JP4870464B2 - Method for selecting substance and drug characterized by measuring PPARδ activation action - Google Patents

Description

本発明は、ペルオキシソーム増殖物質活性化受容体δ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲδ）活性化作用を測定することによる熱産生亢進作用を有する物質の選択方法、及びＰＰＡＲδを活性化する作用を有する化合物を含有する熱産生亢進作用を有する薬剤に関する。また本発明は、脂肪酸、ピルビン酸を基質とするエネルギー代謝（呼吸）細胞内の小器官であるミトコンドリアの機能のうち、脱共役蛋白質（ＵＣＰ）によって惹起される脱共役呼吸又はミトコンドリア内膜のプロトンリーク（以下、プロトンリークと総称する）を特異的に亢進させる薬剤に関する。さらに本発明は、抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、又は内臓脂肪蓄積抑制剤に関する。   The present invention includes a method for selecting a substance having a heat production enhancing action by measuring a peroxisome proliferatoriated receptor (PPARδ) activating action, and a compound having an action to activate PPARδ. The present invention relates to a drug having a heat production enhancing action. The present invention also relates to the function of mitochondria, which is an organelle in energy metabolism (respiration) cells using fatty acid and pyruvate as a substrate, uncoupling respiration induced by uncoupling protein (UCP) or protons in the mitochondrial inner membrane. The present invention relates to a drug that specifically enhances leak (hereinafter collectively referred to as proton leak). Furthermore, the present invention relates to an antidiabetic agent, an antiobesity agent, a visceral accumulated fat reducing agent, or a visceral fat accumulation inhibiting agent.

生体のエネルギー代謝調節系は、摂食調節系とエネルギー消費調節系からなっている。エネルギー消費調節系は、生命維持のための基礎代謝に使用されるエネルギー消費と、それ以外のエネルギー消費に分けられる。後者の範疇で主要なものが熱産生である非ふるえ熱産生（ｎｏｎｓｈｉｖｅｒｉｎｇｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ；ｎＳＴ）で、その機能的な意義は生まれ立て時、寒冷暴露時、冬眠から覚める時などの体温維持や、過剰摂取エネルギーの消費による肥満、糖脂質代謝障害の防御などが挙げられる。特に、恒温動物である哺乳動物や鳥類、特に小動物において、体温維持のため、ｎＳＴは重要である。ｎＳＴの惹起機序には、ミトコンドリアのプロトンリーク、すなわち細胞の呼吸鎖の電子伝達系とＡＴＰ合成の関与が重要である。   The biological energy metabolism regulation system is composed of a feeding regulation system and an energy consumption regulation system. The energy consumption regulation system is divided into energy consumption used for basal metabolism for life support and other energy consumption. Non-shivering thermogenesis (nST), the main category of the latter category, is non-shivering thermogenesis (nST), and its functional significance is maintenance of body temperature such as when born, when exposed to cold, and when waking up from hibernation, and excessive intake energy Of obesity due to consumption of glycine, protection of disorders of glycolipid metabolism, and the like. In particular, nST is important for maintaining body temperature in mammals and birds that are thermostats, particularly small animals. Involvement of mitochondrial proton leak, that is, the electron transport system of the respiratory chain of cells and ATP synthesis is important for the mechanism of nST initiation.

褐色脂肪組織（ＢＡＴ）には、その掲色脂肪細胞（ＢＡ）の呼吸鎖電子伝達系と、ＡＴＰ合成を脱共役させる特異的蛋白質である脱共役蛋白質−１（ＵＣＰ１）とよばれる約３００アミノ酸からなる分子量３２ｋＤの蛋白質が、ミトコンドリアの膜に存在する。ＵＣＰ１は約１００個のアミノ酸からなるドメインの３回繰り返し構造からなり、各ドメインに２箇所ずつ、合計６箇所の膜貫通部位があって、これらの膜貫通部位がミトコンドリアの膜にチャネルを形成している。   Brown adipose tissue (BAT) has about 300 amino acids called uncoupling protein-1 (UCP1), which is a specific protein that uncouples the respiratory chain electron transport system of the display adipocytes (BA) and ATP synthesis. A protein having a molecular weight of 32 kD is present in the mitochondrial membrane. UCP1 is composed of a domain consisting of about 100 amino acids and is repeated three times. There are 6 transmembrane sites, 2 in each domain, and these transmembrane sites form a channel in the mitochondrial membrane. ing.

ＵＣＰ１はプロトンを輸送するキャリアである。ＵＣＰ１等が形成するプロトンチャネルは、電気化学的な勾配に従って自由にプロトンを透過させて熱を放出する機能を発現している。これがｎＳＴとなる。つまりｎＳＴは、プロトンチャネルのプロトン透過によって脱共役を起こし、脱共役によりＡＴＰの合成が低下し、ＡＴＰとＡＤＰの比を一定に維持するためにミトコンドリア内の呼吸が活発になり、その結果として大量の脂肪と糖が酸化されて熱が発生して生じる。   UCP1 is a carrier that transports protons. The proton channel formed by UCP1 or the like expresses a function of freely transmitting protons and releasing heat according to an electrochemical gradient. This is nST. In other words, nST undergoes uncoupling by proton permeation through the proton channel, ATP synthesis decreases due to uncoupling, and respiration in the mitochondria becomes active in order to maintain a constant ratio of ATP and ADP. The heat is generated by oxidation of fat and sugar.

ＵＣＰ１の生理的意義としては、生まれ立て時、寒冷暴露時などにおける体温維持機能が重要であるが、そのほかにトランスジェニックマウスを使った研究より、肥満の防御に関与することが明らかになっている。肥満の発症、進展、維持にＵＣＰ１が関与していることは、様々な肥満モデルでＵＣＰ１の発現が低下していることから示唆されていた。例えば、ＢＡＴ減少トランスジェニックマウスで過食無しに肥満が発症することが確認された（Ｌｏｗｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ，３６６，７４０−７４２（１９９３））。また、ＵＣＰ１遺伝子を脂肪細胞特異的な遺伝子ａＰ２のプロモーターに組込み、ＵＣＰ１を強制的に大量発現させたマウスでは、体脂肪の減少、高脂肪食負荷による食餌性肥満に対する抵抗性が観察された（Ｋｏｐｅｃｋｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６，２９１４−２９２３（１９９５））。さらに、ＵＣＰ１の発現が１／３に抑えられたマウスでは、寒冷暴露時の体温維持能低下、体脂肪量増加による肥満、そしてインスリン抵抗性が確認された（ＬｏｗｅｌｌＢ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６６，７４０−７４２（１９９３））。さらにＵＣＰ１のノックアウトマウスは寒冷非耐性であった（Ｅｎｅｒｂａｃｋ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８７，９０−９４（１９９７））。以上のように、ＵＣＰ１が熱産性分子として体温調節やエネルギー消費に重要な役割を有し、肥満と密接な関係にあることは動物実験の結果から明らかとなっている。   As a physiological significance of UCP1, body temperature maintenance function is important at the time of birth and exposure to cold, but other studies using transgenic mice have revealed that it is involved in obesity protection. . It has been suggested that UCP1 is involved in the onset, progress and maintenance of obesity because UCP1 expression is reduced in various obesity models. For example, it was confirmed that obesity develops without overeating in BAT-reducing transgenic mice (Lowell et al., Nature, 366, 740-742 (1993)). Moreover, in mice in which the UCP1 gene was integrated into the promoter of the adipocyte-specific gene aP2 and UCP1 was forcibly expressed in large amounts, a decrease in body fat and resistance to dietary obesity due to a high fat diet were observed ( Kopeky et al., J. Clin. Invest., 96, 2914-2923 (1995)). Furthermore, in mice in which the expression of UCP1 was suppressed to 1/3, decreased body temperature maintenance ability upon exposure to cold, obesity due to increased body fat mass, and insulin resistance were confirmed (LowellBB et al., Nature). 366, 740-742 (1993)). Furthermore, UCP1 knockout mice were cold tolerant (Enerback S. et al., Nature 387, 90-94 (1997)). As described above, it has become clear from the results of animal experiments that UCP1 has an important role in thermoregulation and energy consumption as a thermogenic molecule and is closely related to obesity.

ＵＣＰ１の発現量は、主に核内の遺伝子の転写レベルで調節されており、ｃＡＭＰ濃度上昇によりＵＣＰ１遺伝子発現は増加する（斎藤ら、最新医学、５２，１０９５−１０９６（１９９７））。   The expression level of UCP1 is mainly regulated by the transcription level of the gene in the nucleus, and the expression of UCP1 gene increases with increasing cAMP concentration (Saito et al., Modern Medicine, 52, 1095-1096 (1997)).

