be used for the prevention or treatment of rheumatoid arthritis.

本発明においては、関節リウマチの要因の１つであることが前記で判明している２種の抗原を家畜動物に接種して免疫し、産生したそれらの抗原に対する抗体を家畜の乳、卵または血液から分離し、得られた抗体を食品または医薬品のための組成物とするものである。以下に、各項ごとに説明する。   In the present invention, two kinds of antigens that have been found to be one of the factors of rheumatoid arthritis are inoculated and immunized to livestock animals. The antibody obtained after separation from blood is used as a composition for food or medicine. Each item will be described below.

１．免疫に用いる抗原
本発明においては、抗原として動物のII型コラーゲンおよびグラム陰性細菌もしくはその内毒素（ＬＰＳ）を好ましく使用する。
１）ウシ、ブタ、およびニワトリのII型コラーゲンは市販品（Chondrex社）を用いることができる。抗原は単独でも混合でも良いが、ニワトリ、ウシ、ブタ、のII型コラーゲンを任意の組み合わせで混合した混合ワクチンが効率的かつ経済的である。 1. Antigen used for immunization In the present invention, animal type II collagen and Gram-negative bacteria or endotoxin (LPS) thereof are preferably used as antigens.
1) Commercially available products (Chondrex) can be used for type II collagen of bovine, porcine, and chicken. Antigens may be used alone or in combination, but a mixed vaccine prepared by mixing chicken, bovine, porcine type II collagen in any combination is efficient and economical.

２）細菌内毒素に対する抗体を産生させるために免疫に用いる抗原としては、人体寄生性グラム陰性細菌で、以下に示す属に該当する細菌である。 すなわち、フソバクテリム（Fusobacterium）, ベイヨネラ(Veillonella), メガスフェラ(Megasphaera),ナイセリア(Neisseria), モラクセラ(Moraxella), ブランハメラ(Branhamella), アシネトバクター(Acinetobacter), シトロバクター(Citrobacter), エンテロバクター(Enterobacter), 大腸菌(Escherichia), ハフニア(Hafnia),クレブシエラ(Klebsiella), モルガネラ)(Morganella), プロテウス(Proteus), プロビデンシア(Providencia), サルモネラ(Salmonella), セラチア(Serratia), シゲラ(Shigella), エルシニア(Yersinia), ビブリオ(Vibrio), エロモナス(Aeromonas), プレジオモナス(Plesiomonas), ヘモフィルス(Haemophillus), パスツレラ(Pasteurella), 緑膿菌(Pseudomonas), レジオネラ(Legionella)などのホルマリン処理ないし加熱死菌を死菌ワクチンとする。ワクチンは単独でも混合ワクチンでもよいが、混合ワクチンが効率的である。菌の培養は成書に記載された通常の方法でよい。 2) Antigens used for immunization to produce antibodies against bacterial endotoxins are human parasitic Gram-negative bacteria that fall into the genus shown below. That is, Fusobacterium, Veillonella, Megasphaera, Neisseria, Moraxella, Branhamella, Acinetobacter, Citrobacter, enterobacter Enterobacter (Escherichia), Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Yia Formalin-treated or heat-killed bacteria such as Vibrio, Aeromonas, Prelesiomonas, Haemophillus, Pasteurella, Pseudomonas, Legionella, etc. To do. The vaccine may be a single vaccine or a mixed vaccine, but a mixed vaccine is efficient. The culturing of the fungi may be performed by the usual method described in the book.

３）動物は微生物と共生しており、各動物種の消化管には各動物固有の微生物とともに、ヒトと共通の微生物も生存し、これらが抗原となって動物は抗体を産生し,保有する。これらは自然抗体と称される。ヒトと共通のグラム陰性菌の内毒素に対する抗体も、自然抗体として存在するので、これらを用いることもできる。 3) Animals live in symbiosis with microorganisms, and in the digestive tract of each animal species, microorganisms common to humans and microorganisms common to humans survive, and these animals become antigens and animals produce and possess antibodies. . These are called natural antibodies. Since antibodies against gram-negative bacterial endotoxins common with humans also exist as natural antibodies, these can also be used.

