JP4853972B2

JP4853972B2 - 分子インプリント微粒子を用いた試料中の標的分子検出方法

Info

Publication number: JP4853972B2
Application number: JP2007212826A
Authority: JP
Inventors: 俊文竹内
Original assignee: Kobe University NUC
Current assignee: Kobe University NUC
Priority date: 2007-08-17
Filing date: 2007-08-17
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2027-08-17
Also published as: JP2009047507A

Description

本発明は、分子インプリント微粒子を用いた試料中の標的分子検出方法に関するものであり、詳しくは、分子インプリント微粒子と、標的分子またはその誘導体の単分子層を有する分子集積体との相互作用の検出により試料中の標的分子を検出する方法に関するものである。

標的分子を特異的に認識できる人工レセプター合成法の１つとして、モレキュラーインプリント法（ＭＩ法）が知られている。ＭＩ法とは、認識対象である分子（標的分子）を鋳型として、その標的分子に選択性のある結合部位（標的分子認識部位）を人工的に材料中に構築する方法である。

ＭＩ法を用いて合成されるポリマーはモレキュラーインプリントポリマー（ＭＩＰ）と呼ばれる。ＭＩＰは、鋳型分子（標的分子あるいはその誘導体）と機能性モノマー（鋳型分子に対して特異的に相互作用する部位とビニル基などの重合可能な官能基とを持つ分子）とを架橋剤とともにラジカル重合させ、鋳型分子をポリマー内から除去することによって構築される（非特許文献１参照）。

ＭＩＰによって認識される標的分子としては、除草剤、薬物、殺虫剤、タンパク質やペプチド、コレステロール、染料、炭水化物などが報告されており、ＭＩＰは標的分子認識技術として有用であることが示されている。

また、ＭＩＰは、種々の検出手段と組合わせてセンサーとして適用できることが報告されている。例えば、水晶振動子化学計測装置（非特許文献２参照）、表面プラズモン共鳴計測装置（非特許文献３参照）、電極（非特許文献４参照）などが挙げられる。

一方、近年のポリマー微粒子合成技術の革新により、ポリマー微粒子は、より高度かつ精密に、粒子径・形態・粒子組成・粒子表面の制御が可能となっており、ＭＩＰについても微粒子化が試みられている（非特許文献５参照）。
蒲池幹治、遠藤剛監修者、『ラジカル重合ハンドブック』（1999）エヌティーエス Kugimiya, A.,Yoneyama, H., Takeuchi, T. Sialic Acid Imprinted Polymer-Coated Quartz CrystalMicrobalance, Electroanalysis 2000, 12, 1322-1326. Matsunaga, T.,Hishiya, T., Takeuchi, T., Surface Plasmon Resonance Sensor for Lysozyme Basedon Molecularly Imprinted Thin Films, Anal. Chim. Acta 2007, 591, 63-67. Shoji, R.,Takeuchi, T., Kubo, I. Atrazine Sensor Based on Molecularly Imprinted PolymerModified Gold Electrode, Anal. Chem. 2003, 75, 4882-4886. Silvestri, D.,Borrelli, C., Giusti, P., Cristallini, C., Ciardelli, G., Polymeric devicescontaining imprinted nanospheres: a novel approach to improve recognition inwater for clinical uses, Anal. Chim. Acta 2005, 542, 3-13.

上述のように、ポリマー微粒子合成技術の進歩により、粒子径の揃ったナノサイズ（平均粒子計が１μｍ未満）の分子インプリント微粒子を、簡便かつ安価に合成できるようになっている。このような分子インプリント微粒子は、従来のＭＩＰポリマーを機械的に粉砕して得られる微粒子と比較して比表面積が増大しているので、効果的に標的分子と相互作用することができると考えられる。したがって、これらの特徴を十分に活かすことにより、ナノサイズ（平均粒子計が１μｍ未満）の分子インプリント微粒子を用いた新規なセンシングシステム（検出系）の構築が期待できる。すなわち、ナノサイズ（平均粒子計が１μｍ未満）の分子インプリント微粒子を用いた新規なセンシングシステム（検出系）を構築することが、本研究分野の課題となっている。

本発明は上記の課題を解決するためになされたものであり、その目的は、ナノサイズ（平均粒子計が１μｍ未満）の分子インプリント微粒子を利用した新規な標的分子の検出方法を提供することである。

本発明者は鋭意検討した結果、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサー基板表面に標的分子誘導体を集積させ、分子インプリント微粒子を送液すれば、分子インプリント微粒子が標的分子誘導体集積基板と相互作用し、これによりＳＰＲスペクトルが変化することを利用して試料中の標的分子を検出できることを見出した。さらに、本発明者は蛍光性の分子インプリント微粒子が、表面に標的分子誘導体を集積させた金微粒子と相互作用することにより、分子インプリント微粒子と標的分子誘導体集積金微粒子間の光エネルギーの吸収と放出挙動を利用して試料中の標的分子を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明に係る試料中の標的分子検出方法は、試料中の標的分子を検出する方法であって、以下の（Ａ）と（Ｂ）との相互作用を検出することを特徴とする。
（Ａ）分子インプリント法により構築された標的分子認識部位を有し、動的光散乱法により測定される平均粒子径が１μｍ未満の分子インプリント微粒子
（Ｂ）標的分子またはその誘導体の単分子層を有し、単分子層に分子インプリント微粒子が結合可能な分子集積体

本発明に係る試料中の標的分子検出方法において、分子集積体は、基板の表面に単分子層が形成されていることが好ましい。また、分子集積体は、溶媒に分散可能な微粒子の表面に単分子層が形成されていることが好ましい。

また、分子集積体は、光エネルギーを吸収または放出することが好ましい。一方、分子インプリント微粒子は、分子集積体が光エネルギーを吸収するときは光エネルギーを放出し、分子集積体が光エネルギーを放出するときは光エネルギーを吸収することが好ましい。より好ましい組み合せは、分子インプリント微粒子は蛍光を発光し、分子集積体は分子インプリント微粒子が発する蛍光エネルギーを吸収して分子インプリント微粒子の蛍光を消光する、または分子インプリント微粒子が発する蛍光エネルギーを吸収して分子集積体自身がさらに蛍光を発光することである。逆に、分子集積体は蛍光を発光し、分子インプリント微粒子は分子集積体が発する蛍光エネルギーを吸収して分子集積体の蛍光を消光する、または分子集積体が発する蛍光エネルギーを吸収して分子インプリント微粒子自身がさらに蛍光を発光するものでもよい。

本発明に係る試料中の標的分子検出方法は、試料と前記分子インプリント微粒子と前記分子集積体とを接触させる試料接触工程を包含することを特徴とする。

本発明に係る試料中の標的分子検出キットは、試料中の標的分子を検出するための試薬キットであって、以下の（Ａ）および（Ｂ）を備えることを特徴とする。
（Ａ）分子インプリント法により構築された標的分子認識部位を有し、動的光散乱法により測定される平均粒子径が１μｍ未満の分子インプリント微粒子
（Ｂ）標的分子またはその誘導体の単分子層を有し、単分子層に分子インプリント微粒子が結合可能な分子集積体

本発明によれば、ナノサイズ（平均粒子計が１μｍ未満）の分子インプリント微粒子と、標的分子またはその誘導体の単分子層を有する分子集積体とを利用した新規な標的分子の検出方法を提供することができる。本発明に係る試料中の標的分子検出方法は、種々の検出手段に適用することができ、応用範囲が広いという効果を奏する。

まず、本発明の完成に至る背景を簡単に説明する。

本発明者は、生体分子の機能を人工的に模倣するバイオミメティック技術を開発すべく、モレキュラーインプリント法により構築した標的分子認識構造体を用いたセンシングについて鋭意研究を行っている。今回、本発明者は、女性ホルモン様作用を示す内分泌攪乱物質として知られているビスフェノールＡ（以下「ＢＰＡ」と記す）を標的分子とする分子インプリント微粒子を合成し、この分子インプリント微粒子と標的分子であるＢＰＡとの相互作用を表面プラズモン共鳴（以下「ＳＰＲ」と記する）スペクトルの変化として検出することを試みた。

最初に、本発明者は、ＳＰＲガラス基板表面にＢＰＡ認識分子インプリント微粒子を自己集積させた基板を作製し、これをＳＰＲ測定基板としてＳＰＲ測定装置にセットし、ＢＰＡ溶液を送液してＳＰＲスペクトルの変化を観察した。しかしながら、ＳＰＲスペクトルの変化はほとんど観察されなかった。また、ＢＰＡと非特異的に吸着することが知られている物質を基板に用いた場合も同様にＳＰＲスペクトルの変化が観察されなかった。これらの結果から、基板表面のＢＰＡ認識分子インプリント微粒子にＢＰＡが吸着しないのではなく、ＢＰＡ吸着による基板表面の質量変化（密度変化）が小さすぎるため、ＳＰＲスペクトルの変化として捕らえることができないことが明らかとなった。この結果は、基板表面の密度変化による誘電率変化が共鳴波長に影響するというＳＰＲの原理上妥当であり、今回のターゲットであるＢＰＡ（Ｍｗ＝２２８）は分子量が小さすぎるため、ＳＰＲによる検出対象として不適当であるものと考えられた。

そこで、本発明者は、基板表面にＢＰＡ誘導体を集積させたＳＰＲ測定基板を作製してこれをＳＰＲ測定装置にセットし、ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子溶液を送液することを試みた。その結果、基板への分子インプリント微粒子の吸着をＳＰＲスペクトルの変化として検出できることを見出した。また、ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子を、ＢＰＡを含む試料に加えて放置した後に送液したときのＳＰＲスペクトルの変化は、ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子のみを送液した場合と異なることを見出した。これにより、低分子量のＢＰＡをＳＰＲスペクトルの変化として検出できる、新たな標的分子の検出方法を完成させた（後段の実施例２参照）。

