JP4868391B2 - 転写機構を利用した知能型核酸配列センシングシステム - Google Patents

Description

本発明は、サンプル核酸の配列情報を有する核酸プローブの作製方法、及び試料中のターゲット核酸の検出方法に関する。また本発明は、上記方法において使用するための核酸プローブ及びキットに関する。

生体高分子である核酸分子は遺伝情報の記憶媒体としてだけでなく、酵素としての生理活性及び結合ポケットとなる立体構造を形成して、核酸、タンパク質、小有機化合物又は小生命体を認識する機能などを有している。近年、核酸分子の持つ情報処理機能を利用して、その多様な機能を目的に従って発揮するようプログラムされた核酸分子の創薬や医療への応用に関する研究が、生体分子による分子コンピューティングの有望な応用分野として注目を集めている。

これらの核酸分子の機能は、大別すると「プログラミング機能」、「メモリ機能」、「生理活性物質としての機能」、「その他の結合機能性物質としての機能」などに分けることができ、「遺伝子診断技術」への利用における進歩が著しい。

「プログラミング（情報処理）機能」のうち、核酸分子配列に情報をプログラムして診断・治療に応用する手法としては、Benensonらが、特殊な配列を認識する制限酵素をハードウェアとして、診断と治療に関する情報を核酸分子にプログラムし、前立腺癌や小細胞型肺癌に特異的に発現するＲＮＡの存在を判定してＤＮＡドラッグを放出する核酸分子を用いたシステムを開発し、その核酸分子が生体外で機能することを確認したが、生体内ではその機能は確認されていない（非特許文献１）。

「メモリ機能」のうち、核酸分子の配列に特定の配列情報を学習させ、メモリとして使用する方法として、Chenらは、不正確なハイブリダイゼーションを形成するＤＮＡ間のランダムな相互作用を利用して学習及び読み出しを行えるＤＮＡメモリの開発に成功し、それを発現遺伝子の解析及び分類に使用できることを提案した（非特許文献２）。しかしながら、ＲＮＡを記憶することのできるメモリを作製する手法は具体的には提示されていない。唾液中からも採取可能なＲＮＡで、同様なメモリが作製可能であれば、ＲＮＡ診断が有効な疾患領域が今後広がることにより、侵襲性の低い簡便な診断による早期発見、早期治療への展開が期待される（非特許文献６）。

「生理活性物質としての機能」として、核酸は診断ばかりでなく、治療薬としての効果も持っている。特定の配列を持った核酸分子のうちＤＮＡドラッグとして治療に有効であることが確認されているものにはすでに実用化されているものがある。ｐ５３癌抑制タンパク質の不活性化に重要な役割を担う癌遺伝子タンパク質ＭＤＭ２の合成を阻害するｓｓＤＮＡ薬であり、エイズにおけるＣＭＶ（サイトメガロウィルス）による網膜炎治療に効果があるＶｉｔｒａｖｅｎｅ（アンチセンス医薬；非特許文献３）、進行した悪性黒色腫を対象とするＯｂｌｉｍｅｒｓｅｎ（アンチセンス医薬；非特許文献４）などである。また特定の配列をもった核酸分子のうちＲＮＡドラッグとして治療に有効であることが確認されているものとして、老人性黄斑変性症の治療薬である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するＲＮＡアプタマー（ＮＸ１８３８）がある（非特許文献５）。ＲＮＡドラッグはＤＮＡと同様、機能改良と大量生産が可能で、抗体薬に比べて免疫排除が生じないなどの利点があり、安定性の面でＤＮＡに劣るという問題はあるが、反面ＤＮＡに比べて一定時間で分解され、時間的な投薬制御が容易であるため、近年特に注目が集まっている。

また、「その他の結合機能性物質」としての核酸分子のうち、特殊な機能を持つものとしてGrateらが分子進化工学的手法により創成したマラカイトリーンアプタマーがある（
非特許文献７）。マラカイトグリーンアプタマーは、結合機能性核酸とも呼ばれるアプタマーの一種で、結合ポケットとなる立体構造を形成してマラカイトグリーン（ＭＧ）と結合する能力を持ち、マラカイトグリーンがレーザーで励起されたときに放出される活性酸素を利用してマラカイトグリーンアプタマー配列を組み込んだＲＮＡを不活性化して、ターゲット遺伝子の機能解析を転写レベルで行うことのできるＲＮＡ−ＣＡＬＩ（chromophore-assisted laser inactivation）を行う目的で開発されたものである（非特許文献７
）。マラカイトグリーンアプタマーにはその他の性質として、マラカイトグリーンを結合ポケットに取り込んだ時に、マラカイトグリーンの蛍光を増強することが知られており、マラカイトグリーンアプタマーを改良して、生体内でＤＮＡの構成成分となるなど重要な役割を果たしているアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）や気管支拡張剤のテオフィリンなどを認識することのできるモジュール配列を組み込むことにより、これらの物質を蛍光により検出することのできるセンサーとして使用できることが示されている（非特許文献８）。また、マラカイトグリーンアプタマーの転写に必要な最小限のＤＮＡ配列としてＴ７プロモーター配列とアプタマーの鋳型となる配列の一部を相補鎖として含むＴ７センスＤＮＡとＴ７プロモーター配列の相補鎖となる配列及びアプタマーの鋳型となる配列を含むアンチセンスＤＮＡの配列はすでに明らかになっている（非特許文献９）。

ＲＮＡを蛍光増強によって検出する方法としては、マラカイトグリーンを用いる方法以外にも、有機電界発光素子として知られるピレンをウリジンの糖環の２’水酸基に導入した２’−Ｏ−メチル型ＲＮＡ（ＯＭＵｐｙ）も合成されており、これを用いて２’−Ｏ−メチル型ＲＮＡと相補的な配列を持ったＲＮＡを検出する方法がすでに明らかになっている（非特許文献１０）。

このような方法の他にも例えば当業者に公知の方法によって放射性物質などで標識された基質を取り込むことにより、放射線を測定することでＲＮＡの検出を行うことができる。

また蛍光によらずＲＮＡが転写されたことを検出する方法としては、ビオチン化基質（ｙＴＰなど）を導入してターゲットタンパク質との結合機能をもったアプタマーをビオチン化することにより、アビジン化された水晶発振子や表面プラズモン共鳴を利用した相互作用測定装置（例えばＢＩＡＣＯＲＥ）のセンサーチップにアビジン−ビオチン結合を利用してアプタマーを効率よく固定し、固定したアプタマーを使ってターゲットタンパク質との結合活性を観察することによってターゲットＲＮＡの存在を検出する方法が知られている（非特許文献１１）。

さらに、唾液中のｍＲＮＡの転写量の変化に基づいて乳癌と口腔癌を非侵襲的かつ簡便かつ正確に判定できることが報告されており、今後唾液中のｍＲＮＡで診断できる疾病の研究も進展するであろうと考えられている（非特許文献６）。非特許文献６では、唾液中のｍＲＮＡによる診断を行える対象は乳癌と口腔癌に限定されるわけではなく、唾液中のｍＲＮＡパターンが他の癌や頻度の高い病気に関する情報を提供する可能性が示唆されている。唾液は血液の状態を反映しており、唾液検査によって多くの疾患を発見できるであろうと期待されている。難治性疾患の病因遺伝子を対象とした治療、診断研究も進んでおり、最近の脳科学の成果から統合失調症やアルツハイマー病などの精神・神経疾患において脳に特異的に発現している遺伝子の解析が進んでいる。唾液中のＲＮＡパターンによる早期診断、早期治療システムを整えるには、病因遺伝子の変化を唾液中のＲＮＡパターンから診断できる疾患を探索する網羅的な研究が必要になってくる。唾液は、容易かつ大量に採取でき、また特異性と感度が乳癌と口腔癌では血液診断よりも良好であることが確認されている（非特許文献６）。唾液中には約３０００種類のｍＲＮＡがあり、そのうち健
常者の唾液に固有なものは約２８０種類と言われている。癌や全身疾患を血液中のＲＮＡパターンから判定するには、残りの約２７００種類のｍＲＮＡのうち、癌や全身疾患に特異的なｍＲＮＡパターンを患者集団よりサンプルを集め、大規模解析により決定する必要がある。現在は、ＤＮＡチップを用いて得られたデータを回帰樹モデルやロジスティック回帰モデルを用いて解析が行われているが、疾患の判定に使えるバイオマーカーとしてのｍＲＮＡパターンを決定するのは難しい。それは、ｍＲＮＡの変動には様々な要因が関与しているだけでなく、潜在的に複数の病気を発症している可能性もあるためであり、データからノイズを排除して特定の疾患への罹患及び罹患リスクを判定し、テーラーメイド医療を実現するには安価で簡便で網羅的な解析を行うことのできる感度のよい検査システムの実現が望まれる。

Benenson, Y.; Gil, B.; Ben-Dor, U.; Adar R.; Shapiro, E.; Nature 2004, 429, 423-429. Chen, J.; Deaton, R.; Wang, Y-Z.; LNCS 2004, 2943, 145-156. Holmlund, J. T.; Ann. NY Acad. Sci. 2003, 1002, 244-251. Klasa, R. J.; Gillum, A. M.; Klem, R. E.; Frankel, S. R.; Nucleic Acid Drug Dev. 2002, 12, 193-213. Drolet, DW.; Nelson, J.; Tucker, CE.; Zack, PM.; Nixon, K.; Bolin. R.; Judkins, MB.; Farmer, JA.; Wolf, JL.; Gill, SC.; Bendele, RA.; Pharm Res. 2000, 17(12), 1503-1510. Li Y.; St. John, MAR.; Zhou, Z.; Kim, Y.; Sinha, U.; Jordan, RCK.; Eisele, D.; Abemayor, E.;2 Elashoff, D.; Park N-H.; Wong, DT.; Clinical Cancer Research 2004 10, 8442-8450. Grate, D.; Wilson, C.; Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, 96, 6131-6136. Stojanovic, MN.; Kolpashchikov, DM.; J. AM. CHEM. SOC. 2004, 126, 9266-9270. Babendure, J.R.; Adams, SR.; Tsein RY.; J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 14716-14717. Mahara, A.; Iwase, R.; Sakamoto, T.; Yamaoka, T.; Yamana, K.; Murakami, A.; Bioorg. Med. Chem. 2003, 11, 2783-2790. Moriyama,K.; Kimoto, M.; Mistui, T.; Yokoyama, S.; Hirao, I.; Nucleic Acids Res. 2005 33, e129.

