JP4892583B2 - ピシウム属菌に対する拮抗微生物の検出方法、該拮抗微生物およびそれを用いた土壌病害防除剤 - Google Patents
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Description
本発明により、播種直後の種子を腐敗させ発芽不良や、幼苗の立枯病を引き起こす病原性糸状菌として、特に育苗の現場で問題となっているピシウム属菌に対する拮抗微生物を取得できる。本発明によって得られた拮抗微生物を用いて、ピシウム属菌による病害の生物的防除剤を提供することができる。
しかし、拮抗微生物を用いて、生物農薬や微生物資材の開発まで至った例は、わずかしかない。この原因は、圃場環境で効果を示す拮抗微生物を検定できる実験系の確立が難しいからである。
1)抗生物質生産により他の微生物の生育を阻害する抗生
2)微生物間で栄養分、侵入部位などを奪い合う競合
3)他の微生物に接触または侵入し溶菌させる寄生
4)植物の生態防御機構を引き出す抵抗性誘導
具体的にピシウム属菌の病害に対する拮抗微生物の例を以下に記す。上記1)の抗生では、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)Pf−5株は、この菌株が生産する抗生物質ピヨルテオリン(pyoluteorin)が関与し、ピシウム・ウルティマムによるワタの苗立枯れ病を抑制した報告がある(非特許文献4)。上記2)の競合では、シュードモナス属菌(Pseudomonas sp.)が、播種後の種子表面をすばやく覆い、種子からの浸出物を優先的に利用することで、ピシウム属菌による苗立枯れ病を抑制した報告がある(非特許文献5)。上記3)の寄生では、非病原性のリゾクトニア属菌がピシウム・ウルティマムに寄生することが、病害抑制のメカニズムの一つとして挙げられている(非特許文献6)。上記4)の抵抗性誘導では、シュードモナス属菌が、キュウリに抵抗性を誘導し、ピシウム・アファニデルマータムによる茎腐れを抑制した報告がある(非特許文献7)。
バチルス・ズブチリス水和剤中の拮抗菌は、生育場所及び栄養分の競合により、灰色カビ病菌に拮抗作用を示すとされる(非特許文献8)。また、非病原性エルビニア・カロトボーラ水和剤中の拮抗菌は、葉面上での栄養面での競合と、抗菌作用によって軟腐病に拮抗作用を示すとされている(非特許文献9)。
即ち、本発明は、ピシウム属菌による病害の生物的防除効果を示す拮抗微生物を検出する方法において、
ピシウム属菌汚染土を作製し、該汚染土に検定菌を接種混合した後、植物種子を播種し培養して、ピシウム属菌による植物病害に対する検定菌の抑制効果を評価することにより拮抗微生物を検出する、ポット試験による検出方法であって、該汚染土におけるピシウム属菌の菌数が播種培養した植物全てを発病させるに必要な最小の菌数となるように調製したピシウム属菌汚染土を用いる、
ことを特徴とする、拮抗微生物の検出方法である。
更に本発明は、アースロバクター属(Arthrobacter sp.)、パエシロマイセス(Paecilomyces)属、マルブランキア(Malbranchea)属またはクンニングハメラ(Cunninghamella)属に属する、ピシウム属菌に対する拮抗微生物である。
更に本発明は、上記拮抗微生物を有効成分として含有するピシウム属菌による土壌病害に対する生物的防除剤である。
また、本発明の検出方法では、ピシウム属菌汚染土の作製に用いる土壌は、出来るだけ圃場環境に近い条件の土壌は好ましく、従って、通常の土壌中に含まれる微生物が同じ程度に含まれる土壌が望ましい。より具体的には、例えば、糸状菌数が100〜10,000cfu/g乾土および細菌数が100,000〜10,000,000cfu/g乾土の土壌を用いるのが好ましく、このような土壌を用いることにより、圃場環境に近い条件でピシウム属菌に対する拮抗微生物の検出をポットレベルで行なうことができる。