細胞内のエネルギー消費の約２０〜４０％はミトコンドリア内膜のプロトンリークによって生じると考えられている。ＢＡＴが少量しかないヒト成人やその他の動物では、ｎＳＴの大部分は骨格筋や白色脂肪組織（ＷＡＴ）で生じると考えられていた。以上のことから、ＢＡＴ以外の組織におけるＵＣＰの存在が推定されていた。１９９７年には、二つのグループから相次いでＢＡＴ以外の組織からＵＣＰ２のｃＤＮＡクローニングが報告された（Ｆｌｅｕｒｙら、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ，１５，２６９−２７２（１９９７）；Ｇｉｍｅｎｏら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４６，９００−９０６（１９９７））。   About 20-40% of intracellular energy consumption is thought to be caused by proton leakage in the mitochondrial inner membrane. In human adults and other animals that have only a small amount of BAT, the majority of nST was thought to occur in skeletal muscle and white adipose tissue (WAT). From the above, the existence of UCP in tissues other than BAT has been estimated. In 1997, UCP2 cDNA cloning was reported from two groups in succession from two groups (Fleury et al., Nature Genet, 15, 269-272 (1997); Gimeno et al., Diabetes 46, 900-906 (1997). )).

ヒトＵＣＰ２はヒトＵＣＰ１と５９％のホモロジーを示し、ＵＣＰ１と同様に６箇所の膜貫通部位を有するチャネルを形成し、かつプリンヌクレオチド結合部位を有している。ＵＣＰ２はＵＣＰ１とは異なり、全身組織に広汎に発現しており、特に肺、膵臓で高濃度で発現している。ほかにも心臓、肝臓、脳、腎臓、精巣、ＷＡＴ、ＢＡＴ、骨格筋で発現が検出されている。   Human UCP2 shows 59% homology with human UCP1, forms a channel having 6 transmembrane sites, and has a purine nucleotide binding site, like UCP1. Unlike UCP1, UCP2 is widely expressed in whole body tissues, and is expressed at a high concentration particularly in lung and pancreas. In addition, expression is detected in the heart, liver, brain, kidney, testis, WAT, BAT, and skeletal muscle.

ＵＣＰ２の機能については、高脂肪食負荷マウスで副精巣周囲脂肪組織のＵＣＰ２遺伝子発現の亢進が認められている。しかし、ＵＣＰ２のノックアウトマウスは、寒冷条件下で体温維持能が正常であることが報告された（ＡｒｓｅｎｉｊｅｖｉｃＤ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ ２６，３８７−３８８（２０００））。また上述のＵＣＰ１のノックアウトマウスでは、代償作用と考えられる、掲色脂肪組織におけるＵＣＰ２の大幅な発現亢進が認められるが、このマウスは寒冷非耐性であった（ＥｎｅｒｂａｃｋＳ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８７，９０−９４（１９９７））。さらに、ＵＣＰ２は膵β細胞において細胞内ＡＴＰ濃度変化を介し、インスリン分泌を抑制していることが示された（ＺｈａｎｇＣ．−Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０５，７４５−７５５（２００１））。これは抗糖尿病の観点からみると相反する特性であった。以上のように、ＵＣＰ２については、そのプロトンチャンネルとしての脱共役能は確認されているものの、現在までのところ、エネルギー消費／肥満との関連性は明らかにはされていない。   Regarding the function of UCP2, increased UCP2 gene expression in adipose tissue surrounding the accessory testis is observed in mice with a high fat diet. However, UCP2 knockout mice were reported to have normal body temperature maintenance ability under cold conditions (Arsenievic D. et al., Nature Genet 26, 387-388 (2000)). Moreover, in the above-mentioned knockout mice of UCP1, a significant increase in the expression of UCP2 in the displayed adipose tissue, which is considered to be a compensatory effect, was observed, but this mouse was cold-tolerant (EnnerbackS. Et al., Nature 387, 90-94 (1997)). Furthermore, UCP2 was shown to suppress insulin secretion through changes in intracellular ATP concentration in pancreatic β cells (ZhangC.-Y. Et al., Cell 105, 745-755 (2001)). This was a contradictory characteristic from the viewpoint of anti-diabetes mellitus. As described above, UCP2 has been confirmed to have uncoupling ability as a proton channel, but to date, its relationship with energy consumption / obesity has not been clarified.

生体内の余剰エネルギーは、まず優先的に内臓脂肪（特に腸管膜脂肪）として蓄積される。この内臓脂肪は他の部位の脂肪（特に皮下脂肪）に比べ、脂肪動員を受けやすく、速やかに分解され、消費される。この内臓脂肪（肥満）は生活習慣病（成人病）発症の多重危険因子とみなされている。その理由は、ＷＡＴの白色脂肪細胞（ＷＡ）からの分泌脂肪酸が門脈を経由して直接肝臓に流入してインスリン抵抗性と脂肪合成を亢進し、その結果、耐糖能異常、高血圧および高脂血症を惹起し、最終的にはこれらが合併して動脈硬化を発症するに至るためである。したがって、内臓脂肪の蓄積抑制と蓄積内臓脂肪の低減化が、ヒト成人の糖尿病をはじめとする生活習慣病発症予防およびその治療に有効であると期待される。   Surplus energy in the living body is first preferentially accumulated as visceral fat (especially mesenteric fat). This visceral fat is more susceptible to fat mobilization than other parts of the body (especially subcutaneous fat) and is quickly broken down and consumed. This visceral fat (obesity) is regarded as a multiple risk factor for the development of lifestyle-related diseases (adult diseases). The reason is that secreted fatty acid from white fat cells (WA) of WAT flows directly into the liver via the portal vein and promotes insulin resistance and fat synthesis, resulting in impaired glucose tolerance, hypertension and high fat. This is because blood is induced, and finally they are combined to cause arteriosclerosis. Therefore, suppression of visceral fat accumulation and reduction of accumulated visceral fat are expected to be effective in preventing and treating lifestyle-related diseases such as diabetes in human adults.

ペルオキシソーム増殖物質活性化受容体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲ）は、その構造などから核内受容体（核ホルモン受容体）スーパーファミリーの一員と考えられている。これまで、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ（別称ＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）、およびＰＰＡＲγと称される３種のＰＰＡＲのサブタイプが同定され、それらの遺伝子（ｃＤＮＡ）がクローニングされている（Ｌｅｍｂｅｒｇｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２，３３５−３６３（１９９６））。   Peroxisome proliferator activated receptor (PPAR) is considered to be a member of the nuclear receptor (nuclear hormone receptor) superfamily because of its structure and the like. So far, three PPAR subtypes called PPARα, PPARδ (also known as NUC-1, PPARβ, FAAR), and PPARγ have been identified and their genes (cDNAs) have been cloned (Lemberger et al., Annu). Rev. Cell. Dev. Biol., 12, 335-363 (1996)).

これら３種のうち、ＰＰＡＲαに関しては、そのリガンド効果を有することが知られているフィブレート系薬剤に、臨床で強い血清トリアシルグリセロールレベル低下作用が認められている（Ｆｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，４３１２−４３１７（１９９７））。   Among these three types, regarding PPARα, fibrates that are known to have a ligand effect have been observed to have a strong serum triacylglycerol level lowering effect in clinical practice (Forman et al., Proc. Natl. Acad). Sci. USA, 94, 4312-4317 (1997)).

ＰＰＡＲγは特に脂肪組織で発現しており、脂肪細胞の分化に深く関与する因子であるとされている（Ｔｏｎｔｏｎｏｚら、Ｇｅｎｅｓａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，８，１２２４−１２３４（１９９４）；Ｔｏｎｔｏｎｏｚら、Ｃｅｌｌ，７９，１１４７−１１５６（１９９４））。種々のチアゾリジンジオン誘導体は、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ：ｎｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｉｔｕｓ）のモデル動物で血糖降下作用を示し、インスリン抵抗性解除作用を有する新しいＮＩＤＤＭ治療薬として期待されている。これらチアゾリジンジオン誘導体はまた、ＰＰＡＲγのリガンドとして作用し、ＰＰＡＲγを特異的に活性化することが最近の研究で明らかとなった（Ｌｅｈｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１２９５３−１２９５６（１９９５））。   PPARγ is expressed particularly in adipose tissue and is considered to be a factor deeply involved in adipocyte differentiation (Tontonoz et al., Genesand Development, 8, 1224-1234 (1994); Totonoz et al., Cell, 79, 1147). -1156 (1994)). Various thiazolidinedione derivatives show hypoglycemic action in non-insulin-dependent diabetes mellitus (NIDDM) model animals and are expected as new NIDDM therapeutics having insulin resistance-releasing action. Recent studies have shown that these thiazolidinedione derivatives also act as ligands for PPARγ and specifically activate PPARγ (Lehmann et al., J. Biol. Chem., 270, 1293-112956 (1995). )).

