JP4830114B2 - 汎用的高感度elisa法およびその試薬キット - Google Patents
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Description
Tijssen P、石川栄治 訳:『エンザイムイムノアッセイ』、東京化学同人、8―345 (1992)
(I-1)下記の少なくとも1つの試薬を含む、ELISA試薬キット:
(a)抗原固相化用緩衝液としてTris-buffered saline(TBS)、
(b)ブロッキング剤としてポリエチレンイミン。
(I-2)アミノプレートELISA法のためのELISA試薬キットである、(I-1)に記載するELISA試薬キット。
(I-3)さらにアミノプレートを含有する、(I-1)または(I-2)に記載するELISA試薬キット。
(II-1)下記の工程(1)〜(4) を有するアミノプレートELISA法であって、
(1)(a)抗原固相化用緩衝剤の存在下で、アミノプレートに抗原を固定化する工程、
(2)(b)ブロッキング剤で、上記抗原固相化プレートを処理する工程、
(3)上記プレート上に固相化された抗原と標識抗体とを反応させる工程、および
(4)形成された抗原−標識抗体を識別して、当該抗原−標識抗体を測定する工程、
−上記の(a)抗原固相化用緩衝剤としてTBSを用いるか、
−上記の(b)ブロッキング剤としてポリエチレンイミンを用いるか、または、
−上記の(a)抗原固相化用緩衝剤としてTBSを用い、かつ、上記の(b)ブロッキング剤としてポリエチレンイミンを用いることを特徴とする、アミノプレートELISA法。
(II-2)(a)抗原固相化用緩衝剤として、0.005〜0.5MのTBSを用いることを特徴とする、(II-1)に記載するアミノプレートELISA法。
(II-3)(b)ブロッキング剤として、0.1〜3重量%のポリエチレンイミンを用いることを特徴とする、(II-1)または(II-2)に記載するアミノプレートELISA法。
本発明のELISA試薬キットは、アミノプレートELISA法において好適に使用される試薬であって、その内容成分として、下記の(a)または(b)のいずれか一方、または両方を含むことを特徴とする:
(a)抗原固相化用緩衝剤として、Tris-buffered saline(TBS)
(b)ブロッキング剤としてポリエチレンイミン。
本発明で、抗原固相化用緩衝剤として用いられるTris-buffered saline(TBS)は、Trizma(登録商標)base(SIGMA社)と塩化ナトリウムを水に溶解して調製される緩衝剤であり、例えば、10×TBS(0.5M Tris Base, 9% NaCl, pH7.6)は下記のようにして調製することができる。
Trizma(登録商標)base(SIGMA社) 61 g
NaCl 90 g
蒸留水 1000 ml
上記の割合でTrizma(登録商標)baseと塩化ナトリウムを蒸留水に溶解して、塩酸を用いて、pH7.6に調整する。
ブロッキング剤は、標的物(抗原)を固相化したアミノプレートのウエルに標識抗体を添加して標的物(抗原)と反応させる前に、あらかじめ当該アミノプレートを処理して、アミノプレートと標識抗体との非特異的な結合を抑制するために使用される試薬である。
本発明のELISA試薬キットは、上記の抗原固相化用緩衝剤、および/または、ブロッキング剤に加えて、他の成分として、アミノプレートを含むことができる。
本発明が提供するアミノプレートELISA法は、下記の工程(1)〜(4) を有する方法であって、下記(a)抗原固相化用緩衝剤、および/または、(b)ブロッキング剤として、前述するTBSおよび/またはポリエチレンイミンを用いることを特徴とするものである:
(1)(a)抗原固相化用緩衝剤の存在下で、アミノプレートに抗原を固定化する工程(抗原固相化工程)、
(2)(b)ブロッキング剤で、上記抗原固相化プレートを処理する工程(ブロッキング処理工程)、
(3)上記プレート上に固定された抗原と標識抗体とを反応させる工程(標識工程)、および
(4)形成された抗原−標識抗体を識別して、当該抗原−標識抗体を測定する工程(検出工程)。
アミノプレートELISA法において、次の3種類の緩衝液を用いて、アミノプレートへの抗原(標的物)の固定化に対する各緩衝液の影響を調べた。
(i)TBS:Tris-buffered saline (SIGMA) (pH7.6)
2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパンジオール(1.39 g/l)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(6.06 g/l)、および塩化ナトリウム(9 g/l)を含有する水溶液
(ii)PBS:phosphate buffered saline(和光純薬)(pH6.5)
8.1mmol/l Na2HPO4、1.47mmol/l KH2PO4、137mmol/l NaCl及び2.68mmol/l KClを含有する水溶液
(iii)SBS:sodium bicarbonate buffered saline(pH9.8)
重炭酸ナトリウム10.6 g/lを含有する水溶液。
(1)まず、アミノプレート(Immobilizer Amino Plate Clear Strip:Nunc製)のウエルに、上記各緩衝液を100μl/wellの割合で注ぎ(1緩衝液毎、3ウエルに注入)、26℃の条件下、100 rpmで振盪させながら、60分間放置した(緩衝液での前処理)。
