JP4907767B2 - ポリペプチド - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、被検者に抗腫瘍免疫治療応答を誘発するに有用な、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に関する。特に、本発明は、免疫治療における５Ｔ４抗原およびその使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
多くの癌胎児性抗原または腫瘍関連抗原（tumour-associated antigen; ＴＡＡ）が、ヒトおよび動物の腫瘍で同定され特徴づけられている。一般に、ＴＡＡは、成体の細胞でダウンレギュレートされ、胎児発生中に発現される抗原であり、従って、成体では通常は存在しないかまたは非常に低いレベルでしか存在しない。腫瘍細胞は、ＴＡＡの発現を再開することが観察されており、それ故、腫瘍診断、ターゲッティングおよび免疫療法におけるＴＡＡの適用が示唆されている。
【０００３】
特に、Ｔ細胞により認識される腫瘍抗原が近年クローニングされたことにより、抗原特異的癌ワクチンの開発にかなりの関心が集まった。しかし、多くの腫瘍関連抗原は、変異を起こしていない、免疫原性の低い組織分化抗原である。その弱い免疫原性は、自己寛容に起因し得る。従って、免疫応答を発生させるに適した抗原性ペプチドとして示されることはほとんどない。
【０００４】
これにも関わらず、いくつかの腫瘍関連抗原が、多くの個体において常に腫瘍に関連していることが判明する。かかる抗原は、ワクチンに使用するのに特に魅力的な候補である。それらは、黒色腫分化抗原（melanoma differentiation antigen; ＭＤＡ）、Ｔリンパ球により認識される黒色腫抗原、並びに、ＭＡＧＥファミリーの数個のタンパク質を含む。しかし、現在までに得られた臨床試験の結果により示されるように、これらの抗原に対する治療Ｔ細胞を誘導することは極めて困難であることが判明した。多くの腫瘍抗原に対するヒト免疫系の見かけ上の低応答性の１つの理由は、それらが正常で、変異を起こしていない、自己のものであるというものであり得る。
【０００５】
従って、非変異自己細胞抗原を使用した、腫瘍免疫療法アプローチの適用への、主な障壁は、前記抗原に対する寛容性の破壊のようである。例えば、ネズミポックスウイルス組換え体により発現されるネズミ透明帯抗原は、マウスに不妊を誘導できた。これらのデータにより、自己抗原を発現している組換えポックスウイルスを使用して寛容性を破壊することは可能であるが、確立された腫瘍の活発な治療が可能となるようにその効力を最適化する必要が依然としてある。
【０００６】
ＴＡＡ ５Ｔ４（ＷＯ第８９／０７９４７号参照）は、十分に特徴づけられている。それは、癌に広く発現されているが、正常な成体組織では非常に限定された発現パターンを有する、７２ｋＤａの糖タンパク質である（表１参照）。それは結腸直腸癌および胃癌の転移に強く関連しているようである。ヒト５Ｔ４の全核酸配列はである（Ｍｙｅｒｓ等、１９９４ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １６９：９３１９〜２４）。
【０００７】
【表１】

（Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａ等、Ｅｕｒ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １９９８年６月；１０（６）：４７９〜８４；Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａ等、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９４年５月；６９（５）：８９９〜９０２；Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａ等、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９２年１１月；６６（５）：８６７〜９）
【０００８】
５Ｔ４は、腫瘍進行および転移能の機構に関与している可能性があるので、マーカーとして提案されているが（Ｃａｒｓｂｅｒｇ等、（１９９６）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９６年９月２７；６８（１）：８４〜９２）、５Ｔ４は、免疫治療剤としての使用には提案されていない。５Ｔ４（これ自体は、成体組織に限定的に発現されている）に対する免疫寛容の破壊は、実証されていない。従って、５Ｔ４が癌に対する免役療法の効果的な抗原であり得るかは予測できない。
【０００９】
（発明の概要）
成功裡の治療結果が達成される場合、癌処置に対する免疫治療アプローチは、多くの因子に依存する。これらは、細胞毒性Ｔリンパ球（cytotoxic T-lymphocyte;ＣＴＬ）応答誘発能、抗体応答誘発能、および重要なことには、被検者の免疫寛容破壊能を含む。被検者を５Ｔ４で免疫化することにより、上記により判断して成功裡の免疫治療応答が得られる。特に、５Ｔ４による免疫化は、抗体応答を誘発することが示された。
【００１０】
従って、本発明は、５Ｔ４抗原をコードする核酸を発現しているウイルスベクターを提供する。
【００１１】
被検者における５Ｔ４抗原の発現は、免疫治療抗腫瘍応答の誘発に効果的である。好ましくは、ウイルスベクターは、発現抗原に対するＣＴＬ応答を支持し、有利には、ワクシニアウイルスベクターなどのポックスウイルスベクターである。５Ｔ４抗原の送達に適した、さらなるベクター（ウイルス性および非ウイルス性の両方）を下記する。
【００１２】
本明細書に使用したように、「ベクター」は、宿主細胞に核酸を送達または維持できる任意の物質であり得、ウイルス性ベクター、プラスミド、むき出しの(naked)核酸、ポリペプチドまたは他の分子と複合体を形成した核酸、および、固相粒子上に固定された核酸を含む。かかるベクターは、以下に詳述する。本発明は、その最も広い形態において、５Ｔ４をコードする核酸の送達について任意の特定のベクターに限定しないことが理解される。
【００１３】
本明細書に言及した「核酸」は、天然または合成の、ＤＮＡまたはＲＮＡ、或いはその組合せであり得る。本発明に記載の核酸は、宿主生物の細胞機械により翻訳され得るように、５Ｔ４抗原をコードする機能を果たすことのみにおいて限定される。従って、天然核酸は、例えば、その安定性を増加させるために修飾してよい。ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、しかし特にＲＮＡは、メンバーのヌクレアーゼ抵抗性を向上させるために修飾し得る。例えば、リボヌクレオチドの既知の修飾は、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ＮＨ₂、および２’−Ｏ−アリルを含む。本発明に記載の修飾核酸は、核酸のin vivoでの安定性を増加させるため、その送達を増強または媒介するため、または生体からのクリアランス速度を減少させるために行われた化学的修飾を含み得る。かかる修飾の例は、あるＲＮＡ配列のリボースおよび／またはリン酸および／または塩基位置での化学的置換を含む。例えば、ＷＯ第９２／０３５６８号；米国特許第５，１１８，６７２号；Ｈｏｂｂｓ等、（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：５１３８；Ｇｕｓｃｈｌｂａｕｅｒ等（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４：１９３３；Ｓｃｈｉｂａｈａｒｕ等（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：４４０３；Ｐｉｅｋｅｎ等、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３１４（この各々は、特に本明細書に参照することにより組み込まれる）参照。
【００１４】
５Ｔ４抗原は、５Ｔ４をコードする核酸の翻訳および所望により転写の結果として、宿主生物の細胞に産生されることにより、本発明に従って「発現」される。従って、５Ｔ４はin situで細胞に産生される。５Ｔ４は、膜貫通タンパク質であるので、その細胞外部分は、産生される細胞の表面に提示される。それ故、必要であれば、「発現」なる語は、細胞表面上に提示され、宿主免疫系と相互作用できるように、５Ｔ４の正しいプロセシングを確実にするための、必要なシグナルの供給を含む。
【００１５】
本明細書に使用したように、「ポリペプチド」はポリマーを意味し、ここで、モノマーはアミノ酸であり、ペプチドまたはジスルフィド結合により共に連結している。「ポリペプチド」は、天然アミノ酸鎖の全長またはその断片（例えば結合相互作用に関与する選択した領域のポリペプチド）、或いは合成アミノ酸鎖、或いはその組合せを意味する。従って、「その断片」は、長さ約８〜約５００アミノ酸、好ましくは約８〜約３００アミノ酸、より好ましくは約８〜約２００アミノ酸、さらにより好ましくは約１０〜約５０または１００アミノ酸の、ポリペプチド全長の一部であるアミノ酸配列を意味する。さらに、天然アミノ酸以外のアミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンも含まれ得る。遺伝子によりコードされていない頻繁に見られるアミン酸も本発明に使用し得る。
【００１６】
５Ｔ４抗原は、５Ｔ４として知られるポリペプチドであり、例えば、ＷＯ第８９／０７９４７号に特徴づけられている。好ましい態様において、５Ｔ４は、Ｍｙｅｒｓ等同書により特徴づけられたヒト５Ｔ４であり、その配列は、ＧｅｎＢａｎｋの寄託番号Ｚ２９０８３に示される配列であり、本明細書では配列番号１として示す。しかし、本発明は、本明細書の配列番号３に示したイヌ５Ｔ４および本明細書の配列番号２に示したマウス５Ｔ４（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＪ０１２１６０）を含む、５Ｔ４の種および対立遺伝子変異、並びに、断片、好ましくは、別個のエピトープ、および、５Ｔ４の抗原性を保持した、アミノ酸の挿入、欠失または置換を含む、その変異体を含む。かかる断片および変異体は、以下に、より詳しく記載する。
【００１７】
第二の態様において、本発明は、修飾５Ｔ４抗原に関する。本明細書に使用した「修飾」抗原は、先端を切断するか、伸長するか、またはさもなくば変異し、よって天然５Ｔ４とは異なる５Ｔ４ポリペプチドである。５Ｔ４から得られるペプチド断片は、５Ｔ４特異的抗原性決定基として機能できることが判明した。かかるペプチドは、ＨＬＡ分子に結合でき、被検者において野生型５Ｔ４に対するＣＴＬ応答を、しばしば全長５Ｔ４よりも効率的に誘導できる。さらに、５Ｔ４ペプチドは、アミノ酸の挿入、欠失または置換により変異させることができ、変異ペプチドは、有利には、ＨＬＡにさらにより効率的に結合し、被検者にさらにより強力なＣＴＬ応答を誘発する。ペプチドは任意の長さであり得るが、有利には長さ５〜２５アミノ酸、好ましくは６〜１５アミノ酸、有利には約９アミノ酸である。
【００１８】
修飾ペプチドは、有利には、５Ｔ４のＨＬＡ ＣＴＬエピトープである。かかるエピトープの修飾は、ｈｔｔｐ：ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｏｌｂｉｏ／ｋｅｎ ｐａｒｋｅｒ ｃｏｍｂｏｆｏｒｍで見出し得る、Ｋ．Ｐａｒｋｅｒ（ＮＩＨ）により発明されたプログラム「ペプチド結合予測」を使用して導いた、より効率的なＣＴＬ誘導についての予測に基づき実施し得る（Ｐａｒｋｅｒ，Ｋ．Ｃ等、１９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３も参照）。
【００１９】
好ましい態様において、「修飾」５Ｔ４ペプチドは、免疫応答誘発能を増加させるために、輸送ペプチドまたはアジュバントに結合またはさもなくば会合させたペプチドを含む。例えば、ＨＬＡに効率的に輸送し、ＨＬＡ分子と相互作用させて、ＣＴＬエピトープを増強させるための、ＴＡＰ独立的輸送体ペプチドに、ペプチドを融合させ得る（論評についてはＹｅｗｄｅｌｌ等、１９９８ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２１：１２７〜３１；Ｆｕ等、（１９９８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：１４６９〜８１参照）。
【００２０】
第三の態様において、本発明は、被検者を、５Ｔ４抗原をコードする核酸により免疫化し、被検者において５Ｔ４抗原を発現させるステップを含む、被検者に免疫応答を誘発する方法を提供する。
【００２１】
記載したように、５Ｔ４を発現している核酸により免疫化することによって、免疫応答が誘発される。免疫化は、抗原を含む「初回刺激」物質を投与し、次いで、追加の抗原を含む第二の物質、すなわち「ブースター」物質（これは、初回刺激物質で効率的に初回刺激を受けた後に免疫系に投与される）を投与して誘発し得る。
【００２２】
免疫化に使用したベクターは、任意のベクター（ウイルス性または非ウイルス性）であり得る。使用した５Ｔ４抗原は、全長５Ｔ４であってもそのペプチドであっても、修飾され得、相同起源（すなわち被検者と同じ種から得られる）または異種起源であり得る。
【００２３】
好ましくは、誘発された免疫応答は、５Ｔ４特異的である細胞毒性Ｔリンパ球の活性化に関与するＣＴＬ応答である。
【００２４】
有利には、応答は、被検者の腫瘍を阻害、停止または逆転させるに効果的な、抗腫瘍免疫治療応答である。
【００２５】
第四の態様において、本発明は、被検者の腫瘍を免疫治療するための組成物の調製における５Ｔ４抗原の使用を提供する。
【００２６】
有利には、５Ｔ４抗原での免疫化は、被検者の５Ｔ４に対する免疫寛容を破壊できる。
【００２７】
第五の態様によると、本発明は、５Ｔ４抗原を含むワクチン組成物を提供する。ワクチン組成物は、相同５Ｔ４抗原、異種５Ｔ４抗原または変異５Ｔ４抗原を含み得る。
【００２８】
５Ｔ４抗原含有ワクチンは、５Ｔ４をコードする核酸の同じ目的での使用に類似した様式で、腫瘍に対して免疫化したり、腫瘍を治療するのに有用である。有利には、ワクチン組成物は１つ以上のアジュバントを含む。
【００２９】
第六の態様において、本発明は、５Ｔ４抗原をコードする発現ベクターを含み、このベクターは、５Ｔ４の発現およびワクチン組成物への使用に適した５Ｔ４抗原の産生に有用である。ベクターは、原核生物ベクターでも真核生物ベクターでもよく、有利には、哺乳動物細胞で５Ｔ４を発現できるベクターである。
【００３０】
５Ｔ４抗原は、任意の起源に由来し得、例えば、本明細書に示したような修飾５Ｔ４抗原であり得る。
【００３１】
第七の態様において、本発明は、被検者の免疫化のための組成物の調製における５Ｔ４抗原の使用を提供する。５Ｔ４を使用した免疫化は、被検者に、本発明の第五の態様に記載の免疫学的に有効量のワクチン組成物を投与することを含む。
【００３２】
第八の態様において、本発明は、被検者の避妊のための組成物の調製における５Ｔ４抗原の使用を提供する。５Ｔ４抗原の投与は、被検者の避妊を引き起こすのに有効であり得る。好ましくは、被検者は女性被検者である。
【００３３】
本発明はさらに、５Ｔ４ターゲッティング分子、例えば抗５Ｔ４抗体、例えば抗５Ｔ４ｓｃＦｖｓの使用に関する。これらの抗体は、（ｉ）天然または外来性５Ｔ４をin situで標的とし、および／または（ｉｉ）Ｂ７．１などの免疫増強分子を、天然または外来性５Ｔ４にin situで送達するために使用し得る（Ｃａｒｒｏｌｌ等（１９９８）Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９０（２４）：１８８１〜７）。これにより、被検者の５Ｔ４の免疫原性は増強する。本発明はまた、５Ｔ４抗原をコードするベクターおよび抗５Ｔ４抗体、例えば抗５Ｔ３ｓｃＦｖｓの連続的使用に関する。抗５Ｔ４ｓｃＦｖ抗体は、コード配列を含む発現ベクター（これはウイルス性でも非ウイルス性でもよい）中で、抗体をコードするむき出しのＤＮＡ（例えば、コードＤＮＡを、その産生を制御する短いプロモーター領域と共に含むプラスミド中）として、またはタンパク質形で投与し得る。従って、本発明は、５Ｔ４抗原をコードするベクター、および、腫瘍の処置に、別々に、例えば連続的に使用するための、免疫刺激分子と所望により融合した５Ｔ４に結合できる物質を提供する。
【００３４】
さらなる実施形態において、本発明は、酵素／プロドラッグ療法および５Ｔ４を用いた免疫治療を含む組合せ療法を包含する。例えば、酵素／プロドラッグ療法は、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用して所望により送達される、Ｐ４５０の腫瘍内または全身送達、およびシクロホスファミド（ＣＰＡ）を含み得、次いで、５Ｔ４により全身免疫治療誘導を行う。
【００３５】
従って、本発明はさらに、腫瘍の処置のために、別々に、同時に別々に、または組合せて使用するための、５Ｔ４抗原をコードするベクター、プロドラッグ／酵素の組合せに関する。
【００３６】
さらなる実施形態において、５Ｔ４または５Ｔ４ペプチドを、Ｂ型肝炎コア抗原に融合させて、Ｔヘルパーおよび抗体応答を増強し得る（Ｓｃｈｏｄｅｌ等、１９９６ Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ３９：１０４〜１０）。
【００３７】
