JP4844161B2

JP4844161B2 - Cell electrophysiological sensor, measuring method using the same, and manufacturing method thereof

Info

Publication number: JP4844161B2
Application number: JP2006046548A
Authority: JP
Inventors: 聡一郎平岡; 将也中谷; 浩司牛尾; 章義大島
Original assignee: Panasonic Corp; Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp; Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2006-02-23
Filing date: 2006-02-23
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2026-02-23
Also published as: JP2007225425A

Description

本発明は、細胞の細胞外電位あるいは細胞の活動に発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞電気生理センサとそれを用いた測定方法およびその製造方法に関するものである。 The present invention relates to a cell electrophysiological sensor used for measuring a physicochemical change occurring in an extracellular potential of a cell or a cell activity, a measuring method using the same, and a manufacturing method thereof.

従来の、細胞の電気的活動を指標にして細胞膜に存在するイオンチャネルの機能を解明したり、薬品をスクリーニング（検査）したりする方法として、パッチクランプ法が挙げられる。 As a conventional method for elucidating the function of an ion channel existing in a cell membrane by using the electrical activity of a cell as an index or screening (inspecting) a drug, a patch clamp method can be mentioned.

このパッチクランプ法は、マイクロピペットの先端部分で細胞膜の微小部分（パッチという）を軽く吸引し、マイクロピペットに設けた微小電極プローブを用いて、パッチを横切る電流を、固定（クランプ）した膜電位のもとで測定するものである。そしてこれにより、パッチに存在する一個または少数個のイオンチャネルの開閉の様子を電気的に記録することができるものである。そしてこれは、細胞の生理機能をリアルタイムで調べることのできる数少ない方法の一つである。 In this patch clamp method, a small part of a cell membrane (referred to as a patch) is gently aspirated with the tip of the micropipette, and the membrane potential is obtained by fixing (clamping) the current across the patch using a microelectrode probe provided on the micropipette. Is measured under As a result, the state of opening and closing of one or a small number of ion channels present in the patch can be electrically recorded. This is one of the few methods that can examine the physiological functions of cells in real time.

しかし、パッチクランプ法はマイクロピペットの作成および操作に特殊な技術・技能を必要とし、一つの試料の測定に多くの時間を要することから、大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングする用途には適していない。 However, the patch clamp method requires special techniques and skills to create and operate a micropipette, and it takes a lot of time to measure a single sample. Therefore, it is suitable for screening a large number of drug candidate compounds at high speed. Not.

このため、近年微細加工技術を利用した平板型の微小電極プローブの開発がなされており、これは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。 For this reason, in recent years, a flat-plate microelectrode probe utilizing microfabrication technology has been developed, which is suitable for an automated system that does not require the insertion of a micropipette for each cell.

下記特許文献１では、細胞保持基板に複数の貫通孔を設け、この貫通孔の開口部に被験体細胞を接着させ、貫通孔の下方に配置した第２電極で、被験体細胞の電位依存性のイオンチャネル活性を測定する技術を開示している。 In the following Patent Document 1, a plurality of through holes are provided in a cell holding substrate, a subject cell is adhered to an opening of the through hole, and the second electrode disposed below the through hole is used to determine the potential dependence of the subject cell. Discloses a technique for measuring the ion channel activity.

下記非特許文献１では、シリコン酸化物製の細胞保持基板（ｍｅｍｂｒａｎｅ）の内部に２．５μｍの貫通孔（ｈｏｌｅ）を形成し、この貫通孔にヒト培養細胞株の一種であるＨＥＫ２９３細胞を保持させて高い密着性を確保して高精度に細胞外電位を測定する技術を開示している。 In Non-Patent Document 1 below, a 2.5 μm through hole is formed inside a silicon oxide cell holding substrate, and HEK293 cells, a type of human cultured cell line, are held in this through hole. A technique for ensuring high adhesion and measuring extracellular potential with high accuracy is disclosed.

図１３は、下記特許文献２で開示された細胞電気生理センサ１を示し、細胞保持基板２と、この細胞保持基板２上面に形成された凹部３と、この凹部３の下部から細胞保持基板２の下面まで貫通する貫通孔４と、細胞保持基板２の上方に配置された第１電極５と、前記貫通孔４の内部に配置された第２電極６とを備えている。 FIG. 13 shows a cell electrophysiological sensor 1 disclosed in Patent Document 2 below, and includes a cell holding substrate 2, a recess 3 formed on the upper surface of the cell holding substrate 2, and a cell holding substrate 2 from the lower part of the recess 3. A through hole 4 penetrating to the lower surface of the cell, a first electrode 5 disposed above the cell holding substrate 2, and a second electrode 6 disposed inside the through hole 4.

またこの第２電極６は、配線７を経て信号検出部に連結されている。そして上記細胞保持基板２は、ウエル８内部に配置されている。 The second electrode 6 is connected to the signal detection unit via the wiring 7. The cell holding substrate 2 is disposed inside the well 8.

上記細胞電気生理センサ１の動作方法について以下に説明する。 The operation method of the cell electrophysiological sensor 1 will be described below.

まず、ウエル８内に細胞および電解液１０が注入され、細胞が凹部３によってトラップ（捕捉）され、保持される。この凹部３に保持された細胞を以下被験体細胞９という。 First, the cells and the electrolyte solution 10 are injected into the well 8, and the cells are trapped (captured) by the recess 3 and held. The cells held in the recess 3 are hereinafter referred to as subject cells 9.

そして、測定の際には被験体細胞９は貫通孔４の下方から吸引ポンプなどで吸引され、貫通孔４の開口部に密着した状態で保持される。すなわち、この貫通孔４がガラスピペットにおける先端穴と同様の役割を果たしている。そして被験体細胞９のイオンチャネルの機能性や薬理反応などは、第１電極５と第２電極６との間における反応前後の電圧、あるいは電流を測定し、細胞内外の電位差を求めることによって分析している。
特表２００２−５１８６７８号公報国際公開第０２／０５５６５３号パンフレットＴ．Ｓｏｒｄｅｌｅｔａｌ，ＭｉｃｒｏＴｏｔａｌＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍｓ２００４，Ｐ５２１〜５２２（２００４） During measurement, the subject cell 9 is sucked from below the through hole 4 with a suction pump or the like, and is held in close contact with the opening of the through hole 4. That is, the through hole 4 plays the same role as the tip hole in the glass pipette. The functionality or pharmacological reaction of the ion channel of the subject cell 9 is analyzed by measuring the voltage or current before and after the reaction between the first electrode 5 and the second electrode 6 and determining the potential difference inside and outside the cell. is doing.
JP 2002-518678 Gazette International Publication No. 02/055653 Pamphlet T.A. Sordel et al, Micro Total Analysis Systems 2004, P521-522 (2004)

前述のように、従来の細胞電気生理センサ１は、細胞保持基板２の下面側からの吸引によって被験体細胞９を引き付け、凹部３にトラップし、保持するものである。そしてこの凹部３は、細胞保持基板２上面に、所定間隔をおいて複数個配置されているものである。 As described above, the conventional cell electrophysiological sensor 1 attracts the subject cell 9 by suction from the lower surface side of the cell holding substrate 2 and traps and holds the subject cell 9 in the recess 3. A plurality of the recesses 3 are arranged on the upper surface of the cell holding substrate 2 at a predetermined interval.