さらに、上述の分子インプリント微粒子と標的分子またはその誘導体の単分子層を有する分子集積体とを用いる検出系において、ＳＰＲ測定装置等の高価な装置を使用しなくても標的分子を検出できる方法を開発すべく研究を行った。なぜなら、ＳＰＲ測定装置のような高価な装置を保有する施設は限られており、誰もが容易に実施できるものではないからである。

そこで、本発明者は、蛍光性のＢＰＡ認識分子インプリント微粒子と表面にＢＰＡ誘導体を集積させた金微粒子を用いることを試みた。金微粒子は、蛍光消光剤として、蛍光色素近傍に存在したとき消光反応を示すことが知られているからである（例えば、以下の参考文献を参照のこと。O.Yen-Yu, H.Michael, J.Phys.Chem ,2006,110,2031. C.Fabio,
C.Giuseppe, B.Anna, C.Salvatore, J.Phys.Chem ,2006,110,16491. N.Kato, F.Caruso,
J.Phys.Chem ,2005,109,19604. H.Cheng, D.Silvester, G.Wang, G.Kalyuzhny,
A.Douglas, R.Murry,J.Phys.Chem ,2006,110,4637.）。その結果、蛍光性ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子溶液にＢＰＡ集積金微粒子を添加することによりＢＰＡ集積金微粒子が蛍光性分子インプリント微粒子に吸着し、蛍光性分子インプリント微粒子の蛍光が消光することを見出した。これにより、分子インプリント微粒子と標的分子またはその誘導体の単分子層を有する分子集積体とを用いる検出系において、高価な測定機器を使用しないでも、光エネルギーの放出と吸収を利用することで標的分子の検出が可能であることが示された（後段の実施例３参照）。

以下、本発明に係る試料中の標的分子検出方法ついて詳細に説明する。

〔標的分子の検出方法〕
本発明に係る試料中の標的分子検出方法（以下「本発明に係る検出方法」と記す）は、試料中の標的分子を検出する方法であって、（Ａ）分子インプリント法により構築された標的分子認識部位を有し、動的光散乱法により測定される平均粒子径が１μｍ未満の分子インプリント微粒子と、（Ｂ）標的分子またはその誘導体の単分子層を有し、当該単分子層に前記分子インプリント微粒子が結合可能な分子集積体との相互作用を検出するものである。

本発明に係る検出方法に用いられる分子インプリント微粒子は、分子インプリント法により構築された標的分子認識部位を有し、動的光散乱法により測定される平均粒子径が１μｍ未満であればよい。したがって、その素材は、分子インプリント法を適用して標的分子認識部位が構築でき、かつ、動的光散乱法により測定される平均粒子径が１μｍ未満の微粒子を形成し得るものであればよく、具体的には、例えば、有機ポリマー、無機ポリマー、金属酸化物などが挙げられる。なお、「分子インプリント法」は、認識対象である分子（標的分子）を鋳型として、その標的分子に選択性のある結合部位（標的分子認識部位）を人工的に材料中に構築する方法を意味する。

有機ポリマーを素材としたものは、標的分子あるいはその誘導体や類似化合物を鋳型分子としてラジカル重合反応時に共存させることにより得ることができる。無機ポリマーを素材にしたものは、標的分子あるいはその誘導体や類似化合物を鋳型分子としてゾル-ゲル反応時に共存させることにより得ることができる。（Lee, S.W.,
Ichinose, I., Kunitake, T., Enantioselective binding of amino acid
derivatives onto imprinted TiO2 ultrathin films. Chem. Lett. 2002, 678-679.）金属酸化物を素材としたものは、標的分子あるいはその誘導体や類似化合物を鋳型分子として、金属酸化物膜の製膜法の１種である液相析出法を用いることで得ることができる（Feng, L., Liu, Y., Hu, J., Langmuir 2004, 20, 1786.）。これらの方法は、重合反応時に鋳型分子に対して相補的に相互作用する分子認識部位を、ポリマー合成と同時に構築する方法である。より詳細には、まず、標的分子あるいはその誘導体や類似化合物と結合可能な官能基および重合可能な官能基を併せ持つ機能性モノマーを標的分子と結合させて、標的分子／機能性モノマー複合体を形成させる。なお、この複合体を形成するための結合は、切断可能であれば共有結合でも非共有結合でもかまわない。次に、この標的分子／機能性モノマー複合体に架橋剤および重合開始剤を加え、重合反応を行なう。これにより鋳型分子の形状ならびに相互作用点の配置を記憶した有機高分子が得られる。最後に、得られた高分子より鋳型分子を切断除去することにより、鋳型分子と基質特異的に相互作用する分子認識部位を有する高分子（分子インプリントポリマー）が得られる。なお、分子インプリントポリマーの合成方法については、例えば、参考文献「Komiyama, M., Takeuchi, T., Mukawa, T., Asanuma, H. "Molecular
Imprinting", WILEY-VCH, Weinheim, 2002.」の記載を参照すればよい。

分子インプリント微粒子を得る方法としては、機械的に粉砕して微粒子を得る方法と、核を成長させて微粒子を得る方法の２つに大別される。機械的に粉砕する場合、ハンマー式粉砕機、衝撃式粉砕機、ロール式粉砕機、ジェット気流式粉砕機などの公知の粉砕機が使用できる。得られた粉砕物（微粒子）は、必要により篩別して粒度調製することができる。

分子インプリントポリマーの微粒子を得る方法としては、例えば、沈殿重合法、分散重合法、乳化重合法、シード乳化重合法などを挙げることができる（参考文献：蒲池幹治、遠藤剛監修者、『ラジカル重合ハンドブック』（1999）エヌティーエス、G. Schmid Ed. Nanoparticles,
Wiley-VCH (2004)を参照）。本発明者は、ポリスチレン粒子をシード（種）とするシード乳化重合法により、ＢＰＡ認識分子インプリントポリマー微粒子を合成している（後段の実施例１参照）。

本発明に係る検出方法に用いられる分子インプリント微粒子は、動的光散乱法により測定される平均粒子径が１μｍ未満である。ここで、「動的光散乱法」とは、粒子が分散している溶液にレーザー光を当て、その散乱光変化を測定したときに検出される粒子のブラウン運動に依存した散乱光度の揺らぎに基づいて、粒子の大きさ（粒子径）を導き出す方法である。動的光散乱法に基づく粒子径測定装置は各社から市販されており（大塚電子、シスメックス、ベックマン・コールターなど）、本発明に係る検出方法に用いられる分子インプリント微粒子の平均粒子径測定に好適に用いることができる。

平均粒子径が１μｍ未満であれば、分子インプリント微粒子は、溶媒（液体の分散媒）中で均一に分散することができる。平均粒子径の下限は特に限定されず、凝集が生じない限りにおいて小さいほうが好ましい。分散性と取り扱いの容易さの観点から、分子インプリント微粒子の平均粒子径は１００ｎｍ〜５００ｎｍが好ましい。

本発明に係る検出方法の検出対象である標的分子は特に限定されず、薬剤等の低分子化合物からタンパク質などの高分子化合物まで広範囲の分子を標的分子とすることができる。好ましい標的分子としては、生体分子が挙げられる。生体分子は生物中に存在する分子であればよい。生体分子を標的とすることにより、病気の診断、臨床検査、生物学の基礎研究などに利用可能な標的分子の検出方法を提供することができる。

本発明に係る検出方法を適用する試料は、標的分子を含み得るものであればよい。試料の形態は特に限定されず、液体、個体、粒状体、粉状体、流動体、組織切片などの形態を挙げることができる。生体分子を標的とする場合は、動物および植物の生体構成成分を好適に用いることができる。ヒトを含む動物由来の試料としては、例えば血液、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、喀痰、尿、糞便、腹水等の体液類、皮膚、肺、腎、粘膜、各種臓器、骨等の組織、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨等を洗浄した後の洗浄液、透析排液などを挙げることができる。

本発明に係る検出方法に用いられる分子集積体は、標的分子またはその誘導体の単分子層を有し、当該単分子層に（Ａ）の分子インプリント微粒子が結合可能であるものであればよい。標的分子またはその誘導体の単分子層は、基板の表面、または溶媒に分散可能な微粒子の表面に形成されていることが好ましい。基板および溶媒に分散可能な微粒子については後述する。この単分子層は分子集積体の表面の全部に形成されていてもよく、表面の一部に形成されていてもよい。なお、「標的分子またはその誘導体の単分子層」とは、標的分子またはその誘導体が基板表面や微粒子表面に自己組織化膜やラングミュアーブロジェット膜のように単分子の層を作って固定化されていることを意味する。

本発明に係る検出方法において、上述の分子インプリント微粒子と標的分子またはその誘導体の単分子層を有する分子集積体（以下「分子集積体」と記す）との相互作用とは、分子インプリント微粒子が有する標的分子認識部位が分子集積体表面の標的分子またはその誘導体を特異的に認識し、分子インプリント微粒子と分子集積体とが物理的化学的に相互作用可能なほど近接する状態になることを意味する。