２．動物の選択
通常、自己ないし同種の抗原に対しては、それを注射しても動物は抗体を産生しないことが知られている。さらに、産生された抗体の量は、抗原と免疫される動物種の異種性の隔たりが大きいほど多くなる傾向がある。したがって、例えば、ウシII型コラーゲンに対する抗体の作成はウシII型コラーゲンを鶏に免疫し、鶏卵卵黄抗体として回収することが望ましい。また、ニワトリII型コラーゲンに対する抗体の作成はニワトリII型コラーゲンを牛に免疫して、抗体を乳汁または血清中に得ることができる。このように、II型コラーゲンで免疫される動物は異種由来のII型コラーゲンを接種する。異種由来であれば複数のコラーゲンを混合して混合ワクチンとして注射することが効率的、かつ経済的である。
細菌成分はすべての動物にとって抗原性を持つので、これらをワクチンとして、混合して免疫注射することができる。 2. Selection of animals It is generally known that an animal does not produce an antibody against an autologous or cognate antigen when injected. Furthermore, the amount of antibody produced tends to increase as the heterogeneous distance between the animal species immunized with the antigen increases. Therefore, for example, for the production of antibodies against bovine type II collagen, it is desirable to immunize chickens with bovine type II collagen and recover them as chicken egg yolk antibodies. In addition, an antibody against chicken type II collagen can be obtained by immunizing a cow with chicken type II collagen and obtaining the antibody in milk or serum. Thus, animals immunized with type II collagen are inoculated with heterologous type II collagen. If it is derived from different species, it is efficient and economical to mix a plurality of collagens and inject them as a mixed vaccine.
Since bacterial components are antigenic for all animals, they can be mixed and injected as a vaccine.

３．抗原接種方法
動物即ち乳牛および乳山羊、羊、鶏への摂取方法は、いずれの抗原も水溶液ないし懸濁液のままでもよいが、コラーゲンのように蛋白質性の抗原には各種免疫アジュバントと混合して投与することが望ましい。一回の免疫には蛋白乾燥重量10?1000μグラムを0.1?10ml に溶解ないし懸濁し、等容量のフロインドの完全アジュバントおよび不完全アジュバント、TiterMax Gold または Ribi Adjuvant R-730 などを用いて油中水型エマルジョンとして、皮内、皮下、筋肉内1箇所ないし10箇所に分けて、一箇所0.1?10mlを注射する。これを週１回ないし２月に１回行う。 3. Antigen inoculation method Animals, such as cows and dairy goats, sheep, and chickens, can be in the form of an aqueous solution or suspension. However, proteinaceous antigens such as collagen can be mixed with various immune adjuvants. Is desirable. For a single immunization, dissolve 10-1000 μg of protein dry weight in 0.1-10 ml and suspend in 0.1-10 ml and use an equal volume of Freund's complete and incomplete adjuvants such as TiterMax Gold or Ribi Adjuvant R-730. As a mold emulsion, inject into 0.1 to 10 ml at one site, divided into 1 to 10 sites, intradermal, subcutaneous and intramuscular. Do this once a week or once in February.

内毒素に体する抗体の作成には、0.01％?10％湿重量の一種の死菌液ないし複数の死菌液の混合物の0.1?10 mlを皮下、筋肉内、皮下ないし静脈内に1?４週に1回投与する。内毒素に体する抗体の作成をアジュバントと共に免疫して行うことも可能である。死菌液にフロインドの完全アジュバントおよび不完全アジュバント、TiterMax Gold または Ribi Adjuvant R-730 などを用いて油中水型エマルジョンとして、皮内、皮下、筋肉内1箇所ないし10箇所に分けて注射する。これを週１回ないし２月に１回行う。   For the production of antibodies against endotoxin, 0.1 to 10 ml of a mixture of one type of killed bacteria or a mixture of several killed bacteria of 0.01% to 10% wet weight is given subcutaneously, intramuscularly, subcutaneously or intravenously. Administer once every 4 weeks. It is also possible to immunize with an adjuvant to produce antibodies against endotoxins. The dead bacteria solution is injected as a water-in-oil emulsion using Freund's complete and incomplete adjuvants, such as TiterMax Gold or Ribi Adjuvant R-730, divided into 1 to 10 sites intradermally, subcutaneously, or intramuscularly. Do this once a week or once in February.

