JP4825818B2 - 塩基配列判定方法、塩基配列判定システム及び塩基配列判定プログラム - Google Patents
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Description
SNPの解析のような分子生物学的技術には、非常に多くの試料につき膨大な数の操作を行うことが含まれている。それらは、しばしば、複雑で時間がかかり、一般に高い精度が要求される。多くの技術は、感度、特異性又は再現性の欠如によってその適用が制限されている。
この様な事情のもと、本発明者らは、既に、例えば、SNP(一塩基多型)の判定(2種の塩基のホモ/ヘテロ判定)をするのに、それぞれの信号の大きさをt検定により、有意差判定を行う方法を提案している(特許文献1参照。)。特許文献1に記載された方法では、ほぼ完全に2種の信号値が一致していない限り、ヘテロ判定をすることはないが、実際の測定では、この様なことは不可能である。
(ホ)検出信号の平均値からネガティブコントロール信号の平均値を減算した平均値の差を、予め定めた信号増加量判定基準と比較する第5工程と、(ヘ)平均値の差が信号増加量判定基準よりも大きい場合、平均値の差と、検出信号の標準偏差とネガティブコントロール信号の標準偏差との和の比を予め定めた実効変動係数と比較する第6工程とを含む塩基配列判定方法であることを要旨とする。ここで、信号増加量判定基準は、コントロール電極に対する検出用電極が検出した電流データの信号増加の有無の判定基準を与えるように設定されるパラメータであり、実効変動係数は、複数の検出用電極が検出した電流データにバラツキがあるか否かを判断するために、比を用いる判定の下限であり、比が実効変動係数より小さいと判断された場合には、サンプルDNA中に、検出用電極に固定されたプローブDNAと相補的な配列を有するDNAの存在が不明瞭と判断するように設定されるパラメータである。そして、第1の態様に係る塩基配列判定方法は、平均値の差が信号増加量判定基準より大きく、比が実効変動係数より大きい場合、サンプルDNAは検出用電極に固定されたプローブDNAと相補的な配列を有すると判定することを特徴とする。
本発明の実施の形態に係る塩基配列判定システムは、図7に示すように、チップカートリッジ11と、このチップカートリッジ11と電気的に接続される測定系12、チップカートリッジ11に設けられた流路とインタフェース部を介して物理的に接続される送液系13及びチップカートリッジ11の温度制御を行う温度制御機構14等を備える。図7の測定系12は、図1に示すように、対極502の入力に対して参照極561,562の電圧をフィードバック(負帰還)させることにより、セル内の電極や溶液などの各種条件の変動によらずに溶液中に所望の電圧を印加する3電極方式のポテンシオ・スタットであり、検出チップ21の端子C,R,Wに接続されている。図1の検出チップ21は、図7のチップカートリッジ11に備えられている。
Vw=Iw・Rw ・・・・・(1)
となる。この端子Oから得られる電気化学信号は、図7に示す制御機構15に出力される。作用極551,552,553は複数あるため、端子W及び端子Oは、作用極551,552,553のそれぞれに対応して複数設けられる。複数の端子Oからの出力は後述する信号切替部により切り替えられ、AD変換されることにより各作用極551,552,553からの電気化学信号をデジタル値としてほぼ同時に取得することができる。なお、端子W及び端子Oの間のトランス・インピーダンス増幅器511などの回路は、複数の作用極551,552,553で共有しても良い。この場合、配線501aに複数の端子Wからの配線を切り替えるための信号切替部を備えれば良い。
y[n]=(x[n]+x[n+1]+x[n+2]+x[n+3]+x[n+4])/5 ・・・・・(2)
が、図15(b)に示す移動平均値となる。移動平均により、図15(a)に示すような変動が図15(b)に示すように平準化(スムージング)され、全体的な傾向を分析するが容易になる。
有無判定モジュール330は、図28に示すフローチャートに示す一連の手順に従い、対象とする核酸が存在するかどうかを判定する。
図14に示すフローチャートを用いて、本発明の実施の形態に係る塩基配列判定方法を説明する。なお、以下に述べる塩基配列判定方法は、一例であり、この変形例を含めて、これ以外の種々の塩基配列判定方法により、実現可能であることは勿論であるが、いずれにせよ、図3に示すようなプローブDNA571,572,573が固定化されたチップカートリッジ11にサンプルDNA581,582,583を含む薬液(試料)を注入してハイブリダイゼーション反応などを生じさせ、バッファによる洗浄、挿入剤の導入による電気化学反応を経て測定系12を用いて図13に示すような電気化学的電流の電流−電圧特性を求めることが基礎となる。電気化学的電流の電流−電圧特性から、各プローブDNA571,572,573のハイブリダイゼーション反応に定量的に対応するピーク電流値を算出する。そして算出されたピーク電流値を統計的にデータ処理し、これにより核酸の存在の有無を判定し、或いは核酸の一塩基多型の型判定をする。