ピシウム属菌汚染土におけるピシウム属菌の菌数は、汚染土に播種し培養した植物の全てを発病させるに必要な最小の菌数となるように汚染土を調製する。ここで菌数とは、汚染土中に含まれるピシウム属菌の菌体全体、卵胞子および胞子のうの総数を指し、発病させるに必要な最小の菌数とは、植物種子を汚染土に播種して生育させる際に植物の発病においてお互いの植物個体に影響を与えない程度の距離を保って種子を播種して培養した場合において、植物固体の全てを発病させ且つ全てを枯死させるに必要な最小の菌数を意味する。通常、ピシウム属菌汚染土中に含まれるピシウム属菌数は土壌1g当り10〜1,000cfu、好ましくは、50〜500cfu、より好ましくは、100〜200cfuとなるよう調製する。菌数は、VP3培地(Ali−Shitayeh et al.Trans.Br.mycol.Soc.86:39−47,1986)等のピシウム属菌の選択培地を用い、希釈平板法等で測定する。対象とするピシウム属菌は、例えばピシウム・アファニデルマータム(Pythium aphanidermatum FERM P−19018)や、ピシウム・ウルティマム(Pythium ultimum FERM P−19017)を用いることができるが、他のピシウム属菌についても同様に用いることが出来る。
ポットへの潅水は、下部のパーライトなどの土壌改良材層に液面が存在する程度に行うのが好ましい。パーライトなどの土壌改良材層の存在によりアッセイ中の土壌水分が、適度に保たれる。上記の最適形態の場合、50mlの潅水が適量となる。
本発明により、最適なピシウム属菌数、ピシウム属菌種、植物種、環境条件を確立することにより、ピシウム病菌に対する拮抗菌のスクリーニング系を確立することができる。即ち、ピシウム属菌の汚染土に検定菌を混入後、植物種子を播種し、検定菌の病害抑制効果を評価することで、ピシウム属菌による病害の生物的防除に有用と思われる拮抗微生物を取得できる。本発明は圃場環境に近い条件での、ピシウム属菌に対する拮抗微生物の検出ならびに取得に最適な方法である。
実施例1
目的
植物アッセイにより、効率的に拮抗微生物を検出するために、確実に発病し、かつ出来るだけ少ないピシウム属菌菌数でアッセイを行うことを目的とし、ピシウム属菌としてピシウム・アファニデルマータム(Pythium aphanidermatum OPU431:FERM P−19018)とピシウム・ウルティマム(Pythium ultimum UOP407:FERM P−19017)を用い、本菌の土壌中の菌数と発病との関係を調査し、非滅菌土壌における発病下限の菌数を求めるため以下の実験を行った。
i)6mmに篩った浄水ケーキ(糸状菌数が2,500cfu/g乾土および細菌数が5,000,000cfu/g乾土の浄水ケーキを用いた)を苗箱に敷き詰め、キュウリ(品種:鈴生四葉)を多量に播種し発芽させた。そこに、あらかじめ液体培地で培養したピシウム・アファニデルマータムあるいはピシウム・ウルティマムの菌体を接種し、キュウリを罹病させた。植物体が枯死したら、植物体を取り除き風乾、粉砕した。これをピシウム汚染土の接種源とした。
ii)汚染土は、ピシウム接種源と非汚染土壌との混合割合を変えて、異なる菌数の汚染土を5処理区作製した。汚染土のピシウム属菌数の測定は、汚染土の作製後ピシウム属菌の選択培地であるVP3培地を用いた希釈平板法にて測定した。
iii)85mm(縦)×85mm(横)×140mm(深)のカイワレダイコン用のプラスチック容器に、土壌水分調整のためのパーライト75ml、上記ii)で作製した汚染土壌100mlを充填し、水道水を50ml注いだ。1ポットにつきキュウリ種子5粒を播種し、ビニールでプラスチック容器を被覆し、12時間照明のグロースチャンバー内で培養した。培養温度は、ピシウム・アファニデルマータム汚染土区は30℃、ピシウム・ウルティマム汚染土区は26℃とした。
iv)子葉の展開及びピシウム属菌の感染に要する十分な期間である7日間の培養後、植物の状態を観察し、ピシウム属菌による種子腐敗や苗立枯れなどの発病率を調査した。
調製した各汚染土中の菌数を測定した結果、ピシウム・アファニデルマータム汚染土は土壌1g当りそれぞれ、0、5、22、80、133cfuであった。ピシウム・ウルティマム汚染土は土壌1g当りそれぞれ、0、25、53、77、105cfuであった。植物アッセイによるキュウリの苗立枯病発生の程度を表1および2に示す。発病率は、3回行なった実験の平均値で示した。