それ故、本発明の第九の態様に従って、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする核酸配列を含む、少なくとも１つの免疫回避遺伝子が欠失した、組換えポックスウイルスベクターが提供される。
【００３８】
ＴＡＡは、免疫原性が弱く、免疫系により「自己」として認識され、従ってかなり寛容性である。ポックスウイルスベクターの使用により、この寛容性が少なくとも一部克服できるように、抗原を提示させることができるが、ほとんどのポックスウイルスベクターで観察された免疫原性効果は限られている。ポックスウイルスに天然に存在する免疫回避遺伝子の欠失が、ＴＡＡを用いたワクチン接種に有利な効果を及ぼし得ると考えられる。免疫回避遺伝子の欠失したポックスウイルスベクターは、ＴＡＡを含む、コードされた自己抗原に対する免疫寛容を破壊し得、従って、宿主は、免疫原性の弱い抗原または他の自己抗原に対する免疫応答を生じることができる。
【００３９】
第十の態様において、本発明は、哺乳動物に、本発明の第九の態様に記載の組換えポックスウイルスベクターを投与し、それにより哺乳動物においてＴＡＡに対する免疫応答を誘発させることを含む、哺乳動物において免疫応答を誘発する方法を提供する。
【００４０】
被検者に保護または治療効果を提供するために、ＴＡＡなどの抗原は、ＣＴＬ応答の発生に依拠することが知られているが、これは、ＭＨＣＩ経路を介した抗原のプロセシングに依存する。長期抗原発現は、高レベルで長期のＣＴＬ期間をもたらすと考えられる。本発明の第十一の態様において、被検者において抗原に対するＣＴＬ応答を増強させるために、溶解活性の減少したポックスウイルスが提供される。
【００４１】
第十二の態様において、本発明は、ＴＡＡに対する哺乳動物の免疫応答を誘発させるための、本発明の第九または第十一の態様に従った組換えポックスウイルスベクターの使用を提供する。
【００４２】
第十三の態様において、本発明は、免疫療法において腫瘍関連標的として使用するための５Ｔ４抗原を提供する。
【００４３】
第十四の態様において、本発明は、弱い免疫原に対する哺乳動物の免疫寛容を破壊し、さらに免疫応答を誘発するために、弱い免疫原をコードする核酸配列を含む、少なくとも１つの免疫回避遺伝子の欠失または変異した組換えポックスウイルスベクターの使用を提供する。
【００４４】
本発明の他の態様は、上述の特許請求の範囲および以下の説明および議論に提示される。これらの態様は、別々の章の冒頭に提示する。しかし、各章冒頭の教義は、その特定の章の冒頭に必ずしも限定されないことを理解されたい。
【００４５】
（発明の詳細な説明）
５Ｔ４抗原の送達または発現のためのベクター
本発明に記載の５Ｔ４ポリペプチドは、ウイルス性または非ウイルス性技法により送達できる。
【００４６】
非ウイルス性送達系は、ＤＮＡトランスフェクション法を含むが、これに限定されない。ここで、トランスフェクションは、標的哺乳動物細胞に５Ｔ４遺伝子を送達するための非ウイルスベクターを使用したプロセスを含む。
【００４７】
典型的なトランスフェクション法は、電気穿孔法、核酸微粒子銃、脂質媒介トランスフェクション、圧縮核酸により媒介されるトランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、カチオン性物質媒介、カチオン面両親媒性物質（ＣＦＡ）（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９６ １４；５５６）、多価カチオン、例えばスペルミン、カチオン性脂質またはポリリジン、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）−コレステロール複合体（ＷｏｌｆｆおよびＴｒｕｂｅｔｓｋｏｙ １９９８ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：４２１）およびその組合せを含む。
【００４８】
ウイルス送達系は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはバキュロウイルスベクター、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、ポックスウイルス、例えばカナリア痘ウイルス（Ｔａｙｌｏｒ等 １９９５ Ｖａｃｃｉｎｅ １３：５３９〜５４９）、エントモ痘ウイルス（Ｌｉ Ｙ等 １９９８ 第１２回国際ポックスウイルスシンポジウム、１４４項、要約）、ペンギン痘（Ｓｔａｎｄａｒｄ等 Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ １９９８ ７９：１６３７〜４６）アルファウイルス、およびアルファウイルスをベースとしたＤＮＡベクターを含むが、これらに限定されない。
【００４９】
レトロウイルスの例は、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス哺乳動物腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤浪肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲネズミ骨肉種ウイルス（ＦＢＲＭＳＶ）、モロニーネズミ肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、アベルソンネズミ白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄球腫症ウイルス−２９（ＭＣ２９）、およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）を含むがこれに限定されない。
【００５０】
レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ等（「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」１９９７ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ７５８〜７６３項）に見出し得る。
【００５１】
レンチウイルスは、霊長類および非霊長類群に分類できる。霊長類レンチウイルスの例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト自己免疫不全症呼応群（エイズ）の病因、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含むがこれに限定されない。非霊長類レンチウイルス群は、プロトタイプ「スローウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、並びに、関連ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）およびより近年に記載されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）を含むがこれに限定されない。
【００５２】
レンチウイルスファミリーと他の種類のレトロウイルスの間の差異は、レンチウイルスが、***および非***細胞の両方を感染できることである（Ｌｅｗｉｓ等 １９９２ ＥＭＢＯ．Ｊ １１：３０５３〜３０５８；ＬｅｗｉｓおよびＥｍｅｒｍａｎ １９９４ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：５１０〜５１６）。これに対し、他のレトロウイルス（例えばＭＬＶ）は、例えば、筋肉、脳、肺および肝組織を構成する細胞などの非***細胞を感染できない。
【００５３】
本発明のベクターは、スプリット−イントロンベクターとして捉え得る。スプリット−イントロンベクターは、ＰＣＴ特許出願ＷＯ第９９／１５６８３号および第ＷＯ９９／１５６８４号に記載される。
【００５４】
アデノウイルスの特性が、レトロウイルス／レンチウイルスの遺伝的安定性と合わせられた場合、本質的に、アデノウイルスを使用して、標的細胞を形質導入し、隣接細胞を安定に感染できる一過性レトロウイルス産生細胞とすることができる。５Ｔ４抗原を発現するように操作した前記レトロウイルス産生細胞は、血管新生および／または癌の処置に使用するために、動物またはヒトなどの生物に移植できる。
【００５５】
ポックスウイルスベクター
ポックスウイルスベクターが、本発明の使用に好ましい。ポックスウイルスは、組換え遺伝子発現のためにおよび組換え生ワクチンとして使用するために操作される。これは、外来抗原をコードする核酸を、ポックスウイルスのゲノムに導入するための組換え技法の使用を包含する。ウイルスの生活環に必須でないウイルスＤＮＡ中の部位に核酸を組込むと、新規に産生された組換えポックスウイルスは感染性となることができ、すなわち、外来細胞を感染でき、よって、組込みＤＮＡ配列を発現することができる。このように調製された組換えポックスウイルスは、病理学的および感染性疾病の予防および／または処置の生ワクチンとして使用できる。
【００５６】
ワクシニアウイルスなどの組換えポックスウイルスにおける５Ｔ４の発現は、ワクシニアプロモーターの、５Ｔ４をコードする核酸への連結を必要とする。プラスミドベクター（挿入ベクターとも称される）が、ドナープラスミドの核酸にフランキングするウイルス配列と、親ウイルスに存在する相同的配列の間の相同的組換えにより、核酸をワクシニアウイルスに挿入するために構築された（Ｍａｃｋｅｔｔ等 １９８２ ＰＮＡＳ ７９：７４１５〜７４１９）。ある種類の挿入ベクターは、（ａ）転写開始部位を含むワクシニアウイルスプロモーター；（ｂ）核酸の挿入のための転写開始部位の下流に位置する数個の独特の制限エンドヌクレアーゼクローニング部位；（ｃ）ウイルスゲノムの相同的非必須領域への挿入を指示するプロモーターにフランキングする非必須ワクシニアウイルス配列（例えばチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子）、および核酸のクローニング部位；および（ｄ）Ｅ．Ｃｏｌｉ中で複製および選択するための、複製細菌起源および抗生物質耐性マーカーを含んでなる。前記ベクターの例は、Ｍａｃｋｅｔｔにより記載される（Ｍａｃｋｅｔｔ等 １９８４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：８５７〜８６４）。
【００５７】
挿入すべき核酸を含む単離プラスミドを、細胞培養液（例えばヒヨコ胚繊維芽細胞）に、親ウイルス（例えばポックスウイルス）と共にトランスフェクトする。プラスミドおよびウイルスゲノムのそれぞれの相同的ポックスＤＮＡ間の組換えにより、プロモーター−遺伝子構築物をそのゲノムのウイルス生存性に影響を及ぼさない部位に存在させることによって、修飾された組換えポックスウイルスが得られる。
【００５８】
上記のように、核酸を、得られた組換えウイルスのウイルス生存性に影響を及ぼさないウイルス中の領域（挿入領域）に挿入する。ウイルス中のかかる領域は、例えば、ウイルスＤＮＡのセグメントを、組換え体のウイルス生存性に重度の影響を及ぼすことなく組換え体の形成を可能とする領域について無作為に試験することにより容易に同定できる。容易に使用でき多くのウイルスに存在する１つの領域は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子である。例えば、ＴＫ位は、調べた全てのポックスウイルスゲノムに見られた［レポリポックスウイルス：Ｕｐｔｏｎ等 Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６０：９２０（１９８６）（ショープ繊維腫ウイルス(shope fibroma virus)）；ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ：Ｇｅｒｓｈｏｎ等 Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５２５（１９８９）（ケニアヒツジ−１）；オルソポックスウイルス：Ｗｅｉｒ等 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ４６：５３０（１９８３）（ワクシニア）；Ｅｓｐｏｓｉｔｏ等 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １３５：５６１（１９８４）（サル痘および痘瘡ウイルス）；Ｈｒｕｂｙ等 ＰＮＡＳ、８０：３４１１（１９８３）（ワクシニア）；Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ等 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４３：３９９（１９８５）（ヤバサル腫瘍ウイルス）；アビポックスウイルス：Ｂｉｎｎｓ等 Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ ６９：１２７５（１９８８）（鶏痘）；Ｂｏｙｌｅ等 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５６：３５５（１９８７）（鶏痘）；Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｉｎ等 Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ、２０：３４１（１９８８）（鶏痘、うずら痘）；エントモポックス（Ｌｙｔｖｙｎ等 Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ ７３：３２３５〜３２４０（１９９２）］。
【００５９】
ワクシニアでは、ＴＫ領域に加えて、他の挿入領域は、例えばＨｉｎｄＩＩＩＭを含む。
【００６０】
鶏痘では、ＴＫ領域に加えて、他の挿入領域は、例えば、ＢａｍＨＩＪ［Ｊｅｎｋｉｎｓ等 ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ７：９９１〜９９８（１９９１）］ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、ＢａｍＨＩ断片、ＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、ＢａｍＨＩ断片およびＥＰＯ出願番号０３０８２２０Ａ１に示したＨｉｎｄＩＩＩ断片を含む［Ｃａｌｖｅｒｔ等 Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ ６７：３０６９〜３０７６（１９９３）；Ｔａｙｌｏｒ等 Ｖａｃｃｉｎｅ ６：４９７〜５０３（１９８８）；Ｓｐｅｈｎｅｒ等（１９９０）およびＢｏｕｒｓｎｅｌｌ等 Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ ７１：６２１〜６２８（１９９０）］。
【００６１】
豚痘では、好ましい挿入部位は、チミジンキナーゼ遺伝子領域を含む。
【００６２】
プロモーターは、宿主および標的細胞型に応じて容易に選択できる。例えば、ポックスウイルスでは、ワクシニア７．５Ｋ、または４０Ｋまたは鶏痘Ｃ１などの、ポックスウイルスプロモーターを使用すべきである。適切なポックス配列を含む人工構築物も使用できる。エンハンサーエレメントも、発現レベルを増加させるために組合せて使用できる。さらに、誘導プロモーター（これも当分野で公知である）の使用がいくつかの実施形態において好ましい。
【００６３】
外来遺伝子発現は、酵素的または免疫学的アッセイ（例えば免疫沈降法、ラジオイムノアッセイ、またはイムノブロット）により検出できる。組換えワクシニア感染細胞から産生された天然膜糖タンパク質はグリコシル化され、細胞表面に輸送され得る。高発現レベルが、強力なプロモーターの使用により得ることができる。
【００６４】
ワクチンに使用するウイルスベクターの他の必要条件は、良好な免疫原性および安全性を含む。ＭＶＡは、良好な安全記録をもつ複製欠陥ワクシニア株である。ほとんどの細胞型および正常ヒト組織において、ＭＶＡは複製しない。ＭＶＡの複製は、ＢＨＫ２１細胞などの数個の形質転換細胞型で観察される。Ｃａｒｒｏｌｌ等（１９９７）は、組換えＭＶＡは、保護ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の発生において従来の組換えワクシニアベクターと等しく良好であり、より一般的に使用される複製コンピテントワクシニアウイルスの効果的な代替物である。ＭＶＡから得られるワクシニアウイルス株、またはＭＶＡをワクチンでの使用に特に適したものとするＭＶＡの特性を有する独立的に発達した株も、本発明の使用に適している。
【００６５】
好ましくは、ベクターは、ＭＶＡまたはＮＹＶＡＣなどのワクシニアウイルスベクターである。最も好ましいのは、ワクシニア株修飾ウイルスアンカラ（modified virus ankara; ＭＶＡ）またはそれから得られた株である。ワクシニアベクターの代替物は、ヒト細胞で感染および組換えタンパク質を発現できるが複製できない、ＡＬＶＡＣとして知られる鶏痘またはカナリア痘などのアビポックスベクターおよびそれから得られた株を含む。
【００６６】
本発明の１つの態様において、少なくとも１つの免疫回避遺伝子がポックスウイルスベクターから欠失している。
【００６７】
ウイルス、特に、広いコード能を有し、従って様々な遺伝子をコードできるポックスウイルスなどの大きなウイルスが、その宿主の免疫系を回避するための多くの技法を発達させてきた。例えば、それらは、補体、インターフェロンなどの非特異的防御および免疫応答を回避でき、並びに、サイトカインの機能を妨害または遮断できる。左末端領域のインターフェロン抵抗性遺伝子を除く、多くのこれらの免疫回避ポリペプチドが、ＭＶＡから欠失している。
