JP4853666B2 - Target substance detection method, mixed particles, and target substance detection reagent - Google Patents
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Description
本発明は、標的物質の検出方法、混合粒子、および標的物質の検出試薬に関する。 The present invention relates to a target substance detection method, mixed particles, and a target substance detection reagent.
抗体または抗原などをラテックス粒子に担持させ、該ラテックス粒子の凝集により、対応する抗原または抗体などの被検査物質との特異的反応を検出する方法は一般に、ラテックス免疫診断法といわれ、臨床検査の重要な手段として利用されている（特開２００６−２６６９７０号公報）。 A method for detecting a specific reaction with a test substance, such as a corresponding antigen or antibody, by carrying an antibody or an antigen on latex particles and aggregating the latex particles is generally called a latex immunodiagnostic method. It is used as an important means (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-266970).
ラテックス免疫診断法はその簡便さで知られている。一般に、検体とラテックス粒子とを混合するだけで免疫反応（抗原抗体反応）が素早く進行する。免疫反応によってラテックス粒子が凝集し、免疫反応の進行度をラテックス粒子の凝集度として計測する。 Latex immunodiagnostic methods are known for their simplicity. In general, an immune reaction (antigen-antibody reaction) proceeds rapidly only by mixing a specimen and latex particles. Latex particles are aggregated by the immune reaction, and the progress of the immune reaction is measured as the degree of aggregation of the latex particles.
ラテックス免疫診断法は、酵素免疫法、化学発光免疫診断法、蛍光免疫診断法に代表される、検出に際してラベリング物質を使用する診断方法に比べて、反応物と未反応物との分離（いわゆるＢ／Ｆ分離）操作が必要ない分、短時間で簡便かつ廉価に診断できるという利点を有する。また、ラテックス免疫診断法専用の自動測定機器も市販されており、バッチ処理による大量検体の迅速診断に適する方法として普及している。 Latex immunodiagnostic methods are separated from reactants and unreacted materials (so-called B), compared to diagnostic methods that use labeling substances for detection, such as enzyme immunoassay, chemiluminescent immunodiagnostic method, and fluorescent immunodiagnostic method. / F separation) Since there is no need for operation, there is an advantage that diagnosis can be performed easily and inexpensively in a short time. In addition, automatic measuring instruments dedicated to latex immunodiagnostic methods are also commercially available, and are widely used as methods suitable for rapid diagnosis of large quantities of samples by batch processing.
しかしながら、一般に、ラテックス免疫診断法は他の診断方法と比較して検出感度が低いという欠点を有する。これは、ラテックス免疫診断法の検出がラテックス凝集による吸光度変化のみに頼っていることに起因する。これに対して、酵素免疫法や化学発光免疫診断法などの診断方法では、微小なシグナルを検出するために、酵素と基質との反応を利用してシグナルの増幅が行われる。したがって、ラテックス免疫診断法においては、検出感度を高めることが求められている。 In general, however, latex immunodiagnostic methods have the disadvantage of low detection sensitivity compared to other diagnostic methods. This is due to the fact that detection by latex immunodiagnostics relies solely on changes in absorbance due to latex aggregation. On the other hand, in a diagnostic method such as an enzyme immunization method or a chemiluminescence immunodiagnosis method, in order to detect a minute signal, a signal is amplified using a reaction between an enzyme and a substrate. Therefore, in the latex immunodiagnosis method, it is required to increase the detection sensitivity.
これに対して、近年、ラテックスメーカーの努力により、ラテックス粒子の粒径制御および表面改質によって、ラテックス免疫診断法の検出感度が確実に高められている。検出感度の向上および測定の迅速化を実現するために、現在の多くの測定システムでは、検査液を添加した後の濁度の変化速度を測定し、被検査物質の濃度に対する濁度の変化速度を示す検量線を用いて、測定された濁度の変化速度に基づいて被検査物質の定量が行われている。また、一部の測定システムでは、検査液を添加した後の濁度の一定時間経過後の準平衡値に基づいて検量線を作成する。また、迅速診断を実現するために使われるレートアッセイの場合、反応途中の吸光度を計測し検量線とする方式も採用されている。 On the other hand, in recent years, with the efforts of latex manufacturers, the detection sensitivity of latex immunodiagnostic methods has been reliably increased by controlling the particle size of latex particles and modifying the surface. In order to improve detection sensitivity and speed up measurement, many current measurement systems measure the rate of change of turbidity after adding a test solution, and the rate of change of turbidity with respect to the concentration of the test substance Using the calibration curve indicating quantification of the substance to be inspected based on the measured turbidity change rate. In some measurement systems, a calibration curve is created on the basis of a quasi-equilibrium value after a lapse of a certain time of turbidity after adding a test solution. In the case of a rate assay used for realizing rapid diagnosis, a method of measuring the absorbance during the reaction and using it as a calibration curve is also adopted.
これらの検量線では通常、被検査物質の濃度が低い領域（低濃度域）では傾きが小さく（被検査物質の濃度の変化量に対する、濁度の変化速度の変化量が小さい領域：前期鈍感領域）、次第に傾きが一定勾配となり（被検査物質の濃度の変化量に対する、濁度の変化速度の変化量が一定である領域：比例領域）、さらに、被検査物質の濃度が高い領域（高濃度域）では傾きが小さくなり（被検査物質の濃度の変化量に対する、濁度の変化速度の変化量が小さい領域：後期鈍感領域）、場合によっては、さらに高い濃度域で傾きが逆勾配の領域（プロゾーン領域）が生じることがある。 In these calibration curves, the slope is usually small in the region where the concentration of the test substance is low (low concentration region) (the region where the change in the turbidity change rate is small relative to the change in the concentration of the test material: the insensitive region in the previous period) ) Gradually, the slope becomes a constant slope (region where the amount of change in the turbidity change rate is constant relative to the amount of change in the concentration of the test substance: a proportional region), and further, a region where the concentration of the test substance is high (high concentration) Area) (the area where the change in the turbidity change rate is small relative to the change in the concentration of the test substance: late insensitive area). (Prozone region) may occur.
このような要求特性から、従来、被検査物質の濃度が低い場合の測定においては、僅かな免疫反応により生じた粒子凝集を敏感に検知するため、濁度変化に敏感に対応できる大きな粒子が使用される。 Because of these required characteristics, large particles that can respond sensitively to changes in turbidity are used to measure particle agglomeration caused by slight immune reactions in the measurement when the concentration of the test substance is low. Is done.
一方、比例領域を利用する測定においては、比例領域を可能な限り広くするために、免疫反応に基づく粒子凝集に対して吸光度変化を小さく抑える必要がある。このため、多くの免疫反応が生じた場合、吸光度変化が少ない範囲に抑えるために、粒径の小さい粒子を使用する。 On the other hand, in the measurement using the proportional region, in order to make the proportional region as wide as possible, it is necessary to keep the change in absorbance small with respect to particle aggregation based on the immune reaction. For this reason, when many immune reactions occur, particles having a small particle diameter are used in order to suppress the change in absorbance to a small range.
このように、ラテックス免疫診断法においては、一般に、被検査物質の濃度に応じて大粒子と小粒子とを使い分ける大粒子小粒子併用系が使用されている。 As described above, in the latex immunodiagnosis method, generally, a large particle / small particle combined system is used in which large particles and small particles are selectively used in accordance with the concentration of the substance to be examined.
このような大粒子小粒子併用系においては、大粒子の重量比率は通常、全体粒子の２割未満である。大粒子の比率が多すぎると、抗原濃度が多い領域で吸光度変化が頭打ちになり、測定レンジが狭くなることがある。一方、大粒子の比率が少なすぎると、抗原濃度低値領域の測定感度が確保できない場合がある。 In such a combination system of large particles and small particles, the weight ratio of large particles is usually less than 20% of the total particles. If the ratio of the large particles is too large, the absorbance change may reach a peak in a region where the antigen concentration is high, and the measurement range may be narrowed. On the other hand, if the ratio of large particles is too small, the measurement sensitivity in the low antigen concentration region may not be ensured.
しかし、大小２種類粒子を使っても、抗原濃度の少ない低値域では、大粒子が優先的に抗原と反応する保障はなく、結果的に大・小粒子の競合反応の結果として一部の大粒子が反応する。つまり大粒子の反応効率が粒子個数のゆえに高くない。標的物質としての数少ない抗原の多くは、個数で優位にある小粒子と反応し、吸光度変化へ大きく寄与しない。 However, even if two types of large and small particles are used, there is no guarantee that the large particles will react preferentially with the antigen in the low range where the antigen concentration is low, and as a result, some large and small particles are competing. The particles react. That is, the reaction efficiency of large particles is not high because of the number of particles. Many of the few antigens as target substances react with small particles that are superior in number, and do not contribute greatly to changes in absorbance.
一方、試薬検量線の滑らかさを維持させるためには、大粒子と小粒子との粒径差を大きく変えることができない。片方の粒子の粒径を変える場合には、必然的にもう片方の粒子の粒径も連動して変える必要がある。したがって、所定の要求項目に適切な粒子を選定する際に、粒子の選定幅が狭い。結果的に高感度ラテックス試薬の限界となる。 On the other hand, in order to maintain the smoothness of the reagent calibration curve, the particle size difference between the large particles and the small particles cannot be changed greatly. When changing the particle size of one of the particles, it is inevitably necessary to change the particle size of the other particle in conjunction. Therefore, the selection range of particles is narrow when selecting appropriate particles for a predetermined requirement. As a result, it becomes a limit of a high sensitivity latex reagent.