しかし、このような従来の細胞電気生理センサ１では、ウエル８内に大量の細胞を注入しておく必要があった。 However, in such a conventional cell electrophysiological sensor 1, it is necessary to inject a large amount of cells into the well 8.

それは、細胞保持基板２の上面において、隣接する凹部３と凹部３との間には平面が介在しており、多くの細胞は下方から吸引されると、この平面に着地し積層してしまい、少量の細胞では凹部３へのトラップ率が低いためである。 That is, on the upper surface of the cell holding substrate 2, a plane is interposed between the adjacent recesses 3 and the recesses 3, and when many cells are sucked from below, they land on this plane and are stacked. This is because a small amount of cells has a low trapping rate in the recess 3.

特に付着性の高い細胞を被験体として用いた場合、細胞は細胞保持基板２の平面部分に付着して離れず、凹部３にトラップされ難いことから、この問題は顕著であった。 In particular, when highly adherent cells were used as the subject, this problem was significant because the cells did not adhere to the planar portion of the cell holding substrate 2 and were not easily trapped in the recess 3.

そこで本発明は、凹部３における細胞のトラップ率を向上させ、少量の細胞で検査処理を可能とすることを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to improve the cell trap rate in the recess 3 and to enable inspection processing with a small amount of cells.

上記課題を解決するため本発明は、細胞保持基板と、この細胞保持基板の上方に配置した第１電極槽と、この第１電極槽の内部に配置した第１電極と、細胞保持基板の下方に配置した第２電極槽と、この第２電極槽の内部に配置した第２電極とを備えている。そして、細胞保持基板の上面には複数の凹部を形成し、これらの凹部から細胞保持基板の下面に向けて貫通孔を形成するとともに、隣接する凹部の内壁は互いに交差させて形成したものである。 In order to solve the above problems, the present invention provides a cell holding substrate, a first electrode tank disposed above the cell holding substrate, a first electrode arranged inside the first electrode tank, and a lower part of the cell holding substrate. And a second electrode disposed inside the second electrode tank. Then, a plurality of recesses are formed on the upper surface of the cell holding substrate, through holes are formed from these recesses toward the lower surface of the cell holding substrate, and the inner walls of the adjacent recesses are formed so as to intersect each other. .

これにより本発明では、細胞の凹部へのトラップ率を向上させ、少量の細胞で検査処理をすることができる。 Thereby, in this invention, the trap rate to the recessed part of a cell can be improved, and it can test | inspect with a small amount of cells.

それは、隣接する凹部の内壁は互いに交差しており、この交差部分は曲面で形成された突起形状をしているためである。そしてこの部分に細胞が着地しても、付着することなく、重力によりいずれかの凹部に傾き、その内壁に沿って凹部内部へと速やかに転がりトラップされるのである。 This is because the inner walls of the adjacent concave portions intersect each other, and the intersecting portion has a protruding shape formed by a curved surface. And even if a cell lands on this part, it does not adhere, but is inclined to one of the concave parts by gravity, and is quickly rolled and trapped along the inner wall into the concave part.

そしてその結果、凹部への細胞のトラップ率を向上させ、少量の細胞で検査処理ができるのである。 As a result, the trapping rate of the cells in the recess is improved, and the inspection process can be performed with a small amount of cells.

（実施の形態１）
図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサ１１の細胞保持基板１２を示す斜視図であり、この細胞保持基板１２内部の実線部分は、後述の凹部１３と貫通孔１４の外観形状を表している。また図２は図１の破線Ａ−Ｂ断面における細胞電気生理センサ１１の断面図である。 (Embodiment 1)
FIG. 1 is a perspective view showing a cell holding substrate 12 of a cell electrophysiological sensor 11 according to Embodiment 1 of the present invention. Solid line portions inside the cell holding substrate 12 are external shapes of a recess 13 and a through-hole 14 to be described later. Represents. FIG. 2 is a cross-sectional view of the cell electrophysiological sensor 11 taken along the broken line AB in FIG.

以下に、図２を用いて本発明の細胞電気生理センサ１１の構成について説明する。 Below, the structure of the cell electrophysiological sensor 11 of this invention is demonstrated using FIG.

この細胞電気生理センサ１１は、細胞保持基板１２と、この細胞保持基板１２の上方に配置した第１電極槽１５と、この第１電極槽１５の内部に配置した第１電極１６と、細胞保持基板１２の下方に配置した第２電極槽１７と、この第２電極槽１７の内部に配置した第２電極１８とを備えている。そしてこの第２電極１８は、配線（図示せず）を経て信号検出部（図示せず）に連結されている。 The cell electrophysiological sensor 11 includes a cell holding substrate 12, a first electrode tank 15 arranged above the cell holding board 12, a first electrode 16 arranged inside the first electrode tank 15, and a cell holding cell. A second electrode tank 17 disposed below the substrate 12 and a second electrode 18 disposed inside the second electrode tank 17 are provided. The second electrode 18 is connected to a signal detection unit (not shown) via a wiring (not shown).

また、細胞保持基板１２の上面には複数の凹部１３を形成し、これらの凹部１３から細胞保持基板１２の下面に向けての最深部から細胞保持基板１２の下面に向けて垂直方向に貫通孔１４を形成している。 Further, a plurality of recesses 13 are formed on the upper surface of the cell holding substrate 12, and through-holes are formed in the vertical direction from the deepest portion from these recesses 13 toward the lower surface of the cell holding substrate 12 toward the lower surface of the cell holding substrate 12. 14 is formed.

そして隣接する凹部１３の内壁は互いに交差させて形成している。また、このような凹部１３は、細胞保持基板１２の上面の中央に、複数個配置している。そして、これらの凹部１３は、いずれも碗型をしている。 The inner walls of adjacent recesses 13 are formed so as to intersect each other. A plurality of such recesses 13 are arranged in the center of the upper surface of the cell holding substrate 12. And all of these recessed parts 13 are bowl-shaped.

なお、本実施の形態では、図３の細胞保持基板１２の上面図のごとく、凹部１３は、上面から見ると正六角形状を示すように、１つの凹部１３を６つの凹部と均等な距離で隣接させている（細胞保持基板１２上において最外周の凹部１３は除く）。 In the present embodiment, as shown in the top view of the cell holding substrate 12 in FIG. 3, the recesses 13 are equally spaced from the six recesses so that the recesses 13 have a regular hexagonal shape when viewed from above. Adjacent (excluding the outermost concave portion 13 on the cell holding substrate 12).

なお、図３の点線部分は、隣接する凹部１３の内壁を交差させなかった場合の、凹部１３の開口部外周の形状を示した。図１、図１１、図１２においても同様である。 In addition, the dotted line part of FIG. 3 showed the shape of the opening part outer periphery of the recessed part 13 at the time of not making the inner wall of the adjacent recessed part 13 cross | intersected. The same applies to FIG. 1, FIG. 11, and FIG.

