JP4824386B2 - Dna分離装置、dna分離方法、及びリガンドdna - Google Patents
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Description
DNAには、二重鎖を形成するものと一重鎖を形成するものとが存在する。そしてDNAのもつ、アデニン(A),チミン(T),シトシン(C),グアニン(G)の4つの塩基は、AとT、GとCが結合し易くなっており、DNAが二重鎖を形成する場合、A−T,G−Cで対をなしている。従って、二重鎖を形成する一方のDNAが5’−ATCGCGT−3’と配列されている場合、他方のDNAは5’−ACGCGAT−3’という塩基配列をもつ。
本実施の形態1では、第1サンプルDNAとコンジュゲートDNAの両方に結合可能な第1リガンドDNA、及び前記第2サンプルDNAとコンジュゲートDNAの両方に結合可能な第2リガンドDNAを、それぞれ前記第1,第2サンプルDNAに結合させて第1,第2のDNA複合体を形成した後、該第1,第2のDNA複合体を前記コンジュゲートDNA中で電気泳動させ、両者を分離するものである。
図1は、本実施の形態1におけるコンジュゲートDNA、サンプル溶液に含まれる2つのサンプルDNA、及び2つのリガンドDNAの相関を示す図である。
まず、本実施の形態1のコンジュゲートDNA10は、従来と同様、電気非泳道物質1と、マーカーDNA2とを結合して作製する。
そして、前記マーカーDNA2は、任意の塩基配列を設定する。
これは、前記コンジュゲートDNA10のマーカーDNA2の塩基配列が短すぎると、前記コンジュゲートDNA10とプレサンプル溶液中の前記第1のDNA複合体51との結合力が弱すぎて、前記第1のDNA複合体51の電気泳動速度を遅らすことができないため、適切にサンプルDNAを分離することができなくなる可能性があり、また逆に、コンジュゲートDNA10のマーカーDNA2の塩基配列が長すぎると、コンジュゲートDNA10と、プレサンプル溶液中の第1のDNA複合体51との結合力が強すぎて、DNA複合体がコンジュゲートDNA10に結合したままになる可能性があるからである。
キャピラリー電気泳動装置100は、サンプルDNAを分離するための密閉流路であるキャピラリー管130と、pHを特定の値に調整し、且つ緩衝作用を有し、さらに支持電解質をも有している緩衝液11を保持する第1,第2の容器131,132と、前記キャピラリー管130の両端に電圧を印加する正電極133,負電極134と、その両電極133,134に電圧を印加する可変電源部135と、サンプル溶液中の目的DNAを検出する検出部150と、前記可変電源部135の電圧印加、あるいは前記検出部150を制御する制御部140とで構成されるものである。
このとき、リガンドDNAとしては、上記第1,第2リガンドDNA3,4の2種類を常に用意するようにする。これは、前記サンプル溶液として、第1の塩基配列が含まれている第1サンプルDNA5だけが存在している場合、あるいは第2の塩基配列が含まれている第2サンプルDNA6だけが存在している場合、もしくはその両方のサンプルDNA5,6が含まれている場合の3タイプが考えられるため、前記リガンドDNAは、サンプル溶液中にどちらの塩基配列を有したサンプルDNAが存在しても対応できるようにするためである。
ここでは、第1サンプルDNAの塩基配列は、5’(FITC)−CGGCTGGGGGCTGA−3’であり、第2サンプルDNAの塩基配列は、5’(FITC)−CGGTTGGGGACTGA−3’であり、コンジュゲートDNA10のマーカーDNAの塩基配列は、5’−CACGGT−3’であり、第1リガンドDNAの塩基配列は、5’−CAGCCCCCAGCCACCGTG−3’であり、第2リガンドDNAの塩基配列は、5’−CAGTCCCCAACCTCGATG−3’とする。なお、前記第2リガンドDNA4の3’末端は、コンジュゲートDNA10中のマーカーDNA2に対して1塩基以上相補的でなく、且つヘアピンループ構造をとらない配列であれば、別の塩基配列であっても構わない。