また、大粒子小粒子併用系においては、試薬の保管期間中に大粒子が自重のため沈降する結果、粒子が均一な分散状態を維持することができない場合がある。この現象は、時として測定値の飛び値として現れる。測定結果の信憑性を直接影響ため排除する必要がある。加えて、このような大粒子小粒子併用系の試薬は一般に、試薬の長期保管が困難であるため、保存安定性が低い場合がある。
本発明は、高感度で測定範囲が広く、かつ、測定再現性の優れた標的物質の検出方法、該検出方法に使用することができる混合粒子、および該混合粒子を用いた標的物質の検出試薬を提供する。 The present invention relates to a method for detecting a target substance having high sensitivity, a wide measurement range, and excellent measurement reproducibility, mixed particles that can be used in the detection method, and a reagent for detecting a target substance using the mixed particles I will provide a.
本発明の一態様に係る標的物質の検出方法は、
着色粒子および無着色粒子を含む混合粒子分散液に検体を接触させる工程、および
前記接触させる工程により生じた前記混合粒子の凝集を光学的に検出する工程を含み、
前記着色粒子および前記無着色粒子はそれぞれ、所定の標的物質に対する抗体または抗原が固定化され、かつ、平均粒径が０．０３−１μｍである。
A method for detecting a target substance according to an aspect of the present invention includes:
A step of contacting a specimen with a mixed particle dispersion containing colored particles and non-colored particles, and a step of optically detecting agglomeration of the mixed particles caused by the contacting step,
Each of the colored particles and the non-colored particles has an antibody or antigen against a predetermined target substance immobilized thereon and has an average particle size of 0.03-1 μm.
上記標的物質の検出方法では、前記検出する工程において、前記混合粒子の凝集を波長４００−９００ｎｍの光で検出することができる。 In the target substance detection method, the aggregation of the mixed particles can be detected with light having a wavelength of 400 to 900 nm in the detection step.
上記標的物質の検出方法において、前記混合粒子に占める前記着色粒子の含有量が３−９５質量％であることができる。 In the target substance detection method, the content of the colored particles in the mixed particles may be 3-95% by mass.
上記標的物質の検出方法において、前記着色粒子の粒径の変動係数および前記無着色粒子の粒径の変動係数がそれぞれ２０％以下であることができる。 In the target substance detection method, the variation coefficient of the particle size of the colored particles and the variation coefficient of the particle size of the non-colored particles may be 20% or less, respectively.
上記標的物質の検出方法において、前記無着色粒子の平均粒径に対する前記着色粒子の平均粒径の比が０．２−５であることができる。 In the target substance detection method, a ratio of the average particle diameter of the colored particles to the average particle diameter of the non-colored particles may be 0.2-5.
本発明の一態様に係る混合粒子は、
所定の標的物質に対する抗体または抗原が固定化され、平均粒径が０．０３−１μｍである、着色粒子および無着色粒子を含有する。
The mixed particles according to one embodiment of the present invention are:
An antibody or an antigen against a predetermined target substance is immobilized, and contains colored particles and non-colored particles having an average particle size of 0.03-1 μm.
上記混合粒子は、上記標的物質の検出方法に使用されることができる。 The mixed particles can be used in the target substance detection method.
本発明の一態様に係る標的物質の検出試薬は、上記混合粒子を含有する。 The target substance detection reagent according to one embodiment of the present invention contains the mixed particles.
上記標的物質の検出方法によれば、着色粒子および無着色粒子を含む混合粒子分散液に検体を接触させる工程、および前記接触させる工程により生じた前記混合粒子の凝集を光学的に検出する工程を含み、前記着色粒子および前記無着色粒子はそれぞれ、所定の標的物質に対する抗体または抗原が固定化され、かつ、平均粒径が０．０３−１μｍであることにより、高感度で測定範囲が広く、かつ、長期保存中の粒子の凝集が少ないため、保存安定性に優れている。 According to the method for detecting a target substance, the step of bringing a specimen into contact with a mixed particle dispersion containing colored particles and non-colored particles, and the step of optically detecting aggregation of the mixed particles generated by the contacting step Each of the colored particles and the non-colored particles has a high sensitivity and a wide measurement range because an antibody or an antigen against a predetermined target substance is immobilized and the average particle size is 0.03-1 μm. In addition, since there is little aggregation of particles during long-term storage, the storage stability is excellent.
また、上記混合粒子および上記標的物質の検出試薬によれば、上記着色粒子および無着色粒子を含むことにより、該粒子が沈降しにくいため、臨床検査機器のメンテナンスを減らすことができ、その結果、臨床検査試薬のコスト削減を図ることができる。 Further, according to the detection reagent for the mixed particles and the target substance, since the particles are difficult to settle by including the colored particles and the non-colored particles, the maintenance of the clinical laboratory equipment can be reduced. Cost reduction of clinical test reagents can be achieved.
以下、本発明の一実施形態に係る標的物質の検出方法、混合粒子、および標的物質の検出試薬について、具体的に説明する。 Hereinafter, a target substance detection method, mixed particles, and a target substance detection reagent according to an embodiment of the present invention will be specifically described.
１．混合粒子
１．１．混合粒子の構成
本発明の一実施形態に係る混合粒子は、所定の標的物質に対する抗体または抗原が固定化され、平均粒径が０．０３−１μｍである、着色粒子および無着色粒子を含有する。
1. Mixed particles 1.1. Composition of Mixed Particles Mixed particles according to an embodiment of the present invention contain colored particles and non-colored particles, to which antibodies or antigens against a predetermined target substance are immobilized, and the average particle size is 0.03-1 μm. .
本実施形態に係る混合粒子は、平均粒径が０．０３−１μｍである着色粒子を３−９５質量％含有することができる。ここで、着色粒子の割合が３質量％未満であると、着色粒子の吸光度増幅効果が小さく、実質的な効果が期待できない場合がある。本実施形態に係る混合粒子における着色粒子の割合は５−７０質量％であることがより好ましく、７−４０質量％がさらに好ましい。一方、着色粒子の割合が９５％以上になると、混合粒子の機能がなくなり、無着色粒子の広いレンジ効果がなくなる場合がある。 The mixed particles according to the present embodiment can contain 3-95% by mass of colored particles having an average particle size of 0.03-1 μm. Here, when the ratio of the colored particles is less than 3% by mass, the absorbance amplification effect of the colored particles is small, and a substantial effect may not be expected. The ratio of the colored particles in the mixed particles according to this embodiment is more preferably 5-70% by mass, and further preferably 7-40% by mass. On the other hand, when the ratio of the colored particles is 95% or more, the function of the mixed particles is lost, and the wide range effect of the non-colored particles may be lost.
無着色粒子は、通常の乳化重合、分散重合、懸濁重合、シード重合、ソープフリー重合などの水溶液系で調製されるラテックス粒子であって、通常は乳白色を呈し、明瞭な色彩は有さない。無着色粒子に対する可視域の吸光度測定により得られた吸光スペクトルでは、特定波長域での吸収が確認されない。 Uncolored particles are latex particles prepared in an aqueous solution system such as ordinary emulsion polymerization, dispersion polymerization, suspension polymerization, seed polymerization, soap-free polymerization, etc., and usually have a milky white color and do not have a clear color. . In the absorption spectrum obtained by measuring the absorbance in the visible region with respect to the non-colored particles, absorption in a specific wavelength region is not confirmed.
一方、着色粒子は白色以外の色彩を有する。着色粒子に対する可視域の吸光度測定により得られた吸光スペクトルでは、特定波長域での吸収が確認される。 On the other hand, the colored particles have a color other than white. Absorption spectrum obtained by measuring the absorbance in the visible region with respect to the colored particles confirms absorption in a specific wavelength region.
１．１．１．着色粒子および無着色粒子の平均粒径および粒径分布
本実施形態に係る混合粒子において、着色粒子および無着色粒子の平均粒径はそれぞれ、通常０．０３−１μｍであり、０．０５−０．６μｍであることが好ましい。上記平均粒径が０．０３μｍ未満である場合、粒子凝集による吸光度変化が小さすぎるため、免疫反応が起きても、反応を実質的に追跡できない場合がある。さらに、上記平均粒径が０．０３μｍ未満である場合、粒子表面エネルギーが高くなり、粒子がコロイド的に不安定になるため、臨床検査試薬の製造段階における粒子の遠心分離工程に多くの時間がかかるため製造効率が低く、その結果、製造コストが高くなるうえに、品質保証が困難になる場合がある。
1.1.1. Average particle size and particle size distribution of colored particles and uncolored particles In the mixed particles according to this embodiment, the average particle size of the colored particles and the uncolored particles is usually 0.03-1 μm, and 0.05-0. .6 μm is preferable. When the average particle size is less than 0.03 μm, the change in absorbance due to particle aggregation is too small, so that even if an immune reaction occurs, the reaction may not be substantially tracked. Furthermore, when the average particle size is less than 0.03 μm, the particle surface energy becomes high, and the particles become colloidally unstable, so that a lot of time is required for the centrifugation step of the particles in the manufacturing stage of the clinical test reagent. Therefore, the manufacturing efficiency is low, and as a result, the manufacturing cost increases and quality assurance may be difficult.