なお、第１電極１６は第１電極槽１５の内部に注入する電解液（図４の第１電解液２０）に、また第２電極１８は第２電極槽１７の内部に注入する電解液（図４の第２電解液２１）にそれぞれ浸漬させ、その電位差を測定できればよいため、第１電極１６は、細胞保持基板１２の上面に接合させてもよく、第２電極１８は貫通孔１４の下方に針状の微小電極プローブを配置してもよい。 The first electrode 16 is an electrolyte that is injected into the first electrode tank 15 (first electrolyte 20 in FIG. 4), and the second electrode 18 is an electrolyte that is injected into the second electrode tank 17 ( The first electrode 16 may be bonded to the upper surface of the cell holding substrate 12 and the second electrode 18 may be connected to the through-hole 14 so long as it can be immersed in the second electrolyte solution 21) of FIG. A needle-like microelectrode probe may be arranged below.

また、本実施の形態において、細胞保持基板１２はシリコンで形成した。そして第２電極１８は、銅および銀を主成分として形成したが、その他金、白金、パラジウム等を用いてもよい。 In the present embodiment, the cell holding substrate 12 is formed of silicon. The second electrode 18 is formed mainly of copper and silver, but other gold, platinum, palladium, or the like may be used.

さらに、貫通孔１４の開口部の直径は３μｍとした。細胞が５〜５０μｍ程度の大きさの場合、細胞と貫通孔１４とを高い密着性を持って保持するには、貫通孔１４の開口部の直径を３μｍ以下とすることが望ましいからである。その他、この貫通孔１４の開口部の最適な大きさは、測定する細胞の形状、性質によって決定する。 Further, the diameter of the opening of the through hole 14 was 3 μm. This is because when the size of the cell is about 5 to 50 μm, it is desirable that the diameter of the opening of the through hole 14 is 3 μm or less in order to hold the cell and the through hole 14 with high adhesion. In addition, the optimum size of the opening of the through hole 14 is determined by the shape and properties of the cell to be measured.

次に、本発明の細胞電気生理センサ１１の動作について説明する。 Next, the operation of the cell electrophysiological sensor 11 of the present invention will be described.

図４に示すように、まず第１電極槽１５に細胞１９と第１電解液２０を満たし、第２電極槽１７には第２電解液２１を満たしておく。 As shown in FIG. 4, first, the first electrode tank 15 is filled with the cells 19 and the first electrolyte solution 20, and the second electrode tank 17 is filled with the second electrolyte solution 21.

そして図５に示すように、細胞保持基板１２の下方を減圧するか、上方を加圧することにより、細胞１９と第１電解液２０を貫通孔１４に引き付ける。この時、細胞１９は凹部１３にトラップされ、貫通孔１４の開口部を塞ぐように保持される。以下、前述のように、凹部１３に保持された細胞１９を被験体細胞１９ａといい、凹部１３に保持されなかった細胞を未保持の細胞１９ｂとする。 Then, as shown in FIG. 5, the cell 19 and the first electrolytic solution 20 are attracted to the through-hole 14 by reducing the pressure below the cell holding substrate 12 or pressurizing the top. At this time, the cell 19 is trapped in the recess 13 and held so as to close the opening of the through hole 14. Hereinafter, as described above, the cell 19 retained in the recess 13 is referred to as a subject cell 19a, and the cell not retained in the recess 13 is referred to as an unretained cell 19b.

その後、図６に示すように、減圧または加圧により被験体細胞１９を凹部１３に保持したまま、未保持の細胞（図５の１９ｂ）を生理食塩水で洗い流して取り除く。 Thereafter, as shown in FIG. 6, the unretained cells (19 b in FIG. 5) are removed by washing with physiological saline while the subject cells 19 are held in the recesses 13 by decompression or pressurization.

なお、被験体細胞１９ａが哺乳類筋細胞の場合、第１電解液２０としては、例えばＫ⁺を１５５ｍＭ、Ｎａ⁺を１２ｍＭ、Ｃｌ^-を４．２ｍＭ添加した電解液を用い、第２電解液２１としては、Ｋ⁺を４ｍＭ、Ｎａ⁺を１４５ｍＭ、Ｃｌ^-を１２３ｍＭ添加した電解液を用いた。なお、第１電解液２０と第２電解液２１とは、本実施の形態のように異なる組成のものを用いてもよく、同じものを用いてもよい。 When the subject cell 19a is a mammalian muscle cell, as the first electrolytic solution 20, for example, an electrolytic solution containing 155 mM K ⁺ , 12 mM Na ⁺ and 4.2 mM Cl ⁻ is used, and the second electrolytic solution 21 is used. As an electrolyte, an electrolyte solution containing 4 mM of K ⁺ , 145 mM of Na ⁺ and 123 mM of Cl ⁻ was used. The first electrolytic solution 20 and the second electrolytic solution 21 may have different compositions as in the present embodiment, or the same one may be used.

次に、細胞保持基板１２の下面から吸引するか、あるいはナイスタチンなどの薬剤を投入し、被験体細胞１９ａに微細小孔を形成する。 Next, suction is performed from the lower surface of the cell holding substrate 12 or a drug such as nystatin is introduced to form micropores in the subject cell 19a.

その後、この被験体細胞１９ａに化学的刺激、あるいは物理的刺激を付与する。この化学的刺激としては、化学薬品、毒物、物理的刺激としては機械的変異、光、熱、電気、電磁波などが挙げられる。 Thereafter, chemical stimulation or physical stimulation is applied to the subject cell 19a. Examples of chemical stimuli include chemicals, poisons, and physical stimuli include mechanical mutation, light, heat, electricity, and electromagnetic waves.

そして、被験体細胞１９ａがこれらの刺激に対して活発に反応する場合、被験体細胞１９ａはその細胞膜にあるイオンチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。 When the subject cell 19a responds actively to these stimuli, the subject cell 19a releases or absorbs various ions through ion channels in the cell membrane.

そうすると、被験体細胞１９ａを通るイオン電流が発生し、この被験体細胞１９ａ内外の電位勾配が変化するため、この変化を反応前後の第１電極１６と第２電極１８との間の電圧、あるいは電流を測定することによって検出する。 Then, an ionic current passing through the subject cell 19a is generated, and the potential gradient inside and outside the subject cell 19a changes. Therefore, this change is caused by the voltage between the first electrode 16 and the second electrode 18 before and after the reaction, or Detect by measuring current.

次に、図７〜図９を用いて、本実施の形態における細胞電気生理センサ１１の製造方法を説明する。 Next, the manufacturing method of the cell electrophysiological sensor 11 in this Embodiment is demonstrated using FIGS.