本発明は、生体高分子である核酸分子のもつ情報処理機能をはじめとする多彩な機能に着目し、特定の状態（例えば疾患又は障害）に特異的な遺伝子発現パターンを簡便に判定分類及び診断できる手法及び手段を提供することを目的とする。

本発明者は、上記目的を達成するため鋭意検討を行った結果、プロモーターセンス配列の下流に検出用レポーター分子をコードするセンス配列と２０塩基程度のランダム配列を含む核酸プローブ（ランダムＤＮＡプローブ）に、特定のＤＮＡ／ＲＮＡの配列情報を記憶させ、そしてその配列情報を記憶させたメモリ核酸プローブと、上記プロモーターセンス配列と検出用レポーター分子をコードするセンス配列に対して相補的な配列を有する核酸分子を用いて、試料中に存在する目的のＤＮＡ／ＲＮＡを検出し、分類することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、以下の１〜４である。
１．以下のステップ：
（ａ）プロモーターセンス配列及び５〜１０００００塩基からなるランダム配列を含む核酸プローブとサンプル核酸とを接触させ、該核酸プローブのランダム配列と該サンプル核酸との間で二本鎖を形成させるステップ、
（ｂ）上記核酸プローブの３’末端から、上記核酸プローブとサンプル核酸とが二本鎖を形成している部分まで、上記核酸プローブの一本鎖を分解するステップ、
（ｃ）上記核酸プローブとサンプル核酸とが二本鎖を形成している部分から上記核酸プローブの３’末端側に、サンプル核酸を鋳型としてサンプル核酸の配列に相補的な配列を伸長させるステップ、
（ｄ）上記サンプル核酸を除去し、サンプル核酸の配列に相補的な配列を含む核酸プローブを回収するステップ、
を含む、サンプル核酸の配列情報を有する核酸プローブの作製方法。

上記方法において、核酸は、限定されるものではないが、ＤＮＡ又はＲＮＡである。具体的には、例えば核酸プローブがＤＮＡであり、サンプル核酸がＲＮＡである。サンプル核酸としては、限定されるものではないが、体液（唾液、血液、尿など）、細胞若しくは組織、又はこれらから採取した核酸を用いることができる。

また上記方法において、プロモーター配列としては、例えばＴ７プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列及びこれらの配列を連結したタンデム配列などを用いることができる。

上記方法において、ステップ（ｂ）の一本鎖の分解は、例えばエキソヌクレアーゼＩにより行うことができる。またステップ（ｃ）の配列の伸長は、逆転写又は複製により行うことができる。

上記方法において、核酸プローブは、プロモーターセンス配列の下流にさらに検出用レポーター分子をコードするセンス配列を含んでもよい。該検出用レポーター分子は、マラカイトグリーンアプタマーＲＮＡ分子などの検出が容易なＲＮＡ分子であることが好ましい。

さらに上記方法では、複数のサンプル核酸を用いて、各サンプル核酸の配列情報を有する複数の核酸プローブを作製することができる。また、サンプル核酸として、配列が特定されていないものを用いることができる。

２．以下のステップ：
（ａ）プロモーターセンス配列及びターゲット核酸の全体又は一部に対し相補的な配列を含む核酸プローブと試料とを接触させ、該核酸プローブと該試料に含まれるターゲット核酸との間で二本鎖を形成させるステップ、
（ｂ）上記核酸プローブの３’末端から上記核酸プローブの一本鎖を分解するステップであって、ここで上記核酸プローブとターゲット核酸とが二本鎖を形成している場合には、二本鎖を形成している部分まで上記核酸プローブを分解するステップ、
（ｃ）プロモーターセンス配列に対し相補的な配列及び検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列を含む検出用アンチセンス核酸を添加し、該プロモーターセンス配列と該相補的配列との間で二本鎖を形成させるステップ、
（ｄ）ポリメラーゼを添加して上記検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列を転写させて検出用レポーター分子を形成させるステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）における転写反応を確認して試料中のターゲット核酸を検出するステップ、
を含む、試料中のターゲット核酸の検出方法。

上記方法において、ステップ（ａ）において使用する核酸プローブは、例えば前項１に記載の方法により作製されたものである。

上記方法において、試料としては、限定されるものではないが、体液（唾液、血液、尿など）、細胞若しくは組織、又はこれらから採取した核酸を用いることができる。

また、核酸としては、限定されるものではないが、ＤＮＡ又はＲＮＡを用いることができる。具体的には、例えば核酸プローブがＤＮＡであり、ターゲット核酸がＲＮＡである。

また上記方法において、プロモーター配列としては、例えばＴ７プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列及びこれらの配列を連結したタンデム配列などを用いる。その場合、ステップ（ｃ）のポリメラーゼとしては、それぞれプロモーター配列に応じてＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。

上記方法において、ステップ（ｂ）の一本鎖の分解は、例えばエキソヌクレアーゼＩにより行うことができる。

また、検出用レポーター分子としては、例えば蛍光試薬と結合して蛍光観察が可能になるようなＲＮＡアプタマー分子であるマラカイトグリーンアプタマーＲＮＡ分子を用いることができ、その場合、検出用試薬としてはマラカイトグリーンを使用する。

上記方法において、核酸プローブは、プロモーターセンス配列の下流にさらに検出用レポーター分子をコードするセンス配列を含んでいてもよく、それにより、ステップ（ｃ）において該検出用レポーター分子をコードするセンス配列と検出用アンチセンス核酸における検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列との間で二本鎖が形成される。

さらに上記方法においては、ターゲット核酸として配列が特定されていないものを用いることができる。

３．プロモーターセンス配列及び５〜１０００００塩基からなるランダム配列を含む核酸プローブ又はプロモーターセンス配列及びターゲット核酸の全体若しくは一部に対し相補的な配列を含む核酸プローブを含むことを特徴とするターゲット核酸を検出するためのキット。

上記キットにおいて、ランダム配列は、１０〜１０００塩基からなるものが好ましい。また核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡであることが好ましい。

上記キットにおいて、核酸プローブのプロモーター配列は、限定されるものではないが、Ｔ７プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列及びこれらの配列が連結したタンデム配列などである。核酸プローブは、プロモーター配列の下流にさらに検出用レポーター分子をコードするセンス配列を含んでもよい。

また上記キットは、プロモーターアンチセンス配列部分が核酸プローブのプロモーターセンス配列と二本鎖を形成し、自身がコードする検出用レポーター分子を転写できるように設計されたプロモーターセンス配列に対し相補的な配列及び検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列を含む核酸をさらに含んでもよい。この検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列は、検出が容易なＲＮＡ分子を形成することができること
が好ましく、蛍光試薬であるマラカイトグリーンと結合して蛍光を測定することのできるマラカイトグリーンアプタマーＲＮＡ分子を用いることができる。

さらに上記キットは、エキソヌクレアーゼＩ、プローブ伸長用酵素（逆転写又は複製）、ＲＮＡポリメラーゼ、基質及び検出用試薬からなる群より選択される少なくとも１つをさらに含んでもよい。

４．以下のステップ：
（ａ）前項１に記載の方法を用いて、基準被験体に由来する核酸の配列情報を有するメモリ核酸プローブを作製するステップ、
（ｂ）上記メモリ核酸プローブを、特定の状態又は特徴を示す被験体に由来する核酸と接触させ、上記メモリ核酸プローブが有する配列情報と同じ配列情報を有する核酸と二本鎖を形成させるステップ、
（ｃ）上記メモリ核酸プローブを取り除くことにより、特定の状態又は特徴を示す被験体に固有の核酸群を取得するステップ、
を含む、特定の状態又は特徴を示す被験体に特異的な遺伝子のライブラリの作製方法。

上記方法において、基準被験体としては、例えば健康又は正常な被験体を用いることができる。特定の状態としては、例えば疾患又は障害がある。また、基準被験体に由来する核酸及び特定の状態又は特徴を示す被験体に由来する核酸は、例えばｍＲＮＡである。

上記方法においては、さらに（ｄ）上記の特定の状態又は特徴を示す被験体に固有の核酸群より、前項１に記載の方法を用いて、特定の状態又は特徴を示す被験体に固有の配列情報を有するメモリ核酸プローブを作製するステップを行って、特定の状態又は特徴を示す被験体に特異的な遺伝子の配列情報を有するメモリ核酸プローブライブラリを作製することも可能である。

本発明の方法により、核酸分子（核酸プローブ）上に、任意の核酸の配列情報を、その配列が特定されていなくても記憶させることができる。これは、ノイズを含む膨大なデータから効率よく目的の核酸の存在パターンを分類する際に有効である。これにより疾病診断に有効なバイオマーカーの網羅的な探索が容易になり、遺伝子診断による早期発見、早期治療が有効な疾病領域の拡大を可能にする。

また上述のように記憶させた配列情報を利用して、試料中の目的の核酸を簡便にかつ高感度で検出することができる。さらに本発明の方法により網羅的に分類された核酸パターンを基に、多様なメモリ核酸プローブライブラリを用いて、目的の核酸パターンを示す被験体又は被験体集団を容易に診断することができ、診断医療の分野で大きな効果を発揮すると期待される。

本発明においては、配列情報を記憶する機能と発光を誘導する機能を有する核酸分子（ランダム核酸プローブ）に、特定の配列情報を記憶させ（メモリ核酸プローブ）、該メモリ核酸プローブと、これと一部相補鎖を形成して、検出用レポーター分子の転写を可能にする機能を有する核酸分子（検出用アンチセンス核酸）を用いて特定の配列情報を有するターゲット核酸を検出し、又は特定の配列情報を有するターゲット核酸を除去する。本発明のランダム核酸プローブには、配列が特定されていない配列情報を記憶させることができ、また複数の配列情報を同一反応系において複数のランダム核酸プローブに記憶させることができる。

１．ランダム核酸プローブ
本発明において用いる核酸分子の１つはランダム核酸プローブである。このランダム核酸プローブは、配列情報を記憶するための基盤となる核酸分子であり、プロモーターセンス配列及びランダム配列から構成される（図１Ａ）。核酸分子は、後述するターゲット核酸の検出において特に有用な検出用レポーター分子をコードするセンス配列をさらに含んでいてもよい（図１Ａ）。これは必須の構成要素ではないが、後述する検出用レポーター分子の転写反応を安定化することが期待される。

ランダム核酸プローブは、これらの配列が配列情報記憶機能と転写反応を利用した検出機能を発揮できるようにこれらの配列を含む限り、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのいずれであってもよい。好ましくは、ランダム核酸プローブはＤＮＡである。

プロモーター配列は、ポリメラーゼによる転写を開始することができる配列であり、具体的な配列は当業者に公知である。例えば限定されるものではないが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写を開始することができる配列（例：Ｔ７プロモーター配列（配列番号１）、Ｔ３プロモーター配列（配列番号１０）、ＳＰ６プロモーター配列（配列番号１１））、及びこれらの配列を連結したタンデム配列が挙げられる。好ましくは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの存在下でＤＮＡからＲＮＡへの転写を開始することができるＴ７プロモーター配列（配列番号１）をカスタマイズした配列番号１６を使用する。

ランダム配列は、５〜１０００００塩基前後のランダムな一本鎖の核酸配列であれば任意の配列とすることができる。ランダム配列は、後述するように、サンプル核酸とアニーリングさせていくつかの処理を行うことにより、サンプル核酸の配列情報を記憶するものである。ここで非特許文献９によれば、ランダム配列部分は２０塩基で約５Ｍｂｐの大腸菌のゲノムの配列情報を記憶し、記憶した配列情報に基づく読み出しを行うことができることが確認されている。したがって、ランダム配列は、５〜１０００００塩基、好ましくは１０〜１０００塩基、より好ましくは１０〜１００塩基程度の長さである。ランダム配列は、当業者であれば公知の方法を用いて容易に作製することができる。例えばＤＮＡ合成装置を用いて、保護基のついたヌクレオチドを基質として脱保護されたヌクレオチドに付加させる。保護基がついていることによりその後にさらにヌクレオチドが付加しないようになっており、１塩基付加→脱保護処理を繰り返して目的の配列を合成する。付加する塩基をランダムに決定することにより容易にランダム配列を合成することができる。

後述するメモリＤＮＡプローブの作製において、サンプルＲＮＡ約１０ｐｍｏｌを用いて、１００塩基以上の長さを持つ精製メモリＤＮＡプローブ１ｐｍｏｌを得るのに使用したランダムＤＮＡプローブの量は約１００ｐｍｏｌであった。ここでは、ランダムＤＮＡプローブはサンプルＲＮＡに対して大過剰に使用している。ランダムＤＮＡプローブは一本一本が異なるランダム配列を持っているので、ＲＮＡと反応するランダムＤＮＡプローブの多様性を確保するためである。ランダム配列作製に当たっては、多様なターゲット核酸の配列情報を記憶できるように偏りのないランダムな配列になるよう留意すべきである。また読み出し時の注意としては、精製したメモリ核酸プローブはターゲット核酸と１：１で反応すると考えられるので、メモリ核酸プローブは、ターゲット核酸量より多く投入する必要はないはずであるが、ターゲット核酸の濃度が低い場合には反応確率が下がるので過剰量のメモリ核酸プローブの投入を行うことにより、反応時間を短縮し、反応効率を上げることができると期待される。