(イ)先ず、チップカートリッジ11にサンプルDNAを含む薬液(試料)を注入してハイブリダイゼーション反応などを生じさせ、挿入剤の導入による電気化学反応による電流−電圧特性を測定系12を用いて、各電極毎に測定する。図4に基板714上に多数の電極ユニット761を模式的に示したが、この多数の電極ユニット761に対応して、プローブDNA571,572,573がそれぞれ固定化されるSNP1検出用電極551,SNP2検出用電極552,コントロール電極553は、等価な電極として多数存在し、それに対応して多数のデータが取得される。ステップS101において、ノイズ除去モジュール301が、プローブDNA571,572,573が固定化された各電極毎に、測定された一群のデータのそれぞれを、平準化(スムージング)により、ノイズを除去する。スムージングは、既に説明したように、図15に示すような、単純移動平均法を用いれば良い。
(ロ)次に、ステップS102において、電流波形判定モジュール302が、各電極毎に測定された電流波形(電流−電圧特性)のベースラインの傾きをそれぞれ求め、それぞれのベースラインの傾きにより、それぞれの検出信号(電流波形)の正常・異常を判定し、異常な検出信号を演算対象外とする。ステップS102における電流波形判定モジュール302の処理の詳細は、図16のフローチャートを用いて後述する。
図1の測定系12が測定したチップカートリッジ11における電気化学的電流の信号(電流波形)は、特徴的に、図17に示したような電流−電圧特性の波形をとる。電気信号を発生する物質(挿入剤)に特有の電圧において、図17に示したようなピーク形状を有する電流−電圧特性の波形を持っている。図17では、データ1とデータ2の2種類の電流−電圧特性を示しているが、データ1の電流−電圧特性が示すベースラインの傾きに比して、データ2の電流−電圧特性が示すベースラインの傾きの方が大きく、データ2の電流−電圧特性では、ピーク形状が不明確で肩(ショールダー)的な変化を示している。
(a)先ず、ステップS201において、各電極毎に測定された電流波形(電流−電圧特性)のベースラインの傾きを計算する範囲を抽出し、設定する。この範囲の抽出では、設定パラメータとして、範囲下限電圧VLoと範囲上限電圧VHi(VLo < VHi)を入力装置304を用いて設定し、波形判定用電圧範囲記憶部351に格納する。更に、ベースラインの傾きの許容範囲を規定するパラメータとして「傾き下限値(Coef Lo)」と「傾き上限値(Coef Hi)」を設定し、傾き許容範囲記憶部352に格納する。
ステップS103におけるピーク電流検出モジュール310の処理の詳細を、図18及び図19のフローチャートを用いて説明する。ステップS103において、測定系12が測定したそれぞれの電極ユニット761による電流−電圧特性の波形から、それぞれの正味のピーク電流値を検出する工程は、ステップS221〜S223における電流ピークを与える電圧値を算出する工程(図20参照。);ステップS224〜S228におけるベースラインを近似する工程(図21及び図22参照。);及びステップS229〜S230におけるピーク電流値を算出する工程(図23参照。)を、各電極ユニット761のそれぞれの電流−電圧特性に対して実行する手順からなる:
(a)チップカートリッジ11で測定された電気化学的電流の電流−電圧特性が示す電流ピークは、ほぼ一定の電圧範囲に現れる。このため、ステップS221においては、図8に示した入力装置304を用い、予め、ピーク探索電圧値範囲[V1,V2]を設定パラメータとしてピーク探索電圧値範囲記憶部353に格納しておく。即ち、図20に示すように、電気化学的電流のピーク電流探索は、下限値V1〜上限値V2の範囲で行う。先ず、ステップS222において、ピーク電流検出モジュール310の電圧値算出部311は、電気化学的電流の電流(i)−電圧(v)特性の波形を電圧値(v)に対して微分演算する。そして、ステップS223において、電圧値算出部311は、下限値V1〜上限値V2の範囲において、電気化学的電流の微分値(di/dv)が「ゼロクロス」する点の電圧値Vpk1と電流値Ipk1を算出する(図20参照。)。「ゼロクロス」する点とは、電気化学的電流の微分値(di/dv)が正値から負値に変化する点、又は負値から正値に変化する点であり、電流ピークを与える電圧値Vpk1及び電流値Ipk1に対応する。図20には、電圧値の増大に伴い、微分値(di/dv)が負値から正値に変化する点の電圧値Vpk1と電流値Ipk1が示されている。「ゼロクロス値」が奇数個ある場合には、電圧値Vpk1として、中央の値を、偶数個ある場合には、電圧値Vpk1として中心値に最も近い値を採用する。ステップS223において算出された「ゼロクロス値(ゼロクロス電圧値Vpk1,ゼロクロス電流値Ipk1)」は、ゼロクロス値記憶部354に、図4に示した基板714上の、すべての電極ユニット761毎に整理して、格納する。
y = ax+b ・・・・・(3)