まず、図７に示すように、シリコンからなる細胞保持基板１２を用意し、細胞保持基板１２の上面側にマスク層２２を形成する。このとき、マスク層２２のエッチングホールの形状および位置は、必要とする貫通孔１４の形状および位置とほぼ同じになるように設計しておく。そして、貫通孔１４の中心点間距離は、本実施の形態で使用する被験体細胞１９ａの平均直径の１．５倍になるように統一した。なお、この被験体細胞１９ａの平均直径は、被験体細胞１９ａを生理食塩水に含浸させ、この被験体細胞１９ａ内外の浸透圧が平衡となった状態での測定値を基準にするものとする。また、複数の貫通孔１４の中心点間距離は、被験体細胞１９ａの平均直径の１．５倍に限定するものではないが、後述の通り、２倍より短く、かつ上記平均直径より長くなるように設けることが好ましい。 First, as shown in FIG. 7, a cell holding substrate 12 made of silicon is prepared, and a mask layer 22 is formed on the upper surface side of the cell holding substrate 12. At this time, the shape and position of the etching hole in the mask layer 22 are designed to be substantially the same as the shape and position of the required through hole 14. The distance between the center points of the through holes 14 was unified so as to be 1.5 times the average diameter of the subject cells 19a used in the present embodiment. The average diameter of the subject cell 19a is based on a measurement value in a state where the subject cell 19a is impregnated with physiological saline and the osmotic pressure inside and outside the subject cell 19a is in equilibrium. . Further, the distance between the center points of the plurality of through holes 14 is not limited to 1.5 times the average diameter of the subject cells 19a, but as will be described later, it is shorter than twice and longer than the average diameter. It is preferable to provide as described above.

次に、図８のように、ドライエッチング法により、細胞保持基板１２に凹部１３を形成する。この時、隣接する凹部１３同士がそれぞれの内壁を互いに交差させるように、すなわち、隣接する凹部１３同士がそれぞれ一部で連結するように形成した。 Next, as shown in FIG. 8, the recess 13 is formed in the cell holding substrate 12 by dry etching. At this time, it formed so that adjacent recessed parts 13 may mutually cross | intersect each inner wall, ie, adjacent recessed parts 13 may each be connected in part.

また、細胞保持基板１２がシリコンである場合、エッチングを促進するエッチングガスとしてＳＦ₆、またはＣＦ₄、またはＮＦ₃、またはＸｅＦ₂、またはこれらの混合ガスのいずれかを用いることができる。これらはシリコンのエッチングを深さ方向だけでなく、水平方向へのエッチングも促進する作用があるため、細胞保持基板１２を半球形状の碗型にエッチングすることができる。 When the cell holding substrate 12 is silicon, SF ₆ , CF ₄ , NF ₃ , XeF ₂ , or a mixed gas thereof can be used as an etching gas that promotes etching. Since these have the effect of accelerating the etching of silicon not only in the depth direction but also in the horizontal direction, the cell holding substrate 12 can be etched into a hemispherical saddle shape.

また、本実施の形態においては、エッチングを促進するＳＦ₆、ＣＦ₄、ＮＦ₃、ＸｅＦ₂またはこれらの混合ガスのいずれかのエッチングガスに、Ｎ₂、Ａｒ、Ｈｅ、Ｈ₂などのキャリアガスを混合して用いた。 In this embodiment, carrier gas such as N ₂ , Ar, He, H _{2 is used} as an etching gas of SF ₆ , CF ₄ , NF ₃ , XeF ₂ or a mixed gas thereof that promotes etching. Were used as a mixture.

また、図８からも判るように、本実施の形態における細胞電気生理センサ１１の構成では、隣接する凹部１３の内壁が互いに交差する部分は、細胞保持基板１２の上面より下方にあることから、マスク層２２の中央部分の下方は空洞となっており、細胞保持基板１２で支えられていない。 Further, as can be seen from FIG. 8, in the configuration of the cell electrophysiological sensor 11 in the present embodiment, the portion where the inner walls of the adjacent recesses 13 intersect each other is below the upper surface of the cell holding substrate 12. The lower part of the central portion of the mask layer 22 is a cavity and is not supported by the cell holding substrate 12.

よって、マスク層２２にはある程度の硬さを有し、外形を維持できる材料が好ましい。特に、エッチング進行中もエッチングホールの形状が不変である材料を用いる必要がある。 Therefore, a material having a certain degree of hardness and capable of maintaining the outer shape is preferable for the mask layer 22. In particular, it is necessary to use a material in which the shape of the etching hole does not change even during etching.

したがって、マスク層２２の材料としてはシリコン酸化物、シリコン窒化物、シリコンオキシ窒化物またはこれらの混合物を用いることが望ましい。これらで形成したマスク層２２は、エッチング加工時に撓まない程度の硬さを有し、さらにエッチング進行中のエッチングホール形状が不変であるとともに、シリコンを酸化処理、または窒化処理することにより容易に形成することができるためである。 Therefore, it is desirable to use silicon oxide, silicon nitride, silicon oxynitride or a mixture thereof as the material of the mask layer 22. The mask layer 22 formed by these has a hardness that does not bend during the etching process, and the shape of the etching hole during the etching is not changed, and it is easily obtained by oxidizing or nitriding silicon. This is because it can be formed.

そしてその後、図９で示すように前述のマスク層２２を配置した状態で、凹部１３の最深部から細胞保持基板１２の下面までを垂直方向に貫く貫通孔１４を形成する。 Then, as shown in FIG. 9, in the state where the above-described mask layer 22 is disposed, the through-holes 14 penetrating vertically from the deepest part of the recess 13 to the lower surface of the cell holding substrate 12 are formed.

この貫通孔１４を形成する際には前述のエッチングを促進するエッチングガス（ＳＦ₆、ＣＦ₄、ＮＦ₃、ＸｅＦ₂の少なくともいずれか一つ）とエッチングを抑制するガスを交互に用いたドライエッチング加工を行う。このエッチングを抑制するガスとしてはＣＨＦ₃、Ｃ₄Ｆ₈などがある。このエッチングを抑制するガスを、エッチングされた壁面に吹き付けると、その表面にＣＦ₂のポリマーである保護膜を形成するため、貫通孔１４をマスク層２２の下方へ垂直に進行させることができるのである。 When forming the through-holes 14, dry etching using alternately an etching gas (at least one of SF ₆ , CF ₄ , NF ₃ , and XeF ₂ ) that promotes the etching described above and a gas that suppresses etching. Processing. Gases that suppress this etching include CHF ₃ and C ₄ F ₈ . When a gas that suppresses this etching is blown onto the etched wall surface, a protective film, which is a CF ₂ polymer, is formed on the etched surface, so that the through-hole 14 can be vertically advanced below the mask layer 22. is there.

この仕組みについて、以下に詳述する。なお、これはエッチングガスとしてＳＦ₆、エッチングを抑制するガスとしてＣ₄Ｆ₈を用いたドライエッチング加工の実験結果に基づき考察したものである。 This mechanism will be described in detail below. This is based on the results of dry etching processing using SF _{6 as} an etching gas and C ₄ F ₈ as a gas for suppressing etching.

まず、エッチングガスＳＦ₆によるドライエッチングの際、細胞保持基板１２の上方では、外部コイルの誘導結合法によりプラズマを生成させている。したがって、このプラズマ中には、エッチングガスＳＦ₆に含まれるプラスイオン（ＳＦ₅ ⁺）が存在している。 First, during dry etching using the etching gas SF ₆ , plasma is generated above the cell holding substrate 12 by an inductive coupling method using an external coil. Therefore, positive ions (SF ₅ ⁺ ) contained in the etching gas SF ₆ are present in the plasma.

