JP4884373B2 - 抗デルマタン硫酸抗体と機能性硫酸化オリゴ糖 - Google Patents

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Description

本発明は、特定の構造を有するデルマタン硫酸を特異的に認識・検出する抗デルマタン硫酸抗体、及びその抗体によって認識され、増殖因子や神経栄養因子などの活性調節に関与する機能性硫酸化オリゴ糖に関するものである。本発明は、特に糖鎖の構造及び機能の研究解析において、及びその医療等への応用分野において有用な技術を提供するものである。
なお、本明細書並びに図面において適宜使用される各略号の意味は以下のとおりである（主要なもののみ）。CS：コンドロイチン硫酸、DS：デルマタン硫酸、HS：ヘパラン硫酸、GAG：グリコサミノグリカン、PG：プロテオグリカン、GlcUA：グルクロン酸、GalNAc：N-アセチルガラクトサミン、IdoUA：イズロン酸、HexUA：ヘキスロン酸、D-ユニット：[GlcUA(2S)β1-3GalNAc(6S)]、iD-ユニット：[IdoUA(2S)α1-3GalNAc(6S)]、2S：2-O-硫酸、4S：4-O-硫酸、6S：6-O-硫酸、E-CS/DS：ブタ胎仔脳由来CS/DS鎖、An-DS：ホヤ (Ascidian nigra) 由来デルマタン硫酸、iC-ユニット：[IdoUAα1-3GalNAc(6S)]、ΔD-ユニット：[Δ4,5HexUA(2S)α1-3GalNAc(6S)]、Δ4,5HexUA（ΔHexUA）：4-deoxy-L-threo-hex-4-enepyranosyluronic acid、mAb：モノクローナル抗体。
ヘパラン硫酸 (HS) と同様に、コンドロイチン硫酸 (CS) やデルマタン硫酸 (DS) はグリコサミノグリカン (GAG) の一種であり、コアタンパク質に共有結合した形でプロテオグリカン (PG) として合成され（非特許文献1-3）、あらゆる組織の細胞表面や細胞外マトリックスに存在している。さらに、こうしたCS/DS-PGsは、哺乳類の脳の構成成分であり、神経細胞の接着、移動、分化、神経突起形成や軸索誘導などの調節を通して、神経の発生に関与している（非特許文献4-8）。
CSとDSの骨格構造は、それぞれ [-GlcUA-GalNAc-]、[-IdoUA-GalNAc-] (GlcUA、GalNAc、IdoUAはそれぞれグルクロン酸、N-アセチルガラクトサミン、イズロン酸を示す) の二糖繰り返し構造から成る。さらに、これらの構造を様々な割合で有するハイブリッド糖鎖も存在する（非特許文献9）。これらの二糖単位中では様々な組み合わせで、GlcUA/IdoUAの2位やGalNAcの4位、6位が硫酸化修飾を受けている。それらの修飾によってCS、DS、CS/DSハイブリッド糖鎖は特徴的な硫酸化パターンを有し、さらには構造の膨大な多様性を有することになる。
最近の研究によって、脳におけるCS/DSのGlcUA/IdoUAの存在比、硫酸化パターンが個体発生に伴って変化し（非特許文献10-12）、神経突起生成において、異なった構造の糖鎖のサブポプュレーションが異なった役割を担っていることが示されている（非特許文献13-15）。さらに、様々な海産動物由来の多硫酸化CS/DS鎖は、in vitroでマウス海馬ニューロンの神経突起伸長促進活性を有する（非特許文献16-19）。
脳のCS/DS鎖は、多硫酸化された二糖構造を少ないながらも有意に有している（非特許文献11、14、20）。例えば、ブタ胎仔脳由来のCS/DS (E-CS/DS) 鎖は、1.7％のD-ユニット[GlcUA(2S)-GalNAc(6S)]あるいはiD-ユニット[IdoUA(2S)-GalNAc(6S)]と0.9％のE-ユニット [GlcUA-GalNAc(4S, 6S)] (2S、4S、6Sはそれぞれ、2-O-硫酸、4-O-硫酸、6-O-硫酸を示す) を有している（非特許文献11）。本発明者は最近、これらの珍しい多硫酸化二糖構造に加えて、IdoUAを含んだ二糖構造がE-CS/DSの神経突起生成の重要な構成要素であることを明らかにした（非特許文献11-15）。さらに、培養神経膠腫 (glioma) 細胞由来のアミロイド前駆体タンパク質アピカンのCS鎖がE-ユニットを14.3％も有していることが報告されている（非特許文献21）。このことは、脳のPGが多硫酸化CS二糖構造のクラスターを保持していることもあることを示唆している。しかしながら、哺乳類の脳において多硫酸化DS構造が存在することは、現在まであまりよく研究されていない。
ホヤ (Ascidian nigra) 由来のDS鎖 (An-DS) は、iD-二糖ユニット [IdoUA(2S)-GalNAc(6S)] (〜80％) を主要構成成分とし、加えて、iC-二糖ユニット [IdoUA-GalNAc(6S)] (〜20％) も有している（非特許文献22）。そのiD-ユニットを含む構造は珍しく、哺乳動物の組織では見つかっていない。しかしながら、An-DSは、肝細胞増殖因子 (HGF) との結合能を有し（非特許文献23）、in vitroで海馬ニューロンの神経突起伸長促進活性を示す（非特許文献18）。これらの知見は、iD-ユニットを含むDS構造が生理機能を有していることを暗示している。サメ皮膚から単離したCS/DSハイブリッド糖鎖もまた、増殖因子と結合し、神経突起生成活性をもち、その糖鎖はD-あるいはiD-ユニットを含む２硫酸化二糖構造を少なからず有している（非特許文献19）。
このようにiD-ユニットを含むデルマタン硫酸などの種々の構造の糖鎖がそれぞれ特有の生理機能を有することが近年徐々に明らかにされつつある。デルマタン硫酸の構造と機能に関する研究を今後もなお一層精力的に進めることは、哺乳類の中枢神経系の形成・発達における糖鎖の役割や、増殖因子等の作用機構における糖鎖の役割を解明する上において非常に重要である。更にその研究成果を利用した創薬、疾病の診断法の開発など医療等への応用も期待される。
The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz, W. J., ed.), pp. 267-371, Plenum Publishing, New York (1980) Annu. Rev. Biochem. 47, 385-417 (1991) Trends Glycosci. Glycotechnol. 12, 321-349 (2000) Persp. Dev. Neurol. 3, 319-330 (1996) Physiol. Rev. 80, 1267-1290 (2000) Arch. Biochem. Biophys. 374, 24-34 (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 13, 612-620 (2003) Glycoconj. J. 21, 329-341 (2004) IUBMB Life 54, 177-180 (2002) J. Biol. Chem. 272, 31377-31381 (1997) J. Biol. Chem. 279, 9765-9776 (2004) J. Biol. Chem. 278, 35805-35811 (2003) J. Cell Biol. 126, 783-799 (1994) J. Biol. Chem. 273, 28444-28453 (1998) J. Biol. Chem. 280, 9180-9191 (2005) J. Biol. Chem. 273, 3296-3307 (1998) Neurosci. Lett. 269, 125-128 (1999) J. Biol. Chem. 278, 43744-43754 (2003) J. Biol. Chem. 280, 4058-4069 (2005) J. Biol. Chem. 275, 37407-37413 (2000) J. Biol. Chem. 276, 37155-37160 (2001) J. Biol. Chem. 270, 31027-31036 (1995) Biochem. Soc. Trans. 31, 352-353 (2003)
本発明は、研究用試薬などとして有用な、デルマタン硫酸を特異的に認識・検出する抗デルマタン硫酸抗体を作製・提供することを第１の課題とする。コンドロイチン硫酸に対する数種の抗体が市販されているが、デルマタン硫酸に対して特異性を示す抗体は従来知られていなかった。とりわけ、神経系の形成・発達に重要な役割を担っていると考えられる、iD-ユニットを含むデルマタン硫酸を特異的に検出する抗体の提供が本発明の第１の課題である。
また本発明は、このようなiD-ユニットを含むデルマタン硫酸由来の機能性硫酸化オリゴ糖を提供することを第２の課題とする。従来、ヘパリンコファクターIIと結合し血液凝固阻害活性をもつオリゴ糖以外には、デルマタン硫酸由来の構造の明確な硫酸化オリゴ糖は知られていなかった。本発明は特に、増殖因子や神経栄養因子の活性調節に関与する機能性硫酸化オリゴ糖の提供をその課題とする。