2,212 マーカーDNA
3 第1リガンドDNA
4 第2リガンドDNA
4’ 第3リガンドDNA
5 第1サンプルDNA
6 第2サンプルDNA
10,210 コンジュゲートDNA
11 緩衝液
31 第1プローブ
32 第2プローブ
41 第3プローブ
42 第4プローブ
51 第1のDNA複合体
61 第2のDNA複合体
61’ 第3のDNA複合体
130 キャピラリー管
131 第1の容器
132 第2の容器
133 正電極
134 負電極
135 可変電源部
140 制御部
150 検出部
151 レーザー
152 スリット
153 フィルター
154 フォトマルチプライヤー
155 プリアンプ
156 A/Dコンバータ
200 サンプルDNA
Claims (13)
- サンプル溶液中に含まれる、第1の塩基配列を含む第1のサンプルDNAと、該第1の塩基配列と一部の塩基配列を異にする第2の塩基配列を含む第2のサンプルDNAとを、電気泳動によって分離するDNA分離装置において、
キャピラリー型の密閉流路の両端の各端部に、正電極、および負電極を、それぞれ、緩衝液に浸漬して設けてなり、
前記密閉流路中に、前記第1のサンプルDNA、及び第2のサンプルDNAの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質に、特定の塩基配列を有するマーカーDNAを結合させたコンジュゲートDNAを緩衝液中に添加してなるコンジュゲートDNA溶液を、充填し、かつ、
前記第1の塩基配列に対して相補的な配列を有する第1のプローブ、及び前記マーカーDNAの塩基配列に対して相補的な配列を有する第2のプローブを有する第1のリガンドDNAと、前記第1のサンプルDNAとを結合させた第1のDNA複合体、および、前記第2の塩基配列に対して相補的な配列を有する第3のプローブ、及び前記第2のプローブの塩基配列と少なくとも一つの塩基配列が異なる塩基配列を有する第4のプローブを有する第2のリガンドDNAと、前記第2のサンプルDNAとを結合させた第2のDNA複合体、を含むプレサンプル溶液を、前記密閉流路内に注入してなり、
前記正電極、および負電極の各々に電圧を印加し、前記コンジュゲートDNA溶液中で、前記第1のDNA複合体、及び前記第2のDNA複合体を電気泳動させて、該両者を分離する、
ことを特徴とするDNA分離装置。 - サンプル溶液中に含まれる、第1の塩基配列を含む第1のサンプルDNAと、該第1の塩基配列とその一部の塩基配列を異にする第2の塩基配列を含む第2のサンプルDNAを、電気泳動によって分離するDNA分離装置において、
キャピラリー型の密閉流路の両端の各端部に、正電極、および負電極を、それぞれ、緩衝液に浸漬して設けてなり、
前記密閉流路中に、第1サンプルDNA、及び第2のサンプルDNAの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質にマーカーDNAを結合させたコンジュゲートDNAを、緩衝液中に添加してなるコンジュゲート溶液を、充填し、かつ、
前記第1の塩基配列に対して相補的な配列を有する第1のプローブと、前記マーカーDNAの塩基配列に対して相補的な配列を有する第2のプローブとを有する第1のリガンドDNAと、前記第1のサンプルDNAとが結合した第1のDNA複合体、および、前記第2の塩基配列に対して相補的な配列を有する第3のプローブを有する第3のリガンドDNAと、前記第2のサンプルDNAとを結合させた第3のDNA複合体と、を含むプレサンプル溶液を、前記密閉流路内に注入してなり、
前記正電極、および負電極に電圧を印加し、前記コンジュゲートDNA溶液中で、前記第1のDNA複合体、及び前記第3のDNA複合体を電気泳動させて、該両者を分離する、
ことを特徴とするDNA分離装置。 - 請求項1に記載のDNA分離装置において、
