JP4822291B2 - Liver fibrosis inhibitor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、プロアントシアニジン（以下、「ＰＡＣ」という）を有効成分として含む肝線維化抑制剤に関する。 The present invention relates to a liver fibrosis inhibitor containing proanthocyanidins (hereinafter referred to as “PAC”) as an active ingredient.
肝線維化は肝臓の炎症や毒物による肝細胞の損傷、肝血流の変化、あるいはウイルス、細菌、真菌又は寄生虫の感染症など、非常に多くの因子によって生じる病態である。また、先天性代謝異常が線維化に関わることも多く、脂質代謝異常（ゴーシェ病）、糖原病、α抗トリプシン欠損症、鉄過剰蓄積症候群（ヘモクロマトーシス）、銅蓄積症（ウィルソン病）、毒性代謝産物の蓄積（チロシン血症，果糖血症，ガラクトース血症）、ペルオキシソームの異常（ゼルウェガー症候群）などが知られている。さらに、アルコール、メトトレキサートなどの化学物質や薬物、あるいは肝臓の循環障害（慢性心不全、バッド−キアリ症候群、静脈閉塞症、門脈血栓症など）や慢性的な胆汁流出路の閉塞も肝線維化の原因となる。 Liver fibrosis is a condition caused by numerous factors such as liver inflammation, damage to hepatocytes by toxins, changes in hepatic blood flow, or viral, bacterial, fungal or parasitic infections. Also, inborn errors of metabolism are often associated with fibrosis, abnormal lipid metabolism (Gaucher's disease), glycogenosis, alpha antitrypsin deficiency, iron overaccumulation syndrome (hemochromatosis), copper accumulation disease (Wilson's disease). Accumulation of toxic metabolites (tyrosinemia, fructoseemia, galactosemia), peroxisome abnormalities (Zelweger syndrome), etc. are known. In addition, chemical substances and drugs such as alcohol and methotrexate, or hepatic circulatory disturbance (chronic heart failure, Bad-Chiari syndrome, venous occlusion, portal thrombosis, etc.) and chronic biliary outflow tract obstruction Cause.
ウイルス性肝炎などの慢性肝炎から肝硬変への進行過程において肝線維化は主要な病態であり、肝線維化を抑えることは肝硬変を予防する上で極めて重要である。特にＣ型肝炎治療でのインターフェロン無効例においては、肝線維化抑制療法の開発が急務である。肝線維化の主たる原因は肝非実質細胞の一つである肝星細胞からの細胞外マトリックス（コラーゲン、ラミニン、プロテオグリカンなど）の異常産生である。肝星細胞の機能は肝マクロファージであるクッパー細胞の産生するサイトカイン及び増殖因子により調節されている。血小板由来増殖因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ； ＰＤＧＦ）は、肝星細胞の活性化促進因子の一つであり、肝星細胞の増殖を促進することにより肝線維化をもたらす。従って、肝星細胞の増殖あるいはＰＤＧＦによる活性化を抑制する薬剤が開発されれば、これにより肝線維化を抑制し、ウイルス性肝炎などの慢性肝障害から肝硬変への進展を抑制することが可能である。 In the process of progression from chronic hepatitis such as viral hepatitis to cirrhosis, liver fibrosis is a major pathological condition, and suppressing liver fibrosis is extremely important in preventing cirrhosis. In particular, in cases where interferon is ineffective in the treatment of hepatitis C, development of liver fibrosis suppression therapy is urgent. The main cause of liver fibrosis is abnormal production of extracellular matrix (collagen, laminin, proteoglycan, etc.) from hepatic stellate cells, one of the non-parenchymal cells of the liver. The function of hepatic stellate cells is regulated by cytokines and growth factors produced by Kupffer cells, which are hepatic macrophages. Platelet-derived growth factor (PDGF) is one of the activation promoting factors of hepatic stellate cells, and causes liver fibrosis by promoting the proliferation of hepatic stellate cells. Therefore, if a drug that suppresses the proliferation of hepatic stellate cells or activation by PDGF is developed, it is possible to suppress hepatic fibrosis and suppress the progression from chronic liver damage such as viral hepatitis to cirrhosis. It is.
肝星細胞の活性化を抑制する天然物化合物としては、緑茶由来のカテキン、エピカテキン等が知られている。緑茶カテキン療法は胆道閉鎖症術後患者の酸化ストレスを軽減し肝線維化を抑制することが報告されている。 As natural product compounds that suppress the activation of hepatic stellate cells, catechins derived from green tea, epicatechins, and the like are known. Green tea catechin therapy has been reported to reduce oxidative stress and suppress liver fibrosis in patients after biliary atresia.
非特許文献１、２及び３にはエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（以下「ＥＧＣＧ」という）が、組み替えヒト血小板由来増殖因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ-ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ-ＢＢ；以下「ＰＤＧＦ−ＢＢ」という）処理による肝星細胞のＤＮＡ合成量を抑制することが報告されている。 In Non-Patent Documents 1, 2 and 3, epigallocatechin-3-O-gallate (hereinafter referred to as “EGCG”) is a recombinant human platelet-derived growth factor-BB; hereinafter referred to as “PDGF-BB”. It is reported that the amount of hepatic stellate cells synthesized by treatment is suppressed.
特許文献１では、ウーロン茶や紅茶などの発酵茶から抽出されたＰＡＣを含む高分子ポリフェノール類が脂肪肝の予防や治療に有効であることが述べられている。また、特許文献２ではプロシアニジンおよびその誘導体を含むポリフェノール類を含有する組成物が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、膵癌、肝細胞癌または大腸癌等の腫瘍の治療に有効であることが示唆されている。 Patent Document 1 states that high-molecular polyphenols containing PAC extracted from fermented tea such as oolong tea and black tea are effective for the prevention and treatment of fatty liver. In Patent Document 2, a composition containing polyphenols containing procyanidins and derivatives thereof is effective for treatment of tumors such as breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, lung cancer, pancreatic cancer, hepatocellular carcinoma or colon cancer. Has been suggested.
本発明の目的は、慢性肝炎から肝硬変への病態進展を抑制できる肝線維化抑制剤であって、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能な、肝線維化抑制剤を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a liver fibrosis inhibitor capable of suppressing the progression of the pathology from chronic hepatitis to cirrhosis, which exhibits excellent pharmacological activity, has few side effects and can be used for a long period of time. There is.
本発明者らは、上記目的を達成するため、培養ヒト肝星細胞ＬＩ９０のＰＤＧＦ−ＢＢによる活性化の抑制効果を指標に、天然物由来の成分について種々検討した結果、フラバン−３−オールの重合体に、ＥＧＣＧと同等の肝線維化抑制効果があることを見出し、本発明に至った。 In order to achieve the above object, the present inventors have conducted various studies on components derived from natural products using the inhibitory effect of activation of cultured human hepatic stellate cells LI90 by PDGF-BB as an index. The polymer was found to have an effect of suppressing liver fibrosis equivalent to EGCG, leading to the present invention.
すなわち本発明は、プロアントシアニジン組成物を有効成分とする肝線維化抑制剤に関する。 That is, this invention relates to the liver fibrosis inhibitor which uses a proanthocyanidin composition as an active ingredient.
本発明の肝線維化抑制剤は、上記のような構成を備えることにより、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能なものとなる。このような肝線維化抑制剤によれば、ウイルス性肝炎やアルコール性肝障害などの慢性肝障害における肝線維化を効果的に抑制することができる。また、肝線維化を病因とする、肝硬変や肝細胞癌などの病の発症又は進展を、効果的に予防又は抑制することができる。 The hepatic fibrosis inhibitor of the present invention has an excellent pharmacological activity by having the above-described configuration, and can be used for a long time with few side effects. According to such a liver fibrosis inhibitor, liver fibrosis in chronic liver disorders such as viral hepatitis and alcoholic liver disorder can be effectively suppressed. Moreover, the onset or progress of diseases such as cirrhosis or hepatocellular carcinoma caused by liver fibrosis can be effectively prevented or suppressed.
本発明の肝線維化抑制剤は、上記プロアントシアニジン組成物が、下記一般式（１）で表されるフラバン−３−オール骨格が、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式で２以上互いに結合した構造を有するものであることが好ましい。
（ｉ）４位炭素及び８位炭素の結合
（ｉｉ）４位炭素及び６位炭素の結合
（ｉｉｉ）４位炭素及び８位炭素の結合並びに２位炭素及び７位酸素の結合
The inhibitor of hepatic fibrosis according to the present invention is such that the proanthocyanidin composition has a flavan-3-ol skeleton represented by the following general formula (1), and the binding mode is the following (i), (ii) or (iii): It is preferable that two or more have a structure bonded to each other.
(I) 4-position and 8-position carbon bonds (ii) 4-position and 6-position carbon bonds (iii) 4-position and 8-position carbon bonds and 2-position and 7-position oxygen bonds
式（１）中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基、Ｒ２は水酸基、Ｒ４は水素原子又は一価の有機基を、それぞれ示す。 In formula (1), R 1 and R 3 each independently represent a hydrogen atom or a hydroxyl group, R 2 represents a hydroxyl group, and R 4 represents a hydrogen atom or a monovalent organic group.
上記のような肝線維化抑制剤は、薬理活性に一層優れ、副作用が少なく長期に亘って使用することができる。 The liver fibrosis inhibitor as described above is more excellent in pharmacological activity, has few side effects, and can be used over a long period of time.
本発明の肝線維化抑制剤は、上記プロアントシアニジンが天然物由来であるものであることが好ましい。このような肝線維化抑制剤は、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能で、且つ天然物から容易に加工することができる。 In the hepatic fibrosis inhibitor of the present invention, the proanthocyanidins are preferably derived from natural products. Such an inhibitor of liver fibrosis exhibits excellent pharmacological activity, has few side effects, can be used for a long time, and can be easily processed from natural products.
また、本発明は、プロアントシアニジン組成物を有効成分とする肝星細胞増殖抑制剤に関する。 Moreover, this invention relates to the hepatic stellate cell growth inhibitor which uses a proanthocyanidin composition as an active ingredient.
本発明の肝星細胞増殖抑制剤は、肝星細胞の増殖又は活性化を抑制できる肝星細胞増殖抑制剤であって、上記のような構成を備えることにより、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能なものである。 The hepatic stellate cell growth inhibitor of the present invention is a hepatic stellate cell growth inhibitor capable of suppressing the proliferation or activation of hepatic stellate cells, and exhibits excellent pharmacological activity and side effects by having the above-described configuration. There are few and can be used for a long time.
本発明の肝星細胞増殖抑制剤は、上記プロアントシアニジン組成物が、下記一般式（１）で表されるフラバン−３−オール骨格が、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式で２以上互いに結合した構造を有するものであることが好ましい。
（ｉ）４位炭素及び８位炭素の結合
（ｉｉ）４位炭素及び６位炭素の結合
（ｉｉｉ）４位炭素及び８位炭素の結合並びに２位炭素及び７位酸素の結合
In the hepatic stellate cell growth inhibitor of the present invention, the proanthocyanidin composition has a flavan-3-ol skeleton represented by the following general formula (1), which is a bond of the following (i), (ii) or (iii): It is preferable to have a structure in which two or more are bonded to each other in a manner.
(I) 4-position and 8-position carbon bonds (ii) 4-position and 6-position carbon bonds (iii) 4-position and 8-position carbon bonds and 2-position and 7-position oxygen bonds
式（１）中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基、Ｒ２は水酸基、Ｒ４は水素原子又は一価の有機基を、それぞれ示す。 In formula (1), R 1 and R 3 each independently represent a hydrogen atom or a hydroxyl group, R 2 represents a hydroxyl group, and R 4 represents a hydrogen atom or a monovalent organic group.
上記のような肝星細胞増殖抑制剤は、薬理活性に一層優れ、副作用が少なく長期に亘って使用することができる。 The hepatic stellate cell growth inhibitor as described above is more excellent in pharmacological activity, has few side effects, and can be used over a long period of time.
本発明の肝星細胞増殖抑制剤は、上記プロアントシアニジンが天然物由来であるものであることが好ましい。このような肝線維化抑制剤は、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能で、且つ天然物から容易に加工することができる。 In the hepatic stellate cell growth inhibitor of the present invention, the proanthocyanidins are preferably derived from natural products. Such an inhibitor of liver fibrosis exhibits excellent pharmacological activity, has few side effects, can be used for a long time, and can be easily processed from natural products.
本発明の肝星細胞増殖抑制剤は、ある側面において、肝星細胞アポトーシスに基づいて、肝星細胞の増殖又は活性化を抑制するものである。 In one aspect, the hepatic stellate cell growth inhibitor of the present invention inhibits the growth or activation of hepatic stellate cells based on hepatic stellate cell apoptosis.