４．抗体の採取
１）乳汁抗体の採取
搾乳は通常の方法により手または搾乳機を用いて行う。
抗体は７２℃を超える加熱で活性を失うため、最終製品まで過剰な加熱を避ける。生乳の殺菌は７２℃以下での処理、紫外線照射殺菌または放射線照射殺菌が適当である。乳汁は遠心分離により、脂肪を除き、噴霧乾燥し、スキムミルクとしたもの、脂肪を除いた後、塩酸を加えてｐＨ4.6とし、析出するカゼインをろ過除去し、さらに乳糖、ミネラルなどの低分子成分を限外ろ過により除いてホエーとしたもの、さらに限外ろ過によりラクトアルブミン、ラクトグロブリンをのぞき抗体蛋白を主とする分画などを、低温噴霧乾燥、または凍結乾燥し、抗体含有量0.1％台から約90％含有する粉末状の抗体組成物とすることができる。通常初乳を除く牛生乳１トンから総抗体として10〜100ｇ、平均30ｇが得られる。また、抗体を含有する、市販のホエー、乳清タンパク濃縮物（ＷＰＣ）、乳清タンパク分離物（ＷＰＩ）を用いることもできる。 4). Antibody collection 1) Milk antibody collection Milking is carried out by hand or using a milking machine in the usual manner.
Since antibodies lose activity upon heating above 72 ° C., avoid excessive heating to the final product. For sterilization of raw milk, treatment at 72 ° C. or lower, ultraviolet irradiation sterilization or radiation irradiation sterilization are suitable. Milk is centrifuged to remove fat, spray dried to skim milk, fat is removed, hydrochloric acid is added to pH 4.6, precipitated casein is removed by filtration, and low molecular weight substances such as lactose and minerals are added. Components obtained by removing the components by ultrafiltration to make whey, and fractions mainly consisting of antibody proteins excluding lactalbumin and lactoglobulin by ultrafiltration are cryospray-dried or freeze-dried, and the antibody content is 0.1%. It can be set as the powdery antibody composition containing about 90% from a stand. Usually, 1 to 100 g of total antibody is obtained from 1 ton of raw cow milk excluding colostrum, and an average of 30 g. Commercially available whey, whey protein concentrate (WPC), and whey protein isolate (WPI) containing antibodies can also be used.

２）血清抗体の採取
免疫動物の血液は抗体含量が高く、原料として優れる。
採取した血液を遠心分離して血清とした後、硫安１/３飽和で沈殿するガンマグロブリン画分をろ過採取し、水に溶解後、脱塩し、低温噴霧乾燥ないし凍結乾燥し粉末とする。通常抗体含有量は70〜90％で、血液1kgから、総抗体約15gが得られる。 2) Collection of serum antibodies The blood of immunized animals has a high antibody content and is excellent as a raw material.
The collected blood is centrifuged to obtain serum, and then the gamma globulin fraction that precipitates at 1/3 saturation of ammonium sulfate is collected by filtration, dissolved in water, desalted, and low-temperature spray-dried or freeze-dried to obtain a powder. Usually, the antibody content is 70 to 90%, and about 15 g of total antibody is obtained from 1 kg of blood.

３）鶏卵抗体の採取
免疫鶏卵の卵黄よりGITキット〔コスモバイオ（株）〕を用いて、一般に鶏卵１kgより純度90％のIgY抗体0.9〜1.5gが得られる。抗体溶液は低温噴霧乾燥ないし凍結乾燥し粉末とする。 3) Collection of chicken egg antibody From the egg yolk of immunized chicken egg, 0.9 to 1.5 g of 90% pure IgY antibody is generally obtained from 1 kg of chicken egg using GIT kit [Cosmo Bio Co., Ltd.]. The antibody solution is powdered by low temperature spray drying or freeze drying.

５．抗体の定量法
抗体の量については、抗体の抗原特異性とは関係なく、総抗体量を測定する方法と、各抗原に対する抗体の量の測定法としてELISA法(Fujii K, et al. J Immunol Methods 1989;124:63-70)による測定方法の両者が用いられる。 5. Antibody quantification method The amount of antibody is independent of the antigen specificity of the antibody, and the total antibody amount is measured, and the ELISA method (Fujii K, et al. J Immunol Both measurement methods according to Methods 1989; 124: 63-70) are used.

１）総抗体量の測定
プロテインGカラムは、抗体を効率よく精製するための抗体精製用アフィニテイカラムとして市販されている（アマシャム バイオサイエンス、その他）。抗体を含む溶液を中性付近のｐＨで通過させると、抗体を100％近く吸着することが出来る。カラムを洗浄後、ｐＨを2.5〜2.8の酸性溶液を流すと、抗体はカラムから遊離し回収される。抗体１％溶液の紫外部波長280nmにおける吸光度は種差に共通で約14であるので、吸光度から抗体の量を求める。 1) Measurement of total antibody amount Protein G columns are commercially available as antibody purification affinity columns for efficiently purifying antibodies (Amersham Biosciences, etc.). When a solution containing an antibody is passed at a pH near neutral, the antibody can be adsorbed by nearly 100%. After washing the column, when an acidic solution having a pH of 2.5 to 2.8 is passed, the antibody is released from the column and collected. Since the absorbance at an ultraviolet wavelength of 280 nm of the antibody 1% solution is about 14 in common with the species difference, the amount of antibody is determined from the absorbance.