【００６８】
一般に、ポックスウイルスは、大きなＤＮＡウイルスであり、潜伏感染ではなく急性感染を確立する。それらは、大変多くの抗原性タンパク質をコードするので、抗原変異体は困難であり、従って、哺乳動物免疫系からそれ自体を保護する活動的免疫回避に依拠する。それらは、免疫系の多くの態様の妨害に関与するポリペプチドをコードする遺伝子を多く有する。それらはインターフェロン作用を破壊し、補体、サイトカイン活性、炎症応答およびＣＴＬ認識を妨害する（論評については、Ｓｍｉｔｈ等、（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １５９：１３７〜１５４）。これらのタンパク質の除去は、被検者に免疫応答を誘発させるために、ポックスウイルスベクター上にコードされた弱い免疫原の能力を促進するのに有利である。
【００６９】
免疫回避遺伝子またはポリペプチドは、ウイルスが哺乳動物免疫系を回避するのを補助する、遺伝子またはその産物である。好ましくは、遺伝子または遺伝子産物は、免疫系の作動を少なくとも１つのレベルにおいて妨害する。これは、可溶性サイトカイン受容体擬似物等を提供することにより、シグナル伝達分子の競合物質を提供することにより、シグナル伝達経路を妨害することなどにより、多くの方法で達成され得る。
【００７０】
免疫回避遺伝子は、以下を含むがこれに限定されない。
インターフェロン回避遺伝子。ワクシニアは、ＩＦＮ作用を妨害する、少なくとも３つの遺伝子を有する。Ｅ３Ｌ遺伝子は、Ｐ１の活性化、ｅＩＦ２αのリン酸化、および結果として翻訳開始複合体の会合を不可能にする事象である、Ｐ１プロテインキナーゼの二本鎖ＲＮＡへの結合を競合する、２５Ｋｄポリペプチドを発現する。この経路は、普通、ＩＦＮ活性化に応答性であるが、Ｅ３Ｌ発現により妨害され、従って翻訳開始が妨害されずに進行できる。
【００７１】
Ｋ３Ｌ遺伝子は、１０．５Ｋｄポリペプチドを発現し、これもＰ１活性を妨害する。なぜなら、効率的なｅＩＦ２α擬似体であり、Ｐ１プロテインキナーゼの競合物質として作用するからである。従って、その作用機構は、Ｅ３Ｌに類似している。
【００７２】
Ａ１８Ｒ遺伝子は、ヘリカーゼをコードしていると予測され、これは２’，５’−オリゴアデニレート経路を妨害するようであり、これは次いでＩＦＮ応答性である。２’，５’−Ａは、ＲＮＡｓｅＬを活性化し、これはウイルス翻訳を防ぐように作用する。Ａ１８Ｒの発現は、感染細胞において２’，５’−Ａレベルを減少させるようである。
【００７３】
補体。ワクシニアのＢ５Ｒ遺伝子産物は、別の補体経路の調節因子である、Ｈ因子に高度に関連していることが知られる。この経路は、古典的経路とは異なり、抗原のみにより活性化され得る。従って、Ｂ５Ｒ遺伝子産物は、別の補体経路を妨害し得る。
【００７４】
Ｃ２１Ｌ遺伝子は、次いで、ヒトにおけるＣ４ｂ結合タンパク質に関連し、表面上にＣ４ｂを有する細胞と相互作用し、ＣＲ１補体受容体への結合を防ぐ。
【００７５】
可溶性サイトカイン受容体。ワクシニアＷＲ Ｂ１５Ｒ遺伝子産物（コペンハーゲンワクシニア株のＢ１６Ｒ）は、ＩＬ−１βの受容体であるＩＬ１−Ｒに関連する。
【００７６】
コペンハーゲンワクシニア株のＡ５３Ｒである、ＷＲ遺伝子ＯＲＦ ＳａｌＦ１９Ｒは、ＴＮＦ受容体をコードする。しかし、野生型ウイルスでは、これらの両方の遺伝子が、ＯＲＦの断片化により不活性であると考えられる。
【００７７】
Ｂ８Ｒ遺伝子は、可溶性ＩＦＮ−γ受容体をコードすると考えられ、ウイルスに、さらに別のＩＦＮ回避機序を与える。
【００７８】
炎症。多くの遺伝子が、ウイルス感染に対する炎症応答の防止に関与すると考えられる。これらは、Ａ４４Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｂ１３ＲおよびＢ２２Ｒを含む。
【００７９】
本発明の１つの態様において、大半の免疫回避遺伝子が、組換えポックスウイルスベクターから欠失している。好ましくは、全ての免疫回避遺伝子が欠失している。従って、本発明の１つの態様において、組換えポックスウイルスベクターは、組換えＭＶＡベクターであり、ここでＫ３Ｌインターフェロン抵抗性タンパク質遺伝子が破壊または欠失している。
【００８０】
好ましいのは、目的の被検者に有害でないポックスウイルスである。従って、例えば、ヒトへの使用には、宿主範囲の限定された（例えば、アビポックスウイルス）またはさもなくば弱毒化された（例えば弱毒化ワクシニア株）（ＮＹＶＡＣおよびＭＶＡを含む）ポックスウイルスが好ましい。最も好ましいのは、弱毒化ワクシニアウイルス株であるが、非ワクシニア株が、既存の天然痘免疫をもつ被検者に有用に使用される。
【００８１】
ＭＶＡゲノム内の天然に生じた欠失、例えば欠失ＩＩに隣接したＭＶＡ ＤＮＡ配列にフランキングされる５Ｔ４をコードする少なくとも１つの核酸を含む構築物を、ＭＶＡで感染させた細胞に導入し、相同的組換えを可能とする。
【００８２】
一旦、構築物が真核細胞に導入され、５Ｔ４ＤＮＡがウイルスＤＮＡと組換えされると、所望の組換えワクシニアウイルスを、好ましくはマーカーにより補助して単離できる（Ｎａｋａｎｏ等 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９、１５９３〜１５９６［１９８２］、Ｆｒａｎｋｅ等 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９１８〜１９２４［１９８５］、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ等 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３４０３〜３４０９［１９８５］、Ｆａｔｈｉ等 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９７〜１０５［１９８６］）。
【００８３】
挿入する構築物は直鎖状でも環状でもよい。環状ＤＮＡ、特にプラスミドが好ましい。構築物は、ＭＶＡゲノム内の天然に生じた欠失、例えば欠失ＩＩの左側および右側にフランキングする配列を含む（Ａｌｔｅｎｂｕｒｇｅｒ，Ｗ、Ｓｕｔｅｒ，Ｃ．Ｐ．およびＡｌｔｅｎｂｕｒｇｅｒ Ｊ．（１９８９）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１０５、１５〜２７）。外来ＤＮＡ配列は、天然に生じた欠失にフランキングする配列間に挿入する。
【００８４】
少なくとも１つの核酸を発現するために、核酸の上流に存在する核酸の転写に必要とされる調節配列が必要である。かかる調節配列は、当業者には公知であり、例えば、ＥＰ−Ａ−１９８，３２８に記載したワクシニア１１ｋＤａ遺伝子の、および７．５ｋＤａ遺伝子（ＥＰ−Ａ−１１０，３８５）の調節配列を含む。
【００８５】
構築物は、トランスフェクションにより、例えばリン酸カルシウムチン沈降法により、（Ｇｒａｈａｍ等 Ｖｉｒｏｌ．５２、４５６〜４６７［１９７３；Ｗｉｇｌｅｒ等 Ｃｅｌｌ ７７７〜７８５［１９７９］）、電気穿孔法により（Ｎｅｕｍａｎｎ等 ＥＭＢＯ Ｊ．１、８４１〜８４５［１９８２］）、マイクロインジェクションにより（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ等 Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１、４８２〜４９２（１９８３））、リポソームにより（Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ等 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１、５１２〜５２７（１９８３））、スフェロプラストにより（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７、２１６３〜２１６７（１９８０）、または当業者に公知の他の方法により、ＭＶＡ感染細胞に導入できる。リポソームによるトランスフェクションが好ましい。
【００８６】
本発明の組換え初期刺激およびブースターベクターは、哺乳動物の特異的細胞型に向性を有し得る。例えば、本発明の組換えベクターを操作して、樹状細胞およびマクロファージなどの専門的ＡＰＣを感染できる。樹状細胞は、特に細胞性応答の成功裡の免疫応答の調和物質として知られている。樹状細胞を、抗原または標的抗原を含むウイルスベクターでex vivo処理すると、同系動物またはヒトへの注入時に効果的な免疫応答を誘導することが示されている（Ｎｅｓｔｌｅ ＦＯ等、黒色腫患者の、ペプチドまたは腫瘍溶解パルス樹状細胞を用いたワクチン接種、Ｎａｔ Ｍｅｄ．１９９８年５月；４（３）３２８〜３２およびＫｉｍ ＣＪ．等 ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａをコードするポックスウイルスで感染させた樹状細胞は、in viｔroでＴリンパ球を感作する Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１９９７年７月；２０（４）２７６〜８６参照）。組換えベクターもまた、腫瘍細胞を感染できる。別に、組換えベクターは、哺乳動物の任意の細胞を感染できる。
【００８７】
ベクターの他の例は、電気穿孔法、ＤＮＡ微粒子銃、脂質により媒介されるトランスフェクションおよび圧縮ＤＮＡ媒介トランスフェクションなどのＤＮＡトランスフェクション法を含むがこれに限定されない、ex vivo送達系を含む。
【００８８】
ベクターは、プラスミドＤＮＡベクターであり得る。本明細書に使用したような「プラスミド」は、異種ＤＮＡを、その発現または複製のために、細胞に導入するために使用される別個のエレメントを意味する。かかる媒体(vihycle)の選択および使用は、当業者の技術の十分範囲内である。多くのプラスミドが利用でき、適切なプラスミドの選択は、プラスミドの目的の用途、すなわち、ＤＮＡ増幅またはＤＮＡ発現に使用するか、プラスミドに挿入するＤＮＡのサイズ、およびプラスミドで形質転換する宿主細胞に依存する。各プラスミドは、その機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）および適合性の宿主細胞に応じて様々な成分を含む。プラスミド成分は、一般に、１つ以上の複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結配列およびシグナル配列を含むがこれらに限定されない。
【００８９】
発現プラスミドおよびクローニングプラスミドの両方が、一般に、プラスミドの１つ以上の選択された宿主細胞中での複製を可能とする核酸配列を含む。典型的には、クローニングプラスミドにおいて、この配列は、宿主染色体ＤＮＡに独立的なプラスミドの複製を可能とする配列であり、複製起点または自己複製配列を含む。かかる配列は、様々な細菌、酵母およびウイルスについて公知である。プラスミドｐＢＲ３２２の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適しており、２ｍプラスミド起源は、酵母に適しており、様々なウイルス起源（例えばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス）は哺乳動物細胞でのクローニングプラスミドに適している。一般に、複製起点成分は、ＣＯＳ細胞などの高レベルＤＮＡ複製に適合性の哺乳動物細胞に使用されない場合、哺乳動物発現プラスミドに必要ではない。
【００９０】
ほとんどの発現プラスミドはシャトルプラスミドであり、すなわち、少なくとも１つのクラスの生物で複製できるが、別のクラスの生物に発現のためにトランスフェクトできる。例えば、プラスミドは、Ｅ．Ｃｏｌｉでクローニングされされ、次いで、宿主細胞染色体とは独立的に複製できないが、同プラスミドを酵母または哺乳動物細胞にトランスフェクトする。
【００９１】
有利には、発現プラスミドおよびクローニングプラスミドは、選択マーカーとしても称される選択遺伝子を含み得る。この遺伝子は、選択培養培地中で増殖する形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むプラスミドで形質転換されていない宿主細胞は、培養培地では生存しない。典型的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する抵抗性を付与するか、栄養要求欠損症を補完するか、または複合培地から利用できない重要な栄養分を供給するタンパク質をコードする。
【００９２】
酵母に適切な選択的遺伝子マーカーについては、マーカー遺伝子の表現型発現による形質転換体の選択を容易にする、任意のマーカー遺伝子を使用できる。酵母に適切なマーカーは、例えば、抗生物質Ｇ４１８、ヒグロマイシンまたはブレオマイシンに対する抵抗性を付与するものであるか、または栄養要求性酵母変異体に原栄養性を提供し、例えばＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＴＲＰ１またはＨＩＳ３遺伝子である。
【００９３】
プラスミドの複製は、慣用的には、Ｅ．Ｃｏｌｉで行い、Ｅ．Ｃｏｌｉ遺伝子マーカーおよびＥ．Ｃｏｌｉ複製起点が有利には含まれる。これらは、Ｅ．Ｃｏｌｉ複製起点およびアンピシリンなどの抗生物質に対する抵抗性を付与するＥ．Ｃｏｌｉ遺伝子マーカーの両方を含む、Ｅ．Ｃｏｌｉプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標名）プラスミドまたはｐＵＣプラスミド、例えばｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９から得ることができる。
【００９４】
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーは、５Ｔ４核酸を取り込んだ細胞の同定を可能にするもの、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ、メトトレキサート抵抗性）、チミジンキナーゼ、またはＧ４１８またはヒグロマイシンに対する抵抗性を付与する遺伝子である。哺乳動物細胞形質転換体は、マーカーを取込み発現している形質転換体のみが独特に生存に適合するような選択圧下に置く。ＤＨＦＲまたはグルタミンシンターゼ（ＧＳ）マーカーの場合、選択圧は、形質転換体を、圧力が進行的に増加する条件下で培養することにより課することができ、これにより選択遺伝子および５Ｔ４をコードする連結ＤＮＡの両方が（その染色体組込み部位で）増幅される。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生のために需要の高い遺伝子を、所望のタンパク質をコードし得る密接に関連した遺伝子と共に、組換え細胞の染色体内で直列型で反復するプロセスである。増加量の所望のタンパク質は、通常、かくして増幅したＤＮＡから合成される。
【００９５】
発現プラスミドおよびクローニングプラスミドは、通常、宿主生物により認識されるプロモーターを含み、５Ｔ４核酸に作動可能に連鎖している。かかるプロモーターは、誘導的であっても構成的であってもよい。プロモーターは、制限酵素消化によりＤＮＡ源からプロモーターを取り出し、単離プロモーター配列をプラスミドに挿入することにより、５Ｔ４をコードするＤＮＡに作動可能に連鎖される。天然５Ｔ４プロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方が、５Ｔ４ＤＮＡの増幅および／または発現を指示するために使用し得る。「作動可能に連鎖」なる語は、記載した成分が、その目的の様式でそれらが機能することを可能とする関係にある並置を意味する。コード配列に「作動可能に連鎖した」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合性の条件下で達成されるように連結される。
【００９６】
原核生物宿主に使用するに適したプロモーターは、例えば、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。そのヌクレオチド配列は発表されており、それにより当業者は、任意の必要な制限部位を供給するためにリンカーまたはアダプターを使用して、それらを、５Ｔ４をコードするＤＮＡに作動可能に連結できる。細菌系に使用するプロモーターもまた、一般に、５Ｔ４をコードするＤＮＡに作動可能に連鎖した、シャイン−ダルガーノ配列を含む。
【００９７】
好ましい発現プラスミドは、細菌中で機能できる、ファージまたはＴ７などのバクテリオファージのプロモーターを含む、細菌発現プラスミドである。最も広く使用される発現系の１つにおいて、融合タンパク質をコードする核酸は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによりプラスミドから転写され得る（Ｓｔｕｄｉｅｒ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０〜８９、１９９０）。ｐＥＴプラスミドと共に使用される、Ｅ．ＣｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）宿主株では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、宿主細菌でλ−溶原ＤＥ３から産生され、その発現は、ＩＰＴＧ誘導ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にある。この系は、多くのタンパク質の過剰産生に成功裡に使用されている。別に、ポリメラーゼ遺伝子は、市販されているＣＥ６ファージ（ノバゲン、マジソン、米国）などのｉｎｔ−ファージでの感染により、λファージに導入され得る。他のプラスミドは、ＰＬＥＸ（インビトロゲン、ＮＬ）などのλＰＬプロモーターを含むプラスミド、ｐＴｒｃＨｉｓＸｐｒｅｓｓＴｍ（インビトロゲン）またはｐＴｒｃ９９（ファルマシアバイオテック、ＳＥ）などのｔｒｃプロモーターを含むプラスミド、または、ｐＫＫ２２３−３（ファルマシアバイオテック）またはＰＭＡＬ（ニューイングランドバイオラブズ、ＭＡ、米国）などのｔａｃプロモーターを含むプラスミドを含む。