また、本発明は、上記肝線維化抑制剤又は上記肝星細胞増殖抑制剤を含む、肝線維化を病因とする肝疾病の発症・進展抑制剤に関する。 The present invention also relates to an agent for inhibiting the onset / progress of liver disease caused by liver fibrosis, including the liver fibrosis inhibitor or the hepatic stellate cell growth inhibitor.
また、本発明は、上記肝線維化抑制剤又は上記肝星細胞増殖抑制剤を含む、肝線維化抑制、肝星細胞増殖抑制、肝星細胞アポトーシス誘導、肝線維化を病因とする肝疾病の発症抑制、又は、肝線維化を病因とする肝疾病の進展抑制用の、機能性補助飲食物に関する。 Further, the present invention includes a liver fibrosis inhibitor, a hepatic stellate cell proliferation inhibitor, a hepatic stellate cell apoptosis induction, or a liver disease caused by liver fibrosis. The present invention relates to a functional auxiliary food or drink for suppressing the onset or suppressing the progression of liver disease caused by liver fibrosis.
本発明によれば、慢性肝炎から肝硬変への病態進展を抑制できる肝線維化抑制剤であって、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能な、肝線維化抑制剤を提供することができる。また本発明によれば、肝星細胞の増殖又は活性化を抑制できる肝星細胞増殖抑制剤であって、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能な、肝星細胞増殖抑制剤を提供することができる。さらに本発明によれば、上記肝線維化抑制剤又は上記肝星細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする、肝疾病の発症・進展抑制剤及び機能性補助飲食物を提供することができる。 According to the present invention, there is provided a liver fibrosis inhibitor capable of suppressing the progression of pathology from chronic hepatitis to cirrhosis, which exhibits excellent pharmacological activity, has few side effects and can be used for a long time. be able to. Further, according to the present invention, a hepatic stellate cell growth inhibitor capable of suppressing the proliferation or activation of hepatic stellate cells, which exhibits excellent pharmacological activity, has few side effects and can be used for a long period of time. Can be provided. Furthermore, according to the present invention, it is possible to provide a liver disease onset / progress inhibitor and a functional auxiliary food or drink characterized by containing the above-mentioned liver fibrosis inhibitor or the above-mentioned hepatic stellate cell growth inhibitor.
以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。 Hereinafter, the best mode for carrying out the present invention will be described in detail with reference to the drawings as necessary. However, the present invention is not limited to the following embodiments.
本実施形態に係る肝線維化抑制剤及び肝星細胞増殖抑制剤は、プロアントシアニジン組成物（以下、「ＰＡＣ組成物」と表す。）を有効成分とする。ここで、ＰＡＣ組成物は、１種又は複数のプロアントシアニジン（以下、「ＰＡＣ」と表す。）からなる組成物であり、実施形態に係る肝線維化抑制剤及び肝星細胞増殖抑制剤は、多くの場合、複数のＰＡＣからなる組成物を有効成分としている。またＰＡＣ組成物は、ＰＡＣの誘導体、その生理学的に許容される塩、その水和物、その溶媒和物等を含んでも良い。 The hepatic fibrosis inhibitor and hepatic stellate cell growth inhibitor according to this embodiment comprise a proanthocyanidin composition (hereinafter referred to as “PAC composition”) as an active ingredient. Here, the PAC composition is a composition comprising one or more proanthocyanidins (hereinafter referred to as “PAC”), and the liver fibrosis inhibitor and the hepatic stellate cell proliferation inhibitor according to the embodiment are: In many cases, a composition comprising a plurality of PACs is used as an active ingredient. The PAC composition may also contain a derivative of PAC, a physiologically acceptable salt thereof, a hydrate thereof, a solvate thereof, and the like.
ＰＡＣは、フラバン骨格を基本として、種々の部位に水酸基を有する単量体が重合してなる重合体化合物群の総称である。このような重合体の構成単位のうち、基端部をターミナルユニット、その他をエクステンションユニットと呼ぶ。また、重合体の重合度は、二量体、三量体のものから１００量体以上の高分子にまで及ぶ。 PAC is a general term for a group of polymer compounds formed by polymerizing monomers having hydroxyl groups at various sites based on a flavan skeleton. Among the structural units of such a polymer, the base end portion is called a terminal unit, and the others are called extension units. In addition, the degree of polymerization of the polymer ranges from dimers and trimers to polymers of 100 or more.
本実施形態において、薬理活性の観点からＰＡＣの重合度は３以上であることが好ましく、５以上であることがより好ましく、５〜２０であることがさらに好ましい。ただし、ＰＡＣ組成物は、主たる成分が重合度３以上の重合体であれば、モノマー、その他の断片を含んでもよい。また、ＰＡＣ組成物に含まれるＰＡＣの平均重合度は、３以上であることが好ましく、５以上であることがより好ましく、５〜２０であることがさらに好ましい。なお、本発明において平均重合度とは、上記単量体が結合している平均個数を示し、例えば、後述する実施例に示す方法などにより、測定することができる。 In this embodiment, from the viewpoint of pharmacological activity, the degree of polymerization of PAC is preferably 3 or more, more preferably 5 or more, and further preferably 5 to 20. However, as long as the main component is a polymer having a polymerization degree of 3 or more, the PAC composition may contain monomers and other fragments. The average degree of polymerization of PAC contained in the PAC composition is preferably 3 or more, more preferably 5 or more, and further preferably 5 to 20. In the present invention, the average degree of polymerization refers to the average number of the above-mentioned monomers bonded, and can be measured, for example, by the method shown in the examples described later.
ＰＡＣとしては、例えば、図１の化学式で示されるような、主としてカテキン類、すなわちフラバン−３−オールを構成単位とする重合度が２以上の重合体からなるポリフェノール成分が挙げられる。なお、図１の化学式中Ｒは、上記一般式（１）におけるＯＲ４に相当する。また、フラバン環３位水酸基にしばしば没食子酸がエステル結合する。 Examples of the PAC include a polyphenol component mainly composed of a catechin, that is, a polymer having a degree of polymerization of 2 or more having flavan-3-ol as a structural unit, as shown in the chemical formula of FIG. Note that R in the chemical formula of FIG. 1 corresponds to OR 4 in the general formula (1). In addition, gallic acid is often ester-bonded to the 3-position hydroxyl group of the flavan ring.
ある特定の単量体（骨格）が重合したＰＡＣには慣用名が与えられ、代表的なＰＡＣとしては、Ｂ環（図１参照）の水酸基の数に応じて定義・分類された、プロペラルゴニジン（４’−ＯＨ）、プロシアニジン（３’−ＯＨ、４’−ＯＨ）及びプロデルフィニジン（３’−ＯＨ、４’−ＯＨ、５’−ＯＨ）が挙げられる。例えば、Ａ環５位の水酸基を欠く成分を構成単位とした重合体には、プロガイボールチニジン、プロフィセチニジン、及びプロロビネチニジンがあり、さらにその他の特定部位の水酸基の有無に応じて、プロテラカシジン、プロメラカシジン、プロアピゲニニジン、プロルテオリニジンなどの慣用名がある。 Common names are given to PACs in which a specific monomer (skeleton) is polymerized, and typical PACs are propellers defined and classified according to the number of hydroxyl groups in the B ring (see FIG. 1). Examples include nidin (4'-OH), procyanidin (3'-OH, 4'-OH) and prodelphinidin (3'-OH, 4'-OH, 5'-OH). For example, polymers having a component lacking a hydroxyl group at the 5-position of the A ring include progaiballinidine, proficetinidine, and prolovinetinidine, and depending on the presence or absence of hydroxyl groups at other specific sites. There are common names such as proteracacidin, promelacacidin, proapigenidin, and prolteolinidin.
本発明においてＰＡＣは、好ましくは、プロシアニジン、プロペラルゴニジン又はプロデルフィニジンである。「プロシアニジン」の構成単位（骨格）は、同一又は異なっていてもよく、カテキン、エピカテキン、カテキンガレート及びエピカテキンガレートから選択できる。「プロデルフィニジン」の構成単位（骨格）は、同一または異なっていてもよく、ガロカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキンガレート及びエピガロカテキンガレートから選択できる。 In the present invention, PAC is preferably procyanidin, propelargonidin or prodelphinidin. The structural units (skeletons) of “procyanidins” may be the same or different and can be selected from catechin, epicatechin, catechin gallate and epicatechin gallate. The structural unit (skeleton) of “prodelphinidin” may be the same or different, and can be selected from gallocatechin, epigallocatechin, gallocatechin gallate and epigallocatechin gallate.
また、ＰＡＣとしては、例えば、さまざまな植物に広く含まれている縮合型タンニンが挙げられる。このようなＰＡＣは、酸処理によって、シアニジン、デルフィニジン、ペラルゴニジン、オーランチニジン、ルテオリニジン、ペオニジン、マルビジン、ペチュニジン、ヨーロピニジン、ロシニジン、ヒルスチジン、アピゲニニジンなどを得ることができる。 Moreover, as PAC, the condensed tannin widely contained in various plants is mentioned, for example. Such a PAC can obtain cyanidin, delphinidin, pelargonidin, aurantidine, luteolinidine, peonidin, malvidin, petunidin, europeinidine, rosinidine, hirastidine, apigenidin and the like by acid treatment.
さらに、ＰＡＣには、各環上の結合位置の違いや、構成単位内の置換基の立体配座、異なる構成単位の重合体内での結合順序などによる多様な化合物が知られている。本発明に含まれるＰＡＣの一部について、化学名（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｎａｍｅ）を以下に例示する。なお、括弧内は分子式（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｕｌａ）である。なお、本発明においては、下記のＰＡＣにのみならず、これらのＰＡＣが更にカテキン、エピカテキンなどの構成単位あるいは他のＰＡＣと縮合した、より高重合度のＰＡＣをも包含する。 Furthermore, various compounds are known for PACs, such as the difference in the bonding position on each ring, the conformation of substituents in the structural unit, and the bonding order in the polymer of different structural units. The chemical names of some of the PACs included in the present invention are exemplified below. In addition, the molecular formula (molecular formula) is in parentheses. In the present invention, not only the following PACs but also PACs having a higher degree of polymerization in which these PACs are further condensed with structural units such as catechin and epicatechin or other PACs are included.
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＰＺ５ （Ｃ７５ Ｈ６２ Ｏ３１），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＢＰ １ （Ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｅｄ），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＲＰ ４ （Ｃ１２９ Ｈ１０６ Ｏ６７），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＲＰ ３ （Ｃ１３６ Ｈ１２０ Ｏ７０），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＣＳ ４ （Ｃ１３６ Ｈ１２０ Ｏ７０），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＣＳ ３ （Ｃ１２７ Ｈ１２８ Ｏ６９），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＣＳ ２ （Ｃ１１３ Ｈ１１０ Ｏ６２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＣＳ１ （Ｃ１２１ Ｈ１１８ Ｏ６５），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＲＰ ２ （Ｃ１２０ Ｈ１１４ Ｏ６４），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＲＰ １ （Ｃ１２５ Ｈ１３０ Ｏ６９），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｔ４ （Ｃ１２８ Ｈ１２２ Ｏ６５），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｔ３ （Ｃ１０５ Ｈ１０２ Ｏ５９），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｔ２ （Ｃ６７ Ｈ５４ Ｏ２９），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｔ１ （Ｃ８７ Ｈ７２ Ｏ４３），
４−（Ｂｅｎｚｙｌｔｈｉｏ）ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ２ （Ｃ３７ Ｈ３０ Ｏ１２ Ｓ），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ７（Ｃ３０ Ｈ２４ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ （Ｃ３０ Ｈ２４ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ５’（Ｃ３０ Ｈ２４ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ４ （Ｃ３０ Ｈ２４ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ６ （Ｃ３７ Ｈ３０ Ｏ１６），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ２ ３，３’−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ （Ｃ４４ Ｈ３４ Ｏ２０），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ４ （Ｃ３０ Ｈ２６ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ２ ４α−ｂｅｚｙｌｔｈｉｏｅｔｈｅｒ （Ｃ３７ Ｈ３０ Ｏ１２ Ｓ），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ２ （Ｃ３０ Ｈ２４ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｃ１ （Ｃ４５ Ｈ３８ Ｏ１８），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ２ （Ｃ３０ Ｈ２６ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ （Ｃ３１ Ｈ２８ Ｏ１２），
Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ｛（Ｃ２９ Ｈ３２ Ｏ１０）ｘ｝，
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ１ （Ｃ３０ Ｈ２６ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ （Ｃ３１ Ｈ２８ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｃ（Ｃ３０ Ｈ２６ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ５（Ｃ３０ Ｈ２６ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｐ−１ （Ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｅｄ）．
Proanthocyanidin PZ5 (C75 H62 O31),
Proanthocyanidin BP 1 (Unspecified),
Proanthocyanidin RP 4 (C129 H106 O67),
Proanthocyanidin RP 3 (C136 H120 O70),
Proanthocyanidin CS 4 (C136 H120 O70),
Proanthocyanidin CS 3 (C127 H128 O69),
Proanthocyanidin CS 2 (C113 H110 O62),
Proanthocyanidin CS1 (C121 H118 O65),
Proanthocyanidin RP 2 (C120 H114 O64),
Proanthocyanidin RP 1 (C125 H130 O69),
Proanthocyanidin T4 (C128 H122 O65),
Proanthocyanidin T3 (C105 H102 O59),
Proanthocyanidin T2 (C67 H54 O29),
Proanthocyanidin T1 (C87 H72 O43),
4- (Benzylthio) proanthocyanidin A2 (C37 H30 O12 S),
Proanthocyanidin A7 (C30 H24 O12),
Proanthocyanidin (C30 H24 O12),
Proanthocyanidin A5 ′ (C30 H24 O12),
Proanthocyanidin A4 (C30 H24 O12),
Proanthocyanidin B6 (C37 H30 O16),
Proanthocyanidin B2 3,3′-O-gallate (C44 H34 O20),
Proanthocyanidin B4 (C30 H26 O12),
Proanthocyanidin A2 4α-benzylthioether (C37 H30 O12 S),
Proanthocyanidin A2 (C30 H24 O12),
Proanthocyanidin C1 (C45 H38 O18),
Proanthocyanidin B2 (C30 H26 O12),
Proanthocyanidin B (C31 H28 O12),
Methylated polymer proanthocyanidin {(C29 H32 O10) x},
Proanthocyanidin B1 (C30 H26 O12),
Proanthocyanidin A (C31 H28 O12),
Proanthocyanidin C (C30 H26 O12),
Proanthocyanidin B5 (C30 H26 O12),
Proanthocyanidin P-1 (Unspecified).