次に細胞保持基板１２に高周波を印加すると、細胞保持基板１２には、マイナスのバイアス電圧が発生し、前述のプラスイオン（ＳＦ₅ ⁺）は細胞保持基板１２に向かって垂直に衝突する。 Next, when a high frequency is applied to the cell holding substrate 12, a negative bias voltage is generated in the cell holding substrate 12, and the aforementioned positive ions (SF ₅ ⁺ ) collide vertically toward the cell holding substrate 12.

その結果、ドライエッチングは細胞保持基板１２の垂直方向（下方）に進むことになる。 As a result, dry etching proceeds in the vertical direction (downward) of the cell holding substrate 12.

一方、エッチングを抑制するガスＣ₄Ｆ₈を用いる際には、細胞保持基板１２に高周波を加えないでおく。そうすることによって、細胞保持基板１２にはバイアス電圧は全く発生しない。 On the other hand, when the gas C ₄ F ₈ that suppresses etching is used, no high frequency is applied to the cell holding substrate 12. By doing so, no bias voltage is generated in the cell holding substrate 12.

したがって、エッチングを抑制するガスＣ₄Ｆ₈に含まれるＣＦ⁺は、偏向を受けることなく、細胞保持基板１２のドライエッチング穴の壁面に付着し、均一な膜を形成する。 Therefore, CF ⁺ contained in the gas C ₄ F ₈ that suppresses etching adheres to the wall surface of the dry etching hole of the cell holding substrate 12 without being deflected, and forms a uniform film.

そしてこのＣＦ⁺の膜は、保護膜となってエッチングを抑制する。そしてこの工程を繰り返すことによって、エッチングは垂直下方のみに進行する。 This CF ⁺ film serves as a protective film to suppress etching. By repeating this process, etching proceeds only vertically downward.

以上のように貫通孔１４を形成した後、マスク層２２を除去すれば、凹部１３および貫通孔１４を有する細胞保持基板１２が完成する。なお、本実施の形態においては、貫通孔１４は凹部１３の最深部から細胞保持基板１２の下面に向けて垂直に形成したが、この細胞保持基板１２を斜めに傾けた状態で前述のようなエッチング加工をすることにより、貫通孔１４の方向に傾斜をつけることができる。 If the mask layer 22 is removed after forming the through holes 14 as described above, the cell holding substrate 12 having the recesses 13 and the through holes 14 is completed. In the present embodiment, the through-hole 14 is formed perpendicularly from the deepest part of the recess 13 toward the lower surface of the cell holding substrate 12, but as described above with the cell holding substrate 12 tilted obliquely. By etching, the direction of the through hole 14 can be inclined.

そして上記のように貫通孔１４を形成した後、この細胞保持基板１２の下面に真空蒸着法またはスパッタ法を用いて、第２電極１８を形成した。 And after forming the through-hole 14 as mentioned above, the 2nd electrode 18 was formed in the lower surface of this cell holding substrate 12 using the vacuum evaporation method or the sputtering method.

本実施の形態における効果を以下に説明する。 The effect in this Embodiment is demonstrated below.

本実施の形態では、図２において、凹部１３への細胞１９のトラップ率を向上させ、少量の細胞１９で検査処理をすることができる。 In the present embodiment, the trap rate of the cells 19 in the recesses 13 can be improved in FIG. 2, and the inspection process can be performed with a small amount of cells 19.

それは、隣接する凹部１３の内壁は互いに交差しており、この交差部分は曲面で形成された突起形状をしているためである。そしてこの部分に細胞１９が着地しても、付着することなく、重力によりいずれかの凹部１３に傾き、その内壁に沿って凹部内部へと速やかに転がりトラップされるのである。 This is because the inner walls of the adjacent recesses 13 intersect each other, and the intersecting portion has a protruding shape formed by a curved surface. And even if the cell 19 lands on this part, it does not adhere, but it is inclined to any one of the recesses 13 due to gravity, and is quickly rolled and trapped along the inner wall into the recesses.

特に、平滑な平面で付着性の強い細胞を被験体として用いる場合、従来の構成では、その平面に細胞１９が付着してしまい、凹部１３にトラップされ難いという問題があった。しかし本実施の形態では、隣接する凹部１３の開口部間には平面が介在しておらず、突起形状の曲面で形成されていることから、上記のように細胞１９が隣接する凹部１３の開口部間に付着してしまうのを有効に防ぐことができるのである。 In particular, when a cell having a smooth surface and strong adhesion is used as a subject, the conventional configuration has a problem that the cell 19 adheres to the surface and is not easily trapped in the recess 13. However, in the present embodiment, no plane is interposed between the openings of the adjacent recesses 13 and the projections are formed as curved surfaces. Therefore, as described above, the openings of the recesses 13 adjacent to the cells 19 are formed. It is possible to effectively prevent adhesion between the parts.

そしてその結果、凹部１３への細胞１９のトラップ率を向上させ、少量の細胞で検査処理ができるのである。 As a result, the trap rate of the cells 19 in the recess 13 is improved, and the inspection process can be performed with a small amount of cells.

さらに、本実施の形態では、細胞電気生理センサ１１の信頼性を向上させることができる。その理由を以下に説明する。 Furthermore, in the present embodiment, the reliability of the cell electrophysiological sensor 11 can be improved. The reason will be described below.

すなわち、従来の構成では、凹部１３開口部の周辺の平面に付着した未保持の細胞１９ｂが、凹部１３に保持された被験体細胞１９ａと接触してしまい、寄生容量成分を発生させたり、被験体細胞１９ａのイオンチャネルを封鎖したりしてしまうことがあった。また、未保持の細胞１９ｂが被験体細胞１９ａと接近、あるいは接触していると、印加した物理化学的刺激の被験体細胞１９ａへの伝達を阻害することがあった。 That is, in the conventional configuration, the unretained cells 19b attached to the plane around the opening of the recess 13 come into contact with the subject cell 19a held in the recess 13 to generate a parasitic capacitance component, In some cases, the ion channel of the somatic cell 19a is blocked. In addition, when the unretained cell 19b approaches or is in contact with the subject cell 19a, transmission of the applied physicochemical stimulus to the subject cell 19a may be inhibited.

特に細胞保持基板１２の表面は一般的に鏡面加工が施されていることが多く、付着性の高い細胞は、その平滑な平面で平たく広がるように付着してしまい、除去するのが非常に困難なことから、上記問題は顕著であった。 In particular, the surface of the cell holding substrate 12 is generally mirror-finished in general, and highly adherent cells adhere so as to spread flat on the smooth plane and are very difficult to remove. Therefore, the above problem was remarkable.

一方、本実施の形態では、隣接する凹部１３の開口部間には未保持の細胞１９ｂが付着できるような平面が介在していないため、被験体細胞１９ａに接触する未保持の細胞１９ｂを著しく低減することができる。また、流水で洗浄することによって、未保持の細胞１９ｂを容易に除去することができる。 On the other hand, in the present embodiment, since there is no plane between the openings of the adjacent recesses 13 to which the unretained cells 19b can adhere, the unretained cells 19b in contact with the subject cells 19a are markedly different. Can be reduced. Further, the unretained cells 19b can be easily removed by washing with running water.