(1) 表面に標的分子またはその誘導体の単分子層が形成された基板を用いる方法（第１実施形態）
本発明に係る検出方法の一実施形態において、分子集積体は表面に標的分子またはその誘導体の単分子層が形成された基板（以下「分子集積基板」と記す）であることが好ましい。基板は、その表面に標的分子またはその誘導体の単分子層が形成できるものであればよい。好適な基板としては、例えば、金属基板、ガラス基板、シリコン基板、光導波路基板などが挙げられる。また、分子インプリント微粒子と基板表面の標的分子またはその誘導体との相互作用の検出に用いる検出手段に応じて、適宜基板の材質を選択することが好ましい。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法に適用する場合はＳＰＲ用の金基板を用いることが好ましく、局在プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）法に適用する場合は光導波路基板を用いることが好ましく、水晶振動子センサーに適用する場合は水晶振動子をセンシングチップとすることが好ましく、電気化学的方法による検出に適用する場合は電極となる金属基板（例えば、金基板）を用いることが好ましい。また、発光や発色による検出に適用する場合はガラスや石英基板、光ファイバー、光導波路基板を用いることが好ましい。

基板表面に標的分子の単分子層を形成させる方法としては、例えば本発明者は、金−チオール結合を利用して、チオール基を導入したＢＰＡの自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：Ｓｅｌｆ−ＡｓｓｅｍｂｌｅｄＭｏｎｏｌａｙｅｒ）を形成させることにより、ＢＰＡインプリント微粒子が結合可能なＢＰＡ誘導体の分子集積基板を作製している（後段の実施例２参照）。

図１は、分子インプリント微粒子が分子集積基板に吸着している状態を示す模式図である。図１に示したように、本実施形態では、分子集積基板表面の標的分子またはその誘導体と分子インプリント微粒子とが接触すると、分子インプリント微粒子が有する標的分子認識部位が標的分子またはその誘導体を特異的に認識し、両者の相互作用により分子インプリント微粒子が分子集積基板に吸着する。この相互作用を検出することにより、試料中の標的分子を検出することができる。分子インプリント微粒子と分子集積基板表面の標的分子またはその誘導体との相互作用の検出手段には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法、局在プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）法、水晶振動子センサー、電気化学的方法、発光法、発色法、光導波路分光法などの公知の方法を好適に適用することができる。なお、いずれの手段を用いる場合も、通常とは逆に、標的分子を捕捉するための標的分子認識部位を有する分子インプリント微粒子を固定化せずに、バッチ式検出系の場合は試料溶液に分散させ、フロー式検出系の場合はキャリア溶液に混合して流すこととし、表面に標的分子またはその誘導体が単分子層を形成して集積している基板を用いることになる。この点が、本発明に係る検出方法の特徴であり、分子インプリント微粒子との相互作用が非常に小さい低分子の標的分子をも検出することが可能となる。

試料中の標的分子を検出する際には、分子インプリント微粒子と分子集積基板との２者を接触させたときの相互作用の強さと、標的分子を含み得る試料と分子インプリント微粒子と分子集積基板との３者を接触させたときの相互作用の強さとを比較する。つまり、３者を接触させたときに試料中に標的分子が存在すれば、この試料中の標的分子が、基板表面に集積された標的分子またはその誘導体と競合して分子インプリント微粒子の標的分子認識部位に吸着する。その結果、２者を接触させたときと比較して、分子インプリント微粒子と分子集積基板との相互作用が小さくなるので、試料中に標的分子が存在していることがわかる。この際、検量線を作成することにより、試料中の標的分子を定量することが可能となる。

試料と分子インプリント微粒子と分子集積基板との３者を接触させる場合、分子インプリント微粒子と分子集積基板と接触させる前に、分子インプリント微粒子を試料と接触させてもよく、分子インプリント微粒子を分子集積基板と接触させた後に、分子インプリント微粒子を試料と接触させてもよく、３者を同時に接触させてもよい。検出対象の標的分子や用いる検出手段等に応じて最適な順序を選択することが好ましい。

(2) 表面に標的分子またはその誘導体の単分子層が形成された微粒子を用いる方法（第２実施形態）
本発明に係る検出方法の他の実施形態において、分子集積体は表面に標的分子またはその誘導体の単分子層が形成され、溶媒に分散可能な微粒子（以下「分子集積微粒子」と記す）であることが好ましい。溶媒に分散可能とは、溶媒（液体の分散媒）中において均一な分散状態が維持され、凝集や沈殿が生じない状態を意味する。したがって、微粒子を構成する物質、標的分子、使用する溶媒などの条件により好適な微粒子の大きさが選択される。通常、平均粒子径は数十ｎｍ〜数百ｎｍの範囲で選択される。

微粒子はその表面に標的分子またはその誘導体の単分子層が形成できるものであればよい。好適な微粒子としては、有機ポリマー微粒子（ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチルなど）、無機ポリマー微粒子（シリカ、アルミナなど）、金属微粒子（金、銀、白金、チタンなど）が挙げられる。

表面に標的分子またはその誘導体の単分子層が形成された微粒子は、有機ポリマー微粒子や無機ポリマー微粒子の場合は、標的分子またはその誘導体が化学結合可能な官能基をあらかじめ導入することでポリマー表層に標的分子またはその誘導体を結合することにより取得することができる。金属微粒子の場合は、標的分子またはその誘導体にチオール基を導入して、金属微粒子表面上に自己組織化膜を形成させることで取得することができる。本発明者は、塩化金酸溶液とチオール基を導入したＢＰＡから、表面にＢＰＡの単分子層が形成された金微粒子を合成している（後段の実施例３参照）。

本実施形態において、分子集積微粒子は光エネルギーを吸収または放出することが好ましい。「光エネルギーを吸収する」とは、分子が光エネルギーを吸収して基底状態から励起状態になることを意味し、「光エネルギーを放出する」とは、分子が励起状態から基底状態へ戻る際にエネルギーを光として放出することを意味する。

光エネルギーを放出する分子インプリント微粒子を用いる場合、分子インプリント微粒子が発する光エネルギーを吸収する分子集積微粒子を用いることで、分子インプリント微粒子と分子集積微粒子が相互作用した際に起こる消光現象を利用するセンシングが可能となる。また、光エネルギーを放出する分子インプリント微粒子を用いる場合、分子インプリント微粒子が発する光エネルギーを吸収することが可能で、かつその吸収した光エネルギーで励起状態になり、基底状態に戻る際に分子インプリント微粒子が発する光の波長とは異なる長波長側の新たな光を発する光の共鳴エネルギー移動が生じる分子集積微粒子を用いることで、分子インプリント微粒子と分子集積微粒子が相互作用した際に起こる光の共鳴エネルギー移動現象を利用するセンシングが可能となる。

また、上記とは逆に、光エネルギーを放出する分子集積微粒子と分子集積微粒子が発する光エネルギーを吸収する分子インプリント微粒子とを用いた場合も同様のセンシングが可能となり、光エネルギーを放出する分子集積微粒子と分子集積微粒子が発する光エネルギーを吸収することが可能で、かつその吸収した光エネルギーで励起状態になり、基底状態に戻る際に分子集積微粒子が発する光の波長とは異なる長波長側の新たな光を発する光の共鳴エネルギー移動が生じる分子インプリント微粒子とを用いた場合も、同様のセンシングが可能となる。

光エネルギーを吸収する物質としては、特定の化合物の指定はなく、用いる発光物質の発光波長付近に吸収極大のある化合物であればよい。光の共鳴エネルギー移動現象を利用する場合は、用いる発光物質の発光波長付近に吸収極大のある化合物で、その吸収した光エネルギーを用いて新たな発光現象を生じる化合物であればよい。光エネルギーを放出する物質としては、ピレン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、ダンシル、Ｃｙ３，Ｃｙ５などの蛍光物質やＣｄＳｅ微粒子など量子ドットと呼ばれる無機発光物質を挙げることができる。

したがって、光エネルギーを吸収する分子集積微粒子は、用いる発光物質の発光波長付近に吸収極大のある化合物を微粒子合成の際に混入させてドープさせたり、微粒子表面に官能基を導入し共有結合や非共有結合で化学的に結合させれば取得することができる。光エネルギーを放出する分子集積微粒子も同様に、上記例示した物質から適宜選択した物質を微粒子合成の際に混入させてドープさせたり、微粒子表面に官能基を導入し共有結合や非共有結合で化学的に結合させれば取得することができる。

また、光エネルギーを吸収する分子インプリント微粒子は、用いる発光物質の発光波長付近に吸収極大のある化合物を分子インプリント微粒子合成の際に混入させてドープさせたり、共重合させたり、微粒子表面に官能基を導入し共有結合や非共有結合で化学的に結合させれば取得することができる。光エネルギーを放出する分子インプリント微粒も同様に、上記例示した物質から適宜選択した物質を分子インプリント微粒子合成の際に混入させてドープさせたり、共重合させたり、微粒子表面に官能基を導入し共有結合や非共有結合で化学的に結合させれば取得することができる。

本実施形態において、蛍光を発光する分子インプリント微粒子と、当該分子インプリント微粒子が発する蛍光エネルギーを吸収して分子インプリント微粒子の蛍光を消光させる分子集積微粒子を用いることが好ましい。これにより、分子インプリント微粒子と分子集積微粒子との相互作用を、蛍光強度を指標に検出することが可能となる。

また、蛍光を発光する分子インプリント微粒子と、当該分子インプリント微粒子が発する蛍光エネルギーを吸収して自身がさらに蛍光を発光する蛍光共鳴エネルギー移動現象を生じる分子集積微粒子を用いてもよい。同様に、分子インプリント微粒子と分子集積微粒子との相互作用を、蛍光共鳴エネルギー移動現象に基づく蛍光強度を指標に検出することが可能となる。