電気泳動によって前記密閉流路中を移動する、前記第1のサンプルDNA、あるいは第2のサンプルDNAの、少なくとも一つを検知する検出部を、さらに備え、
前記密閉流路中に、前記コンジュゲートDNA溶液を充填し、かつ、前記第1のDNA複合体、もしくは前記第2のDNA複合体の、少なくとも一つを含むプレサンプル溶液を、前記密閉流路内に注入してなり、
前記正電極、および負電極に電圧を印加し、前記コンジュゲートDNA溶液中で、前記プレサンプル溶液に含まれる前記第1のDNA複合体、もしくは前記第2のDNA複合体を電気泳動させ、前記検出部で、該密閉流路を移動する前記第1のDNA複合体、もしくは第2のDNA複合体の、少なくとも一つを検知する、
ことを特徴とするDNA分離装置。 - 請求項2に記載のDNA分離装置において、
電気泳動によって前記密閉流路中を移動する、前記第1のサンプルDNA、あるいは第2のサンプルDNAの、少なくとも一つを検知する検出部を、さらに備え、
前記密閉流路中に、前記コンジュゲートDNA溶液を充填し、かつ、前記第1のDNA複合体、もしくは前記第3のDNA複合体の、少なくとも一つを含むプレサンプル溶液を、前記密閉流路内に注入してなり、
前記正電極、および負電極に電圧を印加し、前記コンジュゲートDNA溶液中で、前記プレサンプル溶液に含まれる前記第1のDNA複合体、もしくは前記第3のDNA複合体を電気泳動させ、前記検出部で、該密閉流路を移動する前記第1のDNA複合体、もしくは第3のDNA複合体の、少なくとも一つを検知する、
ことを特徴とするDNA分離装置。 - 請求項3または請求項4に記載のDNA分離装置において、
前記第1のサンプルDNA、もしくは前記第2のサンプルDNAは、蛍光色素が付加されている、
ことを特徴とするDNA分離装置。 - 請求項1または請求項2に記載のDNA分離装置において、
前記第1プローブと、前記第3プローブが、10塩基以上である、
ことを特徴とするDNA分離装置。 - 請求項1または請求項2に記載のDNA分離装置において、
前記第2プローブ、もしくは前記第4プローブが、6塩基以上である、
ことを特徴とするDNA分離装置。 - 請求項1または請求項2に記載のDNA分離装置において、
前記緩衝液が、TB緩衝液、Tris−HCl緩衝液、TAE緩衝液、TBE緩衝液、もしくはSSC緩衝液のいずれかである、
ことを特徴とするDNA分離装置。 - 請求項1または請求項2に記載のDNA分離装置において、
前記電気非泳動物質は、アクリルアミド、もしくはエチレングリコールのいずれかで作られたリニアポリマーである、
ことを特徴とするDNA分離装置。 - サンプル溶液中に含まれる、第1の塩基配列を含む第1のサンプルDNAと、該第1の塩基配列とはその一部の塩基配列を異にする第2の塩基配列を含む第2のサンプルDNAとを、電気泳動によって分離するDNA分離方法において、
前記密閉流路中に、第1のサンプルDNA、及び第2のサンプルDNAの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質にマーカーDNAを結合させたコンジュゲートDNAを、緩衝液中に添加してなるコンジュゲートDNA溶液を充填させる充填ステップと、
前記第1の塩基配列に対して相補的な配列を有する第1のプローブと、前記第1、及び第2の塩基配列とは異なる塩基配列を有する第2のプローブとを有する第1のリガンドDNAと、前記第2の塩基配列に対して相補的な配列を有する第3プローブと、前記第2のプローブと少なくとも一つの塩基配列を異にする塩基配列を有する第4プローブとを有する第2のリガンドDNAと、前記サンプル溶液とを混合して、ハイブリダイズさせ、前記第1のサンプルDNAと、前記第1のリガンドDNAとを結合させた第1のDNA複合体と、前記第2のサンプルDNAと、前記第2のリガンドDNAとを結合させた第2のDNA複合体とを含むプレサンプル溶液を作製するプレサンプル溶液作製ステップと、