本実施形態において、ＰＡＣ組成物は、下記一般式（１）で表されるフラバン−３−オール骨格が、（ｉ）４位炭素及び８位炭素の結合、（ｉｉ）４位炭素及び６位炭素の結合、（ｉｉｉ）４位炭素及び８位炭素の結合並びに２位炭素及び７位酸素の結合、のいずれかの結合様式で２以上互いに結合した構造を有するものを含むことが好ましい。 In this embodiment, in the PAC composition, the flavan-3-ol skeleton represented by the following general formula (1) has (i) a bond between the 4-position carbon and the 8-position carbon, and (ii) a 4-position carbon and a 6-position. It is preferable to include those having a structure in which two or more carbon atoms are bonded to each other in any one of carbon bonds, (iii) 4-position carbon and 8-position carbon bonds, and 2-position carbon and 7-position oxygen bonds.
式（１）中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基、Ｒ２は水酸基、Ｒ４は水素原子又は一価の有機基を、それぞれ示す。 In formula (1), R 1 and R 3 each independently represent a hydrogen atom or a hydroxyl group, R 2 represents a hydroxyl group, and R 4 represents a hydrogen atom or a monovalent organic group.
上記一般式（１）中のＲ４が示す一価の有機基としては、ガレート基、有機酸残基、糖残基等が挙げられる（ここで、残基とは、分子中の原子又は基が除かれて生じる一価の基を意味する）。有機酸残基のもとになる有機酸としては、ｐ−クマル酸、カフェ酸、フェルラ酸、シナピン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、没食子酸、酢酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸等が挙げられる。糖残基を形成する糖は必要に応じて、例えばフェノール水酸基とエステル結合を介して任意の位置で修飾される。その配糖体形成残基の例としては、ピラノース型のヘキース残基、フラノース型のペントース残基を挙げることができる。具体的には、糖の形態として、グルコース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、アラビノース等の単糖類の他に、２糖類や３糖類を挙げることができる。 Examples of the monovalent organic group represented by R 4 in the general formula (1) include a gallate group, an organic acid residue, a sugar residue, and the like (wherein the residue is an atom or group in the molecule). Means a monovalent group formed by removing. Examples of organic acids that form organic acid residues include p-coumaric acid, caffeic acid, ferulic acid, sinapinic acid, p-hydroxybenzoic acid, gallic acid, acetic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, malic acid Etc. The sugar that forms the sugar residue is modified at any position, for example, via a phenol hydroxyl group and an ester bond, as necessary. Examples of the glycoside-forming residue include a pyranose type hexose residue and a furanose type pentose residue. Specifically, examples of sugar forms include disaccharides and trisaccharides in addition to monosaccharides such as glucose, galactose, rhamnose, xylose, and arabinose.
また、Ｒ４は、ガレート基や有機酸基に糖が結合した配糖体形成残基であってもよい。その場合、例えば、糖は、ガレート基や有機酸基のフェノール水酸基とエステル結合を介して任意の位置で結合する。その配糖体形成残基の例としては、ピラノース型のヘキース残基、フラノース型のペントース残基等を挙げることができる。糖の形態としては、グルコース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、アラビノース等の単糖類の他に、２糖類や３糖類を挙げることができる。 R 4 may be a glycoside-forming residue in which a sugar is bonded to a gallate group or an organic acid group. In this case, for example, the sugar is bonded to a phenolic hydroxyl group of a gallate group or an organic acid group at an arbitrary position via an ester bond. Examples of the glycoside-forming residue include a pyranose type hexose residue and a furanose type pentose residue. Examples of sugar forms include disaccharides and trisaccharides in addition to monosaccharides such as glucose, galactose, rhamnose, xylose, and arabinose.
なかでも、Ｒ４は、置換基を有していてもよいガレート基を示すことが好ましい。「置換基を有していてもよいガレート基」には、「ガレート基」及び「置換基を有するガレート基」が含まれ、「置換基を有するガレート基」には、「糖が結合したガレート基」等が含まれる。 Among them, R 4 preferably exhibits good gallate group which may have a substituent. The “gallate group optionally having substituent (s)” includes “gallate group” and “gallate group having substituent (s)”, and “gallate group having substituent (s)” includes “gallate to which sugar is bound. Group "and the like.
なお、式（１）中、Ａ環の５位及び／又は７位の水酸基は、ガレート基、糖、有機酸などが結合した修飾基であってもよい。 In formula (1), the hydroxyl group at the 5-position and / or 7-position of the A ring may be a modifying group to which a gallate group, a sugar, an organic acid or the like is bonded.
上記（ｉ）の結合様式によりフラバン−３−オール骨格が互いに結合した構造を有するプロアントシアニジンとしては、例えば、下記一般式（２）で表されるものがある。 Examples of proanthocyanidins having a structure in which the flavan-3-ol skeletons are bonded to each other by the bonding mode (i) above include those represented by the following general formula (2).
上記（ｉｉｉ）の結合様式によりフラバン−３−オール骨格が互いに結合した構造を有するプロアントシアニジンとしては、例えば、下記一般式（３）で表されるものがある。
ＰＡＣの構成単位同士の主たる結合部位としては、上記のように（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式があるが、具体例としては、例えば、Ａ−タイプ結合；４位と８位および２位と７位酸素の２箇所、また例えば、Ｂ−タイプ結合；４位と６位または４位と８位のいずれか１箇所、が挙げられる。またこれら結合からなる種々の立体配置を有するＰＡＣが存在する。 The main binding sites between PAC structural units include (i), (ii) or (iii) as described above. Specific examples include, for example, an A-type bond; 2 positions of oxygen and 2-position and 7-position, for example, B-type bond; any one position of 4-position and 6-position or 4-position and 8-position is mentioned. There are also PACs having various configurations consisting of these bonds.
ＰＡＣは、天然物由来、あるいは合成品を使用することができるが、天然物由来のＰＡＣが好ましく、植物由来のＰＡＣがより好ましい。このようなＰＡＣを得るための出発素材としては、野菜、ナッツ、樹皮、及びポリフェノール化合物を含む他の植物材料のような、植物から誘導される植物材料からの原料を用いることができる。例えば、殆どの色のついた果実、イチゴ類、及び野菜は、ポリフェノール化合物を含むことが知られている。ポリフェノール化合物を含む植物、果実、イチゴ類、及び野菜の例には、例えば、ブルーベリー葉、ブドウ種子、サトイモ、ビルベリー、エルダーベリー、プラム、ブラックベリー、ストロベリー、レッドカーラント、ブラックカーラント、クランベリー、チェリー、ラズベリー、グレープ実、カーラント、ハイビスカスの花、シシトウガラシ、豆、エンドウ豆、大豆皮、赤キャベツ、パープルコーン、紫サツマイモが含まれるが、それらに限定されるものではない。これらのうち、例えばブルーベリー葉、ブドウ種子、クロトン種樹液由来のようなＰＡＣ組成物の使用が実際的である。 PAC can be derived from natural products or synthetic products, but PACs derived from natural products are preferred, and plant-derived PACs are more preferred. As starting materials for obtaining such PACs, raw materials from plant materials derived from plants, such as vegetables, nuts, bark, and other plant materials including polyphenol compounds can be used. For example, most colored fruits, strawberries, and vegetables are known to contain polyphenolic compounds. Examples of plants, fruits, strawberries, and vegetables that contain polyphenol compounds include, for example, blueberry leaves, grape seeds, taro, bilberries, elderberries, plums, blackberries, strawberries, red currants, black currants, cranberries, Examples include, but are not limited to, cherry, raspberry, grapefruit, currant, hibiscus flower, pepper, beans, peas, soybean hulls, red cabbage, purple corn, purple sweet potato. Of these, the use of PAC compositions such as those derived from blueberry leaves, grape seeds, and croton seed sap is practical.
本実施形態にかかるＰＡＣ組成物の具体例として、ブルーベリー葉、ブドウ種子及びクロトン種樹液から得られるプロアントシアニジン組成を表１に示す。 Table 1 shows proanthocyanidin compositions obtained from blueberry leaves, grape seeds, and croton seed sap as specific examples of the PAC composition according to this embodiment.
本発明の出発素材において、使用する植物の部分は、葉、花弁、萼片、花、葉柄、新芽、根、茎、種子、鞘、塊茎、樹皮、形成層、材木、菌こぶ、果実、野菜、ハーブ、シダ、樹液、樹脂、ブドウ、リンゴ、タマネギやアボカドなどの皮、柑橘類の皮、果物の外皮を含む皮、リンゴ、ワインの絞りかす、穀粒の外皮、藁、干し草、オリーブ、アブラナ或いはカノラ由来の油製種子の塊、及びその他油料作物抽出物等を任意に用いることができる。 In the starting material of the present invention, the parts of the plant to be used are leaves, petals, sepals, flowers, petiole, shoots, roots, stems, seeds, pods, tubers, bark, formation layers, timbers, fungi, fruits, vegetables, Herbs, ferns, sap, resin, grapes, apples, skins such as onions and avocados, citrus peels, skins including fruit hulls, apples, wine pomace, grain hulls, straw, hay, olives, rapes or A lump of oil seed derived from canola and other oil crop extracts can be used arbitrarily.
本発明で好ましい出発素材として、ブルーベリーが挙げられる。ブルーベリーは、ツツジ科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）スノキ属（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）サイアノコカス節（Ｃｙａｎｏｃｏｃｃｕｓ）に属するアメリカ原産の落葉性もしくは常緑性の低木または半高木果樹である。ブルーベリーはおよそ６種類からなるが、果樹園芸上重要なのは下記の三種である。本発明では、使用するブルーベリーについて、種類、由来、原産地を特に制限するものではない。 A preferred starting material in the present invention is blueberry. Blueberry is a Ericaceae (Ericaceae) the genus Vaccinium (Vaccinium) Saianokokasu clause of the American native deciduous or evergreen belonging to the (Cyanococcus) shrub or semi-tall fruit trees. There are about six types of blueberries, but the following three are important for fruit gardening. In the present invention, the type, origin, and place of origin of the blueberries to be used are not particularly limited.
（１）ハイブッシュブルーベリー（Ｈｉｇｈｂｕｓｈ ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ， Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｃｏｒｙｍｂｏｓｕｍ Ｌ．）：オニール、シャープブルー、ジョージアジェム、フローダブルー、レベレイ、スパルタン、ダロウ、デューク、バークレイ、ハリソン等。 (1) Highbush blueberry (Highbush blueberry, Vaccinium corymbosum L.): O'neill, Sharp blue, Georgia gem, Flowable, Leveley, Spartan, Darrow, Duke, Berkeley, Harrison, etc.