蛍光を発光する分子インプリント微粒子は、有機ポリマー素材の分子インプリント微粒子を合成する際に、蛍光性モノマーを添加することにより取得することができる。蛍光性モノマーとしては、例えばピレン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、ダンシル、Ｃｙ３，Ｃｙ５などを用いることができる。

蛍光エネルギーを吸収して消光させる分子集積微粒子は、金属（金、銀、白金、チタンなど）や有機化合物（蛍光物質の蛍光波長のところに吸収波長を持つ有機化合物）などを
用いて上記と同様の方法で取得することができる。また、蛍光エネルギーを吸収して自身がさらに蛍光を発光する分子集積微粒子は、はじめに発光する蛍光物質の発光波長付近の波長で励起できる蛍光物質を用いて上記と同様の方法で取得することができる。

逆に、蛍光を発光する分子集積微粒子と、当該分子集積体が発する蛍光エネルギーを吸収して分子集積微粒子の蛍光を消光させる分子インプリント微粒子を用いることも可能である。同様に、蛍光を発光する分子集積微粒子と、当該分子集積体が発する蛍光エネルギーを吸収して自身がさらに蛍光を発光する分子インプリント微粒子を用いることも可能である。これらの分子集積微粒子、分子インプリント微粒子も上記と同様の方法で取得することができる。

分子インプリント微粒子と分子集積微粒子との相互作用を、蛍光強度を指標に検出する場合、蛍光性分子インプリント微粒子および分子集積微粒子の粒子径はいずれも蛍光の励起波長以下であることが好ましい。励起光を照射しても分散液中の微粒子が見えないからである。

以下、蛍光を発光する分子インプリント微粒子と当該分子インプリント微粒子が発する蛍光エネルギーを吸収して分子インプリント微粒子の蛍光を消光させる分子集積微粒子との相互作用により、蛍光強度を指標として標的分子を検出する方法について説明する。

図２は、蛍光を発光する分子インプリント微粒子（蛍光性分子インプリント微粒子）と分子集積金微粒子との相互作用を示す模式図である。図２に示したように、蛍光性分子インプリント微粒子のみが系内に存在している場合は、励起により強い蛍光発光が観測される。そこに蛍光エネルギーを吸収する金微粒子の表面に標的分子誘導体の単分子層を形成させた分子集積金微粒子を添加すると、蛍光性分子インプリント微粒子表面の標的分子認識部位に分子集積金微粒子が吸着し、これが消光剤として作用するため消光反応が進行する。さらに、標的分子、標的化合物誘導体、もしくは粒子間相互作用を阻害する化合物を添加すると蛍光が回復すると考えられる。

試料中の標的分子を検出する際には、蛍光性分子インプリント微粒子と消光剤として作用する分子集積微粒子との２者を接触させたときの蛍光強度と、標的分子を含み得る試料と蛍光性分子インプリント微粒子と分子集積微粒子（消光剤）との３者を接触させたときの蛍光強度とを比較する。つまり、３者を接触させたときに試料中に標的分子が存在すれば、この試料中の標的分子が、分子集積微粒子表面の標的分子またはその誘導体と競合して蛍光性分子インプリント微粒子の標的分子認識部位に吸着する。その結果、２者を接触させたときと比較して、蛍光性分子インプリント微粒子と分子集積微粒子との相互作用が小さくなるので消光の程度も小さくなる。つまり、蛍光強度が大きくなり、試料中に標的分子が存在していることがわかる。この際、検量線を作成することにより、試料中の標的分子を定量することが可能となる。

試料と分子インプリント微粒子と分子集積微粒子との３者を接触させる場合、分子インプリント微粒子と分子集積微粒子と接触させる前に、分子インプリント微粒子を試料と接触させてもよく、分子インプリント微粒子を分子集積微粒子と接触させた後に、分子インプリント微粒子を試料と接触させてもよく、３者を同時に接触させてもよい。検出対象の標的分子等に応じて最適な順序を選択することが好ましい。

なお、本実施形態では蛍光を発光する分子インプリント微粒子と消光剤として作用する分子集積微粒子とを用いる液相の検出系について説明したが、蛍光を発光する分子インプリント微粒子を基板上に固定化して基板上の蛍光強度を指標とする検出系とすることもできる。

また、分子集積微粒子に代えて分子集積基板を用いても実施することができる。具体的には、例えば、分子集積基板に分子インプリント微粒子のみを滴下したときの基板上の蛍光強度と、分子集積基板に標的分子を含み得る試料および分子インプリント微粒子を滴下したときの基板上の蛍光強度とを比較することにより、試料中の標的分子を検出することが可能である。

〔標的分子の検出キット〕
本名発明に係る試料中の標的分子検出キットは、以下の（Ａ）および（Ｂ）を備えるものであればよい。
（Ａ）分子インプリント法により構築された標的分子認識部位を有し、動的光散乱法により測定される平均粒子径が１μｍ未満の分子インプリント微粒子
（Ｂ）標的分子またはその誘導体の単分子層を有し、当該単分子層に前記分子インプリント微粒子が結合可能な分子集積体
これ以外の具体的なキットの構成については特に限定されるものではなく、必要な試薬や器具等を適宜選択してキットの構成とすればよい。本発明に係るキットを用いることにより、本発明に係る検出方法を簡便かつ迅速に実施することができる。

（Ｂ）は表面に標的分子もしくはその誘導体の単分子層が形成された基板（分子集積基板）、または、表面に標的分子もしくはその誘導体の単分子層が形成され、溶媒に分散可能な微粒子（分子集積微粒子）であることが好ましく、表面に標的分子もしくはその誘導体の単分子層が形成され、溶媒に分散可能な微粒子（分子集積微粒子）がより好ましい。

（Ａ）と（Ｂ）の好適な組み合せとしては、上述の第２実施形態で説明したように、（Ａ）光エネルギーを吸収する分子集積微粒子と（Ｂ）光エネルギーを放出する分子インプリント微粒子の組み合せ、または、（Ａ）光エネルギーを放出する分子集積微粒子と（Ｂ）光エネルギーを吸収する分子インプリント微粒子の組み合せが挙げられる。

より具体的には、（１）蛍光を発光する分子インプリント微粒子と当該分子インプリント微粒子が発する蛍光エネルギーを吸収して分子インプリント微粒子の蛍光を消光させる分子集積微粒子との組み合せ、（２）蛍光を発光する分子インプリント微粒子と当該分子インプリント微粒子が発する蛍光エネルギーを吸収して自身がさらに蛍光を発光する分子集積微粒子との組み合せ、（３）蛍光を発光する分子集積微粒子と当該分子集積体が発する蛍光エネルギーを吸収して分子集積微粒子の蛍光を消光させる分子インプリント微粒子との組み合せ、（４）蛍光を発光する分子集積微粒子と当該分子集積体が発する蛍光エネルギーを吸収して自身がさらに蛍光を発光する分子インプリント微粒子との組み合せ、が挙げられる。これらの詳細については、上述の第２実施形態で説明したので、ここでは説明を省略する。

また、本キットは、上述の本発明に係る検出方法の実施手順に準じて使用することができる。

本明細書において「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは当該材料を使用するための使用説明書を備える。使用説明書は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。

〔実施例１：ビスフェノールＡ認識分子インプリント微粒子の合成と評価〕
ビスフェノールＡ（ＢＰＡ）認識分子インプリント微粒子を合成し、その評価を行った。本実施例に使用した試薬は、いずれも市販品を購入した。また、分析機器としては、以下のものを使用した。すなわち、合成した分子インプリント微粒子の評価には高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた。ＨＰＬＣはオートサンプルインジェクター（ＡＵＴＯＩＮＪＥＣＴＯＲ２３４）、ポンプ（３２２ｐｕｍｐ）、ＵＶ検出器（ＵＶ／ＶＩＳ−１５２）からなる計器（ＧＩＬＳＯＮ）にパソコンをつなぎ、計測プログラムにはＵｎｉｐｏｉｎｔＶ．３．００を使用した。ポリマーの洗浄にはトミー精工株式会社の遠心分離器ＳＲＸ−２０１を使用した。粒子径分布と平均粒子径の測定には大塚電子株式会社のダイナミック光散乱光度計（ＤＬ−６５００）を使用した。遠心エバポレータは東京理科器械株式会社のＣＶＥ−２０００型を用いた。インキュベーションにはエッペンドルフ社製サーモミキサーコンフォートを使用した。走査型分析電子顕微鏡（ＳＥＭ）は日本電子株式会社（ＪＥＯＬ）のＪＳＭ−５６１０ＬＶＳを使用した。

（１−１）ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子の合成
シード（種粒子）として用いるためのスチレン粒子の合成を行った。スチレンモノマーはインヒビターリムーバーにより重合禁止剤を除去したものを使用した。５００ｍｌセパラブルフラスコに表１のレシピに従ってモノマーと蒸留水を仕込み、攪拌しながら窒素雰囲気下で重合温度８０℃まで加温した。開始剤Ｖ−５０を５ｍｌ蒸留水に溶解させ、その水溶液を加温後のセパラブルフラスコに加えた。窒素雰囲気下、８０℃でメカニカルスターラーを用いて１５０ｒｐｍで１２時間攪拌重合を行った。重合終了後、遠心分離洗浄を３回行い未反応のモノマー、開始剤を除去し、エマルション固形分濃度を０．７４％に調整した。重合率は１００％で、ダイナミック光散乱光度計（ＤＬＳ）による平均粒子径は３８１ｎｍであった。

