JP4836145B2 - マイコバクテリアに由来する、免疫機能刺激用、免疫疾患治療用、アトピー性皮膚炎治療用および/または正常免疫細胞保護用オリゴヌクレオチド - Google Patents
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Description
ここで、RはAまたはGであり、SはCまたはGであり、HはA、TまたはCであり、KはGまたはTであり、MはCまたはAである。
ここで、RはAまたはGであり、SはCまたはGであり、HはA、TまたはCであり、KはGまたはTであり、DはA、GまたはTであり、MはCまたはAであり、YはCまたはTである。
本発明において、前記オリゴヌクレオチドは、5’−AGCAGCGTTCGTGTCGGCCT−3’ (配列番号3)、5’−AGCAGCGTTCGTGTGCGCCT−3’ (配列番号4)、5’−AGCAGCGTTCATGTCGGCCT−3’(配列番号5)、5’−AGCAGCGTTCGTGTCCGCCT−3’(配列番号6)、5’−GTATTCGTTCGTGTCGTCCT−3’(配列番号7)および5’−TGACTCGTTCGTGTCGCATG−3’ (配列番号8)からなる群より選択されることが好ましい。
1)マウスおよびマウス脾臓の免疫細胞においてIL−12の生産を増加させる。
2)樹状細胞を活性化させてIL−12の発現を誘導させる。
3)HELを抗原として用い、MB−ODNをアジュバントとして用いたとき、抗体の生産が増加する。この際、CFAを抗原として用いたとき、Th1免疫反応の結果として、IgG2aの生産がより増加した。
したがって、下記実施例は、本発明を例示するもので、本発明の内容を限定するものではない。
E.coliとM.bovis BCGの染色体DNAのDNA塩基配列の分析
<1−1>E.coliとM.bovis BCGの染色体DNAにおけるCpGモチーフのDNA塩基配列の分析
本発明者らは、E.coliとM.bovis BCGの染色体DNA配列をコンピュータプログラムを用いて分析した。E.coliとM.bovis BCGの染色体DNA内に存在する6ヌクレオチドからなるDNA配列の頻度をコンピュータプログラムを用いて計算した。染色体上のDNA配列XXCGXXの確率は、理論的に1/46であるが、実際、E.coliとM.bovis BCGの染色体DNA上のDNA配列XXCGXXの確率は一層高い。また、M.bovis BCGの染色体DNAにおけるXXCGXXの頻度は、でE.coliより高いことを確認した(図1)。
M.bovis BCGの染色体DNAを無作為に20個の塩基配列を選択し、そして次いで、その中から、3つのXXCGXXモチーフが含まれるオリゴヌクレオチドを選別した。
例えば:GACGTTGAGTCGTTAACGAG CとC間に4および5塩基のギャップを有するオリゴヌクレオチド(−CGXXCGXXXCG−、MB−ODN 4/5、図2a)、並びにCとC間の各5塩基のギャップを有するオリゴヌクレオチド(−CGXXXCGXXXCG−、MB−ODN 5/5、図2b)を分析した結果は、図2のとおりである。M.bovis BCGの染色体DNA中に、395の−CGXXCGXXXCG−形態のオリゴヌクレオチド、354の−CGXXXCGXXXCG−形態のオリゴヌクレオチドが存在することを示している。図1において示されるように、頻度の高いモチーフXXCGXXを含むオリゴヌクレオチドに高い点数を与える優先順位で20個の塩基配列を記載した。オリゴヌクレオチドの20個の塩基対の5’−または3’−末端にCGが存在するオリゴヌクレオチド配列を排除し、候補免疫反応調節用オリゴヌクレオチドを71個選定して合成し、候補物質の検出に利用した。
免疫活性を有するMB−ODNの検出
<2−1>合成した候補MB−ODNの免疫反応
前記実施例<1−2>で製造されたMB−ODNおよびその多様な置換体がマクロファージのIL−8およびIL−12のプロモータを活性化可能か否かを調査した。
RAW264.7細胞(ATCC、ヴァージニア州マナッサス)を、10%FBS(Gibco BRL)を含むDMEM培地で培養した。細胞培養を37℃、5%CO2インキュベーター(Forma)中で行った。
IL−8プロモータ領域(−135bpから+46bpまで)を増幅するために、ヒトゲノムDNAを鋳型とし、次のプライマーセットを用いてPCRを行った。