【００９８】
さらに、本発明に記載の５Ｔ４遺伝子は、好ましくは、細菌宿主からのポリペプチドの分泌を容易にするための分泌配列を含み、封入体によりも可溶性天然ペプチドとして産生される。ペプチドは、細菌細胞膜周辺腔、または培養培地から適宜回収され得る。
【００９９】
酵母宿主に使用するに適切な促進配列は、調節され得るかまたは構成性であり得、好ましくは、高度に発現される酵母遺伝子、特にサッカロミセスセルビシエ遺伝子から得られる。従って、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨ１またはＡＤＨＩＩ遺伝子、酸ホスファターゼ（ＰＨ０５）遺伝子のプロモーター、ａ−またはα−因子をコードする酵母交配フェロモン遺伝子のプロモーター、または、解糖酵素をコードする遺伝子から得られたプロモーター、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼまたはグルコキナーゼ遺伝子、Ｓ．セレビジアエＧＡＬ４遺伝子、Ｓ．ｐｏｍｂｅ ｎｍｔ１遺伝子のプロモーター、またはＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）遺伝子のプロモーターを使用できる。さらに、ある酵母遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）および別の酵母遺伝子の機能的ＴＡＴＡボックスを含む下流プロモーターエレメントを含むハイブリッドプロモーター、例えば、酵母ＰＨ０５遺伝子のＵＡＳ（群）および酵母ＧＡＰ遺伝子の機能的ＴＡＴＡボックスを含む下流プロモーターエレメントを含むハイブリッドプロモーター（ＰＨ０５−ＧＡＰハイブリッドプロモーター）を使用することが可能である。適切な構成性ＰＨ０５プロモーターは、例えば、ＰＨ０５遺伝子のヌクレオチド−１７３で始まりヌクレオチド−９で終るＰＨ０５（−１７３）プロモーターエレメントなどの、上流調節エレメント（ＵＡＳ）のない、短縮された酸ホスファターゼＰＨ０５プロモーターである。
【０１００】
哺乳動物宿主でのプラスミドからの５Ｔ４遺伝子の転写は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスゲノムから得られるプロモーター、アクチンプロモーターなどの異種哺乳動物プロモーターまたはリボソームタンパク質プロモーターなどの非常に強力なプロモーターから、および、５Ｔ４配列と正常に会合したプロモーターにより制御され得、ただし、かかるプロモーターは、宿主細胞系に適合性である。
【０１０１】
高等真核生物による５Ｔ４をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をプラスミドに挿入することにより増加させ得る。エンハンサーは、比較的に配向および位置独立的である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が知られている（例えばエラスターゼおよびグロビン）。しかし、典型的には、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。例は、複製起点の後部側上のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）およびＣＭＶ初期プロモーターエンハンサーを含む。エンハンサーは、５Ｔ４ＤＮＡの５’または３’の位置のプラスミドにスプライスされ得るが、好ましくはプロモーターの５’部位に位置する。
【０１０２】
有利には、５Ｔ４をコードする真核生物発現プラスミドは、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）を含み得る。ＬＣＲは、宿主細胞染色質に組込まれた導入遺伝子の高レベルの組込み部位独立的発現を指示でき、これは、５Ｔ４遺伝子を、プラスミドの染色体組込みが起こった永久にトランスフェクトされた真核細胞系に関連して、遺伝子療法に適用するために設計されたプラスミドで、またはトランスジェニック動物で発現させたい場合には特に重要である。
【０１０３】
真核生物発現プラスミドはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。かかる配列は、真核生物またはウイルスＤＮＡ若しくはｃＤＮＡの５’および３’非翻訳領域から一般に得られる。これらの領域は、５Ｔ４をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
【０１０４】
発現プラスミドは、前記ＤＮＡを発現できる、プロモーター領域などの調節配列と作動可能に連鎖した５Ｔ４核酸を発現できる任意のプラスミドを含む。従って、発現プラスミドは、適切な宿主細胞への導入により、クローニングされたＤＮＡが発現される、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物、例えばプラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のプラスミドを意味する。適切な発現プラスミドは、当分野の普通程度の技術的理解力を有する者には公知であり、真核生物および／または原核細胞で複製できるもの、およびエピソームであり続けるもの、または宿主細胞ゲノムに取込まれるものを含む。例えば、５Ｔ４をコードするＤＮＡは、哺乳動物細胞でのｃＤＮＡの発現に適したプラスミド、例えば、ｐＥＶＲＦなどのＣＭＶエンハンサーをベースとしたプラスミドに挿入し得る（Ｍａｔｔｈｉａｓ等、（１９８９）ＮＡＲ １７、６４１８）。
【０１０５】
本発明の実践に特に有用なのは、哺乳動物細胞で５Ｔ４をコードするＤＮＡの一過性発現を提供する、発現プラスミドである。一過性発現は、通常、宿主細胞中で効率的に複製できる発現プラスミドの使用を含み、よって、宿主細胞は、多くのコピーの発現プラスミドを蓄積し、次いで高いレベルの５Ｔ４を合成する。本発明の目的のために、一過性発現系は、可能性あるリン酸化部位を同定するために、または、タンパク質の機能的ドメインを特徴づけるために、例えば、５Ｔ４変異体の同定に有用である。
【０１０６】
本発明に記載のプラスミドの構築は、慣用的なライゲーション技法を使用する。単離プラスミドまたはＤＮＡ断片は、切断し、作成し、必要なプラスミドの作成に望ましい形で再連結する。所望であれば、構築プラスミドでの正しい配列を確認するための解析を既知の様式で実施する。発現プラスミドを構築し、in viｔroで転写物を調製し、ＤＮＡを宿主細胞に導入し、５Ｔ４発現および機能を評価するための解析を実施するに適切な方法は、当業者には公知である。遺伝子の存在、増幅および／または発現は、サンプルにおいて、直接的に、例えば、慣用的なサザンブロット、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノザンブロット、ドットブロット（ＤＮＡまたはＲＮＡ解析）、または、in situハイブリダイゼーションにより、本明細書に提供した配列に基づき得る適切に標識したプローブを使用して測定し得る。当業者は、これらの方法が、所望であればどのように修飾し得るかを容易に認識する。
【０１０７】
５Ｔ４抗原、断片および変異体
本明細書に言及した５Ｔ４抗原は、５Ｔ４の少なくとも１つの共通の抗原決定基を保持した、５Ｔ４のペプチドおよび他の断片を含む。
【０１０８】
「共通の抗原決定基」は、５Ｔ４の少なくとも抗原機能を有した問題の誘導体を意味する。抗原機能は、天然または変性５Ｔ４ポリペプチドまたはその断片に対して生じた抗体と交差反応できる、エピトープまたは抗原部位の保有、或いは、ＨＬＡ分子と結合し、５Ｔ４特異的免疫応答を誘発する能力を含む。従って、本発明により提供された５Ｔ４は、一次転写物の選択的スプライシングにより作成されたｍＲＮＡによりコードされるスプライス変異体、アミノ酸変異体、グリコシル化変異体、および、５Ｔ４の生理学的および／または物理的特性を保持した５Ｔ４の他の共有結合的誘導体を含む。誘導体の例は、本発明のタンパク質が、天然アミノ酸以外の部分を用いて、置換、化学的、酵素的、または他の適切な手段により共有結合的に修飾された分子を含む。かかる部分は、酵素または放射性同位体などの検出可能な部分であり得る。さらに、特定の種、特に哺乳動物に見られる５Ｔ４の天然変異体も含まれる。かかる変異体は、同遺伝子ファミリーの関連遺伝子により、特定遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされ得るか、または５Ｔ４遺伝子の選択的スプライシング変異体を示し得る。
【０１０９】
共通の抗原決定基を保持した誘導体は、５Ｔ４の断片であり得る。５Ｔ４の断片は、その個々のドメイン、並びに、ドメインから得られる小ポリペプチドを含む。好ましくは、本発明に記載の５Ｔ４から得られる小ポリペプチドは、５Ｔ４に特徴的である単一のエピトープを規定する。断片は、理論的に、５Ｔ４の１つの特徴を保持している限り、ほぼ任意のサイズでよい。好ましくは、断片は、５〜４００アミノ酸長である。より長い断片は、全長５Ｔ４の切断短縮形として捉えられ、一般に「５Ｔ４」なる語により包含される。有利には、断片は、５〜２５の次元のアミノ酸長の比較的小さいペプチドである。好ましいのは、約９アミノ酸長のペプチドである。
【０１１０】
５Ｔ４の誘導体はまた、その変異体も含み、これは、５Ｔ４の少なくとも１つの特性を保持するという必要条件を有する、アミノ酸欠失、付加または置換を含み得る。従って、保存的アミノ酸置換は、５’または３’末端の切断短縮と同じように、５Ｔ４の性質を変化させることなく実質的に実施され得る。欠失および置換は、さらに、本発明に含まれる５Ｔ４の断片に実施され得る。５Ｔ４変異体は、例えば、１つ以上のアミノ酸の付加、交換および／または欠失をもたらす、in viｔroの変異誘発を実施した５Ｔ４をコードするＤＮＡから産生され得る。例えば、５Ｔ４の置換、欠失または挿入変異体は、組換え法により調製でき、５Ｔ４の天然形との免疫交差反応性についてスクリーニングできる。
【０１１１】
さらに、変異体ペプチドは、国立保健研究所のＫ．Ｐａｒｋｅｒにより発明されたプログラム「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ」を使用して、優れたＨＬＡ結合能についてスクリーニングできる（Ｐａｒｋｅｒ，Ｋ．Ｃ等、１９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３参照）。
【０１１２】
５Ｔ４の断片、変異体および他の誘導体は、好ましくは、５Ｔ４と実質的な相同性を保持する。本明細書に使用したような「相同性」は、２つの実体が、当業者が、それらが配向および機能の点で類似していると決定するに十分な特徴を共有していることを意味する。好ましくは、相同性は、配列同一性を意味するために使用される。従って、５Ｔ４の誘導体は、好ましくは、配列番号２の配列と実質的な配列同一性を保持する。
【０１１３】
「実質的な相同性」は、相同性が配列同一性を示す場合、直接的な配列アラインメントおよび比較により判断して、４０％以上の配列同一性、好ましくは４５％以上の配列同一性、最も好ましくは５０％またはそれ以上の配列同一性を意味する。
【０１１４】
配列相同性（または同一性）は、さらに、任意の適切な相同性アルゴリズムを使用して、例えば、デフォールトパラメータを使用して決定し得る。有利には、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用し、パラメータはデフォールト値に設定する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌに詳述され、これは、本明細書に参考として組み込まれている。探索パラメータは、下記のように定義し、有利には、定義したデフォールトパラメータに設定する。
【０１１５】
有利には、「実質的な相同性」は、ＢＬＡＳＴにより評価する場合、少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９、最も好ましくは１０またはそれ以上のＥＸＰＥＣＴ値と一致する配列と等しい。ＢＬＡＳＴ探索におけるＥＸＰＥＣＴのデフォールト域値は、通常１０である。
【０１１６】
ＢＬＡＳＴ（基本的局所アラインメント探索ツール）は、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘにより使用される発見的探索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、増強したＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌの統計学的方法（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ参照）を使用して、これらの知見に有意性を帰する。ＢＬＡＳＴプログラムは、例えば、検索配列への相同性を同定するために、配列類似性探索用に作成した。プログラムは、一般に、モチーフ−スタイル探索には有用でない。配列データベースの類似性探索における基本的な問題の議論については、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：１１９〜１２９参照。
【０１１７】
ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで入手可能な５つのＢＬＡＳＴプログラムは、以下の仕事を実施する。
ｂｌａｓｔｐは、タンパク質配列データベースに対して、アミノ酸検索配列を比較し、
ｂｌａｓｔｎは、ヌクレオチド配列データベースに対して、ヌクレオチド検索配列を比較し、
ｂｌａｓｔｘは、タンパク質配列データベースに対して、ヌクレオチド検索配列（両鎖）の６フレームの概念的翻訳産物を比較し、
ｔｂｌａｓｔｎは、全６つのリーディングフレーム（両鎖）に動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対して、タンパク質検索配列を比較し、
ｔｂｌａｓｔｘは、ヌクレオチド配列データベースの６フレーム翻訳物に対して、ヌクレオチド検索配列の６フレーム翻訳物を比較する。
【０１１８】
ＢＬＡＳＴは、以下の探索パラメータを使用する。
ＨＩＳＴＯＧＲＡＭは、各探索についてのスコアのヒストグラムを示し、デフォールトはイエスである（ＢＬＡＳＴマニュアル中のパラメータＨ参照）。
【０１１９】
ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮＳは、報告された一致配列の短い記載の数を、特定の数に制限し；デフォールト制限は１００記載である。（マニュアル項のパラメータＶ参照）。ＥＸＰＥＣＴおよびＣＵＴＯＦＦも参照。
【０１２０】
ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳは、データベース配列を、高スコアセグメント対（ＨＳＰｓ）が報告された特定の数に制限し、デフォールト制限は５０である。これよりも多くのデータベース配列が、報告の統計学的有意域値を満たす場合（以下のＥＸＰＥＣＴおよびＣＵＴＯＦＦ参照）、最大の統計学的有意性に帰する一致のみを報告する（ＢＬＡＳＴマニュアル中のパラメータＢ参照）。
【０１２１】
ＥＸＰＥＣＴ データベース配列に対する一致を報告するための統計学的有意域値；デフォールト値は１０であり、よって１０の一致はＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）の確率モデルに従って、単に偶然に発見されることが期待される。一致に帰せられる統計学的有意性が、ＥＸＰＥＣＴ域値よりも高い場合、一致が報告される。より低いＥＸＰＥＣＴ域値がより厳密であれば、一致が報告される機会は少なくなる。間欠的数値も許容可能である（ＢＬＡＳＴマニュアル中のパラメータＥ参照）。
【０１２２】
ＣＵＴＯＦＦ 高スコアのセグメント対を報告するためのカットオフスコア。デフォールト値は、ＥＸＰＥＣＴ値（上記参照）から計算する。ＨＳＰは、データベース配列のために、それらに帰せられる統計学的有意性が、ＣＵＴＯＦＦ値に等しいスコアを有する孤立ＨＳＰに帰せられるのと少なくとも同じ高さである場合にのみ報告する。より高いＣＵＴＯＦＦ値はより厳密であり、位置が報告される機会はより少ない。（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＳ参照）。典型的には、有意域値はＥＸＰＥＣＴを使用してより直感的に操作できる。
【０１２３】