上記で得られたシードを用いてＢＰＡ認識分子インプリント微粒子の合成を行った。５０ｍｌバイアル瓶にポリスチレンシード溶液（０．９９７ｗｔ％）３０ｇをはかりとり、表２のレシピに従って所定量のモノマーを添加し、室温で６時間攪拌して膨潤させた。モノマー相の消失を確認した後、窒素雰囲気下で重合温度８０℃まで加温し、開始剤Ｖ―５０を５ｍｌ蒸留水に溶解させた水溶液を加温後のバイアル瓶に加えた。窒素雰囲気下、８０℃、スターラー２００ｒｐｍで１２時間攪拌重合を行った。重合終了後、遠心分離洗浄を３回行い未反応のモノマー、開始剤を除去した。重合率は８８．５％で、ＤＬＳによる平均粒子径は４３８．５ｎｍであった。ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子（表２中「ＩＮＰ」）と同様の条件でＢＰＡジメタクリレートモノマーを用いずにブランク微粒子（表２中「ＢＮＰ」）も合成した。

ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子からＢＰＡを除去するため、加水分解反応を行った。１００ｍｌナスフラスコに、得られた分子インプリント微粒子固形分濃度０．７ｗｔ％を８０ｍｌ加え、水酸化ナトリウムを添加し１Ｍに調整した。それを還流下、２４時間攪拌し加水分解を行った。２４時間後攪拌を止め、室温まで冷ました後、遠心分離により上澄みを除去した。そこへＨＣｌ水溶液（１Ｍ）を加え、１０分間超音波照射し、遠心分離により溶媒を除去した。酸による洗浄を３回繰り返した後、最後に蒸留水で２回洗浄し、エマルションとして保管した。

（１−２）ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子の評価
得られたポリマー（ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子）の分子認識能の評価としてＨＰＬＣによる再結合実験を行った。合成したＢＰＡ認識分子インプリント微粒子を５ｍｇずつ１．５ｍｌバイアル瓶にはかりとり、そこへ標的分子であるＢＰＡを含む４種類（ＢＰＡ、ビスフェノールＢ（ＢＰＢ）、１−ナフトール、１７β−エストラジオール（図３参照））のサンプル溶液（各３本１．１ｍＭ乾燥トルエン溶液）を１．５ｍｌずつ加えサーモミキサーで２５℃、２４時間インキュベーションを行った。その後シリンジフィルター（０．２μｍ）で溶液をろ過し、ろ液１ｍｌをマイクロピペットで採取した。そこへ内部標準試料（ビス（４−ヒドロキシフェニル）メタン６．２８ｍＭトルエン溶液）を１００μｌ加えた後、遠心エバポレータで溶媒を留去した。留去後、アセトニトリルに再溶解させその濃度をＨＰＬＣを用いて定量し、ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子への結合量を算出した（ＨＰＬＣ測定条件；溶離液：ＭｅＣＮ／Ｈ_２Ｏ＝４／６、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、注入量：１０μｌ、検出波長：２７８ｎｍ、カラム：ＳＵＰＥＬＣＯＬＣ−８−ＤＢ）。

（１−３）結果
図４に、合成したＢＰＡ認識分子インプリント微粒子のＳＥＭ画像を示した。図４から、比較的単分散な粒子径４５０ｎｍ程度の粒子が形成されていることが確認できた。

図５に、合成したＢＰＡ認識分子インプリント微粒子への各サンプルの吸着量を算出した結果を示した。図５から明らかなように、標的分子であるＢＰＡの吸着量は、ポリマー１ｇあたり１３．８μｍｏｌであり、１−ナフトール（１．４２μｍｏｌ／ｇポリマー)、１７β−エストラジオール（１．０３μｍｏｌ／ｇポリマー）と比較して吸着量が多かった。１−ナフトールは構造、官能基ともにＢＰＡとの差異が多いが、１７β−エストラジオールについては同じジオール化合物でありながら、吸着が抑えられた。また、ほぼ同じ構造を有するＢＰＢの吸着量は１１．０μｍｏｌ／ｇポリマーであり、標的分子であるＢＰＡと同程度の吸着性が見られた。この結果から、ＢＰＡとほぼ同じ構造であるＢＰＢを識別することは困難なものの、今回合成した分子インプリント微粒子には、ＢＰＡ特異的な認識部位が構築されていることが示された。

〔実施例２：ＢＰＡ−ＳＡＭ基板とＢＰＡ認識分子インプリント微粒子を用いたＳＰＲセンシング〕
ＢＰＡ−ＳＡＭ基板とＢＰＡ認識分子インプリント微粒子を用いて、ＳＰＲセンシングを試みた。本実施例に使用した試薬は、いずれも市販品を購入した。また、分析機器としては、以下のものを使用した。すなわち、誘導体合成に使用したシリカゲルクロマトグラフィーは和光純薬工業のシリカゲル（ＷａｋｏｇｅｌＣ−３００ＨＧ）を用いた。ＮＭＲスペクトルは日本電子(株)製ＮＭＲ測定装置（ＪＮＭ−ＬＡ３００）を用いて測定した。質量分析にはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（株）製ＥＳＩ−ＭＳ（ＡＰＩ２０００）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ−２０００［ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇｖｏｌｔａｇｅ２０ｋＶ］）を用いた。ＩＲスペクトル測定にはＤＩＧＩＬＡＢＥＸＣＵＬＩＢＵＲＳＥＲＩＥＳＦＴ３０００を使用した。分子インプリント微粒子の評価には、システムインスツルメンツ株式会社製のプラズモン光導波路分光装置（Ｓ−ＳＰＲ６０００）を使用した。走査型分析電子顕微鏡（ＳＥＭ）は日本電子株式会社（ＪＥＯＬ）のＪＳＭ−５６１０ＬＶＳを使用した。

（２−１）ＢＰＡ−ＳＡＭ基板の作製
ＳＰＲ基板上にＢＰＡを集積させるための手段としてＢＰＡ−ＳＡＭ（Ｓｅｌｆ−ＡｓｓｅｍｂｌｅｄＭｏｎｏｌａｙｅｒ、自己組織化単分子膜）を形成させるため、まずＢＰＡにチオール基の導入を行った。

(i) ４，４−Ｂｉｓ−（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｐｈｅｎｙｌ）−Ｐｅｎｔａｎｏｉｃａｃｉｄ（１１−ｍｅｒｃａｐｔｏ−ｕｎｄｅｃｙｌ)−ａｍｉｄｅの合成（下記反応式（１）参照）
２００ｍＬ二口ナスフラスコにｄｉｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄ（３．４３ｇ）、Ｋ_２ＣＯ_３（４．１５ｇ）、Ａｃ_２Ｏ（４．５１ｍｌ）を入れ、アセトニトリル(１５０ｍｌ)を加え、６０℃で１２時間攪拌した。ＴＬＣにより原料がなくなり２スポットになったことを確認してから反応をとめ、エバポレータで溶媒を留去した。Ｈ_２Ｏ：ＣＨ_２Ｃｌ_２にて抽出を行った後、シリカゲルカラムクロマトグラフィ−（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝２０：１）にて精製し白色の粉末を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで目的物１を確認した（収量３．０５ｇ、収率６８．７％）。

(ii) アルキルチオール誘導体２の合成（下記反応式（２）参照）
１１−ａｍｉｎｏ−１−ｕｎｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅの抽出（ＮａＨＣＯ_３水溶液：ＣＨ_２Ｃｌ_２）をし、脱塩酸処理を行った。１１−ａｍｉｎｏ−１−ｕｎｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ（５３．８ｍｇ）と化合物１（９８ｍｇ)を２０ｍｌＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解させた。そこへ、ＷＳＣ（７５．１ｍｇ）と、ＮＨＳ（４５．７ｍｇ）、ＤＩＥＡ（１３８．４μｌ）を加え室温で２４時間攪拌した。ＴＬＣにより３スポットが確認された。そこで（ＡｃＯＥｔ：４％ＮａＨＣＯ_３水溶液,１０％クエン酸水溶液，飽和食塩水）抽出を行った。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィ−にてＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝１００：１とＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝１００：３で精製を２回行い、３スポットを分離したところ、２番目のスポットの精製物から目的物２の^１Ｈ−ＮＭＲ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳが確認できた（収量２５ｍｇ、収率１７％）。

(iii) ＢＰＡ−チオール誘導体３の合成（下記反応式（３）参照）
ＴＨＦ６ｍｌに化合物２１０ｍｇを溶解させ、ＮａＯＨ水溶液（０．２５Ｍ）を１ｍｌ加え、室温で６時間攪拌した。ＴＬＣにより原料のスポットが消え、極性の高いスポットが現れたことを確認し、反応を止め、中和後、エバポレータにて溶媒を留去した。その後、抽出（ＡｃＯＥｔ：１０％クエン酸水溶液）を行い、^１Ｈ−ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより化合物３を確認した。また桐山ろうとを用いて得られた化合物３を、ＨｘとＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄し回収したものについて、^１Ｈ−ＮＭＲを確認した（収量８ｍｇ、収率９３％）。

(iv) ＢＰＡ−チオール誘導体３を用いたＢＰＡ−ＳＡＭ膜の合成
ＳＰＲ測定基板として用いるため、高屈折ガラス基板上の金薄膜にピランハ溶液（濃硫酸：３０％過酸化水素水＝３：１）を滴下し５分間静置し、その後蒸留水で洗浄した。そこに、上記ＢＰＡ−チオール誘導体３溶液（１ｍＭエタノール溶液）を滴下し、カバーガラスをかぶせ窒素雰囲気一晩静置した。その後、基板をＥｔＯＨで洗浄し乾燥させた。また、ＢＰＡ−ＳＡＭ膜の形成を確認するため、別の金基板に同様の手順でＳＡＭ膜を作成したものを高感度反射赤外分光測定器（ＩＲ−ＲＡＳ）により観察した。