しかしながら、ＰＰＡＲδの生理作用は明らかにされていない（Ｗｉｌｌｓｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３（４），５２７−５０（２０００））。ＷＯ９７／２８１４９号明細書にはＰＰＡＲδリガンドの血中ＨＤＬ上昇作用が、またＷＯ９９／０４８１５号明細書にはＰＰＡＲδ受容体を活性化する物質を投与することによるコレステロール低下作用が開示されている。しかし、ＰＰＡＲδと熱産生亢進作用との関係や、ＰＰＡＲδと脱共役蛋白質との関係については開示も示唆もされていない。   However, the physiological action of PPARδ has not been clarified (Willson et al., J. Med. Chem. 43 (4), 527-50 (2000)). WO97 / 28149 discloses a blood HDL raising action of a PPARδ ligand, and WO99 / 04815 discloses a cholesterol lowering action by administering a substance that activates a PPARδ receptor. However, there is no disclosure or suggestion about the relationship between PPARδ and the heat production enhancing action or the relationship between PPARδ and uncoupling protein.

また、アラキドン酸のような不飽和脂肪酸、カルバプロスタサイクリン（ｃＰＧＩ）、およびＬ−１６５０４１、（４−（３−（２−ｐｒｏｐｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ａｃｅｔｙｌ−ｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌｏｘｙ）−ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）がＵＣＰ２の発現を増加させることがわかった（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．１４，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ａｐｒｉｌ ６，ｐｐ．１０８５３−１０８６０，２００１）。しかし、ＵＣＰ１とＰＰＡＲδの関係については、明らかにされていない。   Also unsaturated fatty acids such as arachidonic acid, carbaprostacyclin (cPGI), and L-165041, (4- (3- (2-propyl-3-hydroxy-4-phenyloxy) propyoxy) -phenoxyacetic acid) Increased the expression of UCP2 (The Journal Of Biological Chemistry, Vol. 276, No. 14, Issue of April 6, pp. 10853-10860, 2001). However, the relationship between UCP1 and PPARδ has not been clarified.

ＷＯ９７／２８１４９号明細書WO97 / 28149 specification ＷＯ９９／０４８１５号明細書WO99 / 04815 specification Ｌｏｗｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ，３６６，７４０−７４２（１９９３）Lowell et al., Nature, 366, 740-742 (1993). Ｋｏｐｅｃｋｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６，２９１４−２９２３（１９９５）Kopeky et al. Clin. Invest. 96, 2914-2923 (1995). ＬｏｗｅｌｌＢ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６６，７４０−７４２（１９９３）Lowell B. B. et al. , Nature 366, 740-742 (1993). Ｅｎｅｒｂａｃｋ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８７，９０−９４（１９９７）Enerback S.M. et al. , Nature 387, 90-94 (1997). 斎藤ら、最新医学、５２，１０９５−１０９６（１９９７）Saito et al., Latest Medicine, 52, 1095-1096 (1997) Ｆｌｅｕｒｙら、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ，１５，２６９−２７２（１９９７）Fleury et al., Nature Genet, 15, 269-272 (1997). Ｇｉｍｅｎｏら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４６，９００−９０６（１９９７）Gimeno et al., Diabetes 46,900-906 (1997). ＡｒｓｅｎｉｊｅｖｉｃＤ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ ２６，３８７−３８８（２０００）Arsenijevic D. et al. , Nature Genet 26, 387-388 (2000) ＥｎｅｒｂａｃｋＳ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８７，９０−９４（１９９７）EnerbackS. et al. , Nature 387, 90-94 (1997). ＺｈａｎｇＣ．−Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０５，７４５−７５５（２００１）ZhangC. -Y. et al. , Cell 105, 745-755 (2001). Ｌｅｍｂｅｒｇｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２，３３５−３６３（１９９６）Lemberger et al., Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , 12, 335-363 (1996) Ｆｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，４３１２−４３１７（１９９７）Forman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4312-4317 (1997) Ｔｏｎｔｏｎｏｚら、Ｇｅｎｅｓａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，８，１２２４−１２３４（１９９４）Totonoz et al., Genesand Development, 8, 1224-1234 (1994). Ｔｏｎｔｏｎｏｚら、Ｃｅｌｌ，７９，１１４７−１１５６（１９９４）Totonoz et al., Cell, 79, 1147-1156 (1994). Ｌｅｈｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１２９５３−１２９５６（１９９５）Lehmann et al. Biol. Chem. , 270, 1293-112956 (1995) Ｗｉｌｌｓｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３（４），５２７−５０（２０００）Willson et al. Med. Chem. 43 (4), 527-50 (2000) Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．１４，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ａｐｒｉｌ ６，ｐｐ．１０８５３−１０８６０，２００１The Journal Of Biological Chemistry, Vol. 276, no. 14, Issue of April 6, pp. 10853-10860, 2001

本発明の目的は、熱産生を亢進させる作用を有する物質の選択方法、及びその薬剤を提供することである。さらに、本発明の目的は、抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、もしくは内臓脂肪蓄積抑制剤を提供することである。   The objective of this invention is providing the selection method of the substance which has the effect | action which accelerates | stimulates heat production, and its chemical | medical agent. Furthermore, an object of the present invention is to provide an antidiabetic agent, an antiobesity agent, a visceral accumulated fat reducing agent, or a visceral fat accumulation inhibiting agent.

本発明者らは、生体エネルギー消費調節系のうちのｎＳＴを促進することによる熱産生亢進作用に着眼した。そして、ミトコンドリアの脱共役呼吸の亢進、ｎＳＴの組織としては相対的に小さいＢＡＴ内ミトコンドリアのプロトンリーク亢進に加え、ＷＡＴ内ミトコンドリアプロトンリーク、及び脱共役蛋白質同族体であるＵＣＰ１の機能を亢進させる手段を創造し、よってその効率を向上させることを意図した。 The present inventors have focused on the heat production enhancing action by promoting nST in the bioenergy consumption regulating system. Further, in addition to the enhancement of mitochondrial uncoupling respiration, the increase of proton leak of mitochondrion in BAT, which is relatively small as an nST tissue, means for enhancing the function of mitochondrial proton leak in WAT and UCP1 which is an uncoupled protein homologue Intended to create and thus improve its efficiency.

本発明者らは、上記課題を解決することを目標として鋭意研究した結果、非特異的ＰＰＡＲリガンドであるカルバプロスタサイクリン（ｃＰＧＩ：６，９α−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−１１α，１５Ｓ−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｐｒｏｓｔａ−５Ｅ，１３Ｅ−ｄｉｅｎ−１−ｏｉｃａｃｉｄ）やイロプロスト（Ｉｌｏｐｒｏｓｔ：５−｛（Ｅ）−（１Ｓ，５Ｓ，６Ｒ，７Ｒ）−７−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−［（Ｅ）−（３Ｓ，４ＲＳ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−５−ｏｃｔｅｎ−６−ｉｎｙｌ］−ｂｉｃｙｃｌｏ［３．３．０］−ｏｃｔａｎ−３−ｙｌｉｄｅｎｅ｝ｐｅｎｔａｎｏｉｃａｃｉｄ）が、骨格筋細胞もしくは脂肪細胞においてＵＣＰ１発現の亢進作用を有することを見出した。   As a result of intensive studies aimed at solving the above problems, the present inventors have found that a non-specific PPAR ligand, carbaprostacyclin (cPGI: 6,9α-methylene-11α, 15S-dihydroxy-prosta-5E, 13E). -Dien-1-oicacid) and iloprost (Iloprost: 5-{(E)-(1S, 5S, 6R, 7R) -7-hydroxy-6-[(E)-(3S, 4RS) -3-hydroxy- 4-methyl-5-octen-6-inyl] -biccyclo [3.3.0] -octan-3-ylidene} pentanoicacid) was found to have an enhancing action on UCP1 expression in skeletal muscle cells or adipocytes .