ＭＡＴＲＩＸは、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＸの別のスコアリングマトリックスを特定する。デフォールトマトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２）。妥当な別の選択は、ＰＡＭ４０、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ２５０およびＩＤＥＮＴＩＴＹを含む。別のスコアリングマトリックスはＢＬＡＳＴＮに利用できず、ＢＬＡＳＴＮ要求に指示的なＭＡＴＲＩＸの特定は、誤応答を戻す。
【０１２４】
ＳＴＲＡＮＤは、ＴＢＬＡＳＴＮ探索を、データベース配列の単に上端または底部の鎖に制限するか、またはＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸまたはＴＢＬＡＳＴＸ探索を、検索配列の上端または底部の鎖のリーディングフレームに制限する。
【０１２５】
ＦＩＬＴＥＲ Ｗｏｏｔｔｏｎ＆Ｆｅｄｅｒｈｅｎ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１４９〜１６３のＳＥＧプログラムにより決定した、低い組成物複雑性を有する検索配列のセグメント、或いは、Ｃｌａｖｅｒｉｅ＆Ｓｔａｔｅｓ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１９１〜２０１のＸＮＵプログラムにより、ＢＬＡＳＴＮでは、ＴａｔｕｓｏｖおよびＬｉｐｍａｎのＤＵＳＴプログラム（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）により決定した短周期内部反復配列からなるセグメントの覆いを取る。フィルタリングは、統計学的に有意であるが、生物学的に関心のない報告を、ｂｌａｓｔ出力（例えば、共通の酸性、塩基性、またはプロリンリッチ領域に対するヒット）から削除でき、データベース配列に対する特異的な一致に利用できる、より生物学的に関心のある検索配列領域が得られる。
【０１２６】
フィルタープログラムにより見出された複雑性の低い配列を、ヌクレオチド配列の文字「Ｎ」（例えば、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ）およびタンパク質配列の文字「Ｘ」（例えばＸＸＸＸＸＸＸＸＸ）を使用して置換する。
【０１２７】
フィルタリングは、検索配列（またはその翻訳産物）のみに適用され、データベース配列には適用されない。デフォールトフィルタリングは、ＢＬＡＳＴＮではＤＵＳＴであり、他のプログラムではＳＥＧである。
【０１２８】
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴに配列を適用した場合に、ＳＥＧ、ＸＮＵ、または両方によりマスクされることは全く珍しいことではなく、よってフィルタリングが常に効果をもたらすとは期待するべきではない。さらに、いくつかの場合では、配列はその全体がマスクされ、フィルターされていない検索配列に対して報告された任意のマッチの統計学的有意性を疑うべきであることが示される。
【０１２９】
ＮＣＢＩ−ｇｉは、アクセス名および／または座名に加えて、ＮＣＢＩ ｇｉ識別子を出力に示す。
【０１３０】
最も好ましくは、配列比較は、ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴで提供される、単純なＢＬＡＳＴ探索アルゴリズムを使用して実施する。
【０１３１】
別に、配列相同性は、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｌｏｇｙ．ｎｃｓａ．ｕｉｕｃ．ｅｄｕ／ＢＷ３０／ＢＷ．ｃｇｉで入手できるＦａｓｔＡなどのアルゴリズムにより決定し得る。ＦａｓｔＡは、短い配列のアラインメントには、ＢＬＡＳＴより優れていると考えられる。有利には、ＦａｓｔＡアルゴリズムは、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｌｏｇｙ．ｎｃｓａ．ｕｉｕｃ．ｅｄｕ／ＢＷ３０／ＢＷ．ｃｇｉのデフォールトパラメータを使用して利用する。
【０１３２】
好ましくは、本発明のタンパク質またはその誘導体は、単離形で提供される。「単離」は、タンパク質または誘導体が同定され、その天然環境の１つ以上の成分が含まれないことを意味する。単離５Ｔ４は、組換え細胞培養液中の５Ｔ４を含む。組換え５Ｔ４遺伝子を発現している生物に存在する５Ｔ４（５Ｔ４タンパク質は、「単離」されていてもいなくても）は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１３３】
腫瘍に対するヒトのワクチン接種において、非ヒトＴＡＡの使用が好ましい。本発明は、従って、イヌ５Ｔ４を提供する。イヌ５Ｔ４は、有利には、ヒト被検者にヒト５Ｔ４に対する免疫応答を誘発させるための、ヒトでのワクチン成分としての使用のために提供される。
【０１３４】
イヌ５Ｔ４の配列は配列番号３に示す。他のイヌ源に由来する配列は、当業者により、例えば、配列番号３から得られた核酸プローブを用いたハイブリダイゼーションにより得ることができる。
【０１３５】
従って、核酸の例は、イヌ５Ｔ４タンパク質をコードし、配列番号３に示したＤＮＡ配列または前記ＤＮＡ配列の選択された断片にハイブリッドする、核酸配列として特徴づけることができる。好ましいのは、厳密度の高い条件下で配列番号３の配列にハイブリッドする、イヌ５Ｔ４をコードする配列である。
【０１３６】
ハイブリダイゼーションの厳密度は、ポリ核酸ハイブリッドが安定な条件を意味する。かかる条件は、当分野の普通程度の技術的理解力を有する者には明らかである。当業者には公知のように、ハイブリッドの安定性は、配列相同性が１％減少する毎に、約１〜１．５℃減少する、ハイブリッドの融点（Ｔｍ）に反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度および温度の関数である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は、厳密度のより高い条件下で実施し、次いで、様々な厳密度で洗浄する。
【０１３７】
本明細書に使用したように、高厳密度は、１Ｍ Ｎａ＋中、６５〜６８℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能とする条件を意味する。厳密度の高い条件は、例えば、６×ＳＳＣ、５×デンハード液、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１Ｎａ＋ピロリン酸、および非特異的競合物質としての０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ***ＤＮＡを含む水溶液中でのハイブリダイゼーションにより提供できる。ハイブリダイゼーション後、高厳密度の洗浄を、０．２〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーション温度での最終洗浄（約３０分間）を含む、数回のステップで実施し得る。
【０１３８】
中程度の厳密度は、上記した、しかし約６０〜６２℃である溶液中のハイブリダイゼーションに等価な条件を意味する。この場合、最終洗浄は、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度で実施する。
【０１３９】
低厳密度は、上記した、しかし約５０〜５２℃の溶液中のハイブリダイゼーションに等価な条件を意味する。この場合、最終洗浄は、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度で実施する。
【０１４０】
これらの条件は、様々な緩衝液、例えば、ホルムアミドをベースとした緩衝液、および温度を使用して適合および再現し得ると理解される。デンハード溶液およびＳＳＣは、他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液と同様に、当業者には公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等編（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク、またはＡｕｓｕｂｅｌ等編（１９９０），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社）。最適なハイブリダイゼーション条件は、プローブの長さおよびＧＣ含量も役割を果たしているので、経験的に決定しなければならない。
【０１４１】
有利には、本発明はさらに、厳密な条件下で、配列番号３の断片にハイブリッドできる核酸配列を提供する。好ましくは、断片は、１５〜５０塩基長である。有利には、約２５塩基長である。
【０１４２】
本明細書に提供された指針を考えると、本発明の核酸は、当分野で公知の方法に従って得ることができる。例えば、本発明のＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して化学合成により、またはイヌ５Ｔ４を有し、それを検出可能なレベルで発現すると考えられる起源から調製した、ゲノムライブラリーまたは適切なｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。
【０１４３】
目的の核酸の化学合成法は、当分野で公知であり、トリエステル、ホスファイト、ホスホルアミジト、およびＨ−ホスホネート法、ＰＣＲおよび他の自己プライマー法、並びに、固相支持体上でのオリゴヌクレオチド合成を含む。これらの方法は、核酸の全核酸配列が既知の場合に、またはコード鎖に相補的な核酸配列が入手できる場合に使用し得る。別に、標的アミノ酸配列が既知の場合、各アミノ酸残基について既知および好ましいコード残基を使用して、あり得る核酸配列を推論し得る。
【０１４４】
イヌ５Ｔ４をコードする遺伝子を単離する別の手段は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等１９８９の第１４章に記載のＰＣＲ技術を使用することである。この方法は、イヌ５Ｔ４核酸にハイブリッドするオリゴヌクレオチドプローブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチドの選択戦略は、下記する。
【０１４５】
目的の遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブまたは分析ツールを使用してライブラリーをスクリーニングする。ｃＤＮＡ発現ライブラリーについて、適切な手段は、イヌ５Ｔ４を認識し特異的に結合する、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、同じまたは異なる種の既知または疑われるイヌ５Ｔ４ｃＤＮＡをコードする、約２０〜８０塩基長のオリゴヌクレオチド；および／または同じまたはハイブリッドしている遺伝子をコードする、相補的ｃＤＮＡまたは相同ｃＤＮＡまたはそれらの断片を含む。ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするに適切なプローブは、同じまたはハイブリッドしているＤＮＡをコードする、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡまたはその断片、および／または相同的ゲノムＤＮＡまたはその断片を含むが、これらに限定されない。
【０１４６】
イヌ５Ｔ４をコードする核酸は、適切なｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを、適切なハイブリダイゼーション条件下で、プローブ、すなわち配列番号３に示した配列から得られるオリゴヌクレオチドを含む本明細書に開示した核酸を用いてスクリーニングすることにより単離し得る。適切なライブラリーは、市販で入手できるか、または例えば、細胞系、組織サンプル等から調製できる。
【０１４７】
本明細書に使用したように、プローブは、例えば、配列番号３に示した連続塩基の等価体と同じ（またはその相補体）か、またはより数の多い、１０〜５０、好ましくは１５〜３０、最も好ましくは約２０の連続塩基を含むヌクレオチド配列を有する、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである。プローブとして選択した核酸配列は、偽の陽性結果が最小となるように、十分な長さで十分に明瞭とする。ヌクレオチド配列は、通常、イヌ５Ｔ４の保存的または高度に相同的なヌクレオチド配列または領域に基づく。プローブとして使用する核酸は、１つ以上の位置で縮重し得る。縮重したオリゴヌクレオチドの使用は、種での優先的なコドン使用が知られていない種のライブラリーをスクリーニングする場合に特に重要であり得る。
【０１４８】
プローブを構築する好ましい領域は、５’および／または３’コード配列、リガンド結合部位をコードすると予測される配列等を含む。例えば、本明細書に開示された全長ｃＤＮＡクローンまたはその断片をプローブとして使用できる。好ましくは、本発明の核酸プローブは、ハイブリダイゼーション時に容易に検出されるに適切な標識手段で標識する。例えば、適切な標識手段は放射標識である。ＤＮＡ断片を標識する好ましい方法は、当分野で公知のように、ランダムプライミング反応で、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いてα３２Ｐ ｄＡＴＰを取込むことによる。オリゴヌクレオチドは、通常、γ３２Ｐ標識ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼで末端標識する。しかし、他の方法（例えば非放射活性）もまた、例えば、酵素標識、適切なフルオロフォアを用いた蛍光標識およびビオチン化を含む、断片またはオリゴヌクレオチドを標識するために使用し得る。
【０１４９】
ライブラリーを、例えば、実質的に全てのイヌ５Ｔ４コード配列を含むＤＮＡ部分または前記ＤＮＡの部分に基づいた適切なオリゴヌクレオチドを用いてスクリーニングした後、陽性クローンを、ハイブリダイゼーションシグナルの検出により同定し、同定クローンを制限酵素マッピングおよび／またはＤＮＡ配列解析により特徴づけ、次いで、例えば本明細書に示した配列との比較により調べ、それらが、完全なイヌ５Ｔ４をコードするＤＮＡを含むかを（すなわち、それらが翻訳開始および終結コドンを含むかを）確認する。選択したクローンが不完全である場合、それらを使用して、同じまたは異なるライブラリーを再度スクリーニングして、重複クローンが得られ得る。ライブラリーがゲノムである場合、重複クローンはエキソンおよびイントロンを含み得る。ライブラリーがｃＤＮＡライブラリーである場合、重複クローンは、オープンリーディングフレームを含む。両方の場合において、完全なクローンを、本明細書に提供したＤＮＡおよび推定アミノ酸配列との比較により同定し得る。
【０１５０】
本発明の核酸は、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入またはひと続きのヌクレオチドの反転、およびその任意の組合せにより容易に修飾できる。かかる変異体を使用して、例えば、天然に見られるイヌ５Ｔ４配列とは異なるアミノ酸配列を有する、イヌ５Ｔ４変異体を産生できる。変異誘発は、前もって決定し得るか（部位特異的）またはランダムであり得る。サイレント変異ではない変異は、リーディングフレーム外に配列を配置してはならず、好ましくは、ハイブリッドして、ループまたはヘアピンなどの二次ｍＲＮＡ構造を産生し得る、相補領域を創製しない。
【０１５１】
前記の考察はまた、別のネズミ（配列番号２）またはヒト（配列番号１）５Ｔ４抗原の単離にも適用し得る。
【０１５２】
５Ｔ４をコードするベクターの投与
本発明に記載の医薬組成物は、活性成分として、記載の５Ｔ４抗原をコードするベクターを含む主題の組成物である。本発明に記載の活性成分を含む医薬組成物の活性成分は、特定の場合に応じた量で投与した場合に、例えば、腫瘍或いは細胞増殖、感染および炎症状態に関連した他の疾病の処置および／または予防において、優れた治療および／または予防活性を示すと考えられる。投与方式は、最適の治療応答を提供するように調整し得る。例えば、数個の分割用量を毎日投与し得るか、または、用量は、治療状況の緊急度により応じて比例的に減少させ得る。
【０１５３】
活性化合物は、経口、静脈内（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内または坐剤経路またはインプラント（例えば遅延放出分子を使用）などの慣用的な方法で投与し得る。投与経路に応じて、活性成分は、酵素、酸の作用および前記成分を不活性化し得る他の天然条件から前記成分を保護するために、物質でコーティングする必要があり得る。
【０１５４】
非経口投与以外により活性化合物を投与するために、その不活性化を防ぐ物質でコーティングするか、またはそれと共に投与する。例えば、活性化合物は、アジュバント中で投与し得るか、または酵素阻害剤と共にまたはリポソーム中で同時投与し得る。アジュバントは、その広義の意味で使用され、インターフェロンなどの任意の免疫刺激化合物を含む。本明細書で考えるアジュバントは、レゾルシノール、非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルを含む。酵素阻害剤は、膵トリプシンを含む。
【０１５５】
リポソームは、水中油中水滴型ＣＧＦエマルション並びに慣用的なリポソームを含む。
【０１５６】
活性化合物はまた、非経口または腹腔内投与し得る。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物および油中に調製できる。通常の保存および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。