を、ゼロクロス電圧値Vpk1と変曲点電圧Vifpの間で求める。例えば、ゼロクロス電圧値Vpk1と変曲点電圧Vifpの間における電流−電圧特性の波形データを、最小二乗法により式(3)のように直線近似する。図21に示す例では、一次式の係数a=-1.397×10-10、定数b=3.396×10-8と求められ、図22に示す例では、一次式の係数a=-2.899×10-11、定数b=4.504×10-9と求められる。更に、ベースライン近似部312はステップS226において、電流−電圧特性の波形と式(3)の近似直線との交点を与える交点電圧Vcrsを図22に示すように求め、この交点電圧Vcrsを交点電圧記憶部356に格納する。そして、ベースライン近似部312はステップS227において、交点電圧Vcrsを起点として、設定パラメータとして規定しているオフセット値だけ電圧を負の方向に遡った(電圧を減少させた)オフセット電圧Vofsを、図22のように求める。求められたオフセット電圧Vofsは、オフセット電圧記憶部357に格納する。更に、ベースライン近似部312は、オフセット電圧Vofsをオフセット電圧記憶部357から、交点電圧Vcrsを交点電圧記憶部356からそれぞれ読み出し、ステップS228において、オフセット電圧Vofsと交点電圧Vcrsの間の電流−電圧特性の波形データのバックグラウンドの接線(ベースライン)となる近似一次式を最小二乗法により、図23に示すように求める。この近似一次式は、式(3)と同様な形式で表現可能で、図23に示す直線近似では、一次式の係数a=-6.072×10-12、定数b=-5.902×10-9と求められる。
Ipk2 =abs(Ipk1−Ibg) ・・・・・(4)
式(4)を各電極ユニット761のそれぞれのSNP1検出用電極(SNP="G"検出用電極)551,SNP2検出用電極(SNP="T"検出用電極)552,コントロール電極553のそれぞれの電流−電圧特性に対して適用することにより、各電極ユニット761のそれぞれの電極551,552,553から、それぞれ真の電流値Ipk2が算出される。
以上説明したように、図14のステップS103では、ピーク電流検出モジュール310が、測定系12が測定した各電極ユニット761によるそれぞれの電流−電圧特性のピークを示すゼロクロス電流値Ipk1から、バックグラウンド(ベースライン)の電流値Ibgを差し引いて、各電極ユニット761のそれぞれのSNP1検出用電極(SNP="G"検出用電極)551,SNP2検出用電極(SNP="T"検出用電極)552,コントロール電極553毎に、それぞれの正味の電流値Ipk2が、種々の判定モードで算出され、分類される。図24(a)〜(c)及び図25(d)〜(f)に示した集合的な棒グラフにより分類されるモードA〜Fは、そのような検出信号の代表例を示したものである。モードA〜Fを示すそれぞれの図において、左端の「コントロール」と示した電流値Ipk2は、複数のコントロール電極553によって測定された値であり、中央の「T」と示した電流値Ipk2は、複数のSNP2検出用電極(SNP="T"検出用電極)552によって測定された値であり、右端の「G」と示した電流値Ipk2は、複数のSNP1検出用電極(SNP="G"検出用電極)551によって測定された値である。
(a)ステップS301では、異常データ除外モジュール320は、グループで定義したすべて電極から得られる電流値Ipk2をデータとして採用する。グループ単位は、同等の電極毎に定義される。即ち、複数の電極ユニット761のそれぞれのSNP1検出用電極(SNP="G"検出用電極)551,SNP2検出用電極(SNP="T"検出用電極)552,コントロール電極553毎に、定義される。
(CV(0))*(dCV/CV)> CV(1) ・・・・・(4)
(e)ステップS305で、第1CV値CV(0)をCV値補正係数dCV/CVで補正した(乗した)値が、第2CV値CV(1)よりも小さくなったら、最小値の除外が適切でなかったので、ステップS321に進む。異常データ除外モジュール320はステップS321で、そのグループの一連のデータから除外した最小値をもとに戻し、今度は、そのグループの一連のデータの最大値を除外して、再度そのグループで定義されている他のすべて電極から得られる電流値Ipk2の標準偏差と平均値を計算する。そして、ステップS321では、最大値を除外した標準偏差を最大値を除外した平均値で除して、第3CV値CV(2)を求め、ステップS322に進む。
(CV(0))*(dCV/CV)> CV(2) ・・・・・(5)
(e)ステップS322で、第1CV値CV(0)をCV値補正係数dCV/CVで補正した(乗した)値が、第3CV値CV(2)よりも小さくなったら、除外した値が異常値であったと判断できるので、ステップS325に進み、ステップS321で除外した最大値を「演算対象外」とするエラーセットをし、以後の判定フロー(図14のステップS105)からは、この最大値を除外して判定することにする。