２）総IgYの測定
市販の卵黄抗体の吸着カラム（HiTrapIgYPurificationHP,アマシャム バイオサイエンス）を用い、容易に定量することができる。抗体含有液を0.5M硫酸カリウム含有20ｍMリン酸緩衝溶液pH7.5で吸着させ、同液で洗浄後、20ｍMリン酸緩衝溶液ｐH7.5で溶出し、回収したIgY抗体を吸光度より算出する。 2) Measurement of total IgY A commercially available egg yolk antibody adsorption column (HiTrapIgYPurificationHP, Amersham Bioscience) can be easily quantified. The antibody-containing solution is adsorbed with 0.5 M potassium sulfate-containing 20 mM phosphate buffer solution pH 7.5, washed with the same solution, eluted with 20 mM phosphate buffer solution pH 7.5, and the collected IgY antibody is calculated from the absorbance.

３）アフィニテイ精製特異抗体のELISA法による測定
コラーゲンおよび細菌内毒素（LPS）をアクテイゲル（ステロジーン）やCNBr活性化（セファロースアマシャム バイオサイエン）に共有結合させ、抗体精製用の抗原アフィニテイカラムとして用いる。精製する抗体溶液をカラムに流し、目的とする抗体のみカラムに吸着させ、カラムに吸着しない免疫グロブリンなどを中性バッファーで洗い出した。カラムに結合した抗体はpＨ2.8の０．１Mグリシン緩衝液で溶出した。溶出抗体をさらにプロテインGカラムによりかけ、精製した抗体を標準品としてELISA（酵素免疫測定法）により検量線を作成し、定量した。各抗原によるウエルの感作条件、ブロッキング溶液を以下に記載する。 3) Measurement of affinity-purified specific antibody by ELISA method Collagen and bacterial endotoxin (LPS) are covalently bound to Actigel (Steligen) or CNBr activation (Sepharose Amersham Biosciencen) and used as an antigen affinity column for antibody purification. The antibody solution to be purified was allowed to flow through the column, only the target antibody was adsorbed to the column, and immunoglobulins that were not adsorbed on the column were washed out with a neutral buffer. The antibody bound to the column was eluted with 0.1 M glycine buffer at pH 2.8. The eluted antibody was further applied to a protein G column, a calibration curve was prepared by ELISA (enzyme immunoassay) using the purified antibody as a standard, and quantified. Conditions for sensitization of wells with each antigen and blocking solutions are described below.

・抗コラーゲン抗体のELISA測定：
コラーゲン10μｇ/ｍｌとなるように0.15Mリン酸カリウム緩衝液pH 7.2に希釈し、その50μｌをELISAプレートウエルに入れ、一昼夜４℃でコートした。ブロッキングは56℃、30分過熱したウサギ血清に0.05M トリス、0.15M食塩を加え、pＨを7.8に調整した液をブロッキング液として用いる。抗体測定検体の希釈もこのブロッキング液をもちいる。 ・ ELISA measurement of anti-collagen antibody:
The collagen was diluted to 0.15M potassium phosphate buffer pH 7.2 to 10 μg / ml, and 50 μl thereof was placed in an ELISA plate well and coated at 4 ° C. overnight. For blocking, a solution obtained by adding 0.05 M Tris and 0.15 M salt to rabbit serum heated at 56 ° C. for 30 minutes and adjusting the pH to 7.8 is used as a blocking solution. This blocking solution is also used for dilution of the antibody measurement specimen.

・細菌内毒素に対する抗体のELISA測定：
グラム陰性菌菌体よりトリクロロ酢酸抽出したLPSをpH9.5の0.05M炭酸緩衝液に、それぞれ5μｇ/ｍｌの濃度でふくむ溶液でELISAプレートウエルをコートする。ブロッキングは牛血清アルブミンを0.1％含有するリン酸緩衝生理食塩液により行う。 ・ ELISA measurement of antibody against bacterial endotoxin:
The ELISA plate well is coated with a solution containing LPS extracted from gram-negative bacterial cells with trichloroacetic acid in 0.05 M carbonate buffer at pH 9.5 at a concentration of 5 μg / ml. Blocking is performed with phosphate buffered saline containing 0.1% bovine serum albumin.