任意によりランダム核酸プローブに含まれる検出用レポーター分子をコードするセンス配列は、後述する反応において、検出用アンチセンス核酸に含まれる検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列と二本鎖を形成しうるように設計する。そして、検出用
レポーター分子をコードするセンス配列がメモリ核酸プローブに含まれるか否かにかかわらず、プロモーター配列部分が二本鎖を形成していれば、ＲＮＡポリメラーゼにより検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列が転写されて検出用レポーター分子となる。従って、転写反応を検出することにより、プロモーター配列部分が二本鎖を形成したことがわかり、センス側の核酸プローブのプロモーター配列部分が検出用アンチセンス核酸と結合できる状態で反応液中に存在していることが確認できる。

検出用レポーター分子をコードする配列としては、当業者に公知の任意の配列を用いることができる。例えば、有機色素であるマラカイトグリーンと結合してマラカイトグリーンの蛍光を増幅する機能を有するマラカイトグリーンアプタマー分子、あるいはこれを機能改良したアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アプタマー分子、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）アプタマー分子、スルホローダミンＢの蛍光を増幅する機能を有するスルホローダミンＢアプタマー分子、タンパク質などの物質との結合活性を有するアプタマーに、ビオチン化された基質（ｙＴＰ）（非特許文献１１）を取り込ませ、水晶発振子や表面プラズモン共鳴を利用したタンパク質相互作用測定装置（例えばＢＩＡＣＯＲＥ）のアビジンセンサーチップにアビジン−ビオチン結合を利用して、アプタマーを固定して、該タンパク質とアプタマーとの結合活性を測定することにより転写の有無を判断することができるビオチン化アプタマー分子、有機電界発光素子ピレンを導入した２’−Ｏ−メチル型ＲＮＡと結合して蛍光観察が可能になるＲＮＡ分子などをコードする配列が挙げられる。また転写と同時に蛍光を発するなどにより転写反応が起きたことを観察できる機能性ＲＮＡ分子が開発されれば、それを用いることができる。このような方法の他にも例えば当業者に公知の方法によって放射性物質などで標識された基質を取り込むことにより、放射線を測定することでＲＮＡの検出を行うことができる。

好ましくは、検出用レポーター分子をコードする配列としては、検出手順が簡便であることから、転写された配列がマラカイトグリーンアプタマーＲＮＡ（配列番号３、５等）を形成することができるＤＮＡ配列を使用する。マラカイトグリーンアプタマーＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列としては、限定されるものではないが、配列番号２、４等（センス配列）が挙げられる（非特許文献７〜９）。また、スルホローダミンＢアプタマーＲＮＡ分子（配列番号７）をコードするＤＮＡ配列（配列番号６）(センス配列)を使用することも可能である。また、例えばＲａｆ−１タンパク質と結合することのできるビオチン化アプタマー分子（配列番号１７）(非特許文献１１)を形成できるＤＮＡ配列（配列番号１８）（センス配列）(非特許文献１１)を使用することも可能である。さらに、ＲＮＡを特異的に検出する蛍光核酸プローブである２’−Ｏ−メチルＲＮＡのようなＲＮＡ検出試薬を用いることができる。この場合には、２’−Ｏ−メチルＲＮＡと反応するＲＮＡを転写することができる配列（配列番号１２）（非特許文献１０）などの配列（センス配列）を使用することが可能である。本発明においては、マラカイトグリーンアプタマーＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列（配列番号２）(センス配列)を用いることが好ましい。

本発明のランダム核酸プローブは、５’から３’に向かって、プロモーターセンス配列及びランダム配列の順で含む。検出用レポーター分子をコードするセンス配列は、プロモーターセンス配列の下流に、すなわちプロモーターセンス配列とランダム配列との間に含まれる。これらの配列は直接連結していてもよいし、適当なリンカーを介して連結していてもよい。

プロモーターセンス配列の最後（３’側）の３塩基は、安定な転写反応を行うために、検出用レポーター分子をコードするセンス配列の最初（５’側）の３塩基と重なるように設計することが好ましい。これは、ランダム核酸プローブが検出用レポーター分子をコードするセンス配列を含まない場合であっても、後述する反応において、検出用アンチセンス核酸と二本鎖を形成し、安定な転写反応を行うために用いる。例えば、実施例１におい
て作製しているランダム核酸プローブにおけるＴ７プロモーターセンス配列の最後尾のＧで始まる３塩基（ＧＧＡ）は、後述する検出用アンチセンス核酸との二本鎖形成後に転写されてＲＮＡとなる部分である。この３塩基を含めた配列が、検出用アンチセンス核酸と二本鎖を形成し、ＲＮＡポリメラーゼによりＧ以降の配列の転写を開始するために重要であり、この３塩基は転写されて検出用レポーター分子の一部となる。ここで用いられる安定な転写反応を行うためにプロモーター配列の最後に加えられる塩基配列は、検出用レポーター分子の機能に影響を及ぼさない配列であればよく、実施例１で実際に作製しているＧ以降の塩基は、プロモーター配列の最初からＧを含めて３塩基以上まで二本鎖を形成するようにセンス鎖、アンチセンス鎖が設計されており、好ましくは少なくとも３塩基が二本鎖を形成できればそれ以降は一本鎖でも安定な転写を行えることから、その塩基数及び塩基種は限定されるものではない。

また、本発明のランダム核酸プローブは、検出用レポーター分子をコードするセンス配列の部分に、後述する反応において転写された分子内で相補鎖を形成して転写終了時に転写されたＲＮＡ分子が核酸プローブから離れやすくするために転写開始部分と転写終了部分が相補配列になるような配列を組み込んでもよいし（例えば、ここではマラカイトグリーンアプタマーの転写された最初の３塩基はＧＧＡで最後の３塩基はＵＣＣであるがこの部分が相補鎖となっており、転写後、それぞれＧ−Ｃ、Ｇ−Ｃ、Ａ−Ｕとアニールすることにより、鋳型から離れやすくなる。本目的で組み込まれる配列は、相補鎖を形成し、アプタマーの機能を阻害しないものならどのような組み合わせでもよい）、蛍光強度を増幅するためのコミュニケーションモジュール（セカンドモジュールとの連結部分であり、ファーストモジュールとセカンドモジュールが結合ポケットを作るのを妨げないように配慮されたつなぎの配列。ファーストモジュールとセカンドモジュールに応じて設計される。）に連結するセカンドモジュール（例えばマラカイトグリーンアプタマーの場合は、テオフィリン若しくはＡＴＰ又はフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）などに対する結合ポケットとなるモジュールをコミュニケーションモジュールを介して接続することにより蛍光強度が増幅されることが知られている）に相当する配列を組み込んでもよいし（配列番号１３〜１５）（非特許文献８）、あるいは検出用レポーター分子をコードするセンス配列とランダム配列の間に分子間及び分子内で好ましくない二次構造を形成するのを防ぐための配列を組み込んでもよい。

さらに、実施例１において作製したランダム核酸プローブのプロモーターセンス配列の先頭（５’側）には、Ｔ７プロモーターが機能するのに必要なミニマム配列として知られている配列の直前に４塩基の配列「ＡＧＣＴ」が含まれている。この配列は、Ｔ７プロモーター結合部位のすぐ上流への数塩基の付加がＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を助け、転写量が改善されると一般に報告されていることから、付加された配列である。この数塩基の配列は特に限定されるものではない。ランダム核酸プローブのプロモーター配列としてＴ７プロモーター配列を選択した場合には、Ｔ７プロモーターの機能を促進するため、このような任意の数塩基を付加することが好ましい。付加することができる塩基は、Ｔ７プロモーターの機能を促進することができるものであれば特に限定されるものではなく、１〜５塩基程度で、塩基数及び塩基種は限定されるものではない。

２．メモリ核酸プローブ
本発明において用いる別の核酸分子はメモリ核酸プローブであり、これは、特定の配列情報が記憶された核酸分子である。メモリ核酸プローブは、プロモーターセンス配列及び配列情報が記憶された配列（メモリ部分）から構成され、例えば図１Ａに示すように作製することができる。また、メモリ核酸プローブは、後述するターゲット核酸の検出において特に有用な検出用レポーター分子をコードするセンス配列を含んでいてもよい（図１Ａ）。これは必須の構成要素ではないが、後述する検出用レポーター分子の転写反応を安定化することが期待される。

まず、ランダム核酸プローブと、記憶させようとする配列情報を有するサンプル核酸とを接触させる（図１Ａのａ及びｂ）。サンプル核酸は、配列情報を記憶することができる限り、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのいずれであってもよい。また、サンプル核酸を鋳型とした伸長反応を行うことで、使用するサンプル核酸の配列は、特定されているものだけでなく、特定されていないものも用いることができる。

反応条件は、ランダム核酸プローブにおけるランダム配列とサンプル核酸とが、その相補性に基づいて二本鎖を形成することが可能な条件であり、そのような条件は当業者には公知である。但し、ランダム配列とサンプル核酸の配列が完全な相補性に基づいて二本鎖を形成する必要はなく、以降の３’→５’エキソヌクレアーゼによる切断、逆転写又は複製による伸長の際に離れない程度の親和力があればよく、部分的な相補性に基づいて二本鎖を形成してもよい。例えば、１塩基でも二本鎖を形成していれば、サンプル核酸を鋳型としたプローブ伸長反応を行うことができる。サンプル核酸がＲＮＡの場合は反応液のセットアップに際しては、ＲＮＡの分解及び連続する反応で不完全なメモリ核酸プローブの合成を避けるためにすべて氷上で行うという条件が好ましい。またこのとき、特別にＲＮＡの変性及びアニーリングを行う必要はないが、複雑な二次構造を有するＲＮＡの場合には、変性ステップを必要とする場合もあり、その際は、ヌクレアーゼ不含水に溶解したＲＮＡを６５℃〜７０℃で５分〜１０分インキュベーション後すぐに氷上に反応チューブをおくという操作を行うことが好ましい。より好ましくは７０℃で１０分のインキュベーションを行う。ＲＮＡの変性は逆転写溶液中では行わないことが好ましい。さらに、ランダム核酸プローブは１００塩基以上になるので、サンプル核酸と接触させる前に、９４℃で３０秒インキュベーションののち、氷上で急冷という、変性操作を行って分子内の高次構造の形成を壊しておく操作を必要に応じて行う。ランダム核酸プローブのエキソヌクレアーゼ反応中の濃度は、例えば５０〜１５０ｍｇ／Ｌ、好ましくは約１００ｍｇ/Ｌ、逆転
写反応液中の最終濃度は２〜３ｍｇ/Lとなるように、試料を調製する。

続いて、ランダム核酸プローブの３’末端から二本鎖を形成していない核酸を分解する（図１Ａのｃ）。このときランダム核酸プローブの３’末端側配列がサンプル核酸と二本鎖形成している部分まで分解される。この分解は、３’から５’の方向に一本鎖の核酸配列を分解することができれば、その分解方法は特に限定されるものではない。例えば、一本鎖ＤＮＡの３’−ＯＨ末端から５’方向へ３’，５’−ホスホジエステル結合を順次分解する活性を有する３’→５’エキソヌクレアーゼＩを使用することができる。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素としては、エキソヌクレアーゼＩ、ＫＯＤ ＤＮ
Ａポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。本発明においては、好ま
しくはエキソヌクレアーゼＩを使用する。エキソヌクレアーゼＩの一本鎖ＤＮＡに対する特異性は高く、二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡは分解しない。なお、エキソヌクレアーゼＩは、８０℃、１５分間の熱処理によって失活するため、反応停止のためにさらなる化学的処理を必要としない。