RAW264.7細胞(ATCC、Rockviller、MID)を5×104細胞/ウェルの濃度で12ウェルプレートに分注して37℃、5%CO2インキュベーターで24時間培養した。前記細胞を、前記b)で構築したIL−8プロモータ−LucレポータプラスミドまたはIL−12プロモータ−LucレポータプラスミドとpRL−nullプラスミド(Progema)で共トランスフェクション(co−transfection)した。その後、共トランスフェクションした細胞を37℃で、5%CO2インキュベーターで24時間培養した。図3に記載のMB−ODNs(10μg/ウェル)で各ウェルを処理し、37℃、5%CO2インキュベーターで6時間または12時間培養した。この際、対照群をPBSで処理した。その後、デュアル−ルシフェラーゼレポータアッセイシステム(Dual−luciferase reporter assay system、Promega)のPLB(passive lysis buffer)を100μL/wellの濃度で各ウェルに添加して細胞を均質化した。細胞溶解液を遠心分離し、得られた上澄み液(15μL)を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼの活性は、TD−20/20(Turner designs)ルミノメータ(luminometer)を用いて測定した。MB−ODNの処理による各プロモータの活性は、対照群に対する相対的な活性として測定した。すなわち、対照群の活性を「1」として、実験群はこれに対する活性化倍数(fold activation)で表わした。
前記実施例<2−1>でIL−8プロモータの活性化に効果があるMB−ODN 4/5#31の塩基配列のうちCGTTCGTGTCG配列は同一であり、その他の塩基配列は異なるMB−ODN4/5#31と類似のM.bovis BCGの染色体DNAに存在する20個の塩基配列を分析した。その結果、図5aに示すように、17個のMB−ODN4/5#31類似オリゴヌクレオチドが存在することが分かった。その後、前記実施例<2−1>と同様の方法を繰り返し、IL−8プロモータの活性を測定した。
MB−ODN4/5#31オリゴヌクレオチドのDNA配列の修飾および免疫反応
<3−1>MB−ODN4/5#31オリゴヌクレオチドのDNA配列の修飾
MB−ODN4/5#31オリゴヌクレオチドのDNA配列を図6aのように修飾して、DNA配列を合成した。MB−ODN4/5#31のCG配列をGC配列にそれぞれ変えた(#31−CG−1、#31−CG−2、#31−CG−3)。また、1番目のCGと2番目のCGをGC配列に変え(#31−CG−4)、2番目のCGと3番目のCGをGC配列に変え(#31−CG−5)、1番目のCGと3番目のCGをGC配列に変えた(#31−CG−5)。図6aに示すようにCG配列のGをA、T、Cに図6aのようにそれぞれ変えた。また、1番目と2番目のCGをCAに、2番目と3番目のCGをCAに、1番目と3番目のCGをCAに変えた。
12ウェルプレートにRAW264.7細胞を5×104細胞/ウェルで敷き、24時間37℃、5%CO2インキュベーター中でインキュベートした。IL−8プロモータレポータプラスミドとpRL−nullプラスミドを共トランスフェクションさせた後、24時間37℃、5%CO2インキュベーター中でインキュベートした。10μg/ウェルの合成オリゴヌクレオチドで各ウェルを処理し、6時間37℃、CO2インキュベーター中でインキュベートした。その後、前記実施例<2−1>と同様の方法を繰り返し、IL−8プロモータ活性を測定した。
MB−ODN 4/5#31およびMB−ODN 4/5#31.14オリゴヌクレオチドの骨格修飾による免疫反応調査
<4−1>MB−ODN 4/5#31およびMB−ODN 4/5#31.14の骨格修飾によるRAW264.7細胞の活性化
RAW264.7細胞に、前記実施例<2−1>のb)で構築したIL−8−LucプロモータレポータベクターまたはIL−12−LucプロモータレポータベクターとpRL−nullプラスミド(Promega)で共トランスフェクションさせた。前記トランスフェクションされた細胞にO型(ホスホジエステル骨格)並びにS型(ホスホロチオエート骨格)MB−ODN 4/5#31およびMB−ODN 4/5#31.14(0または10μg/mL)でそれぞれ処理し、8時間インキュベートした。その後、前記実施例<2−1>と同様の方法を繰り返し、IL−8プロモータおよびIL−12プロモータの活性を測定した。その結果、図7に示すように、本発明に係るMB−ODN 4/5#31とMB−ODN 4/5#31.14は、骨格の形態を問わずに(O型およびS型の両方とも)最も高い活性を示した。