一方、上記平均粒径が１μｍを超える場合、ラテックス凝集を測定原理とする自動臨床検査機器を使用した測定において、粒子凝集による吸光度（濁度）変化が大きすぎる。特に、被測定物質の濃度が高い場合、粒子凝集による吸光度（濁度）の変化量が測定可能領域を超えてしまい、高濃度領域では被測定物質の濃度に応じた吸光度（濁度）変化量が得られず、定量的な測定ができなくなる。その結果、実質的に免疫反応のごく初期の段階しか追跡できない場合がある。 On the other hand, when the average particle size exceeds 1 μm, the change in absorbance (turbidity) due to particle aggregation is too large in the measurement using an automatic clinical testing instrument whose measurement principle is latex aggregation. In particular, when the concentration of the substance to be measured is high, the amount of change in absorbance (turbidity) due to particle aggregation exceeds the measurable range, and in the high concentration range, the amount of change in absorbance (turbidity) according to the concentration of the substance to be measured. Cannot be obtained and quantitative measurement cannot be performed. As a result, only the very early stages of the immune response can be tracked substantially.
着色粒子および無着色粒子の好適な粒径分布はそれぞれ、下記式で定義される変動係数（ＣＶ値）が２０％以下であることが好ましく、より好ましくは１５％以下であり、特に好ましくは１０％以下である。上記変動係数が２０％を超える場合、該粒子を用いた標的物質の検出結果の再現性が低下する場合がある。
［変動係数］
変動係数（ＣＶ値）（％）＝（粒子径の標準偏差／平均粒径）×１００（％）
The preferable particle size distribution of the colored particles and the non-colored particles preferably has a coefficient of variation (CV value) defined by the following formula of 20% or less, more preferably 15% or less, and particularly preferably 10%. % Or less. If the coefficient of variation exceeds 20%, the reproducibility of the detection result of the target substance using the particles may be reduced.
[Coefficient of variation]
Coefficient of variation (CV value) (%) = (standard deviation of particle diameter / average particle diameter) × 100 (%)
着色粒子および無着色粒子の平均粒径は、透過型電子顕微鏡で測定することができる。また、電子線による粒子の縮小率を補正するため、粒子の平均粒径の値として、電子線照射時間と粒子縮小率との相関図から、照射時間ゼロのポイントを外挿した値を使用する。 The average particle diameter of colored particles and non-colored particles can be measured with a transmission electron microscope. Also, in order to correct the particle reduction rate due to the electron beam, the value obtained by extrapolating the zero irradiation point from the correlation diagram between the electron beam irradiation time and the particle reduction rate is used as the average particle size value of the particles. .
具体的には、撮影された粒子写真を画像解析装置により粒子２００個を計測して、その平均粒径および標準偏差を算出する。この場合、粒径の標準として、ＪＱＡの標準物質およびトレーサビリティーが得られる標準解析格子を用いる。 Specifically, the photographed particle photograph is measured with 200 particles by an image analyzer, and the average particle diameter and standard deviation are calculated. In this case, JQA standard material and a standard analysis grid capable of obtaining traceability are used as particle size standards.
１．１．２．着色粒子および無着色粒子の組成
着色粒子および無着色粒子は、フェニル基を有する重合性単量体を含有するモノマー部を重合して得られたポリマー部から構成される表面を有するラテックス粒子であることが好ましい。
1.1.2. Composition of colored particles and non-colored particles Colored particles and non-colored particles are latex particles having a surface composed of a polymer part obtained by polymerizing a monomer part containing a polymerizable monomer having a phenyl group. It is preferable.
また、粒子の沈降速度をより遅くできる点で、ポリマー部は水よりも比重が小さいことが好ましい。水よりも比重が小さいポリマー部を製造するためには、例えば、ポリマー部がポリスチレン部位を含むことが挙げられる。 Moreover, it is preferable that specific gravity of a polymer part is smaller than water at the point which can make the sedimentation rate of particle | grains slower. In order to produce a polymer part having a specific gravity smaller than that of water, for example, the polymer part includes a polystyrene moiety.
フェニル基を有する重合性単量体としては特に限定されず、例えば、スチレン、ジビニルベンゼン、エチルスチレン、α−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ｐ−クロロスチレン、クロロメチルスチレン等が挙げられる。これらは単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。これらの中では、スチレンが好ましく用いられる。 The polymerizable monomer having a phenyl group is not particularly limited, and examples thereof include styrene, divinylbenzene, ethylstyrene, α-methylstyrene, p-methylstyrene, p-chlorostyrene, and chloromethylstyrene. These may be used independently and 2 or more types may be used together. Of these, styrene is preferably used.
モノマー部で使用する重合性単量体の総量における、フェニル基を有する重合性単量体の含有率は５０％以上であるのが好ましく、６５％以上がより好ましい。上記含有率が５０％未満であると、免疫診断用途において、抗体または抗原の結合量が少なくなるおそれがある。また、上記含有率は、粒子製造時の重合性単量体の添加量によって制御することができる。なお、重合性単量体の添加量は、重合性単量体の実導入量ではない。重合性単量体の実導入量は例えば、熱分解ガスクロマススペクトルのような分析機器で定量することができる。 The content of the polymerizable monomer having a phenyl group in the total amount of polymerizable monomers used in the monomer portion is preferably 50% or more, and more preferably 65% or more. If the content is less than 50%, the amount of antibody or antigen binding may be reduced in immunodiagnostic applications. Moreover, the said content rate can be controlled by the addition amount of the polymerizable monomer at the time of particle manufacture. The addition amount of the polymerizable monomer is not the actual introduction amount of the polymerizable monomer. The actual introduction amount of the polymerizable monomer can be quantified with an analytical instrument such as a pyrolysis gas chromatograph spectrum.
モノマー部で使用する重合性単量体として、必要に応じて、アクリレートおよびメタクリレートをさらに使用することもできる。アクリレートおよびメタクリレートの具体例としては、例えば、メチルメタアクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ｎ−ブチルアクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、ｔーブチルアクリレート、ｔーブチルメタクリレート、イソブチルアクリレート、イソブチルメタクリレート、ペンチルアクリレート、ペンチルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレートなどの鎖状アルキル基を有するアルキルアクリレートおよびアルキルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、シクロヘキシルエチレングリコールメタクリレート、シクロヘキシルジプロピレングリコールメタクリレートなどの環状脂肪族基を有するアルキルアクリレートおよびアルキルメタクリレート、メチル置換シクロヘキシルアクリレートなどのシクロヘキシル基の水素原子の一部が炭素数１−４のアルキル基で置換された置換シクロヘキシルアクリレート、置換シクロヘキシルメタクリレート、シクロヘキセンジメタクリレートなどが挙げられ、これらは単独でまたは２種以上を組み合わせて、上記フェニル基を有する重合性単量体の１種または２種以上と共重合することができる。 As the polymerizable monomer used in the monomer part, acrylate and methacrylate can be further used as necessary. Specific examples of the acrylate and methacrylate include, for example, methyl methacrylate, 2-ethylhexyl acrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, n-butyl acrylate, n-butyl methacrylate, t-butyl acrylate, t-butyl methacrylate, isobutyl acrylate, isobutyl methacrylate. Alkyl acrylates and alkyl methacrylates having a chain alkyl group such as pentyl acrylate, pentyl methacrylate, stearyl acrylate, stearyl methacrylate, lauryl acrylate, lauryl methacrylate, cyclohexyl acrylate, cyclohexyl methacrylate, cyclohexyl ethylene glycol methacrylate, cyclohexyl dipropylene glycol methacrylate Alkyl acrylates and alkyl methacrylates having a cycloaliphatic group such as methylate, and substituted cyclohexyl acrylates and substituted cyclohexyl methacrylates in which some of the hydrogen atoms of the cyclohexyl groups such as methyl-substituted cyclohexyl acrylates are substituted with alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms , Cyclohexene dimethacrylate, and the like, which can be copolymerized with one or more of the above polymerizable monomers having a phenyl group, alone or in combination of two or more.