そして、この新たな知見、ならびにＰＰＡＲαのリガンドであるフィブレート系化合物およびＷｙ１４６４３や、ＰＰＡＲγのリガンドであるチアゾリジンジオン系化合物にＵＣＰ１発現の亢進作用がほとんど認められないという知見を総合し、ＵＣＰ１発現の亢進作用にはＰＰＡＲδが主に関与しているのではないかと考え、ＰＰＡＲδ活性化作用を有する化合物について更に研究した。   The new findings and the findings that fibrates and Wy14643, which are ligands of PPARα, and thiazolidinedione compounds, which are ligands of PPARγ, have almost no effect of enhancing UCP1 expression, Considering that PPARδ is mainly involved in the action, the compounds having PPARδ activation action were further studied.

そして、ＰＰＡＲδ活性化作用を有する物質が、ＵＣＰ１の発現亢進作用を示すことを、ヒトおよびげっ歯類の骨格筋細胞および脂肪細胞を用いた実験により明らかにした。   Then, it was clarified by experiments using human and rodent skeletal muscle cells and adipocytes that a substance having PPARδ activation action exhibits an action of enhancing UCP1 expression.

さらに本発明者らは、このようにＵＣＰ遺伝子の発現がＰＰＡＲδにより制御を受けていることから、ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することによって、ＵＣＰ１遺伝子の発現を増加させ、ｎＳＴ機能を増進させる、熱産生亢進作用を有する物質のスクリーニングが可能であることを見出した。   Furthermore, since the expression of the UCP gene is controlled by PPARδ in this way, the present inventors increased the expression of the UCP1 gene and increased the nST function by measuring the PPARδ activation effect. It was found that screening for substances having a production enhancing action was possible.

すなわち、本発明は以下の事項を包含する。
（１）ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする、熱産生亢進作用を有する物質の選択方法。
（２）ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする、ミトコンドリアの脱共役呼吸を亢進させる作用を有する物質の選択方法。
（３）ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする、ミトコンドリア内膜でのプロトンリークを亢進させる作用を有する物質の選択方法。
（４）ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする、ミトコンドリア含有細胞のＵＣＰ１の発現量を増大させる物質の選択方法。
（５）ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする、脂肪酸β酸化を亢進させる物質の選択方法。
（６）レポーター遺伝子を利用する、（１）から（５）のいずれかに記載の物質の選択方法。
（７）下記1)から3)の工程を含む（６）に記載の熱産生亢進作用を有する物質の選択方法。
1) ＵＣＰ１遺伝子を発現する細胞にＰＰＡＲδ活性化作用を有する物質を接触および／または導入する工程。
2) 前記細胞におけるＵＣＰ１遺伝子の発現量を測定する工程。
3) 前記細胞における前記ＵＣＰ１遺伝子の発現量を増加させる化合物を選択する工程。
（８）前記ＵＣＰ１遺伝子を発現する細胞が、脂肪細胞又は骨格筋細胞である（７）に記載の選択方法。
（９）前記ＵＣＰ１遺伝子を発現する細胞が、脂肪細胞である（７）に記載の選択方法。
（１０）ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、熱産生亢進作用を有する薬剤。
（１１）ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、ミトコンドリアの脱共役呼吸を亢進させる薬剤。
（１２）ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、ミトコンドリア内膜でのプロトンリークを亢進させる薬剤。
（１３）ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、ミトコンドリア含有細胞のＵＣＰ１の発現量を増大させる薬剤。
（１４）ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、脂肪酸β酸化を亢進させる薬剤。
（１５）前記ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質が、非特異的ＰＰＡＲリガンド又はＰＰＡＲδリガンドである（１０）から（１４）のいずれかに記載の薬剤。
（１６）前記ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質が、カルバプロスタサイクリン、イロプロスト、又はｐ−（３−（４−ａｃｅｔｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｒｏｐｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄである（１０）から（１４）のいずれかに記載の薬剤。
（１７）前記ミトコンドリアが骨格筋、白色脂肪組織、もしくは褐色脂肪組織の細胞のものである（１１）から（１３）のいずれかに記載の薬剤。
（１８）前記ミトコンドリアが白色脂肪組織、もしくは褐色脂肪組織の細胞のものである（１１）から（１３）のいずれかに記載の薬剤。
（１９）ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、もしくは内臓脂肪蓄積抑制剤。
（２０）（１０）から（１８）のいずれかに記載の薬剤を有効成分として含有する、抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、もしくは内臓脂肪蓄積抑制剤。 That is, the present invention includes the following matters.
(1) A method for selecting a substance having a heat production enhancing action, characterized by measuring a PPARδ activation action.
(2) A method for selecting a substance having an action of enhancing mitochondrial uncoupled respiration, which comprises measuring a PPARδ activation action.
(3) A method for selecting a substance having an action of enhancing proton leak in the inner mitochondrial membrane, characterized by measuring a PPARδ activation action.
(4) A method for selecting a substance that increases the expression level of UCP1 in a mitochondrial-containing cell, characterized by measuring a PPARδ activation action.
(5) A method for selecting a substance that enhances fatty acid β oxidation, which comprises measuring a PPARδ activation action.
(6) The method for selecting a substance according to any one of (1) to (5), wherein a reporter gene is used.
(7) The method for selecting a substance having a heat production enhancing action according to (6), comprising the following steps 1) to 3).
1) A step of contacting and / or introducing a substance having PPARδ activation action into a cell expressing the UCP1 gene.
2) A step of measuring the expression level of the UCP1 gene in the cell.
3) A step of selecting a compound that increases the expression level of the UCP1 gene in the cell.
(8) The selection method according to (7), wherein the cell expressing the UCP1 gene is an adipocyte or a skeletal muscle cell.
(9) The selection method according to (7), wherein the cell expressing the UCP1 gene is an adipocyte.
(10) A drug having a heat production enhancing action, which contains a substance having an action of activating PPARδ as an active ingredient.
(11) A drug that enhances mitochondrial uncoupled respiration, comprising a substance having an action of activating PPARδ as an active ingredient.
(12) A drug that enhances proton leakage in the inner mitochondrial membrane, containing a substance having an action of activating PPARδ as an active ingredient.
(13) A drug that increases the expression level of UCP1 in mitochondria-containing cells, which contains a substance having an action of activating PPARδ as an active ingredient.
(14) A drug that enhances fatty acid β oxidation, which contains a substance having an action of activating PPARδ as an active ingredient.
(15) The agent according to any one of (10) to (14), wherein the substance having an action of activating PPARδ is a non-specific PPAR ligand or a PPARδ ligand.
(16) The substance having an activity of activating PPARδ is carbaprostacyclin, iloprost, or p- (3- (4-acetyl-3-hydroxy-2-propyoxy)) phenylacetic acid (10) (14) The drug according to any one of (14).
(17) The drug according to any one of (11) to (13), wherein the mitochondria are cells of skeletal muscle, white adipose tissue, or brown adipose tissue.
(18) The drug according to any one of (11) to (13), wherein the mitochondria are cells of white adipose tissue or brown adipose tissue.
(19) An anti-diabetic agent, an anti-obesity agent, a visceral fat accumulation reducing agent, or a visceral fat accumulation inhibitor, which contains a substance having an action of activating PPARδ as an active ingredient.
(20) An antidiabetic agent, an antiobesity agent, a visceral fat accumulation reducing agent, or a visceral fat accumulation inhibitor, which contains the drug according to any one of (10) to (18) as an active ingredient.

本発明のｎＳＴ組織のミトコンドリアのプロトンリーク等を特異的に亢進する作用を有する薬剤は、ＰＰＡＲδ活性化作用を有する化合物またはその誘導体を有効成分とする。本発明の薬剤は、上記有効成分そのものでも、それを含む適宜の配合物、組成物、混合物であってもよい。また、ＰＰＡＲ活性化作用を有する化合物とは、「ＰＰＡＲリガンド」としてＰＰＡＲに結合することにより、ＰＰＡＲの標的遺伝子の転写活性化能を制御する化合物を指し、天然に存在するものに限られず、人工的に合成されたものも含まれる。   The agent having the action of specifically enhancing the mitochondrial proton leak and the like of the nST tissue of the present invention comprises a compound having PPARδ activation action or a derivative thereof as an active ingredient. The drug of the present invention may be the active ingredient itself or an appropriate blend, composition, or mixture containing the same. A compound having PPAR activation activity refers to a compound that regulates the transcription activation ability of a target gene of PPAR by binding to PPAR as a “PPAR ligand”, and is not limited to a naturally occurring compound. Synthetically synthesized products are also included.