(2)次いで、ウエルを0.1%のTween20を含む0.05M TBSで洗浄した後、各緩衝液で1μg/mlとなるように希釈した抗原anti-GOAT-IgG (SIGMA)を100μl/wellの割合で注ぎ、再度26℃の条件下、100 rpmで振盪させながら 60分間放置した(抗原固相化処理)。なお、ここで抗原として使用したanti-GOAT-IgG は、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)で標識されている。
(4)これに反応停止液(ELISA Stop-solution:リン酸水溶液1mol/l)を100μl/wellの割合で注いで、上記TMBの反応を停止し、各ウエルの反応液の吸光度(450nm)を、MICROPLATE READER (BIO RAD)で測定した。
結果を図1に示す。横軸は使用した緩衝液の種類を、縦軸はELISA法で得られた吸光度(450nm)を示す。なお、横軸の緩衝液名の後ろの(+)と(-)は、それぞれ「緩衝液前処理あり」と「緩衝液前処理なし」を意味する。
アミノプレートELISA法において、10種類の試薬〔グリシン、ニコチンアミド、モノエタノールアミン、グルタミン酸ナトリウム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール(以上、和光純薬)、ウシ血清アルブミン(BSA)、ポリエチレンイミン(以上、SIGMA)〕を用いて、各試薬のブロッキング性能を調べた。なお、これらの試薬のうち、カゼインとBSAは、アミノプレートELISA法において、従来からブロッキング剤として使用されている公知の試薬である。
(1)TBSを用いて各濃度(3.12 ng/ml、1.56 ng/ml、781 pg/ml、390 pg/ml、195 pg/ml、97 pg/ml、48 pg/ml)になるように希釈したmouse-IgG(DAKO社)を、アミノプレート(Immobilizer Amino Plate White:Nunc製)の各ウエルに100μl/wellの割合で注ぎ、これにTBSを100μl/wellの割合で注入して、26℃の条件下、100 rpmで振盪させながら、60分間放置した(抗原固定化処理)。なお、ここでTBSとして、実験例1と同様に、2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパンジオール1.39 g/l、およびトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩6.06 g/lを含有する水溶液を用いた。
測定した発光強度(シグナル強度)から、各試薬(ブロッキング剤候補)の最適濃度を決定した。その結果、グリシンの最適濃度は0.5%前後、ニコチンアミドは0.8%前後、モノエタノールアミンは4mM/L前後、グルタミン酸ナトリウムは0.5%前後、ゼラチンは0.5%前後、ポリエチレンイミンは1%前後、ポリビニルアルコールの最適濃度は0.7%前後であると認められた。
実施例 白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor:LIF)の検出
マウス胎児から採取した脳脊髄液(CSF)、羊水(AF)、血清(SEおよびSD)を、等量の50%エチレングリコールと混合した溶液を用いて、本発明のアミノプレートELISA法を行った。具体的には、アミノプレートとして、Nunc Immobilizer Amino plate(Nalge Nunc International)を用い、抗原固定化用緩衝液として、0.05MのTris-bufferd saline(TBS)を使用し、またブロッキング剤として1重量%のポリエチレンイミンを使用する以外は、定法のダイレクトELISA法(Harlow E, Lane DP. Antibodies.: A laboratory manual. New York, Cold Spring Harbor laboratory; 1988)に従って行った。具体的には、上記検体を上記のTBSで所定濃度になるように調製し、これをアミノプレートの各ウエルに注入して、室温で1時間処理した(固相化)。次いで、得られたプレートの各ウエルを蒸留水で洗浄した後、1重量%のポリエチレンイミン水溶液を注入して室温で30分間処理してブロッキングした。次いで、得られたプレートの各ウエルを蒸留水で洗浄した後、1重量%のポリエチレンイミン水溶液を注入して室温で30分間処理してブロッキングした。
Claims (5)
- 下記(a)および(b)の試薬をそれぞれ個別に包装された形態で含む、アミノプレートELISA法のためのELISA試薬キット:
(a)抗原固相化用緩衝液としてTris-buffered saline、
(b)ブロッキング剤としてポリエチレンイミン - さらにアミノプレートを含有する、請求項1に記載するELISA試薬キット。
- −下記の工程(1)〜(4) を有するアミノプレートELISA法であって、
(1)(a)抗原固相化用緩衝剤の存在下で、アミノプレートに抗原を固定化する工程、
(2)(b)ブロッキング剤で、上記抗原固相化プレートを処理する工程、
(3)上記プレート上に固相化された抗原と標識抗体とを反応させる工程、および
(4)形成された抗原−標識抗体を識別して、当該抗原−標識抗体を測定する工程、
−上記の(a)抗原固相化用緩衝剤としてTris-buffered salineを用い、かつ上記の(b)ブロッキング剤としてポリエチレンイミンを用いることを特徴とする、アミノプレートELISA法。 - (a)抗原固相化用緩衝剤として、0.005〜0.5MのTris-buffered salineを用いることを特徴とする、請求項3に記載するアミノプレートELISA法。
- (b)ブロッキング剤として、0.1〜3重量%ポリエチレンイミンを用いることを特徴とする、請求項3または4に記載するアミノプレートELISA法。
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