（２−２）ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子の合成
メカニカルスターラーの回転を２００ｒｐｍに変更した以外、実施例１と同様の方法でシードとして用いるためのスチレン粒子の合成を行った。遠心分離洗浄後のエマルション固形分濃度を１．４４％に調整した。重合率は１００％で、ＤＬＳによる平均粒子径は２７０ｎｍ（ｄｗ／ｄｎ＝１．１４）であった。

得られたシードを用いてＢＰＡ認識分子インプリント微粒子の合成を行った。１００ｍｌバイアル瓶にポリスチレンシード粒子溶液（１．４４ｗｔ％）５０ｇをはかりとり、表３のレシピに従って所定量のモノマーを添加し、室温で６時間攪拌して膨潤させた。モノマー相の消失を確認した後、窒素雰囲気下で重合温度８０℃まで加温し、開始剤Ｖ―５０を５ｍｌ蒸留水に溶解させた水溶液を加温後のバイアル瓶に加えた。窒素雰囲気下、８０℃、スターラー２００ｒｐｍで１２時間攪拌重合を行った。重合終了後、遠心分離洗浄を３回行い未反応のモノマー、開始剤を除去した。重合率は９１％で、ＤＬＳによる平均粒子径は２９２．９ｎｍ（ｄｗ／ｄｎ＝１．１１）であった。ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子（表３中「ＩＮＰ」）と同様の条件でＢＰＡジメタクリレートモノマーを用いずにブランク微粒子（表３中「ＢＮＰ」）も合成した。

ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子からＢＰＡを除去するため、実施例１と同じ方法で加水分解を行い、酸による洗浄および蒸留水による洗浄を行った。さらに本実施例では、クロロホルム溶媒を用いてＳＰＲ測定を行うため、メタノールに置換した後クロロホルムによる置換を行った。なお、以後の実験においては、鋳型分子（ＢＰＡ）の切り出し処理を行った分子インプリント微粒子を「ＩＮＰ」、鋳型分子（ＢＰＡ）の切り出し処理を行っていない分子インプリント微粒子を「ＲＮＰ」、鋳型分子（ＢＰＡ）を添加せずに合成した微粒子を「ＢＮＰ」と表記する。

（２−３）ＳＰＲによるＢＰＡ−ＳＡＭ基板とＢＰＡ認識分子インプリント微粒子との相互作用のセンシング
ＢＰＡ−ＳＡＭ基板をステージに設置し、セルと流路を装着し、アナライトとしてＩＮＰ溶液、ＲＮＰ溶液およびＢＮＰ溶液（０〜３ｗｔ％水溶液）を送液し、平衡に達した５分後のＳＰＲスペクトルを測定した。また、微粒子を含まない（０ｗｔ％）時のＳＰＲスペクトルからの長波長側へのシフトの値をΔλ［ｎｍ］とし、各微粒子とＢＰＡ−ＳＡＭ基板との吸着等温線をグラフ化し評価した。

さらに、競合実験としてＩＮＰ溶液中に標的分子であるＢＰＡを添加してＢＰＡを吸着させた後、その溶液を流路に送液しスペクトル変化を測定した。具体的には、ＩＮＰ３ｗｔ％溶液にＢＰＡを所定量添加し５０ｍＭになるように調整した。その溶液を２５℃で１２時間インキュベーションした後送液し、ＳＰＲのスペクトルの経時変化を観察した。比較として、ＢＰＡを添加していないＩＮＰ溶液についても同様に実験を行った。

次に、ＩＮＰのＢＰＡ−ＳＡＭ基板からの解離を目的とし、標的分子であるＢＰＡ、またＢＰＡ類似体である４，４’−ｄｉａｍｉｎｏｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ（ＤＡＤＰＭ、下記式（４）参照）、極性溶媒で水素結合を弱めるメタノールを送液しその変化を観察した。最初に５分間ＩＮＰ溶液（３ｗｔ％クロロホルム溶液）を流しＩＮＰを吸着させ、その経時変化を追った。そこへ溶媒であるクロロホルム（ＣＨＣｌ_３）をさらに５分間送液し、濃度平衡によるＩＮＰの解離の経時変化を追った。そして最後に阻害剤としてＢＰＡ溶液（５０ｍＭ）、またはＤＡＤＰＭ（２５ｍＭ）、またはメタノールをそれぞれ５分間送液しＩＮＰの解離の経時変化を追跡した。メタノールについては、メタノール送液後に溶媒であるクロロホルムに戻して測定を行った。
ＳＰＲ測定条件は以下の通りである。
入射角２８．１°
検出角２８．６°
積算時間１０ｍｓ
加算平均５回
スムージング５点
Ｐ偏光入射
流速２０μｌ／ｍｉｎ

（２−４）結果
(i) ＳＥＭによる分子インプリント微粒子同定
合成した各分子インプリント微粒子のＳＥＭ画像を図６〜図８に示した。図６はＩＮＰのＳＥＭ画像であり、図７はＲＮＰのＳＥＭ画像であり、図８はＢＮＰのＳＥＭ画像である。図６〜図８から明らかなように、得られた各分子インプリント微粒子は、いずれも直径３００ｎｍ程度の粒子径の揃ったポリマー（ＩＮＰ：ｄｗ／ｄｎ＝１．１、ＲＮＰ：ｄｗ／ｄｎ＝１．１１）であることが確認された。このことから、それぞれの表面積は同程度であると仮定でき、ＳＰＲスペクトルの変化は結合挙動を反映するとものと考えられる。

(ii)ＩＲによるＢＰＡ−ＳＡＭ基板の同定
図９にＢＰＡ−ＳＡＭ基板のＩＲ−ＲＡＳスペクトルを示した。図９より、以下の通り基板上にＢＰＡ−ＳＡＭ膜が形成されていることが確認された。
３５００〜３７００ｃｍ^−１：フェノールＯＨ一置換アミドＮ−Ｈ伸縮振動
１６００ｃｍ^−１付近：芳香族Ｃ＝ＣおよびＣ−Ｈ伸縮振動
１７００ｃｍ^−１付近：一置換アミドＣ＝Ｏ伸縮振動
１２００〜１３５０ｃｍ^−１：Ｃ１０の長鎖アルキルのひねりおよび横揺れ振動

(iii) ＢＰＡ−ＳＡＭ基板とＢＰＡ認識分子インプリント微粒子を用いたＳＰＲ測定
図１０に、３種類の微粒子（ＩＮＰ、ＲＮＰ、ＢＮＰ）の各濃度における波長のシフト値（Δλｎｍ）をプロットした吸着等温線を示した。図１０から明らかなように、いずれの微粒子を送液した場合でも、濃度の上昇とともにＳＰＲスペクトルの長波長側へのシフトが観察されたが、３種類の微粒子のなかで、ＩＮＰのシフト値が最も大きいことが確認された。この結果から、ＢＰＡ−ＳＡＭ基板と各微粒子との相互作用(吸着)の差をＳＰＲスペクトルの波長シフト量によってセンシングすることが可能であることが示された。

(iv) ＢＰＡ存在下での競合実験
競合実験としてＩＮＰ溶液中に標的分子であるＢＰＡを添加してＩＮＰにＢＰＡを吸着させた後、その溶液を流路に送液し、０分〜５分まで経時的にスペクトル変化を測定した。対照として、ＢＰＡを添加していないＩＮＰ溶液を流路に送液し、同様にスペクトル変化を測定した。

図１１に、送液開始からの各時間における波長のシフト値（Δλｎｍ）をプロットした吸着等温線を示した。図１１から明らかなように、ＢＰＡを添加した場合と添加しない場合のいずれも１分後に平衡に達している挙動は同様であるものの、その変化量は圧倒的にＢＰＡを添加した場合の方が小さかった。この結果は、ＢＰＡとＩＮＰを共存させインキュベーションすることにより、ＩＮＰ表面のＢＰＡ認識部位にＢＰＡが予め吸着するため、ＩＮＰとＢＰＡ−ＳＡＭ基板間の相互作用が阻害されることを示すものであると考えられた。したがって、ＢＰＡの競合によりＩＮＰとＢＰＡ−ＳＡＭ基板間の相互作用（吸着）に変化が生じ、この変化を検出することにより、サンプル中のＢＰＡを検出可能であることが示された。

(v) ＩＮＰのＢＰＡ−ＳＡＭ基板からの解離
図１２に、ＢＰＡ−ＳＡＭ基板にＩＮＰ溶液を送液後、溶媒（クロロホルム）を送液し、最後にＢＰＡを送液したときのＳＰＲスペクトルの変化を示した。図１２に示したように、まず、ＩＮＰ溶液を５分間送液するとＩＮＰがＢＰＡ−ＳＡＭ基板に吸着し、ＳＰＲスペクトルが大きく長波長側にシフトした。次に、溶媒であるクロロホルムを送液するとその濃度平衡が崩れ、基板上に弱く結合していたＩＮＰが若干解離するため、ＳＰＲスペクトルは短波長側にシフトした。しかし、それでは完全にＩＮＰを解離することはできないので、さらに標的分子であるＢＰＡを用いて解離を試みたところ、ＢＰＡ飽和濃度５０ｍＭの溶液を送液してもＳＰＲスペクトルの変化が見られなかった。

図１３は、ＢＰＡ−ＳＡＭ基板にＩＮＰ溶液を送液後、溶媒（クロロホルム）を送液し、最後にＤＡＤＰＭを送液したときのＳＰＲスペクトルの変化を示した。ＤＡＤＰＭは、上記式（４）に示したように、ＩＮＰ表面のＢＰＡ認識部位に存在するカルボン酸残基と強く水素結合を形成すると考えられるアミノ基を有し、かつＢＰＡ類似骨格を持つ化合物である。図１３に示したように、ＤＡＤＰＭ溶液を送液すると、ＳＰＲスペクトルはクロロホルム送液時よりさらに短波長側にシフトし、ＩＮＰのさらなる解離が観測された。