着色粒子および無着色粒子の表面に、抗体または抗原と反応しうる基を導入するために、ラジカル重合性の不飽和結合を有する基および抗体または抗原と反応しうる基（例えばカルボキシル基）を分子中に有する重合性酸モノマーとの共重合も可能である。具体例としては、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸などのカルボン酸モノマーを挙げることができる。また、粒子表面に親水性を殖やす目的で、グリシジルメタアクリレートと共重合してもよい。これらは単独または組み合わせて使うことができる。これらの重合性酸モノマーは、上記フェニル基を有する重合性単量体の１種または２種以上、または、アクリレートおよびメタクリレートモノマーの１種または２種以上と共重合してもよい。モノマー部で使用する重合性単量体の総量における、重合性酸モノマーの添加量は、好ましくは０−１０質量％、より好ましくは０−５質量％である。モノマー部で使用する重合性単量体の総量における重合性酸モノマーの添加量が０−０．５質量％である着色粒子および無着色粒子は、表面に存在するカルボキシル基の量が少ないため、化学結合によって抗体または抗原を固定化する方法のみならず、物理吸着によって抗体または抗原を固定化する方法にも使用できる。 In order to introduce a group capable of reacting with an antibody or an antigen onto the surface of a colored particle or an uncolored particle, a group having a radical polymerizable unsaturated bond and a group capable of reacting with an antibody or an antigen (for example, a carboxyl group) are molecules Copolymerization with the polymerizable acid monomer contained therein is also possible. Specific examples include carboxylic acid monomers such as acrylic acid, methacrylic acid, crotonic acid, itaconic acid, fumaric acid and maleic acid. Further, it may be copolymerized with glycidyl methacrylate for the purpose of growing hydrophilicity on the particle surface. These can be used alone or in combination. These polymerizable acid monomers may be copolymerized with one or more of the above-mentioned polymerizable monomers having a phenyl group, or with one or more of acrylate and methacrylate monomers. The addition amount of the polymerizable acid monomer in the total amount of the polymerizable monomer used in the monomer part is preferably 0-10% by mass, more preferably 0-5% by mass. The colored particles and the non-colored particles in which the addition amount of the polymerizable acid monomer in the total amount of the polymerizable monomer used in the monomer part is 0-0.5% by mass, because the amount of carboxyl groups present on the surface is small, Not only the method of immobilizing an antibody or antigen by chemical bonding, but also a method of immobilizing an antibody or antigen by physical adsorption can be used.
１．１．３．着色粒子の色彩
着色粒子は、乳白色の無着色ラテックス粒子を、染料または顔料などを用いて染色または着色することにより製造することができる。染料としては、例えば、スダンオレンジＲ、スダンブルーなどの油性染料、あるいは、オレンジII、コンゴーレッド、アントラゾールＯ、アリザリンレッドＳ、スピリットブルーなどの水溶性あるいはアルコール可溶性の染料を用いることができる。
1.1.3. Color of Colored Particles Colored particles can be produced by dyeing or coloring milky white uncolored latex particles with a dye or pigment. As the dye, for example, oil-based dyes such as Sudan Orange R and Sudan Blue, or water-soluble or alcohol-soluble dyes such as Orange II, Congo Red, Anthrazole O, Alizarin Red S, and Spirit Blue can be used.
着色粒子としては、具体的には、例えば、赤、青、紫のような可視領域に吸収を有する着色粒子が挙げられる。例えば、染料または顔料をラテックスに含芯させることにより、着色粒子を調製することができる。また、同一粒径の粒子において、吸光度の効果を最大に発揮させるために、利用する検出光の波長に合わせて吸収最大の色彩を有する着色粒子を使用することが好ましい。 Specific examples of the colored particles include colored particles having absorption in the visible region such as red, blue, and purple. For example, colored particles can be prepared by incorporating a dye or pigment into the latex. In order to maximize the effect of absorbance in particles having the same particle diameter, it is preferable to use colored particles having the maximum absorption color in accordance with the wavelength of detection light to be used.
例えば、ラテックス免疫診断法に適用可能な測定装置として、日立７０７０、７１５０、７１７０、ＬＰＩＡ−Ａ７００、Ｓ５００他多数の自動分析機が市販されている。これらの分析機は、抗体または抗原を固定化させたラテックスの免疫血清学的凝集反応による反応系の吸光強度、散乱光強度等の光学的特性の変化を測定することによって被測定物質を定量的に検出するものであり、これらの自動分析機の多くが、検出光の波長を６６０ｎｍに設定することができる。 For example, Hitachi 7070, 7150, 7170, LPIA-A700, S500 and many other automatic analyzers are commercially available as measuring devices applicable to latex immunodiagnosis. These analyzers quantitatively determine the substance to be measured by measuring changes in the optical properties such as the light intensity and scattered light intensity of the reaction system due to the immunoserologic agglutination reaction of latex immobilized with antibodies or antigens. Many of these automatic analyzers can set the wavelength of detection light to 660 nm.
検出光の波長を６６０ｎｍに設定することができる自動分析機を用いて免疫反応を検出する場合、６６０ｎｍ近傍に最大吸収を有する赤色ラテックス粒子を使用することが好ましい。６６０ｎｍの波長においては、赤色ラテックス粒子の吸収は無着色粒子の吸収の約２倍以上であるため、赤色ラテックス粒子の使用は、無着色粒子の粒径を２倍大きくした場合と同等の光吸収効果が期待できる。 When detecting an immune reaction using an automatic analyzer capable of setting the wavelength of detection light to 660 nm, it is preferable to use red latex particles having maximum absorption in the vicinity of 660 nm. At the wavelength of 660 nm, the absorption of the red latex particles is about twice or more that of the non-colored particles, so the use of the red latex particles is equivalent to the light absorption when the particle size of the non-colored particles is increased twice. The effect can be expected.
着色粒子は例えば、特開２００４−１４３２１８号公報、特開２００４−１８４２９５号公報、特開平４−３６３３３１号公報、特公平６−０３４０１４号公報、特許第３６３７６９２号に開示された方法により調製することができる。 The colored particles are prepared, for example, by the methods disclosed in JP-A Nos. 2004-143218, 2004-184295, JP-A-4-363331, JP-B-6-034014, and JP-A-3637692. Can do.
１．１．４．着色粒子と無着色粒子の平均粒径の比
本実施形態に係る混合粒子において、無着色粒子の平均粒径に対する着色粒子の平均粒径（無着色粒子の平均粒径／着色粒子の平均粒径）は０．２−５であることが好ましく、０．７−１．３であることがより好ましい。上記平均粒径の比が０．２−５であることにより、粒径の選択の幅が広く、粒子が沈降しにくいため、保存安定性に優れている。
1.1.4. Ratio of average particle diameter of colored particles and non-colored particles In the mixed particles according to this embodiment, the average particle diameter of the colored particles with respect to the average particle diameter of the uncolored particles (average particle diameter of the uncolored particles / average particle diameter of the colored particles) ) Is preferably 0.2-5, more preferably 0.7-1.3. When the ratio of the average particle diameter is 0.2-5, the selection range of the particle diameter is wide and the particles are not easily settled, so that the storage stability is excellent.
本実施形態に係る混合粒子において、着色粒子の平均粒径と、無着色粒子の平均粒径とを等しくすることができる。この場合、着色粒子の持つ特定波長光の吸収増加分が実質的に大粒子の役割を果たす。この場合は、大・小２粒子混合系から来る諸問題を自然にと解決される。 In the mixed particles according to the present embodiment, the average particle diameter of the colored particles and the average particle diameter of the non-colored particles can be made equal. In this case, the increased absorption of the specific wavelength light of the colored particles substantially plays the role of large particles. In this case, the problems arising from the mixed system of large and small two particles can be solved naturally.
上記平均粒径の比が０．２−５の範囲外である場合、一般に用いられている大粒子小粒子併用系と近い混合形態になり、大粒子小粒子併用系において生じる諸問題と同様の問題（例えば、大粒子の沈降による分散性の低下や、大粒子および小粒子の粒径の選択範囲が狭くなること）が生じる欠点がある。 When the ratio of the average particle diameter is out of the range of 0.2-5, it becomes a mixed form similar to the commonly used large particle / small particle combined system, and the same problems as those in the large particle / small particle combined system occur. There are disadvantages that cause problems (for example, a decrease in dispersibility due to settling of large particles and a narrow selection range of particle sizes of large and small particles).
本実施形態に係る混合粒子において、粒子の表面に抗体または抗原を固定化する前に着色粒子と無着色粒子とを混合してもよいし、あるいは、着色粒子および無着色粒子各々の表面に抗体または抗原を固定化してから両粒子を混合してもよい。粒子の免疫反応性を重視する用途においては、抗体または抗原の量を調製しやすい点で、各々の粒子の表面に抗体または抗原を固定化してから両粒子を混合するのが好ましい。 In the mixed particles according to the present embodiment, the colored particles and the non-colored particles may be mixed before the antibody or antigen is immobilized on the surface of the particles, or the antibodies are respectively present on the surfaces of the colored particles and the non-colored particles. Alternatively, both particles may be mixed after immobilizing the antigen. In applications in which the immunoreactivity of particles is important, it is preferable to immobilize the antibody or antigen on the surface of each particle and then mix both particles in order to easily adjust the amount of antibody or antigen.
製造コストを重視する場合に、一工程で固定化を完了したい場合は、着色粒子と無着色粒子とを混合してから抗体または抗原を固定化してもよい。固定化の方法は用途に応じて選択することができる。 In the case where production cost is important, if it is desired to complete immobilization in one step, the antibody or antigen may be immobilized after mixing the colored particles and the non-colored particles. The immobilization method can be selected according to the application.
無着色粒子の表面状態と着色粒子の表面状態とは同一であってもよいし、異なっていてもよい。例えば、着色粒子および無着色粒子の一方に物理吸着により抗体または抗原を固定化し、もう一方に化学結合により抗体または抗原を固定化してもよい。実際の診断用途に応じて適切に選択されるこれらの様式はすべて本発明の範疇に含まれる。 The surface state of the non-colored particles and the surface state of the colored particles may be the same or different. For example, the antibody or antigen may be immobilized on one of the colored particles and the non-colored particle by physical adsorption, and the antibody or antigen may be immobilized on the other by chemical bonding. All these modes appropriately selected according to the actual diagnostic use are included in the scope of the present invention.