上述のように、多硫酸化CS、DS、CS/DSハイブリッド糖鎖は、脳の発生に重要な役割を担っていると考えられる。その一方、本発明者は最近、海産動物ホヤ由来のデルマタン硫酸である前記An-DSが、肝細胞増殖因子 (HGF) のみならず、繊維芽細胞増殖因子-2 (FGF-2)、プライオトロフィン (PTN)、ミッドカイン (MK) およびヘパリン結合性上皮成長因子 (HB-EGF) といった様々な増殖因子と結合することを明らかにした。An-DSは海馬ニューロンの神経突起伸長促進活性をも示すことから、An-DSの有するDS構造が哺乳類の脳の形成・発達段階においても重要な生理機能を発揮している可能性が考えられた。
そこで、脳における機能的多硫酸化DS構造を解析するために、ホヤ由来のAn-DSに対する新規モノクローナル抗体 (mAb) 2A12を作製し、この抗体を用いて免疫組織化学的解析などの後述する種々の解析を行った。その結果、上記抗体2A12によって認識されるエピトープが、出生後7日目の胎仔マウス脳の海馬や小脳に特異的に検出され、成体マウスの小脳では消失すること、上記抗体2A12は培養海馬ニューロンの神経突起伸長を阻害すること等を明らかにした。さらに、上記抗体2A12が認識する2種類の最小十糖断片を単離し、これらiD-ユニットを含む構造の2つの十糖がいずれも、増殖因子及び神経栄養因子とE-CS/DSとの結合を抑制・阻害する従来報告のない新規の機能性硫酸化オリゴ糖であること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
［１］本発明の抗デルマタン硫酸抗体
本発明は第１に、デルマタン硫酸を特異的に認識又は検出する抗体を提供するものである。特に、iD-ユニットを含むデルマタン硫酸を特異的に認識又は検出する抗体は、哺乳類の脳（特に出生後10日頃迄の新生期の脳）において発現する、iD-ユニットを含む機能的デルマタン硫酸エピトープの検出に有用である。ここで、iD-ユニットとは、[IdoUA(2S) α1-3GalNAc(6S)]、即ち、［イズロン酸(2-硫酸)α1−3N-アセチルガラクトサミン(6-硫酸)］の二糖構造を意味し、iD-ユニットを含むデルマタン硫酸とは、このような二糖構造を糖鎖内に１組又は複数組有するデルマタン硫酸を意味する。
iD-ユニットを含むDS構造は、マウス胎仔脳由来の海馬ニューロンにも発現しており、本発明の抗体である前記2A12は培養海馬ニューロンの神経突起伸長を有意に阻害した。前述のように、抗体2A12によって認識されるエピトープが、出生後7日目の胎仔マウス脳の海馬や小脳に特異的に見出された結果とあわせ、これらの結果は、iD-ユニットを含むDS構造が中枢神経系の形成・発達に特異な役割を担っていることを示している。
本発明の抗体は、このように中枢神経系の形成・発達に重要な役割を担っていると考えられる、iD-ユニットを含むデルマタン硫酸の構造と機能に関する研究において特に有用なツールとなるものである。もっとも、本発明の用途はこれに限定されるものではなく、デルマタン硫酸と特異的に結合する抗体として種々の用途を有する。例えば、本発明の抗体は神経突起の形成・伸長を阻害したので、その阻害剤として利用することが可能である。また、研究用試薬としてデルマタン硫酸を含めた糖鎖研究全般への利用のほかに、癌をはじめとする疾病の診断法の開発などに本発明の抗体を利用することも可能である。本発明の抗体によって認識されるデルマタン硫酸は増殖因子等と結合し、細胞の増殖、分化等に関与し、更に多彩な生命活動に関与すると考えられるからである。
本発明の抗体は、後述の実施例に示すように、ホヤ (Ascidian nigra) 由来のデルマタン硫酸An-DSを抗原として作製することができる。An-DS鎖は、ユニークなiD-ユニットの二糖繰り返し構造を有している。前記モノクローナル抗体2A12は、このAn-DSを抗原としてマウスに免疫して作製され、iD-ユニットを豊富に含む後述の十糖（10-aおよび10-b）を最小構造として特異的に認識する抗体である。
勿論、本発明の抗体の作製方法は上記方法に制限されるものではなく、種々の改変が可能である。例えば、抗原はAn-DS以外のものを使用してもよいし、天然物から調製した糖鎖以外に、合成した糖鎖を抗原に使用するものであってもよい。また、作製する抗体はポリクローナル抗体であってもよい。一般的な抗体の作製方法としては、例えば、Harlowらの「Antibodies : A laboratory manual」(Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988))、岩崎らの「単クローン抗体 ハイブリドーマとELISA,講談社(1991)」などに記載の方法を挙げることができる。
ここで抗体とは、特異的な抗原を認識して結合するタンパク質のことを意味しており、その種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなど）、作製に利用した動物の由来（例えば、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ラクダなど）を問わない。また、抗体は、一価或いは多価のいずれでもよい。
また、本発明の抗体は、蛍光物質、放射能、酵素その他のタンパク質（例えば、アビジン）などによって標識化してもよいし、本発明の抗体を認識して結合する第２の抗体を用いることにより、本発明の抗体を標識化することなく、目的とするデルマタン硫酸の検出を行ってもよい。
［２］本発明の機能性硫酸化オリゴ糖
本発明は第２に、iD-ユニットを含むデルマタン硫酸由来の機能性硫酸化オリゴ糖を提供するものである。本発明の機能性硫酸化オリゴ糖は、その糖鎖内にiD-ユニット構造を少なくとも１個有するものであればよいが、連続した又は不連続の複数のiD-ユニット構造を有するものであってもよい。また、糖鎖の長さは特に制限されるものではないが、十糖以上であることが好ましい。
本発明の機能性硫酸化オリゴ糖として、以下の（ａ）又は（ｂ）の十糖構造を有するオリゴ糖が挙げられる。
（ａ）ΔD-iD-iD-iD-iC
（ｂ）ΔD-iD-iD-iD-iD
これら２種類のオリゴ糖（後述の10-aおよび10-b）は、ホヤ (Ascidian nigra) 由来のデルマタン硫酸An-DSを酵素処理により断片化し、さらに、本発明の抗体である前記2A12との反応性を指標にして、単離精製されたものである。このように、これらの十糖10-aおよび10-bは、本発明の抗体2A12によって認識され、また、当該抗体2A12とその抗原であるAn-DSとの結合を阻害する。さらに、これらの十糖10-aおよび10-bは、後述の実施例に示すように、各種増殖因子・神経栄養因子と相互作用し、これら増殖因子及び神経栄養因子とブタ胎仔脳由来のCS/DS鎖 (E-CS/DS) との結合を強く阻害した。なお、実施例で使用した増殖因子及び神経栄養因子は、繊維芽細胞増殖因子2（FGF2）、プレイオトロフィン（PTN）、ミッドカイン（MK）、グリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）および脳由来神経栄養因子（BDNF）であり、いずれも組み換え型ヒト由来のものを使用した。
以上の結果は、本発明の硫酸化オリゴ糖が、これらFGF2, PTN, MKなどの増殖因子およびGDNFやBDNFなどの神経栄養因子、あるいは更にサイトカインなどの他の機能性タンパク質の機能調節に利用できること、例えば、それらのタンパク質と混合して、いわば機能性タンパク質の活性調節結合剤として利用できることを示している。
本発明の硫酸化オリゴ糖である上記10-aおよび10-bは、上述のように、ホヤ (Ascidian nigra) 由来のデルマタン硫酸An-DSを酵素処理することにより作製可能であるが、本発明の硫酸化オリゴ糖の作製方法としては勿論当該方法に制限されるものではない。例えば、An-DS以外の天然物由来糖鎖から単離精製してもよいし、糖鎖合成技術を用いて化学合成してもよいし、化学合成した糖鎖や天然物由来糖鎖を化学的に硫酸化することによって、本発明の硫酸化オリゴ糖を作製してもよい。