次に、ランダム核酸プローブの３’末端から、サンプル核酸を鋳型としてプローブを伸長する（図１Ａのｄ）。例えばランダム核酸プローブがＤＮＡであり、サンプル核酸がＲＮＡの場合には、逆転写酵素を用いて、ランダムＤＮＡプローブとサンプルＲＮＡとが二本鎖を形成している部分からサンプルＲＮＡの５’末端側の一本鎖を鋳型として、ＤＮＡプローブを伸長してサンプルＲＮＡに相補的な配列を合成する（逆転写）。このとき用いられる逆転写酵素は逆転写を行えるものであれば限定されるものではない。またランダム核酸プローブがＤＮＡであり、サンプル核酸がＤＮＡの場合は、ＤＮＡ複製酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）を用いて、ランダムＤＮＡプローブとサンプルＤＮＡとが二本鎖を形成している部分からサンプルＤＮＡの５’末端側の一本鎖を鋳型として、ＤＮＡプローブを伸
長してサンプルＤＮＡに相補的な配列を合成する（複製）。一方、例えばランダム核酸プローブがＲＮＡであり、サンプル核酸がＤＮＡの場合には、酵素による伸長が難しいのでサンプル核酸の配列を決定して核酸合成装置を用いた合成により、メモリ部分を有するランダムプローブを作製することが好ましい。このようにして新たに合成された配列は、サンプル核酸の配列情報が記憶されたメモリ部分を有することになる（図１Ａ）。

本発明においては、上述のように配列情報が記憶された核酸プローブを、「メモリ核酸プローブ」という。メモリ核酸プローブを回収するため、メモリ核酸プローブと二本鎖を形成して結合しているサンプル核酸を除去する（図１Ａのｅ）。メモリ核酸プローブがＤＮＡであり、サンプル核酸がＲＮＡの場合には、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを認識してＲＮＡを分解する酵素を用いて、サンプルＲＮＡを除去し、メモリＤＮＡプローブを回収する。そのようなＲＮＡを特異的に認識して分解する酵素としては、特に限定されるものではないが、例えばＥ．ｃｏｌｉリボヌクレアーゼＨ、ＴｔｈリボヌクレアーゼＨが挙げられる。失活操作が容易なことから、好ましくはＥ．ｃｏｌｉリボヌクレアーゼＨが用いられる。また、メモリ核酸プローブがＤＮＡであり、サンプル核酸がＤＮＡである場合には、ＤＮＡ二本鎖を分離することができる方法であれば任意の方法を用いることができる。具体的には、例えば、あらかじめランダムＤＮＡプローブをビオチン化しておき、該メモリを形成したランダムＤＮＡプローブがサンプルＤＮＡと形成している二本鎖を一本鎖に変性させてサンプルＤＮＡを切り離した後、アビジンビーズなどを用いてメモリＤＮＡプローブのみを容易に回収することができる。またメモリ核酸プローブがＲＮＡであり、サンプル核酸がＤＮＡである場合にも同様に、ランダム核酸プローブをビオチン化しておき、該メモリを形成したＲＮＡプローブがサンプルＲＮＡと形成している二本鎖を一本鎖に変性させてサンプルＲＮＡを切り離した後、アビジンビーズなどを用いてメモリＲＮＡプローブのみを回収するなどの方法によりメモリ核酸プローブを容易に取得することができる。

また、メモリ核酸プローブは、既知の配列情報を記憶させたメモリ部分を含むものとして、プロモーターセンス配列及びメモリ部分を含む核酸分子、あるいは任意によりさらに検出用レポーター分子をコードするセンス配列を含む核酸分子を、当技術分野で公知の任意の方法により合成することにより作製してもよい。

本発明においては、複数のサンプル核酸を用いて、その複数の配列情報を同一反応系においてメモリ核酸プローブに記憶させることができる。サンプル核酸は、複数種のサンプルＤＮＡ又はサンプルＲＮＡでもよいし、サンプルＤＮＡとサンプルＲＮＡとの組み合わせでもよい。また、サンプル核酸の配列情報は、合成によらずランダム配列を利用してメモリを作製する場合には、サンプル核酸の全て若しくは一部について特定されているものであってもよいし、又は特定されていないものであってもよい。

例えば、基準となる被験体や特定の状態又は特徴を示す被験体からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを採取し、そのゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡをサンプル核酸として用いて、ランダム核酸プローブに配列情報を記憶させ、基準となる被験体の配列情報が記憶されたメモリ核酸プローブライブラリ、又は特定の状態若しくは特徴を示す被験体の配列情報が記憶されたメモリ核酸プローブライブラリを作製することができる（図２のａ及びｃ）。ここで、基準となる被験体とは、特定の状態又は特徴を示さない被験体であり、例えば健常又は正常な被験体を用いることができる。

また、上記ライブラリ作製の際には、メモリ核酸プローブを、特定の核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）の除去に用いることもできる。例えば特定のＤＮＡを除去する場合には、メモリＤＮＡ核酸プローブにビオチン修飾を行い、アビジンビーズで回収するなどの手法により、特定のＤＮＡと特異的に結合したメモリ核酸プローブを複合体として除去することが可能
である。特定のＲＮＡを除去する場合には、特定のＲＮＡが結合したメモリＤＮＡプローブの回収による除去の他に、メモリＤＮＡプローブに特異的に結合したＲＮＡのみを分解する酵素（例えばＥ．ｃｏｌｉリボヌクレアーゼＨ、ＴｔｈリボヌクレアーゼＨ等）を用いてＲＮＡを選択的に除去することもできる。

メモリ核酸プローブの上記の選択排除機能を利用することによって、例えば特定の状態又は特徴に特異的な遺伝子（例えば癌マーカー遺伝子）のライブラリ作製を効率的に行うことができる。例えば、癌患者の唾液中のｍＲＮＡに、健常者のｍＲＮＡの配列情報を記憶させたメモリ核酸プローブライブラリを投入して、癌患者のｍＲＮＡと健常者が有するｍＲＮＡの配列情報を有するメモリ核酸プローブとをハイブリダイゼーションさせたのち、分解酵素を用いてメモリ核酸プローブとハイブリダイゼーションしているｍＲＮＡを分解すると、健常者と同じ配列を有するｍＲＮＡを選択的に排除することができる（図２のｂ）。すなわち、癌患者に特異的なｍＲＮＡを収集することができる。このようにして収集した癌患者に特異的なｍＲＮＡをサンプル核酸として用いることによって、癌患者に特異的な配列情報が記憶されたメモリ核酸プローブライブラリを作製することができる（図２のｃ）。さらに、癌患者に特異的な配列情報が記憶されたメモリ核酸プローブライブラリの配列を決定することによって、癌に特異的な遺伝子の配列情報を明らかにすることも可能である。本発明の方法は、ランダム核酸プローブのランダム配列部分におけるハイブリダイゼーションを利用することにより、ターゲットとする核酸配列が未知の場合でもメモリ核酸プローブを作製してライブラリを作ることが可能で、またサンプル核酸から、あらかじめ配列を決定することなく不要なノイズとなる配列を排除することが可能であり（つまり癌患者のｍＲＮＡから健常者のｍＲＮＡを除去するなど）、それゆえ解析の効率を上げ、大規模解析により疾病の診断に使用可能な新規バイオマーカーの網羅的な探索を行う際に有効である。特定の病気で異常発現を示す遺伝子群を探索する際にも、解析の妨げとなるノイズを除去することにより、回帰樹モデルやロジスティック回帰モデルなどによる解析を容易にし、大量のサンプルから有意な特異性をもつ診断に有効な未知の遺伝子を簡便に分類することが可能であり、遺伝子決定のプロセスの効率をあげることができる。

３．メモリ核酸プローブを用いたターゲット核酸の検出
本発明においては、メモリ核酸プローブと試料とを接触させると（図１Ｂのｆ）、試料中にメモリ核酸プローブに記憶された配列情報と相補的な配列を有するターゲット核酸（すなわち、配列情報の記憶に用いたサンプル核酸の全体又は一部と同じ配列を有する核酸）が含まれる場合には、そのターゲット核酸とメモリ核酸プローブとの間で反応が起こり、その反応を検出することにより、ターゲット核酸を試料中で検出することができる。

メモリ核酸プローブと反応させる試料は、配列情報を有する核酸（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、総ＲＮＡなど）を含むものであれば特に限定されるものではない。例えば、被験体に由来する体液（唾液、血液、尿など）、細胞、組織とすることができる。好ましくは、これらの供与源から核酸成分を精製及び／又は増幅して、試料として用いる。また、試料は、天然に由来するものであってもよいし（被験体から調製された試料、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡなど）、又は合成されたサンプル（例えばＤＮＡライブラリ、ゲノムライブラリなど）であってもよい。試料中に含まれる核酸は、１種類でもよいし、複数種であってもよい。

試料中にメモリ核酸プローブに記憶された配列情報と相補的な配列を有するターゲット核酸が存在する場合には、メモリ核酸プローブのメモリ部分とターゲット核酸の全体又は一部とが結合（ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成）する（図１Ｂのｇ）。ここで、メモリ核酸プローブを作製したときと同様に、メモリ核酸プローブとターゲット核酸とが二本鎖を形成している部分まで３’末端から核酸を分解する活性を有する酵素、例えばエキソヌクレアーゼＩを用いて、二本鎖を形成していないメモリ
核酸プローブをすべて分解する。ターゲット核酸とハイブリダイズしていないメモリ核酸プローブは、ほとんどの場合、分解される（分子間又は分子内で相補鎖を形成した場合は、一部は分解されずに残る）。従って、試料中にターゲット核酸が存在する場合には、メモリ核酸プローブは分解されずに残り（図１Ｂのｈ）、ターゲット核酸が存在しない場合には、メモリ核酸プローブはほぼ全てが分解されることになる。

続いて、プロモーターアンチセンス配列及び検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列を含む検出用アンチセンス核酸を投入する（図１Ｂのｉ）。本発明において用いる検出用アンチセンス核酸は、転写反応に基づいて試料中のターゲット核酸を検出するために必要な核酸分子であり、ランダム核酸プローブ又はメモリ核酸プローブのプロモーター配列に対して相補的な配列と、検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列から構成される。検出用アンチセンス核酸は、ランダム核酸プローブ又はメモリ核酸プローブが検出用レポーター分子をコードするセンス配列を含む場合であっても又は含まない場合であっても、検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列を含む必要がある。これは、後述する蛍光の検出において転写される検出用レポーター分子の鋳型となるのが、ランダム核酸プローブ又はメモリ核酸プローブにおける検出用レポーター分子をコードするセンス配列ではなく、ここで投入する検出用アンチセンス核酸における検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列であるためである。

検出用アンチセンス核酸は、試料中にターゲット核酸が存在していることにより起きる反応を検出する機能を発揮できるようにこれらの配列を含む限り、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのいずれであってもよい。好ましくは、検出用アンチセンス核酸はＤＮＡである。

検出用アンチセンス核酸におけるプロモーターアンチセンス配列は、ポリメラーゼによる転写を開始することができる配列であり、上述のランダム核酸プローブ又はメモリ核酸プローブにおいて使用したプロモーターセンス配列に対して相補的なものであれば特に限定されるものではない。