よって、寄生容量成分の発生やイオンチャネルの封鎖を抑制し、また印加した物理化学的刺激の伝達の阻害を防ぎ、検出した電気信号の誤差を低減することができる。そしてその結果、細胞電気生理センサ１１の信頼性を向上させることができるのである。 Therefore, generation of parasitic capacitance components and blockage of ion channels can be suppressed, inhibition of transmission of applied physicochemical stimulation can be prevented, and errors in detected electrical signals can be reduced. As a result, the reliability of the cell electrophysiological sensor 11 can be improved.

また、本実施の形態では、隣接する貫通孔１４の中心点間距離を、被験体細胞１９ａの平均直径の１．５倍とすることにより、一つの凹部１３に対し、一つの被験体細胞１９ａを適切にトラップすることができる。 In the present embodiment, the distance between the center points of the adjacent through-holes 14 is set to 1.5 times the average diameter of the subject cells 19a, so that one subject cell 19a is associated with one recess 13. Can be trapped properly.

すなわち、例えば隣接する貫通孔１４の中心点間距離を、被験体細胞１９ａの平均直径の２倍以上とした場合、一つの凹部１３の中に複数の細胞１９がトラップされてしまい、細胞１９同士が押し合って被験体細胞１９ａが貫通孔１４に的確に密着せず、測定誤差が大きくなる場合があった。また、隣接する貫通孔１４の中心点間距離を、被験体細胞１９ａの平均直径以下とした場合、凹部１３に細胞１９が入るスペースがなくなってしまい、測定が不可能であった。 That is, for example, when the distance between the center points of the adjacent through holes 14 is set to be twice or more the average diameter of the subject cells 19a, a plurality of cells 19 are trapped in one recess 13, and the cells 19 And the subject cell 19a does not adhere to the through-hole 14 accurately, resulting in a large measurement error. Moreover, when the distance between the center points of the adjacent through-holes 14 was set to be equal to or smaller than the average diameter of the subject cell 19a, there was no space for the cells 19 to enter the recess 13 and measurement was impossible.

一方、本実施の形態１では、一つの凹部１３に一つの被験体細胞１９ａが収容され、貫通孔１４と的確に接触し、細胞電気生理センサ１１の信頼性を向上させることができる。 On the other hand, in the first embodiment, one subject cell 19a is accommodated in one recess 13 and accurately contacts with the through hole 14, and the reliability of the cell electrophysiological sensor 11 can be improved.

さらに、本実施の形態では、図１０に示すように、隣接する凹部１３の内壁が互いに交差する部分には、上方に突出する丸みを帯びた湾曲部２３が形成されている。この湾曲部２３は、本実施の形態においては、細胞保持基板１２上面から、貫通孔１４に対向する部分を中心に、放射状にエッチング加工することによって、隣接する凹部１３の内壁の交差する部分が重複してエッチング加工された結果生じたものである。 Further, in the present embodiment, as shown in FIG. 10, a rounded curved portion 23 protruding upward is formed at a portion where the inner walls of the adjacent recesses 13 intersect each other. In the present embodiment, the curved portion 23 is etched radially from the upper surface of the cell holding substrate 12 around the portion facing the through-hole 14 so that the portion where the inner walls of the adjacent recesses 13 intersect with each other is formed. This is a result of redundant etching.

そして、この湾曲部２３の上部は、丸みを帯びた曲面で形成されているため、未保持の細胞１９ｂがこの湾曲部２３に着地した場合も、重力に従いいずれかの凹部に速やかに転がってトラップされる。よって、細胞の凹部１３へのトラップ率をより向上させることができる。 And since the upper part of this curved part 23 is formed with the rounded curved surface, even when the unretained cell 19b lands on this curved part 23, it rolls quickly to any concave part according to gravity, and is trapped. Is done. Therefore, the trap rate of the cells in the recess 13 can be further improved.

また、丸みを帯びた湾曲部２３では、この部分に着地した細胞１９を損傷させたり、この突起部分が欠落したりするのを抑制することができ、細胞電気生理センサ１１の信頼性向上に寄与する。 In addition, the rounded curved portion 23 can suppress damage to the cells 19 that land on this portion and the loss of the protruding portions, which contributes to improving the reliability of the cell electrophysiological sensor 11. To do.

なお、このような湾曲部２３は、本実施の形態のように、凹部１３のエッチング加工により必然的に形成される場合もあるが、任意に設けてもよい。 In addition, although such a curved part 23 may be necessarily formed by the etching process of the recessed part 13 like this Embodiment, you may provide arbitrarily.

また、本実施の形態では、図１０からも判るように、隣接する複数の凹部１３の内壁を互いに交差することによって、この交差している部分より上方に細胞保持基板１２の上面を配置している。そしてこれにより、細胞電気生理センサ１１の信頼性を向上させることができる。 In this embodiment, as can be seen from FIG. 10, the upper surfaces of the cell holding substrate 12 are arranged above the intersecting portions by intersecting the inner walls of the plurality of adjacent recesses 13 with each other. Yes. And thereby, the reliability of the cell electrophysiological sensor 11 can be improved.

すなわち、この細胞保持基板１２の上面は平滑な平面であるから、未保持の細胞１９ｂが付着しやすいが、上記構成により凹部１３に保持された被験体細胞１９ａとの距離が広がり、接触を回避することができるからである。 That is, since the upper surface of the cell holding substrate 12 is a smooth flat surface, unretained cells 19b are likely to adhere, but the distance from the subject cells 19a held in the recesses 13 is increased by the above configuration, thereby avoiding contact. Because it can be done.

また、未保持の細胞１９ｂが細胞保持基板１２の上面に積層した場合も、その下方の凹部１３との距離が広がっていることから、この凹部１３の開口部は過剰に狭小となることは無く、細胞１９はこの積層した未保持の細胞１９ｂに阻害されずに凹部１３にトラップされることができる。 Further, even when unretained cells 19b are stacked on the upper surface of the cell holding substrate 12, the distance from the lower concave portion 13 is increased, so that the opening of the concave portion 13 is not excessively narrowed. The cells 19 can be trapped in the recesses 13 without being inhibited by the stacked unretained cells 19b.

また、本実施の形態では、複数の凹部１３が互いの内壁が交差するように連続的に配置したため、細胞保持基板１２における凹部１３の密度を大きくすることができる。したがって、一つの細胞保持基板１２で処理できる試験数を増大することができる。 Moreover, in this Embodiment, since the several recessed part 13 was arrange | positioned continuously so that a mutual inner wall may cross | intersect, the density of the recessed part 13 in the cell holding substrate 12 can be enlarged. Therefore, the number of tests that can be processed by one cell holding substrate 12 can be increased.

さらに、本実施の形態では、凹部１３の形状を碗型とすることにより、球体の被験体細胞１９ａの形状が大きく変形することが無く、被験体細胞１９ａを安定に保持することができる。さらに、貫通孔１４の開口部が凹部１３の最深部となるため、この凹部１３の最深部で被験体細胞１９ａは安定して存在し、この被験体細胞１９ａと貫通孔１４との密着性が向上する。その結果、測定誤差を低減し、細胞電気生理センサ１１の信頼性を向上させることができる。 Furthermore, in this Embodiment, the shape of the recessed part 13 is made into a saddle shape, so that the shape of the spherical subject cell 19a is not greatly deformed, and the subject cell 19a can be stably held. Furthermore, since the opening of the through-hole 14 is the deepest part of the recess 13, the subject cell 19 a stably exists at the deepest part of the recess 13, and the adhesion between the subject cell 19 a and the through-hole 14 is improved. improves. As a result, measurement errors can be reduced and the reliability of the cell electrophysiological sensor 11 can be improved.