セルロースアセテート膜による電気泳動結果を示す図である。コンドロイチナーゼABC (右から3番目のレーン)、AC-I (右から2番目のレーン) およびB (一番右側のレーン) の各分解生成物をセルロースアセテート膜にスポットし、電気泳動を行った。電気泳動後、GAGをアルシアンブルーで染色して検出した。インタクトなAn-DSをコントロールとし (左から2番目のレーン)、標準品のHA、HS、CS-A、CS-Bおよびヘパリン (各々1μg) の電気泳動の挙動を左端のレーンに示した。 Ａ−Ｃは、本発明の抗体mAb 2A12の基質特異性の検討結果を示すグラフである。Ａ：様々なGAGとmAb 2A12との反応性を、種々の標準品のGAGおよびホヤ Halocynthia roretziから調製したiBを主要ユニットとして含む DSであるHr-DSと反応させ、ELISAで調べた。ビオチン化したGAG (各々2μg) をそれぞれ、ストレプトアビジンでコートしたプラスチックプレートのウェルに固相化し、一次抗体mAb 2A12 (400倍希釈) と反応させた後、アルカリホスファターゼを結合したヤギ抗マウスIg (G+M) (5,000倍希釈) と反応させた。二次抗体を基質であるパラニトロフェニルリン酸で検出した。この実験を3回繰り返し行い、その結果を平均値±標準誤差で示した。Ｂ：An-DSとmAb 2A12との反応性に対する様々なコンドロイチナーゼ (CSase) による処理の効果を調べた。An-DS (12μg) をCSase ABC (10 mIU)、CSase B (4 mIU) あるいはCSase AC-I (4 mIU) とCSase AC-II (4 mIU) との混合液で、それぞれ37℃、2時間処理した後、各々の分解物を0.1 M 重炭酸ナトリウム、pH 9.2溶液中で、Nunc社のMaxisorpプラスチックプレートのウェルに添加した。4℃で16時間反応後、ウェルをPBSで洗浄後、上述のようにELISAを行った。ネガティブコントロールとしてAn-DSを除いたものを用いた。ポジティブコントロールとしては、熱で不活化したコンドロイチナーゼABCで処理したAn-DSを用いた。Ｃ：胎仔ブタ脳由来のCS/DS鎖 (E-CS/DS) とmAb 2A12および3種の抗CS抗体 (CS-56、MO-225および473HD) との反応性を、上述したようにELISAで比較した。ネガティブコントロールとしてmAb 2A12を除いたものを用いた。他の3種類の抗CS抗体と比較して、mAb 2A12の反応性は低いが、有意に反応した。＊：0.01 < p < 0.05、コントロールと有意な差あり。 マウス脳における2A12エピトープの免疫組織化学的検出および局在を示す図である。P7 (パネルＡ) および成体 (パネルＥ) マウス由来矢状脳切片を、実験方法に記載した方法で、mAb 2A12を用いて染色した。抗CS mAb CS-56を比較のために用いた (パネルＢおよびＦ)。コンドロイチナーゼABC (パネルＣ) あるいはコンドロイチナーゼB (パネルＤ) でP7マウスの組織切片を前処理したときは、mAb 2A12の染色はわずかであった。これらのCS分解酵素によるエピトープの除去は、成体マウス脳組織においても、同様に検出された。黒塗りの矢印は、mAb 2A12によって染色された部位を示す。Py：錐体細胞層、GrDG：歯状回の顆粒細胞層、WM：白質、GL：顆粒細胞層。CS-56は、CA1領域と歯状回との境界線 (白抜き矢印) を強く染色したが、2A12は染色しなかった。 Ａ−Ｃは、mAb 2A12による海馬ニューロンの染色結果を示す図である。E15.5マウス由来海馬ニューロンを、P-ORNコートしたカバースリップ上で、36〜48時間培養した。細胞を固定し、（Ａ）神経細胞のマーカー (抗-MAP2および抗-NF) あるいは（Ｂ）mAb 2A12で染色した。（Ｃ）に両者の重ね合わせた染色パターンを示した。mAb 2A12は、神経突起および複数の神経突起を有する細胞体を特異的に染色した。スケール：50μm。 Ａ−Ｄは、培養海馬ニューロンの神経突起伸長におけるmAb 2A12の影響を調べた結果である。P-ORN層上にE16.5マウス海馬細胞を播種し、2時間後、mAb 2A12を様々な濃度で培養液に加えた。60時間培養後、細胞を固定し、抗-MAP2および抗-NFで染色した。100μg/mlのmAb 2A12の非存在下（Ａ）あるいは存在下（Ｂ）の細胞形態の代表的なイメージを示した。ＣおよびＤ：神経突起伸長における2A12の影響を、神経突起産生細胞（Ｃ）および1細胞あたりの神経突起の総長（Ｄ）の割合で計測した。コントロールとして、マウスIgM (100μg/ml) を用いた。3回実験を行い、得られた値の平均値±標準誤差を示した。＊：0.01 < p < 0.05、＊＊：0.001 < p < 0.01、外来性の抗体なしの実験から得られた値と有意な差を示す。スケール：50μm。 Ａ−Ｄは、mAb 2A12によって認識されるAn-DSの最小サイズを検討した結果である。Ａ：酵素で部分分解したAn-DSのゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。コンドロイチナーゼABCでAn-DSを部分分解し、その分解物をSuperdex Peptide (10 x 300 mm) カラムを用いてゲルろ過で分画した。バーと矢印で示した画分を回収した。分解して得られた各ピークの分子量をMALDI-TOF MS分析により決定した。数字は構成単糖を示す（2-12糖）。Ｂ：ゲルろ過で得られた各々の画分の等量 (0.5μg) を用いて、mAb 2A12と固相化したAn-DSとの反応に対する阻害活性をELISA法で求めた。十糖画分が、有意な阻害活性を示す最小サイズであった。Ｃ：十糖画分を実験方法に記載した方法に従い、陰イオン交換HPLCを行い、2種類の主要な十糖画分10-aと10-bを得た。＊：ベースラインのシフト。Ｄ：2種類の精製した十糖を、上述のようにELISAで阻害実験を行った。10-aおよび10-bは、同程度の阻害活性を示した。ＢおよびＤの値は、2回の独立した実験から得られた平均値±標準誤差で示した。 Ａ・Ｂは、An-DS十糖10-aの酵素化学的解析結果を示すグラフである。十糖10-aを2ABで蛍光標識し、コンドロイチナーゼABCとΔヘキスロン酸-2-スルファターゼで処理した。Ａ：2ABラベルした標準品と2ABラベルした10-aのコンドロイチナーゼABCによる分解物 (ピークb) のコクロマトグラフィー。a，ΔHexUA(2S)-GalNAc(6S)-GlcUA-GalNAc(6S)-2AB；c，ΔHexUA(2S)-GalNAc(6S)-GlcUA(2S)-GalNAc(6S)-2AB；d，ΔHexUA(2S)-GalNAc(6S)-IdoUA(2S)-GalNAc(6S)-2AB。Ｂ：コンドロイチナーゼABCで処理した10-aをさらに、Δヘキスロン酸-2-スルファターゼで処理した生成物の陰イオン交換HPLC。Δヘキスロン酸-2-スルファターゼで処理すると、2ABラベルした10-aのコンドロイチナーゼABCによる分解物の溶出位置が、38.2分 (ピークb) から32.2分 (ピークb’) にシフトした。これは硫酸基が１つ取り除かれたことを示す。 固定化したE-CS/DSと増殖因子および神経栄養因子との結合に対する、mAb 2A12によって認識されるAn-DS十糖10-aおよび10-bの影響を調べた結果を示すグラフである。BIAcoreシステムを用いて、増殖因子 (FGF2、PTNおよびMK) や神経栄養因子 (GDNFおよびBDNF) とE-CS/DS鎖との結合に対する、An-DS 10-aおよび10-bの阻害効果を解析した。各々の増殖因子あるいは神経栄養因子と十糖10-aあるいは10-b (1.5μg/ml) とを混合し、E-CS/DS-固相化センサーチップの表面に注入した。増殖因子あるいは神経栄養因子とインタクトなE-CS/DS鎖 (1.5μg/ml) との共注入を、比較のために行った。GAGを含まない増殖因子または神経栄養因子の溶液を注入した時に得た結合反応の値と比較し、糖鎖による阻害活性を計算した。 2A12エピトープの毛包での発現を示す写真（倍率x200）である。左側は、抗体2A12によるマウス毛包（hair follicle）の染色結果、右側は、DAPIによる細胞核の染色結果をそれぞれ示す。 2A12エピトープの毛包での発現を示す写真（倍率x400）である。左側は、抗体2A12によるマウス毛包（hair follicle）の染色結果、右側は、DAPIによる細胞核の染色結果をそれぞれ示す。
以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
［1］実験方法
［1-1］An-DSの調製
採取したホヤA. nigra (Chordata-Tunicata)からのGAGの単離は、J. Biol. Chem. 270, 31027-31036 (1995) 記載の方法を若干改変して行った。A. nigraの乾燥した体部 (100 g) をアクチナーゼEで消化し、ピリジニウム塩で沈殿させ、硫酸化GAGとして0.5％の収率を得た。GAG混合液を亜硝酸、pH 1.5で処理してHSを除き、得られたポリマーについて、Acell QMA Plusカートリッジを用いて陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。0.5 M NaClを含む0.3 M リン酸バッファー、pH 6.0 でカートリッジを平衡化し、サンプルを添加後、0.5、1.0および1.5 M NaClを含むリン酸バッファーで段階的に溶出した。1.5 M NaCl溶出画分 (144 mg) の一部 (60 mg) について、同一の条件下で再度、陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。その結果、同一画分に50.4 mgが回収された。このサンプルは2.4％のペプチドを含んでいたが、HPLC分析により調べたところ、HSおよびヒアルロン酸は検出されなかった。このサンプルをマウスに免疫した。C-18疎水クロマトグラフィーによりDS-ペプチド画分から遊離のペプチドを除いてから、抗体のスクリーニングと構造解析および機能解析に用いた。C-18カラムから水で溶出したDS-ペプチド画分をAn-DSとした。このAn-DSは完全にコンドロイチナーゼABCで分解されたので、高い純度をもつことを確認できた。