ピシウム・アファニデルマータム汚染土の場合には、80cfu/g soilでは、不安定な発病であったが、133cfu/g soilでは発病率は100%になった。ピシウム・ウルティマム汚染土では、77cfu/g soil以上で、100%の発病率であった。従って、ピシウム属菌は、汚染土中に100〜200cfu/g soil存在すれば、確実に発病することが明らかになった。本菌数が検定菌の選抜に用いる最も良い条件であると考えられる。
目的
土壌より分離された糸状菌および細菌を実施例1の検出方法に供試し、ピシウム属菌に対する拮抗微生物を取得するため、以下の実験を行った。
i)数ヵ所の任意の土壌から希釈平板法により微生物を分離し、培地上に現れた視覚的に形態の異なる細菌及び糸状菌を単離した。得られた細菌224菌株、糸状菌46菌株を供試した。
ii)実施例1に示した方法でピシウム・アファニデルマータム汚染土を作製し、菌数が土壌1g当り1×102〜2×102cfuとなるように調製した。この汚染土を、あらかじめパーライト75mlが入ったプラスチック容器〔85mm(縦)×85mm(横)×140mm(深)〕に100ml入れた。
iii)検定菌の接種は以下のように行った。検定菌が糸状菌の場合は、土壌フスマ培地(土壌:フスマ=4:1)で25℃、7日間培養後、上記汚染土に10g混合し、容器に蒸留水50mlを注いだ。検定菌が細菌の場合は、MYPG液体培地で30℃、48時間振とう培養後、遠心分離にて培地成分(上清)を除去し、得られた菌体(沈殿)を50mlの滅菌蒸留水に懸濁し、上記汚染土と均一に散布した。
iv)検定菌の接種後27〜30℃で一晩静置した後、薬剤で粉衣された市販品のキュウリ種子の薬剤を流水で落としたキュウリ種子5粒を播種し、ビニールでプラスチック容器を被覆した。30℃、12時間照明のグロースチャンバー内で7日間培養後、植物の状態を観察し、検定菌の発病抑制効果を評価した。発病抑制効果の認められた検定菌株については、同様の試験を3回繰り返し、安定して効果の認められた拮抗菌を選抜した。
結果を、図1および2に示す。ピシウム・アファニデルマータムに対して、細菌はGb4a、Ib2a、Rb5a、Rb5bの4菌株、糸状菌はIf2、Mf2、Uf2の3菌株に発病抑制効果が認められた。
目的
本発明により検出された拮抗微生物7菌株(細菌はGb4a、Ib2a、Rb5a、Rb5bの4菌株、糸状菌はIf2、Mf2、Uf2の3菌株)の、ピシウム・アファニデルマータムに対する抗菌作用機作を調査するために、以下の実験を行った。
i)実施例2において拮抗力が認められた糸状菌をPDA平板上で前培養し、直径8mmのコルクボーラーで菌叢を打ち抜いたディスクを作製した。これを新たにPDA平板の一端に置床し、菌層が2〜3cmに拡大するまで培養した。その平板のもう一端に、ピシウム・アファニデルマータムの菌叢ディスクを同様にして置床し28℃で培養した。
ii)拮抗力が認められた菌が細菌の場合は、MYPG平板の一端に画線し、2日間培養後、ピシウム・アファニデルマータムの菌叢ディスクをシャーレのもう一端に置床し30℃で培養した。
iii)2から3日後、ピシウム・アファニデルマータム菌叢の状態を観察し、生育抑制の有無を観察した。
実験に供した糸状菌3菌株、細菌4菌株のうち、生育抑制が認められたものはなく、抗菌物質生産でない発病抑制メカニズムが示唆された。
目的
本発明により検出された拮抗微生物7菌株(細菌はGb4a、Ib2a、Rb5a、Rb5bの4菌株、糸状菌はIf2、Mf2、Uf2の3菌株)の同定を行った。
菌株の同定は、細菌の場合は、16SrDNAの部分塩基配列約500bpを解析し、相同性検索によって、その菌株の帰属分類群を推定した。糸状菌の同定は、巨視的および微視的な形態観察によって行った。
Gb4a株、Ib2a株、Rb5aおよびRb5bの部分塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号1、2、3および4に示した通りであった。