上記有効成分の有用性を明らかにするために、実施例に具体的に示されているように、各種ＰＰＡＲリガンドを各種骨格筋細胞、脂肪細胞に添加してＵＣＰ１のｍＲＮＡ量を測定した。その結果、測定したＰＰＡＲαリガンド、ＰＰＡＲγリガンドに対し、有意にＵＣＰ１のｍＲＮＡの発現量が多いものはＰＰＡＲδリガンドであった。なお、ＰＰＡＲδリガンドとしては、例えば、コレステロール低下作用を示す化合物としてＷＯ９９０４８１５号明細書に記載された、ｐ−（３−（４−ａｃｅｔｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｒｏｐｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＹＭ−１６６３８）等が挙げられる。   In order to clarify the usefulness of the above active ingredient, as specifically shown in the Examples, various PPAR ligands were added to various skeletal muscle cells and adipocytes, and the amount of UCP1 mRNA was measured. As a result, the PPARδ ligand was found to have a significantly higher UCP1 mRNA expression level than the measured PPARα and PPARγ ligands. In addition, as a PPARδ ligand, for example, p- (3- (4-acetyl-3-hydroxy-2-propyphenoxy) phenylacetic acid (YM-) described in WO 9904815 as a compound exhibiting a cholesterol lowering action. 16638) and the like.

ある物質について、ＰＰＡＲに対する結合／活性化の程度を簡便かつ高感度に知る方法として、レポーター遺伝子が利用される。例えば酵母の転写因子であるＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域とＰＰＡＲのリガンド結合領域とを結合させた融合蛋白質発現用のベクター、およびＧＡＬ４の応答配列（ＧＡＬ４ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）に連結されたレポーター遺伝子を含むレポータープラスミドを導入した動物細胞を用いる方法が知られている（ＷＯ９６／３３７２４；Ｌｅｈｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１２９５３−１２９５６（１９９５）；Ｗｉｌｌｓｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９，６６５−６６８（１９９６））。レポーター遺伝子を利用する方法とは、例えば、まず被験化合物がＰＰＡＲに結合又は活性化する物質であると、被験化合物がＧＡＬ４のＰＰＡＲのリガンド結合領域に結合する。すると、ＰＰＡＲのリガンド結合領域に融合させたＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域が、レポータープラスミドのＧＡＬ４の応答配列に結合し、レポーター遺伝子の発現が亢進する。レポーター遺伝子によって発現した蛋白質の活性等を測定すること、つまりレポーター活性を検出することによって、被験化合物がＰＰＡＲに結合又は活性化する物質か否かが検出できる。   A reporter gene is used as a method for easily and highly sensitively knowing the degree of binding / activation to PPAR for a certain substance. For example, a fusion protein expression vector in which a DNA binding region of GAL4 which is a transcription factor of yeast and a ligand binding region of PPAR are bound, and a reporter plasmid containing a reporter gene linked to a GAL4 binding element (GAL4 binding element) Methods using introduced animal cells are known (WO 96/33724; Lehmann et al., J. Biol. Chem. 270, 1293-112956 (1995); Willson et al., J. Med. Chem., 39, 665-668). (1996)). For example, when the test compound is a substance that binds or activates PPAR, the test compound binds to the PPAR ligand binding region of GAL4. Then, the DNA binding region of GAL4 fused to the ligand binding region of PPAR binds to the response element of GAL4 of the reporter plasmid, and the expression of the reporter gene is enhanced. By measuring the activity or the like of the protein expressed by the reporter gene, that is, by detecting the reporter activity, it is possible to detect whether or not the test compound is a substance that binds or activates PPAR.

したがって、ＰＰＡＲに結合する未知のリガンドのスクリーニングや被験化合物がＰＰＡＲに結合するリガンドであるか否かの検査において、その天然または人工的に合成されたリガンドを検出し、単離することができる。なお、レポーター活性の検出は、レポーター遺伝子の種類に応じ、染色、蛍光、細胞の生死などを指標に、当業者の技術常識に基づいて適宜行うことができる。   Therefore, in screening for an unknown ligand that binds to PPAR and in the test whether a test compound is a ligand that binds to PPAR, the natural or artificially synthesized ligand can be detected and isolated. The detection of reporter activity can be appropriately performed based on the technical common knowledge of those skilled in the art using dyeing, fluorescence, cell viability, etc. as indicators according to the type of reporter gene.

さらに、本発明におけるスクリーニング方法は、上述のレポーター活性の検出系に（ａ）ＵＣＰ１遺伝子を発現する細胞に被験試料を接触および／または導入する工程、（ｂ）該細胞におけるＵＣＰ１遺伝子の発現量を測定する工程、（ｃ）該細胞におけるＵＣＰ１遺伝子の発現量を増加させる化合物を選択する工程、を加えることができる。   Further, the screening method of the present invention comprises (a) a step of contacting and / or introducing a test sample into a cell expressing UCP1 gene in the above-described reporter activity detection system, and (b) the expression level of UCP1 gene in the cell. A step of measuring, and (c) a step of selecting a compound that increases the expression level of the UCP1 gene in the cell can be added.

スクリーニングに用いる「ＵＣＰ１遺伝子を発現する細胞」としては、特に制限はないが、特に白色脂肪細胞や褐色脂肪細胞等の脂肪細胞、骨格筋細胞が好適である。細胞は、動物組織から分離した初代培養細胞であってもよく、癌化もしくは不死化した株化細胞であってもよい。脂肪細胞としては、例えば、後述する実施例に記載のヒト白色脂肪細胞、あるいはラット褐色脂肪細胞、３Ｔ３−Ｌ１（マウス脂肪細胞）などの各種脂肪細胞が、骨格筋細胞としては、例えば、ＳｋＭＣ（ヒト骨格筋細胞）、Ｃ２Ｃ１２（マウス骨格筋細胞）などの各種骨格筋細胞が好適に用いられる。なおＵＣＰファミリー（脱共役蛋白同族体）遺伝子としては、例えばＵＣＰ１遺伝子、ＵＣＰ２遺伝子、ＵＣＰ３遺伝子、ＵＣＰ４遺伝子が挙げられる。   The “cells that express the UCP1 gene” used for screening are not particularly limited, but adipocytes such as white adipocytes and brown adipocytes, and skeletal muscle cells are particularly suitable. The cells may be primary cultured cells isolated from animal tissue, or may be cancerous or immortalized cell lines. Examples of the adipocytes include human white adipocytes described in Examples described later, or various adipocytes such as rat brown adipocytes and 3T3-L1 (mouse adipocytes), and skeletal muscle cells include, for example, SkMC ( Various skeletal muscle cells such as human skeletal muscle cells) and C2C12 (mouse skeletal muscle cells) are preferably used. Examples of the UCP family (uncoupling protein homolog) gene include UCP1 gene, UCP2 gene, UCP3 gene, and UCP4 gene.

本発明のスクリーニング方法の一工程では、これらＵＣＰ１遺伝子を発現する細胞に被験物質を接触および／または導入し、ＵＣＰ１遺伝子の発現量を測定する。遺伝子の発現量の測定には、当業者によく知られた種々の方法を用いることが可能である。例えば、ノザンブロット法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，２０１−２０６（１９８７），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）あるいはＲＴ−ＰＣＲ法（Ｓｈａｆｆｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９０，２９２−２９６（１９９０））などの方法で、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白質を測定することによって、行うことができる。   In one step of the screening method of the present invention, a test substance is contacted and / or introduced into cells expressing the UCP1 gene, and the expression level of the UCP1 gene is measured. Various methods well known to those skilled in the art can be used to measure the expression level of a gene. For example, the Northern blot method (Sambrook et al., Molecular Cloning, 201-206 (1987), Cold Spring Harbor Laboratory) or the RT-PCR method (Shaffer et al., Anal. Biochem., 190, 292-296 (1990)), This can be done by measuring DNA, RNA or protein.

ＵＣＰ１遺伝子の発現量測定の結果、ＵＣＰ１遺伝子の発現の有意な増加が認められれば、用いた被験試料の化合物はｎＳＴ機能を増進させる作用を有する。ｎＳＴの組織内細胞のミトコンドリアで脂肪および糖が燃焼するためにはＵＣＰ１の発現が不可欠であるが、本発明の有効成分は、前記のように該組織内細胞のＵＣＰ１発現量を顕著に増大させる作用を有する。この分子レベルでの知見から、本発明の薬剤は内臓脂肪蓄積抑制および蓄積内臓脂肪の低減化に有効である。   As a result of measuring the expression level of the UCP1 gene, if a significant increase in the expression of the UCP1 gene is observed, the compound of the test sample used has the effect of enhancing the nST function. Although the expression of UCP1 is indispensable for burning fat and sugar in mitochondria of nST tissue cells, the active ingredient of the present invention remarkably increases the amount of UCP1 expression in the tissue cells as described above. Has an effect. From the knowledge at this molecular level, the drug of the present invention is effective in suppressing visceral fat accumulation and reducing accumulated visceral fat.