抗体量は、成書に従って、それぞれペルオキシダーゼ標識した抗ウシ抗体、抗山羊抗体、抗羊抗体、抗IgY抗体を反応させ、OPDを基質として発色させ、吸光度を測定し、抗体の標準品を用いて作成した検量線より総抗体量または特異抗体量を求める。   The amount of antibody was determined by reacting peroxidase-labeled anti-bovine antibody, anti-goat antibody, anti-sheep antibody, and anti-IgY antibody, developing OPD as a substrate, measuring the absorbance, and using a standard antibody. The total antibody amount or specific antibody amount is determined from the prepared calibration curve.

６．抗体含有組成物の作成
グラム陰性菌内毒素に対する抗体を含有する調整物とII型コラーゲンで免疫した抗体含有調整物の単独、または両者を混合して抗体含有組成物とすることができる。必要により、抗体含有調整物以外の食品材料、賦型剤を加えて食品、医薬品とすることもできる。最終製品の総抗体含有量が１％以上であることがのぞましい。 6). Preparation of Antibody-Containing Composition An antibody-containing composition can be prepared by mixing a preparation containing an antibody against Gram-negative bacterial endotoxin and an antibody-containing preparation immunized with type II collagen, or a mixture of both. If necessary, food materials and excipients other than antibody-containing preparations can be added to produce foods and pharmaceuticals. The total antibody content of the final product is preferably 1% or more.

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが本発明はそれらに限定されるものではない。実施例中、％は特にことわらない限り、質量％である。   The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto. In Examples,% is% by mass unless otherwise specified.

［実施例１］
ａ）ウシのコラーゲンによる免疫
鶏 II 型コラーゲン（コンドレックス社）2mgを0.05M 酢酸１mlに溶解し、2mg／ml のコラーゲン酢酸溶液とした。これと同量の2倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）をまぜ2ml とし、この１mlをTiterMax gold 1mlに加え、良く撹拌してエマルションを作成した。 エマルジョン2ｍｌを4頭の妊娠牛頚部皮下に、1mlずつ2箇所に分けて、出産予定の60日前、30日前、出産の30日後、60日後の4回注射して免疫した。 [Example 1]
a) Immune chicken type II collagen (chondrox) 2 mg with bovine collagen was dissolved in 1 ml of 0.05M acetic acid to give a 2 mg / ml collagen acetate solution. 2 ml of phosphate buffered saline (PBS) of the same amount as this was mixed to make 2 ml, and 1 ml of this was added to 1 ml of TiterMax gold, and stirred well to prepare an emulsion. Two ml of emulsion was subcutaneously divided into four necks of 4 pregnant cows, divided into two 1 ml portions, and immunized by four injections 60 days before, 30 days before, 30 days after delivery, and 60 days after delivery.

ｂ）大腸菌O-111:B4株によるウシの免疫
大腸菌O-111：B4株を普通寒天平板培地で培養増殖させ、１％ホルマリン加生理食塩液を加えてかきとり、80度Cで1時間加熱殺菌した。加熱菌液を洗浄後、濁度を波長６６０nmで吸光度１．０に調節した。菌液１ｍｌをTiterMax gold 1mlに加え、良く撹拌してエマルションを作成した。この１ｍｌずつを3頭の妊娠牛の皮下に、出産予定の60日前、30日前の2回に、首部皮内に注射した。 b) Bovine immunization with Escherichia coli O-111: B4 strain E. coli O-111: B4 strain is cultured and grown on a normal agar plate, scraped with 1% formalin-added physiological saline, and sterilized by heating at 80 ° C for 1 hour. did. After washing the heated bacterial solution, the turbidity was adjusted to an absorbance of 1.0 at a wavelength of 660 nm. 1 ml of the bacterial solution was added to 1 ml of TiterMax gold and stirred well to prepare an emulsion. Each 1 ml was injected subcutaneously into the neck skin of 3 pregnant cows twice, 60 days before and 30 days before the scheduled delivery.

