JP4821400B2

JP4821400B2 - Structural analysis system

Info

Publication number: JP4821400B2
Application number: JP2006087008A
Authority: JP
Inventors: 茂樹梶原; 慎一岩本; 禎規関谷
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2006-03-28
Filing date: 2006-03-28
Publication date: 2011-11-24
Anticipated expiration: 2026-03-28
Also published as: JP2007263641A

Description

本発明は、質量分析を利用して各種試料の構造を解析するシステムに関し、具体的には、例えばペプチド混合物を含む試料を質量分析し、得られたデータを基に各ペプチドのアミノ酸配列を決定するのに好適な構造解析システムに関する。 The present invention relates to a system for analyzing the structure of various samples using mass spectrometry. Specifically, for example, mass analysis is performed on a sample containing a peptide mixture, and the amino acid sequence of each peptide is determined based on the obtained data. The present invention relates to a structural analysis system suitable for this.

近年、ポストゲノム研究としてタンパク質の構造や機能の解析が急速に進められている。このようなタンパク質の構造・機能解析手法の一つとして、質量分析装置を用いたタンパク質の発現解析や一次構造解析が広く行われるようになってきており、四重極型イオントラップ（Quadrupole Ion Trap：ＱＩＴ）や衝突誘起分解（Collision Induced Dissociation：ＣＩＤ）などによって特定のピークに対応するイオンの捕捉と開裂を行う、いわゆるＭＳ／ＭＳ分析（又はＭＳ^ｎ分析）が威力を発揮している。一般にＭＳ／ＭＳ分析では、まず、分析対象物から特定の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するイオンをプリカーサイオンとして選別し、該プリカーサイオンをＣＩＤによって開裂させる。その後、開裂によって生成したイオン（プロダクトイオン）を質量分析することによって、目的とするイオンの質量や化学構造についての情報を取得することができる。
In recent years, protein structures and functions have been rapidly analyzed as post-genomic research. As one of such protein structure and function analysis methods, protein expression analysis and primary structure analysis using mass spectrometers have been widely performed. Quadrupole ion traps (Quadrupole Ion Trap) : QIT), collision induced decomposition (Collision Induced Dissociation: CID), etc., so-called MS / MS analysis (or MS ⁿ analysis), which captures and cleaves ions corresponding to a specific peak, demonstrates its power. In general, MS / MS analysis, first, the specific mass to charge ratio from the analyte ions having (m / z) were selected as the precursor ion cleaves the precursor ions by CID. Thereafter, mass analysis of ions (product ions) generated by cleavage can obtain information on the mass and chemical structure of the target ions.

上記のようなＭＳ／ＭＳ（又はＭＳ^ｎ）分析を利用してタンパク質のアミノ酸配列の同定を行う場合には、まず、タンパク質を適当な酵素で消化してペプチド断片の混合物としてから、該ペプチド混合物を質量分析（ＭＳ分析）に供する。このとき、各ペプチドを構成する、炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）等の元素には質量の異なる安定同位体が存在するため、同一のアミノ酸配列から成るペプチドであっても、その同位体組成の違いによって質量電荷比の異なる複数のピークがマススペクトル上に出現する。該複数のピークは、天然存在比が最大の同位体のみで構成されたイオン（主イオン又はモノアイソトピックイオンという）のピークと、それ以外の同位体を含むイオン（同位体イオン）のピークとから成り、これらは１[Ｄａ]間隔で並んだ複数本のピークから成るピーク群を形成する。本発明ではこれを同位体ピーク群と呼ぶ。マススペクトル上での同位体ピーク群の一例を図７に示す。
When the amino acid sequence of a protein is identified using MS / MS (or MS ⁿ ) analysis as described above, the protein is first digested with an appropriate enzyme to form a mixture of peptide fragments, and then the peptide mixture. Is subjected to mass spectrometry (MS analysis). At this time, since stable isotopes having different masses exist in elements such as carbon (C) and nitrogen (N) constituting each peptide, even if the peptides are composed of the same amino acid sequence, the isotope composition a plurality of peaks of different mass to charge ratios appearing on the mass spectrum by difference. The plurality of peaks include a peak of an ion composed of only an isotope having a maximum natural abundance ratio (referred to as a main ion or a monoisotopic ion), and a peak of an ion including other isotopes (isotope ions) These form a peak group consisting of a plurality of peaks arranged at intervals of 1 [Da]. In the present invention, this is called an isotope peak group. An example of an isotope peak group on the mass spectrum is shown in FIG.