24ウェルプレートにカバーガラスを入れ、RAW264.7細胞を5×105細胞/mLずつ入れて37℃、5%CO2インキュベーター中で24時間インキュベートした。各ウェルをMB−ODN 4/5#31およびMB−ODN 4/5#31.14をそれぞれ5μg/ウェルの量で処理した。30分経過後、3.7%のホルムアルデヒドで細胞を固定させた後、0.2%Triton−X100を含むPBSで浸透可能に(permeabilize)した。0.2%Tween−20を含むPBS(PBST)に1%ドンキー血清(donkey serum)を入れた溶液で30分間ブロッキングした後、PBSTにマウス抗−p65(力価1:500)抗体を0.5μL/ウェルの濃度で入れて2時間常温に放置した。PBSTで洗浄した後、細胞をドンキー−抗−マウス−IgG−FITC(力価1:250)抗体で2時間処理した。共焦点顕微鏡(Confocal microscopy)を用いてNF−kBの核への移動を観察した(Lee, Y., et. al., (2002) Blood 99, 4307−4317)。
MB−ODN 4/5#31の体液性免疫反応誘導
<5−1>免疫化(Immunization)
4週齢のBalb/cマウスに鶏卵リゾチーム(HEL、50mg/匹)とMB−ODN 4/5#31(100μg/匹)の混合物を腹腔内投与した。1週経過後、同量のHELとMB−ODN 4/5#31の混合物を再び投与した。1週経過後、ハートパンチング(heart punching)方法で血液を採取し、遠心分離して血球を沈澱させ、血清を獲得した。獲得した血清から抗−HEL抗体(総IgG、Ig G1、Ig G2a)の力価を測定するためにELISAを行った。
獲得した血清にPBS/0.2%アジ化ナトリウム(sodium azide)を用いて1:10で希釈(dilution)して−20℃に保管した。96ウェル免疫プレート(Nunc)にHEL(10μg/mL重炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6)を入れて4℃で16時間放置してプレート底にHELを固定した。PBST(PBS/0.05%Tween20)を用いてプレートを洗浄し、細胞をブロッキングするために、1%牛血清アルブミン(BSA)を入れて室温で1時間放置した。血清をPBSを用いて1:3で連続希釈してプレートに順次添加し、4℃で16時間放置した後、PBSTで洗浄した。アルカリホスファダーゼ−共役検出(Alkaline phosphatase−conjugated detecting)抗体をPBSTに混ぜてプレートに添加し、室温で2時間放置した。総Igを検出するために、1:2,000ヤギ抗−マウスIg(H+L)(Southern Biotechnology Associates)抗体を使用した。発色のために1−StepTM ABTS(PIERCE)を入れ、ELISAリーダー(Labsystems)を用いて405nmで吸光を測定した(Chu, R. S., et. al., (1997) J. Exp. Med. 186, 1623−1631)。
MB−ODN 4/5#31のサイトカイン生産誘導
<6−1>樹状細胞におけるサイトカイン発現
a)樹状細胞の分離およびMB−ODN 4/5#31での処理
4週齢のBalb/cマウスの大腿部の骨髄から前駆細胞を分離した。分離された前駆細胞をRBC溶解溶液(150mM NH4Cl、10mM 炭酸カリウム、0.1mM EDTA pH7.4)と反応させた後、細胞を回収した。前記細胞を6−ウェルプレート(Nunc)に2×106cells/wellの密度で分注した。骨髄の前駆細胞を樹状細胞に分化させるために、IL−4とGM−CSF(biosource)をそれぞれ10ng/mLの濃度で添加した10%FBS含有RPMI培地を各ウェルに加えた(Ghosh, M., J Immunol. 170: 5625−5629, 2003)。細胞を37℃で5%CO2インキュベーター中でインキュベートした。細胞は、2日毎に使用した培地を新鮮な培地に交替しながら6日間インキュベートした。その後、細胞を、本発明に係るO型MB−ODN 4/5#31、CpG−ODN 1826およびnon−CpG−ODN2041と10μg/mLのレベルで処理した。
本発明に係るO型MB−ODN 4/5#31で処理した樹状細胞におけるIL−12の発現レベルを測定するためにRT−PCRを行った。
本発明に係るMB−ODN 4/5#31で処理したマウスにおいてIL−12p40の発現レベルを測定するために免疫化した後、ELISAを行った。
4週齢のBalb/cマウスにO型とS型のMB−ODN 4/5#31、およびnon−CpG−ODN2041(100μg/匹)それぞれを腹腔内投与した。24時間経過後、ハートパンチング方法で血液を採取し、遠心分離して血球を沈澱させ、血清を獲得した。
まず、前記実施例<5−2>と同様に、MB−ODN 4/5#31で免疫化したBalb/cマウスから単離された血清中で抗−IL−12p40および抗−IL−4抗体の力価を測定するためにELISAを行った。