なお、細胞保持基板１２としてシリコンを用いたが、シリコンの中に酸化シリコン層が埋め込まれた基板を用いることもできる。このような基板はＳＯＩ基板と呼ばれ、これにより、貫通孔１４をドライエッチングによって形成する際、酸化シリコン層がエッチングストップ層となるのでより簡単な製造方法とすることができる。 Although silicon is used as the cell holding substrate 12, a substrate in which a silicon oxide layer is embedded in silicon can also be used. Such a substrate is called an SOI substrate. Accordingly, when the through hole 14 is formed by dry etching, the silicon oxide layer serves as an etching stop layer, so that a simpler manufacturing method can be achieved.

また、本実施の形態では、隣接する凹部１３間に介在する平面を無くすように凹部１３を配置したが、本発明は、上記のように平面を完全に除去する構造に限定するものではない。 Further, in the present embodiment, the recess 13 is disposed so as to eliminate the plane interposed between the adjacent recesses 13, but the present invention is not limited to the structure in which the plane is completely removed as described above.

（実施の形態２）
本実施の形態２と実施の形態１との違いは、図１１の細胞保持基板１２の上面図から判るように、一つの凹部１３の内壁を、隣接する４つの凹部１３の内壁とそれぞれ交差させ、凹部１３の開口部の形状を、上面から見ると正方形状を示すように形成したことである（最外周の凹部１３を除く）。 (Embodiment 2)
As can be seen from the top view of the cell holding substrate 12 in FIG. 11, the difference between the second embodiment and the first embodiment is that the inner wall of one recess 13 intersects the inner walls of four adjacent recesses 13. The shape of the opening of the recess 13 is formed so as to show a square shape when viewed from above (except for the outermost recess 13).

本実施の形態２は実施の形態１よりも、隣接する複数の凹部１３の内壁が交差する部分が大きくなるため、細胞保持基板１２における凹部１３の密度がより増大し、一度に処理できる試験数を更に増やすことができる。 In the second embodiment, since the portion where the inner walls of the plurality of adjacent concave portions 13 intersect with each other is larger than in the first embodiment, the density of the concave portions 13 in the cell holding substrate 12 is further increased, and the number of tests that can be processed at one time Can be further increased.

その他の構成、動作、製造方法および効果等は実施の形態１と同様であるため省略する。 Other configurations, operations, manufacturing methods, effects, and the like are the same as those in the first embodiment, and are omitted.

（実施の形態３）
本実施の形態３と実施の形態１との違いは、図１２の細胞保持基板１２の上面図で示すように、細胞保持基板１２の上面の全面に凹部１３を形成したことである。 (Embodiment 3)
The difference between the third embodiment and the first embodiment is that the recess 13 is formed on the entire upper surface of the cell holding substrate 12 as shown in the top view of the cell holding substrate 12 in FIG.

このような構成とすることによって、細胞１９の凹部１３へのトラップ率を著しく向上させることができる。 By setting it as such a structure, the trap rate to the recessed part 13 of the cell 19 can be improved significantly.

また細胞保持基板１２の上面から平面がほぼ完全に排除されることから、未保持の細胞１９ｂと被験体細胞１９ａとの接触を著しく低減することができる。したがって、寄生容量成分の発生やイオンチャネルの封鎖、および印加した物理化学的信号の伝達の阻害による測定誤差を低減し、細胞電気生理センサ１１の信頼性を向上させることができる。 Further, since the plane is almost completely removed from the upper surface of the cell holding substrate 12, contact between the unheld cells 19b and the subject cells 19a can be significantly reduced. Therefore, measurement errors due to generation of parasitic capacitance components, blockage of ion channels, and inhibition of transmission of applied physicochemical signals can be reduced, and the reliability of the cell electrophysiological sensor 11 can be improved.

なお、本実施の形態３では、複数の凹部１３のうち、最外周の凹部１３は形状が不完全であるから、この凹部１３にトラップされた被験体細胞１９ａは測定の対象から除外している。また、細胞保持基板１２や第２電極槽１７の形状により、貫通孔１４が形成しにくい凹部１３には貫通孔１４を形成せず、測定の対象から除外している。 In the third embodiment, among the plurality of recesses 13, the outermost recess 13 has an incomplete shape, and the subject cell 19 a trapped in the recess 13 is excluded from the measurement target. . Further, due to the shape of the cell holding substrate 12 and the second electrode tank 17, the through hole 14 is not formed in the recess 13 in which the through hole 14 is difficult to be formed, and is excluded from the measurement target.

その他の構成、動作方法、製造方法および効果については実施の形態１と同様であるため省略する。 Since other configurations, operation methods, manufacturing methods, and effects are the same as those in the first embodiment, the description thereof is omitted.

本発明の細胞電気生理センサおよびその製造方法は、細胞の凹部へのトラップ率を向上させることができる。 The cell electrophysiological sensor and the method for producing the same of the present invention can improve the trap rate of the cells into the recesses.

よって、少量の細胞で迅速な処理が可能となり、医療分野等における細胞電気生理センサとして、大いに利用可能性を有するものである。 Therefore, rapid processing is possible with a small amount of cells, and it has great applicability as a cell electrophysiological sensor in the medical field and the like.

本実施の形態１における細胞電気生理センサの斜視図The perspective view of the cell electrophysiological sensor in this Embodiment 1. 本実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図（図１のＡＢ断面）Sectional drawing of the cell electrophysiological sensor in this Embodiment 1 (AB cross section of FIG. 1) 本実施の形態１における細胞保持基板の上面図Top view of cell holding substrate in the first embodiment 本実施の形態１における細胞電気生理センサの動作説明図Operation explanatory diagram of the cell electrophysiological sensor in the first embodiment 本実施の形態１における細胞電気生理センサの動作説明図Operation explanatory diagram of the cell electrophysiological sensor in the first embodiment 本実施の形態１における細胞電気生理センサの動作説明図Operation explanatory diagram of the cell electrophysiological sensor in the first embodiment 本実施の形態１における細胞電気生理センサの製造工程図Manufacturing process diagram of cell electrophysiological sensor according to Embodiment 1 本実施の形態１における細胞電気生理センサの製造工程図Manufacturing process diagram of cell electrophysiological sensor according to Embodiment 1 本実施の形態１における細胞電気生理センサの製造工程図Manufacturing process diagram of cell electrophysiological sensor according to Embodiment 1 本実施の形態１における細胞保持基板の断面図Sectional view of the cell holding substrate in the first embodiment 本実施の形態２における細胞保持基板の上面図Top view of cell holding substrate in the second embodiment 本実施の形態３における細胞保持基板の上面図Top view of cell holding substrate in the third embodiment 従来の細胞電気生理センサの断面図Sectional view of a conventional cellular electrophysiological sensor