［1-2］セルロースアセテート膜上での電気泳動
An-DS (各々2μgずつ) をコンドロイチナーゼABC (10 mIU)、AC-I (4 mIU) あるいはB (4 mIU) で37℃、1時間処理した。各々の分解物をセルロースアセテート膜にスポットし、30分間、100 Vの定圧下で電気泳動を行った。その後、膜をアルシアンブルー (0.1％酢酸中に0.1％の濃度) 溶液で10分間染色し、0.1％酢酸で20分間脱色した。
［1-3］酵素結合免疫測定法 (ELISA)
特に断りのない限り、実験は室温で行った。抗体のスクリーニングおよび基質特異性を調べるために、ストレプトアビジンでコートしたプレートを用いた。様々なGAGのサブタイプに対する抗体の反応性をELISAにより調べた。様々なGAGをビオチン化し、プレートに固相化した。それぞれのウェルについて、1％ウシ血清アルブミンでブロッキングを行い、抗体を含むハイブリドーマ上清あるいは腹水液と反応させた後に、アルカリホスファターゼを結合したヤギ抗マウスIgG (G+M) あるいはIgMと反応させた。その二次抗体をパラニトロフェニルリン酸を基質として、415 nmにおける吸光度で検出した。ネガティブコントロールとして、An-DSあるいは一次抗体を加えないものを用いた。一次抗体として用いたmAb 473HDあるいは市販の抗CS抗体であるCS-56およびMO-225は、50倍希釈して用いた。
ELISA法での阻害実験には、プレートにのせる前に、0.5μgのGAGあるいはコンドロイチナーゼABC分解 (後述) によって調製したオリゴ糖画分をmAb 2A12 (腹水液として、400倍希釈) と室温で1時間、全量50μlで反応させた。阻害活性は、GAGを含まないコントロールで得られた吸光度との相対減少率として算出した。
二糖繰り返し領域とオリゴ糖-ペプチド結合領域を含むAn-DS中の2A12エピトープを決定するために、精製したAn-DS (12μg) を、コンドロイチナーゼABC (10 mIU) およびB (4 mIU)、あるいはコンドロイチナーゼAC-I (4 mIU) とAC-II (4 mIU) の混合液で、それぞれ37℃で2時間反応させた。加熱処理で不活化したコンドロイチナーゼABCで処理したものをコントロールとした。それらの分解物を0.1 M 重炭酸ナトリウム緩衝液、pH 9.2と混合し、Maxisorpプレートに加えた。4℃で16時間反応後、リン酸緩衝食塩水 (PBS) で洗浄し、後述の操作を行った。基質であるパラニトロフェニルリン酸を加えて、2時間後、吸光度を記録した。
［1-4］抗体の作製と選別
A. nigraから得たDS-ペプチドを用いて、BALB/cA Jolマウスに免疫し、モノクローナル抗体を作製した。2週間ごとに 200μgをマウスの背中の皮下に注入した。3回注入後、その血清を用いて、高度に精製したAn-DSに対する反応性をもとにELISA法でスクリーニングした。融合ハイブリドーマ細胞を培養後、ビオチン化An-DSを用いて、その培養上清を用いてELISA法でスクリーニングした。4種類の陽性クローン (2A12、3G11、4B5および5F4) を選別した。各々のクローンの基質特異性を調べるために、マウスの腹腔にこれらのクローンを注射した。こうして得られた抗体の中で、mAb 2A12が高い特異性を示し、この抗体によるマウス脳の染色パターンがユニークだったので、この抗体の性質をさらに調べた。
2A12の一定量をマウスIgM精製キットを用いて精製した。精製した抗体をBCAタンパクアッセイによって定量し、培養胎仔海馬ニューロンの神経突起伸長の阻害実験に用いた。
［1-5］免疫組織化学
P7および成体ddYマウスを麻酔し、脳を摘出し、直ちにドライアイスで凍結し、−80℃で保存した。摘出後2-4日以内に、凍結脳の切片を12μmの厚さで作製し、60℃で1時間熱して脱水し、−80℃で保存し、用いた。抗体の免疫組織化学染色をするために、脳切片をアセトン-メタノール (1 : 1) で固定し、蒸留水で再水和させた。その切片を以下の溶液で処理した。：（１）PBS (10 mM、pH 7.4) 中、2.5％ 過酸化水素、30分間；（２）PBS中、1％ BSA、4％ 正常ヤギ血清、60分間；（３）1％ BSA/PBS中、一次抗体 (2A12およびCS-56をそれぞれ、200倍および100倍希釈して用いた)、4℃、一昼夜；（４）1％ BSA/PBS中、ビオチン化抗マウスIgM (μ鎖) (8 ng/ml)、60分間；（５）PBS中、ベクタステインABC溶液 (200倍希釈)、60分間；（６）トリス緩衝食塩水 (TBS、20 mM、pH 7.6) 中、0.06％ ジアミノベンジヂン、0.01％ 過酸化水素。最後に、切片を濃度の異なる一連のエタノール溶液で固定し、キシレンを含むマウント溶液でマウントした。コントロールとして、マウスIgMを一次抗体として用いた。抗体の染色特異性を確認するために、プロテアーゼを含まないコンドロイチナーゼABC (2 mIU/切片) で脳切片を処理し、CSおよびDSを取り除いた。それから、上述のように免疫組織化学染色を行った。
［1-6］細胞培養
海馬細胞は、J. Cell Biol. 126, 783-799 (1994) 等に記載の方法に従い、15.5日 (E15.5) あるいは16.5日齢 (E16.5) の胎仔マウス脳を用いて培養した。海馬は顕微解剖によって得、数分間トリプシン処理して細胞を分離した。分離した細胞をN2サプリメントを含むイーグルの最少必須培地 (EMEM) で懸濁し、P-ORNコートしたカバースリップ上にまき、加湿した5％ CO2の下、37℃で培養した。
［1-7］免疫組織化学
E15.5齢のマウスの海馬の細胞を48時間培養後、PBSで1回洗浄し、4％ パラホルムアルデヒドを含むPBSで30分間固定した。固定した細胞をPBSで3回洗浄後、1％ BSA/4％ 正常ヤギ血清を含むPBSでブロッキングし、PBSで3回洗浄後、0.2％ トリトン-X100を含むPBSで30分間浸透し、抗-MAP2 (200倍希釈) および抗-NF (200倍希釈) を含む1％ BSA/PBS溶液で4℃において、一昼夜反応させた。PBSで3回洗浄後、蛍光Alexa 568を結合したヤギ抗マウス IgG (200倍希釈) および蛍光Alexa 488を結合したヤギ抗マウス IgM (200倍希釈) を含む1％ BSA/PBS溶液を細胞と1時間反応させた。細胞をPBSで3回洗浄後、マウントし、オリンパス社の共焦顕微鏡下で観察した。
［1-8］神経突起伸長測定
E16.5マウス脳海馬ニューロンの神経突起伸長を、J. Cell Biol. 126, 783-799 (1994) 等に記載の方法を少し改変した方法を用いて測定した。分離した海馬の細胞をP-ORNでプレコートしたカバーグラス上に、10,000、25,000あるいは50,000細胞/cm2で播き、2時間培養した。前培養後、精製したmAb 2A12 (10-200μg/ml) を培養液に加えた。コントロールとして、マウスIgMを加えた。
60時間培養後、4％ パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、それから抗-MAP2および抗-NFで免疫組織化学染色を行い、上述のように色素原としてジアミノベンジヂンを用い、ベクタステインABCキットで、二次抗体を検出した。神経突起伸長の評価は、1細胞あたり少なくとも1つの突起を産生する細胞の割合を決定し、またその神経突起の総長の割合としても求めた。神経突起は、細胞体長よりも長いものを選択し、計測した。約300細胞を無作為に選別し、突起をもつ細胞の割合を計算する一方、1枚のカバースリップ上の100細胞について、神経突起の長さを測定した。このような測定を3回繰り返して行い、平均値±標準誤差として表した。平均値の有意差は、Student t検定により求めた。
［1-9］マトリックス支援レーザ脱離イオン化 飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)
オリゴ糖 (精製した十糖5〜10 pmolおよび未精製のオリゴ糖混合物30 pmol) を乾燥して、1-2μlの (Arg-Gly)15 (10 pmol) と混合し、そこに1μlのゲンチジン酸溶液 (1mg/ml) を混合した。(Arg-Gly)15 およびゲンチジン酸をコントロールとして、各々の混合溶液をMS解析用プレート上にスポットした。HCD1001法を使用し、ポジティブモードで解析した。MSスペクトルはVoyager DE-RP-Pro (PerSeptive Biosystems、Framingham、MA) でリニアモードで記録した。