（２）ラビットアイブルーベリー（Ｒａｂｂｉｔｅｙｅ ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ， Ｖ． ａｓｈｅｉ Ｒｅａｄｅ， Ｖ． ｖｉｒｇａｔｕｍ Ａｉｔｏｎ）：ウッダード、ガーデンブルー、ティフブルー、ホームベル、マイヤー等。 (2) rabbit eye blueberries (Rabbiteye blueberry, V. ashei Reade, V. virgatum Aiton): Woodard, Garden Blue, Tiff Blue, home Bell, Meyer and the like.
（３）ローブッシュブルーベリー（Ｌｏｗｂｕｓｈ ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ， Ｖ． ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ Ａｉｔｏｎ； Ｖ． ｍｙｒｔｉｌｌｏｉｄｅｓ Ｍｉｃｈａｕｘ）：チグネクト、ブロンズウィック、ブロミドン等。 (3) Low bush blueberry ( V. angustifolium Aiton; V. mytilloides Michaux): signature, bronzewick, bromidone, etc.
本発明の有効成分である天然物由来のＰＡＣ組成物は、目的に応じて以下の工程を適宜組み合わせることにより得ることができる。 The natural product-derived PAC composition which is the active ingredient of the present invention can be obtained by appropriately combining the following steps according to the purpose.
（１）前処理加工：
葉、皮、果実、茎、根等の全草部位に応じて、あらかじめ水洗、濾別などにより物理的に不純物を除く。あるいは、葉緑素、繊維素等、本発明のＰＡＣ以外の成分を溶媒で留去することもできる。この溶媒には、留去する対象により異なるが、クロロホルム、ヘキサン、アセトン等を用いることができる。生の素材は、そのまま粉砕しても乾燥後粉砕して、粉末状で次工程に供してもよいし、生素材からの搾汁液、抽出液を次工程に供してもよい。搾汁又は抽出液は、濃縮又は乾燥して粉末状で次工程に供してもよい。
(1) Pretreatment processing :
Depending on the whole plant parts such as leaves, skin, fruits, stems, roots, etc., impurities are physically removed in advance by washing with water or filtering. Alternatively, components other than the PAC of the present invention, such as chlorophyll and fibrin, can be distilled off with a solvent. For this solvent, chloroform, hexane, acetone or the like can be used, although it varies depending on the object to be distilled off. The raw material may be pulverized as it is, or may be pulverized after drying, and may be used in the powder form for the next step, or the juice or extract from the raw material may be used for the next step. The squeezed juice or extract may be concentrated or dried and used in the next step in powder form.
乾燥手段は、本発明の薬理効果を損なわなければ特に制限はなく、真空凍結乾燥、熱風乾燥、遠赤外線乾燥、減圧乾燥、マイクロ波減圧乾燥、及び過熱蒸気乾燥等を広く用いることができる。なかでも、成分変化の少ない真空凍結乾燥が好適に使用できる。真空凍結乾燥条件は、原料素材の種類、部位の状態によって適宜選択できるが、例えば生葉をそのまま乾燥する際の凍結温度は−３０〜−２０℃、乾燥温度は−３０〜３０℃、乾燥時間は１５〜２４時間の範囲が好ましい。 The drying means is not particularly limited as long as the pharmacological effect of the present invention is not impaired, and vacuum freeze drying, hot air drying, far-infrared drying, vacuum drying, microwave vacuum drying, superheated steam drying, and the like can be widely used. Among these, vacuum freeze-drying with little component change can be preferably used. The vacuum freeze-drying conditions can be appropriately selected depending on the type of raw material and the state of the part. For example, the freezing temperature when drying fresh leaves as it is is −30 to −20 ° C., the drying temperature is −30 to 30 ° C., and the drying time is A range of 15 to 24 hours is preferred.
（２）抽出工程：
前工程で得られた加工処理物は、次に溶媒抽出することができる。溶媒抽出には、下記の溶媒を適宜組み合わせて、必要に応じ多段抽出する。使用する抽出溶媒は特に制限されないが、水又は水と相溶性のある極性溶媒の使用が好適である。水と相溶性のある極性溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの炭素数１〜４の低級アルキルアルコール；エチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコールなどを挙げることができる。アルコールとしては、安全性の観点から低級アルコール、特にメタノールやエタノールの使用が実際的である。他の有機溶媒としては、例えばアセトン、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステル、キシレン、クロロホルム、トルエン、ヘキサンなどを挙げることができる。水と極性溶媒の組み合わせを含め、これらの溶媒は、単独あるいは２種以上を組み合わせて使用してもよい。例えば、アセトンとエチルエーテルの混合溶媒、好ましくはアセトンとエチルエーテルの１ ： １（ｖ／ｖ）混合液の使用が可能である。一般的には、極性溶媒と水との混合溶媒の使用が望ましい。これらの含水溶媒としては、含水アルキルアルコール、より好ましくは含水メタノール、含水エタノールである。含水アルコール中のアルコール濃度は、５〜９０容量％、好ましくは８０〜９０容量％、より好ましくは５０〜９０容量％である。アルコール以外の好ましい混合溶媒としては、水とアセトンの混液を挙げることができる。
(2) Extraction process :
The processed product obtained in the previous step can then be solvent extracted. For solvent extraction, the following solvents are combined as appropriate, and multistage extraction is performed as necessary. The extraction solvent to be used is not particularly limited, but it is preferable to use water or a polar solvent compatible with water. Examples of polar solvents that are compatible with water include lower alkyl alcohols having 1 to 4 carbon atoms such as methanol, ethanol, propanol, and butanol; polyhydric alcohols such as ethylene glycol, butylene glycol, propylene glycol, and glycerin. it can. As the alcohol, it is practical to use a lower alcohol, particularly methanol or ethanol, from the viewpoint of safety. Examples of other organic solvents include acetone, diethyl ether, dioxane, acetonitrile, acetic acid ethyl ester, xylene, chloroform, toluene, hexane, and the like. These solvents including combinations of water and polar solvents may be used alone or in combination of two or more. For example, it is possible to use a mixed solvent of acetone and ethyl ether, preferably a 1: 1 (v / v) mixture of acetone and ethyl ether. In general, it is desirable to use a mixed solvent of a polar solvent and water. These water-containing solvents are water-containing alkyl alcohols, more preferably water-containing methanol and water-containing ethanol. The alcohol concentration in the hydrous alcohol is 5 to 90% by volume, preferably 80 to 90% by volume, more preferably 50 to 90% by volume. As a preferable mixed solvent other than alcohol, a mixed solution of water and acetone can be exemplified.
抽出操作としては、加工処理物を溶媒に冷浸、温浸などの浸漬処理が挙げられる。通常は、加温下で撹拌しながら抽出し、ろ過して抽出液を得る。例えば、８０容量％エタノール水溶液による撹拌抽出では、溶液温度は、望ましくは室温、浸漬時間は温度により異なるが３０秒〜１時間の範囲内が好適である。また、パーコレーション法によることもできる。 Examples of the extraction operation include immersion treatment such as cold immersion and digestion of a processed product in a solvent. Usually, extraction is performed with stirring under heating, followed by filtration to obtain an extract. For example, in stirring extraction with an 80% by volume ethanol aqueous solution, the solution temperature is desirably room temperature, and the immersion time varies depending on the temperature, but is preferably in the range of 30 seconds to 1 hour. It can also be based on the percolation method.
得られた抽出物は、必要に応じてろ過又は遠心分離により固形物を除去する。ろ液は、次工程の要求に応じてそのまま用いるか、又は溶媒を留去して一部濃縮もしくは乾燥して用いてもよい。必要に応じて、これらの抽出、濃縮物は精製する。精製方法は、特に限定されないが、例えばカラム法や溶媒による分割法などを挙げることができる（ＷＯ００／６４８８３号公報参照）。 From the obtained extract, solids are removed by filtration or centrifugation as necessary. The filtrate may be used as it is depending on the requirements of the next step, or may be used after partially concentrating or drying by distilling off the solvent. If necessary, these extracts and concentrates are purified. The purification method is not particularly limited, and examples thereof include a column method and a resolution method using a solvent (see WO 00/64883).
ＰＡＣ組成物は、抽出液、濃縮エキス、ペースト、乾燥、半乾燥物など、最終利用形態としてはさまざまな形で利用できる。精製されたＰＡＣ組成物は、濃縮されているので、一般に単純な抽出物に比べより高い薬理活性（肝線維化抑制活性）を有する。 The PAC composition can be used in various forms such as an extract, a concentrated extract, a paste, a dried product, and a semi-dried product. Since the purified PAC composition is concentrated, it generally has a higher pharmacological activity (liver fibrosis inhibiting activity) than a simple extract.
得られたＰＡＣ組成物は、そのまま、又は、プロドラッグ若しくは薬剤として、利用できる。本実施形態に係る肝線維化抑制剤又は肝星細胞増殖抑制剤は、ＰＡＣ組成物、その生理学的に許容される塩、それらの水和物及び／又はそれらの溶媒和物からなる薬剤であっても良いが、一般には上記の物質と薬理学的及び製剤学的に許容される添加物を含む医薬組成物に調製することが望ましい。 The obtained PAC composition can be used as it is or as a prodrug or a drug. The hepatic fibrosis inhibitor or hepatic stellate cell growth inhibitor according to this embodiment is a drug comprising a PAC composition, a physiologically acceptable salt thereof, a hydrate thereof and / or a solvate thereof. However, it is generally desirable to prepare a pharmaceutical composition containing the above substances and pharmacologically and pharmaceutically acceptable additives.
薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、例えば賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤、溶解補助剤、張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤などを用いることができる。 Examples of pharmacologically and pharmaceutically acceptable additives include excipients, disintegrants, disintegration aids, binders, lubricants, coating agents, dyes, diluents, bases, solubilizers, and dissolution agents. Adjuvants, tonicity agents, pH adjusters, stabilizers, propellants, adhesives, and the like can be used.
本実施形態に係る肝線維化抑制剤又は肝星細胞増殖抑制剤を医薬品とする場合は、投与単位形態で投与することが好ましく、経口投与、組織内投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与など）、局所投与（経皮投与など）、又は経直腸的に投与をすることもできる。 When the hepatic fibrosis inhibitor or hepatic stellate cell growth inhibitor according to this embodiment is used as a pharmaceutical, it is preferably administered in a dosage unit form, and is administered orally, intra-tissue (subcutaneous, intramuscular, intravenous Administration), local administration (transdermal administration, etc.), or rectal administration.
経口投与剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤などから適宜選択すればよい。また経口投与用液状医薬製剤としては、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができる。製剤にあたっては、各種製剤に応じた賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色料、矯味矯臭剤、ｐＨ調整剤などを適宜配合することができる。例えば、錠剤の場合は、必要に応じて、通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、又は多層錠とすることができる。錠剤の形態に調製するに際しては、担体として、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸などの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖などの崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤；グリセリン、澱粉などの保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコールなどの潤沢剤などを例示できる。 The oral dosage form may be appropriately selected from tablets, pills, capsules, fine granules, granules and the like. Examples of liquid pharmaceutical preparations for oral administration include emulsions, solutions, suspensions, and syrups. In the preparation, excipients, binders, disintegrants, lubricants, colorants, flavoring agents, pH adjusters and the like according to various preparations can be appropriately blended. For example, in the case of a tablet, if necessary, it can be made into a tablet with a normal coating, such as a sugar-coated tablet, a gelatin-encapsulated tablet, an enteric tablet, a film-coated tablet, a double tablet, or a multilayer tablet. When preparing into tablet form, as a carrier, for example, lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, silicic acid, etc .; water, ethanol, propanol, simple syrup , Glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, shellac, methylcellulose, potassium phosphate, polyvinylpyrrolidone and other binders; dried starch, sodium alginate, agar powder, laminaran powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene Disintegrants such as sorbitan fatty acid ester, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, starch, lactose; disintegration inhibitors such as sucrose, stearin, cocoa butter, hydrogenated oil; quaternary ammonium salts, sodium lauryl sulfate Humectants such as glycerin and starch; adsorbents such as starch, lactose, kaolin, bentonite and colloidal silicic acid; and lubricants such as purified talc, stearate, boric acid powder and polyethylene glycol .