【０１５７】
注射使用に適した医薬形は、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および、無菌注射溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、形は、無菌でなければならず、容易にシリンジを使える程度に流体でなければならない。製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、溶媒、または、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、その適切な混合物、および植物油を含む、分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持できる。
【０１５８】
微生物の作用の防御は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によりもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射組成物の延長吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤を組成物中に使用することによりもたらすことができる。
【０１５９】
無菌注射溶液は、必要量の活性化合物を、適切な溶媒中に、必要であれば上記に列挙した様々な他の成分と共に取込み、次いで滅菌ろ過することにより調製する。一般に、分散液は、無菌活性成分を、塩基性分散媒体および上記に列挙した必要な他の成分を含む無菌ベヒクルに取込むことにより調製する。無菌注射溶液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥および凍結乾燥技法であり、活性成分と、前記のその滅菌ろ過溶液からの任意の追加の所望の成分を生じる。
【０１６０】
活性化合物を、上記のように適切に保護する場合、例えば、不活性成分と共にまたは同化可能な食用担体と共に経口投与し得るか、または硬または軟殻ゼラチンカプセルに封入し得るか、または錠剤に圧縮し得るか、または直接食事の食物に取込み得る。経口治療投与のために、活性化合物は、添加剤と共に取込み、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハース等の形で使用し得る。このような適切な投与形において、かかる治療に有用な組成物中の活性化合物の量が得られる。
【０１６１】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤等は、また、トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤、リン酸二カルシウムなどの添加剤、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、アルギン酸等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、およびスクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、冬緑油、またはチェリー風味などの風味剤を加え得る。単一投与形がカプセル剤である場合、それは上記の種類の物質に加えて液体担体を含み得る。
【０１６２】
様々な他の物質が、コーティング剤として、または物理的投与単位形を別様に修飾するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤を、シェラック、糖または両方でコーティングし得る。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素およびチェリーまたはオレンジ風味などの風味剤を含み得る。勿論、任意の投与単位形の調製に使用した任意の物質は、医薬的に純粋であり、使用する量において実質的に無毒性とすべきである。さらに、活性化合物は、持続放出調製物および製剤に取込み得る。
【０１６３】
本明細書に使用したように「医薬的に許容される担体および／または希釈剤」は、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。かかる媒体および医薬的に活性な物質の使用は当分野で公知である。任意の慣用的な媒体または物質が活性成分と適合性である限り、その治療組成物における使用が考えられる。補充的活性成分も、組成物に取込むことができる。
【０１６４】
投与し易くするためにおよび投与量を均一にするために、単位投与形で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書に使用した単位投与形は、処置する哺乳動物被検者用の均一な投与量として適した物理的に別個の単離を意味し；各単位は、必要な医薬的担体と共に所望の治療効果をもたらすと計算される、前もって決定された量の活性物質を含む。本発明の新規投与単位形の規格は、（ａ）活性物質の独特の特徴および達成すべき特定の治療効果、および（ｂ）身体の健康が障害された疾病状態を有する生存被検者における疾病の処置における活性成分などを配合する技術に固有の制限により指示されおよび直接的に依存する。
【０１６５】
主活性成分は、投与単位形で、適切な医薬的に許容される担体と共に、有効量の慣用的かつ効果的な投与のために配合される。補充的活性成分を含む組成物の場合、投与量は、通常の用量および前記成分の投与様式を参照して決定する。
【０１６６】
本発明に記載の５Ｔ４発現ベクターの投与方式は、慣用的な効力試験により決定し得る。しかし、特に好ましいのは、連続的初回刺激およびブースターステップを含む方式である。かかる方式は、免疫寛容の優れた破壊およびＣＴＬ応答の誘導を達成することが観察される。好ましい実施形態において、初回刺激ステップは、非ウイルス性ベクター、例えば５Ｔ４をコードするプラスミドを使用して実施し、ブースターは、ウイルス性ベクター、例えば５Ｔ４をコードするポックスウイルスを使用して実施する（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ等、１９９８ Ｎａｔ Ｍｅｄ ４：３９７〜４０２参照）。
【０１６７】
５Ｔ４抗原の投与
一般に、５Ｔ４をコードする核酸の投与に関連した、上記に概略を示したアプローチは、腫瘍の治療および／または予防のための、慣用的なワクチン調製物として、５Ｔ４抗原の投与に使用し得る。
【０１６８】
一般に、ワクチンは、５Ｔ４抗原を用いて調製し得る。活性成分（群）として５Ｔ４抗原を含むワクチンの調製は、当業者には公知である。典型的には、かかるワクチンは、注射液として、液体溶液または懸濁液として調製され、注射前の液体溶液または懸濁液に適した個体形も調製し得る。調製物はまた乳化しても、タンパク質をリポソーム中にカプセル化してもよい。活性免疫原性成分は、しばしば、医薬的に許容であり、活性成分と適合性である添加剤と混合する。適切な添加剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、またはその他およびその組合せである。
【０１６９】
さらに、所望であれば、ワクチンは、少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／またはワクチンの効力を増強するアジュバントを含み得る。効果的であり得るアジュバントの例は、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７、ノル−ＭＤＰと称される）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称される）およびＲＩＢＩ（これは細菌から抽出した３つの成分を含む）、モノホルホリルリピドＡ、トレハロースジミコレートおよび２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルション中の細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含むがこれに限定されない。
【０１７０】
アジュバントおよび他の物質のさらなる例は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水滴型エマルション、水中油滴型エマルション、ムラミルジペプチド、細菌エンドトキシン、リピドＸ、コリネバクテリウム・パルブム（プロピオニバクテリウム・アクネス）、百日咳菌、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リソレシチン、ビタミンＡ、サポニン、リポソーム、レバミゾール、ＤＥＡＥ−デキストラン、ブロックコポリマーまたは他の合成アジュバントを含む。かかるアジュバントは、様々な起源、例えば、メルクアジュバント６５（メルクアンドカンパニー社、ローウェー、Ｎ．Ｊ．）またはフロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（ディフコラボラトリーズ、デトロイト、ミシガン）から市販で入手できる。
【０１７１】
典型的には、アンフィゲン（水中油滴型）、アルヒドロゲル（水酸化アルミニウム）、またはアンフィゲンとアルヒドロゲルの混合物を使用する。水酸化アルミニウムのみが、ヒトの使用に承認されている。
【０１７２】
免疫原とアジュバントの比率は、両方が有効量で存在する限り、幅広く変化し得る。例えば、水酸化アルミニウムは、ワクチン混合物の約０．５％（Ａｌ₂Ｏ₃を基準に）の量で存在し得る。慣用的には、ワクチンは、０．２〜２００μｇ／ｍｌ、好ましくは５〜５０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１５μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度の免疫原を含むように製剤化する。
【０１７３】
製剤化後、ワクチンは、無菌容器に取込み得、次いで封をし、低温度、例えば４℃で保存するか、または凍結乾燥し得る。凍結乾燥により、安定形で長期保存できる。
【０１７４】
ワクチンは、注射により、例えば皮下または筋肉内で、慣用的に非経口投与される。他の投与形態に適した追加の製剤は、坐剤、およびある場合には経口製剤も含む。坐剤では、伝統的な結合剤および担体は、例えば、ポリアルキレングルコールまたはトリグリセリドを含み得、かかる坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の活性成分を含む混合物から形成され得る。経口製剤は、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリド、セルロース、炭酸マグネシウム等などの普通に使用される添加剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤または粉末の形をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分を含む。ワクチン組成物を凍結乾燥した場合、凍結乾燥した物質は、投与前に、例えば懸濁液として復元し得る。復元は、好ましくは緩衝液中で実施する。
【０１７５】
患者に経口投与するためのカプセル剤、錠剤および丸剤は、例えば、オイドラジット「Ｓ」、オイドラジット「Ｌ」、セルロースアセテート、セルロースアセテートフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む、腸溶性コーティングを施し得る。
【０１７６】
５Ｔ４は、中性または塩形としてワクチンに製剤化し得る。医薬的に許容される塩は、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基を用いて形成される）を含み、これは、塩酸またはリン酸などの無機酸、或いは、酢酸、シュウ酸、酒石酸およびマレイン酸などの有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成された塩はまた、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または鉄などの無機塩基、および、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカインなどの有機塩基から得られ得る。
【０１７７】
５Ｔ４投与の効力の測定
免疫治療分子としての５Ｔ４活性は、抗体産生アッセイ、ＣＴＬ応答誘導および腫瘍減退モデルを含む、当分野で公知の任意の技術に従って評価し得る。技術の例は、以下の実施例に示す。
【０１７８】
本発明を、以下の図面を参照した以下の実施例において、単に説明の目的のためにさらに説明する。
【０１７９】
例１
組換えポックスウイルスベクターの構築
ワクシニアウイルスの増殖
高度に弱毒化したＭＶＡ株は、複製コンピテントＡｎｋａｒａ株から得られ、初代ヒヨコ胚繊維芽細胞で５７０以上の継代を続けた。ＭＶＡ複製は、哺乳動物細胞でほんの最小限の複製が報告されたため、最初は、ＣＥＦ細胞に限定されると考えられていた。しかし、さらなる解析により、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）は、高力価のＭＶＡの産生を支持できることが示された。従って、ＭＶＡは、ＢＨＫ−２１または一次ＣＥＦ細胞上で増殖し得る（Ｃａｒｒｏｌｌ＆Ｍｏｓｓ（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３８：１９８〜２１１）。
【０１８０】
ＣＥＦ細胞を調製するために、１０日齢のヒヨコ胚の内臓を取り、四肢および頭部を取り出し、その後、細かく切り、０．２５％トリプシン溶液中でトリプシン処理し、３７℃でインキュベートする。細胞懸濁液を、コースフィルターメッシュを通してろ過し、細胞を洗浄し、２０００ｒｐｍでＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ−３Ｂ中で１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して濃縮する。１０％ＦＣＳを含むＭＥＭ中に細胞を懸濁し、１７５ｃｍフラスコに分注し、３７℃でＣＯ₂インキュベーター中でインキュベートする。単層が９５％集密性となれば、トリプシン処理し、追加のフラスコまたは６穴プレートに播くために使用する。別に、一次培養液を、３１℃インキュベーターに後に使用するために移す（ＳｕｔｔｅｒおよびＭｏｓｓ（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０８４７〜１０８５１）。
【０１８１】
粗ウイルス、半精製ウイルスおよび精製ウイルス貯蔵液の調製
粗ウイルス貯蔵液は、最初の組換えウイルス解析のために、または後の高力価ウイルス調製物に使用するウイルス貯蔵液として調製する。ワクシニアウイルス調製物は、細胞膜および核を遠心分離して除去することにより、或いは、予め発現された組換えタンパク質産物および細胞小器官による汚染を防ぐためにスクロース遠心分離を含む追加のステップにより、半精製できる。使用する方法は、Ｅａｒｌ等、Ａｕｓｕｂｅｌ等（編）（１９９１）分子生物学の現在のプロトコル、１６．１６．１〜１６．１６．１７項、ニューヨーク；グリーンパブリッシングアソシエーツおよびウィリーインターサイエンス；ＥａｒｌおよびＭｏｓｓ、同書、１６．１７．１〜１６．１７．１６項；ＥａｒｌおよびＭｏｓｓ、同書、１６．１８．１〜１６．１８．１０項；およびＢｒｏｎｔｅ等（１９９７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４（７）：３１８３〜３１８８により記載の方法の修飾である。
【０１８２】
粗ウイルス
ＭＶＡは、ＣＥＦまたはＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣから得られる）で増殖させ、ＷＲは、ＨｅＬａまたはＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ）中で１７５ｃｍ²組織培養フラスコ中で増殖させる。簡潔には、集密な単層は、ＭＶＡまたはＷＲで、約１ｐｆｕの感染効率で感染させる。ウイルスを、２％ＦＣＳを含む１０ｍｌのＭＥＭに懸濁し、集密な細胞単層を含む１７５ｃｍ²のフラスコに加える。１時間３７℃で接種した後、２％ＦＣＳを含む追加の２０ｍｌのＭＥＭを加える。４８〜７２時間後、感染細胞を、培地にこすり出し、１５００ｇで５分間ペレット化させる。粗ウイルス調製物用に、細胞を、１７５ｃｍ²フラスコあたり、２ｍｌのＭＥＭ（２％）に再懸濁する。細胞を３回凍結解凍し、超音波処理し、１ｍｌの凍結チューブに分注する。代表的な分注液を、凍結解凍し、滴定してウイルス濃度を決定する。ウイルス貯蔵液は−２０℃で保存する。
【０１８３】
半精製調製物
感染細胞を、以前に記載のように収集する（Ｅａｒｌ等；ＥａｒｌおよびＭｏｓｓ；１９９１）。遠心分離後、細胞をＰＢＳ（２ｍｌ／１７５ｃｍ²フラスコ）に再懸濁し、３０〜４０ストロークで堅くフィットしたガラスダウンスホモジナイザー中、氷上でホモジナイズする。細胞破砕は、顕微鏡により点検する。核、細胞小器官および膜は、３００ｇで５分間（４℃）で遠心分離して除去し、上清を確保する。細胞ペレットを、１ｍｌ／１７５ｃｍ²フラスコに再懸濁し、遠心分離を繰返す。上清をプールし、分注し、保存する。
【０１８４】
精製調製物
