JP4847038B2 - ラクトバチルス・パラカゼイの新規微生物株gm−080及びアレルギー関連疾患を処置するためのその使用 - Google Patents
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Description
(a)形態学的特性
(1)細胞の形状及びサイズ:MRSブロス中37℃で一晩培養された後に顕微鏡で観察された場合に、縁が丸い棒状の形状を有する桿菌。
(2)運動性:運動型
(3)鞭毛:なし
(4)胞子形成:胞子形成なし
(5)グラム染色:陽性
(1)培地:MRSブロス(DIFCO(商標)0881)、最終pH6.5±0.2
(2)培養条件:37℃の嫌気的又は好気的培養
(3)抗生物質耐性:アンピシリン100μg/mL
(1)カタラーゼ:ポジティブ
(2)オキシダーゼ:ネガティブ
(3)API 50 CHL試験:API 50 CHL系は、乳酸菌の同定に使用する。一連の酵素の応答をアッセイすることにより、当該乳酸の特性が確立される。GM-080のAPI 50 CHL試験結果を表1に列記する。
GM-080の16s rDNA配列解析を決定する。結果は、GM-080が他のラクトバチルス・パラカゼイ株と高度に相同であることを示す(図2に示すとおり)。更に、距離の系統樹を図3に示す。また、ランダム増幅多型DNA(RAPD解析)を実施した。それは、GM-080がラクトバチルス・パラカゼイに属しているが、特定の16s rDNA配列を有することを示している。上記のことを考慮すると、GM-080は新規なラクトバチルス・パラカゼイ株である。
GM-080の細胞壁タンパク質は、他の常用のラクトバチルス・パラカゼイ株と比較した場合、同様のパターンを示す。GM-080の細胞壁タンパク質のSDS−PAGEパターンを図4に示す。
微生物を同定するための標準的な検出系は、2003年5月29日に出願された米国特許出願番号第10/446,781号に開示されており、これは、同定のためのマーカーとして所定の微生物を用いて、又は用いずに試験細胞系を培養した遺伝子発現の差異を用いる。試験した遺伝子を表2に列記する。
−:遺伝子発現が2倍低下
試料:内視鏡で採取したヒトの胃、腸又は十二指腸の組織片を、100μg/mLアンピシリンを含有している2mLのラクトバチルスMRSブロス(DIFCO(商標)0081)中37℃で約2日間培養した。当該ブロスをCaCO3含有MRSアガー上にプレーティングし、そして37℃で2日間インキュベートした。当該プレート上で生育する単一のコロニーを選択し、そしてグラム染色にかけた。グラム陽性細菌を続いて選択した。当該株の全てをラクトバチルスMRSブロス中37℃で定常期まで培養し、そして3000gで15分間遠心することにより回収し、そして1mLのPBS(リン酸緩衝食塩水、pH7.2)中で再懸濁し、そして次に95℃で30分間加熱し、そして続いてオートクレーブにかけ、そしてPBS中−20℃で保存した。
−30μLの2.5μg/mLの精製したマウス抗ヒトIFN-γ抗体(カタログ番号18181D, PharMingen(商標), USA)を10mLのコーティング緩衝液(0.1MのNa2HPO4、pH9.0)に添加し、そして100μLの抗体溶液をELISAプレートの各ウェルに添加する段階;
−プレートを4℃で振とうする段階;
−プレートの各ウェルを洗浄緩衝液(0.05%のTween 20/PBS)を洗浄する段階;
−300μLのブロッキング緩衝液(1%BSA/PBS)をプレートの各ウェルに添加する段階;
−プレートを室温で少なくとも2時間振とうする段階;
−脾細胞試料の100μLの上清をプレートの各ウェルに添加する段階;
−プレートを4℃で一晩振とうする段階;
−プレートの各ウェルを洗浄緩衝液で洗浄する段階;
−150μLのビオチンマウス抗ヒトIFN-γ抗体(カタログ番号18112D, PharMingen(商標), USA)をプレートの各ウェルに添加する段階;
−プレートを室温で1時間インキュベートする段階;
−プレートの各ウェルを洗浄緩衝液で洗浄する段階;
−希釈緩衝液で希釈した150μLのストレプトアビジン−AKP(1:1000)をプレートの各ウェルに添加する段階;
−プレートを1時間室温で振とうする段階;
−プレートの各ウェルを洗浄緩衝液で8回洗浄する段階;
−200μLの基質pNppをプレートの各ウェルに添加する段階;
−前記基質反応が完了するまでプレートを室温でインキュベートする段階;
−プレートの各ウェルの405nmの吸光度(すなわちOD405)を測定する段階、