マウスの脾臓から免疫細胞を収集し、これを5×105cells/wellの密度で各ウェルに分注した。その後、各ウェルをO型またはS型のMB−ODN 4/5#31、およびnon−CpG−ODN 2041(0または10μg/mL)で処理し、24時間インキュベートした。培養が完了した後、細胞培養液を分離した。その後、細胞培養液内サイトカインのレベルを測定するために、各商用化された抗−IL−12 p40およびIL−4抗体(R&D systems、ミネソタ州ミネアポリス)を用いて、前記実施例<5−2>と同様にサンドイッチELISAをそれぞれ行った。
アトピー性皮膚炎を治療する能力を調査するためのインビボ分析
<7−1>本発明のMB−ODN 4/5#31含有軟膏剤の塗布
NC/Ngaマウス6匹を2つの群に分けた:MB−ODN 4/5#31処理群および無処理群。製造したO型MB−ODN 4/5#31を含有する軟膏剤(0.2mg/head)を処理群のマウスの背にあるアトピー性皮膚炎病変部位に5日に1回ずつ2週間(総4回)塗布した。本発明のCpG ODNが添加されていないペトロラタムを、無処理群のマウスに同一の条件で塗布した。
本発明のMB−ODN 4/5#31含有軟膏剤の塗布後5日目または7日目にアトピー性皮膚炎の病変部位を肉眼で観察した。その結果、図12aに示すように、無処理群のマウスと比較するとき、O型MB−ODN 4/5#31を塗布したマウスの背において皮膚病変の消失が観察された。また、マウスの背から皮膚を摘出してH&E染色法によってアトピー性皮膚炎の治療効果を調査した。その結果、図12bに示すように、本発明のO型MB−ODN 4/5#31を塗布したマウスの病変では、過角化症(hyperkeratosis)とアカントシース(acanthosis)が著しく減少し、真皮内リンパ球の浸潤も減少して、アトピー性皮膚炎がマウスの病変部位で治療されることを確認した。
a)サイトカインの発現
本発明のMB−ODN 4/5#31含有軟膏剤の塗布後5日目、7日目および14日目に1.5×1.5cm2の皮膚を摘出した。その後、4%ホルマリン溶液で少なくとも1日固定した。固定された皮膚組織をパラフィンで処理して5μmの厚さに切った。パラフィンを除去した後、以下のようにLSAB+kit(DAKO、デンマーク)のマニュアルに従って実験を行った。上記皮膚組織を3%H2O2で10分間処理した。その後、皮膚組織を0.1%BSAを含有するTBS(Tris−buffered saline、pH7.4)で希釈した10%正常ヤギ血清を添加してブロッキングした。次いで、皮膚組織を、1次抗体、例えばヤギ抗マウスIL−10抗体、ヤギ抗マウスIL−4抗体(Santa Cruz、USA)、ラット抗マウスIFN抗体(Pierce、USA)で処理し、4℃で少なくとも12時間反応させた。その後、皮膚組織をビオチン標識2次抗体を室温で少なくとも30分間反応させた後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンをそこへ添加して常温で約30分間反応させた。DAB Substrate chromogen system(DAKO、デンマーク)を用いて皮膚組織を染色した後、染色した皮膚組織を顕微鏡によって観察した。
本発明のO型MB−ODN 4/5#31含有軟膏剤の塗布後5日目、7日目および14日目に1.5×1.5cm2の皮膚を摘出した。摘出された皮膚組織を液体窒素で冷凍した。その後、ティッシュテック(Tissue−Tek)OCT化合物(Sakura Finetek USA、INC.)を用いて皮膚組織を試料ブロックに挿入し、低温保持装置(cryostat)を用いて5μmの厚さに切断した。切断された皮膚組織を1次抗体、例えばラット抗マウスCD4mAb(BD phamingen、USA)またはラット抗CD8mAb(Serotec、UK)を4℃で12時間反応させた。次いで、上記皮膚組織をビオチン標識2次抗体で常温で少なくとも30分間反応させ、次いで、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンをそこに添加して常温で約30分間反応させた。DAB Substrate chromogen system(DAKO、デンマーク)を用いて皮膚組織を染色した後、染色した皮膚組織を顕微鏡によって観察した。写真は全て100倍で撮った。
各群のマウスから血漿を収得し、使用する前まで−20℃で保管した。総IgE水準は、マウスIgE BD OptEIA Kit(BD phamingen、USA)を用いて測定した。その後、血漿内IgE抗体(BD pharmingen、USA)レベルを調査するために、商用化されたビオチン標識IgE抗体(BD phamingen、USA)を用いて前記実施例<5−2>と同様にサンドイッチELISAをそれぞれ行った。