図14のステップS105は、図27に示すように2種類のアルゴリズムを含む。このため、先ずステップS332において、ある核酸が存在するかどうかを判定するアルゴリズムのフローに進むのか、SNPの型が、2種の内のどちらであるか、又、それがG/Gホモ型であるか、G/Tヘテロ型であるか、又はT/Tホモ型であるかを判定するアルゴリズムのフローに進むのかを決定する。
図27のステップS332において、ある核酸が存在するかどうかを判定するアルゴリズムのフローに進むと決定された場合は、図28に示すフローチャートの手順で有無判定モジュール330が判断する。
Y1=(X1−Xnc)/(σ1+σnc) ・・・・・(6)
を平均値・標準偏差記憶部360に格納して、ステップS346に進む。
図27のステップS332において、SNPの型が、SNP="G",SNP="T"の2種の内のどちらであるか、又、それがG/Gホモ型であるか、G/Tヘテロ型であるか、又はT/Tホモ型であるかを判定するアルゴリズムのフローに進むと決定された場合は、図29及び図30に示すフローチャートの手順で型判定モジュール340が判断する。
(a)先ず、型判定モジュール340は、ステップS361では、標的数が2個であるか否かを判定する。SNP="G",SNP="T"の2種を判定しようとしているのであるから、標的数が0個,1個、3個等では、そもそも初期設定が間違っているので、図30に示すように、ステップS436で、分類結果記憶部369に判定結果を分類して格納し、表示装置306に「設定エラー」の表示をさせる。
R=Log10(abs((X1−Xnc1)/(X2−Xnc2))) ・・・・・(7)
そして、算出したR値を、絶対値対数記憶部367に格納し、ステップS368に進む。
Y1=(X1−Xcmp1)/(σ1+σcmp1) ・・・・・(8)
を平均値・標準偏差記憶部360に格納して、ステップS404に進む。
Y2=(X2−Xcmp2)/(σ2+σcmp2) ・・・・・(9)
を平均値・標準偏差記憶部360に格納して、ステップS414に進む。
チップカートリッジ11や測定系12に異常があった場合や、データにばらつきがあった場合等でも、それらの異常なデータを除外して、正確にある核酸が存在するかどうかを高い精度で判定できる。又、本発明の実施の形態に係る塩基配列方法によれば、初期設定にエラーがあれば「設定エラー」と判定し,チップ若しくは試料(バイオサンプル)に異常があれば「未定(サンプル・エラー)」と判定し、装置(ハードウェア)に不具合があれば「未定(ハードウェア・エラー)」と判定する等の処理をして、それらの異常なデータを除外できる。更に、信号のばらつきにより判定できない場合や信号強度が弱い場合やその他の原因で不明瞭な場合は「不明瞭」,「自動的には未定(ホモ又はヘテロ)」,「未定(小信号)」,「自動判定不能」,「"1/1ホモ"不明瞭等」,「"2/2ホモ"不明瞭」、「"1/2ヘテロ"不明瞭」等とその状況に応じた判定が可能である。このため、本発明の実施の形態に係る塩基配列方法によれば、種々の測定環境や状況(実状)に適格に応じながら、「"1/1ホモ"OK」,「"2/2ホモ"OK」,「"1/2ヘテロ"OK」等のように、SNPの型が、どの型であるか、又、それがホモ型であるか、ヘテロ型であるか、を高い精度で判断できる。ここで、”1”や”2”と便宜的に表現したものは、実際には”A”、”T”、”G”、”C”等の表示がなされる。
図14,図16,図18−19,図26−30に示した一連の判定操作は、図14,図16,図18−19,図26−30と等価なアルゴリズムのプログラムにより、図8に示した塩基配列判定システムを制御して実行できる。このプログラムは、本発明の塩基配列判定システムを構成するコンピュータシステムのプログラム記憶装置(図示省略)に記憶させれば良い。又、このプログラムは、コンピュータ読取り可能な記録媒体に保存し、この記録媒体を塩基配列判定システムのプログラム記憶装置に読み込ませることにより、本発明の一連の判定操作を実行することができる。ここで、「コンピュータ読取り可能な記録媒体」とは、例えばコンピュータの外部メモリ装置、半導体メモリ、磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、磁気テープなどのプログラムを記録することができるような媒体などを意味する。具体的には、フレキシブルディスク、CD−ROM,MOディスク、カセットテープ、オープンリールテープ、メモリカード、ハードディスク、リムーバブルディスクなどが「コンピュータ読取り可能な記録媒体」に含まれる。
上記のように、本発明は上記の実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面は本発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。
11…チップカートリッジ
12…測定系
13…送液系
14…温度制御機構
15…制御機構
16…コンピュータ
21…検出チップ
300…CPU
301…ノイズ除去モジュール
301,…ノイズ除去モジュール
302…電流波形判定モジュール
303…バス