実際に、実施例ではＰＰＡＲδリガンドにより発現が亢進したＵＣＰが内臓脂肪蓄積を抑制および低減するべく機能しうること、すなわち細胞内の脂肪および糖の燃焼を促進することを確認するために、各種ＰＰＡＲリガンドを初代ヒト脂肪細胞に添加し、脂肪燃焼亢進の指標のひとつとして知られる脂肪酸β酸化を測定した。実施例に具体的に示されているように、ＵＣＰの発現量に比例して脂肪酸β酸化も亢進した。そして最も脂肪酸β酸化が亢進したのはＰＰＡＲδリガンドであった。   In fact, in the examples, in order to confirm that UCP whose expression is enhanced by PPARδ ligand can function to suppress and reduce visceral fat accumulation, that is, to promote the burning of intracellular fat and sugar, various PPARs are used. Ligand was added to primary human adipocytes, and fatty acid β oxidation, which is known as one of the indicators of fat burning enhancement, was measured. As specifically shown in the Examples, fatty acid β oxidation was also increased in proportion to the expression level of UCP. The fatty acid β oxidation was most enhanced by the PPARδ ligand.

本発明の薬剤は、ｎＳＴに関与する骨格筋、脂肪等の非ふるえ熱産生組織細胞中のミトコンドリアにある内膜貫通型蛋白質のＵＣＰ１の発現量を増大させ、上記細胞中のミトコンドリアの脱共役呼吸、プロトンリーク、及び熱産生を特異的に亢進させる作用を有する。本発明の薬剤は、ＰＰＡＲδ活性化作用を有する化合物またはその誘導体を有効成分とするものであり、上記したように脂肪、骨格筋等のｎＳＴ組織細胞中のＵＣＰ１の発現量を著しく増大させる高ＵＣＰ１発現作用をもつ。本発明の薬剤は、ＵＣＰ１発現活性を指標として同定および分離・精製することができる。そうして得られた物質を有効成分とすることで、特に抗肥満に著効を有する内臓蓄積脂肪低減化剤ないし内臓脂肪蓄積抑制剤を調製することができる。   The agent of the present invention increases the expression level of UCP1 which is a transmembrane protein in mitochondria in non-shrinking heat-producing tissue cells such as skeletal muscle and fat involved in nST, and uncoupled respiration of mitochondria in the cells , Has a function of specifically enhancing proton leak and heat production. The agent of the present invention comprises a compound having a PPARδ activating action or a derivative thereof as an active ingredient, and has a high UCP1 that significantly increases the expression level of UCP1 in nST tissue cells such as fat and skeletal muscle as described above. Has an expression effect. The agent of the present invention can be identified, separated and purified using UCP1 expression activity as an index. By using the substance thus obtained as an active ingredient, a visceral accumulated fat reducing agent or a visceral fat accumulation inhibiting agent that is particularly effective for anti-obesity can be prepared.

本発明の薬剤は、エネルギー代謝や脂質代謝を促進させ、血漿脂質を低下させるので、特に哺乳動物（例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、サル、ネコ、ウマ、ウサギ等）や鳥類の肥満の予防または治療に用いることができる。さらに、肥満に合併する疾患（例えば糖尿病、高血圧症、高脂血症、動脈硬化、虚血性心疾患等の成人病等）等の予防または治療にも有効である。   Since the drug of the present invention promotes energy metabolism and lipid metabolism and lowers plasma lipids, it is particularly obese in mammals (eg, humans, mice, rats, guinea pigs, dogs, monkeys, cats, horses, rabbits, etc.) and birds. It can be used for prevention or treatment. Furthermore, it is also effective for prevention or treatment of diseases associated with obesity (for example, adult diseases such as diabetes, hypertension, hyperlipidemia, arteriosclerosis, and ischemic heart disease).

当該低減剤又は抑制剤の担体としては、その使用形態に応じて、適当な充填剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、表面活性剤、防湿剤、賦形剤、希釈剤などを使用することができる。製剤形態は、その使用目的に応じて適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば錠剤、顆粒剤、粉末剤、丸剤、カプセルなどの固剤や、液剤、懸濁剤、乳剤などが例示される。かくして得られる抗糖尿病剤、抗肥満剤、または内臓蓄積脂肪低減化剤ないし内臓脂肪蓄積抑制剤は経口投与が望ましく、その投与量は、投与する者の症状等に応じて適宜選択される。したがって、投与量、投与回数などは特に限定されない。   As a carrier for the reducing agent or inhibitor, an appropriate filler, binder, extender, disintegrant, surfactant, moisture-proofing agent, excipient, diluent, etc. should be used depending on the form of use. Can do. The form of the preparation may be appropriately determined according to the purpose of use, and is not particularly limited. Examples thereof include solids such as tablets, granules, powders, pills, and capsules, liquids, suspensions, and emulsions. Is done. The thus obtained anti-diabetic agent, anti-obesity agent, visceral fat accumulation-reducing agent or visceral fat accumulation-inhibiting agent is desirably administered orally, and the dosage is appropriately selected according to the symptoms of the recipient. Therefore, the dose, the number of administrations, etc. are not particularly limited.

次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は当該実施例によって何ら限定されるものではない。なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓより発刊）に記載の方法により行った。なお、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品に添付の指示書に従った。   Next, the present invention will be specifically described based on examples, but the present invention is not limited to the examples. In the following examples, unless otherwise specified, each operation is described in “Molecular Cloning” (published by Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press). Performed by the method described. When using commercially available reagents and kits, the instructions attached to the commercially available products were followed.

［実施例１］
ヒト白色脂肪細胞におけるＵＣＰ１およびＵＣＰ２ｍＲＮＡ発現誘導に対する薬剤の影響
（１）ヒト白色脂肪細胞の培養とＲＮＡ調製
ヒト脂肪細胞は、皮下脂肪組織由来の未分化凍結前駆脂肪細胞（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＰ−Ｆ，Ｌｏｔ．Ｎｏ．Ｌ０１１３９９）を米国Ｚｅｎ−Ｂｉｏ社から購入した。これを２４穴プレートにて培養し、業者の指示に従って分化誘導を行うことにより脂肪細胞を得、ヒト白色脂肪組織由来脂肪細胞として使用した。すなわち、２４穴プレートで、ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｍｅｄｉｕｍ培地中、コンフルエントな状態まで３７℃でＣＯ_２インキュベータで培養後、ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ培地に培地交換し、約７２時間培養することにより分化誘導を行った。さらにａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｍｅｄｉｕｍ培地に培地交換し、１４日間培養して白色脂肪細胞へと分化させた。この培養細胞についてさらに以下の条件で培養した。 [Example 1]
Effects of drugs on UCP1 and UCP2 mRNA expression induction in human white adipocytes (1) Human white adipocyte culture and RNA preparation Human adipocytes are derived from subcutaneous adipose tissue-derived undifferentiated frozen preadipocytes ( Cat. No. SP -F). , Lot. No. L011399) was purchased from Zen-Bio. This was cultured in a 24-well plate and differentiation induction was performed according to the instructions of the manufacturer to obtain adipocytes, which were used as human white adipose tissue-derived adipocytes. That is, differentiation induction was performed by culturing in a 24-well plate in a preadipocytomedium medium to a confluent state at 37 ° C. in a CO ₂ incubator, replacing the medium with a differentiation medium medium, and culturing for about 72 hours. Furthermore, the medium was changed to an adipocyte medium and cultured for 14 days to differentiate into white adipocytes. The cultured cells were further cultured under the following conditions.