感染細胞を、以前に記載のように収集し（Ｅａｒｌ等；ＥａｒｌおよびＭｏｓｓ；１９９１）、１０ｍＭトリス．Ｃｌ（ｐＨ９．０）（２ｍｌ／フラスコ）に再懸濁し、手順のこの時点から氷上でサンプルを保つ。１０ｍＭトリスを使用して以前に記載のようにホモジナイズする。溶解液を、最大出力（５００Ｗ）で１分間、ＸＬ２０１５ソニケーティングカップ（ミソニクス、米国）を使用して超音波処理（氷上）する。サンプルを、１分間氷上に置き、３回超音波処理を繰返す。最大５ｍｌを一度に超音波処理し、超音波処理中に氷を補給する。溶解液を、ＳＷ−２７遠心チューブ中、１７ｍｌの３６％スクロース（１０ｍＬトリス．Ｃｌ、ｐＨ９．０）のクッション上に穏やかに重層する。溶解液を、ＳＷ−２７ローター中、１３５００ｒｐｍ（３２，９００×ｇ）で４℃で８０分間遠心分離する。上清を廃棄し、ウイルスペレットを無菌ＰＢＳに再懸濁し、１分間（氷上で）カップソニケーター中で超音波処理する。濃縮ウイルスを分注し、−２０℃で保存する。
【０１８５】
例２
５Ｔ４を発現している組換えウイルスベクターの構築および特徴づけ
ネズミおよびヒト５Ｔ４遺伝子を、ＷＲ（ｐＳＣ６５）（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ等（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１０９４〜７）およびＭＶＡ（ｐＬＷ２２）移行プラスミドにクローニングし、それぞれのウイルスゲノムの標的領域への相同的組換えを可能とする。
【０１８６】
ヒトおよびネズミ５Ｔ４を発現している組換えＭＶＡおよびＷＲ
１．４ｋｂのネズミおよびヒト５Ｔ４（Ｐ．Ｓｔｅｒｎ Ｐａｔｅｒｓｏｎ研究所マンチュスターにより供給）遺伝子を、ｐＢＳＩＩ−ｍ５Ｔ４（５Ｔ４ｃＤＮＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン））およびｐＢＳＩＩ−ｈ５Ｔ４（Ｍｙｅｒｓ等（１９９４）ＪＢＣ ２６９：９３１９〜９３２４）から、それぞれＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限消化により切出す。断片を、ｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼで「充填する」ことにより平滑末端とする。平滑末端断片を、ｐＬＷ２２（ＭＣＳの上流の初期後期プロモーター（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ等、１９９７）からなる、ＭＶＡ移行プラスミド）のＰｍｅＩ部位にクローニングする。隣接するのは、組換えウイルスの検出のためのＶＶ７．５Ｋｂ ＬａｃＺカセット（図１ａ参照）およびｐＳＣ６５（ｂ）のＳｍａＩ部位である（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ等、１９９７）。ｐＬＷ２２およびｐＳＣ６５は、それぞれ欠失領域ＩＩおよびｔｋ遺伝子への相同的組換えを指示する。
【０１８７】
ヒト被検者にワクチン接種する予定の構築物において、７．５ｋプロモーターの制御下のＬａｃＺ遺伝子を取り除く。組換えプラークを、以前に記載のように（Ｗｙａｔｔ等（１９９６）Ｖａｃｃｉｎｅ １４：１４５１〜１４５８）、抗５Ｔ４モノクローナル抗体を使用して生免疫染色することにより同定する。
【０１８８】
Ｂ．Ｍｏｓｓ（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、米国）により供給された野生型ＭＶＡを、プラーク精製クローンからＣＥＦ細胞中で増殖させ、以前に記載された組換えウイルスの作成に使用したのと同じ単離株である（ＳｕｔｔｅｒおよびＭｏｓｓ（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０８４７〜１０８５１、Ｓｕｔｔｅｒ等（１９９４）Ｖａｃｃｉｎｅ １２：１０３２〜１０４０、Ｈｉｒｓｃｈ等（１９９６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：３７４１〜３７５２、ＣａｒｒｏｌｌおよびＭｏｓｓ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：３５２〜３５５、Ｗｙａｔｔ等（１９９５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１０：２０２〜２０５、Ｓｕｔｔｅｒ等（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３７１：９〜１２、Ｗｙａｔｔ等（１９９６）Ｖａｃｃｉｎｅ １４：１４５１〜１４５８、Ｃａｒｒｏｌｌ等（１９９７）Ｖａｃｃｉｎｅ、１５：３８７〜３９４、ＣａｒｒｏｌｌおよびＭｏｓｓ（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３８：１９８〜２１１）。ＷＲ貯蔵液は、ＡＴＣＣ単離株から、Ｂ．Ｍｏｓｓ（ＮＩＨ）により供給される（例えば、ＥａｒｌおよびＭｏｓｓ、１９９１参照）。ＷＲ貯蔵液は、ＨｅＬａＳ３細胞（ＡＴＣＣ）で調製する。
【０１８９】
組換えＭＶＡウイルスの作成に使用したプロトコルは、以前に記載されたもの（Ｃａｒｒｏｌｌ＆Ｍｏｓｓ（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３８：１９８〜２１１）と類似している。簡潔には、ＢＨＫ−２１またはＣＥＦ細胞を、ＭＶＡ貯蔵液を用いて、０．１の感染効率で感染させる。プラスミドＤＮＡを、１００μｌのｄ．Ｈ₂Ｏ中で２μｇまで希釈し、滅菌ｄ．Ｈ₂Ｏで１００μｌまで希釈した、３０μｇのリポフェクチン（ＢＲＬ）と混合する。１０分間室温でインキュベートした後、リポフェクチン／ＤＮＡ溶液を、ＯｐｔｉＭＥＭを重層した感染細胞に加える。３７℃で５時間インキュベートした後、細胞培地を吸引し、２％ＦＣＳを含むＭＥＭと交換する。細胞をさらに３６時間インキュベートした後に収集し、５−ブロモ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトシダーゼの存在下で、ＣＥＦまたはＢＨＫ−２１細胞上でβ−ｇａｌの発現についてアッセイする。単離プラークを、少なくともさらに３回プラーク精製する。プラーク精製後、小ウイルス貯蔵液を、ＣＥＦまたはＢＨＫ−２１細胞中で調製する。
【０１９０】
組換えＷＲを構築するプロトコルは、以前に記載されたもの（ＣａｒｒｏｌｌおよびＭｏｓｓ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：３５２〜３５５；ＥａｒｌおよびＭｏｓｓ、１９９１）と類似している。簡潔には、組換えは、ＭＢＡと同様に実施する。しかし、ＢＳ−Ｃ−１細胞を使用し、組換えプラークを、ＢｒｄＵの存在下で、ＬａｃＺ遺伝子の基質である５−ブロモ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトシダーゼを含む寒天を重層して、１４３ｔｋ^-細胞中でアッセイする。ニュートラルレッドを使用して、ウイルス均一性の評価のために、ＬＡＣ Ｚ陰性自発性ｔｋ^-ウイルスを検出する。
【０１９１】
組換えタンパク質発現は、最初、以前に記載されたもの（Ｃａｒｒｏｌｌ＆Ｍｏｓｓ（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３８：１９８〜２１１）と類似の方法を使用して、ｈ５Ｔ４およびｍ５Ｔ４に特異的な抗体を使用した直接的なプラーク免疫染色により分析する。簡潔には、組換えウイルスを、単層のＢＳ−Ｃ−１細胞上にプラークを形成させ、アセトン／メタノールで固定し、ＭＡｂ ５Ｔ４（ＨｏｌｅＮ、およびＳｔｅｒｎＰＬ、（１９９０）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４５（１）：１７９〜１８４）で処理する。抗マウスＨＲＰコンジュゲート抗体およびジアニジジン基質を使用して、組換え５Ｔ４タンパク質発現を可視化する。５Ｔ４発現タンパク質は、ＭＡｂは高次構造的エピトープを認識するので、非還元条件下でのウェスタンブロットにより特徴づける。図２から分かるように、組換えウイルスは、適切な７２ｋＤａのサイズの、高レベルのタンパク質を発現する。貯蔵液を、Ｃａｒｒｏｌｌ＆Ｍｏｓｓ（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３８：１９８〜２１１に記載されたように二重免疫染色により均一性について点検する。
【０１９２】
例３
マウス５Ｔ４とヒト５Ｔ４の免疫学的交差保護を説明するための動物モデル
ある種の５Ｔ４遺伝子産物が、別の種の５Ｔ４に対する免疫を誘導できるかを決定するために、組換えポックスウイルスを、ネズミ腫瘍モデルで試験する。マウスモデルは、ＢＡＬＢ／ｃ起源の化学的に誘導した腺癌であるＣＴ２６（Ｂｒｉｔｔａｉｎ等（１９８０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４０：１７９〜１８４）、および、Ｃ５７Ｂ６マウスから得られた黒色腫系のＢ１６に基づく。ＣＴ２６系およびＢ１６の両方が、安定に形質転換され、ヒトおよびネズミ５Ｔ４を発現する。マウスに静脈内（肺小結節に誘導、ＣＴ２６）または皮下（ＣＴ２６およびＢ１６）注射して、１つの塊の皮下腫瘍を作成する。
【０１９３】
７匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、１×１０⁷ｐｆｕのＭＶＡ−ｈ５Ｔ４（ここで５Ｔ４抗原はＯＢＡ１と称する）構築物を、０、２１および４２日目に、３回静脈内または筋肉内接種する。次いで、マウスに、ヒト５Ｔ４で安定にトランスフェクトした、５×１０⁵腫瘍細胞を静脈内投与する。攻撃の１４日後に、マウス肺を取り出し、肺小結節を計測する。
【０１９４】
結果３
図３ａおよび３ｂに示した結果は、ＭＶＡ−ｈ５Ｔ４でワクチン接種したマウスは、ｈ５Ｔ４タンパク質を発現している同系腫瘍系ＣＴ２６を投与すると、抗腫瘍活性を示すことが実証される。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ統計解析により、ＭＶＡ−ｈ５Ｔ４でワクチン接種した後の保護は、ＭＶＡ−ＬａｃＺまたはＰＢＳでのワクチン接種に比べて有意であることが示される（ｐ＜０．０５）。
【０１９５】
例４
５匹のＣ５７ＢＬ６マウスの群に、３週間間隔で２回、１０⁷ｐｆｕのＭＶＡ−ｈ５Ｔ４（静脈内または筋肉内）またはＭＶＡ−ＬａｃＺ（静脈内）を接種した。マウスに、５×１０⁵のＢ１６−ｈ５Ｔ４細胞を投与した。腫瘍サイズを、２日間間隔で、腫瘍投与後に記録した。個々の腫瘍面積を得る。
【０１９６】
５および７匹のＣ５７ＢＬ６マウスの群を、２回、３週間間隔で、１０⁷ｐｆｕのＭＶＡ−ｍ５Ｔ４（静脈内または筋肉内）またはＭＶＡ−ＬａｃＺ（静脈内）で接種した。マウスを、５×１０⁵のＢ１６−ｍ５Ｔ４細胞で投与した。腫瘍サイズを、２日間間隔で、腫瘍攻撃後に記録した。個々の腫瘍面積を得る。
【０１９７】
結果４
図４ａは、ＭＶＡ−ｈ５Ｔ４でのワクチン接種は、明らかに、マウスにＢ１６−ｈ５Ｔ４を投与した場合、抗腫瘍効果を有することを示す。図４ａのデータのＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ統計解析により、ＭＶＡ−ｈ５Ｔ４でワクチン接種した後の腫瘍減退は、ＭＶＡ−ＬａｃＺでのワクチン接種に比べて有意であることが示される（ｐ＜０．０５）。
【０１９８】
図４ｂおよび４ｃは、ＭＶＡ−ｍ５Ｔ４でのワクチン接種は、明らかに、マウスにＢ１６−ｍ５Ｔ４を投与した場合、抗腫瘍効果を有することを示す。図４ｃのデータのＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ統計解析により、ＭＶＡ−ｍ５Ｔ４でのワクチン接種後の腫瘍減退は、ＭＶＡ−ＬａｃＺでのワクチン接種に比べて有意であることが示される（ｐ＜０．０５）。
【０１９９】
例５
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０⁵のＣＴ２６−ｈ５Ｔ４細胞を静脈内注射した。３日後、大きな肺腫瘍が確立される。マウスを、腫瘍接種の３および１０日後に、１０⁷ｐｆｕのＭＶＡ−ＬａｃＺ、ＭＶＡ−ｈ５Ｔ４（１０匹のマウスの群）またはＰＢＳ（５匹のマウスの群）で処理する。肺を染色し、腫瘍を腫瘍接種の１４日後に計測する。
【０２００】
結果５
ＭＶＡ−５ｈ５Ｔ４での処理は、ｈ５Ｔ４を発現している確立されたＣＴ２６肺小結節に対して、有意な治療効果を有することは、図５から明らかである。統計解析（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）は、ＭＶＡ−ｈ５Ｔ４での治療は、ＭＶＡ−ＬａｃＺまたはＰＢＳに比較して、有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０２０１】
例６
ＣＴ２６−ｍ５Ｔ４およびＢ１６−ｍ５Ｔ４自己抗原モデル
Ｃ５７ＢＬ６マウスに、２回、３週間間隔で、１×１０⁷ｐｆｕのＭＶＡ−ＬａｃＺ（ｎ＝３）またはＭＶＡ−ｍ５Ｔ４（ｎ＝６）を静脈内接種する。最後のワクチン接種の３週間後に、マウスを、ｍ５Ｔ４を発現している５×１０⁵のＢ１６で、皮下接種する。皮下（Ｓ．Ｃ．）腫瘍の発達をモニタリングする。
【０２０２】
図６は、ＭＢＡ−ｍ５Ｔ４でワクチン接種したマウスが、対照ワクチンを受けたマウスよりも遅い速度で腫瘍を発達させることを示す。さらに、ｍ５Ｔ４のワクチン接種マウスの腫瘍は、ＭＶＡ−ＬａｃＺ処理を受けたマウスに比べて、平均して５倍容積が小さい（１３日目には１０倍小さい）。この保護特性は、これらのマウスに誘導されたｍ５Ｔ４抗体応答と匹敵し得る。
【０２０３】
例７
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２回、３週間間隔で、１×１０⁷ｐｆｕのＭＶＡ−ＬａｃＺ（ｎ＝５）またはＭＶＡ−ｍ５Ｔ４（ｎ＝６）を静脈内接種する。最後のワクチン接種の３週間後に、マウスを、ｍ５Ｔ４を発現している５×１０⁵のＣＴ２６で攻撃する。攻撃の１２日後、マウス肺を取り出し、腫瘍小結節を盲検的に計測する。
【０２０４】
結果７
図７は、ＭＶＡ−ｍ５Ｔ４でワクチン接種したマウスは、ＭＶＡ−ＬａｃＺ処理を受けたマウスよりも腫瘍負荷の少ないことを示す。この保護特性は、これらのマウスに誘導されたｍ５Ｔ４抗体応答と匹敵し得る。
【０２０５】
例８
Ｃ５７およびＢＡＬＢ／ｃマウスでの５Ｔ４抗体応答の誘導
マウスに、上記のようにＭＶＡ−ｍ５Ｔ４およびＭＶＡ−ｈ５Ｔ４でワクチン接種し、各ワクチン接種の１０日後に出血させる。
【０２０６】
結果８
ＭＶＡ−ｍ５Ｔ４は、２回の接種後に、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７Ｂ１６マウスの両方における耐性を克服できる。さらに、ＤＮＡ、次いでＭＶＡで初回刺激したマウスは、ｍ５Ｔ４に対する抗体応答の兆しを示さない。
【０２０７】
それ故、２つのネズミ腫瘍モデルにおいて、ネズミ５Ｔ４を発現しているＭＶＡでのワクチン接種は、ｍ５Ｔ４を発現している同系腫瘍細胞に対する保護特性を有することが示される。これらの抗腫瘍特性は、抗ｍ５Ｔ４免疫応答に匹敵し得る（ＥＬＩＳＡにより測定）。さらに、かかる免疫応答の誘導は、これらの動物に自己免疫毒性を誘導しないことが示される。
【０２０８】
例９
初回刺激ブースターワクチン接種を使用した５Ｔ４に対する免疫応答
ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ６マウスにおいて、５Ｔ４に対する免疫を誘導する、ＭＶＡおよび裸ＤＮＡベクターの効力を評価するために、マウスおよびヒト５Ｔ４をコードするむき出しのＤＮＡおよびＭＶＡベクターの両方を、連続的な初回刺激およびブースターを使用してマウスに接種する。より詳細には、マウスに、１×１０⁷ｐｆｕのＭＶＡ−５Ｔ４（静脈内）、５０ｇのｐＣｌ−ｈ５Ｔ４（２５ｇ／後足）または２５ｇのｐＣｌ−ｍ５Ｔ４（１２．５ｇ／後足）で０日目に接種し、第二の（ブースター）接種を、ＭＶＡ−５Ｔ４を用いて２１日目に実施する。２９日目に、マウスを出血させ、抗体力価をＥＬＩＳＡにより決定する。
【０２０９】
結果９
表２および３で示されるような以下の力価（ＭＶＡ−ＬａｃＺのバックグラウンドＯＤの２倍のＯＤを与える希釈として定義）が観察される。
【０２１０】
【表２】

【表３】

【０２１１】
結果により、異種５Ｔ４抗原（ｈ５Ｔ４）を用いたＤＮＡ：ＭＶＡの初回刺激：ブースター、または、異種または相同５Ｔ４（Ｈ５Ｔ４またはｍ５Ｔ４）を用いたＭＶＡ：ＭＶＡ初回刺激：ブースターの使用は、高力価の抗体を産生するのに効果的である。
【０２１２】
例１０
癌免疫療法のための修飾形の５Ｔ４
ヒト５Ｔ４を修飾して、その免疫原性を増強し、従って、より効率的な免疫治療応答を誘導することが可能である。これを実施するために、ＨＬＡ ＣＴＬエピトープの同定、および、ＨＬＡ分子への結合を向上させ、従ってより効率的なＣＴＬ誘導を誘導するための前記エピトープの修飾は、国立保健研究所のＫ．Ｐａｒｋｅｒにより発明されたプログラム「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ」を使用して実施する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｏｌｂｉｏ／ｋｅｎ＿ｐａｒｋｅｒ＿ｃｏｍｂｏｆｏｒｍ）（Ｐａｒｋｅｒ，Ｋ．Ｃ．等、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３参照）。以下の結果は、ヒト（表４）およびネズミ（表５）５Ｔ４ ９ｍｅｒについて得る。
【０２１３】
【表４】