304…入力装置
305…出力装置
306…表示装置
310…ピーク電流検出モジュール
311…電圧値算出部
312…ベースライン近似部
313…ピーク電流値演算部
320…異常データ除外モジュール
330…有無判定モジュール
340…型判定モジュール
351…波形判定用電圧範囲記憶部
352…許容範囲記憶部
353…ピーク探索電圧値範囲記憶部
354…ゼロクロス値記憶部
355…変曲点記憶部
356…交点電圧記憶部
357…オフセット電圧記憶部
358…ベースライン電流値記憶部
360…平均値・標準偏差記憶部
361…CV値記憶部
362…SLL記憶部
363…ESLL記憶部
364…HUL記憶部
365…MSL記憶部
366…SLR記憶部
367…絶対値対数記憶部
368…HLL記憶部
369…分類結果記憶部
403,413,423,433、441,445,454…電磁弁
454…送液ポンプ
500…保護回路
501a,502a,503a,511a,511b,512a,512b,513a,513b…配線
502…対極
510…電圧パターン発生回路
511…トランス・インピーダンス増幅器
512…反転増幅器
513…電圧フォロア増幅器
551…SNP1検出用電極(作用極)
552…SNP2検出用電極(作用極)
553…コントロール電極(作用極)
561,562…参照極
571,572,573…プローブDNA
581,582,583…サンプルDNA
591…挿入剤
703…電気コネクタ
705…バルブユニット
707,708…ノズル
710…プローブユニット
711…カセット上蓋
712…カセット下蓋
713…パッキン
714…基板
722,723…ノズル差込孔
724,725…電気コネクタ用ポート
726…シール検出孔
727a〜727d,728a,728b,747a〜747d、748a,748b…孔
742…内表面
746…シール検出孔
749…カセット種類判別用孔
752,753…送出ポート
756,757…流路
761…電極ユニット
762,763…パッド
781,782…バルブボディ
789…カセット種類判別用ピン
Rff…フィードバック抵抗
Rf,Rw,Rs…抵抗
Claims (6)
- プローブDNAがそれぞれ固定された複数の検出用電極と、該複数の検出用電極に対応して配置され、前記プローブDNAとは塩基配列が異なるコントロールDNAがそれぞれ固定された複数のコントロール電極とを備えるチップカートリッジに、サンプルDNAを含む薬液を注入する第1工程と、
前記複数の検出用電極を介してそれぞれ検出信号を、前記複数のコントロール電極を介してそれぞれネガティブコントロール信号を取得する第2工程と、
前記検出信号の平均値及び標準偏差を算出する第3工程と、
前記ネガティブコントロール信号の平均値及び標準偏差を算出する第4工程と、
前記検出信号の平均値から前記ネガティブコントロール信号の平均値を減算した平均値の差を、予め定めた信号増加量判定基準と比較する第5工程と、
前記平均値の差が前記信号増加量判定基準よりも大きい場合、前記平均値の差と、前記検出信号の標準偏差と前記ネガティブコントロール信号の標準偏差との和の比を予め定めた実効変動係数と比較する第6工程
とを含み、前記信号増加量判定基準は、前記コントロール電極に対する前記検出用電極が検出した電流データの信号増加の有無の判定基準を与えるように設定されるパラメータであり、前記実効変動係数は、前記複数の検出用電極が検出した電流データにバラツキがあるか否かを判断するために、前記比を用いる判定の下限であり、前記比が前記実効変動係数より小さいと判断された場合には、サンプルDNA中に、前記検出用電極に固定されたプローブDNAと相補的な配列を有するDNAの存在が不明瞭と判断するように設定されるパラメータであり、前記平均値の差が前記信号増加量判定基準より大きく、前記比が前記実効変動係数より大きい場合、前記サンプルDNAは前記検出用電極に固定されたプローブDNAと相補的な配列を有すると判定することを特徴とする塩基配列判定方法。 - 前記チップカートリッジが、前記複数の検出用電極として、第1プローブDNAがそれぞれ固定された複数の第1検出用電極、及び前記第1プローブDNAとは塩基配列が異なる第2プローブDNAがそれぞれ固定された複数の第2検出用電極を備え、更に、前記複数のコントロール電極として、前記複数の第1検出用電極に対応して配置され、前記第1プローブDNA及び前記第2プローブDNAとは塩基配列が異なる第1コントロールDNAがそれぞれ固定された複数の第1コントロール電極、及び前記複数の第2検出用電極に対応して配置され、前記第1プローブDNA及び前記第2プローブDNAとは塩基配列が異なる第2コントロールDNAがそれぞれ固定された複数の第2コントロール電極を備え、
前記第2工程が、前記検出信号として、前記複数の第1検出用電極を介してそれぞれ第1検出信号を、前記複数の第2検出用電極を介してそれぞれ第2検出信号をそれぞれ取得し、前記ネガティブコントロール信号として、前記複数の第1コントロール電極を介してそれぞれ第1ネガティブコントロール信号を、前記複数の第2コントロール電極を介してそれぞれ第2ネガティブコントロール信号をそれぞれ取得する工程であり、