Gb4a株及びIb2a株の部分塩基配列より、MicroSeqTM Microbial Identification System software Ver1.4.1およびMicroSeqTM Bacteral 500Library v.0023により相同性検索を行ったところ、相同性96.42%でアースロバクター・オキシダンス(Arthrobacter oxydans)に対して最も高い相同性を有しており、分子系統樹上ではアースロバクター・パセンス(A.pascens)とクラスターを形成した。ブラスト(BLAST)相同性検索では、相同率99.0%でアースロバクター属菌(Arthrobacter sp.)SMCC ZAT262株に対して最も高い相同性を示した。従って、これら2株はアースロバクター属に属しアースロバクター・パセンス(A.pascens)に近縁な菌株と推定できる。
Rb5a及びRb5bの部分塩基配列より、MicroSeqTM Microbial Identification System software Ver1.4.1およびMicroSeqTM Bacteral 500Library v.0023により相同性検索を行ったところ、相同性100%でアースロバクター・ヒスチディノロボランス(Arthrobacter histidinolovorans)と一致した。分子系統樹上でもアースロバクター・ヒスチディノロボランス(A.histidinolovorans)と同じ場所に位置した。従って、これら2株はアースロバクター・ヒスチディノロボランス(Arthrobacter histidinolovorans)に帰属することが示唆された。
以上の観察結果より、If2株はパエシロマイセス属菌(Paecilomyces sp.)と帰属された。
以上の観察結果より、Mf2株はマルブランキア属菌(Malbaranchea sp.)と帰属された。
以上より、Uf2株はクンニングハメラ属菌(Cunninghamella sp.)と帰属された。
パエシロマイセス属菌(Paecilomyces sp.)If2
FERM P−19016
マルブランキア属菌(Malbaranchea sp.)Mf2
FERM P−19019
クンニングハメラ属菌(Cunninghamella sp.)Uf2
FERM P−19020
アースロバクター属菌(Arthrobacter sp.)Gb4a
FERM P−19021
アースロバクター属菌(Arthrobacter sp.)Ib2a
FERM P−19022
アースロバクター・ヒスチディノロボランス(Arthrobacter histidinolovora ns)Rb5a
FERM P−19023
アースロバクター・ヒスチディノロボランス(Arthrobacter histidinolovora ns)Rb5b
FERM P−19024
Claims (7)
- ピシウム属菌による病害の生物的防除効果を示す拮抗微生物を検出する方法において、
ピシウム属菌汚染土を、ピシウム属菌を含む土壌を風乾、粉砕して得た接種源、および前記土壌として浄水場発生土を用いて作製し、該汚染土に検定菌を接種混合した後、植物種子を播種し培養して、ピシウム属菌による植物病害に対する検定菌の抑制効果を評価することにより拮抗微生物を検出する、ポット試験による検出方法であって、該汚染土におけるピシウム属菌の菌数が播種培養した植物全てを発病させるに必要な最小の菌数となるように調製したピシウム属菌汚染土を用いる、
ことを特徴とする、拮抗微生物の検出方法。 - ピシウム属菌数を10〜1,000cfu/g soilとなるよう調製したピシウム属菌汚染土を用いる請求項1の検出方法。
- ピシウム属菌がピシウム・アファニデルマータム(Pythium aphanidermatum)あるいはピシウム・ウルティマム(Pythium ultimum)である請求項1または2の検出方法。
- ピシウム菌汚染土の下層に土壌水分を保持するための土壌改良材を充填したポットを用いる請求項1から3のいずれかの検出方法。
- 植物にウリ科植物を用いる請求項1から4のいずれかの検出方法。
- ウリ科植物がキュウリである請求項5の検出方法。
- ピシウム属菌汚染土の作製のための土壌として、糸状菌数が100〜10,000cfu/g乾土および細菌数が100,000〜10,000,000cfu/g乾土の土壌を用いる請求項1から6のいずれかの検出方法。
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