また、ＲＮＡポリメラーゼにより、検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列を鋳型として転写反応が起きることによって、検出用レポーター分子が形成されるため、検出用レポーター分子を検出することにより転写反応を観察する。後述するように、転写反応が観察された場合には、メモリ核酸プローブがターゲット核酸を認識して二本鎖を形成することにより、エキソヌクレアーゼによる切断を免れ、あるいはターゲット核酸によって、転写反応を妨げるプロモーター配列部分との分子間あるいは分子内高次構造の形成が阻害されてプロモーター配列が二本鎖を形成できる状態にあることになどにより、メモリ核酸プローブと検出用アンチセンス核酸の間でプロモーター部分の二本鎖が形成されていることを示す。もしターゲット核酸がないことによりすべてエキソヌクレアーゼにより切断されて、メモリ核酸プローブが存在しなければ、検出用アンチセンス核酸に対応するセンス配列が存在しないし、若しくはターゲット核酸がないことにより、メモリ配列部分がプロモーター配列部分と分子間又は分子内で非特異的な高次構造を形成してプロモーター配列部分が検出用アンチセンス核酸と二本鎖を形成することを阻害している場合には、ポリメラーゼが転写すべき核酸配列を認識することができないため、転写反応は起こらない。プロモーター配列がセンス配列とアンチセンス配列の間で二本鎖を形成していれば、ポリメラーゼによる転写が起こり、アンチセンス核酸の検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列が転写され、検出操作を行うことで、メモリ核酸プローブが記憶している配列情報を有するターゲット核酸分子が存在していることが示される。

検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列としては、当業者に公知の任意の配列を用いることができる。例えば、有機色素であるマラカイトグリーンと結合してマラ
カイトグリーンの蛍光を増幅する機能を有するマラカイトグリーンアプタマー分子、あるいはこれを機能改良したアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アプタマー分子、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）アプタマー分子、スルホローダミンＢの蛍光を増幅する機能を有するスルホローダミンＢアプタマー分子、タンパク質などの物質との結合活性を有するアプタマーに、ビオチン化された基質（ｙＴＰ）（非特許文献１１）を取り込ませ、水晶発振子や表面プラズモン共鳴を利用したタンパク質相互作用測定装置（例えばＢＩＡＣＯＲＥ）のアビジンセンサーチップにアビジン−ビオチン結合を利用して、アプタマーを固定して、該タンパク質とアプタマーとの結合活性を測定することにより転写の有無を判断することができるビオチン化アプタマー分子、有機電界発光素子ピレンを導入した２’−Ｏ−メチル型ＲＮＡと結合して蛍光を増幅させるＲＮＡ分子をコードする配列が挙げられる。

好ましくは、検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列としては、転写された配列がマラカイトグリーンアプタマーＲＮＡ（配列番号３、５等）を形成することができるＤＮＡをコードする配列のアンチセンス配列を使用する。マラカイトグリーンアプタマーＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列としては、限定されるものではないが、配列番号２、４等に対するアンチセンス配列が挙げられる（非特許文献７〜９）。また、スルホローダミンＢアプタマーＲＮＡ分子（配列番号７）をコードするＤＮＡ配列（配列番号６）のアンチセンス配列を使用することも可能である。さらに、ＲＮＡを特異的に検出する蛍光核酸プローブである２’−Ｏ−メチルＲＮＡのようなＲＮＡ検出試薬を用いることができる。ＲＮＡ検出試薬をＲＮＡの検出に用いる場合には、２’−Ｏ−メチルＲＮＡと反応するＲＮＡを転写することができる配列（配列番号１２）（非特許文献１０）などのアンチセンス配列を使用することも可能である。また、例えばＲａｆ−１タンパク質と結合することのできるビオチン化アプタマー分子（配列番号１７）（非特許文献１１）を形成できるＤＮＡ配列(配列番号１８）（非特許文献１１）のアンチセンス配列を使用すること
も可能である。本発明においては、マラカイトグリーンアプタマーＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列（配列番号２）のアンチセンス配列を用いることが好ましい。

ランダム核酸プローブ又はメモリ核酸プローブに検出用レポーター分子をコードするセンス配列が含まれる場合には、検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列は、検出用レポーター分子をコードするセンス配列に対して相補的となるように適切な配列を選択する。

検出用アンチセンス核酸は、５’から３’に向かって、検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列、及びプロモーターセンス配列に対し相補的な配列の順で含む。これらの配列は直接連結していてもよいし、適当なリンカーを介して連結していてもよい。また、使用するランダム核酸プローブ又はメモリ核酸プローブがプロモーターセンス配列部の前、あるいはプロモーター配列部とランダム配列部又はメモリ配列部の間にさらに追加の配列（塩基）を含む場合には、その追加の配列に対して相補的となるように、検出用アンチセンス核酸に適宜配列又は塩基を追加することが好ましい。

検出用アンチセンス核酸は、上記の構成要素を含むように当業者であれば容易に設計することができる。例えば、ランダム核酸プローブ又はメモリ核酸プローブにおいて配列番号１６に示されるＴ７プロモーターセンス配列と配列番号２に示される検出用レポーター分子をコードするセンス配列を用いた場合には、検出用アンチセンス核酸として配列番号９に示される配列を用いることができる。

上述の分解反応（図１Ｂのｈ）においてメモリ核酸プローブが分解されずに残っている場合には（あるいはターゲット核酸の存在によりメモリ核酸プローブのプロモーター配列部分が高次構造を形成せずにフリーとなっている場合には）、検出用アンチセンス核酸がメモリ核酸プローブのプロモーターセンス配列とハイブリダイズし、二本鎖を形成する（
図１Ｂのｊ）ことにより、ＲＮＡポリメラーゼによる認識が可能となり、ＲＮＡポリメラーゼによって検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列を鋳型として転写反応が起きることになる（図１Ｂのｋ）。

そこで、二本鎖のプロモーター配列を認識して転写開始するポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼ）を投入し、検出用レポーター分子をコードする配列を転写させて、検出用レポーター分子を形成させる（図１Ｃのｋ）。使用するポリメラーゼは特に限定されるものではなく、プロモーター配列に応じて適宜選択することができる。例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなどを用いることができるし、タンデムプロモーターを用いた場合はこれらのポリメラーゼのうち任意の一つを用いることができる。上記ステップにおいてＴ７プロモーターアンチセンス配列を含む検出用アンチセンス核酸を投入して二本鎖を形成させている場合には、二本鎖を形成しているＴ７プロモーター配列を認識して転写反応を行うＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ａｍｂｉｏｎなどより入手可）を用いることが好ましい。

次に形成された検出用レポーター分子の特性に基づいてレポーター分子の存在を観察する。図１Ｃのｌ及びｍには、検出用試薬（発光を誘起する又は増幅する物質）であるマラカイトグリーンと結合することにより蛍光が観察可能になるマラカイトグリーンアプタマーの例を示してある。レポーター分子の観察方法は、検出用レポーター分子の種類に応じて異なり、例えばマラカイトグリーンアプタマーの場合はマラカイトグリーンを投入し、スルホローダミンＢアプタマーの場合はスルホローダミンＢ、ＯＭＵｐｙアプタマーの場合は有機電界発光素子ピレンを導入した２’−Ｏ−メチル型ＲＮＡなどである。蛍光を観察する場合は、蛍光検出用試薬の種類に適した波長で蛍光を励起し、例えば蛍光顕微鏡を用いて行うことができる。転写されることにより自ら蛍光を発するような分子は現在開発されていないがそのような分子が開発されればそのような分子も検出用レポーター分子として用いることができる。

この検出用レポーター分子の転写反応の確認は、蛍光観察によるものでなくてもよい。例えば、タンパク質などとの結合特性を持つアプタマーにビオチン化された基質を取り込ませたビオチン化アプタマー分子は、水晶発振子や表面プラズモン共鳴を利用した相互作用測定装置（例えばＢＩＡＣＯＲＥ）のアビジンセンサーチップにアビジン−ビオチン結合を用いて固定することによりアプタマーとタンパク質などとの結合活性を測定することにより転写反応を定量的、定性的に判定することができる。

検出用レポーター分子が転写されていることが確認された場合には、試料中にターゲット核酸が含まれていたと判定することができる。本発明において「検出」とは、単にターゲット核酸の存在を判定することのみならず、ターゲット核酸を定量することも意味する。ターゲット核酸の量は、例えばコントロールとの蛍光強度の比較によって行うことができる。

本発明の方法を用いて、被験体の病気の罹患の有無又は罹患リスクを判断し又は予測することが可能となる。この判断は、例えば、上述のように健常又は正常な被験体の配列情報が記憶されたメモリ核酸プローブライブラリ、及び特定の病気に罹患した被験体の配列情報が記憶されたメモリ核酸プローブライブラリ（図２）を用いて、被験体の試料における病気に特異的な核酸の存在の有無を検出することによって行う（図３Ａ及びＢ）。メモリ核酸プローブは、当技術分野で公知の技法により、マイクロアレイ又はマイクロチップ上に固定することが好ましい（図３Ａ）。被験体の試料としては、限定されるものではないが、唾液、血液、尿などの体液や、細胞、組織などの他、これらより精製された核酸などを用いることができる。特に、採取の簡便性の点から、試料として唾液又は唾液より精製された核酸を用いることが好ましい。唾液中には約３０００種のｍＲＮＡが存在し、そ
のうち健常者に特異的なｍＲＮＡは約２８０種であることが知られている。また、口腔癌患者の唾液中に含まれる１６７９の遺伝子が健常者のものと異なる発現性を示し、特に７種のｍＲＮＡが癌患者において約３．５倍増大していることも報告されており、唾液中のｍＲＮＡをバイオマーカーとした疾病の判定はこの２つの疾病の診断においては既に実用化が進められている。

上記の本発明の方法は、キットを利用することでより簡便に行うことができる。そのようなキットは、ランダム核酸プローブ又はメモリ核酸プローブ（核酸分子）、及び検出用アンチセンス核酸と、反応に必要な酵素及び試薬、例えばエキソヌクレアーゼＩ、逆転写酵素、ポリメラーゼ、基質及び必要な検出用試薬を含む。キットは、さらにリボヌクレアーゼＨ、バッファーなどを含んでもよい。

また本発明の方法を利用して、ＤＮＡ／ＲＮＡを分類することができる。分類は、例えば同じ又は類似するＲＮＡ発現パターンを示すサンプル群を、そのパターンに基づいて整理するなどの目的をもって行われる。具体的には、同じ又は類似するＲＮＡ発現パターンを示すサンプル群を分類する方法は次のように行うことができる。

ある特定のＲＮＡ発現パターンを示すサンプル群より、その発現ＲＮＡを記憶させたメモリ核酸プローブライブラリを作製し、ｃＤＮＡアレイを用いてメモリ核酸プローブがどの遺伝子と反応するかを網羅的に調べ、その反応したメモリ核酸プローブのみを含む専用ｃＤＮＡアレイを作製する。次いで、発現パターン未解析のサンプルを複数用意し、作製した専用ｃＤＮＡアレイを用いてこれらを解析する。すべての又は大部分の反応において発光が生じた場合には、同じ又は類似する発現パターンをもったサンプルであるといえる。メモリ核酸プローブのＤＮＡアレイ上の反応は、ＡＲＥＳ^ＴＭ ＤＮＡ標識キット（インビトロジェン）のような標識を使用して検体であるメモリ核酸プローブを標識して観察することができる。あるいは、検出用レポーター分子が蛍光による観察機能を有する場合には、このような標識を行うことなく、検出用アンチセンス核酸とＴ７ポリメラーゼ、検出用試薬など必要な試薬を投入することにより、簡便かつ容易に反応を観察できる。また、サンプルＲＮＡのアレイ上での観察のためのＲＮＡの標識はＵＬＹＳＩＳ（登録商標）直接ラベリングキット（インビトロジェン）などで当業者に知られた公知の方法を利用しても容易に行うことができる。アレイ自身に本発明の検出用レポーター分子がマラカイトグリーンアプタマーのような蛍光による観察機能を有するメモリ核酸プローブ及び検出用キットを用いた場合はこのような標識を行う必要がなく、メモリ核酸プローブの蛍光検出機能を利用することができる。