組織内投与剤形としては、注射剤を挙げることができる。注射剤として調製するには、非毒性の溶液、乳剤及び懸濁剤などの形態とするのが望ましい。これらは、殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ましい。これら液剤、乳剤及び懸濁剤の形態に調製するに際しては、希釈剤として、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類などを用いることができる。また等張性の溶液を調製するに十分な量の食塩、グルコース、又はグリセリン、及び通常の溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤なども配合することができる。これらの注射剤は、皮下、筋肉内又は静脈内に投与することができる。 An example of the intra-tissue dosage form is an injection. For preparation as an injection, it is desirable to use forms such as non-toxic solutions, emulsions and suspensions. They are preferably sterilized and isotonic with blood. In preparing these solutions, emulsions and suspensions, for example, water, ethanol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, etc. are used as diluents. be able to. A sufficient amount of sodium chloride, glucose, or glycerin to prepare an isotonic solution, and usual solubilizers, buffers, pH adjusters, soothing agents, and the like can also be blended. These injections can be administered subcutaneously, intramuscularly or intravenously.
局所投与剤形としては、例えば、局所用液剤、クリーム剤、粉剤、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤などの外用製剤を挙げることができる。これらは、本実施形態に係るＰＡＣ組成物、そのプロドラッグ、製薬上許容されうるそれらの塩等の一定量を、外用製剤の目的に適合する香料、着色料、充填剤、界面活性剤、保湿剤、皮膚軟化剤、ゲル化剤、担体、保存剤、安定剤などのうちの一種以上と組み合わせることにより調製することができる。 Examples of the topical dosage form include external preparations such as topical solutions, creams, powders, pastes, gels and ointments. These include a certain amount of a PAC composition, a prodrug thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, and the like according to the present embodiment, a fragrance, a colorant, a filler, a surfactant, a moisturizing agent that are suitable for the purpose of external preparation. It can be prepared by combining with one or more of agents, emollients, gelling agents, carriers, preservatives, stabilizers and the like.
経直腸的投与剤形としては、坐剤を挙げることができる。坐剤の形態に調製するに際しては、基材として、例えばパルミチン酸ミリスチルエステルなどの高級エステル類、高級アルコール類、ポリエチレングリコール、カカオ脂、ゼラチン、半合成グリセリド、これらの混合物などの低融点基材を挙げることができる。座剤は、本実施形態に係るＰＡＣ組成物、そのプロドラッグ、製薬上許容され得るそれらの塩等を、上記のような基材に混入し、成型することにより調製することができる。 Suppositories can be mentioned as a rectal dosage form. In preparing the suppository form, the base material is a low-melting-point base material such as higher esters such as myristyl palmitate, higher alcohols, polyethylene glycol, cacao butter, gelatin, semi-synthetic glycerides, and mixtures thereof. Can be mentioned. The suppository can be prepared by mixing and molding the PAC composition according to the present embodiment, a prodrug thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, and the like into the base material as described above.
本実施形態に係る肝線維化抑制剤又は肝星細胞増殖抑制剤などを医薬品として投与する場合、ＰＡＣ組成物（若しくはそのプロドラック、又は製薬上許容され得るそれらの塩）の有効投与量は、患者の年齢、体重、疾病の性質、進展状態、投与経路などにより異なるので特定はできないが、通常は成人一人、体重６０ｋｇ換算で、一日当たり１〜２０００ｍｇの範囲である。患者の状態などに応じて、上記範囲未満又は上記範囲を超える用量を投与することもできる。多量に投与するときは、一日数回に分割して投与することが望ましい。医薬品の場合、ＰＡＣの有効含量は、投与量又は服用量との関係で一概に特定できないが、０．１〜９９．５重量％、好ましくは０．５〜９０重量％の範囲で選択すればよい。 When the hepatic fibrosis inhibitor or hepatic stellate cell growth inhibitor according to this embodiment is administered as a pharmaceutical, the effective dose of the PAC composition (or its prodrug, or a pharmaceutically acceptable salt thereof) is: Although it cannot be specified because it varies depending on the patient's age, weight, nature of disease, progress, administration route, etc., it is usually in the range of 1 to 2000 mg per day in terms of 60 kg body weight for an adult. Depending on the patient's condition and the like, a dose below or above the above range can also be administered. When administering a large amount, it is desirable to divide the dose into several times a day. In the case of pharmaceuticals, the effective content of PAC cannot be generally specified in relation to the dose or dose, but it can be selected in the range of 0.1 to 99.5% by weight, preferably 0.5 to 90% by weight. Good.
本実施形態に係るＰＡＣ組成物を用いた医薬品の用途としては、肝線維化抑制剤、肝星細胞増殖抑制剤、肝星細胞ＤＮＡ合成活性化抑制剤、肝星細胞アポトーシス誘導剤、又は、肝繊維化を病因とする肝疾病（例えば肝硬変や肝癌）の発症若しくは進展抑制剤、等を挙げることができる。 Examples of the use of the pharmaceutical using the PAC composition according to the present embodiment include a liver fibrosis inhibitor, a hepatic stellate cell growth inhibitor, a hepatic stellate cell DNA synthesis activation inhibitor, a hepatic stellate cell apoptosis inducer, or a liver Examples include inhibitors of the onset or progression of liver diseases (for example, cirrhosis and liver cancer) caused by fibrosis.
本実施形態に係るＰＡＣ組成物は、肝線維化抑制を含め、上記疾病の発症及び進展の予防のための機能性補助飲食物としても利用できる。機能性飲食物製剤としては、固体状、液体状、エマルジョンなどが可能であるが、必要に応じて薬学的もしくは食品上許容される担体又は添加剤を配合することもできる。添加剤には、一般的な剤形補助剤などの外、他の薬剤、機能性成分、例えばビタミン類、その他の微量成分などの有効成分を含むことができる。剤形は、特に問わないが、経口に適した形態であることが好ましい。また、その形態は特に制限されないが、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、トローチ剤、又は溶液剤（ドリンク）などの形態に調製することができる。 The PAC composition according to the present embodiment can also be used as a functional supplement food or drink for preventing the onset and progression of the above diseases, including suppression of liver fibrosis. The functional food and drink preparation can be in the form of a solid, liquid, emulsion or the like, but a pharmaceutically or food-acceptable carrier or additive can be blended as necessary. In addition to general dosage form adjuvants and the like, the additives may include active ingredients such as other drugs, functional ingredients such as vitamins and other trace ingredients. The dosage form is not particularly limited, but is preferably a form suitable for oral administration. Moreover, the form is not particularly limited, but it can be prepared in the form of tablets, pills, capsules, granules, powders, powders, troches, or solutions (drinks).
以下、実施例を挙げて本発明についてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。以下の実施例において、「％」は、特に言及しない限り、「ｗ／ｗ％（質量％）」を意味する。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples. In the following examples, “%” means “w / w% (mass%)” unless otherwise specified.
１．各素材からのＰＡＣの調製
ＰＡＣは、上述のとおり、広く植物界から見いだされている。ＰＡＣを含有することが報告されている下記に挙げる素材（試料１〜３）を入手し、ＰＡＣ画分を調製した。
1. Preparation of PAC from each material As described above, PAC is widely found in the plant kingdom. The materials listed below (Samples 1 to 3) reported to contain PAC were obtained, and PAC fractions were prepared.
試料１：ブルーベリー葉
試料２：ブドウ種子抽出物（グラヴィノールＴＭ：キッコーマン株式会社）
試料３：クロトン樹液（Ｓａｎｇｒｅ ｄｅ Ｄｒａｇｏ； Ｒａｉｎｔｒｅｅ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， Ｉｎｃ．）
Sample 1: Blueberry leaf Sample 2: Grape seed extract (Gravinol TM : Kikkoman Corporation)
Sample 3: Croton sap (Sangre de Drago; Raintree Nutrition, Inc.)
（試料１：ブルーベリー葉由来ＰＡＣ画分の調製）
ラビットアイブルーベリー種（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ Ａｉｔｏｎ）の生葉を、凍結乾燥（ＦＴＳ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｄｕｒａ−Ｔｏｐ ＭＰ＆Ｄｕｒａ−Ｄｒｙ ＭＰ）し、超遠心粉砕機（ＭＲＫ＆ＲＥＴＳＣＨ、ＥＭ−１）で粉砕することで、ブルーベリー葉の凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末１０ｇに１００ｍｌのヘキサンを加え、室温で３０分間振盪抽出し、デカンテーションにより残渣を回収した。この抽出操作を３回繰り返し、ブルーベリー葉ヘキサン洗浄物を得た。
(Sample 1: Preparation of PAC fraction derived from blueberry leaves)
Freezing dry leaves of rabbit eye blueberry seeds ( Vaccinium virgatum Aiton) by freeze-drying (FTS System, Dura-Top MP & Dura-Dry MP) and grinding with ultracentrifuge grinder (MRK & RETSCH, EM-1) A dry powder was obtained. 100 g of hexane was added to 10 g of this lyophilized powder, and the mixture was extracted by shaking at room temperature for 30 minutes, and the residue was collected by decantation. This extraction operation was repeated three times to obtain a washed product of blueberry leaf hexane.
さらに、得られたブルーベリー葉ヘキサン洗浄物に、１００ｍｌの酢酸エチルを加え、同様に３０分間振盪抽出し、デカンテーションにて残渣を回収した。これも同様に３回繰り返し、ヘキサン−酢酸エチル洗浄物を得た。 Furthermore, 100 ml of ethyl acetate was added to the resulting washed product of blueberry leaf hexane, and similarly extracted by shaking for 30 minutes, and the residue was recovered by decantation. This was similarly repeated three times to obtain a washed product of hexane-ethyl acetate.
次に、ヘキサン−酢酸エチル洗浄物に１００ｍｌのメタノールを加え、３０分間振盪抽出し、ろ過にて抽出液を回収し、残渣に再度メタノール１００ｍｌを加え、同様に３回繰り返し抽出液を合わせた。 Next, 100 ml of methanol was added to the washed product of hexane-ethyl acetate, extracted by shaking for 30 minutes, the extract was collected by filtration, 100 ml of methanol was added again to the residue, and the extracts were combined three times in the same manner.
抽出液をエバポレーターで減圧濃縮後、凍結乾燥し、ブルーベリー葉メタノール抽出物約３．５ｇを得た。さらに、この抽出物約５００ｍｇを６０％メタノールに溶解し、６０％メタノールで平衡化したセファデックスＴＭＬＨ−２０（容量１００ｍｌ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）カラムにアプライし、６０％メタノール４００ｍｌで洗浄し、次に１００％メタノール４００ｍｌで洗浄した。その後７０％アセトン４００ｍｌで溶出させ、減圧濃縮後、凍結乾燥し、ブルーベリー葉由来ＰＡＣ画分（試料１）を約１００ｍｇ得た。同様に以下の試料を調製した。 The extract was concentrated under reduced pressure using an evaporator and then freeze-dried to obtain about 3.5 g of a blueberry leaf methanol extract. Furthermore, about 500 mg of this extract was dissolved in 60% methanol and applied to a Sephadex ™ LH-20 (volume 100 ml; manufactured by GE Healthcare Bioscience) column equilibrated with 60% methanol. Washed and then washed with 400 ml of 100% methanol. Thereafter, the residue was eluted with 400 ml of 70% acetone, concentrated under reduced pressure, and lyophilized to obtain about 100 mg of a blueberry leaf-derived PAC fraction (sample 1). Similarly, the following samples were prepared.
（試料２〜３由来のＰＡＣ画分の調製）
試料２〜３は、素材を直接入手して、１００％メタノールで抽出を行い、減圧濃縮後、凍結乾燥した。その後、上記調製と同じように、セファデックスＬＨ−２０でＰＡＣ画分を調製した。
(Preparation of PAC fractions derived from samples 2-3)
Samples 2 to 3 were obtained directly, extracted with 100% methanol, concentrated under reduced pressure, and then lyophilized. Thereafter, as in the above preparation, a PAC fraction was prepared with Sephadex LH-20.
ＰＡＣ調製物の組成解析
各起源から抽出された上記試料１〜３につき、ＰＡＣ純度、組成及び平均重合度を調べた。以下に用いた解析方法と結果を示す。
Composition analysis of PAC preparation PAC purity, composition and average degree of polymerization were examined for samples 1 to 3 extracted from each source. The analysis methods and results used are shown below.
２．ブタノール−塩酸加水分解法（ポーター法）
下記文献の方法に従い、ポーター法を用いてＰＡＣの分析を行った。
・Ｐｏｒｔｅｒ Ｌ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．、“Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、１９８６年、第２５巻、ｐ．２２３−２３０
・Ｓｈｏｊｉ Ｔ． ｅｔ ａｌ．、“Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．”、２００６年、第５４巻、ｐ．８８４−８９２
2. Butanol-hydrochloric acid hydrolysis method (Porter method)
PAC was analyzed using the porter method according to the method of the following literature.