２．標的物質の検出方法
本実施形態に係る標的物質の検出方法は、所定の標的物質に対する抗体または抗原が固定化され、平均粒径が０．０３−１μｍである、着色粒子および無着色粒子を含む混合粒子分散液に検体を接触させる工程、および前記接触させる工程により生じた前記混合粒子の凝集を光学的に検出する工程を含む。
2. Target Substance Detection Method The target substance detection method according to the present embodiment includes colored particles and non-colored particles, to which an antibody or antigen against a predetermined target substance is immobilized, and the average particle diameter is 0.03-1 μm. A step of bringing a specimen into contact with the mixed particle dispersion, and a step of optically detecting aggregation of the mixed particles generated by the contacting step.
本実施形態に係る標的物質の検出方法によれば、免疫反応に基づく粒子の凝集を光学的に検出することができる。 According to the method for detecting a target substance according to the present embodiment, particle aggregation based on an immune reaction can be optically detected.
一般的な着色粒子の診断方法においては、クロマトグラフのような粒子と検体とをろ紙上に展開し、免疫反応を目視で判定している。この場合、目視判定しやすいように、着色粒子が一般に使用されている。 In a general method for diagnosing colored particles, particles such as a chromatograph and a specimen are developed on a filter paper, and an immune reaction is visually determined. In this case, colored particles are generally used so that visual determination is easy.
これに対して、本実施形態に係る標的物質の検出方法においては、着色粒子および無着色粒子を含む混合粒子分散液に検体を接触させる工程、および前記接触させる工程により生じた前記混合粒子の凝集を光学的に検出する工程を含むことにより、光学的に最大の吸光度変化を得ることができるため、高感度でかつ広範囲の測定が可能になる。 In contrast, in the method for detecting a target substance according to the present embodiment, the step of bringing a specimen into contact with a mixed particle dispersion containing colored particles and non-colored particles, and the aggregation of the mixed particles caused by the step of contacting By including the step of optically detecting the light, it is possible to obtain the maximum change in absorbance optically, and therefore, high sensitivity and wide range measurement are possible.
この場合、混合粒子の凝集を波長４００−９００ｎｍの光で検出するのが好ましい。ここで、波長４００ｎｍ未満の光を用いて検出を行うと、粒子による吸光度のベースラインが高くなり、有限な測定範囲がベースラインとして無駄に使用され、十分な測定範囲が得られない場合がある。一方、波長９００ｎｍを超える光を用いて検出を行うと、ラテックス凝集による吸光度変化が鈍くなり、高感度検出を行うことができない場合がある。 In this case, it is preferable to detect the aggregation of the mixed particles with light having a wavelength of 400 to 900 nm. Here, if detection is performed using light having a wavelength of less than 400 nm, the baseline of absorbance due to particles becomes high, and a finite measurement range may be used as a baseline, and a sufficient measurement range may not be obtained. . On the other hand, when detection is performed using light having a wavelength exceeding 900 nm, the change in absorbance due to latex aggregation becomes dull, and high-sensitivity detection may not be performed.
波長４００−９００ｎｍの光を用いて検出を行うことができる多くの装置が市販されている。波長４００−９００ｎｍの光を用いて検出を行う装置は信頼性が高く、コストも低いため、好ましい。 Many devices are commercially available that can perform detection using light having a wavelength of 400-900 nm. An apparatus that performs detection using light with a wavelength of 400 to 900 nm is preferable because it has high reliability and low cost.
２．１．抗原または抗体の固定化
着色粒子および無着色粒子の表面に抗原または抗体を固定化する工程は特に限定されないが、例えば、蛋白質の疎水部分と粒子表面のポリマー部に存在する疎水性部位との物理吸着により達成してもよいし、あるいは、抗原または抗体中の反応性基（限定されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基）と、抗原または抗体と反応しうる基との反応による化学結合により達成してもよい。化学結合により着色粒子および無着色粒子の表面に抗原または抗体を固定化する場合、使用する反応基にあわせて適切な触媒、カップリング剤を添加してもよい。例えば、カルボキシル基とアミノ基との反応においては、水溶性カルボジイミド、ハイドロサクシイミドなどを用いてもよい。
2.1. Immobilization of antigen or antibody The process of immobilizing the antigen or antibody on the surface of colored particles and non-colored particles is not particularly limited. For example, the physical properties of the hydrophobic part of the protein and the hydrophobic part present in the polymer part of the particle surface Reaction may be achieved by adsorption or reaction of a reactive group in the antigen or antibody (but not limited to, for example, an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, or a thiol group) with a group capable of reacting with the antigen or antibody. It may also be achieved by chemical bonding. When an antigen or antibody is immobilized on the surface of colored particles and non-colored particles by chemical bonding, an appropriate catalyst or coupling agent may be added according to the reactive group to be used. For example, in the reaction between a carboxyl group and an amino group, water-soluble carbodiimide, hydrosuccinimide, or the like may be used.
物理吸着により抗原または抗体を固定化する方法と、化学結合により抗原または抗体を固定化する方法とは、実際の用途に応じて選択することができる。 The method for immobilizing an antigen or antibody by physical adsorption and the method for immobilizing an antigen or antibody by chemical bonding can be selected according to the actual application.
着色粒子および無着色粒子の表面に固定化する抗原または抗体は、標的物質と特異的に結合する物質である。 The antigen or antibody immobilized on the surface of the colored particles and the non-colored particles is a substance that specifically binds to the target substance.
抗原または抗体としては、例えば、Ｃ反応性蛋白抗体（抗ＣＲＰ抗体）、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ抗原）、抗ＨＢｓ抗体、人絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ抗体）、β２マイクログロブリン、抗ＨＣＧ抗体、ヒトフィブリノーゲン、フェリチン、イムノグロブリンＧ、リウマチ因子（ＲＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、マイコプラズマ抗原、マイコプラズマ抗原、エストロゲン、抗エストロゲン抗体等の免疫学的反応性を有する物質が挙げられる。 Examples of the antigen or antibody include C-reactive protein antibody (anti-CRP antibody), hepatitis B surface antigen (HBs antigen), anti-HBs antibody, human chorionic gonadotropin (HCG antibody), β2 microglobulin, anti-HCG antibody, Examples thereof include substances having immunological reactivity such as human fibrinogen, ferritin, immunoglobulin G, rheumatoid factor (RA), α-fetoprotein (AFP), mycoplasma antigen, mycoplasma antigen, estrogen, and anti-estrogen antibody.
また、抗体としては、免疫グロブリン分子自体の他、例えば、Ｆ（ａｂ’）２のような免疫グロブリン分子の断片であってもよい。 In addition to the immunoglobulin molecule itself, the antibody may be a fragment of an immunoglobulin molecule such as F (ab ') 2.
２．２．標的物質
標的物質としては、例えば、蛋白質、各種抗原または抗体、核酸、核蛋白質、エストロゲン脂質、レセプター、酵素等が挙げられる。酵素としては、例えば、グリコースイソメラーゼ、グリコースオキシターゼ、α−アミラーゼ、パパイン、アミノアシラーゼなどが挙げられる。
2.2. Target substance Examples of the target substance include proteins, various antigens or antibodies, nucleic acids, nuclear proteins, estrogen lipids, receptors, enzymes, and the like. Examples of the enzyme include glycose isomerase, glycose oxidase, α-amylase, papain, aminoacylase and the like.
その他の標的物質としては、例えば、胎児肺細胞、腎細胞、繊維芽細胞等の育成に固体表面を必要とする細胞、ＤＮＡ，ＲＮＡのような核酸またはこれらの一部または断片、核蛋白があげられるが、目的に応じて、これらの物質を修飾したり、その一部に色相、酵素、蛍光体などの標識物質を導入したりすることができる。 Examples of other target substances include cells that require a solid surface for the growth of fetal lung cells, kidney cells, fibroblasts, nucleic acids such as DNA and RNA, or parts or fragments thereof, and nuclear proteins. However, depending on the purpose, these substances can be modified, or a labeling substance such as a hue, an enzyme, or a phosphor can be introduced into a part thereof.
抗原または抗体を固定化した着色粒子および無着色粒子を、目的反応系に適する緩衝液に分散し、検体と接触させ、免疫反応（抗原抗体反応）による粒子凝集を検出することにより、目的の診断を行うことができる。この場合の検体は例えば、血清、血漿、唾液、粘膜、尿、糞など生体から採集できるものであってもよい。 The target diagnosis is achieved by dispersing colored particles and non-colored particles with immobilized antigen or antibody in a buffer solution suitable for the target reaction system, bringing them into contact with the sample, and detecting particle aggregation due to immune reaction (antigen-antibody reaction). It can be performed. The specimen in this case may be one that can be collected from a living body such as serum, plasma, saliva, mucous membrane, urine, feces.