ｃ）ニワトリII型コラーゲン免疫牛の初乳、大腸菌O-111 ：B4株免疫牛の初乳よりホエーの調整
前記ａ）、ｂ）で免疫された各ウシの出産後3日間の生乳をプールして集めた。その１部８リットルについて、20000g30分遠心して脂肪層を除き脱脂乳を得た。脱脂乳を62.5度で30分加熱殺菌後、塩酸を加えてpH4.6とし、20000g３０分遠心分離によりカゼインを除いた後、水酸化ナトリウム溶液を加えてpH7.0とし、凍結乾燥し、それぞれ乾燥物707ｇ、780gを得た。 c) Colostrum of chicken type II collagen immunized cow, Escherichia coli O-111: Adjusting whey from colostrum of cow immunized with B4 strain Pool raw milk for 3 days after delivery of each cow immunized in a) and b) Collected. A portion of 8 liters was centrifuged at 20000 g for 30 minutes to remove the fat layer and obtain skim milk. The skim milk is sterilized by heating at 62.5 degrees for 30 minutes, then hydrochloric acid is added to pH 4.6, casein is removed by centrifugation at 20000 g for 30 minutes, sodium hydroxide solution is added to pH 7.0, freeze-dried, and dried. 707 g and 780 g of product were obtained.

［実施例２］
抗LPSウシ抗体の特異精製
実施例１ｃ）で調整した大腸菌免疫牛ホエーは大腸菌内毒素O-111に対する抗体を0.25％含有した。これをリン酸緩衝整理食塩液50ｌに1％含有する溶液とし、500mlのO-111固相化アフィニテイカラムにかけ、洗浄、pH2.8溶出、中和後、さらにプロテインGカラムで濃縮精製し、抗原特異抗体580ｍｇを得た。 [Example 2]
Specific purification of anti-LPS bovine antibody The E. coli immunized bovine whey prepared in Example 1c) contained 0.25% of an antibody against E. coli endotoxin O-111. This is a solution containing 1% in 50 l of phosphate buffered saline, applied to a 500 ml O-111 solid phase affinity column, washed, pH 2.8 eluted, neutralized, and further concentrated and purified on a protein G column. 580 mg of antigen-specific antibody was obtained.

［実施例３］
抗ニワトリII型コラーゲンウシ抗体の特異精製
実施例１ｃ）で調整したニワトリII型コラーゲン免疫牛の初乳より調整したホエーはニワトリII型コラーゲンに対する抗体を0.6％含有した。これをリン酸緩衝整理食塩液30ｌに1％含有する溶液とし、500mlのO-111固相化アフィニテイカラムにかけ、順次カラムを洗浄、ｐH2.8溶出、中和後、さらにプロテインGカラムで濃縮精製し、抗原特異抗体930ｍｇを得た。 [Example 3]
Specific Purification of Anti-Chicken Type II Collagen Bovine Antibody The whey prepared from the colostrum of chicken type II collagen immunized cow prepared in Example 1c) contained 0.6% of antibody against chicken type II collagen. This is made into a solution containing 1% in 30 liters of phosphate buffered saline, applied to a 500 ml O-111 solid phase affinity column, washed sequentially, pH 2.8 eluted, neutralized, and further concentrated on a protein G column. Purification was performed to obtain 930 mg of antigen-specific antibody.

［実施例４］
マウス抗コラーゲン・モノクローナル抗体混合物による関節炎発症モデルにおける抗LPSウシ抗体の関節炎発症阻止効果
マウス関節軟骨コラーゲンに対するモノクローナル抗体（関節炎用カクテル、コンドレックス社）の4 ｍｇを注射投与するとマウスは関節炎を発症し、2日で関節の腫れは最大となる。ところが、関節炎用カクテルの量を減じ、2 ｍｇでは関節炎は全く発症しない。しかし、このマウスに大腸菌LPS（E. coli O-111:B4 Sigma）を経口投与で3 ｍｇ/マウス/日で3回投与（関節炎用カクテル投与日を0日として0，1，2日）すると関節炎を発症し、6日で腫れは最高に達した。1群3匹の6週齢BALB/c 雄性マウスを一群3匹とし、関節炎用カクテル群、関節炎用カクテルとLPS経口併用群、関節炎用カクテルとLPS経口さらに抗LPS抗体経口投与の3群を設け、関節炎の腫れを両足容積測定により評価した。抗LPSウシ抗体は実施例２で示した精製特異抗体を3mg/マウス/日宛、LPS投与日に経口摂取させた。結果を表１に示した。 [Example 4]
Anti-LPS Bovine Antibody Inhibition of Arthritis Development in an Arthritis Development Model Using a Mouse Anti-Collagen Monoclonal Antibody Mixture When 4 mg of a monoclonal antibody against articular cartilage collagen (arthritis cocktail, Chondrex) is administered by injection, mice develop arthritis. In 2 days, joint swelling is maximized. However, reducing the amount of arthritic cocktail, 2 mg does not cause arthritis at all. However, when E. coli LPS (E. coli O-111: B4 Sigma) was orally administered to this mouse three times at a dose of 3 mg / mouse / day (0, 1, and 2 days with the arthritis cocktail as 0 days) Arthritis developed and the swelling reached its maximum in 6 days. Three groups of six 6-week-old BALB / c male mice per group, with three groups: arthritis cocktail group, arthritis cocktail and LPS oral combination group, arthritis cocktail and LPS oral administration, and anti-LPS antibody oral administration The swelling of arthritis was evaluated by measuring both foot volumes. As the anti-LPS bovine antibody, the purified specific antibody shown in Example 2 was orally ingested to 3 mg / mouse / day, on the day of LPS administration. The results are shown in Table 1.