前記第3工程が、前記検出信号の平均値として、前記第1検出信号の平均値及び前記第2検出信号の平均値をそれぞれ算出し、前記検出信号の標準偏差として、前記第1検出信号の標準偏差、及び前記第2検出信号の標準偏差をそれぞれ算出する工程であり、
前記第4工程が、前記ネガティブコントロール信号の平均値として、前記第1ネガティブコントロール信号の平均値及び前記第2ネガティブコントロール信号の平均値をそれぞれ算出し、前記ネガティブコントロール信号の標準偏差として、前記第1ネガティブコントロール信号の標準偏差、及び前記第2ネガティブコントロール信号の標準偏差をそれぞれ算出する工程であり、
前記第5工程が、前記平均値の差として前記第1検出信号の平均値から前記第1ネガティブコントロール信号の平均値を減算した第1平均値の差と、前記第2検出信号の平均値から前記第2ネガティブコントロール信号の平均値を減算した第2平均値の差を、それぞれ算出し、算出した前記第1平均値の差と前記第2平均値の差を、それぞれ、予め定めた前記信号増加量判定基準と比較する工程であり、
前記比として、前記第1平均値の差と、前記第1検出信号の標準偏差と前記第1ネガティブコントロール信号の標準偏差との和の第1の比と、前記第2平均値の差と、前記第2検出信号の標準偏差と前記第2ネガティブコントロール信号の標準偏差との和の第2の比の少なくとも一方を定義し、
且つ、前記平均値の差が前記信号増加量判定基準より大きい場合として、前記第1平均値の差と前記第2平均値の差の少なくとも一方が前記信号増加量判定基準よりも大きい場合を定義し、
前記第6工程が、前記平均値の差が前記信号増加量判定基準より大きい場合、前記第1及び第2の比の少なくとも一方を、予め定めた実効変動係数と比較する工程であり、
前記コントロール電極に対する前記検出用電極が検出した電流データの信号増加として、前記第1コントロール電極に対する前記第1検出用電極が検出した電流データの信号増加及び前記第2コントロール電極に対する前記第2検出用電極が検出した電流データの信号増加をそれぞれ定義し、
前記信号増加量判定基準が、前記第1及び第2コントロール電極に対する前記第1及び第2検出用電極が検出した電流データの信号増加の有無の判定基準を与えるように設定されるパラメータであり、
前記実効変動係数が、前記複数の第1及び第2検出用電極が検出した電流データにバラツキがあるか否かを判断するために、前記第1及び第2の比を用いる判定の下限であり、前記第1又は第2の比が前記実効変動係数より小さいと判断された場合には、前記第1又は第2のプローブDNAと相補的な配列を有するDNAの存在が不明瞭と判断するように設定されるパラメータであり、
前記平均値の差が前記信号増加量判定基準より大きい場合は、前記サンプルDNAは前記検出用電極に固定された第1及び第2プローブDNAの少なくとも1種と相補的な配列を有すると判定することを特徴とする請求項1記載の塩基配列判定方法。 - プローブDNAがそれぞれ固定された複数の検出用電極と、該複数の検出用電極に対応して配置され、前記プローブDNAとは塩基配列が異なるコントロールDNAがそれぞれ固定された複数のコントロール電極とを備えるチップカートリッジと、
前記複数の検出用電極、前記複数のコントロール電極を介して電流を測定する測定系と、
前記チップカートリッジに、薬液を送液する送液系と、
前記測定系及び前記送液系を制御する制御機構と、
該制御機構により前記測定系及び前記送液系を制御し、前記複数の検出用電極を介してそれぞれ検出信号を、前記複数のコントロール電極を介してそれぞれネガティブコントロール信号をそれぞれ電流−電圧特性として取得し、前記検出信号の平均値及び標準偏差を算出し、前記ネガティブコントロール信号の平均値及び標準偏差を算出し、前記検出信号の平均値から前記ネガティブコントロール信号の平均値を減算した平均値の差を、予め定めた信号増加量判定基準と比較し、前記平均値の差が前記信号増加量判定基準よりも大きい場合、前記平均値の差と、前記検出信号の標準偏差と前記ネガティブコントロール信号の標準偏差との和の比を予め定めた実効変動係数と比較する有無判定モジュール、及び前記平均値の差が前記信号増加量判定基準より大きく、前記比が前記実効変動係数より大きい場合、前記サンプルDNAは前記検出用電極に固定されたプローブDNAと相補的な配列を有すると判定する型判定モジュールとを有するコンピュータ