を含んで成る。
DNA抽出:GM-080及び他の細菌、CCRC12913、CCRC14001及びCCRC16100のゲノムDNAが、QIAamp(商標)Stool Mini Kit (Qiagen(商標)、カタログ番号51504)を用いて抽出された。精製は、以下に列記したような段階に従い実施した:
−1.4mLのABS緩衝液を培地に添加し、そしてそれいを1分間ボルテックスにかける段階;
−先の段階で得られた溶液を70℃で5分間加熱する段階;
−当該溶液を約15秒間ボルテックスにかけ、そして次にそれを約13,000rpmで1分間遠心する段階;
−上清を新しい遠心管に移す段階;
−上清にInhibitExタブレットを添加し、そしてそれを振とうして当該タブレットを溶解させ、そして次に室温で1時間インキュベートする段階;
−溶液を約13,000rpmで3分間遠心して細菌をInhibitExに付着させる段階;
−上清を新しい遠心管に移し、そして次に約13,000rpmで3分間遠心する段階;
−200μLの上清を新しい遠心管に移し、そしてプロテアーゼKを添加する段階;
−200μLの緩衝液ALを添加し、そしてそれを15分間ボルテックスにかけて均質溶液を得る段階;
−15μLのプロテアーゼKを前記均質溶液に添加し、そしてそれを15秒間ボルテックスにかける段階;
−当該溶液を70℃で10分間インキュベートする段階;
−200μLの96〜100%エタノールを添加してボルテックスにかける段階;
−溶液をQIAampスピンカラムに移し、そしてそれを約13,000rpmで1分間遠心する段階;
−QIAampスピンカラムを新しい遠心管に移し、そして500μLの緩衝液AW1を添加し、そして次にそれを約13,000rpmで1分間遠心する段階;
−QIAampスピンカラムを新しい遠心管に移し、そして500μLの緩衝液AW2を添加し、そして次にそれを約13,000rpmで1分間遠心する段階;
−QIAampスピンカラムを新しい遠心管に移し、そして200μLの緩衝液AEを添加し、そして次にそれを室温で1分間インキュベートする段階;
−約13,000rpmで1分間遠心してDNAを溶出する段階、
を含んで成る。
GM-080、ラクトバチルス・パラカゼイATCC 25598, 25302, 335, 11582,及び27216のDNA抽出は、実施例2に記載のように実施した。
細胞壁タンパク質は、Angelisにより説明されている方法(Angelis, M.D., Corsetti, A., Tosti, N., Rossi, J.,. Corbo, M. R., and Gobbetti, M. (2001) Characterization of Non-starter Lactic acid bacteria (NSLAB) from Italian ewe cheeses based on phenotypic, genotipic, cell-wall protein analyses. Appl. Environ Microbiol. 2001; 67: 2011-2020)に従い精製された。MRSブロス(Difco(商標))中で一晩培養した細胞は収集し、そして次に0.1M CaCl2含有0.05M Tris−HCl(pH7.5)で2回洗浄し、そして1.0mlの同一の緩衝液中で10.0のOD600に再懸濁した。8,000xgでの5分間の遠心の後、細胞壁タンパク質は、0.01M EDTA、0.01M NaCl、及び2%(wt/vol)SDSを含有する1.0mlの抽出緩衝液(pH8.0)を用いてペレットから抽出した。懸濁液を室温で60分間保存し、100℃で5分間加熱し、そして11,600xgで10分間4℃で遠心した。上清を12%SDS−PAGEで解析し、そしてクーマシーブルーで染色した。
刺激:ジャーカット細胞は、新しい培地を添加することによってリフレッシュされ、そして16時間培養された。次に、細胞を2つの群に分け、一方を乳酸菌を含む培養液とし、そして他方を乳酸菌を含まない培養液とした。細胞濃度が1x107/10mLに達したとき、細胞は、1x107の異なる乳酸菌(CCRC12193, GM-080又はCCRC12188)を用いて、又は用いずに24時間刺激された。刺激後、細胞を回収し、PBSで2回洗浄し、そしてRNA単離に使用した。
Caco-2細胞を本実施例の上皮細胞として採用した。Caco-2細胞は、機能的な微絨毛を有し、且つその上に加水分解酵素を付着させており、それは腸の成熟上皮細胞の分化した形態及び機能をin vitroで示した。