これらの結果より、本発明のO型MB−ODN 4/5#31がTh1−リンパ球によって仲介されるサイトカインの発現を増加させるが、Th2リンパ球によって仲介されるサイトカインの発現を抑制し、血清内IgE水準を減少させることにより、アトピー性皮膚炎の治療に非常に優れた効果を示すことを確認することができた。
放射線照射の際に免疫細胞の生存率に及ぼすMD−ODN 4/5#31の効果
<8−1>MB−ODN 4/5#31処理によるBcl−xs/Lの発現
6ウェルプレートにRAW264.7細胞を1×105細胞/ウェルで敷き、24時間37℃、5%CO2インキュベーター中でインキュベートした。各細胞を、10μg/ウェルの密度で合成オリゴヌクレオチドと処理し、37℃、5%CO2インキュベーター中で6時間インキュベートした。溶解緩衝液(lysis buffer)を100μL/ウェルずつ入れ、RAW264.7細胞を均質化した。細胞溶解液を遠心分離して上澄み液(15μL)を得て、これを用いてウェスタンブロットを行った。生じた上澄み液を、抗体−ヤギ抗マウスBcl−xs/Lで処理し、ペルオキシダーゼ標識2次抗体と反応させた後、エンハンストケミルミネサンス試薬(enhanced chemiluminescence reagent)(Amersham Pharmacia Biotech、ニュージャージー州ピスカタウェイ、USA)を用いてBcl−xs/Lを観察した。
4ウェルチャンバースライド(Lab−TEK Chamber slide、Nalge Nunc International,Inc)にRAW264.7細胞を3×104細胞/ウェルで敷き、24時間37℃、5%CO2インキュベーター中でインキュベートした。各ウェルを、10μg/ウェルの密度で合成オリゴヌクレオチドと6時間処理し、γ−照射器で10Gy放射線を照射した後、37℃、5%CO2インキュベーター中で48時間インキュベートした。培養したRAW264.7細胞の培地に3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)溶液(5×、2μg/mL)を直接添加し(0.4μg/mLとなるように)、37℃、5%CO2インキュベーター中で4時間反応させた。各ウェルの培地を完全にに除去し、DMSO0.5mLを添加した後、37℃で10分間反応させ、生成されたホルマザン(formazan)結晶を溶かした。反応液100μLを取って、570nmで吸光度を測定するために使用した。
6ウェルプレートにRPMI8226細胞を1×105細胞/ウェルで敷き、10μg/ウェルの密度で合成オリゴヌクレオチドと6時間処理し、γ−照射器で10Gy放射線を照射した後、37℃、5%CO2インキュベーター中で48時間インキュベートした。インキュベートした細胞にヨウ化プロピジウム(PI)(Propidium Iodide)を50μg/mLで添加して、10分間氷浴で反応させた後、フローサイトメトリー(Flow Cytometry)でPIでの細胞染色のレベルを確認した。
Claims (5)
- 免疫反応(adjuvant)を刺激するための、または免疫疾患を治療するためのオリゴデオキシヌクレオチドであって、以下:
5’−AGCAGCGTTCGTGTCGGCCT−3’(配列番号3)、5’−AGCAGCGTTCGTGTGCGCCT−3’(配列番号4)、5’−AGCAGCGTTCATGTCGGCCT−3’(配列番号5)、5’−AGCAGCGTTCGTGTCCGCCT−3’(配列番号6)、5’−GTATTCGTTCGTGTCGTCCT−3’(配列番号7)、および5’−TGACTCGTTCGTGTCGCATG−3’(配列番号8)からなる群より選択される、前記オリゴデオキシヌクレオチド。 - 前記オリゴデオキシヌクレオチドが、放射線治療を適用する際に正常免疫細胞を保護する、請求項1に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- 前記オリゴデオキシヌクレオチドが、皮膚疾患を治療または予防する、請求項1に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- 前記オリゴデオキシヌクレオチドが、多様なTh1/Th2免疫反応のバランスを維持する、請求項1に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- 前記オリゴデオキシヌクレオチドが、前記ヌクレオチド間にホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合を有する、請求項1に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
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