［1-10］An-DSの断片化
An-DS (2 mg) を全量100μl、60 mM 酢酸ナトリウムを含む50 mM トリス-塩酸緩衝液、pH 8.0の中で、プロテアーゼを含まないコンドロイチナーゼABC (25 mIU) と37℃、32分間反応させた。100℃で1分間煮沸後、分解物を、Superdex Peptide (10 x 300 mm) カラムを用いたゲルろ過で、0.2 M 重炭酸アンモニウム溶液を溶媒として、流速0.3 ml/分で分画した。各々のピークを回収し、同一条件で再度ゲルろ過を行い、蒸発乾固を繰り返し行うことによって脱塩し、カルバゾール反応を利用して定量した。各々の画分のサイズは、上述したMS分析によって決定した。
［1-11］陰イオン交換クロマトグラフィーによる十糖の分画および二糖組成分析
十糖画分の分離および二糖組成はそれぞれ、CS-D由来の八糖の分離（J. Biol. Chem. 273, 3296-3307 (1998)）および2-アミノベンズアミド (2AB)で誘導化した不飽和CS二糖の分離方法と同様に、アミン結合シリカPA-03カラム (YMC社) を用いて、流速1 ml/分、リン酸ナトリウムの濃度勾配による高速液体クロマトグラフィー (HPLC) で分析した。バクテリアのコンドロイチナーゼによって得られた不飽和二糖の同定と定量は、CSおよびDS鎖の標準不飽和二糖の溶出位置との比較で決定した。
Δ4,5HexUAα1-3GalNAc (ΔOユニット) はGlcUAβ1-3GalNAc (Oユニット)から産生される。
Δ4,5HexUAα1-3GalNAc(6S) (ΔCユニット) はGlcUAβ1-3GalNAc(6S) (Cユニット)あるいはIdoUAα1-3GalNAc(6S) (iCユニット)から産生される。
Δ4,5HexUAα1-3GalNAc(4S) (ΔAユニット) はGlcUAβ1-3GalNAc(4S) (Aユニット)あるいはIdoUAα1-3GalNAc(4S) (iAユニット)から産生される。
Δ4,5HexUA(2S)α1-3GalNAc(6S) (ΔDユニット) はGlcUA(2S)β1-3GalNAc(6S) (Dユニット)あるいはIdoUA(2S)α1-3GalNAc(6S) (iDユニット)から産生される。
Δ4,5HexUA(2S)α1-3GalNAc(4S) (ΔBユニット) はGlcUA(2S)β1-3GalNAc(4S) (Bユニット)あるいはIdoUA(2S)α1-3GalNAc(4S) (iBユニット)から産生される。
Δ4,5HexUAα1-3GalNAc(4S,6S) (ΔEユニット) はGlcUAβ1-3GalNAc(4S,6S) (Eユニット)あるいはIdoUAα1-3GalNAc(4S,6S) (iEユニット)から産生される。
Δ4,5HexUA(2S)α1-3GalNAc(4S,6S) (ΔTユニット)はGlcUA(2S)β1-3GalNAc(4S,6S) (Tユニット)あるいはIdoUA(2S)α1-3GalNAc(4S,6S) (iTユニット)から産生される。
［1-12］酵素処理
二糖組成分析のため、多糖あるいはオリゴ糖 (二糖として100〜500 pmol) を5mIUのコンドロイチナーゼABCを用い、37℃、2時間処理した。その分解物を2-AB化し、過剰の2ABをクロロホルムで除去した。An-DSから精製した50 pmolの十糖 (An-DS 10-aおよび10-b) を様々なコンドロイチナーゼ、コンドロイチナーゼABC (1 mIU)、コンドロイチナーゼB (1 mIU) あるいはコンドロイチナーゼAC-I (0.5 mIU) とAC-II (0.5 mIU) の混合液で、それぞれ、37℃で1時間処理し、各々の酵素による分解能を調べた。その分解物の半量について、PA-03カラムを用いた陰イオン交換HPLCを行い、残りの半量については、さらにΔヘキスロン酸2-スルファターゼ (4μIU) を用いて、全量30μlの0.15％ BSAを含む20 mM ナトリウム緩衝液、pH 6.5中で、37℃で30分間処理した。すべての酵素反応物を100℃、1分間煮沸し、反応を停止した。各々の分解物を2AB化するか、あるいはせずに、陰イオン交換HPLCで分析した。
［1-13］相互作用解析
固相化E-CS/DSと増殖因子や神経栄養因子との結合に対するAn-DS 10-a十糖および10-b十糖による阻害活性を、BIAcoreシステム (BIAcore AB、ウプサラ、スウェーデン) を用いて調べた。E-CS/DS-固定化センサーチップは、J. Biol. Chem. 279, 9765-9776 (2004) 記載のものと同じものを用いた。様々な増殖因子あるいは神経栄養因子 (100 ng/per time) を、多糖あるいはオリゴ糖 (1.5μg/ml) と混合し、センサーチップの表面上にインジェクトした。結合反応を2分間 (結合相) 行った後、そのセンサーを少なくとも2分間洗浄した (解離相)。レスポンスカーブを記録し、糖鎖がない時のレスポンスとある時のレスポンスとの相対的割合で阻害効果を表した。
［2］結果
［2-1］ホヤ (Ascidian nigra) 由来のDSの単離および構造的特徴の解析
A. nigraの成体から前記方法によりAn-DSを単離精製したところ、収率は乾燥重量で0.12％であった。その平均分子量を（J. Biol. Chem. 279, 50799-50809 (2004)）記載の方法に従って、ゲルろ過によって算出したところ、6.3 x 104あった。二糖組成分析を行ったところ、下記表１に示すように、ΔD二糖 (76.6 mol％) が主要な二糖単位で、ΔO、ΔCおよびΔTユニットが微量な二糖単位であった。
［表１：ホヤAscidian nigra由来のDSの二糖組成］Ascidian nigraの成体からDS鎖 (An-DS) を単離し、コンドロイチナーゼABCで、完全に二糖にまで分解した。得られた不飽和二糖の同定および定量を実験方法に示したように、陰イオン交換HPLCによって行った。値は、2回の独立した実験から得られた平均値を示す。

この結果は、以前の報告（J. Biol. Chem. 270, 31027-31036 (1995)）の結果と一致した。興味深いことに、An-DSはその全てもしくは大半がIdoUAを含む二糖から成るが、コンドロイチナーゼAC-IだけではなくコンドロイチナーゼBによっても全く分解されなかった (図1)。
［2-2］抗An-DS 2A12抗体の選択と特異性の評価
マウスでAn-DSに対するモノクローナル抗体を作製し、4種類の抗体を選別した。なかでも2A12は、An-DSに対して特に高い特異性を示した (後述)。そこで本実施例では特にmAb 2A12について特徴を調べた。ビオチン化したGAGをストレプトアビジンコートしたプレート上に各々固相化し、様々なGAGの種類に対する2A12の反応性をELISA法を用いて解析した (図2A)。2A12はAn-DSに対して特異的に反応し、CS-A、CS-B、CS-C、CS-D、CS-E、CS-H、Hr-DS (iB-ユニットを主要二糖単位とするホヤH. roretzi由来DS) およびヘパリンなどの他のGAGには反応しなかった。2A12は、iD [IdoUA(2S)-GalNAc(6S)] を含むAn-DSを、D-ユニット [GlcUA(2S)-GalNAc(6S)] を多く有する (20-21％) CS-Dを含めた他の多硫酸化CSやDSと識別していることを示す結果である。この特異性は、ELISA法による阻害実験で、固定化したAn-DSと2A12との結合に対して可溶性のAn-DSが顕著に阻害することによっても確認した。2A12がインタクトなAn-DSの二糖繰り返し領域を認識しているのか、あるいはオリゴ糖とペプチドとの結合領域を認識しているのかどうかを調べるために、An-DSを様々なコンドロイチナーゼで処理し、二糖繰り返し領域よりも結合領域をより強く結合するNunc社Maxisorpプラスチックプレートを用いてELISA法を行った。図2Bに示すように、コンドロイチナーゼABCで処理したAn-DSに対する2A12の反応性は完全に消失した。これは、2A12がAn-DSの結合領域ではなく、二糖繰り返し領域中の構造を認識していることを示している。An-DSをコンドロイチナーゼAC-I、AC-IIあるいはB処理しても、2A12に対する反応性に変化はなかった。これは、An-DSがこれらのCS分解酵素によっては切断されないという上述の結果を支持する結果である (図1)。mAb 2A12は、ELISA実験で抗マウスIgGあるいはIgAとは結合せず、抗マウスIgMにのみ結合することから、IgMであると判定した。
mAb 2A12とマウス胎仔脳由来のE-CS/DSとの反応性も調べた。A-D-四糖配列 [GlcUA-GalNAc(4S)-GlcUA(2S)-GalNAc(6S)] を含む構造を認識するmAb 473HD、CS-56 およびMO-225と比較して、2A12はE-CS/DSと低い値ではあるが有意な反応性を示した (図2C)。これはおそらく、E-CS/DS鎖に珍しい2A12エピトープが少量含まれているからと考えられる (後述)。mAb 2A12は、D二糖ユニットあるいはiD二糖ユニットを3％有するサメ皮膚由来のDSとも反応した。これらの結果は、2A12エピトープがホヤの成体以外に、他の動物組織にも存在する可能性を示している。