各種被験化合物を終濃度１０μＭとなるように培地に加え、６時間培養した（ｎ＝３）。各種被験化合物は、ＰＰＡＲαリガンドのベザフィブレート（Ｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅ）、ＷＹ１４６４３、ＰＰＡＲδリガンドのＹＭ−１６６３８、ＰＰＡＲγリガンドのトログリタゾン（Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、非特異的ＰＰＡＲリガンドのｃＰＧＩ、イロプロスト（Ｉｌｏｐｒｏｓｔ）、β３アドレナリンレセプターアゴニストのＬ７５５５０７とした。コントロールは被験化合物の溶媒であるＤＭＳＯを終濃度０．５％となるように加え、同様に培養した。培養した細胞を各々回収し、細胞溶解用緩衝液（ＲＬＴ溶液、ＱＩＡＧＥＮ社製）１５０μｌに懸濁した後、細胞を破砕し、細胞抽出液を得た。この細胞抽出液からトータルＲＮＡを調製した。ＲＮＡの調製はＲＮＡ調製キット（商品名：ＲＮｅａｓｙｔｏｔａｌ ＲＮＡキット、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて指示書に従って行った。   Various test compounds were added to the medium to a final concentration of 10 μM and cultured for 6 hours (n = 3). Various test compounds include PPARα ligand bezafibrate, WY14643, PPARδ ligand YM-16638, PPARγ ligand troglitazone, rosiglitazone, non-specific PPAR ligand cPGI, iroprost The adrenergic receptor agonist L755507. As a control, DMSO, which is a solvent for the test compound, was added to a final concentration of 0.5% and cultured in the same manner. Each cultured cell was collected and suspended in 150 μl of a cell lysis buffer (RLT solution, manufactured by QIAGEN), and then the cells were disrupted to obtain a cell extract. Total RNA was prepared from this cell extract. The RNA was prepared using an RNA preparation kit (trade name: RNeasytal RNA kit, manufactured by QIAGEN) according to the instructions.

（２）ＵＣＰ１ ｍＲＮＡ発現量の測定
前項（１）で得たＲＮＡ（トータルＲＮＡ、約０．１μｇ）をテンプレートとして、以下のようにリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲｅａｌＴｉｍｅ ＰＣＲ）によりＵＣＰ１ ｍＲＮＡ発現量を測定した。 (2) Measurement of UCP1 mRNA expression level Using the RNA (total RNA, about 0.1 μg) obtained in (1) above as a template, UCP1 mRNA expression level was measured by real-time polymerase chain reaction (RealTime PCR) as follows. .

ヒトＵＣＰ１遺伝子用のＰＣＲプライマーとしては、５’−ＡＡＣＣＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＧＴＧＡＡＡＧ−３’（フォワード側プライマー）、および５’−ＣＧＴＧＴＡＧＣＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＴＣＣ−３’（リバース側センスプライマー）の２種を用いた。ＰＣＲプローブとしては、５’−ＣＡＧＡＣＴＴＣＡＡＧＣＡＴＡＧＡＧＣＣＡＴＣＴＣＣＡ−３’を用いた。プローブに結合した蛍光色素はＦＡＭであった。また、２−Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙとして同時に測定したＧ３ＰＤＨ ｍＲＮＡの測定についてはＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの推奨する方法に従って行った。なお、プライマーの化学合成はＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、プローブの化学合成（蛍光色素の結合を含む）はＰＥＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社に依頼した。   Two types of PCR primers for human UCP1 gene were used: 5'-AACCCACAGGAGTCGTGAAAG-3 '(forward primer) and 5'-CGTGTAGCGGAGGTTGATTCC-3' (reverse sense primer). As a PCR probe, 5'-CAGACTTCAAGCATAGAGCCATCTCCA-3 'was used. The fluorescent dye bound to the probe was FAM. In addition, the measurement of G3PDH mRNA simultaneously measured as 2-Reporter Assay was performed according to the method recommended by PE Applied Biosystems. The chemical synthesis of the primer was requested by Amersham Pharmacia Biotech, and the chemical synthesis of the probe (including the binding of the fluorescent dye) was requested by PE Applied Biosystems.

調製した被験トータルＲＮＡ、上記プライマーおよびプローブ、市販のリアルタイム検出ＰＣＲ用試薬キット（ＴａｑＭａｎＥＺ ＲＴ−ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（商品名）、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて反応チューブ１本あたり表１に示す反応液を調製した。   Table 1 shows one reaction tube using the prepared test total RNA, the above primers and probes, and a commercially available reagent kit for real-time detection PCR (TaqManEZ RT-PCR Core Reagent Kit (trade name), manufactured by PE Applied Biosystems). A reaction solution was prepared.

ＰＣＲ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｍｉｃｒｏａｍｐ ＯｐｔｉｃａｌＴｕｂｅ（商品名、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）１本あたり上記反応液を２５μｌ調製し、キャップをした後、ＡＢＩＰＲＩＳＭ ７７００ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にセットし、以下の条件で反応を行った。   25 μl of the above reaction solution was prepared per PCR Perkin Elmer Microamp Optical Tube (trade name, manufactured by PE Applied Biosystems), capped, and then set to ABIPRISM 7700 Sequence Detection System (trade name, manufactured by PE Aim, manufactured by PEAy The reaction was performed under the following conditions.

混入ＤＮＡのＵＮＧによる分解反応５０℃、５０分、逆転写工程６０℃１０分、ＵＮＧの失活９５℃、２分の後、ＰＣＲ反応を変性工程９５℃、１５秒、アニーリング工程５８℃、９０秒の条件（サイクル数：４０サイクル）で行った。反応開始後、蛍光強度をリアルタイムで自動測定することによりＵＣＰ１ｍＲＮＡ発現量を測定した。ＵＣＰ１ ｍＲＮＡ発現量は対照であるブランクコントロールを１００とした場合の相対値で示し、Ｇ３ＰＤＨｍＲＮＡ発現量で補正をかけて算出した。   Decomposition reaction of contaminated DNA by UNG 50 ° C., 50 minutes, reverse transcription step 60 ° C. 10 minutes, UNG inactivation 95 ° C., 2 minutes, PCR reaction is denatured step 95 ° C., 15 seconds, annealing step 58 ° C., 90 ° The measurement was performed under the second condition (cycle number: 40 cycles). After starting the reaction, the UCP1 mRNA expression level was measured by automatically measuring the fluorescence intensity in real time. The UCP1 mRNA expression level was expressed as a relative value when the blank control as a control was set to 100, and was calculated with correction by the G3PDH mRNA expression level.

その結果を第１図に示した。ＵＣＰ１ ｍＲＮＡ発現量は、ＰＰＡＲδリガンド（ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する化合物）であるＹＭ−１６６３８でコントロールの約１２倍の増加を示した。これにより、ＰＰＡＲδリガンドはかかる作用を顕著に発現することが明確となった。本実験においてＰＰＡＲδリガンドはＵＣＰ１遺伝子を特異的に増強することが判明したことから、ＰＰＡＲδリガンドによるＷＡＴの機能亢進作用は、ＰＰＡＲδリガンドのＷＡＴへの直接的な作用であることがわかった。ＵＣＰ１は、げっ歯類のみならず、ヒト白色脂肪細胞において顕著な発現の増大が観察されたことから、ヒトの糖尿病や肥満に対し、ＰＰＡＲδリガンドが極めて有効であることが示された。   The results are shown in FIG. The expression level of UCP1 mRNA showed an increase of about 12 times that of the control with YM-16638, which is a PPARδ ligand (a compound having an effect of activating PPARδ). As a result, it was clarified that the PPARδ ligand expresses such an effect remarkably. In this experiment, it was found that the PPARδ ligand specifically enhances the UCP1 gene. Therefore, it was found that the PPARδ ligand-enhancing function of WAT is a direct effect of the PPARδ ligand on WAT. UCP1 was observed not only in rodents but also in human white adipocytes, and thus, it was shown that PPARδ ligand is extremely effective against human diabetes and obesity.

（３）ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ発現量の測定
前項（１）で得たＲＮＡ（トータルＲＮＡ、約０．１μｇ）をテンプレートとして、前項（２）と同様にリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によりＵＣＰ２ ｍＲＮＡ発現量を測定した。ヒトＵＣＰ２遺伝子用のＰＣＲプライマーとしては、５’−ＣＧＣＣＡＡＡＴＧＡＧＣＴＴＴＧＣＣＴ−３’（フォワード側プライマー）、および５’−ＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＴＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＧＡ−３’（リバース側センスプライマー）の２種を用いた。ＰＣＲプローブとしては、５’−ＴＧＴＣＣＧＣＡＴＣＧＧＣＣＴＧＴＡＴＧＡＴＴＣ−３’を用いた。プローブに結合した蛍光色素はＦＡＭであった。 (3) Measurement of UCP2 mRNA expression level Using the RNA (total RNA, about 0.1 μg) obtained in the previous section (1) as a template, the UCP2 mRNA expression level was measured by the real-time polymerase chain reaction in the same manner as in the previous section (2). As PCR primers for the human UCP2 gene, two kinds of 5′-CGCCAAATGAGCTTTGCCT-3 ′ (forward primer) and 5′-GCCCTGTGTGTAGAACTGTTTGA-3 ′ (reverse sense primer) were used. As the PCR probe, 5′-TGTCCGCATCGGCCCTGTATGATTC-3 ′ was used. The fluorescent dye bound to the probe was FAM.