続いて、上記のようなペプチド混合物の質量分析データ（ＭＳマススペクトルデータ）の中から、単一のペプチドに由来する一組の同位体ピーク群をプリカーサイオンとして選択し、該プリカーサイオンを開裂させることで得られたイオン（プロダクトイオン）を質量分析（ＭＳ／ＭＳ分析）する。 Subsequently, a set of isotope peaks derived from a single peptide is selected as a precursor ion from the mass spectrometry data (MS mass spectrum data) of the peptide mixture as described above, and the precursor ion is cleaved. The ions (product ions) thus obtained are subjected to mass spectrometry (MS / MS analysis).

このようにして得られたＭＳ／ＭＳ分析によるマススペクトルパターンや、上記ＭＳ分析によるマススペクトルパターンをデータベース検索に供することによって、被検ペプチドのアミノ酸配列を同定することができる。また、これらのマススペクトルパターンをデノボ（De Novo)シーケンスと呼ばれるコンピュータソフトウェアを用いて数理的に解析することで、各ペプチドのアミノ酸配列を推定することもできる。 The amino acid sequence of the test peptide can be identified by subjecting the thus obtained mass spectrum pattern by MS / MS analysis or the mass spectrum pattern by MS analysis to a database search. Moreover, the amino acid sequence of each peptide can also be estimated by mathematically analyzing these mass spectrum patterns using computer software called a De Novo sequence.

従来、上記のような手法によるアミノ酸配列の同定を行う際に、ＭＳ分析によるマススペクトル上で異なるペプチドに由来する同位体ピーク群が近接していた場合には、所望のペプチド由来のピークに対応するイオンと共に該ピークに近接した他のペプチド由来のピークに対応したイオンがプリカーサイオンとして選択されてしまい、正確な同定を行うことができなかった。これに対し、近年の高質量分離能イオントラップ技術の発展に伴い、１[Ｄａ]間隔で現れる同位体ピーク群の中から単一のピークに対応するイオンを選択してプリカーサイオンとすることが可能となったため、異なるペプチド由来の同位体ピーク群の一部が重なり合っているような場合であっても、その中から各ペプチドに由来するピークに対応するイオンを個別に選択してＭＳ／ＭＳ分析を行うことで、各ペプチドの分離・同定を的確に行うことができるようになった（例えば非特許文献１参照）。 Conventionally, when identifying amino acid sequences by the above-mentioned methods, if isotopic peak groups derived from different peptides are close to each other on the mass spectrum by MS analysis, it corresponds to the peak derived from the desired peptide As a result, ions corresponding to peaks derived from other peptides close to the peak were selected as precursor ions, and accurate identification could not be performed. On the other hand, with the recent development of high-mass resolution ion trap technology, ions corresponding to a single peak can be selected as a precursor ion from a group of isotope peaks appearing at intervals of 1 [Da]. Since it became possible, even when a part of isotopic peak groups derived from different peptides overlap each other, ions corresponding to the peaks derived from each peptide are individually selected from among them, and MS / MS By performing the analysis, it has become possible to accurately separate and identify each peptide (see, for example, Non-Patent Document 1).

しかしながら、異なるペプチド由来の同位体ピーク群の重なりが大きい場合には、上述のように同位体ピーク群の中から単一ピークを選択してそれに対応するイオンのＭＳ／ＭＳ分析を行っても、もともとその単一ピーク自体が複数種類のペプチドに由来するイオンが混在した状態から得られたものであるため、ＭＳ／ＭＳマススペクトルの解釈が複雑になり、正確なアミノ酸配列の同定を行うことができないという問題があった。 However, when there is a large overlap of isotope peak groups derived from different peptides, even if a single peak is selected from the isotope peak group and the corresponding ions are subjected to MS / MS analysis as described above, Since the single peak itself was originally obtained from a mixture of ions derived from multiple types of peptides, interpretation of the MS / MS mass spectrum was complicated, and accurate amino acid sequence identification was possible. There was a problem that I could not.

こうした問題を解決するために、本願発明者は非特許文献２において、ＭＳ／ＭＳ分析により得られたマススペクトル上の同位体ピーク群を、各同位体ピーク群を構成するピークの数に応じてクラス分けし、各クラス毎にピークの質量電荷比を集めたピークリストを作成して、このピークリストに基づいてアミノ酸配列の同定を行うという手法を提案している。この手法によれば、従来よりも個々のペプチドの同定精度の向上が期待できる。
In order to solve these problems, the inventor of the present application described in Non-Patent Document 2 the isotope peak groups on the mass spectrum obtained by MS / MS analysis according to the number of peaks constituting each isotope peak group. A method has been proposed in which a class list is created, a peak list in which mass-to- charge ratios of peaks are collected for each class, and amino acid sequences are identified based on the peak list. According to this method, it is possible to expect improvement in identification accuracy of individual peptides as compared with the conventional technique.