３．標的物質の検出試薬
本発明の一実施形態に係る標的物質の検出試薬は、上記混合粒子を含む。本実施形態に係る標的物質の検出試薬は、適当な検体希釈液で希釈されてもよい。上記検体希釈液としては、ｐＨ５．０−９．０の緩衝液であれば特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が挙げられる。
3. Target Substance Detection Reagent A target substance detection reagent according to an embodiment of the present invention includes the mixed particles. The target substance detection reagent according to the present embodiment may be diluted with an appropriate specimen diluent. The sample dilution solution is not particularly limited as long as it is a buffer solution having a pH of 5.0 to 9.0. For example, a phosphate buffer solution, a glycine buffer solution, a tris buffer solution, a borate buffer solution, a citrate buffer solution, and the like. Is mentioned.
本実施形態に係る標的物質の検出試薬は、例えば、測定感度の向上や、抗原抗体反応の促進のために種々の増感剤を用いてもよい。上記増感剤としては、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース等のアルキル化多糖類；プルラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等が挙げられる。 As the target substance detection reagent according to the present embodiment, for example, various sensitizers may be used for improving measurement sensitivity and promoting antigen-antibody reaction. Examples of the sensitizer include alkylated polysaccharides such as methyl cellulose and ethyl cellulose; pullulan, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyethylene glycol and the like.
本実施形態に係る標的物質の検出試薬は、検体中に存在する他の物質により起こる非特異的凝集反応を抑制するため、または、試薬の安定性を高めるために、アルブミン（牛血清アルブミン、卵性アルブミン）、カゼイン、ブロックエース、ゼラチン等の蛋白質、蛋白質分解物、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、界面活性剤等を含有してもよい。特に、界面活性剤として抗体にダメージを与えないノニオン系界面活性剤、または蛋白質酵素消化促進剤として市販品のＲａｐｉｇｅｓｔ ＳＦ（Ｗａｔｅｒｓ社）などが好ましい。Ｒａｐｉｇｅｓｔ ＳＦの使用により、酵素消化促進のみならず、抗体・抗原反応効率を高め、かつ、非特異反応を抑える効果が得られる。この他に、ＢＳＡと同様の機能を有する合成ポリマー（特にエチレングリコール単位の繰り返し構造単位を有する合成ポリマーなど）を使用してもよい。これらの添加剤の添加濃度は、通常０．０１−１０％である。 The detection reagent for the target substance according to the present embodiment is albumin (bovine serum albumin, egg) in order to suppress non-specific aggregation reaction caused by other substances present in the specimen or to increase the stability of the reagent. Protein), protein such as casein, block ace and gelatin, proteolysate, amino acid, peptide, polypeptide, surfactant and the like. In particular, nonionic surfactants that do not damage antibodies as surfactants, or commercially available Rapigest SF (Waters) as protein enzyme digestion accelerators are preferred. Use of Rapigest SF not only promotes enzyme digestion, but also enhances antibody / antigen reaction efficiency and suppresses non-specific reactions. In addition, a synthetic polymer having the same function as BSA (especially a synthetic polymer having a repeating structural unit of ethylene glycol units) may be used. The concentration of these additives is usually 0.01-10%.
本実施形態に係る標的物質の検出試薬を用いた免疫診断測定においては、従来の濁度を計測する検査機を用いることができる。ラテックス凝集を自動的に追跡できる装置としては、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出できる光学機器が挙げられる。上記凝集の度合いを光学的に測定する方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、凝集の形成を濁度の増加としてとらえる比濁法、凝集の形成を粒度分布または平均粒径の変化としてとらえる方法、凝集の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し、透過光強度との比を比較する積分球濁度法等が挙げられる。上記の測定法においては、異なる時点で少なくとも２つの測定値を得、これらの時点間における測定値の増加分、すなわち、増加速度に基づき凝集の程度を求める速度試験（レートアッセイ）、および、通常は反応の終点と考えられるある時点で１つの測定値を得、この測定値に基づき凝集の程度を求める終点試験（エンドポイントアッセイ）を利用できるが、測定の簡便性、迅速性の点から、比濁法による速度試験が好ましい。 In the immunodiagnostic measurement using the target substance detection reagent according to the present embodiment, a conventional inspection machine for measuring turbidity can be used. Examples of the apparatus that can automatically track latex aggregation include an optical instrument that can detect scattered light intensity, transmitted light intensity, absorbance, and the like. As a method for optically measuring the degree of aggregation, a known method can be used, for example, a turbidimetric method in which the formation of aggregates is regarded as an increase in turbidity, and the formation of aggregates is determined by particle size distribution or average particle size. Examples thereof include a method of capturing as a change, an integrating sphere turbidity method in which a change in forward scattered light due to the formation of aggregates is measured using an integrating sphere, and a ratio with transmitted light intensity is compared. In the above measurement method, at least two measurement values are obtained at different time points, and an increase in the measurement value between these time points, that is, a rate test (rate assay) for determining the degree of aggregation based on the increase rate, and usually Can obtain a single measured value at a certain point considered to be the end point of the reaction, and can use an end point test (endpoint assay) to determine the degree of aggregation based on this measured value. A speed test by the turbidimetric method is preferred.
本実施形態に係る標的物質の検出試薬を用いた免疫診断測定に適する臨床検査自動機としては、例えば、日立７０７０、７１５０、７１７０、ＬＰＩＡ−Ａ７００、Ｓ５００などの市販の自動分析機が挙げられる。 Examples of the clinical laboratory automatic machine suitable for immunodiagnostic measurement using the target substance detection reagent according to the present embodiment include commercially available automatic analyzers such as Hitachi 7070, 7150, 7170, LPIA-A700, and S500.
本実施形態に係る標的物質の検出試薬によれば、上記混合粒子を含有することにより、濁度または吸光度の計測において、検量線の比例領域が広い。 According to the target substance detection reagent of the present embodiment, by containing the mixed particles, the proportional area of the calibration curve is wide in the measurement of turbidity or absorbance.
また、本実施形態に係る標的物質の検出試薬は長期間保存しても、上記混合粒子を再分散させずに、そのまま使用できる。具体的には、実際の臨床診断において、自動測定器の試薬保管庫に試薬を設置してから長期間経過した後であっても、粒子を再分散する必要がない。これにより、臨床診断現場のメンテナンスの手間を省くことができ、結果的にコスト削減を図ることができる。また、本実施形態に係る標的物質の検出試薬中の粒子の分散性が良好であるため、再現性のよい評価結果が得られ、再検率を低下させることができる。 Moreover, the detection reagent for the target substance according to the present embodiment can be used as it is without re-dispersing the mixed particles, even if stored for a long period of time. Specifically, in actual clinical diagnosis, it is not necessary to redisperse particles even after a long period of time has elapsed since the reagent was placed in the reagent storage of the automatic measuring instrument. As a result, it is possible to save labor for maintenance at the clinical diagnosis site, and as a result, cost reduction can be achieved. Moreover, since the dispersibility of the particles in the detection reagent for the target substance according to the present embodiment is good, an evaluation result with good reproducibility can be obtained, and the retest rate can be reduced.
４．実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本実施例において、％および部は、重量基準である。
4). Examples Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples. In this example,% and part are based on weight.
４．１．実施例１
４．１．１．無着色粒子の調製
２Ｌの攪拌機つきガラスフラスコに、イオン交換水１８００ｍｌ、乳化剤としてドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．１ｇ（水中濃度５５ｐｐｍ）、カルボン酸モノマーとしてアクリル酸１ｇ、およびスチレンモノマー２００ｇを入れ、１２０ｒｐｍで攪拌しながら窒素置換をして８０℃に昇温した。８０℃に達した時点で、開始剤（３％過硫酸カリウム水溶液１６ｇ）を添加し、８０℃で５時間の重合を行い、無着色粒子（粒子Ａ白）を得た。
4.1. Example 1
4.1.1. Preparation of uncolored particles In a 2 L glass flask equipped with a stirrer, 1800 ml of ion-exchanged water, 0.1 g of sodium dodecylbenzenesulfonate (55 ppm in water) as an emulsifier, 1 g of acrylic acid as a carboxylic acid monomer, and 200 g of styrene monomer were added, and 120 rpm The mixture was purged with nitrogen while being stirred and heated to 80 ° C. When the temperature reached 80 ° C., an initiator (3% aqueous potassium persulfate solution 16 g) was added, and polymerization was performed at 80 ° C. for 5 hours to obtain non-colored particles (particle A white).
重合開始から５時間後に固形分濃度を測定して重合転化率を測定したところ、重合転化率９８．５％であり、重合液は乳無着色であった。 When the solid content concentration was measured 5 hours after the start of polymerization and the polymerization conversion rate was measured, the polymerization conversion rate was 98.5% and the polymerization solution was uncolored milk.
また、カルボン酸モノマー、開始剤、および乳化剤の濃度を表１のように変量した以外は、上述した方法と同様の方法により、表１に示す無着色粒子（粒子Ｂ−Ｆ白）を得た。 Moreover, the non-colored particle | grains (particle BF white) shown in Table 1 were obtained by the method similar to the method mentioned above except having changed the density | concentration of the carboxylic acid monomer, the initiator, and the emulsifier as shown in Table 1. .