【表５】

【０２１４】
例１１
ＨＬＡ Ａ０２０１の結合を向上させるためのＨ５Ｔ４の変異
Ｐａｒｋｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎから得られた上記のデータは、３０１位で始まるヒトＡＡ配列の変異がＹＭＡＤＭＶＡＷＬからＨＭＡＤＭＶＴＷＬに変化した場合、ＨＬＡ Ａ０２０１への解離の半減時間が１０倍増加した９ｍｅｒとなる。この結合親和性の増加は、５Ｔ４ポリペプチドのＣＴＬ誘導特性を大きく向上させる（また、Ｏｖｅｒｗｉｊｋ等、１９９８ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８８：２７７〜８６参照）。
【０２１５】
結果１１
さらに、８１で始まるｈ５Ｔ４ ９ｍｅｒの、ＮＬＴＥＶＰＴＤＬからＮＬＬＥＶＰＡＤＬへの変異により、ＨＬＡ Ａ０２０１への９ｍｅｒの解離半減時間は４倍増加する。
【０２１６】
例１２
毒性試験
自己免疫毒性の非存在
この試験の目的は、免疫モデルで５Ｔ４に対する自己免疫毒性の誘導についての、生じうる効果を試験することであった。
【０２１７】
実験計画
５匹のＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ ＢＬ６マウスの群に、ヒト（ＭＶＡ−ｈ５Ｔ４）およびネズミ５Ｔ４（ＭＶＡ−ｍ５Ｔ４）を発現している、１０⁷ｐｆｕの組換えワクシニアウイルスＭＶＡを静脈内接種した。ネガティブコントロールとして、マウスに、Ｅ．ＣｏｌｉＬａｃＺ（ＭＶＡ−ＬａｃＺ）を発現しているＭＶＡまたはＰＢＳを接種した。
【０２１８】
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、全部で４回、１４ヶ月の期間におよび接種した。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、３回、１４ヶ月の期間におよび接種した。血液サンプルを、接種後に採取し、ＥＬＩＳＡにより５Ｔ４特異的抗体について評価した。
【０２１９】
結果１２ａ
抗体応答：２回の接種後、ＭＶＡ−ｍ５Ｔ４およびＭＶＡ−ｈ５Ｔ４で接種したマウスは、それぞれ高レベルの抗ｍ５Ｔ４および抗ｈ５Ｔ４をその血清中に有した（表２および表３参照）。
【０２２０】
毒性：マウスを、毎日、健康障害の兆しについて観察した。過去１４ヶ月間に、ＭＶＡ−ｍ５Ｔ４またはＭＶＡ−ｈ５Ｔ４で接種した動物の物理的外見は、ＭＶＡ−ＬａｃＺまたはＰＢＳで接種した動物のそれとは異ならなかった。全ての動物が健康のようであるという、動物の健康に関する資格のある獣医により作成された２つの報告が作成された。
【０２２１】
要約
ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ ＢＬ６マウスの群に、４回まで、１４ヶ月の期間におよび、ｍ５Ｔ４を発現しているＭＶＡ抗原（ＭＶＡ−ｍ５Ｔ４）またはｈ５Ｔ４抗原を発現しているＭＶＡ（ＭＶＡ−ｈ５Ｔ４）で接種し、毒性の兆しについて点検した。マウスは、ｍ５Ｔ４に対する高力価の抗体を有することが示されたが、１４ヶ月の期間におよび健康障害の兆しは全くなかった。資格のある獣医が動物を評価し、それらは健康障害の兆しを全く示さないことを見出し、これは自己免疫毒性がないことを示す。
【０２２２】
従って、ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ ＢＬ６マウスを、ＭＶＡ−ｈ５Ｔ４またはＭＶＡ−ｍ５Ｔ４で接種すると、それぞれｈ５Ｔ４およびｍＴ５４に対する免疫応答が誘導される。かかる応答は、マウスの健康に有害な効果を全く及ぼさない。
【０２２３】
実施例１２ｂ
受精能に対する５Ｔ４自己免疫の効果
５Ｔ４は、ヒトおよびネズミ胎盤に見出される。従って、抗マウス５Ｔ４免疫応答は、マウスの妊娠を予防し得るか、または胎児の健康を影響を及ぼし得ることが可能である。我々は、これらの問題に取り組むために広範な試験を実施した。この試験の目的は、妊娠に対する、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ ＢＬ雌マウスの両方におけるｍ５Ｔ４に対する免疫応答の効果を評価することであった。
【０２２４】
実験計画
５匹の雌ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ ＢＬ６マウスの群に、３回、１０⁷ｐｆｕのＭＶＡ−ｍ５Ｔ４、ＭＶＡ−ＬａｃＺまたはＰＢＳを接種した。最終接種後の特定の時間に（１０、３０および６０日目）、マウスを交尾させ、妊娠能および健康な子を産む能力について評価した。
【０２２５】
結果１２ｂ
（ｉ）Ｃ５７ＢＬ６マウス試験
【表６】

【表７】

【表８】

【０２２６】
（ｉｉ）ＢＡＬＢ−ｃマウス試験
【表９】

【表１０】

【０２２７】
要約
ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ６マウスに、ｍ５Ｔ４を発現しているＭＶＡ組換えウイルスを注射し、抗−ｍ５Ｔ４抗体応答を誘導した。これらのマウスを交尾させると、妊娠し、対照ウイルスで接種したマウスと同じ割合で同腹仔を産むことが示された（表６〜１０参照）。さらに、離乳までの同腹仔の健康に対する影響は全くなかった。従って、ＭＶＡ−ｍ５Ｔ４での接種およびｍ５Ｔ４抗体応答の誘導は、（ｉ）ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ６マウスの受精能、（ｉｉ）生産児の数および（ｉｉｉ）同腹仔の体重および離乳までの生存に対して有害な効果を及ぼさない。
【０２２８】
例１２ｃ
正常ヒト組織での５Ｔ４の分布
この試験の目的は、正常ヒト組織での５Ｔ４分布の独立的な評価を実施することであった。いくつかの過去の試験により、小血管に関連した正常組織の５Ｔ４発現のレベルは、胎盤に関連したものよりも１０００倍以上低いことが判明したが、５Ｔ４を発現している正常組織は潜在的に、この腫瘍抗原に対して誘導された免疫応答の標的となり得ることが示唆されている。染色は、特異的であるのかまたはＭＡｂによるいくらかの交差反応性を反映するのかは明らかではなかった。
【０２２９】
実験計画
３つの異なるドナーからの３２の異なる組織型のスライド調製物は、ＧＬＰ条件下で資格を有する病理学者により評価された。各組織サンプルの凍結切片は、５Ｔ４に特異的な３つの異なる濃度のＭａｂで染色した。
【０２３０】
結果１２ｃ
要約表１１は、脳、ＣＮＳ、肝臓および腎臓を含む、全ての必須臓器からの組織切片が、５Ｔ４発現について陰性であったことを示す。１つ以上のドナー組織でのいくつかの弱い染色が、数個の非必須組織で明らかであった。いくつかの陽性染色が、癌により死亡した個体から得られた組織で観察されたことに注記すべきである。
【０２３１】
免疫組織化学的解析を使用した過去の研究により、いくつかの５Ｔ４染色が、「弱く染色したように見え」、腎臓（糸球体）、膀胱（上皮）、小腸（絨毛上皮）、子宮（子宮内膜腺）、頸部（子宮頸管腺）および皮膚（基底表皮）を含む、いくつかの非癌性臓器の「いくつかの小血管」で観察されたことが判明したが、この独立的な研究は、５Ｔ４が、必須臓器の細胞上には発現されていないことを示し、さらに、いくつかの正常組織での発現は、低いレベルであり、全３つのドナーサンプルにはほとんど見られない程に散発性である。従って、このデータは、５Ｔ４の組織発現は、腫瘍免疫治療試験に使用された、いくつかの他の腫瘍抗原と比較して、より厳密に制限されていることを示す。それ故、これらの知見は、５Ｔ４が癌免疫治療の優れた候補抗原であるという見解を繰返す。
【０２３２】
【表１１】

【０２３３】
例１３
ＳｃＦｖ融合タンパク質の in vivo の抗腫瘍効力データ
研究の目的は、一連の単鎖抗体融合タンパク質の効力を試験することであった。
【０２３４】
実験計画
ヒト５Ｔ４（ＣＴ２６−ｈ５Ｔ４）およびＣＴ２６−ｎｅｏを発現しているＣＴ２６細胞
細胞を、ＰＢＳ、ＬｓｃＦｖ−１、ＬｓｃＦｖ−２、Ｂ７−ｓｃＦｖ、ＳｃＦｖ−Ｉｇと共に前もってインキュベートした。
【０２３５】
ＬｓｃＦｖ−１および２は、ＢＨＫ細胞系で発現した。ＬｓｃＦｖ−１は、ニッケルカラムでそのヒスチジンタグを介して精製し、ｓｃＦｖ−２は、ろ過系を使用して精製した。Ｂ７−ｓｃＦｖは、Ｈｉｓタグを介してＢＨＫ系から精製し、ｓｃＦｖ−Ｉｇはろ過カラムを介して精製した。実験に使用した各ｓｃＦｖの濃度は、ＦＡＣＳアッセイでＣＴ２６−ｈ５Ｔ４細胞の結合を飽和させるのに必要なタンパク質の量として定義した。
【０２３６】
ＣＴ２６−ｈ５Ｔ４およびＣＴ２６−ｎｅｏ細胞を、各ｓｃＦｖの飽和量と共に前もってインキュベートし、１時間インキュベートした。細胞を洗浄した後、５×１０⁵の細胞を、シンジェニックなＢＡＬＢ／ｃマウスの横腹に皮下注射した。
【０２３７】
腫瘍測定は、２日間毎に行い、容積を計算した。
【０２３８】
結果１３
図８：ＣＴ２６−ｎｅｏ
腫瘍接種の３６日後に、ＰＢＳ対照と比べて、腫瘍サイズが３倍減少したようであるＬｓｃＦｖ−１の場合以外は、群間に有意な差異はない。
【０２３９】
図９：ＣＴ２６−ｈ５Ｔ４
全てのｓｃＦｖ構築物で処理した腫瘍は、腫瘍増殖に対して有意な効果を示した。ｓｃＦｖ−１で処理した５匹中４匹のマウスには、３６日目に腫瘍がなかった。３６日目に、ｓｃＦｖ−１で処理した腫瘍は、ＰＢＳで処理した腫瘍よりも＞６０倍小さかった。
【０２４０】
類似の実験を、ｈ５Ｔ４を発現するように操作したマウス黒色腫系（Ｂ１６）を使用して実施する場合、抗腫瘍効果は全くなかった。
【０２４１】
要約
要約すると、ＣＴ２６およびＢ１６ネズミモデルにおいて、Ｂ７またはＩｇＧを、５Ｔ４特異的ｓｃＦｖに融合する利点は全くないようである。ｓｃＦｖ単独は、その結合親和性の高さから、より効力があり得る（Ｂ７−ｓｃＦｖに比べて、ＢＩＡＣＯＲＥで示したように）。それ故、このデータは、ｓｃＦｖ単独は、腫瘍減退に対して有意な効果を示し、ｓｃＦｖに融合した免疫増強分子は、５Ｔ４モデルで腫瘍減退に対して効果を示すために必要でないだろうことを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１ａは、遺伝子構築物を示し、図１ｂは遺伝子構築物を示す。
僅かにより詳細には、図１ａは、組換えワクシニアウイルスＭＶＡの地図である。導入遺伝子を、ワクシニアウイルス合成初期／後期プロモーターの制御下に置く。ＬａｃＺ遺伝子は、ワクシニアウイルス７．５Ｋ初期／後期プロモーターの制御下にある。これらの遺伝子にフランキングするＤＮＡ領域は、ＭＶＡの２つの欠失領域から得られ、従って、この部位への相同的組換えが可能となる。
図１ｂは、組換えワクシニアウイルスＷＲの地図である。導入遺伝子は、ワクシニアウイルス合成初期／後期プロモーターの制御下にある。ＬａｃＺ遺伝子は、ワクシニアウイルス７．５Ｋ初期／後期プロモーターの制御下にある。遺伝子にフランキングするＤＮＡ領域は、ＷｙｅｔｈＶＶ株のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子から得られ、従って、この部位への相同的組換えが可能となる。
【図２】 図２ａは、写真表示を示し、図２ｂは、写真表示を示す。僅かにより詳細には、図２は、ヒト５Ｔ４を発現する組換えワクシニアウイルスのウェスタンブロットを示す。サンプルを、１２％ＳＤＳ ＰＡＧＥに流し、ニトロセルロース膜に転写した。
図２ａ：ブロットは、１：５００希釈のＭａｂ５４（抗ヒト５Ｔ４）でプローブする。結合した抗体を、抗マウスＨＲＰコンジュゲート抗体およびＥＣＬで可視化する。レーン１：ヒト５Ｔ４を発現している組換えＷＲクローン１、レーン２：ヒト５Ｔ４を発現している組換えＷＲクローン２、レーン３：ＷＲに感染したＢＳ−Ｃ−１細胞、レーン４：非感染ＢＳ−Ｃ−１細胞、レーン５：Ｂ１６黒色腫細胞、レーン６：ヒト５Ｔ４を発現しているＢ１６細胞系。
図２ｂ：ブロットは、１：５００希釈のウサギ抗マウス５Ｔ４プローブする。レーン１：ＬａｃＺを発現している組換えＷＲ、レーン２：マウス５Ｔ４を発現している組換えＷＲ、レーン３；ヒト５Ｔ４を発現している組換えＷＲ、レーン４；マウス５Ｔ４を発現している組換えＭＶＡ。
【図３】 図３ａはグラフを示し、図３ｂはグラフを示す。
僅かにより詳細には、図３ａおよび３ｂは、マウスを、ＭＶＡ−ｈ５Ｔ４で接種すると、ｈ５Ｔ４を発現しているＣＴ２６での攻撃に対して保護されることを示すグラフである。
【図４】 図４ａはグラフを示し、図４ｂはグラフを示し、図４ｃはグラフを示す。
僅かにより詳細には、図４ａは、ＭＶＡ−ｈ５Ｔ４で接種すると、ｈ５Ｔ４を発現しているＢ１６腫瘍に対する抗腫瘍活性が誘導されることを示すグラフである。
図４ｂおよび４ｃは、ＭＶＡ−ｍ５Ｔ４で接種すると、ｍ５Ｔ４を発現しているｍ１６腫瘍に対する抗腫瘍活性が誘導されることを示すグラフである。
【図５】 図５はグラフを示す。
僅かにより詳細には、図５は、ＭＶＡ−ｈ５Ｔ４は、前もって肺腫瘍の確立されたマウスにおいて腫瘍療法を誘導することを示すグラフである。
【図６】 図６はグラフを示す。
僅かにより詳細には、図６は、ＭＶＡ−ｍ５Ｔ４をワクチン接種したマウスは、対照ワクチンを受けたマウスよりも、遅い速度で腫瘍を発達させることを示すグラフである。
【図７】 図７はグラフを示す。
僅かにより詳細には、図７は、ＭＶＡ−ｍ５Ｔ４でワクチン接種したマウスは、ＭＶＡ−ＬａｃＺ処置を受けたマウスよりも、腫瘍負荷の少ないことを示すグラフである。
【図８】 図８はグラフを示す。
【図９】 図９はグラフを示す。
【配列表】

Claims (25)

1. 免疫化物質として５Ｔ４抗原を含む、被検者に免疫応答を誘発することができるワクチン組成物。
2. １つ以上のアジュバントをさらに含む請求項１に記載のワクチン組成物。
3. 前記５Ｔ４抗原は、アミノ酸の挿入、欠失または置換により変異させた５Ｔ４抗原であって、ＨＬＡ分子に結合でき、被検者において野生型５Ｔ４に対するＣＴＬ応答を誘導できる請求項１または２に記載のワクチン組成物。
4. 前記５Ｔ４抗原は、ＣＴＬ応答を誘導する５Ｔ４抗原のペプチドエピトープである請求項１または２に記載のワクチン組成物。
5. 前記５Ｔ４抗原は、ＨＭＡＤＭＶＴＷＬおよびＮＬＬＥＶＰＡＤＬからなる群から選択される請求項１または２に記載のワクチン組成物。
6. 被検者において５Ｔ４抗原を発現させるための５Ｔ４抗原をコードする核酸を含む、請求項１に記載の被検者に免疫応答を誘発することができるワクチン組成物。
7. ５Ｔ４抗原をコードする核酸を発現するウイルスベクターを含む請求項６に記載のワクチン組成物。
8. 前記ウイルスベクターはポックスウイルスベクターである請求項７に記載のワクチン組成物。
9. 前記ウイルスベクターがＭＶＡである請求項８に記載のワクチン組成物。
10. 前記５Ｔ４抗原は、アミノ酸の挿入、欠失または置換により変異させた５Ｔ４抗原であって、ＨＬＡ分子に結合でき、被検者において野生型５Ｔ４に対するＣＴＬ応答を誘導できる請求項６に記載のワクチン組成物。
11. 前記５Ｔ４抗原は、ＣＴＬ応答を誘導する５Ｔ４抗原のペプチドエピトープである請求項６に記載のワクチン組成物。
12. 前記５Ｔ４抗原は、ＨＭＡＤＭＶＴＷＬおよびＮＬＬＥＶＰＡＤＬからなる群から選択される請求項１１に記載のワクチン組成物。
13. 免疫応答は、ＣＴＬ応答または抗体応答である請求項１〜１２のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
14. 被検者の腫瘍を免疫療法するための組成物の調製における５Ｔ４抗原の使用。
15. 被検者における５Ｔ４抗原に対する免疫寛容を破壊するための組成物の調製における５Ｔ４抗原の使用。
16. ５Ｔ４抗原は、５Ｔ４抗原をコードする核酸を発現するウイルスベクターにより送達される請求項１４または１５に記載の使用。
17. 前記５Ｔ４抗原は、アミノ酸の挿入、欠失または置換により変異させた５Ｔ４抗原であって、ＨＬＡ分子に結合でき、被検者において野生型５Ｔ４に対するＣＴＬ応答を誘導できる請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の使用。
18. 前記５Ｔ４抗原は、ＣＴＬ応答を誘導する５Ｔ４抗原のペプチドエピトープである請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の使用。
19. 前記５Ｔ４抗原は、ＨＭＡＤＭＶＴＷＬおよびＮＬＬＥＶＰＡＤＬからなる群から選択される請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の使用。
20. 少なくとも１つの免疫回避遺伝子が欠失した組換えポックスウイルスベクターを含み、５Ｔ４抗原をコードする核酸を含む、哺乳動物において５Ｔ４抗原に対する免疫応答を誘発することができるワクチン組成物。
21. 前記組換えポックスウイルスベクターから全ての免疫回避遺伝子が欠失している請求項２０に記載のワクチン組成物。
22. 前記組換えポックスウイルスベクターは、溶解活性が減少している請求項２０に記載のワクチン組成物。
23. 前記組換えポックスウイルスベクターは、ＭＶＡではない請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
24. 前記組換えポックスウイルスベクターは、複製欠損性である請求項２０〜２３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
25. 免疫応答がＣＴＬ応答である請求項２０に記載のワクチン組成物。

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