また、上述のように本発明の方法を用いて作製したライブラリを用いて、サンプル群から指標にならない（すなわち、サンプル群に特異的ではない）ＲＮＡをノイズとしてあらかじめサブトラクションにより除くことによって、サンプル群に特徴的なＲＮＡパターンの分類の効率化を図ることができる。例えば疾病に特徴的な発現パターンを分類するときには、健常者からのサンプルを用いて作製したライブラリを用いてあらかじめライブラリに記憶された健常者の発現パターンにも同様に存在する配列を排除してパターン分類を行うことができる。

また、本発明の方法を用いて、類似する発現パターンを示すサンプルを探索することができる。ここで、類似する発現パターンを示すサンプルとは、例えば、ターゲット核酸がＲＮＡであり、発現量の増加しているＲＮＡの種類を調べている時は、総ＲＮＡサンプル中でＲＮＡの定量的な発現量チェックを行い、発現量の増加しているＲＮＡの組み合わせが類似するサンプル同士をいい、このような類似する発現パターンを示すサンプルが採取された生物は、同じ又は類似する状態を示す、すなわち同じ病気を発症していたり、よく似た健康状態にある可能性がある。つまりサンプルが示すＲＮＡ発現パターンの類似性を
調べることで、それが共通の病気を持つ患者群から採取したものである場合にはその病気の疾病マーカーとしてのＲＮＡの組み合わせの探索を行うことも可能であるし、あらかじめ明らかになっている疾病マーカーとしてのＲＮＡの組み合わせがあればサンプルを採取した生物の疾病の早期発見にもつなげることが可能である。本発明の利点は、これらの探索を行う際にあらかじめ配列を特定する前に、ノイズとなる核酸分子のサブトラクションを行うことにより分類の効率化が可能である点、試料の蛍光標識プロセスが不要になる点、転写反応を利用してサンプル中のＲＮＡの定量的な増幅が可能である点、転写反応を用いることによりターゲット核酸がプロモーター配列部分の高次構造形成から保護する特性を利用して検出感度の向上が可能になる点などである。なお、検出用アンチセンス核酸に検出用リポーター配列を組み込まなくても当業者に公知の方法（例えば直接検出用アンチセンス核酸に蛍光標識を行って、その蛍光を利用してメモリ核酸プローブを検出する）ことにより、メモリ核酸プローブが残っていること、すなわちサンプル核酸の存在を判定することもできる。その場合には、本発明のように転写反応を利用する場合に可能な定量的な増幅を行うことはできないが、ポリメラーゼによる転写反応を行う必要がなく、簡便である。

さらに本発明は、診断・分類システムとしてばかりでなく、プロモーター配列の下流に薬物をコードする核酸配列（例えばＲＮＡドラッグとして知られるアンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ等をコードする核酸配列）を組み込むことにより、特定のターゲット核酸の存在を感知してその薬物を放出する医薬を製造し、疾患又は障害の治療又は予防を行うために用いることができる。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

ランダムＤＮＡプローブの作製
本実施例においては、核酸の配列情報を記憶するための基盤となるランダムＤＮＡプローブを作製した。具体的に説明すると、このＤＮＡプローブのモデルＤＮＡとして、Ｔ７プロモーターセンス配列（下線部）の下流にマラカイトグリーンアプタマー配列に対して相補的な配列及び２０塩基のランダム配列を含む７９塩基のセンスＤＮＡ（5’-AGCTTAATACGACTCACTATAGGATCCCGACTGGCGAGAGCCAGGTAACGAATGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；配
列番号８）を合成した。また、後述の実施例４において使用する、５９塩基の検出用アンチセンスＤＮＡ（5’-GGATCCATTCGTTACCTGGCTCTCGCCAGTCGGGATCCTATAGTGAGTCGTATTAAGCT-3’；配列番号９）を準備した。

サンプルＲＮＡ及びターゲットＲＮＡの作製
本実施例においては、ランダムＤＮＡプローブに配列情報を記憶するために用いるサンプルＲＮＡと、メモリＤＮＡプローブを用いて検出するためのターゲットＲＮＡを作製した。

サンプルＲＮＡ及びターゲットＲＮＡの作製用としてＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ）に含まれる対照実験用のｐＴＲＩ−β−ａｃｔｉｎ−ＭｏｕｓｅのＤＮＡコントロールテンプレートを用意する。コントロールテンプレートｐＴＲＩ−β−ａｃｔｉｎ−Ｍｏｕｓｅは、アンチセンスマウスβ−アクチンプローブを作製するために用いられ、ｐＡＬ４１からサブクローニングされたマウスβ−アクチン遺伝子の制限酵素サイトＫｐｎＩ−Ｘｂａ１の間の２５０塩基対の断片で、直鎖状に調製されたプラスミドであり、ＳＰ６、Ｔ７及びＴ３タンデムプロモーターで転写制御されている。ＳＰ６、Ｔ７及びＴ３ＲＮＡポリメラーゼで転写された場合、それぞれ３３４塩基、３０４
塩基、及び２７６塩基の長さになる。

本実施例においては、後述するターゲットＲＮＡの検出においてＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応を利用しているため、サンプルＲＮＡ及びターゲットＲＮＡの調製はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＳＰ６キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してＳＰ６ ＲＮ
Ａポリメラーゼで行って、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、吸光光度計（ＢＥＣＫＭＡＮ ＤＵ６４０）により定量した。ｐＴＲＩ−β−ａｃｔｉｎ−Ｍｏｕｓｅ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を反応液２０μＬあたり１μＬで５倍量調製し、ＲＮｅａｓｙミニカラム２本を用いてそれぞれ３０μＬのヌクレアーゼ不含水で溶出し精製した。得られたＲＮＡは１．３４μｇ／μＬで約６０μＬであった。分注して使用時まで−８０℃で保存しておく。

ランダムＤＮＡプローブを用いたメモリＤＮＡプローブの作製
本実施例においては、実施例１において作製したランダムＤＮＡプローブを用いて、実施例２において作製したサンプルＲＮＡの配列情報を、ランダムＤＮＡプローブに記憶させた（図１Ａ）。

１００ｐｍｏｌのランダムＤＮＡプローブ（実施例１）約２．４μｇを、１．３μｇの１２ｐｍｏｌ ｐＴＲＩ−β−ａｃｔｉｎ−ＭｏｕｓｅのサンプルＲＮＡ（実施例２）に
投入して（図１Ａのａ）、ヌクレアーゼ不含水で１０μＬにして、ＲＮＡが分子内で高次構造をとっているのを壊すために、７０℃で１０分間加熱した。その後、４℃に急冷してから、サンプルＲＮＡとランダムＤＮＡプローブのランダム配列部分をアニールさせるため、３０℃で３０分間インキュベーションした。ここでは、ランダムＤＮＡプローブが長いので分子内で形成される高次構造を壊すための操作として、サンプルＲＮＡを投入する前にランダムＤＮＡプローブに９４℃で３０秒のインキュベーションを加えてもよい。この溶液に１０μＬあたり、エキソヌクレアーゼＩ（Ｔａｋａｒａ）添付の１０×エキソヌクレアーゼＩバッファーを１．５μＬとエキソヌクレアーゼＩ（５ユニット／μＬ）を２μＬ加えてヌクレアーゼ不含水で１５μＬにした。ここでエキソヌクレアーゼＩの１ユニットは熱変性仔牛胸腺ＤＮＡを基質として３７℃、ｐＨ９．５の条件において、３０分間に１０ｎｍｏｌの酸可溶性分解物を生成する酵素活性と定義されている。ここでは１０ユニット分加えたが、１反応あたり、５０ユニット加えると切断がより完全に行える。次に３７℃で３０分加熱して二本鎖を形成していないランダムＤＮＡプローブの３’末端からの分解を行う（図１Ａのｃ）。二本鎖を形成していればそこで分解は停止する。その後、エキソヌクレアーゼＩを失活させるため８０℃、１５分間の熱処理を行った後、４℃に急冷する。

次にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^ＴＭＩＩ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を用いて二本鎖を形成しているＲＮＡを鋳型として逆転写を行う（図１Ａのｄ）。反応液の全量にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^ＴＭＩＩ添付の４μＬの５×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄバッファー、２μＬの１Ｍ ＤＴＴ、１μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰミックスを加え、ランダム配列のアニールを促進す
るため、再び２５℃で１０分間インキュベーションした後、４２℃で２分間インキュベートした。さらにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^ＴＭＩＩ１μＬを加え、４２℃で５０分反応させた後、ランダム配列用の処理として５５℃で１５分インキュベートした後、７０℃で１５分加熱してＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^ＴＭＩＩを不活性化した。

アニールしているサンプルＲＮＡを除去するために（図１Ａのｅ）、リボヌクレアーゼＨ（Ｔａｋａｒａ）６０ユニット／μＬを２ユニット加えて３７℃で２０分インキュベートした後、６５℃で２０分間加熱し、リボヌクレアーゼＨの失活処理を行った。ここでリボヌクレアーゼＨの１ユニットは、３７℃、２０分間で１ｎｍｏｌ酸可溶性リボヌクレオ
チドの生成を行うために必要な酵素量で、反応溶液として２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ
（ｐＨ７．８）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴを使用し、基質として２０μＭ放射性標識ｐｏｌｙ（ｒＡ）：ｐｏｌｙ（ｄＴ）を使用したときの値と定義されている。以上の操作によりｐＴＲＩ−β−ａｃｔｉｎ−ＭｏｕｓｅのサンプルＲＮＡの配列情報が記録されたメモリＤＮＡプローブが完成した。

さらにＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを用いて１００ｍｅｒ以上のメモリＤＮＡプローブのみを精製した。１０倍量の反応液をカラム２本を用いてそれぞれ３０μＬのヌクレアーゼ不含水で抽出し、吸光光度計により濃度を測定する。０．００５μｇ／μＬ＝〜０．０２ｐｍｏｌ／μＬのメモリＤＮＡプローブが約５６μＬ得られた。使用時まで−２０℃でストックする。メモリＤＮＡプローブの作製に投入したランダムＤＮＡプローブ１０００ｐｍｏｌのうち、回収できたのは１．１２ｐｍｏｌであった。必要に応じてＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットによる精製を行わない未精製のものも用意する。

メモリＤＮＡプローブを用いたターゲットＲＮＡの検出
本実施例においては、実施例３において配列情報を記憶させたメモリＤＮＡプローブを用いて、ターゲットＲＮＡの検出を行った（図１Ｂ及び図４参照）。具体的には、精製したｐＴＲＩ−β−ａｃｔｉｎ−Ｍｏｕｓｅ ＲＮＡ用のメモリＤＮＡプローブ（実施例３
において調製）を用いて図４に示す検出実験を行った。

精製したメモリＤＮＡプローブ４６μＬ（０．２３μｇ）を投入し（図１Ｂのｆ、図４のｇ）、１μＬの１．３４μｇ／μＬ ｐＴＲＩ−β−ａｃｔｉｎ−Ｍｏｕｓｅ ＲＮＡ（ターゲットＲＮＡ、実施例２において調製）をアニールさせた（図１Ｂのｇ、図４のｈ）。ＲＮＡが分子内で高次構造をとっているのを壊すために、７０℃１０分間加熱した後、４℃に急冷してから、３０℃で３０分間インキュベーションをした。ここでは、メモリＤＮＡプローブが長いので分子内で形成される高次構造を壊すための操作として、ターゲットＲＮＡを投入する前にメモリＤＮＡプローブに９４℃で３０秒のインキュベーションを加えてもよい。