図１４は、ＢＰＡ−ＳＡＭ基板にＩＮＰ溶液を送液後、溶媒（クロロホルム）を送液し、最後にメタノールを送液したときのＳＰＲスペクトルの変化を示した。図１４に示したように、極性溶媒であるメタノールを送液すると、長波長シフトの値（Δλ［ｎｍ］）がほぼ「０」となり、ＩＮＰがＢＰＡ−ＳＡＭ基板からほぼ完全に解離されたことが示された。

以上のように、アミンおよび極性溶媒によってＩＮＰのＢＰＡ−ＳＡＭ基板への吸着を解離できたことから、ＩＮＰとＳＡＭ基板間の相互作用は水素結合ベースの特異的な結合であることが示唆された。

〔実施例３：ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子を用いた蛍光消光センシング〕
上述のように、金微粒子は蛍光消光剤として、蛍光色素近傍に存在したとき消光反応を示すことが知られている。そこで、標的分子であるＢＰＡを金微粒子表面に集積したＢＰＡ集積金微粒子と、ＢＰＡを標的分子とした蛍光性分子インプリント微粒子（蛍光性ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子）とを用いて、蛍光消光センシングを試みた（図２参照）。

本実施例に使用した試薬は、いずれも市販品を購入した。また、分析機器としては、以下のものを使用した。すなわち、誘導体合成に使用したシリカゲルクロマトグラフィーは和光純薬工業のシリカゲル（ＷａｋｏｇｅｌＣ−３００ＨＧ）を用いた。ＮＭＲスペクトルは日本電子(株)製ＮＭＲ測定装置（ＪＮＭ−ＬＡ３００）を用いて測定した。質量分析にはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（株）製ＥＳＩ−ＭＳ（ＡＰＩ２０００）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ−２０００［ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇｖｏｌｔａｇｅ２０ｋＶ］）を用いた。ポリマーの洗浄にはトミー精工株式会社の遠心分離器ＳＲＸ−２０１を使用した。粒子径分布と平均粒子径の測定には大塚電子株式会社のダイナミック光散乱光度計（ＤＬ−６５００）を使用した。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）は、日立社の透過型電子顕微鏡Ｈ−７５００を使用した。紫外・可視分光光度分析には紫外・可視分光光度計（ＪＡＳＣＯＶ−５６０）を使用し、システム制御およびデータ処理には専用ソフトウェアＳｐｅｃｔｒａＭａｎａｇｅｒ（ＪＡＳＣＯ）を使用、また測定には１ｃｍ角石英セルを用いた。蛍光スペクトル測定にはＨｉｔａｃｈｉＦ−２５００を使用、また測定には１ｃｍ角石英セルを用いた。

（３−１）蛍光性ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子の合成
(i) ピレンモノマーの合成（下記反応式（５）参照）
５０ｍＬナスフラスコに１−ｐｙｒｅｎｅｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ５００ｍｇ（２ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの乾燥ジクロロメタン（ＣＨ_２Ｃｌ_２）に溶かし、窒素雰囲気下でｍｅｔｈａｃｒｙｒｏｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ（３７７ｍｇ、４ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．３６ｍｌ、４ｍｍｏｌ）を加え、還流下で１６時間攪拌した。抽出（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＮａＨＣＯ_３水溶液、ＨＣｌ水溶液、ＮａＣｌ水溶液）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィ−（ＣＨ_２Ｃｌ_２）により精製し、白色の目的物を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで確認した（収量３００ｍｇ、収率５０％）。

(ii) 蛍光性ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子の合成
得られたピレンモノマーおよび実施例２で合成した粒子径２７０ｎｍ（ＤＬＳ測定）のスチレンシードを用いて、蛍光性ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子の合成を行った。２５ｍｌバイアル瓶にポリスチレンシード溶液（１．４ｗｔ％）１０ｇをはかりとり、表４のレシピに従って所定量のモノマーを添加し、室温で６時間攪拌して膨潤させた。ピレン含有分子インプリント微粒子については、モノマーの溶解性のためアセトンを微量添加しピレンモノマーを溶解させた。モノマー層の消失を確認した後、窒素雰囲気下で重合温度８０℃まで加温し、開始剤Ｖ−５０を５ｍｌ蒸留水に溶解させた水溶液を加温後のバイアル瓶に加えた。窒素雰囲気下、８０℃、スターラー２００ｒｐｍで２４時間攪拌重合を行った。重合終了後、遠心分離洗浄を３回行い未反応のモノマー、開始剤を除去した。ピレン含有分子インプリント微粒子の重合率は９５％であった。

蛍光性ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子からＢＰＡを除去するため、実施例１と同じ方法で加水分解を行い、酸による洗浄および蒸留水による洗浄を行った。さらに本実施例では、蛍光測定をメタノール／トルエン＝７／１３溶液で行うため、メタノールで１回洗浄した後、メタノール／トルエン＝７／１３溶液に置換した。

（３−２）ＢＰＡ集積金微粒子の合成
標的分子であるＢＰＡを金微粒子表面に集積させるため、実施例２で合成したＢＰＡ−チオール誘導体を保護剤として金微粒子の合成を行った（参考文献：M.Brust, M.Walker, D.Bethell, D.Schiffrin,R.Whyman, Chem.Commun.,1994,801.
M.Brust, J.Fink, D.Bethell, D.Schiffrin,C.Kiely, Chem.Commun.,1995,1655.）。

予め、合成に使用する器具のシリコンコートを行った。２％ジメチルジクロロシラン（溶媒：トルエン）を調製し、１０ｍｌバイアル瓶に注ぎ、容器を回しながら液を行き渡らせた。液を戻し、そのまま溶液を蒸発させ、蒸留水ですすぎ乾燥させたものを使用した。

表５に示すように、２ｍｌのＢＰＡ−チオール誘導体溶液（５．８ｍＭｉｎＭｅＯＨ）と２ｍｌの塩化金酸溶液（５．８ｍＭメタノール溶液）をバイアルにとり、酢酸８０μｌを加えた。この液をスターラーで攪拌しながら、０．４Ｍの水素化ホウ素ナトリウム水溶液を１００μｌずつ５回に分けてゆっくり滴下した。瞬時に溶液の色が赤紫色に変化したので、それから３０分後に攪拌をとめた。この反応溶液をエバポレータにかけ、溶媒を留去した。その後エーテルを加え、生じた沈殿物を桐山ろうとを用いてろ過し、さらに酢酸エチル、蒸留水の順に洗浄した。得られた金微粒子をメタノール／トルエン＝７／１３溶液で再溶解させた（収量：４．３ｍｇ）。

（３−３）蛍光性ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子およびＢＰＡ集積金微粒子を用いた蛍光消光センシング
系内に蛍光性ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子（蛍光ＩＮＰ）のみ存在する場合について、蛍光発光が飽和する濃度を検討するため滴定実験を行った。具体的には、１ｃｍ角石英セルにメタノール／トルエン＝７／１３溶液を３ｍｌ加え、そこへＢＰＡ蛍光分子インプリント微粒子溶液（１．２ｗｔ％メタノール／トルエン＝７／１３）を５μｌずつ滴下することにより、蛍光が飽和し、濃度消光による消光が起こる濃度を確認した。鋳型分子の切り出し処理をしていない蛍光性ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子（蛍光ＲＮＰ）についても同様の手順で測定を行った。

次に、蛍光消光反応を検出するため蛍光ＩＮＰ溶液または蛍光ＲＮＰ溶液へのＢＰＡ集積金微粒子の滴定実験を行った。蛍光スペクトル測定は、蛍光ＩＮＰまたは蛍光ＲＮＰの濃度を共に２．４×１０^−３ｗｔ％（メタノール／トルエン＝７／１３）に調整し、それぞれ３ｍｌを１ｃｍ角石英セルに加えた。そこにＢＰＡ集積金微粒子３ｍｇ／ｍｌ溶液（メタノール／トルエン＝７／１３）を１０μｌずつ滴下し１分間攪拌した後、蛍光スペクトルを測定し消光を観察した。なお、ＢＰＡ集積金微粒子添加に伴い蛍光ＩＮＰの濃度を補正した。

消光状態からの蛍光回復を測定するため、ＢＰＡ集積金微粒子を添加されて消光状態となっている蛍光ＩＮＰ溶液または蛍光ＲＮＰ溶液に、蛍光ＩＮＰへのＢＰＡ集積金微粒子の吸着を阻害する阻害剤溶液を添加する滴定実験を行った。蛍光ＩＮＰ溶液または蛍光ＲＮＰ溶液３．２×１０−３ｗｔ％（メタノール／トルエン＝７／１３）３ｍｌを１ｃｍ角石英セルに加え、ＢＰＡ集積金微粒子溶液を０．０２ｍｇ／ｍｌまで添加し消光状態を形成した。そこへ阻害剤として標的分子であるＢＰＡ溶液、あるいはカルボン酸である酢酸溶液を添加し一分間攪拌したのち蛍光測定を行った。ＢＰＡ溶液は濃度４００ｍＭ（メタノール／トルエン＝７／１３）、酢酸溶液は濃度１００ｍＭ（メタノール／トルエン＝７／１３）に調製したものを滴定に使用した。なお、酢酸溶液添加に伴い蛍光ＩＮＰの濃度を補正した。