-Porter L. J. et al. et al. "Phytochemistry", 1986, Vol. 25, p. 223-230
Shoji T. et al. "J. Agric. Food Chem.", 2006, Vol. 54, p. 884-892
ＰＡＣは酸性条件下における加熱により、フラバン間の結合が切断され、カルベニウムイオンとカテキン類を与える。前者はさらに酸化されて赤色のアントシアニジンとなる。この原理を利用した呈色法がポーター法であり、５４０ｎｍの吸光度の上昇により、試料中のＰＡＣを鋭敏に検出できる。 PAC breaks the bond between flavans by heating under acidic conditions to give carbenium ions and catechins. The former is further oxidized to red anthocyanidins. The coloration method using this principle is the Porter method, and the PAC in the sample can be detected sharply by increasing the absorbance at 540 nm.
（１）ポーター法によるＰＡＣの定性及び定量
精製画分をメタノールに溶解し、その２００μｌに５％（ｖ／ｖ）塩酸を含む１−ブタノール７５０μｌと１％（ｗ／ｖ）硫酸鉄アンモニウムを含む２ｍｏｌ／Ｌ塩酸５０μｌを添加し、１０５℃で４０分間反応させた。反応液を室温に戻し、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとしてプロシアニジンＢ２（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
(1) Qualitative and quantitative determination of PAC by Porter method The purified fraction is dissolved in methanol, and 200 μl of 1-butanol containing 5% (v / v) hydrochloric acid and 750 μl of 1% (w / v) ammonium iron sulfate are contained. 50 μl of 2 mol / L hydrochloric acid was added and reacted at 105 ° C. for 40 minutes. The reaction solution was returned to room temperature, and the absorbance at 540 nm was measured. Procyanidin B2 (manufactured by Sigma) was used as a control.
（２）組成分析；ＬＣ／ＭＳ法
ＬＣ／ＭＳを用いて上記ポーター法反応分解物の分析を実施した。もしブルーベリー葉から精製したＰＡＣであれば、アントシアニジンを検出するはずである。ＬＣ／ＭＳに用いた装置及び条件は下記の通りである。
・装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ／ＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ
・カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｔ３、２．１ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１００ｍｍ、３μｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）、４０℃
・移動相（溶出液）：（Ａ）５ｍＭギ酸アンモニウムを含む０．５％（ｖ／ｖ）ギ酸
（Ｂ）アセトニトリル
・グラジエント：溶出液Ｂ １０％（０分）→４０％（１５分）→１００％（１５分）→１００％（２２．５分）
・移動相流速：０．２５ｍｌ／分
・検出器１：フォトダイオードアレイ５４０ｎｍ
・検出器２：ＥＳＩ−ＭＳ
（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｉｏｎ Ｍｏｄｅ、インターフェイス電圧：４．５ｋＶ、
ＣＤＬ温度２００℃、ネブライズガス流量：１．５Ｌ／分、
ドライガス圧力：２００ｋＰａ、ヒートブロック温度：２００℃）
(2) Composition analysis; LC / MS method The LC / MS was used to analyze the Porter method reaction decomposition product. If the PAC was purified from blueberry leaves, it would detect anthocyanidins. The apparatus and conditions used for LC / MS are as follows.
・ Device: Shimadzu LC / MS-IT-TOF
Column: Atlantis T3, 2.1 mm I.D. D. × 100 mm, 3 μm (manufactured by Waters), 40 ° C.
Mobile phase (eluent): (A) 0.5% (v / v) formic acid containing 5 mM ammonium formate
(B) Acetonitrile gradient: eluent B 10% (0 min) → 40% (15 min) → 100% (15 min) → 100% (22.5 min)
-Mobile phase flow rate: 0.25 ml / min-Detector 1: Photodiode array 540 nm
Detector 2: ESI-MS
(Positive-Ion Mode, interface voltage: 4.5 kV,
CDL temperature 200 ° C., nebulization gas flow rate: 1.5 L / min,
(Dry gas pressure: 200 kPa, heat block temperature: 200 ° C.)
上記で調製した各植物由来ＰＡＣ調製物のサンプルは本法によって赤色を呈したことから、ＰＡＣの存在が明らかとなった。また、ＬＣ／ＭＳ分析の結果、分解物のメインピークの溶出時間はシアニジン標品と同じであり、ＭＳ／ＭＳスペクトルも一致したことからＰＡＣと同定された（図２）。さらにプロシアニジンＢ２を標品として定量した結果、ＰＡＣの純度は５５．９１〜８８．１２％となった（表１）。 The samples of the plant-derived PAC preparations prepared above showed a red color by this method, which revealed the presence of PAC. Further, as a result of LC / MS analysis, the elution time of the main peak of the decomposed product was the same as that of the cyanidin sample, and the MS / MS spectrum was also matched, so that it was identified as PAC (FIG. 2). Furthermore, as a result of quantifying procyanidin B2 as a sample, the purity of PAC was 55.91 to 88.12% (Table 1).
また、ＬＣ／ＭＳによってアントシアニジン組成を解析した結果、ブルーベリー葉とブドウ種子由来の調製物はプロシアニジンが１００％であったが、クロトン種樹液由来のものはプロデルフィニジンが約４割含まれていることが分かった（表１）。 Moreover, as a result of analyzing the anthocyanidin composition by LC / MS, the preparation derived from blueberry leaves and grape seeds was 100% procyanidin, but the one derived from croton seed sap contains about 40% prodelphinidin. (Table 1).
３．チオール開裂によるＰＡＣの平均重合度と構成ユニット組成の解析
上記結果より、各植物由来調製物の主成分がＰＡＣであることが示された。次いでここでは、ＰＡＣの構成単位、結合様式及び重合度を調べるために、Ｇｕｙｏｔらの方法（Ｇｕｙｏｔ Ｓ． ｅｔ ａｌ．、“Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．”、２００１年、第４９巻、ｐ．１４−２０参照）に基づきチオール開裂分析を行った。
3. Analysis of average polymerization degree and structural unit composition of PAC by thiol cleavage From the above results, it was shown that the main component of each plant-derived preparation was PAC. Next, in order to examine the structural unit, the binding mode and the degree of polymerization of PAC, the method of Guyot et al. (Guyot S. et al., “J. Agric. Food Chem.”, 2001, vol. 49, p. 14-20), thiol cleavage analysis was performed.
図３に、チオール開裂の基本反応を示す。チオール開列の基本反応においては、ＰＡＣを酸性条件下でトルエン−α−チオールと反応させることにより、エクステンションユニットはベンジルチオエーテル付加物となり、ターミナルユニットは遊離のフラバン−３−オールとなる。それらチオール開裂反応産物を逆相ＨＰＬＣで分析することにより、ターミナルユニットとエクステンションユニットの各組成や平均重合度（ｍＤＰ）の情報を得ることができる。平均重合度（ｍＤＰ）は、以下の式により求めることができる。
平均重合度（ｍＤＰ）＝［ターミナルユニット＋エクステンションユニット］／［ターミナルユニット］
FIG. 3 shows the basic reaction of thiol cleavage. In the basic reaction of thiol opening, by reacting PAC with toluene-α-thiol under acidic conditions, the extension unit becomes a benzylthioether adduct and the terminal unit becomes free flavan-3-ol. By analyzing these thiol cleavage reaction products by reverse phase HPLC, it is possible to obtain information on each composition and average degree of polymerization (mDP) of the terminal unit and the extension unit. The average degree of polymerization (mDP) can be determined by the following equation.
Average degree of polymerization (mDP) = [terminal unit + extension unit] / [terminal unit]
標品としてカテキンとエピカテキンを用い、チオール開裂の反応中に生じる遊離のフラバン−３−オールの異性化も考慮に入れて補正を行った（Ｇｕ Ｌ． ｅｔ ａｌ．、“Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．”、２００２年、第５０巻、ｐ．４８５２−４８６０参照）。 Catechin and epicatechin were used as preparations and corrections were made taking into account the isomerization of free flavan-3-ols produced during the thiol cleavage reaction (Gu L. et al., “J. Agric. Food. Chem. ", 2002, 50, pp. 4852-4860).
（１）チオール開裂、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）条件
ブルーベリー葉由来活性化合物ＰＡＣを、メタノールで１ｍｇ／ｍｌに調製し、５０μｌを取り、３．３％（ｖ／ｖ）塩酸メタノール５０μｌを加え、５％（ｖ／ｖ）トルエン−α−チオール１００μｌを加え、５０℃で３０分間反応させた後、反応液を５倍にメタノールで希釈し、ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
・装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＬＣ−２０Ａ
・カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｔ３，４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ，３μｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）、４０℃
・移動相（溶出液）：（Ａ）０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸
（Ｂ）アセトニトリル
・グラジエント：溶出液Ｂ １５％（０分）→２５％（１０分）→６０％（４０分）→１００％（４０分）→１００％（５０分）
・移動相流速：０．７０ｍｌ／分
・検出器：ＵＶ２８０ｎｍ
(1) Thiol cleavage, high performance liquid chromatography (HPLC) conditions Blueberry leaf-derived active compound PAC is prepared to 1 mg / ml with methanol, 50 μl is taken, and 50% of 3.3% (v / v) hydrochloric acid methanol is added, After adding 100 μl of 5% (v / v) toluene-α-thiol and reacting at 50 ° C. for 30 minutes, the reaction solution was diluted 5-fold with methanol and subjected to HPLC. The HPLC conditions are shown below.
-Equipment: Shimadzu Prominence LC-20A
Column: Atlantis T3, 4.6 mm I.D. D. × 150 mm, 3 μm (Waters), 40 ° C.
Mobile phase (eluent): (A) 0.05% (v / v) trifluoroacetic acid
(B) Acetonitrile gradient: Eluent B 15% (0 min) → 25% (10 min) → 60% (40 min) → 100% (40 min) → 100% (50 min)
-Mobile phase flow rate: 0.70 ml / min-Detector: UV280nm
（２）反応物の同定；液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）
上記反応物を同様にＬＣ／ＭＳに供し各検出ピークの同定を行った。分析条件は下記に示す。
・装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ／ＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ
・カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｔ３，２．１ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）
・移動相（溶出液）：（Ａ）０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸
（Ｂ）アセトニトリル
・グラジエント：溶出液Ｂ １５％（０分）→２５％（１０分）→６０％（４０分）→１００％（４０分）
・移動相流速：０．２５ｍｌ／分
・検出器１：フォトダイオードアレイ２８０ｎｍ
・検出器２：ＥＳＩ−ＭＳ
（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｉｏｎ Ｍｏｄｅ、インターフェイス電圧：４．５ｋＶ、ＣＤＬ温度２００℃、ネブライズガス流量：１．５Ｌ／分、ドライガス圧力：２００ｋＰａ、ヒートブロック温度：２００℃）
(2) Identification of reactants; liquid chromatograph mass spectrometry (LC / MS)
The reaction product was similarly subjected to LC / MS to identify each detection peak. The analysis conditions are shown below.
・ Device: Shimadzu LC / MS-IT-TOF
Column: Atlantis T3, 2.1 mm D. × 100mm (made by Waters)
Mobile phase (eluent): (A) 0.05% (v / v) trifluoroacetic acid
(B) Acetonitrile gradient: Eluent B 15% (0 min) → 25% (10 min) → 60% (40 min) → 100% (40 min)
-Mobile phase flow rate: 0.25 ml / min-Detector 1: Photodiode array 280 nm
Detector 2: ESI-MS
(Positive-Ion Mode, interface voltage: 4.5 kV, CDL temperature 200 ° C., nebulization gas flow rate: 1.5 L / min, dry gas pressure: 200 kPa, heat block temperature: 200 ° C.)
ブルーベリー葉から調製したＰＡＣをチオール開裂し、ＨＰＬＣで分離したところ、主に８本のメインピークが確認できた。ＨＰＬＣのクロマトグラムを図４に示す。カテキン、エピカテキンとトルエン−α−チオールは、標品の溶出時間より確認を行い、ピークＡはカテキン、ピークＣはエピカテキン、そしてピークＨはトルエン−α−チオールと判明した。他のピークはＬＣ／ＭＳで再度分析を行い、各ピークのＭＳスペクトルを確認した。 When PAC prepared from blueberry leaves was cleaved by thiol and separated by HPLC, 8 main peaks were mainly confirmed. An HPLC chromatogram is shown in FIG. Catechin, epicatechin and toluene-α-thiol were confirmed from the elution time of the sample, and peak A was found to be catechin, peak C was epicatechin, and peak H was found to be toluene-α-thiol. Other peaks were analyzed again by LC / MS, and the MS spectrum of each peak was confirmed.