［2-3］マウス脳における2A12エピトープの免疫組織化学的検出と局在
脳の発達に伴う珍しい2A12エピトープの発現を調べるために、生後7日 (P7) と成体マウス脳の切片を用いて、2A12の免疫組織化学的染色を行った。P7と成体マウス脳の矢状切片における染色パターンを、図3に示した。以前の報告（J. Biol. Chem. 278, 35805-35811 (2003)）の結果と同様に、CS-56エピトープはP7の脳で強く普遍的に発現しているが (図3、パネルB)、成体マウスの脳ではその発現が減少していた (図3、パネルF)。対照的に、2A12はP7の海馬と小脳を特異的に染色し (図3、パネルA)、成体マウスの海馬も同様に染色した (図3、パネルE)。2A12はP7の小脳において顆粒細胞層と白質を染色し、海馬においては歯状回とプルキンエ細胞層を染色した。P7の切片をコンドロイチナーゼABCで処理すると、その染色性が完全に消失した (図3、パネルC)。従って、その染色性はCS鎖又はDS鎖あるいはそれらの両方に対して特異的であることを示している。興味深いことに、コンドロイチナーゼBによってもP7の脳の染色性がほとんど消失した (図3、パネルD) ことから、2A12エピトープはDSあるいはCS/DSハイブリッド糖鎖のDSドメイン中に存在することを示唆している。CS分解酵素を利用して、同様に成体マウス脳についても行ったところ、同様の結果が得られた。これらの結果は、2A12エピトープの発現が、マウス脳において空間的または時間的に調節されていることを示している。
［2-4］海馬ニューロンの細胞表面に存在する2A12エピトープの免疫蛍光検出
海馬における2A12の発現をさらに検証するために、胎仔マウス脳から海馬ニューロンを分離し、神経細胞のマーカーに対する抗体 (抗MAP2および抗NF) と2A12を用いて二重染色を行った。図4に示すように、培養海馬ニューロンは、2A12との反応が陽性であった。2A12は、細胞体とほとんどの神経突起を染色した。2A12エピトープの発現は、細胞体の他の領域よりも神経突起出芽領域で、特に高かった。
［2-5］海馬ニューロンの神経突起伸長に対する2A12の影響
海馬ニューロンを分離し、E-CS/DSのサブポピュレーションとP-ORNを含む基質上で、10,000 細胞/cm2の密度で24時間培養すると、複数の神経突起が生成する。E-CS/DS鎖を除いた基質上と、E-CS/DS鎖を含む基質上とで細胞を増殖させ、ニューロンの神経突起の形成を比較すると、E-CS/DS鎖を除いた基質上では、より高密度 (2.5〜5倍) で、より長い培養期間 (2〜3倍) が必要であった (図5A)。そこで、海馬の神経細胞表面に存在する2A12エピトープが神経突起の形成と増殖に関与しているかどうかを調べるために、2A12を海馬ニューロンの培養液に加えた。P-ORNのみを加えた基質上でのニューロンの神経突起伸長を、2A12は有意に抑制した (図5B)。2A12は50μg/mlの濃度で、神経突起の形成を有意に阻害し (図5C)、1細胞あたりの神経突起の総長も減少させることを統計的にも確かめた (図5D)。コントロールとして200μg/mlの濃度のIgMを用いて、同様の実験を行ったところ、神経突起の形成および伸長に対する抑制活性は見られなかった (図5CおよびD)。対照的に、PTNを介したE-CS/DSの神経突起伸長メカニズムとは異なる未同定のメカニズムによると考えられているサメ軟骨由来CS-Eの神経突起伸長促進は、100μg/mlの濃度の2A12によっても影響を受けなかった。このことは、2A12抗体による阻害活性が特異的で、細胞毒性効果ではないことを示している。
［2-6］2A12によって認識される最小構造の同定
2A12エピトープは海馬ニューロンで発現し、おそらく神経突起の形成と伸長に関与しているという結果から、次にこの抗体が認識するAn-DSの最小構造を調べた。インタクトなAn-DSをコンドロイチナーゼABCで部分的に分解し、その分解物をゲルろ過によって分画した。図6Aに示すように溶出画分を集め、MALDI-TOF MSによって各々の画分の分子量を決定した。2A12が認識する最小構造をどの画分が含んでいるかを決定するため、各々の画分を等量用いて、固相化したAn-DSと2A12との反応に対する阻害実験をELISA法で行った。図6Bに示すように、十糖とそれ以上の画分に阻害活性が検出され、分子量が増加するとともに阻害活性も増加した。このことは、An-DS由来の十糖画分に2A12によって認識される最小構造が含まれていることを示している。
次に、陰イオン交換HPLCによって、その十糖をさらに分離し、2種類の主要なオリゴ糖 (An-DS 10-aおよび10-b) を単離した (図6C)。An-DS 10-aおよび10-bの分子量はそれぞれ2613.0と2697.0（下記表２）であった。これは、10-aの十糖構造中に9つの硫酸基が存在し、10-bは10個の硫酸基を有していることを示している。これらの2種類の成分はAn-DSと2A12との反応を有意に阻害した (図6D)。これは、2A12が両者をともに認識することを示している。両オリゴ糖の詳細な配列を、酵素処理と二糖組成分析によって調べた。その結果を下記表２にまとめた。
［表２：コンドロイチナーゼABCで分解後、An-DSから単離した2種類の主要な十糖の性質］各々の構成成分について、分子量、様々なコンドロイチナーゼ (CSase) に対する感受性および二糖組成を実験方法に示した方法に従い、決定した。
［注］
a) MALDI-TOF-MS解析によって決定した分子量。
b) “+”および“-”は、それぞれの酵素処理に対する感受性を示す。
c) ΔCおよびΔD はそれぞれ、ΔHexUA-GalNAc(6S) およびΔHexUA(2S)-GalNAc(6S) を表す。
d) iCおよびiDはそれぞれ、IdoUA-GalNAc(6S) およびIdoUA(2S)-GalNAc(6S) を表す。
e) “+”は、固定化したAn-DSへのmAb 2A12の結合に対する阻害活性を、図2で示したようにELISAで調べた結果を示す。
An-DS 10-aおよび10-bの両者ともコンドロイチナーゼABCで分解されるが、コンドロイチナーゼAC-I、AC-IIあるいはBでは分解されなかった。An-DS 10-bをコンドロイチナーゼABCで消化するとΔDのみが検出された。これは、その十糖構造がΔHexUA(2S)α1→3GalNAc(6S)β1→4IdoUA(2S)α1→3GalNAc(6S)β1→4IdoUA(2S)α1→3GalNAc(6S)β1→4IdoUA(2S)α1→3GalNAc(6S)β1→4IdoUA(2S)α1→3GalNAc(6S) [ΔD-iD-iD-iD-iD] であることを示している。An-DS 10-aをコンドロイチナーゼABCで消化すると、生成したΔCとΔDのモル比は1 : 3.9の割合であった。An-DS 10-a配列中にiCユニットが存在することを確認するため、そのオリゴ糖の還元末端を2ABでラベルし、ラベル化したオリゴ糖をコンドロイチナーゼABCで処理し、続いてΔヘキスロン酸-2-スルファターゼで処理した。コンドロイチナーゼABCはもとのオリゴ糖の硫酸化構造とは無関係に2AB化されたオリゴ糖を切断して2AB化四糖を生成すること、Δヘキスロン酸-2-スルファターゼは非還元末端側のΔHexUAのC-2位から硫酸基を取り除くことが知られている。図7に示すように、2AB化したAn-DS 10-aのコンドロイチナーゼABC分解物をΔヘキスロン酸-2-スルファターゼで処理すると、2AB化不飽和四糖の溶出位置が前にシフトした。このことは、その四糖の非還元末端から硫酸基が取り除かれたことを示している。An-DS 10-b由来の2AB化不飽和四糖においても、このようなシフトが観察された。しかしながら、Δヘキスロン酸-2-スルファターゼは、ネガティブコントロールとして用いたΔA-D-2AB [ΔHexUA-GalNAc(4S)-GlcUA(2S)-GalNAc(6S)-2AB] のような2AB化不飽和四糖の還元末端のΔHexUAのC-2位の硫酸基には作用しなかった。従って、An-DS 10-aは4つの連続したiDユニットと還元末端に存在すると考えられる1つのiCユニットから構成されている。（即ちその構造は、ΔHexUA(2S)α1→3GalNAc(6S)β1→4IdoUA(2S) α1→3GalNAc(6S)β1→4IdoUA(2S)α1→3GalNAc(6S)β1→4IdoUA(2S)α1→3GalNAc(6S)β1→4IdoUAα1→3GalNAc(6S) [ΔD-iD-iD-iD-iC]と考えられる。）これらの結果は、mAb 2A12がiDに富んだ十糖を認識していることを示している。
［2-7］増殖因子や神経栄養因子とE-CS/DSとの結合に対する2A12エピトープの影響