以上の実験において、蛍光測定は以下の条件で行った。
Ｅｘｉｔａｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ３４７ｎｍ
温度２５℃，
ｐｈｏｔｏｍａｌ電圧４００Ｖ

（３−４）結果
(i) 蛍光性ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子およびＢＰＡ集積金微粒子の同定
図１５に、ピレンモノマーを含んだ蛍光性ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子のＳＥＭ画像を示した。図１５から明らかなように、きれいに形状を保った平均粒子径３６８ｎｍの微粒子であることが確認された。

図１６に、可視紫外吸収光度計で測定したＢＰＡ集積金微粒子溶液の吸収スペクトルを示した。図１６に示したように、金粒子のプラズモン由来の吸収が５２０ｎｍ付近に、ＢＰＡ由来の吸収が２７９ｎｍ付近に観測された。また、図１７に、ＢＰＡ集積金微粒子のＴＥＭ画像を示した。図１７に示したように、大きさにばらつきはみられるものの、粒子径３０ｎｍ程度の粒子が形成されていることが明らかとなった。

(ii) 蛍光性ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子における蛍光強度の濃度依存性
図１８および図１９に、それぞれ蛍光ＩＮＰの濃度と蛍光強度の関係、および蛍光ＲＮＰの濃度と蛍光強度の関係を示した。図１８および図１９から明らかなように、蛍光ＩＮＰおよび蛍光ＲＮＰともに０．０２ｗｔ％付近で蛍光強度が飽和に達しており、濃度をそれ以上高くした場合、濃度消光が引き起こされることが確認された。この結果を踏まえて、以後の実験においては蛍光ＩＮＰ（蛍光ＲＮＰ）の濃度として、濃度消光の起こらない低濃度（２〜３×１０^−３ｗｔ％）を用いることにした。

(iii) 蛍光性ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子およびＢＰＡ集積金微粒子の相互作用に基づく蛍光消光
図２０に、蛍光ＩＮＰ溶液および蛍光ＲＮＰ溶液に、それぞれＢＰＡ集積金微粒子溶液を添加したときの蛍光強度の変化率を示した。蛍光強度の変化率は、波長３９７ｎｍにおけるＢＰＡ集積金微粒子添加前の蛍光強度（Ｆ_０）に対する、ＢＰＡ集積金微粒子添加後の蛍光強度（Ｆ）の比（Ｆ／Ｆ_０）で示した。図２０に示したように、蛍光ＲＮＰの消光の程度より、蛍光ＩＮＰ溶液の消光程度のほうが大きいこと確認された。この結果から、蛍光ＩＮＰ表面に形成されたＢＰＡ認識部位にＢＰＡ集積金微粒子が吸着することにより、効率よく蛍光が消光することが明らかとなった。

(iv)ＢＰＡおよび極性溶媒による蛍光回復
図２１に、集積金微粒子を加えて消光状態となっている蛍光ＩＮＰ溶液にＢＰＡ溶液を滴下したときの蛍光スペクトルの変化を示した。図中、右上に波長３９７ｎｍ付近の蛍光スペクトルを拡大して示した。ＢＰＡは、セル中のＢＰＡ濃度が２０ｍＭになるまで滴下した。図２１から明らかなように、大きなスペクトルの変化は見られなかった。この結果は、実施例２の結果と一致するものであった。

図２２に、集積金微粒子を加えて消光状態となっている蛍光ＩＮＰ溶液および蛍光ＲＮＰ溶液に、それぞれ酢酸溶液を滴下したときの蛍光強度の回復率を示した。蛍光強度の回復率は、集積金微粒子添加前の蛍光ＩＮＰ溶液および蛍光ＲＮＰ溶液の蛍光強度（波長３９７ｎｍ）を１００％とし、集積金微粒子添加後、蛍光が消光したときの蛍光強度を０％として算出した。図２２から明らかなように、酢酸の添加により蛍光ＩＮＰの蛍光回復が観測され、その蛍光回復率は１５．５％であった。一方、蛍光ＲＮＰでは蛍光の回復はほとんど観測されず、蛍光回復率は２％であった。この結果は、実施例２の結果と一致するものであり、蛍光ＩＮＰと集積金微粒子との解離がカルボン酸によって促進されたことから、蛍光ＩＮＰと集積金微粒子間の相互作用は水素結合による特異的な結合であることが示唆された。

なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

本発明は、公衆衛生、環境衛生、医療などの分野に利用することができる。また、試薬産業に利用することができる。

分子インプリント微粒子が分子集積基板に吸着している状態を示す模式図である。蛍光性分子インプリント微粒子と分子集積金微粒子との相互作用を示す模式図である。ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子の評価に用いた４種類の化合物の化学構造式を示す図である。合成したＢＰＡ認識分子インプリント微粒子のＳＥＭ画像である。合成したＢＰＡ認識分子インプリント微粒子への各サンプルの吸着量を算出した結果を示す図である。ＩＮＰのＳＥＭ画像である。ＲＮＰのＳＥＭ画像である。ＢＮＰのＳＥＭ画像である。ＢＰＡ−ＳＡＭ基板のＩＲ−ＲＡＳスペクトルを示す図である。３種類の微粒子（ＩＮＰ、ＲＮＰ、ＢＮＰ）の各濃度における波長のシフト値（Δλｎｍ）をプロットした吸着等温線を示す図である。送液開始からの各時間における波長のシフト値（Δλｎｍ）をプロットした吸着等温線を示す図である。ＢＰＡ−ＳＡＭ基板にＩＮＰ溶液を送液後、溶媒（クロロホルム）を送液し、最後にＢＰＡを送液したときのＳＰＲスペクトルの変化を示す図である。ＢＰＡ−ＳＡＭ基板にＩＮＰ溶液を送液後、溶媒（クロロホルム）を送液し、最後にＤＡＤＰＭを送液したときのＳＰＲスペクトルの変化を示す図である。ＢＰＡ−ＳＡＭ基板にＩＮＰ溶液を送液後、溶媒（クロロホルム）を送液し、最後にメタノールを送液したときのＳＰＲスペクトルの変化を示す図である。ピレンモノマーを含んだ蛍光性ＢＰＡ認識分子インプリント微粒子のＳＥＭ画像である。可視紫外吸収光度計で測定したＢＰＡ集積金微粒子溶液の吸収スペクトルを示す図である。ＢＰＡ集積金微粒子のＴＥＭ画像である。蛍光ＩＮＰの濃度と蛍光強度の関係を示す図である。蛍光ＲＮＰの濃度と蛍光強度の関係を示す図である。蛍光ＩＮＰ溶液および蛍光ＲＮＰ溶液に、それぞれＢＰＡ集積金微粒子溶液を添加したときの蛍光強度の変化率を示す図である。集積金微粒子を加えて消光状態となっている蛍光ＩＮＰ溶液にＢＰＡ溶液を滴下したときの蛍光スペクトルの変化を示す図である。集積金微粒子を加えて消光状態となっている蛍光ＩＮＰ溶液および蛍光ＲＮＰ溶液に、それぞれ酢酸溶液を滴下したときの蛍光強度の回復率を示す図である。

Claims

試料中の標的分子を検出する方法であって、以下の（Ａ）と（Ｂ）との相互作用を検出することを特徴とする試料中の標的分子検出方法。
（Ａ）分子インプリント法により構築された標的分子認識部位を有し、動的光散乱法により測定される平均粒子径が１μｍ未満の分子インプリント微粒子
（Ｂ）標的分子またはその誘導体の単分子層を有し、当該単分子層が自己組織化膜またはラングミュアーブロジェット膜であり、当該単分子層に前記分子インプリント微粒子が結合可能な分子集積体
前記分子集積体は、基板の表面に前記単分子層が形成されていることを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的分子検出方法。
前記分子集積体は、溶媒に分散可能な微粒子の表面に前記単分子層が形成されていることを特徴とする請求項１に記載の試料中の標的分子検出方法。
前記分子集積体は、光エネルギーを吸収または放出することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の試料中の標的分子検出方法。
前記分子インプリント微粒子は、前記分子集積体が光エネルギーを吸収するときは光エネルギーを放出し、前記分子集積体が光エネルギーを放出するときは光エネルギーを吸収することを特徴とする請求項４に記載の試料中の標的分子検出方法。
前記分子インプリント微粒子は蛍光を発光し、前記分子集積体は当該分子インプリント微粒子が発する蛍光エネルギーを吸収して分子インプリント微粒子の蛍光を消光する、または当該分子インプリント微粒子が発する蛍光エネルギーを吸収して分子集積体自身がさらに蛍光を発光することを特徴とする請求項５に記載の試料中の標的分子検出方法。
前記分子集積体は蛍光を発光し、前記分子インプリント微粒子は当該分子集積体が発する蛍光エネルギーを吸収して分子集積体の蛍光を消光する、または当該分子集積体が発する蛍光エネルギーを吸収して分子インプリント微粒子自身がさらに蛍光を発光することを特徴とする請求項５に記載の試料中の標的分子検出方法。
試料と前記分子インプリント微粒子と前記分子集積体とを接触させる試料接触工程を包含することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の試料中の標的分子の検出方法。
試料中の標的分子を検出するための試薬キットであって、以下の（Ａ）および（Ｂ）を備えることを特徴とする試料中の標的分子検出キット。
（Ａ）分子インプリント法により構築された標的分子認識部位を有し、動的光散乱法により測定される平均粒子径が１μｍ未満の分子インプリント微粒子
（Ｂ）標的分子またはその誘導体の単分子層を有し、当該単分子層が自己組織化膜またはラングミュアーブロジェット膜であり、当該単分子層に前記分子インプリント微粒子が結合可能な分子集積体