しかしながら、こうした方法によっても次のような問題がある。即ち、或る１組の同位体ピーク群を構成する複数個のピークにおいては、選択したプリカーサイオンに含まれる同位体の個数が多くＭＳ／ＭＳピーク群の質量電荷比が大きくなるほど、高質量電荷比のイオンに対応するピークに比べて低質量電荷比のイオンに対応するピークの強度が相対的に小さくなる傾向にある。そのため、相対的に低い質量電荷比のピークの強度が小さ過ぎ、測定ノイズに埋もれてしまって明確にピークとして検出することが困難になる場合がある。こうした場合、同位体ピーク群を構成するピーク本数を正確に把握できず、誤ったクラス分けを行うおそれがある。
However, even this method has the following problems. That is, in the plurality of peaks composing a set of isotopic peak group one, the larger the mass to charge ratio of number number number MS / MS peaks of isotopes contained in the selected precursor ions, high mass the intensity of the peak corresponding to the low mass to charge ratio ions as compared with the peak corresponding to the charge ratio ions in a relatively small tendency. For this reason, the intensity of the peak having a relatively low mass-to- charge ratio is too small, and it may be buried in measurement noise, making it difficult to clearly detect the peak. In such a case, the number of peaks constituting the isotope peak group cannot be accurately grasped, and there is a risk of incorrect classification.

いま一例として、図８に、ＭＳ分析で得られた質量電荷比１０４６から始まるピーク群或いはその一部をプリカーサイオンとして選択してＭＳ／ＭＳ分析した結果の一部、具体的には質量電荷比９３２近傍のマススペクトルの拡大図を示す。この図８において（ａ）〜（ｄ）は、質量電荷比１０４６〜１０４８のピーク群（all）、質量電荷比１０４６のピーク１本のみ、質量電荷比１０４７のピーク１本のみ、質量電荷比１０４８のピーク１本のみ、に対応するイオンをそれぞれプリカーサイオンとして選択してＭＳ／ＭＳ分析を実行して得たスペクトルを示している。このとき、ＭＳ／ＭＳマススペクトルに出現するピークの本数は、実際にはプリカーサイオンに含まれる同位体の数に応じて（ｂ）では１本、（ｃ）では２本、（ｄ）では３本となっている筈である。しかしながら、（ｄ）において、質量電荷比１０４８のピークに対応するイオンをプリカーサイオンとして選択して実行されたＭＳ／ＭＳ分析によるマススペクトルの同位体ピーク群では、質量電荷比が最も小さな（ｍ／ｚ＝９３２）ピークの強度が殆ど測定ノイズと同程度のレベルしかなく、実質的にこれをピークとして検出することは困難である。その結果、例えばこの結果を見ても、ピーク数が２であるか３であるかを明確に区別するのは困難である。
As an example, FIG. 8 shows a part of the results of MS / MS analysis by selecting a peak group starting from the mass-to- charge ratio 1046 obtained by MS analysis or a part thereof as a precursor ion, specifically, the mass-to- charge ratio. An enlarged view of the mass spectrum near 932 is shown. In this FIG. 8 (a) ~ (d) are peaks of mass-to-charge ratio from 1046 to 1048 (all), one peak of mass to charge ratio 1046 only, one peak of mass to charge ratio 1047 only, mass-1048 A spectrum obtained by performing MS / MS analysis by selecting ions corresponding to only one peak of each as a precursor ion is shown. At this time, the number of peaks appearing in the MS / MS mass spectrum is actually 1 in (b), 2 in (c), and 3 in (d), depending on the number of isotopes contained in the precursor ion. It should be a book. However, in (d), an isotope peak group of mass spectrum by MS / MS analysis performed by selecting an ion corresponding to a peak with a mass to charge ratio of 1048 as a precursor ion has the smallest mass to charge ratio (m / z = 932) The intensity of the peak is almost the same level as the measurement noise, and it is substantially difficult to detect this as a peak. As a result, even if this result is seen, for example, it is difficult to clearly distinguish whether the number of peaks is 2 or 3.