表１に示すとおり、経口LPSの関節炎発症促進効果は特異精製した抗LPS抗体の経口投与により阻止された。   As shown in Table 1, the arthritis development promoting effect of oral LPS was blocked by oral administration of a specifically purified anti-LPS antibody.

［実施例５］
ニワトリII型コラーゲン、LPS長期経口投与によるマウス関節炎発症にたいする抗コラーゲン抗体および抗LPS抗体の阻止効果
ニワトリ II 型コラーゲンにLPS を加えてマウスに経口投与すると II 型コラーゲン単独投与群に比較して抗体産生と関節炎発症が増強される（K. Terato et al. Br. J. Rheum. 35,828-838, 1996）。そこで、それぞれに対する抗体の関節炎発症抑制作用をDBA/1 マウスを用いて検討した。関節炎好発系のDBA/1雄性6週齢マウスを1群6匹とし、コラーゲン（ニワトリII型コラーゲン コンドレックス社）単独群、コラーゲンにLPS（E.coli O-111 :B4 Sigma）を加えた群、および、これらにさらに抗コラーゲン抗体（実施例３）、抗LPS抗体（実施例２）を添加して投与する群を設定し、14週間にわたって2週を１クールとする４クールの経口免疫を行った。経口免疫期間の経口投与は、コラーゲン、LPSの経口吸収を促進するために、対照群１を含むすべての群にインドメタシン40μgグラムを加え、全容積0.4mlを経口投与した。16週の第1日に眼底採血し血清を得た後、一週間関節炎発症を意図して、LPS経口による惹起投与した。各免疫クールの第１日目と、17週の第一日に、関節の腫脹をスコアー化（表２記載文献）して評点した。動物群の構成と処置条件、足蹠容積を表２に示した。投与量はすべてマウスあたりの経口投与である。 [Example 5]
Inhibitory effect of anti-collagen antibody and anti-LPS antibody against the onset of arthritis in mice by long-term oral administration of chicken type II collagen and LPS When LPS is added to chicken type II collagen and orally administered to mice, antibody production is produced compared to the group administered with type II collagen alone And the onset of arthritis is enhanced (K. Terato et al. Br. J. Rheum. 35,828-838, 1996). Thus, the arthritis inhibitory action of each antibody was examined using DBA / 1 mice. Arthritis-prone DBA / 1 male 6-week-old mice consisted of 6 mice per group, collagen (chicken II collagen chondrox) alone group, and LPS (E.coli O-111: B4 Sigma) added to collagen A group and a group to which an anti-collagen antibody (Example 3) and an anti-LPS antibody (Example 2) are further added and administered are set, and 4 courses of oral immunization with 2 weeks as 1 course over 14 weeks Went. In oral administration during the oral immunization period, in order to promote oral absorption of collagen and LPS, 40 μg of indomethacin was added to all groups including Control Group 1, and a total volume of 0.4 ml was orally administered. On the first day of 16 weeks, blood was collected from the fundus and serum was obtained. Then, LPS was orally administered for the purpose of developing arthritis for one week. On the first day of each immunization course and on the first day of the 17th week, the swelling of the joint was scored (documents described in Table 2) and scored. Table 2 shows the composition of the animal group, treatment conditions, and footpad volume. All doses are orally administered per mouse.