このアニール液全量に、エキソヌクレアーゼＩ添付の１０×エキソヌクレアーゼＩバッファー５μＬとエキソヌクレアーゼＩ（５ユニット／μＬ）４μＬを加えて５６μＬにして、３７℃で３０分加熱して二本鎖を形成していないメモリプローブの３’末端からの分解を行った（図１Ｂのｈ、図４のｉ）。二本鎖を形成していればそこで分解は停止する。その後、エキソヌクレアーゼＩを失活させるため８０℃、１５分間の熱処理を行った後、４℃に急冷する。ここでは１０ユニット分加えたが、１反応あたり、５０ユニット加えると切断がより完全に行える。

さらに検出用アンチセンスＤＮＡ（実施例１にて調製）を１μＬ、１００ｐｍｏｌ入れ（図１Ｂのｉ）、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７キットを用いて蛍光アプタマー配列を転写させるため、９４℃で３０秒、６８℃で３０分インキュベートして、それをメモリＤＮＡプローブのプロモーター配列及びマラカイトグリーンアプタマー配列部分とアニールさせた（図１Ｂのｊ、図４のｊ）。ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７キットのインストラクションに従って、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰを各１２．５μＬ、１０×反応バッファーを１２．５μＬ、に試料を全量投入した後、Ｔ７ポリメラーゼを含む酵素ミックスを１２．５μＬ投入して３７℃で１６時間インキュベートし、転写反応を行った（図１Ｂのｋ）。

同様に、コントロール１として、ランダムＤＮＡプローブ０．５μＬ（５０ｐｍｏｌ）
を投入し（図１Ｂのｆ、図４のａ）、１．３４μｇ／μＬ ｐＴＲＩ−β−ａｃｔｉｎ−
Ｍｏｕｓｅ ＲＮＡ（ターゲットＤＮＡ、実施例２において調製）１μＬをヌクレアーゼ
不含水で１０μＬにしてアニールさせた（図１Ｂのｇ、図４のｂ）。ＲＮＡが分子内で高次構造をとっているのを壊すために、７０℃１０分間加熱した後、４℃に急冷してから、３０℃で３０分間インキュベーションした。このアニール液全量に、エキソヌクレアーゼＩ添付の１０×エキソヌクレアーゼＩバッファーを２μＬとエキソヌクレアーゼＩ（５ユニット／μＬ）を２μＬ加えてヌクレアーゼ不含水で２０μＬにする。３７℃で３０分加熱して二本鎖を形成していないランダムメモリの３’末端からの分解を行った（図１Ｂのｈ、図４のｃ）。二本鎖を形成していればそこで分解は停止する。その後、エキソヌクレアーゼＩを失活させるため、８０℃、１５分間の熱処理を行った後、４℃に急冷した。

さらに検出用アンチセンスＤＮＡ（実施例１にて調製）を１μＬ、１００ｐｍｏｌ入れ（図１Ｂのｉ）、９４℃で３０秒、６８℃で３０分インキュベートして、メモリＤＮＡプローブのプロモーター配列とマラカイトグリーンアプタマー配列部分とアニールさせた（図１Ｂのｊ、図４のｄ）。さらにＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７キットを用いて蛍光アプタマー配列を転写させる。キットのインストラクションに従ってＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰを各５μＬ、１０×反応バッファーを５μＬ、にサンプルを全量投入した後、Ｔ７ポリメラーゼを含む酵素ミックスを５μＬ投入して３７℃で１６時間インキュベーションして転写反応を行った（図１Ｂのｋ）。

また同様に、コントロール２としてエキソヌクレアーゼＩによる切断を行わないランダムＤＮＡプローブ０．５μＬ（５０ｐｍｏｌ）と検出用アンチセンスＤＮＡを１μＬ １
００ｐｍｏｌ投入してヌクレアーゼ不含水で２０μＬにして９４℃で３０秒、６８℃で３０分インキュベートしてアニールさせた。ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７キットを用いて蛍光アプタマー配列を転写させた。ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰを各５μＬ、１０×反応バッファーを５μＬ、にサンプルを全量投入した後、Ｔ７ポリメラーゼを含む酵素ミックスを５μＬ投入して３７℃で１６時間インキュベーションした。

これらの試料に蛍光試薬を投入し、本発明の検証を行った。ランダム／メモリＤＮＡプローブが残っている試料では、検出用アンチセンスＤＮＡがメモリＤＮＡプローブのセンス部分とアニールしてＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７キットに含まれるＴ７ＲＮＡポリメラーゼによりマラカイトグリーンアプタマー分子の転写が開始される（図１Ｂのｋ）。観察時にマラカイトグリーンの入った２×観察用バッファー（２００ｍＭ ＫＣＬ
、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０μＭ ＭＧ［マラカイトグリーン］）を反応液と同体積加えて（図１Ｃのｌ、図４のｋ）、プレートリーダー（モレキュラーデバイス、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＧＥＭＩＮＩ）を用いて蛍光の観察を行った。マラカイ
トグリーンは理論値では１：１でアプタマーと反応するため、最終濃度１０μＭのマラカイトグリーンでは１０μＭのマラカイトグリーンアプタマーを検出できることになる（図１Ｃのｍ、図４のｌ）。投入したＤＮＡの質量の８０倍から１２０倍のＲＮＡの生成が保障されていることから、１０μＭは予想される精製メモリＤＮＡプローブによるアプタマー生成量の３００倍程度になると思われ、十分量であると考えられる。

ここで転写の効率を比較するために次の量を定義する。ランダム／メモリＤＮＡプローブ５０ｐｍｏｌ、１．２１μｇを使って転写反応液２０μＬを観察用バッファーで２倍に薄めて転写反応を観察したときのランダム／メモリＤＮＡプローブ反応を１ユニットとする。

図５〜６は実施例に基づくプレートリーダー（モレキュラーデバイス、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＧＥＭＩＮＩ）による観察結果である。縦軸に６２０ｎｍで励起したときの蛍光
量、横軸に観測波長をとる。図中のＲＮＡ、ＥｘｏＩ及びＭＧはそれぞれＲＮＡ及びエキ
ソヌクレアーゼ及びマラカイトグリーンを表し、＋及び−記号でそれぞれを添加した処理を行っているか（＋）又は行っていないか（−）を表している。最初に図５に蛍光アプタマー分子とマラカイトグリーンが同時に存在しないと蛍光が観察できないことを示すために、エキソヌクレアーゼ切断を行わないランダムＤＮＡプローブで調製したコントロール２をマラカイトグリーンを添加して観察した結果、マラカイトグリーン添加せずに観察した結果（コントロール３）とマラカイトグリーンの蛍光のみを観察用バッファーで観察した結果(コントロール４)を示す。コントロール３の条件のランダムＤＮＡプローブのみ、あるいはコントロール４のマラカイトグリーン（ＭＧ）のみでは本スケールで観測可能な蛍光を示さないことを示している。メモリ作製前のランダムＤＮＡプローブとマラカイトグリーンの蛍光の測定は、それぞれ全量１００μＬを用いて５ユニットのマラカイトグリーン及び５ユニットのメモリ作製前のランダムＤＮＡプローブで行った。図５〜６では、図６に示すＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットによる精製を行う前の未精製メモリ核酸プローブに、メモリ部に記憶されている配列情報を有するＲＮＡを加えて蛍光を観察したときの最大値を１として規格化を行っている。

図６は、１００ｐｍｏｌのランダムＤＮＡプローブから作製した未精製メモリＤＮＡプローブと精製メモリＤＮＡプローブ、及び５０ｐｍｏｌのランダムＤＮＡプローブ(コン
トロール１)とを、すべてターゲットＲＮＡとの反応とエキソヌクレアーゼI切断を行って実験した観察結果である。

ここで図５と６のターゲットＲＮＡとの反応とエキソヌクレアーゼIによる切断とを行
ったランダムＤＮＡプローブ(コントロール１)と、両者を行わないランダムＤＮＡプローブ(コントロール２)との比較を行うと以下のことが推察される。このときコントロール２ではターゲットＲＮＡとの反応は行わなかったが、コントロール１では、ターゲットＲＮＡと反応させている。コントロール１及び２は同じ程度の蛍光が観察されることを確認した。これはＲＮＡが検出用アンチセンス核酸の配列部分との分子間及び分子内相補鎖を形成することを阻止している可能性を示すものであると考えられる。メモリ核酸プローブのメモリ部分がターゲット核酸との相補鎖を形成するのに十分な特異性がある場合は、ターゲット核酸と検出用アンチセンス核酸がアニールするメモリ核酸プローブのプロモーター配列部分が二本鎖を形成することによりメモリ核酸プローブ同士の好ましくない分子間及び分子内相補鎖の形成を阻止してメモリ核酸プローブのセンス配列部分に検出用アンチセンス核酸がアニールすることができるよう保護することができるが、メモリ核酸プローブに十分な配列情報が記憶されていない場合やターゲット核酸が存在しない場合は、メモリ核酸プローブのメモリを形成せずに残ったランダム配列部分やメモリを形成しているメモリ配列部分が分子間及び分子内でプロモーター配列部分と高次構造を形成して、検出用アンチセンス核酸とのアニールを阻害し、メモリ核酸プローブが十分量存在していると考えられる場合でも蛍光検出反応を著しく阻害すると考えられる。そのため、メモリ核酸プローブが記憶した配列を有するターゲット核酸が存在するときにのみ、検出用アンチセンス核酸のプロモーターアンチセンス配列がメモリ核酸プローブのプロモーターセンス配列部分と二本鎖を形成することができ、ＲＮＡポリメラーゼが二本鎖となったプロモーター配列を認識して蛍光を検出するのに必要な反応が起き、この蛍光によってターゲットＲＮＡの検出をより効果的に行うことができると予想される。つまり、ターゲット核酸が存在しないときにプロモーターセンス配列部分と検出用アンチセンス核酸のプロモーターアンチセンス配列との二本鎖形成を阻害するようなメモリ核酸プローブの分子構造自体がＲＮＡ検出の特異性を高めているということができる。メモリ作製前のランダムＤＮＡプローブを用いた２つの実験は同じ５ユニットで全量１００μＬで行った。エキソヌクレアーゼＩ処理を行ったメモリ作製前のランダムＤＮＡプローブで蛍光が検出されているのは、分子内又は分子間で相補鎖を形成しためエキソヌクレアーゼIによる切断を免れたもの、ある
いはＲＮＡと一部相補鎖を形成して切断されずに残ったもののうち、検出用アンチセンスＤＮＡとメモリ作製前のランダムＤＮＡプローブのプロモーター配列部分とのアニールが
阻害されなかったものであると考えられる。またエキソヌクレアーゼＩ処理をしていないものは検出用アンチセンスＤＮＡによるメモリ作製前のランダムＤＮＡプローブのプロモーター配列とのアニールが阻害されなかったものと考えられる。ランダム配列部分にメモリを記憶させることにより、プロモーターによる転写開始機構が効率よく作動し、本発明の転写機能が正しく動作するようになると考えられる。