上記工程で得られた粒子Ａ−Ｆ白の粒径を透過型電子顕微鏡（日本電子社製）ＪＥＭ−２０１０Ｆ（型名）で計測した。粒径参照標準は、回折格子レプリカ（回折格子：１ｍｍ／２１６０本型、ボシュロム社製）を使用した。また、表面負荷電量を「ポテンショグラフ７９４ｂａｓｉｃ型」（メトラー社製）により測定した。 The particle size of particles A-F white obtained in the above step was measured with a transmission electron microscope (manufactured by JEOL Ltd.) JEM-2010F (type name). As a particle size reference standard, a diffraction grating replica (diffraction grating: 1 mm / 2160 type, manufactured by Bosch Lomb) was used. Further, the surface load electricity was measured by “potentiograph 794 basic type” (manufactured by METTLER).
各粒子を調製するために使用したモノマー、重合開始剤および乳化剤の組成および各粒子の物性を表１に示す。 Table 1 shows the composition of the monomer, polymerization initiator and emulsifier used to prepare each particle, and the physical properties of each particle.
４．１．２．着色粒子の調製
赤色の油溶性染料「ソルベントレッド２７」（２０℃におけるトルエンへの溶解度８．５ｇ／１００ｍｌ）の濃度２．５質量％のトルエン溶液よりなる染料溶液１質量部に、濃度０．２５質量％のドデシル硫酸ナトリウム水溶液５質量部を加え、超音波分散機「ＵＳ３００型」（日本精機製作所社製）を用いて染料溶液を分散させて、赤色染料エマルジョンを調製した。
4.1.2. Preparation of Colored Particles A red oil-soluble dye “Solvent Red 27” (solubility in toluene at 20 ° C .: 8.5 g / 100 ml) was added to 1 part by weight of a dye solution consisting of a 2.5% by weight toluene solution. 5 parts by mass of a 25% by mass aqueous sodium dodecyl sulfate solution was added, and the dye solution was dispersed using an ultrasonic disperser “US300” (manufactured by Nippon Seiki Seisakusho Co., Ltd.) to prepare a red dye emulsion.
また、青色の油溶性染料「ソルベントブルー１１１」（２０℃におけるトルエンへの溶解度６．１ｇ／１００ｍｌ）を用いて上記と同様の操作により、青色染料エマルジョンを調製した。 A blue dye emulsion was prepared in the same manner as described above using a blue oil-soluble dye “Solvent Blue 111” (solubility in toluene at 20 ° C. 6.1 g / 100 ml).
次に、赤色染料エマルジョンの４２ｇを、固形分１０質量％の粒子Ａ白の分散液２００ｍｌ相当と混合し、１００ｒｐｍで室温にて８時間穏やかに攪拌した。その後、水蒸気蒸留によってトルエンを除去し、蒸留水を用いて遠心沈降で５回洗浄することにより、溶解性ドデシル硫酸ナトリウムおよび過剰の染料を除去して、赤で染色された着色粒子Ａ（以下、「粒子Ａ赤」という。）を調製した。また、青色染料エマルジョンを用いて同様の操作を行い、青で染色された着色粒子Ａ（以下、「粒子Ａ青」という。）を調製した。 Next, 42 g of the red dye emulsion was mixed with the equivalent of 200 ml of a particle A white dispersion having a solid content of 10% by mass, and gently stirred at 100 rpm at room temperature for 8 hours. Thereafter, toluene is removed by steam distillation, and by washing with distilled water five times by centrifugal sedimentation, soluble sodium dodecyl sulfate and excess dye are removed, and colored particles A dyed in red (hereinafter, "Particle A red") was prepared. Further, the same operation was performed using a blue dye emulsion to prepare colored particles A dyed blue (hereinafter referred to as “particle A blue”).
また、同様の操作を粒子Ｂ−Ｆ白についても実施して、赤で染色された着色粒子Ｂ−Ｆ赤および青で染色された着色粒子Ｂ−Ｆ青を調製した。 Further, the same operation was performed on the particles BF white to prepare colored particles BF red dyed with red and colored particles BF blue dyed with blue.
これらの操作によって得られた各粒子の粒径および表面負荷電を、上記４．１．１．に記載された方法にて測定した。また、色彩値を色彩色差計「ＣＲ−２２１型」（コニカミノルタセンシング社製）を用いて測定した。得られた粒子の物性および色彩値を表２に示す。 The particle diameter and surface negative charge of each particle obtained by these operations are the same as those in 4.1.1. It was measured by the method described in 1. The color value was measured using a color difference meter “CR-221 type” (manufactured by Konica Minolta Sensing Co., Ltd.). Table 2 shows the physical properties and color values of the obtained particles.
４．１．３．ラテックス粒子の調製
上記４．１．１．で調製された無着色粒子と、上記４．１．２．で調製された着色粒子とを表３に示す混合比で調製し、試験例１−５に係るラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の物性を表３に示す。
4.1.3. Preparation of latex particles 4.1.1. And uncolored particles prepared in 4.1.2. The colored particles prepared in (1) were prepared at the mixing ratio shown in Table 3, and latex particles according to Test Example 1-5 were obtained. Table 3 shows the physical properties of the obtained latex particles.
４．１．４．化学結合による、ラテックス粒子への抗体の固定化
上記表３に示す試験例１−５に係るラテックス粒子をそれぞれ、１／１５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍｌおよび生理食塩水１０ｍｌの混合液（以下ＰＢＳと記す）に、該粒子の濃度が１質量％になるように分散させた。
4.1.4. Immobilization of antibody to latex particles by chemical bonding Each of the latex particles according to Test Example 1-5 shown in Table 3 above was mixed with 10 ml of 1/15 M phosphate buffer (pH 7.2) and 10 ml of physiological saline. The particles were dispersed in a liquid (hereinafter referred to as PBS) so that the concentration of the particles was 1% by mass.
次に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同仁化学）を、最終濃度が０．０５％となるように添加した。これらの粒子分散液に抗ＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白）抗体（ウサギ）の１ｍｇ／ｍｌ液をそれぞれ等量加え、５６℃で３時間ゆっくり回転しながら、抗体（抗ＣＲＰ抗体）を粒子表面に固定化した。その後、それぞれの粒子分散液に１％ＢＳＡ／０．０５％Ｒａｐｉｇｅｓｔ ＳＦ ０．５ｍｌを加え、室温で１０時間ゆっくり回転攪拌した。これらの操作後、粒子分散液を遠心管に移し替え、１０，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離して、粒子を沈殿として回収し、未反応の抗体およびＷＳＣ等が含まれる上澄を除去した。続いて、ｐＨ７．４の５０ｍＭのトリス緩衝液に該粒子を再懸濁させ、超音波で１０分間分散させた。この操作を２回繰り返し、最終的に粒子を超音波分散させ、０．８μｍディスクフィルターに通してから、１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液／０．０２％ＢＳＡ／０．０１％ポリビニルピロリドン（分子量３６万）溶液で粒子固形分が０．０５％となるように調製し、それぞれの粒子を用いて抗ＣＲＰ抗体固定化ラテックス分散液を得た。 Next, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (Dojindo Laboratories) was added to a final concentration of 0.05%. Add equal amounts of 1 mg / ml anti-CRP (C-reactive protein) antibody (rabbit) to each of these particle dispersions, and fix the antibody (anti-CRP antibody) on the particle surface while rotating slowly at 56 ° C for 3 hours. Turned into. Thereafter, 0.5 ml of 1% BSA / 0.05% Rapigest SF was added to each particle dispersion, and the mixture was slowly rotated and stirred at room temperature for 10 hours. After these operations, the particle dispersion was transferred to a centrifuge tube and centrifuged at 10,000 rpm for 20 minutes to collect the particles as a precipitate, and the supernatant containing unreacted antibody and WSC was removed. Subsequently, the particles were resuspended in 50 mM Tris buffer at pH 7.4 and dispersed with ultrasound for 10 minutes. This operation is repeated twice. Finally, the particles are ultrasonically dispersed and passed through a 0.8 μm disk filter, and then a 10 mM PBS buffer / 0.02% BSA / 0.01% polyvinylpyrrolidone (molecular weight 360,000) solution. The particle solid content was adjusted to 0.05% and an anti-CRP antibody-immobilized latex dispersion was obtained using each particle.
これらのラテックス分散液につき、ＣＲＰ抗原標準液を用いて検量線を作成して、ラテックス診断薬としての性能を評価した。
装置：日立 ７０２０型自動分析装置
使用波長：５７０ｎｍ、または６６０ｎｍ、測定温度３７℃
被検査物質（０−１００ｍｇ／ｄｌのＣＲＰ標準液）：３μｌ
第１試薬（牛血清アルブミン０．１％を含むＰＢＳ）：２００μｌ
第２試薬（ラテックス分散液）：２００μｌ
For these latex dispersions, a calibration curve was prepared using a CRP antigen standard solution to evaluate the performance as a latex diagnostic agent.
Equipment: Hitachi 7020 automatic analyzer
Use wavelength: 570 nm or 660 nm, measurement temperature 37 ° C.