表２はコラーゲンおよび、LPSの長期間投与による経口感作によって、それぞれ単独でも関節炎を発症し、両者を加えて投与すると関節炎が強く発症すること。それに対し、抗コラーゲン抗体と抗細菌内毒素抗体（抗LPS抗体）の併用で阻止できることを示した。   Table 2 shows that arthritis develops by oral sensitization by long-term administration of collagen and LPS alone, and arthritis develops strongly when both are administered. On the other hand, it was shown that anti-collagen antibody and anti-bacterial endotoxin antibody (anti-LPS antibody) can be blocked together.

［実施例６］
抗関節リウマチ治療組成物
ニワトリに市販のウシII型コラーゲン、ブタII型コラーゲンを免疫して得た、総抗体量として50％抗体含有量の鶏卵抗体含有粉末と、ニワトリII型コラーゲンおよび市販大腸菌ワクチン（imocoliv,ゼンノウ）で免疫したウシより得た生乳より総抗体含有量5％のホエー粉末を用意し、これらを1対９の割合で混合し、賦形剤を添加して、約６５℃の温度で、定法に準じて総抗体含量0.1％の顆粒を調整した。



[Example 6]
Anti-rheumatoid arthritis therapeutic composition Chicken obtained by immunization with commercially available bovine type II collagen and porcine type II collagen, 50% antibody content powder containing chicken egg antibody, chicken type II collagen and commercially available E. coli vaccine Prepare whey powder with a total antibody content of 5% from raw milk obtained from cows immunized with (imocoliv), mix them at a ratio of 1: 9, add excipients, Granules having a total antibody content of 0.1% were prepared at a temperature according to a conventional method.

Claims (4)

食物中の動物由来のＩＩ型コラーゲン又は細菌内毒素の消化管からの体内移行によって誘導される関節リウマチの発症を予防するための経口投与用組成物であって、
免疫される動物種に対して異種由来のＩＩ型コラーゲンを含む抗原を家畜動物に接種して免疫し、産生した抗ＩＩ型コラーゲン抗体を該家畜動物から分離する工程、及び／又は
該細菌内毒素を含む抗原を家畜動物に接種して免疫し、産生した抗細菌内毒素抗体を該家畜動物から分離する工程、
を含む工程により得られた抗ＩＩ型コラーゲン抗体及び／又は抗細菌内毒素抗体を有効成分とする、
関節リウマチを予防するための経口投与用組成物。 A oral group forming compounds to prevent the onset of rheumatoid arthritis induced by the body shifts from the gastrointestinal tract of type II collagen or bacterial endotoxins from animals in food,
A step of inoculating and immunizing a livestock animal with an antigen containing type II collagen derived from a heterologous animal species, and / or separating the produced anti-type II collagen antibody from the domestic animal, and / or the bacterial endotoxin Inoculating a livestock animal with an antigen containing the antibacterial endotoxin antibody produced from the livestock animal,
An anti-type II collagen antibody and / or anti-bacterial endotoxin antibody obtained by a process comprising
For oral administration sets composition as to prevent rheumatoid arthritis. 前記抗ＩＩ型コラーゲン抗体が、抗ニワトリＩＩ型コラーゲン抗体、抗ウシＩＩ型コラーゲン抗体、抗ブタＩＩ型コラーゲン抗体の少なくともいずれかである請求項１に記載の関節リウマチを予防するための経口投与用組成物。 2. The oral administration for preventing rheumatoid arthritis according to claim 1, wherein the anti-type II collagen antibody is at least one of anti-chicken type II collagen antibody, anti-bovine type II collagen antibody, and anti-pig type II collagen antibody . set Narubutsu. 前記抗ＩＩ型コラーゲン抗体と前記抗細菌内毒素抗体を任意の割合で混合された請求項１又は２に記載の関節リウマチを予防するための経口投与用組成物。 Wherein said anti-type II collagen antibody with the oral administration group composition as to prevent rheumatoid arthritis according antibacterial endotoxin antibodies to claim 1 or 2 were mixed at an arbitrary ratio. 前記抗ＩＩ型コラーゲン抗体および前記抗細菌内毒素抗体の少なくともいずれかを含有し、総抗体量として０．１質量％以上を含有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の関節リウマチを予防するための経口投与用組成物。 The rheumatoid arthritis according to any one of claims 1 to 3, which contains at least one of the anti-type II collagen antibody and the anti-bacterial endotoxin antibody, and contains 0.1% by mass or more as a total antibody amount. for oral administration sets composition as to prevent.