さらに図６では、１００ｐｍｏｌのランダムＤＮＡプローブから作製した未精製メモリＤＮＡプローブと精製メモリＤＮＡプローブ、及びエキソヌクレアーゼ切断を行わない５０ｐｍｏｌのランダムＤＮＡプローブ(コントロール２)とを比較する。未精製メモリＤＮＡプローブに含まれている１００ｍｅｒ以上のメモリＤＮＡプローブは０．５ｐｍｏｌ程度と推定されるが、同じ条件のランダムＤＮＡプローブ５０ｐｍｏｌよりも強い蛍光を示していることから、５０ｐｍｏｌ以上の１００ｍｅｒ以下のメモリＤＮＡプローブが含まれていると推定されるが、３ｐｍｏｌのメモリＤＮＡプローブのほうが強い蛍光を示している。これらより、メモリＤＮＡプローブは１００ｍｅｒ以上のものを精製することにより、特異性が増しメモリＤＮＡプローブの検出感度を上げることができると期待される。さらに前述のように図５のエキソヌクレアーゼ処理を行っていないランダムＤＮＡプローブ(コントロール２)と比較することにより、ランダムＤＮＡプローブでは、プローブ間及びプローブ内部の高次構造形成の弊害のためプロモーター部をポリメラーゼが認識することができず、蛍光の検出量が低下することが推定される。メモリＤＮＡプローブのターゲットＲＮＡに対する特異性の高さについて、精製メモリＤＮＡプローブ（図４のｇ〜ｌ）と、コントロール１として用意したメモリ作製前のランダムＤＮＡプローブの蛍光観察データを（図４のａ〜ｆ）を比較して検討する。最初２倍量で調製した精製メモリＤＮＡプローブは、プレートリーダーの測定可能な蛍光量を上回ったため、２倍に希釈して測定しなおした。ＲＮＡとの特異性が高く、ＲＮＡが存在するところではＲＮＡと相補鎖を作ることにより、検出反応に重要なプロモーター配列を保護することができ６分の１のプローブ投入でランダムＤＮＡプローブ投入の２．７倍の蛍光量の検出が可能であることがわかる（図６）。ランダムＤＮＡプローブのもつ脆弱なハイブリダイゼーション能力では、エキソヌクレアーゼ切断や、蛍光観察を阻害する分子内の高次構造形成を十分阻止できないため、メモリＤＮＡプローブのような強い蛍光は得られないことが推定される。未精製メモリＤＮＡプローブを用いた予備実験ではこのような感度は達成されなかったこととも併せて、これらの結果より、本発明の方法は精製により感度が上がり、サンプル核酸の配列情報を記憶し、記憶した配列情報を有するターゲット核酸の存在の有無を蛍光量により判定できることがわかった。

ターゲット核酸がＰＰＡＰ２ＢやＰＩＭ１などの癌マーカー遺伝子より転写されたＲＮＡである場合、ターゲット核酸を検出することにより罹患の有無を診断することができる。また本発明の方法は、配列を事前に決定せずに複数のサンプル核酸が有する複数の類似性パターンを判定することを可能にし、ライブラリの作製にも応用できる優れたシステムである。

本発明の方法により、核酸分子上に、任意の核酸の配列情報を、その配列が特定されていなくても記憶させることができる。これは、ノイズを含む膨大なデータから記憶した配列情報をノイズとして除去して、ライブラリの作製を行い効率よく目的の核酸の存在パターンを分類する際に有効である。これにより疾病診断に有効なバイオマーカーを網羅的に探索することが容易になり、遺伝子診断が有効な疾病領域を拡げ、早期発見、早期治療が可能な疾病領域の拡大を可能にする。

また上述のように記憶させた配列情報と蛍光検出機能を利用して、試料中の目的の核酸を簡便にかつ高感度で検出することができる。さらに本発明の方法により分類された核酸
パターンを基に、メモリ核酸プローブライブラリを作製し、目的の核酸パターンを示す被験体又は被験体集団を容易に診断することができ、診断医療の分野で有効である。

また本発明の方法は、医療場面で広く応用できる可能性を秘めたもので、現在遺伝子の特異的な発現が起こることが予測されている精神・神経疾患あるいは癌、その他の全身疾患の診断治療及び予防に効果を発揮することが期待される。

ランダム核酸プローブ及びメモリ核酸プローブの構成の例と、ランダム核酸プローブを用いたメモリ核酸プローブの作製手順を示す。 メモリ核酸プローブを用いたターゲット核酸の検出手順を示す。 検出用レポーター分子をコードする配列から転写された検出用レポーター分子の蛍光発光を利用した検出機構をマラカイトグリーンアプタマーを例にとって示す。 メモリ核酸プローブのライブラリ作製の一例の概要を示す。 メモリ核酸プローブのライブラリを用いたマイクロアレイの作製を示す。 メモリ核酸プローブのライブラリを用いた診断例の概要を示す。 ｐＴＲＩ−β−Ａｃｔｉｎ−Ｍｏｕｓｅ ＲＮＡを用いたランダムＤＮＡプローブをコントロールとした、メモリＤＮＡプローブを用いたターゲットＲＮＡの検出実験の概要を示す。 マラカイトグリーンを添加したランダムＤＮＡプローブを用いて得られた転写反応液、マラカイトグリーンを添加していないランダムＤＮＡプローブを用いて得られた転写反応液、及びマラカイトグリーン単独の蛍光強度を示す。 精製メモリＤＮＡプローブと未精製メモリＤＮＡプローブのＲＮＡ検出機能の差をランダムＤＮＡプローブとの比較により示す。

配列番号１、２、４、６、８〜１６及び１８：合成ＤＮＡ
配列番号３、５、７、及び１７：合成ＲＮＡ
配列番号８の６０〜７９位のｎは任意の塩基を表す
配列番号１７の１００位のnはビオチン化された塩基を表す
配列番号１８の１００位のnは２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン又は２−アミ
ノ−６−（２−チアゾリル）プリンを表す

Claims (37)

1. 以下のステップ：
   （ａ）プロモーターセンス配列及び５〜１０００００塩基からなるランダム配列を含む核酸プローブとサンプル核酸とを接触させ、該核酸プローブのランダム配列と該サンプル核酸との間で二本鎖を形成させるステップ、
   （ｂ）上記核酸プローブの３’末端から、上記核酸プローブとサンプル核酸とが二本鎖を形成している部分まで、上記核酸プローブの一本鎖を分解するステップ、
   （ｃ）上記核酸プローブとサンプル核酸とが二本鎖を形成している部分から上記核酸プローブの３’末端側に、サンプル核酸を鋳型としてサンプル核酸の配列に相補的な配列を伸長させるステップ、
   （ｄ）上記サンプル核酸を除去し、サンプル核酸の配列に相補的な配列を含む核酸プローブを回収するステップ、
   を含む、サンプル核酸の配列情報を有する核酸プローブの作製方法。
2. サンプル核酸が体液、細胞若しくは組織又はそれらから採取した核酸である、請求項１記載の方法。
3. 体液が唾液、血液又は尿である、請求項２記載の方法。
4. 核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 核酸プローブがＤＮＡであり、サンプル核酸がＲＮＡである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列若しくはＳＰ６プロモーター配列、又はこれらの配列が連結したタンデム配列である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. ステップ（ｂ）の一本鎖の分解がエキソヌクレアーゼＩにより行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. ステップ（ｃ）の配列の伸長が、逆転写又は複製である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 核酸プローブがプロモーターセンス配列の下流にさらに検出用レポーター分子をコードするセンス配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 検出用レポーター分子がアプタマーＲＮＡ分子である、請求項９記載の方法。
11. 検出用レポーター分子がマラカイトグリーンアプタマーＲＮＡ分子である、請求項１０記載の方法。
12. 複数のサンプル核酸を用いて、各サンプル核酸の配列情報を有する複数の核酸プローブを作製する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. サンプル核酸の配列が特定されていないものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 以下のステップ：
    （ａ）プロモーターセンス配列及びターゲット核酸の全体又は一部に対し相補的な配列を含む核酸プローブと試料とを接触させ、該核酸プローブと該試料に含まれるターゲット核酸との間で二本鎖を形成させるステップ、
    （ｂ）上記核酸プローブの３’末端から上記核酸プローブの一本鎖を分解するステップであって、ここで上記核酸プローブとターゲット核酸とが二本鎖を形成している場合には、二本鎖を形成している部分まで上記核酸プローブを分解するステップ、
    （ｃ）プロモーターセンス配列に対し相補的な配列及び検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列を含む検出用アンチセンス核酸を添加し、該プロモーターセンス配列と該相補的配列との間で二本鎖を形成させるステップ、
    （ｄ）ポリメラーゼを添加して上記検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列を転写させて検出用レポーター分子を形成させるステップ、
    （ｅ）ステップ（ｄ）における転写反応を確認して試料中のターゲット核酸を検出するステップ、
    を含む、試料中のターゲット核酸の検出方法。
15. ステップ（ａ）において使用する核酸プローブが、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法により作製されたものである、請求項１４記載の方法。
16. 試料が体液、細胞、組織又はそれらから採取した核酸である、請求項１４又は１５記載の方法。
17. 体液が唾液、血液又は尿である、請求項１６記載の方法。
18. 核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 核酸プローブがＤＮＡであり、ターゲット核酸がＲＮＡである、請求項１８記載の方法。
20. プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列若しくはＳＰ６プロモーター配列、又はこれらの配列が連結したタンデム配列である、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. ステップ（ｄ）のポリメラーゼが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. ステップ（ｂ）の一本鎖の分解がエキソヌクレアーゼＩにより行われる、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 検出用レポーター分子がマラカイトグリーンアプタマーＲＮＡ分子であり、転写反応の確認の検出用試薬としてマラカイトグリーンを使用して試料中のターゲット核酸を検出する、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 核酸プローブがプロモーターセンス配列の下流にさらに検出用レポーター分子をコードするセンス配列を含み、ステップ（ｃ）において該検出用レポーター分子
    をコードするセンス配列と検出用アンチセンス核酸における検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列との間で二本鎖が形成される、請求項 １４〜２３のいずれか１項に記載の方法。
25. ターゲット核酸の配列が特定されていないものである、請求項１４〜２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 下記（１）及び（２）を含むターゲット核酸を検出するためのキット：
    （１）プロモーターセンス配列及び５〜１０００００塩基からなるランダム配列を含む核酸プローブ又はプロモーターセンス配列及びターゲット核酸の全体若しくは一部に対し相補的な配列を含む核酸プローブ、
    （２）プロモーターセンス配列に対し相補的な配列及び検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列を含む検出用アンチセンス核酸。
27. ランダム配列が１０〜１０００塩基からなるものである、請求項２６記載のキット。
28. 核酸プローブがＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項２６又は２７記載のキット。
29. プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列若しくはＳＰ６プロモーター配列、又はこれらの配列が連結したタンデム配列である、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のキット。
30. 核酸プローブがプロモーターセンス配列の下流にさらに検出用レポーター分子をコードするセンス配列を含む、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載のキット。
31. 検出用レポーター分子をコードするアンチセンス配列がその転写によりマラカイトグリーンアプタマー分子を形成することができるものである、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載のキット。
32. エキソヌクレアーゼＩ、プローブ伸長用酵素（逆転写又は複製）、ＲＮＡポリメラーゼ、基質及び検出用試薬からなる群より選択される少なくとも１つをさらに含む、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載のキット。
33. 以下のステップ：
    （ａ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を用いて、基準被験体に由来する核酸の配列情報を有するメモリ核酸プローブを作製するステップ、
    （ｂ）上記メモリ核酸プローブを、特定の状態又は特徴を示す被験体に由来する核酸と接触させ、上記メモリ核酸プローブが有する配列情報と同じ配列情報を有する核酸と二本鎖を形成させるステップ、
    （ｃ）上記メモリ核酸プローブを取り除くことにより、特定の状態又は特徴を示す被験体に固有の核酸群を取得するステップ、
    を含む、特定の状態又は特徴を示す被験体に特異的な遺伝子のライブラリの作製方法。
34. 基準被験体が健康又は正常な被験体である、請求項３３記載の方法。
35. 特定の状態が疾患又は障害である、請求項３３又は３４記載の方法。
36. 基準被験体に由来する核酸及び特定の状態又は特徴を示す被験体に由来する核酸がｍＲＮＡである、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
37. さらに（ｄ）上記の特定の状態又は特徴を示す被験体に固有の核酸群より、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を用いて、特定の状態又は特徴を示す被
    験体に固有の配列情報を有するメモリ核酸プローブを作製するステップを行って、特定の状態又は特徴を示す被験体に特異的な遺伝子の配列情報を有するメモリ 核酸プローブライブラリを作製するものである、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の方法。
    

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