符号の説明Explanation of symbols

１１細胞電気生理センサ
１２細胞保持基板
１３凹部
１４貫通孔
１５第１電極槽
１６第１電極
１７第２電極槽
１８第２電極
１９細胞
１９ａ被験体細胞
１９ｂ未保持の細胞
２０第１電解液
２１第２電解液
２２マスク層
２３湾曲部 DESCRIPTION OF SYMBOLS 11 Cell electrophysiological sensor 12 Cell holding substrate 13 Recessed part 14 Through-hole 15 1st electrode tank 16 1st electrode 17 2nd electrode tank 18 2nd electrode 19 Cell 19a Subject cell 19b Unretained cell 20 1st electrolyte solution 21 1st 2 Electrolytic solution 22 Mask layer 23 Curved part

Claims

細胞保持基板と、この細胞保持基板の上方に配置した第１電極槽と、この第１電極槽の内部に配置した第１電極と、前記細胞保持基板の下方に配置した第２電極槽と、この第２電極槽の内部に配置した第２電極とを備え、前記細胞保持基板の上面には複数の凹部を形成し、それぞれの凹部の下方から前記細胞保持基板の下面に向けて貫通した、一つの貫通孔を形成するとともに、隣接する凹部の内壁は互いに交差させて形成した細胞電気生理センサ。 A cell holding substrate, a first electrode tank disposed above the cell holding substrate, a first electrode disposed inside the first electrode tank, a second electrode tank disposed below the cell holding substrate, A second electrode disposed inside the second electrode tank, and a plurality of recesses are formed on the upper surface of the cell holding substrate, penetrating from below the respective recesses toward the lower surface of the cell holding substrate , A cell electrophysiological sensor in which one through hole is formed and the inner walls of adjacent recesses intersect each other.

前記細胞保持基板の上面は、隣接する凹部の内壁が交差している部分より上方に設けた請求項１に記載の細胞電気生理センサ。 The cell electrophysiological sensor according to claim 1, wherein the upper surface of the cell holding substrate is provided above a portion where inner walls of adjacent recesses intersect.

細胞保持基板と、この細胞保持基板の上方に配置した第１電極槽と、この第１電極槽の内部に配置した第１電極と、前記細胞保持基板の下方に配置した第２電極槽と、この第２電極槽の内部に配置した第２電極とを備え、前記細胞保持基板の上面には複数の凹部を形成し、それぞれの凹部の下方から前記細胞保持基板の下面に向けて貫通した、一つの貫通孔を形成するとともに、隣接する凹部の開口部間は、上方に突出する湾曲部とした細胞電気生理センサ。 A cell holding substrate, a first electrode tank disposed above the cell holding substrate, a first electrode disposed inside the first electrode tank, a second electrode tank disposed below the cell holding substrate, A second electrode disposed inside the second electrode tank, and a plurality of recesses are formed on the upper surface of the cell holding substrate, penetrating from below the respective recesses toward the lower surface of the cell holding substrate , A cell electrophysiological sensor that forms one through-hole and has a curved portion protruding upward between the openings of adjacent recesses.

前記細胞保持基板の上面は、前記湾曲部より上方に設けた請求項３に記載の細胞電気生理センサ。 The cell electrophysiological sensor according to claim 3, wherein an upper surface of the cell holding substrate is provided above the curved portion.

隣接する前記貫通孔の中心点間距離が、被験体細胞の平均直径の２倍より短く、かつこの被験体細胞の平均直径より長いことを特徴とする請求項１から４のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ。 The distance between the center points of the adjacent through-holes is shorter than twice the average diameter of the subject cells and longer than the average diameter of the subject cells. The cell electrophysiological sensor described.

前記凹部を、前記細胞保持基板の上面の略全面に形成した請求項１または３または５のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ。 6. The cell electrophysiological sensor according to claim 1, wherein the concave portion is formed on substantially the entire upper surface of the cell holding substrate.

第１電極槽に第１電解液と細胞を注入し、第２電極槽に第２電解液を注入し、細胞保持基板の上面に配置した凹部に細胞を保持し、この細胞を前記凹部に設けた貫通孔の開口部に密着させ、この密着させた細胞を保持した状態で、前記凹部に保持されていない細胞を除去した後、前記凹部に保持された細胞の電気生理現象を測定する細胞電気生理センサを用いた測定方法。 The first electrolyte solution and cells are injected into the first electrode tank, the second electrolyte solution is injected into the second electrode tank, the cells are held in the recesses disposed on the upper surface of the cell holding substrate, and the cells are provided in the recesses Cell electricity that measures the electrophysiological phenomenon of the cells held in the recesses after removing the cells not held in the recesses in a state of being in close contact with the openings of the through-holes and holding the closely-attached cells Measurement method using a physiological sensor.

細胞保持基板の上に、所定間隔にエッチングホールを設けたマスク層を配置し、次にエッチングガスを用いたドライエッチング加工で、前記細胞保持基板の上面に複数の凹部を隣接する凹部の内壁が交差するように形成し、その後前記エッチングガスとエッチングを抑制するガスとを交互に用いたドライエッチング加工で前記凹部から前記細胞保持基板の下面まで貫通する一つの貫通孔を形成する細胞電気生理センサの製造方法。 A mask layer provided with etching holes at predetermined intervals is disposed on the cell holding substrate, and then, by dry etching processing using an etching gas, a plurality of recesses are adjacent to the upper surface of the cell holding substrate so that the inner walls of the recesses are adjacent to each other. A cell electrophysiological sensor that is formed so as to intersect, and then forms a single through-hole penetrating from the recess to the lower surface of the cell holding substrate by dry etching using the etching gas and a gas that suppresses etching alternately. Manufacturing method.

前記マスク層はシリコン酸化物、またはシリコン窒化物、またはシリコンオキシ窒化物の少なくともいずれか一つからなる請求項８に記載の細胞電気生理センサの製造方法。 The method for manufacturing a cell electrophysiological sensor according to claim 8, wherein the mask layer is made of at least one of silicon oxide, silicon nitride, or silicon oxynitride.

前記エッチングガスは、ＣＦ₄、またはＳＦ₆、またはＮＦ₃、またはＸｅＦ₂の少なくともいずれか一つとした請求項８または９に記載の細胞電気生理センサの製造方法。 The method for manufacturing a cell electrophysiological sensor according to claim 8 or 9, wherein the etching gas is at least one of CF ₄ , SF ₆ , NF ₃ , or XeF ₂ .

前記エッチングを抑制するガスは、ＣＨＦ₃、またはＣ₄Ｆ₈の少なくとも一方とした請求項８から１０のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサの製造方法。 The method for manufacturing a cell electrophysiological sensor according to any one of claims 8 to 10, wherein the gas for suppressing the etching is at least one of CHF ₃ and C ₄ F ₈ .

前記凹部をドライエッチング加工で形成する際、キャリアガスとしてＮ₂、またはＡｒ、またはＨｅ、またはＨ₂の少なくともいずれか一つを用いた請求項８から１１のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサの製造方法。 The cell electricity according to any one of claims 8 to 11, wherein at least one of N ₂ , Ar, He, or H ₂ is used as a carrier gas when the recess is formed by dry etching. A method for manufacturing a physiological sensor.