増殖因子や神経栄養因子は、細胞運命の調節と神経突起の形成に重要な役割を果たしている。本発明者は最近、in vitroでE-CS/DS鎖のサブポピュレーションとPTNが協調して、海馬ニューロンの神経突起伸長促進活性を示すことを明らかにした（J. Biol. Chem. 280, 9180-9191 (2005)）。E-CS/DS鎖の多硫酸化二糖単位とIdoUAを含む二糖単位はPTNと結合し、神経突起の伸長には必須である。本実施例では、2A12の神経突起伸長阻害のメカニズムを明らかにするため、固相化したE-CS/DSと増殖因子や神経栄養因子との相互作用に対するAn-DS 10-aおよび10-bによる阻害をBIAcoreシステムにより解析した。図8に示すように、増殖因子以外にも、神経栄養因子であるGDNF (トランスフォーミング成長因子-βスーパーファミリー) とBDNF (脳由来神経栄養因子ファミリーメンバー) もE-CS/DSに結合する。調べた全ての増殖因子と神経栄養因子のE-CS/DS鎖への結合に対して、An-DS 10-aおよび10-bは、インタクトなE-CS/DS鎖よりも強く阻害活性を示した (図8)。興味深いことに、An-DS 10-aおよび10-bは、還元末端側の構造のみが異なっているにもかかわらず、10-bのほうが10-aよりも、PTNあるいはMKとE-CS/DSとの結合をそれぞれ、5倍および3倍強く阻害した。このことは、これら2つの増殖因子に対するオリゴ糖の結合には、還元末端も重要であることを示唆している。これらの結果は、おそらく様々な増殖因子や神経栄養因子との機能的結合部位をmAb 2A12が直接マスクし、それによって調節因子のシグナルを阻害していることを示していると考えられる。
加えて、BDNFやGDNFとE-CS/DSとの結合のKd値はそれぞれ、102.1および28.9 nMであった。これは、固相化したウシ小腸粘膜由来HSとBDNF (Kd = 254 nM) やGDNF (Kd = 24 nM) との相互作用に匹敵する低いKd値で高い親和性を示している。HSがGDNFシグナルに必須であることを考慮すると、GDNFとHSとの結合親和性に匹敵するE-CS/DSの親和性は、HSのように、CS/DS鎖が脳においてGDNFに対するコレセプターとして機能していることを示唆していると考えられる。
［2-8］2A12エピトープ（デルマタン硫酸）の毛包での発現
オスのAdult（8週齢）C57BL6マウスの皮膚の凍結切片を用いて、常法に従って、精製したmAb 2A12とAlexa Fluo 488 goat anti-mouse IgM抗体（抗マウスIgM）で順次処理して染色したところ、図９および図１０に示すように、毛包（hair follicle）の外根鞘の細胞に2A12エピトープ（デルマタン硫酸）の強い発現が認められた。なお各図の右側は、DAPI（4’,6-ジアミノ-2-フェニルインドール）による細胞核の染色結果である。抗体2A12による染色結果については、コンドロイチナーゼABCによる前処理で染色が消失することから、染色の特異性が確認された。また、４％パラホルムアルデヒドで固定して作成したパラフィン包埋切片肝臓、脾臓、心臓、睾丸、骨格筋などでは興味ある染色性は観察されなかった。
以上の結果は、本発明の抗体およびそれによって認識される硫酸化オリゴ糖が、育毛の基礎研究および応用研究への利用可能性を有することを示すものである。
［3］本実施例の結果と考察
本実施例では、ホヤAscidian nigra由来のDSに対する抗体を作製し、マウス脳に存在するユニークな多硫酸化DSエピトープ構造を認識する新規なIgM 抗体 2A12の特徴が明らかにされた。2A12抗体はAn-DSに対して特異的に反応するが、その他の典型的なCS/DSバリアントあるいはヘパリンとは反応しないことがELISA法によって明らかになった (図2A)。これは、その必須残基が→4IdoUA(2S)α1→3GalNAc(6S)β1→および→3GalNAc(6S)β1→4IdoUA(2S)α1→という構造を構成している2-O-硫酸化α-IdoUAと6-O-硫酸化β-GalNAcであることを示している。An-DS十糖は、mAb 2A12とAn-DSとの結合阻害に必要な最小オリゴ糖サイズで、それより長いオリゴ糖はより強く阻害する (図6B)。これは、iD二糖ユニットだけではなく、糖鎖のサイズもまたこの抗体の認識に重要であることを示している。An-DSをコンドロイチナーゼABCによって部分分解して調製した2種類の十糖、ΔD-iD-iD-iD-iDおよびΔD-iD-iD-iD-iCは、固相化したAn-DSへの2A12の結合を、ELISA実験で阻害することがわかった。これは、mAb 2A12がiDに富んだ十糖を最小構造として認識することを示している。現在までに、哺乳動物組織でのiDユニットの存在は示唆されてきたが、少量なうえ、iDユニットとDユニットを識別する特異的な切断酵素が存在しないために、明確な証明がなされていなかった。従って、mAb 2A12はiDユニットとDユニットを区別し (図2Aおよび表2)、iDを含む構造分布の解析に有効なツールとなるものである。
マウス脳、ブタ脳、DSD-1-PG/フォスファカンやバーシカンなどの神経細胞由来のCS-PGに、DあるいはiDが少量 (典型的に1.5〜5％) だが有意量見出されている。特に、mAb 2A12はE-CS/DSと反応し (図2C)、マウス脳の特定の領域 (図3) と海馬ニューロンを認識する (図4)。これは、哺乳動物の脳において、iDを含むDS構造が発現していることを示している。興味深いことに、コンドロイチナーゼABCあるいはBで前処理したマウス脳切片では、2A12の染色性が有意に低下した (図3Cおよび3D)。これは、マウス脳の2A12エピトープが、iDに富んだDSタイプであることを示唆している。脳において2A12エピトープは、An-DSから単離したAn-DS 10aおよび10b十糖のような連続したiDユニットを含んでいると考えられるが、An-DSとその十糖がコンドロイチナーゼBによっては切断されないという結果 (図1および表2) を考慮すると、2A12の最小エピトープが、コアとなるiDユニットと他の二糖構造が混ざった十糖である可能性、あるいは複数のiDユニットが分散して存在している十糖である可能性が存する。脳由来のCS/DS鎖から2A12に反応する構造を単離すれば、この珍しいエピトープの明確な構造決定に役立つであろう。
mAb 2A12を用いた免疫組織化学的染色から、特異的にマウス脳で、時間的-空間的に調節された2A12エピトープの発現が明らかになった。CS-56エピトープの発現が強く、幅広く発現していたという報告（前述）があるのに対し、2A12エピトープの発現は生後早い時期の小脳および海馬に限局していた。これら2種類の明確な染色パターンの違いは、おそらくこれらの抗体の異なる特異性に起因していると考えられる。すなわち、CS-56エピトープは、A-D [GlcUA-GalNAc(4S)-GlcUA(2S)-GalANc(6S)] 四糖を含む八糖であるのに対し、2A12エピトープは上述のようにiDを含む構造であるからである。発達段階のマウス脳および成体マウスの脳において、CA1領域と歯状回との境界線をCS-56が強く染色する一方で、2A12エピトープがどちらにも存在しないことは特筆すべきことである。この領域で、CS-56エピトープの発現によってCA1領域から歯状回への軸索の伸長が阻害されるので、2A12エピトープはおそらく、軸索誘導においてCS-56エピトープとは異なった役割を担っていると考えられる。さらに、発達段階の小脳および海馬に存在する2A12エピトープの時間的-空間的発現は、中枢神経系の中で、特にこれら2つの領域の発達に重要な役割を果たしていると考えられる。このことは、培養胎仔海馬ニューロンが2A12で強く染色されることと、この抗体を添加した培養液で培養した海馬ニューロンの神経突起伸長が阻害されるという結果からも支持される。iDユニットの生合成は、GalNAcの6-O-硫酸化、D-GlcUAのL-IdoUAへの異性化、IdoUAの2-O-硫酸化の順番で起こるであろうと考えられる。なぜなら、GalNAcの6-O-硫酸化は異性化および2-O-硫酸化反応の前に起こり、2-O-硫酸基転移酵素はGlcUAおよびIdoUAの両者に硫酸基を転移するからである。6-O-硫酸基転移酵素、2-O-硫酸基転移酵素およびC-5エピメラーゼによるiDユニットの発現の生合成による調節は、おそらく、海馬と小脳の発達に重要な役割を担っているに違いない。