とを備え、前記信号増加量判定基準は、前記コントロール電極に対する前記検出用電極が検出した電流データの信号増加の有無の判定基準を与えるように設定されるパラメータであり、前記実効変動係数は、前記複数の検出用電極が検出した電流データにバラツキがあるか否かを判断するために、前記比を用いる判定の下限であり、前記比が前記実効変動係数より小さいと判断された場合には、サンプルDNA中に、前記検出用電極に固定されたプローブDNAと相補的な配列を有するDNAの存在が不明瞭と判断するように設定されるパラメータであることを特徴とする塩基配列判定システム。 - 前記チップカートリッジが、前記複数の検出用電極として、第1プローブDNAがそれぞれ固定された複数の第1検出用電極、及び前記第1プローブDNAとは塩基配列が異なる第2プローブDNAがそれぞれ固定された複数の第2検出用電極を備え、更に、前記複数のコントロール電極として、前記複数の第1検出用電極に対応して配置され、前記第1プローブDNA及び前記第2プローブDNAとは塩基配列が異なる第1コントロールDNAがそれぞれ固定された複数の第1コントロール電極、及び前記複数の第2検出用電極に対応して配置され、前記第1プローブDNA及び前記第2プローブDNAとは塩基配列が異なる第2コントロールDNAがそれぞれ固定された複数の第2コントロール電極を備え、
前記有無判定モジュールが、
前記検出信号として、前記複数の第1検出用電極を介してそれぞれ第1検出信号を、前記複数の第2検出用電極を介してそれぞれ第2検出信号をそれぞれ取得し、
前記ネガティブコントロール信号として、前記複数の第1コントロール電極を介してそれぞれ第1ネガティブコントロール信号を、前記複数の第2コントロール電極を介してそれぞれ第2ネガティブコントロール信号をそれぞれ取得し、
前記検出信号の平均値として、前記第1検出信号の平均値及び前記第2検出信号の平均値をそれぞれ算出し、
前記検出信号の標準偏差として、前記第1検出信号の標準偏差、及び前記第2検出信号の標準偏差をそれぞれ算出し、前記ネガティブコントロール信号の平均値として、前記第1ネガティブコントロール信号の平均値及び前記第2ネガティブコントロール信号の平均値をそれぞれ算出し、
前記ネガティブコントロール信号の標準偏差として、前記第1ネガティブコントロール信号の標準偏差、及び前記第2ネガティブコントロール信号の標準偏差をそれぞれ算出し、前記平均値の差として前記第1検出信号の平均値から前記第1ネガティブコントロール信号の平均値を減算した第1平均値の差と、前記第2検出信号の平均値から前記第2ネガティブコントロール信号の平均値を減算した第2平均値の差を、それぞれ算出し、算出した前記第1平均値の差と前記第2平均値の差を、それぞれ、予め定めた前記信号増加量判定基準と比較し、
前記比として、前記第1平均値の差と、前記第1検出信号の標準偏差と前記第1ネガティブコントロール信号の標準偏差との和の第1の比と、前記第2平均値の差と、前記第2検出信号の標準偏差と前記第2ネガティブコントロール信号の標準偏差との和の第2の比の少なくとも一方を定義し、
且つ、前記平均値の差が前記信号増加量判定基準より大きい場合として、算出した前記第1平均値の差と前記第2平均値の差の少なくとも一方が前記信号増加量判定基準よりも大きい場合を定義し、
前記平均値の差が前記信号増加量判定基準より大きい場合は、前記第1及び第2の比の少なくとも一方を予め定めた実効変動係数と比較し、
前記型判定モジュールが、前記平均値の差が前記信号増加量判定基準より大きい場合は、前記サンプルDNAは前記検出用電極に固定された第1及び第2プローブDNAの少なくとも1種と相補的な配列を有すると判定し、前記第1及び第2平均値の差が共に前記信号増加量判定基準より小さな場合は判定不能と判断し、
前記コントロール電極に対する前記検出用電極が検出した電流データの信号増加として、前記第1コントロール電極に対する前記第1検出用電極が検出した電流データの信号増加及び前記第2コントロール電極に対する前記第2検出用電極が検出した電流データの信号増加をそれぞれ定義し、
前記信号増加量判定基準が、前記第1及び第2コントロール電極に対する前記第1及び第2検出用電極が検出した電流データの信号増加の有無の判定基準を与えるように設定されるパラメータであり、
前記実効変動係数が、前記複数の第1及び第2検出用電極が検出した電流データにバラツキがあるか否かを判断するために、前記第1及び第2の比を用いる判定の下限であることを特徴とする請求項3記載の塩基配列判定システム。 - プローブDNAがそれぞれ固定された複数の検出用電極と、該複数の検出用電極に対応して配置され、前記プローブDNAとは塩基配列が異なるコントロールDNAがそれぞれ固定された複数のコントロール電極とを備えるチップカートリッジに、サンプルDNAを含む薬液を注入する第1手順と、
前記複数の検出用電極を介してそれぞれ検出信号を、前記複数のコントロール電極を介してそれぞれネガティブコントロール信号を取得する第2手順と、
前記検出信号の平均値及び標準偏差を算出する第3手順と、
前記ネガティブコントロール信号の平均値及び標準偏差を算出する第4手順と、
前記検出信号の平均値から前記ネガティブコントロール信号の平均値を減算した平均値の差を、予め定めた信号増加量判定基準と比較する第5手順と、
前記平均値の差が前記信号増加量判定基準よりも大きい場合、前記平均値の差と、前記検出信号の標準偏差と前記ネガティブコントロール信号の標準偏差との和の比を予め定めた実効変動係数と比較する第6手順