その結果を第２図に示した。ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ発現量はＰＰＡＲδリガンド（ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する化合物）であるＹＭ−１６６３８で対照の約２倍の増加を示した。   The results are shown in FIG. The expression level of UCP2 mRNA was increased approximately twice as much as that of the control by YM-16638 which is a PPARδ ligand (a compound having an effect of activating PPARδ).

［実施例２］
ヒト白色脂肪細胞における遊離脂肪酸β酸化に対する薬剤の影響
実施例１で述べた方法と同様にヒト白色脂肪細胞を分化誘導後、上清を除去し、ａｄｉｐｏｃｙｔｅｍｅｄｉｕｍ培地にオレイン酸およびパルミチン酸をそれぞれ０．６７ｍＭおよび０．３３ｍＭとなるように溶解した培地５００μｌに交換した。各種被験化合物を終濃度１０μＭとなるように培地に加えた後、［９，１０（ｎ）−^３Ｈ］パルミチン酸（アマシャムファルマシア社製、終濃度１？Ｃｉ／ｍｌ）を加え、３７℃で４８時間培養した。被験化合物は、ＰＰＡＲδリガンドであるＹＭ−１６６３８、ＰＰＡＲαリガンドのＷＹ１４６４３、β３アドレナリンレセプターアゴニストのＬ７５５，５０７、ＰＰＡＲγリガンドのロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）とした。コントロールは被験化合物の溶媒であるＤＭＳＯを終濃度０．５％となるように加え、同様に培養した。また培養中、細胞による［９，１０（ｎ）−^３Ｈ］パルミチン酸のβ酸化により生じた^３Ｈ_２Ｏが蒸散しないように、住友ベークラート社製ミニカルチャーフィルター（ＭＳ−３００５５）で培養プレートをシールした。 [Example 2]
Effect of Drug on Free Fatty Acid β Oxidation in Human White Adipocytes In the same manner as described in Example 1, after induction of differentiation of human white adipocytes, the supernatant was removed, and oleic acid and palmitic acid were added to the adipocyte medium medium, respectively. The medium was exchanged with 500 μl dissolved to 67 mM and 0.33 mM. After addition of various test compounds to the culture medium at a final concentration of ^{10μM, [9,10 (n) -} 3 H] palmitic acid (? Amersham Pharmacia Inc., final concentration 1 Ci / ml) was added, at 37 ° C. Cultured for 48 hours. Test compounds were PPARδ ligand YM-16638, PPARα ligand WY14643, β3 adrenergic receptor agonist L755,507, PPARγ ligand rosiglitazone. As a control, DMSO, which is a solvent for the test compound, was added to a final concentration of 0.5% and cultured in the same manner. In addition, in order to prevent ³ H ₂ O generated by β-oxidation of [9,10 (n) ^-3 H] palmitic acid by cells during the culture, the culture plate was used with a miniculture filter (MS-30055) manufactured by Sumitomo Bakerat. Sealed.

４８時間培養後、培地上清２００μｌを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、５０％トリクロロ酢酸を５０μｌ添加し、氷上で３０分間沈殿を形成させ、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。次に、あらかじめ５００μｌの純水を入れた２０ｍｌガラスバイアルの中に蓋なし１．５ｍｌエッペンドルフチューブを入れ、このエッペンドルフチューブに上記遠心で得られた上清を全量移し、ポリプロピレンパッキン付きの蓋で厳重に封をした。このバイアルを５０℃で１８時間加温してバイアル内を^３Ｈ_２Ｏで飽和させ、４℃で冷却後、遠心し（１０００ｒｐｍ、１分）、バイアル内のエッペンドルフチューブに残っている培地上清とエッペンドルフチューブを廃棄した。バイアル内に残った^３Ｈ_２Ｏを含んだ純水に５ｍｌの液体シンチレーター（ウルチマゴールド、パッカード社製）を加え、十分に混和後、カウントした。 After culturing for 48 hours, 200 μl of the medium supernatant was transferred to a 1.5 ml Eppendorf tube, 50 μl of 50% trichloroacetic acid was added, a precipitate was formed on ice for 30 minutes, and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes. Next, put a 1.5 ml Eppendorf tube without a lid in a 20 ml glass vial containing 500 μl of pure water in advance, transfer the entire amount of the supernatant obtained by the above centrifugation to this Eppendorf tube, and carefully tighten it with a lid with polypropylene packing. Sealed. The vial was heated at 50 ° C. for 18 hours, the inside of the vial was saturated with ³ H ₂ O, cooled at 4 ° C., centrifuged (1000 rpm, 1 minute), and the medium supernatant remaining in the Eppendorf tube in the vial And the Eppendorf tube was discarded. 5 ml of liquid scintillator (Ultima Gold, manufactured by Packard) was added to the pure water containing ³ H ₂ O remaining in the vial, and the mixture was mixed thoroughly and counted.

この結果を第３図に示した。ＰＰＡＲδリガンドＹＭ１６６３８ １０μＭにより細胞のβ酸化は３０％亢進した。一方、ＰＰＡＲγリガンドｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ１０μＭでは１５％の亢進、ＰＰＡＲαリガンドＷＹ１４６４３ １０μＭおよびβ３ ａｄｒｅｎａｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒアゴニストＬ７５５，５０７ １０μＭではβ酸化の亢進はみられなかった。この結果は実施例１で示した各種ＰＰＡＲリガンドのＵＣＰ１ ｍＲＮＡ発現亢進作用と良く相関している。すなわち、ＰＰＡＲδリガンドはＵＣＰ１遺伝子の発現亢進によりその蛋白量も増加させ、ＵＣＰ１の機能の一つである遊離脂肪酸を基質としたβ酸化を亢進、ひいてはエネルギー代謝を促進し、内臓脂肪蓄積を抑制および低減させることを示すものである。このことからもＰＰＡＲδリガンドがヒトの抗糖尿病、抗肥満に対して有効であることが示された。   The results are shown in FIG. PPARδ ligand YM16638 10 μM enhanced cell β-oxidation by 30%. On the other hand, the PPARγ ligand rosiglitazole 10 μM showed 15% enhancement, and the PPARα ligand WY14643 10 μM and β3 adrenergic receptor agonist L755,507 10 μM showed no enhancement of β oxidation. This result correlates well with the UCP1 mRNA expression enhancing action of various PPAR ligands shown in Example 1. That is, the PPARδ ligand also increases the amount of protein by enhancing the expression of the UCP1 gene, enhances β-oxidation using free fatty acid, which is one of the functions of UCP1, as a substrate, thereby promoting energy metabolism, suppressing visceral fat accumulation and It shows that it reduces. This also indicates that the PPARδ ligand is effective for human anti-diabetes and anti-obesity.

本発明により、熱産生亢進作用等を有する物質が得られ、それを含む抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、又は内臓脂肪蓄積抑制剤等の薬剤が得られる。   According to the present invention, a substance having a heat production enhancing action or the like can be obtained, and a drug such as an anti-diabetic agent, an anti-obesity agent, a visceral accumulated fat reducing agent, or a visceral fat accumulation inhibiting agent can be obtained.

ＰＰＡＲδリガンドほか各種被験化合物によりヒト脂肪細胞において誘導されるＵＣＰ１ ｍＲＮＡ発現量を示す図である。It is a figure which shows the UCP1 mRNA expression level induced | guided | derived in a human adipocyte by various test compounds other than PPAR (delta) ligand. ＰＰＡＲδリガンドほか各種被験化合物によりヒト脂肪細胞において誘導されるＵＣＰ２ｍＲＮＡ発現量を示す図である。It is a figure which shows the UCP2mRNA expression level induced | guided | derived in a human adipocyte by various test compounds other than PPAR (delta) ligand. ＰＰＡＲδリガンドほか各種被験化合物によりヒト脂肪細胞において惹起される遊離脂肪酸β酸化亢進の程度を示す図である。It is a figure which shows the extent of the free fatty acid (beta) oxidation enhancement induced in human adipocytes by various test compounds other than PPAR (delta) ligand.

Claims (1)

ｃＰＧＩ、イロプロスト、又はｐ−（３−（４−アセチル−３−ヒドロキシ−２−プロピルフェノキシ）プロポキシ）フェニル酢酸を有効成分として含有する、内臓蓄積脂肪低減化剤、もしくは内臓脂肪蓄積抑制剤。   A visceral accumulated fat reducing agent or visceral fat accumulation inhibitor containing cPGI, iloprost, or p- (3- (4-acetyl-3-hydroxy-2-propylphenoxy) propoxy) phenylacetic acid as an active ingredient.

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