前記充填ステップで、前記コンジュゲートDNA溶液を充填してなる密閉流路内に、前記プレサンプル溶液作製ステップで作製したプレサンプル溶液を注入する注入ステップと、
前記密閉流路の両端にある正電極、および負電極に所定の電圧を印加し、前記第1のDNA複合体、及び第2のDNA複合体を電気泳動させて、該両者を分離する分離ステップと、を含む、
ことを特徴とするDNA分離方法。 - サンプル溶液に含まれる、第1の塩基配列を含む第1のサンプルDNAと、該第1の塩基配列とはその一部の塩基配列を異にする第2の塩基配列を含む第2のサンプルDNAとを、電気泳動によって分離するDNA分離方法において、
前記密閉流路中に、第1のサンプルDNA、及び第2のサンプルDNAの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質にマーカーDNAを結合させたコンジュゲートDNAを、緩衝液中に添加してなるコンジュゲートDNA溶液を、充填させる充填ステップと、
前記第1の塩基配列に対して相補的な配列を有する第1のプローブと、前記第1、及び第2の塩基配列とは異なる塩基配列の第2のプローブとを有する第1のリガンドDNAと、前記第2の塩基配列に対して相補的な配列を有する第3プローブを有する第3のリガンドDNAと、前記サンプル溶液とを混合して、ハイブリダイズさせ、前記第1のサンプルDNAと、前記第1のリガンドDNAとを結合させた第1のDNA複合体と、前記第2のサンプルDNAと前記第3のリガンドDNAとを結合させた第3のDNA複合体とを含むプレサンプル溶液を作製するプレサンプル溶液作製ステップと、
前記充填ステップで、前記コンジュゲートDNA溶液を充填してなる密閉流路中に、前記プレサンプル溶液作製ステップで作製したプレサンプル溶液を注入する注入ステップと、
前記密閉流路の両端にある正電極、および負電極に所定の電圧を印加し、前記第1のDNA複合体、及び第3のDNA複合体を電気泳動させて、該両者を分離する分離ステップと、を含む、
ことを特徴とするDNA分離方法。 - 請求項10に記載のDNA分離方法において、
前記プレサンプル溶液作製ステップは、前記第1のリガンドDNAと、前記第2のリガンドDNAと、前記第1のサンプルDNAもしくは前記第2のサンプルDNAの少なくとも一つを有するサンプル溶液とを混合してハイブリダイズさせ、前記第1のDNA複合体もしくは前記第2のDNA複合体の少なくとも一つを有するプレサンプル溶液を作製するものであり、
前記注入ステップは、前記プレサンプル溶液を前記コンジュゲートDNA溶液が充填された密閉流路中に注入するものであり、
前記正電極、および負電極に所定の電圧を印加し、前記コンジュゲートDNA溶液中で、前記プレサンプル溶液に含まれる前記第1のDNA複合体、もしくは前記第2のDNA複合体を電気泳動させ、該密閉流路を移動する前記第1のDNA複合体、もしくは第2のDNA複合体の少なくとも一つを検知する検知ステップを、含む、
ことを特徴とするDNA分離方法。 - 請求項11に記載のDNA分離方法において、
前記プレサンプル溶液作製ステップは、前記第1のリガンドDNAと、前記第3のリガンドDNAと、前記第1のサンプルDNAもしくは前記第2のサンプルDNAの少なくとも一つを有するサンプル溶液とを混合してハイブリダイズさせ、前記第1のDNA複合体もしくは前記第3のDNA複合体の少なくとも一つを有するプレサンプル溶液を作製するものであり、
前記注入ステップは、前記プレサンプル溶液を前記コンジュゲートDNA溶液が充填された密閉流路中に注入するものであり、
前記正電極、および負電極に所定の電圧を印加し、前記コンジュゲートDNA溶液中で、前記プレサンプル溶液に含まれる前記第1のDNA複合体、もしくは前記第3のDNA複合体を電気泳動させ、該密閉流路を移動する前記第1のDNA複合体、もしくは第3のDNA複合体の少なくとも一つを検知する検知ステップを、含む、
ことを特徴とするDNA分離方法。
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