とを含む一連の処理をコンピュータに実行させ、前記信号増加量判定基準は、前記コントロール電極に対する前記検出用電極が検出した電流データの信号増加の有無の判定基準を与えるように設定されるパラメータとし、前記実効変動係数は、前記複数の検出用電極が検出した電流データにバラツキがあるか否かを判断するために、前記比を用いる判定の下限であり、前記比が前記実効変動係数より小さいと判断された場合には、サンプルDNA中に、前記検出用電極に固定されたプローブDNAと相補的な配列を有するDNAの存在が不明瞭と判断するように設定されるパラメータとし、
前記一連の処理により、前記コンピュータに、前記平均値の差が前記信号増加量判定基準より大きく、前記比が前記実効変動係数より大きい場合、前記サンプルDNAは前記検出用電極に固定されたプローブDNAと相補的な配列を有すると判定させることを特徴とする塩基配列判定プログラム。 - 前記チップカートリッジが、前記複数の検出用電極として、第1プローブDNAがそれぞれ固定された複数の第1検出用電極、及び前記第1プローブDNAとは塩基配列が異なる第2プローブDNAがそれぞれ固定された複数の第2検出用電極を備え、更に、前記複数のコントロール電極として、前記複数の第1検出用電極に対応して配置され、前記第1プローブDNA及び前記第2プローブDNAとは塩基配列が異なる第1コントロールDNAがそれぞれ固定された複数の第1コントロール電極、及び前記複数の第2検出用電極に対応して配置され、前記第1プローブDNA及び前記第2プローブDNAとは塩基配列が異なル第2コントロールDNAがそれぞれ固定された複数の第2コントロール電極を備え、
前記第2手順が、前記検出信号として、前記複数の第1検出用電極を介してそれぞれ第1検出信号を、前記複数の第2検出用電極を介してそれぞれ第2検出信号をそれぞれ取得し、前記ネガティブコントロール信号として、前記複数の第1コントロール電極を介してそれぞれ第1ネガティブコントロール信号を、前記複数の第2コントロール電極を介してそれぞれ第2ネガティブコントロール信号をそれぞれ取得する手順であり、
前記第3手順が、前記検出信号の平均値として、前記第1検出信号の平均値及び前記第2検出信号の平均値をそれぞれ算出し、前記検出信号の標準偏差として、前記第1検出信号の標準偏差、及び前記第2検出信号の標準偏差をそれぞれ算出する手順であり、
前記第4手順が、前記ネガティブコントロール信号の平均値として、前記第1ネガティブコントロール信号の平均値及び前記第2ネガティブコントロール信号の平均値をそれぞれ算出し、前記ネガティブコントロール信号の標準偏差として、前記第1ネガティブコントロール信号の標準偏差、及び前記第2ネガティブコントロール信号の標準偏差をそれぞれ算出する手順であり、
前記第5手順が、前記平均値の差として前記第1検出信号の平均値から前記第1ネガティブコントロール信号の平均値を減算した第1平均値の差と、前記第2検出信号の平均値から前記第2ネガティブコントロール信号の平均値を減算した第2平均値の差を、それぞれ算出し、算出した前記第1平均値の差と前記第2平均値の差を、それぞれ、予め定めた前記信号増加量判定基準と比較する手順であり、
前記比として、前記第1平均値の差と、前記第1検出信号の標準偏差と前記第1ネガティブコントロール信号の標準偏差との和の第1の比と、前記第2平均値の差と、前記第2検出信号の標準偏差と前記第2ネガティブコントロール信号の標準偏差との和の第2の比の少なくとも一方を定義し、
且つ、前記平均値の差が前記信号増加量判定基準より大きい場合として、前記第1平均値の差と前記第2平均値の差の少なくとも一方が前記信号増加量判定基準よりも大きい場合を定義し、
前記第6手順が、前記平均値の差が前記信号増加量判定基準より大きい場合、前記第1及び第2の比の少なくとも一方を、予め定めた実効変動係数と比較する手順であり、
前記コントロール電極に対する前記検出用電極が検出した電流データの信号増加として、前記第1コントロール電極に対する前記第1検出用電極が検出した電流データの信号増加及び前記第2コントロール電極に対する前記第2検出用電極が検出した電流データの信号増加をそれぞれ定義し、前記信号増加量判定基準が、前記第1及び第2コントロール電極に対する前記第1及び第2検出用電極が検出した電流データの信号増加の有無の判定基準を与えるように設定されるパラメータであり、
前記実効変動係数が、前記複数の第1及び第2検出用電極が検出した電流データにバラツキがあるか否かを判断するために、前記第1及び第2の比を用いる判定の下限であり、前記第1又は第2の比が前記実効変動係数より小さいと判断された場合には、前記第1又は第2のプローブDNAと相補的な配列を有するDNAの存在が不明瞭と判断するように設定されるパラメータであり、
前記平均値の差が前記信号増加量判定基準より大きい場合は、前記サンプルDNAは前記検出用電極に固定された第1及び第2プローブDNAの少なくとも1種と相補的な配列を有すると判定することを特徴とする請求項5記載の塩基配列判定プログラム。
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