酸:一晩培養したGM-080、L.プランタラム(plantarum)、L.アシドフィラス(acidophilus)、L.カゼイ(casei)、及びL.バルガリカス(bulgarcus)に、2.0、2.5、そして3.2の異なるpH値を有する9mLのPBSを添加し、そして次にこれを更に37℃で3時間培養した。培養後、1mLの細胞を9mLのpH7.4のPBSで連続希釈した。酸処理前後の細胞数を推計し、そして下文の表4において列記するように示した。
動物:雌のBALB/cマウスを台湾のNational Laboratory Animal Centerから入手し、そして光と温度が共に制御された部屋で2週間飼育した。
Der p 5特異的IgG及びIgEの決定:最後の吸入誘発から18時間後、500μLの血液試料を尾から採取した。血液試料を室温で1時間維持し、そして次に遠心にかけた。血清を−80℃で保存した。Der p5特異的IgG2a、及びIgEの量をELISAで決定した。96ウェルのタンパク質高結合プレートを、コーティング緩衝液(0.1M NaHCO3、pH9.6)中10μg/mLの濃度に希釈した200μLの精製Der p 5でコーティングした。4℃で一晩インキュベーションした後、プレートをPBS−Tween20で洗浄し、そしてこれに300μLのブロッキング緩衝液(3%BSA)を添加した。2時間室温で振とうした後、プレートを再びPBS−Tween20で洗浄した。血清は1:10希釈でIgG測定に使用し、そして1:4希釈でIgE測定に使用した。試料を室温で2時間振とうした。一晩4℃でインキュベーションした後、プレートをPBS−Tween20で洗浄し、そしてこれに200μLのビオチン化ラット抗マウスIgEモノクローナル抗体、又はラット抗マウスIgG mAbを添加した。試料を室温で2時間振とうし、そして次にPBS−Tween20で洗浄した。200μLのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ(1:1000)を続いて添加し、そしてこの試料を室温で1時間振とうした。6回洗浄した後、呈色反応を200μLのホスファターゼ基質であるp−ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム塩(pNPP)(Sigma(商標)N-2770, USA)の添加で開始した。プレートはマイクロプレートオートリーダー(Metertech(商標)、台湾)において405nmで読み取った。
試料の調製:感作から18時間後、気管開口術を介して導入したポリエチレンチューブを通じて、0.9%滅菌生理食塩水の5x0.5mlアリコートでマウスを洗浄した。洗浄液を遠心し(500gで10分間、4℃)、そして細胞のペレットを1mlのPBS溶液中で再懸濁した。分化細胞の計数は、Leu染色で染色したサイトスピン調製物で行った。
試料の調製:感作の24時間後、気管開口術を介して導入したポリエチレンチューブを通じて、0.9%滅菌生理食塩水の5x0.5mlアリコートでマウスを洗浄した。洗浄液を遠心し(500gで10分間、4℃)、そして上清を実施例1に記載のようにIFN−γ定量解析にかけた。
不活性GM-080の調製:凍結乾燥したGM-080粉末を蒸留水中で懸濁し、そしてマウスに給餌する前にオートクレーブにかけた(121℃、15分)。
Claims (9)
- CCTCC (the China Cernter for Type Culture Collection)にCCTCC番号:CCTCC M 204012で寄託された、単離された微生物株ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)GM-080。
- 請求項1に記載の微生物株を含んで成る組成物。
- IFN−γ分泌を刺激するために使用される、請求項2に記載の組成物。
- アレルギー関連疾患を処置するために使用される、請求項2に記載の組成物。
- アレルギー関連疾患が炎症である、請求項4に記載の組成物。
- アレルギー関連疾患がエアロアレルゲンに対する曝露と関連している、請求項4に記載の組成物。
- 微生物株が生きているか、あるいは失活している、請求項2に記載の組成物。
- 微生物株が失活している、請求項7に記載の組成物。
- 医薬組成物、栄養補助食品、食品、健康食品、又はそれらの成分の形態の、請求項2に記載の組成物。
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