ピークＥはｍ／ｚ＝４１１．０８９２を検出し、この組成を組成推定によりＣ２２Ｈ２０Ｏ６Ｓ（Ｅｒｒｏｒ＝−３．８ｐｐｍ）と推定した。また、ＭＳ／ＭＳスペクトルにｍ／ｚ＝２８７．０５１０を検出し、親ＭＳとＭＳ／ＭＳの差が１２４．０３８２であったことから、ピークＥはベンジルチオエーテル付加物であることが推定された。加えて、親イオンから推定した組成式Ｃ２２Ｈ２０Ｏ６Ｓからトルエン−α−チオールの組成式Ｃ７Ｈ８Ｓの部分を差し引くとＣ１５Ｈ１４Ｏ６となり、これらのことからピークＥはカテキンもしくはエピカテキンのベンジルチオエーテル付加物であることが確認できた。さらに、プロシアニジンＢ２標品をチオール開裂した場合、エピカテキンとエピカテキンベンジルチオエーテルが生成する。この分解物を分析したとき、エピカテキンベンジルチオエーテルとピークＥの溶出時間が同じであったことから、ピークＥはエピカテキンベンジルチオエーテルとした。 Peak E detected m / z = 411.0892, and this composition was estimated to be C22H20O6S (Error = −3.8 ppm) by composition estimation. In addition, m / z = 287.0510 was detected in the MS / MS spectrum, and the difference between the parent MS and MS / MS was 124.0382. Therefore, it was estimated that peak E was a benzylthioether adduct. . In addition, subtraction of the toluene-α-thiol composition formula C7H8S from the composition formula C22H20O6S estimated from the parent ion yields C15H14O6, confirming that peak E is a benzylthioether adduct of catechin or epicatechin. did it. Furthermore, when the procyanidin B2 preparation is subjected to thiol cleavage, epicatechin and epicatechin benzylthioether are produced. When this decomposition product was analyzed, the elution time of epicatechin benzyl thioether and peak E was the same, so peak E was epicatechin benzyl thioether.
ピークＧは、親イオンとしてｍ／ｚ＝６９７．１３８５を、ＭＳ／ＭＳにｍ／ｚ＝５７３．０９８７を検出し、その差が１２４．０３９８になることからこのピークもベンジルチオエーテル付加物であることが分かった。この精密質量からＣ３７Ｈ３０Ｏ１２Ｓと推定した。この組成からベンジルチオエーテル付加物を除くと、Ｃ３０Ｈ２４Ｏ１２となることから、ピークＧはカテキンやエピカテキンからなるＡ−タイプ２量体のベンジルチオエーテル付加物であると推定された。 Peak G detects m / z = 697.1385 as the parent ion and m / z = 573.0987 in MS / MS, and the difference is 124.0398. This peak is also a benzylthioether adduct. I understood that. From this exact mass, it was estimated as C37H30O12S. When the benzylthioether adduct is removed from this composition, it becomes C30H24O12, and therefore peak G was estimated to be an A-type dimer benzylthioether adduct composed of catechin and epicatechin.
Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｒ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．、“Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ”、１９７２年、ｐ．１３８７−１３９９参照）によると、Ａ−タイプのフラバン間結合はチオール開裂に対して抵抗性があるとされている。チオール開裂反応後、ターミナルユニットにＡ−タイプが存在すれば、それに対応するＡ−タイプ２量体として遊離し、エクステンションユニットにあればそれに相当するベンジルチオエーテル付加物が検出される（Ｆｏｏ Ｌ． Ｙ． ｅｔ ａｌ．、 “Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．”、２０００年、第６３巻、ｐ．１２２５−１２２８参照）。 According to Thompson et al. (See Thompson R. S. et al., “J. Chem. Soc. Perkin Trans. I”, 1972, p. 1387-1399), the A-type interflavan linkage is against thiol cleavage. It is said that it is resistant. After the thiol cleavage reaction, if A-type is present in the terminal unit, it is released as the corresponding A-type dimer, and if it is in the extension unit, the corresponding benzylthioether adduct is detected (Foo L. Y). Et al., “J. Nat. Prod.”, 2000, 63, pp. 125-1228).
ピークＢの親イオンはｍ／ｚ＝８６３．１８２２で、この精密質量から組成を推定するとＣ４５Ｈ３６Ｏ１８（Ｅｒｒｏｒ＝−０．８６ｐｐｍ）となった。Ｂ−タイプ３量体の分子式はＣ４５Ｈ３８Ｏ１８であり、Ａ−タイプはＣ４５Ｈ３４Ｏ１８であることから、このピークＢはＡ−タイプとＢ−タイプが混在した３量体と推測した。 The parent ion of peak B was m / z = 8633.1822, and the composition was estimated from this exact mass, resulting in C45H36O18 (Error = −0.86 ppm). Since the molecular formula of the B-type trimer is C45H38O18 and the A-type is C45H34O18, this peak B was assumed to be a trimer in which A-type and B-type are mixed.
また、ピークＤはｍ／ｚ＝９８５．２００９であり、ベンジルチオエーテル付加物を除くとＣ４５Ｈ３６Ｏ１８となり、この化合物はＡ−Ｂ−タイプ混在型の３量体ベンジルチオエーテルであることが推測できた。 The peak D was m / z = 985.2009, and when the benzylthioether adduct was removed, C45H36O18 was obtained, and this compound was presumed to be an AB-type mixed trimer benzylthioether.
ピークＦはｍ／ｚ＝６０５．１４４９を検出し、ＭＳ／ＭＳでｍ／ｚ＝４８１．１１０９を検出したことから、このピークはベンジルチオエーテル付加物と考えられたが、付加物を除くとＣ２５Ｈ２４Ｏ１０となりそれ以上の情報は得られなかったため、表２ではＵｎｋｎｏｗｎと表示している。 Peak F detected m / z = 6055.1449, and m / z = 481.1109 was detected by MS / MS, so this peak was considered to be a benzylthioether adduct, but when the adduct was removed, C25H24O10 Since no further information was obtained, “Unknown” is displayed in Table 2.
上記より調製したＰＡＣをチオール開裂した結果、その分解物にフラバン−３−オールモノマーとフラバン−３−オールモノマーのベンジルチオエーテル付加物以外に遊離の３量体とＡ−タイプ２量体と３量体ベンジルチオエーテル付加物が検出され、その組成比が比較的多いことから、ｍＤＰの計算方法を改めた。 As a result of thiol cleavage of the PAC prepared from the above, as a result of decomposition of the PAC, a free trimer, an A-type dimer and a trimer other than a flavan-3-ol monomer and a benzylthioether adduct of a flavan-3-ol monomer Since the benzylthioether adduct was detected and its composition ratio was relatively high, the calculation method of mDP was revised.
すなわち、検出されたフラバン−３−オールの重合度をｎとすると（ベンジルチオエーテル付加物も含めて）ｍＤＰは、以下の式により求める値とした。
ｍＤＰ＝［（ベンジルチオエーテル付加物×ｎ）の総和＋（遊離フラバン−３−オール×ｎ）の総和］／［遊離フラバン−３−オールの総和］
That is, assuming that the degree of polymerization of the detected flavan-3-ol is n (including the benzylthioether adduct), mDP was determined by the following equation.
mDP = [sum of (benzylthioether adduct × n) + sum of (free flavan-3-ols × n)] / [sum of free flavan-3-ols]
加えて、検出されたフラバン−３−オールとそのベンジルチオエーテル付加物の面積比は、既知のプロシアニジンＢ２標品のチオール開裂反応物から算出し、それぞれ補正を行った。その結果、表２に示すとおり、ブルーベリー葉から調製したＰＡＣのｍＤＰは１１．２であった。加えて、その組成は全体的にエピカテキンの比率が高く、ターミナルユニットでは４２．６％、エクステンションユニットでは６９．６％であったが、検出されたＡ−タイプ２量体やＡ−Ｂ−タイプ混在３量体の組成が不明なので、検出されたモノマーのみで全体の組成を見ると、９５％以上がエピカテキンで構成されていることが分かった。 In addition, the area ratio of the detected flavan-3-ol and its benzylthioether adduct was calculated from a thiol cleavage reaction product of a known procyanidin B2 preparation, and each was corrected. As a result, as shown in Table 2, the mDP of PAC prepared from blueberry leaves was 11.2. In addition, the composition was generally high in epicatechin ratio, 42.6% for the terminal unit and 69.6% for the extension unit, but the detected A-type dimer and AB- Since the composition of the type-mixed trimer is unknown, it was found that 95% or more was composed of epicatechin when the entire composition was viewed with only the detected monomer.
本発明に用いたＰＡＣの平均重合度（ｍＤＰ）と組成を表２、３に示す。 Tables 2 and 3 show the average degree of polymerization (mDP) and composition of the PAC used in the present invention.
表２の結果から、各起源のＰＡＣ調製物は以下のように特徴づけられた。
（１）ブルーベリー葉由来のＰＡＣは平均重合度が１１．２であり、エピカテキン組成比が高く、すべてプロシアニジンで構成されていた。加えて、Ａタイプの結合を有しており、さらに未同定な側鎖も確認できた。
（２）ブドウ種子由来のものは平均重合度が１４．４とブルーベリーより長く、ターミナルユニットはカテキンの組成比が高く、エクステンションはエピカテキンとエピカテキンガレートがおよそ１：１であった。Ａタイプの結合様式やガレート以外の側鎖は確認されなかった。
（３）クロトン種樹液由来のものは平均重合度が８．３で、ガロカテキンとエピガロカテキンを確認した。そのプロデルフィニジン含量は約４０％であった。
From the results in Table 2, the PAC preparations of each origin were characterized as follows:
(1) Blueberry leaf-derived PAC had an average degree of polymerization of 11.2, a high epicatechin composition ratio, and was composed entirely of procyanidins. In addition, it has an A type bond, and unidentified side chains were also confirmed.
(2) The grape seed-derived one had an average degree of polymerization of 14.4, which was longer than that of blueberries, the terminal unit had a higher catechin composition ratio, and the extension was about 1: 1 for epicatechin and epicatechin gallate. Side chains other than A-type binding mode and gallate were not confirmed.
(3) Those derived from croton seed sap had an average degree of polymerization of 8.3 and confirmed gallocatechin and epigallocatechin. Its prodelphinidin content was about 40%.
４．ＰＡＣ調製物の機能解析
肝星細胞として、ヒト培養肝星細胞継代培養株（ＬＩ９０；財団法人ヒューマンサイエンス振興財団より購入，カタログＮｏ．，ＪＣＲＢ０１６０）を用い、肝線維化抑制機能を評価した。
4). Functional analysis of PAC preparation As a hepatic stellate cell, a human cultured hepatic stellate cell subculture strain (LI90; purchased from Human Science Foundation, Catalog No., JCRB0160) was used to evaluate the liver fibrosis suppression function.