Substance to be inspected (0-100 mg / dl CRP standard solution): 3 μl
First reagent (PBS containing 0.1% bovine serum albumin): 200 μl
Second reagent (latex dispersion): 200 μl
測定には、被検査物質、第１試薬、第２試薬を混合攪拌した後、５０秒経過時と２００秒経過時の濁度の差（変化量）を計測するレートアッセイ法にて検量線を作成した。化学結合により抗体が固定化されたラテックス粒子を表４に示す。 For the measurement, after mixing the substance to be inspected, the first reagent, and the second reagent, a calibration curve is measured by a rate assay method that measures the difference (change) in turbidity between 50 seconds and 200 seconds. Created. Table 4 shows latex particles on which the antibody was immobilized by chemical bonding.
粒子Ｂ赤または粒子Ｂ青ならびに粒子Ｃ赤または粒子Ｃ青についても、上記粒子Ａ赤または粒子Ａ青を用いた場合と同様の操作を実施した。その結果、粒子Ｂ赤または粒子Ｂ青を用いたラテックス混合粒子ならびに粒子Ｃ赤または粒子Ｃ青を用いたラテックス混合粒子は、粒子Ａ赤または粒子Ａ青を用いたラテックス混合粒子と同様に、粒子Ｂ白のみまたは粒子Ｃ白のみを使用したラテックス粒子と比較して、少なくとも倍以上の低値感度が得られた。 For particle B red or particle B blue and particle C red or particle C blue, the same operation as in the case of using particle A red or particle A blue was performed. As a result, latex mixed particles using particle B red or particle B blue and latex mixed particles using particle C red or particle C blue are similar to latex mixed particles using particle A red or particle A blue. Compared with latex particles using only B white or only particle C white, a low value sensitivity at least twice as high was obtained.
４．１．５．物理結合による、ラテックス粒子への抗体の固定化
表２に示す粒子Ｄ青および粒子Ｄ赤についても、上記４．１．３と同様の方法にて、試験例６−８に係るラテックス粒子をそれぞれ調製した。得られたラテックス粒子の物性を表５に示す。
4.1.5. Immobilization of antibodies on latex particles by physical bonding For the particle D blue and particle D red shown in Table 2, latex particles according to Test Example 6-8 were respectively prepared in the same manner as in 4.1.3. Prepared. Table 5 shows the physical properties of the obtained latex particles.
得られた粒子を１／１５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍｌと生理食塩水１０ｍｌの混合液（以下ＰＢＳと記す）に、粒子の濃度が１質量％になるように分散させた。次に、抗ＣＲＰ抗体（ウサギ）の１ｍｇ／ｍｌ液をそれぞれ等量加え、５６℃で３時間ゆっくり回転しながら、抗体（抗ＣＲＰ抗体）を粒子表面に固定化した。その後、それぞれの粒子分散液に１％ＢＳＡ／０．０５％Ｒａｐｉｇｅｓｔ ＳＦ ０．５ｍｌを加え、室温で１０時間ゆっくり回転攪拌した。これらの操作後、粒子分散液を遠心管に移し替え、１０，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、粒子を沈殿として回収し、未反応の抗体およびＷＳＣ等が含まれる上澄を除去した。続いて、ｐＨ７．４の５０ｍＭのトリス緩衝液に該粒子を再懸濁させ、超音波で１０分間分散させた。この操作を２回繰り返し、最終的に粒子を超音波分散させ、０．８μｍディスクフィルターに通してから、１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液／０．０２％ＢＳＡ／０．０１％ポリビニルピロリドン（分子量３６万）溶液において粒子固形分が０．０５％となるように調製することにより、物理結合により固定化された抗ＣＲＰ抗体固定化ラテックス粒子の分散液を得た。 The obtained particles were dispersed in a mixture of 10 ml of 1/15 M phosphate buffer (pH 7.2) and 10 ml of physiological saline (hereinafter referred to as PBS) so that the concentration of the particles was 1% by mass. Next, 1 mg / ml solution of anti-CRP antibody (rabbit) was added in an equal amount, and the antibody (anti-CRP antibody) was immobilized on the particle surface while slowly rotating at 56 ° C. for 3 hours. Thereafter, 0.5 ml of 1% BSA / 0.05% Rapigest SF was added to each particle dispersion, and the mixture was slowly rotated and stirred at room temperature for 10 hours. After these operations, the particle dispersion was transferred to a centrifuge tube and centrifuged at 10,000 rpm for 20 minutes to collect the particles as a precipitate, and the supernatant containing unreacted antibody and WSC was removed. Subsequently, the particles were resuspended in 50 mM Tris buffer at pH 7.4 and dispersed with ultrasound for 10 minutes. This operation is repeated twice. Finally, the particles are ultrasonically dispersed and passed through a 0.8 μm disk filter, and then a 10 mM PBS buffer / 0.02% BSA / 0.01% polyvinylpyrrolidone (molecular weight 360,000) solution. Was prepared so that the particle solid content was 0.05%, whereby a dispersion of anti-CRP antibody-immobilized latex particles immobilized by physical bonding was obtained.
これらのラテックス粒子の分散液につき、ＣＲＰ抗原標準液を用いて検量線を作成して、免疫診断用試薬としての性能を評価した。その結果を表６に示す。 For these latex particle dispersions, a calibration curve was prepared using a CRP antigen standard solution, and the performance as an immunodiagnostic reagent was evaluated. The results are shown in Table 6.
また、粒子Ｅ赤または粒子Ｅ青ならびに粒子Ｆ赤または粒子Ｆ青についても同様に行った結果、表６に示す結果と同様の結果が得られた。 Moreover, as a result of carrying out similarly about particle | grain E red or particle | grain E blue, and particle | grain F red or particle | grain F blue, the result similar to the result shown in Table 6 was obtained.
４．１．６．抗体固定化粒子の調製
試験例１のラテックス粒子（無着色：表１の粒子Ａ白）および試験例４のラテックス混合粒子（赤色）についてそれぞれ、上記４．１．４に記載された方法によって抗体を固定化して、抗体固定化ラテックス粒子を調製した。
4.1.6. Preparation of antibody-immobilized particles The latex particles of Test Example 1 (uncolored: Particle A white in Table 1) and the latex mixed particles (Red) of Test Example 4 were each prepared by the method described in 4.1.4 above. Were immobilized to prepare antibody-immobilized latex particles.
次に、上記各粒子の１質量％分散液を１：１で混合して、試験例９に係るラテックス混合粒子（粒子Ａ白：粒子Ａ赤＝９：１）を得た。試験例９に係るラテックス混合粒子について、上記４．１．４に記載された方法と同様の方法にて評価を行い、表７に示す結果を得た。 Next, the 1% by mass dispersion of each particle was mixed at 1: 1 to obtain latex mixed particles (particle A white: particle A red = 9: 1) according to Test Example 9. The latex mixed particles according to Test Example 9 were evaluated in the same manner as described in 4.1.4 above, and the results shown in Table 7 were obtained.
表１−表７に示すように、本実施例に係るラテックス混合粒子によれば、所定の標的物質に対する抗体または抗原が固定化され、平均粒径が０．０３−１μｍである、着色粒子および無着色粒子を含有することにより、高感度で測定範囲が広く、かつ、長期保存中の粒子の凝集が少ないことが理解できる。 As shown in Table 1 to Table 7, according to the latex mixed particles according to this example, colored particles having an antibody or an antigen against a predetermined target substance immobilized and an average particle size of 0.03-1 μm, and By containing non-colored particles, it can be understood that the measurement range is high with a high sensitivity, and the aggregation of particles during long-term storage is small.
Claims (7)
前記接触させる工程により生じた前記混合粒子の凝集を光学的に検出する工程を含み、
前記着色粒子および前記無着色粒子はそれぞれ、所定の標的物質に対する抗体または抗原が固定化され、かつ、平均粒径が０．０３−１μｍである、標的物質の検出方法。 A step of contacting a specimen with a mixed particle dispersion containing colored particles and non-colored particles, and a step of optically detecting agglomeration of the mixed particles caused by the contacting step,
The method for detecting a target substance, wherein the colored particles and the non-colored particles are each immobilized with an antibody or an antigen against a predetermined target substance and have an average particle diameter of 0.03-1 μm.
前記検出する工程において、前記混合粒子の凝集を波長４００−９００ｎｍの光で検出する、標的物質の検出方法。 In claim 1,
In the detection step, a target substance detection method in which aggregation of the mixed particles is detected with light having a wavelength of 400 to 900 nm.
前記混合粒子に占める前記着色粒子の含有量が３−９５質量％である、標的物質の検出方法。 In claim 1 or 2,
The method for detecting a target substance, wherein the content of the colored particles in the mixed particles is 3-95% by mass.
前記着色粒子の粒径の変動係数および前記無着色粒子の粒径の変動係数がそれぞれ２０％以下である、標的物質の検出方法。 In any of claims 1 to 3,
A method for detecting a target substance, wherein the variation coefficient of the particle size of the colored particles and the variation coefficient of the particle size of the non-colored particles are each 20% or less.
前記無着色粒子の平均粒径に対する前記着色粒子の平均粒径の比が０．２−５である、標的物質の検出方法。 In any of claims 1 to 4,
The method for detecting a target substance, wherein a ratio of an average particle diameter of the colored particles to an average particle diameter of the non-colored particles is 0.2-5.
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