最近CS/DS鎖は、HSと同様にPTN、MK、HGFおよびFGF7のような様々な増殖因子のシグナルの調節に関与していると報告されている。本発明者は最近、神経突起伸長促進にCS/DS鎖がPTNと協調していること、PTNとCS/DS鎖との相互作用に、多硫酸化二糖単位およびIdoUAを含むユニットが必要であるということを明らかにした。一方で、GDNFやBDNFのような神経栄養因子は、ミエリン形成、パーキンソン病における神経変性の抑制に関与し、さらに、GDNFのシグナルにHSが必要であることが報告されている。また最近では、GDNFとBDNFの両者がヌタウナギ脊索由来CS-Hと結合することや、サメ皮膚由来CS/DSハイブリッド糖鎖とも、それらの神経栄養因子とHSとの結合よりも高い親和性で結合することが明らかにされた。これは、CS/DS鎖がこれら2種類の神経栄養因子のレセプターあるいはコレセプターとして機能していることを示唆している。この概念は、これら2種類の神経栄養因子がHSよりもE-CS/DSとより強く結合する (図8) という結果によっても支持される。興味深いことに、An-DSから単離した十糖は、FGF2、PTN、MK、GDNFおよびBDNFとE-CS/DS鎖との結合を、インタクトなE-CS/DS鎖よりも強く阻害した。この結果は、2A12エピトープがそれらの分子と結合し、それらのシグナル伝達に関与し、細胞形態あるいは分化を調節していることを示すものといえる。各々の増殖因子とE-CS/DSとの結合に対するオリゴ糖の阻害活性は、個々の増殖因子の場合で異なっている。これは、個々の増殖因子とE-CS/DSとの結合特異性が異なることを示唆している。CS/DS鎖中の特定のオリゴ糖ドメインの構造は、神経性疾患や脳の損傷の場合に、特定の増殖因子、神経栄養因子をターゲットとした治療薬として利用できる。本発明者の知る限り、本実施例で単離した2種類の機能的十糖以外に、構造のはっきり決定された硫酸化DSオリゴ糖としては、血液凝固因子であるヘパリンコファクターIIに結合する六糖IdoUA(2S)-GalNAc(4S)-IdoUA(2S)-GalNAc(4S)-IdoUA(2S)-GalNAc(4S)-IdoUA(2S)-2,5-anhydrotalitolが報告されているのみである（J. Biol. Chem. 265, 18263-18271 (1990)）。
脳の発達におけるCS-PGやそれらの糖鎖の機能は、未だ解明されてはいない。これまでに、多硫酸化CS、DSおよびそれらのハイブリッド糖鎖が神経突起伸長を促進することが明らかにされた。それとは対照的に、従来、様々なニューロンの軸索伸長と投射において、脳のCS鎖は内因性の阻害物質であると考えられてきた。すなわち、CS分解酵素によるCS鎖の除去は、黒質線条体路の軸索遮断や脊髄損傷の後の軸索の再生を可能にする。このような現象と神経突起伸長促進活性という一見矛盾した現象がともに観察されることは、発達段階でのCS/DS鎖の構造的変化や、構造の異なるCS/DS鎖が調節するその他の関連物質の微小環境における発現の違いに起因していると考えられる。本発明の抗体および硫酸化オリゴ糖は、中枢神経系の発達に伴うダイナミックな構造的および機能的変化の解析におおいに利用できるツールとなる。例えば本発明の抗体および硫酸化オリゴ糖は、どのようなPGが、この珍しいiDユニットを含む2A12エピトープを有しているのかを調査解析するのに有効であろうし、中枢神経系の発達におけるCS/DS-PGの機能をさらに理解するのに貴重な知見を与えるだろう。
以上のように、本発明の抗体は、様々な研究と診断に応用可能な有用な試薬として利用することができる。また、本発明の硫酸化オリゴ糖は、各種増殖因子、神経栄養因子と相互作用し、更にサイトカインなどの他の機能性タンパク質とも相互作用する可能性を有することから、種々の生理活性調節機能を発揮する有用な生理活性調節剤として利用することができる。例えば、これら機能性タンパク質の機能を調節するために、それらのタンパク質と混合して、いわば機能性タンパク質の活性調節結合剤として利用することができる。

Claims (17)

  1. デルマタン硫酸を特異的に認識・検出することを特徴とする抗体であって、
    以下の（ａ）及び（ｂ）の十糖構造を有する硫酸化オリゴ糖を特異的に認識・検出することを特徴とする抗体：
    （ａ）ΔＤ−ｉＤ−ｉＤ−ｉＤ−ｉＣ
    （ｂ）ΔＤ−ｉＤ−ｉＤ−ｉＤ−ｉＤ
    （ただし、ｉＤは［イズロン酸(2-硫酸)α1−3N-アセチルガラクトサミン(6-硫酸)］（[IdoUA(2S)α1-3GalNAc(6S)]）であるｉＤ−二糖ユニット、
    ｉＣは［イズロン酸α1−3N-アセチルガラクトサミン(6-硫酸)］（[IdoUAα1-3GalNAc(6S)]）であるｉＣ−二糖ユニット、および
    ΔＤは[Δ 4,5 HexUA(2S)α1-3GalNAc(6S)]（Δ 4,5 HexUAは、4-deoxy-L-threo-hex-4-enepyranosyluronic acidを表す。）をそれぞれ表す。）。
  2. ホヤ（Ａｓｃｉｄｉａｎ ｎｉｇｒａ）由来デルマタン硫酸を特異的に認識・検出することを特徴とする請求項１記載の抗体。
  3. 哺乳類の新生期の脳に発現するデルマタン硫酸を特異的に認識・検出することを特徴とする請求項１記載の抗体。
  4. 培養海馬ニューロンに発現するデルマタン硫酸を特異的に認識・検出することを特徴とする請求項１記載の抗体。
  5. 神経突起の形成又は伸長を阻害する活性を有する請求項１記載の抗体。
  6. 毛包（ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ）に発現するデルマタン硫酸を特異的に認識・検出することを特徴とする請求項１記載の抗体。
  7. 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
  8. 前記モノクローナル抗体がマウスに免疫して作製されたものである請求項７記載の抗体。
  9. ホヤ（Ａｓｃｉｄｉａｎ ｎｉｇｒａ）由来のデルマタン硫酸を抗原として作製され、ｉＤ−ユニットを含むデルマタン硫酸を特異的に認識・検出するモノクローナル抗体であって、（１）ホヤ（Ａｓｃｉｄｉａｎ ｎｉｇｒａ）由来のデルマタン硫酸、（２）生後７日のマウス脳の海馬と小脳に現れるデルマタン硫酸および成体マウス脳の海馬に現れるデルマタン硫酸、および、（３）マウスの毛包（ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ）に発現するデルマタン硫酸を特異的に認識・検出し、かつ、神経突起の形成又は伸長を阻害する活性を有することを特徴とする請求項１記載の抗体。
  10. ｉＤ−ユニットを含むデルマタン硫酸を酵素処理することにより得られる硫酸化オリゴ糖であって、
    以下の（ａ）又は（ｂ）の十糖構造を有する硫酸化オリゴ糖：
    （ａ）ΔＤ−ｉＤ−ｉＤ−ｉＤ−ｉＣ
    （ｂ）ΔＤ−ｉＤ−ｉＤ−ｉＤ−ｉＤ
    （ただし、ｉＤは［イズロン酸(2-硫酸)α1−3N-アセチルガラクトサミン(6-硫酸)］（[IdoUA(2S)α1-3GalNAc(6S)]）であるｉＤ−二糖ユニット、
    ｉＣは［イズロン酸α1−3N-アセチルガラクトサミン(6-硫酸)］（[IdoUAα1-3GalNAc(6S)]）であるｉＣ−二糖ユニット、および
    ΔＤは[Δ 4,5 HexUA(2S)α1-3GalNAc(6S)]（Δ 4,5 HexUAは、4-deoxy-L-threo-hex-4-enepyranosyluronic acidを表す。）をそれぞれ表す。）。
  11. 増殖因子および／又は神経栄養因子の活性調節に関与する請求項１０記載の硫酸化オリゴ糖。
  12. 繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、ミッドカイン（ＭＫ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）から選ばれる増殖因子又は神経栄養因子の活性を調節する請求項１１記載の硫酸化オリゴ糖。
  13. 増殖因子および／又は神経栄養因子とＥ−ＣＳ／ＤＳ鎖との結合阻害活性を有する請求項１０記載の硫酸化オリゴ糖（ただし、Ｅ−ＣＳ／ＤＳ鎖はブタ胎仔脳由来コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖を示す。）。
  14. 繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、ミッドカイン（ＭＫ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）から選ばれる増殖因子又は神経栄養因子とＥ−ＣＳ／ＤＳ鎖との結合阻害活性を有する請求項１２記載の硫酸化オリゴ糖（ただし、Ｅ−ＣＳ／ＤＳ鎖はブタ胎仔脳由来コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖を示す。）。
  15. ホヤ（Ａｓｃｉｄｉａｎ ｎｉｇｒａ）由来デルマタン硫酸を酵素処理することにより得られる請求項１０記載の硫酸化オリゴ糖。
  16. ホヤ（Ａｓｃｉｄｉａｎ ｎｉｇｒａ）由来デルマタン硫酸に対する抗体によって認識される請求項１０記載の硫酸化オリゴ糖。
  17. ホヤ（Ａｓｃｉｄｉａｎ ｎｉｇｒａ）由来デルマタン硫酸に対する抗体とその抗原との結合阻害活性を有する請求項１０記載の硫酸化オリゴ糖。
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