被検試料としては、調製例１の方法で精製したＢＢ−ＰＡＣ、調製例２の方法で精製したＧＳ−ＰＡＣ、及び調製例３の方法で精製したＣＬ−ＰＡＣを用いた。ＰＡＣあるいはＥＧＣＧ［（-）−エピガロカテキン−Ｏ−ガレート；クリタ高純度試薬、クリタ分析センター（株）、Ｌｏｔ Ｎｏ．０４８３１１］、カテキン［（±）−カテキン；クリタ高純度試薬、クリタ分析センター（株）、Ｌｏｔ Ｎｏ．Ｃ０１２００２Ｊ１５］、エピカテキン（ＳＩＧＭＡ、Ｅ１７５３−１Ｇ、Ｌｏｔ Ｎｏ．０２６Ｋ２６１１）及びプロシアニジンＢ２（Ｂｉｏ Ｃｈｅｍｉｋａ、４２１５７、１ｍｇ）は、いずれも最終濃度が０．１から１０μｇ／ｍｌになるように、無血清ＤＭＥＭ培地で希釈し添加した。上記試薬の溶媒であるＤＭＳＯの最終濃度は、全群で０．１％に統一した。１時間の前培養の後、ＰＤＧＦ−ＢＢ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ、Ｎｏ．２２０−ＢＢ）を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌになるようにＬＩ９０に添加し、さらに培養した。培養終了後、ＬＩ９０の増殖をＭＴＴ法にて、ＤＮＡ合成量をＢｒｄＵ ｌａｂｅｌｉｎｇ＆ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏ．，ＵＳＡ）を用いて評価した。また、アポトーシスにより生じるＤＮＡ断片化の相対量は、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏ．，ＵＳＡ）により測定した。ＥＲＫ（ｐ４２とｐ４４）及びＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）のリン酸化は、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法により検出し、得られたバンドの濃さを定量し、数値化した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法に用いた抗体は、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｄ１３．１４．４Ｅ）ウサギモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、＃９９１０）、ｐ４４／４２（Ｅｒｋ１／２）（１３７Ｆ５）ウサギモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、＃９９２６）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（Ｄ９Ｅ）ウサギモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、＃９９１６）及びＡｋｔ（ｐａｎ）（Ｃ６７Ｅ７）ウサギモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、＃９９１６）である。 As test samples, BB-PAC purified by the method of Preparation Example 1, GS-PAC purified by the method of Preparation Example 2, and CL-PAC purified by the method of Preparation Example 3 were used. PAC or EGCG [(−)-epigallocatechin-O-gallate; Kurita High Purity Reagent, Kurita Analysis Center Co., Ltd., Lot No. 038311], catechin [(±) -catechin; Kurita high purity reagent, Kurita Analysis Center Co., Ltd., Lot No. C012002J15], epicatechin (SIGMA, E1753-1G, Lot No. 026K2611) and procyanidin B2 (Bio Chemika, 42157, 1 mg) are all serum-free DMEM so that the final concentration is 0.1 to 10 μg / ml. Diluted with medium and added. The final concentration of DMSO, which is the solvent for the reagent, was unified to 0.1% for all groups. After 1 hour of pre-culture, PDGF-BB (recombinant human plate growth factor, R & D SYSTEMS, No. 220-BB) was added to LI90 to a final concentration of 10 ng / ml and further cultured. After completion of the culture, the growth of LI90 was evaluated by MTT method and the amount of DNA synthesis was evaluated using BrdU labeling & detection kit (Roche Diagnostics Co., USA). Moreover, the relative amount of DNA fragmentation caused by apoptosis was measured by Cell Death Detection ELISA PLUS (Roche Diagnostics Co., USA). The phosphorylation of ERK (p42 and p44) and Akt (Ser473) was detected by Western blot method, and the intensity of the obtained band was quantified and digitized. The antibodies used in the Western blot method were Phospho-p44 / 42 MAPK (Erk1 / 2) (Thr202 / Tyr204) (D13.14.4E) rabbit monoclonal antibody (Cell Signaling TECHNOLOGY, # 9910), p44 / 42 (Erk1 / 2) (137F5) rabbit monoclonal antibody (Cell Signaling TECHNOLOGY, # 9926), Phospho-Akt (Ser473) (D9E) rabbit monoclonal antibody (Cell Signaling TECHNOLOGY, # 9916) and Akt (pan) (C67E7) rabbit monoclonal antibody (Cell) Signaling TECHNOLOGY, # 9916).
各実験結果における統計学的な有意差の検定は、多重比較検定（Ｔｕｋｅｙ法及びＤｕｎｎｅｔ法）によった。 The test of statistical significance in each experimental result was based on a multiple comparison test (Tukey method and Dunnet method).
図５は、ＢＢ−ＰＡＣによるＬＩ９０細胞数の増殖抑制効果を示す。同図に示すように、ＢＢ−ＰＡＣは、１〜１０μｇ／ｍｌの濃度範囲で、ＬＩ９０細胞数の増殖を抑制するとともに、ＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞数の増加も抑制した。 FIG. 5 shows the growth inhibitory effect on the number of LI90 cells by BB-PAC. As shown in the figure, BB-PAC suppressed the proliferation of the number of LI90 cells and the increase in the number of LI90 cells treated with PDGF-BB in the concentration range of 1 to 10 μg / ml.
図６は、ＢＢ−ＰＡＣによるＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成活性化抑制効果を示す。同図に示すように、ＢＢ−ＰＡＣは、１μｇ／ｍｌにおいてＤＮＡ合成量の増加をほぼコントロールレベルまで抑制した。 FIG. 6 shows the DNA synthesis activation inhibitory effect of LI90 cells treated with PDGF-BB by BB-PAC. As shown in the figure, BB-PAC suppressed the increase in the amount of DNA synthesis to almost the control level at 1 μg / ml.
図７は、ＢＢ−ＰＡＣによるＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞のＥＲＫ及びＡｋｔリン酸化抑制効果を示す。同図に示すように、ＢＢ−ＰＡＣは、１μｇ／ｍｌにおいてＰＤＧＦ−ＢＢ処理によるＥＲＫのリン酸化を完全に抑制した。またＰＤＧＦ−ＢＢ処理によるＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）のリン酸化を部分的に抑制した。 FIG. 7 shows the ERK and Akt phosphorylation inhibitory effect of LI90 cells treated with PDGF-BB by BB-PAC. As shown in the figure, BB-PAC completely suppressed ERK phosphorylation by PDGF-BB treatment at 1 μg / ml. In addition, phosphorylation of Akt (Ser473) by PDGF-BB treatment was partially suppressed.
図８は、ＢＢ−ＰＡＣ以外のＰＡＣによるＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成活性化抑制効果を示す。同図に示すように、ブドウ種子由来のＧＳ−ＰＡＣ及びクロトン種樹液由来ＣＬ−ＰＡＣは、ＧＳ−ＰＡＣと同一の濃度で、ＢＢ−ＰＡＣ同様にＰＤＧＦ−ＢＢによるＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成量の増加を強く抑制した。 FIG. 8 shows the effect of inhibiting DNA synthesis activation of LI90 cells treated with PDGF-BB by PAC other than BB-PAC. As shown in the figure, grape seed-derived GS-PAC and croton seed sap-derived CL-PAC have the same concentration as GS-PAC and, like BB-PAC, increased the amount of LI90 cell DNA synthesis by PDGF-BB. Was strongly suppressed.
図９は、ＰＡＣの重合度によるＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成活性化抑制効果を示す。同図に示すように、ＰＡＣ単量体からなるカテキン、エピカテキン及びＥＧＣＧ、及びエピカテキン二量体からなるプロシアニジンＢ２は、ポジティーブコントロールのＢＢ−ＰＡＣ（平均重合度１１．２）と同一濃度範囲（３及び１０μｇ／ｍｌ）では、ＢＢ−ＰＡＣ及びＥＧＣＧ（コントロール）に匹敵するようなＤＮＡ合成量増加抑制効果は認められなかった。 FIG. 9 shows the DNA synthesis activation inhibitory effect of LI90 cells treated with PDGF-BB depending on the degree of polymerization of PAC. As shown in the figure, catechin composed of PAC monomer, epicatechin and EGCG, and procyanidin B2 composed of epicatechin dimer have the same concentration as BB-PAC (average degree of polymerization 11.2) of positive control. In the range (3 and 10 μg / ml), an inhibitory effect on the increase in the amount of DNA synthesis comparable to BB-PAC and EGCG (control) was not observed.
図１０は、ＢＢ−ＰＡＣによるＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞の増殖抑制及びアポトーシス誘導効果を示す。同図に示すように、ＢＢ−ＰＡＣは、３−１０μｇ／ｍｌの濃度範囲で、濃度依存的にＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞の増殖を抑制するとともに、ＤＮＡの断片化を有意に促進した。後者は、ＢＢ−ＰＡＣがＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞のアポトーシスを誘導する活性があることを示唆している。 FIG. 10 shows the growth-suppressing and apoptosis-inducing effects of LI90 cells treated with PDGF-BB by BB-PAC. As shown in the figure, BB-PAC suppressed the proliferation of LI90 cells treated with PDGF-BB in a concentration-dependent manner in the concentration range of 3-10 μg / ml and significantly promoted DNA fragmentation. The latter suggests that BB-PAC is active in inducing apoptosis of PDGF-BB treated LI90 cells.
これらのことから、結論として次のことが言える。
（１）ブルーベリー葉由来ＢＢ−ＰＡＣは、ＬＩ９０細胞の増殖、及びＰＤＧＦ−ＢＢ処理によるＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成活性化をＥＧＣＧ同様に強く抑制する。
（２）ブドウ種子由来のＧＬ−ＰＡＣ及びクロトン樹液由来のＣＬ−ＰＡＣにもブルーベリー葉由来のＢＢ−ＰＡＣと同等の抑制効果が認められる。
（３）カテキン、エピカテキン及びプロシアニジンＢ２のような単量体や二量体には、同様の抑制効果が殆ど認められない。
（４）ブルーベリー葉由来のＢＢ−ＰＡＣは、ＰＤＧＦ−ＢＢ処理によるＥＲＫ及びＡｋｔのリン酸化を抑制する。
（５）ＢＢ−ＰＡＣは、ＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞のアポトーシスを誘導する。
From these, the following can be concluded as a conclusion.
(1) Blueberry leaf-derived BB-PAC strongly suppresses the proliferation of LI90 cells and the DNA synthesis activation of LI90 cells by PDGF-BB treatment, similar to EGCG.
(2) Grape seed-derived GL-PAC and croton sap-derived CL-PAC have the same inhibitory effect as blueberry leaf-derived BB-PAC.
(3) Monomers and dimers such as catechin, epicatechin and procyanidin B2 have almost no similar inhibitory effect.
(4) Blueberry leaf-derived BB-PAC suppresses phosphorylation of ERK and Akt by PDGF-BB treatment.
(5) BB-PAC induces apoptosis of PDGF-BB treated LI90 cells.
ＰＡＣ組成物を有効成分とする、肝線維化の抑制剤、肝星細胞増殖抑制、肝星細胞ＤＮＡ合成活性化抑制剤、肝星細胞アポトーシス誘導剤、また肝線維化を病因とする肝疾患、例えば肝硬変や肝癌の発症もしくは進展抑制剤は、肝疾患の予防又は治療に優れた効果を示す。加えて、長期間にわたり服用できるところから、これらの改善のための機能性補助飲食物としても利用可能である。 An inhibitor of liver fibrosis, an inhibitor of hepatic stellate cell proliferation, an inhibitor of hepatic stellate cell DNA synthesis activation, an hepatic stellate cell apoptosis inducer, or a liver disease caused by liver fibrosis, comprising a PAC composition as an active ingredient, For example, an inhibitor of the onset or progression of cirrhosis or liver cancer has an excellent effect in preventing or treating liver disease. In addition, since it can be taken over a long period of time, it can also be used as a functional auxiliary food for these improvements.
Claims (12)
前記プロアントシアニジンは、下記一般式（１）
［式（１）中、Ｒ １ 及びＲ ３ はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基、Ｒ ２ は水酸基、Ｒ ４ は水素原子又はガレート基を、それぞれ示す。］
で表されるフラバン−３−オール骨格が、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式で３以上互いに結合した構造を有する、肝線維化抑制剤。
（ｉ）４位炭素及び８位炭素の結合
（ｉｉ）４位炭素及び６位炭素の結合
（ｉｉｉ）４位炭素及び８位炭素の結合並びに２位炭素及び７位酸素の結合 A liver fibrosis inhibitor comprising a composition comprising one or more proanthocyanidins as an active ingredient ,
The proanthocyanidins have the following general formula (1)
[In Formula (1), R 1 and R 3 each independently represent a hydrogen atom or a hydroxyl group, R 2 represents a hydroxyl group, and R 4 represents a hydrogen atom or a gallate group. ]
A hepatic fibrosis inhibitor having a structure in which three or more of the flavan-3-ol skeletons represented by (i), (ii), or (iii) are bonded to each other.
(I) Bond at the 4-position carbon and the 8-position carbon
(Ii) 4-position carbon and 6-position carbon bond
(Iii) 4-position and 8-position carbon bonds and 2-position and 7-position oxygen bonds
前記プロアントシアニジンは、下記一般式（１）
［式（１）中、Ｒ １ 及びＲ ３ はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基、Ｒ ２ は水酸基、Ｒ ４ は水素原子又はガレート基を、それぞれ示す。］
で表されるフラバン−３−オール骨格が、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式で３以上互いに結合した構造を有する、肝星細胞増殖抑制剤。
（ｉ）４位炭素及び８位炭素の結合
（ｉｉ）４位炭素及び６位炭素の結合
（ｉｉｉ）４位炭素及び８位炭素の結合並びに２位炭素及び７位酸素の結合 A hepatic stellate cell growth inhibitor comprising a composition comprising one or more proanthocyanidins as an active ingredient ,
The proanthocyanidins have the following general formula (1)
[In Formula (1), R 1 and R 3 each independently represent a hydrogen atom or a hydroxyl group, R 2 represents a hydroxyl group, and R 4 represents a hydrogen atom or a gallate group. ]
A hepatic stellate cell growth inhibitor having a structure in which three or more of the flavan-3-ol skeletons represented by the formula (i), (ii) or (iii) are bonded to each other .
(I) Bond at the 4-position carbon and the 8-position carbon
(Ii) 4-position carbon and 6-position carbon bond
(Iii) 4-position and 8-position carbon bonds and 2-position and 7-position oxygen bonds
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