ハイペップ研究所沖縄ラボ設立記念コンファレンス配付資料、2005年2月19日、島津製作所High-Pep Institute Okinawa Lab Establishment Commemorative Conference Handout, February 19, 2005, Shimadzu Corporation 梶原、岩本、「ピーク・クラシフィケイション・イン・ＭＳ／ＭＳ・ユージング・ハイ・プリカーサ・リゾリューション・イオン・トラップ (Peak Classification in MS/MS Using High Precursor Resolution Ion Trap)」、53rd ASMS Conference、WP345 (2005)Sugawara, Iwamoto, “Peak Classification in MS / MS Using High Precursor Resolution Ion Trap”, 53rd ASMS Conference , WP345 (2005)

即ち、上記のような従来の方法では、ＭＳ／ＭＳマススペクトル上に現れる各同位体ピーク群を、その同位体ピーク群を構成する複数のピークの本数に応じてクラス分けしようとしても、そのピーク自体の正確な把握が困難であるためにクラス分けの精度を保つのが難しく、その結果、アミノ酸配列の同定の精度が低下するおそれがある。 That is, in the conventional method as described above, even if each isotope peak group appearing on the MS / MS mass spectrum is classified according to the number of peaks constituting the isotope peak group, Since it is difficult to accurately grasp itself, it is difficult to maintain the accuracy of classification, and as a result, the accuracy of identification of amino acid sequences may be reduced.

本発明はこうした課題を解決するために成されたものであり、例えば複数のペプチドに由来する同位体ピーク群が重なり合っている場合であって、しかも、その同位体ピーク群の中の或る同位体ピーク群又はその一部をプリカーサイオンとして選択してＭＳ／ＭＳ分析を行った際に現れるピークの強度が小さいような場合であっても、各ペプチドのアミノ酸配列を高い精度で同定することのできる構造解析システムを提供することである。 The present invention has been made to solve these problems. For example, the isotope peak groups derived from a plurality of peptides are overlapped, and a certain isotope in the isotope peak group is present. Even when the intensity of the peak that appears when MS / MS analysis is performed by selecting a body peak group or a part thereof as a precursor ion, the amino acid sequence of each peptide can be identified with high accuracy. It is to provide a structural analysis system that can.

上記課題を解決するために成された本発明に係る構造解析システムは、質量分析を用いて試料のアミノ酸配列又は塩基配列を同定するための構造解析システムであって、
質量分析を用いて試料のアミノ酸配列又は塩基配列を同定するための構造解析システムであって、
a)試料のＭＳ分析を実行してＭＳマススペクトルを取得するとともに、該ＭＳマススペクトルに現れる同位体ピーク群の中から、一部のピークを選択して該ピークに対応したイオンをプリカーサイオンとしてＭＳ／ＭＳ分析を実行してＭＳ／ＭＳマススペクトルを取得する質量分析手段と、
b)前記質量分析手段により得られたＭＳ／ＭＳマススペクトルに現れる同位体ピーク群を、各同位体ピーク群に含まれる複数のピークの強度比に基づいてその元となったプリカーサイオンに含まれる主同位体以外の同位体の個数を推定することにより、該個数に１対１で対応した複数のクラスにクラス分けし、該クラス毎に同位体ピーク群内のモノアイソトピックピークを決定し、少なくともそのモノアイソトピックピークの質量電荷比を挙げたピークリストを作成するピークリスト作成手段と、
c)前記ピークリスト作成手段によって作成されたピークリストを基に試料のアミノ酸配列又は塩基配列を同定する配列同定手段と、
を備えることを特徴としている。
The structural analysis system according to the present invention, which has been made to solve the above problems, is a structural analysis system for identifying the amino acid sequence or base sequence of a sample using mass spectrometry,
A structural analysis system for identifying the amino acid sequence or base sequence of a sample using mass spectrometry,
a) MS analysis of the sample is performed to obtain an MS mass spectrum, and a part of the isotope peaks appearing in the MS mass spectrum is selected, and ions corresponding to the peaks are used as precursor ions. Mass spectrometry means for performing MS / MS analysis to obtain an MS / MS mass spectrum;
b) The isotope peak group appearing in the MS / MS mass spectrum obtained by the mass spectrometric means is included in the precursor ion that is based on the intensity ratio of a plurality of peaks included in each isotope peak group. By estimating the number of isotopes other than the main isotope, it is classified into a plurality of classes corresponding to the number one-to-one , and monoisotopic peaks within the isotope peak group are determined for each class , A peak list creating means for creating a peak list that lists at least the mass-to-charge ratio of the monoisotopic peak ;
c) sequence identification means for identifying the amino acid sequence or base sequence of the sample based on the peak list created by the peak list creation means;
It is characterized by having.

本発明において「試料」は生体に由来する生体試料や人工的に合成された試料など各種のものとすることができるが、典型的な一例として、試料はペプチド混合物であって、本発明は該ペプチド混合物のアミノ酸配列を同定するための構造解析システムとすることができる。 In the present invention, the “sample” can be various samples such as a biological sample derived from a living body or an artificially synthesized sample. As a typical example, the sample is a peptide mixture, It can be set as the structure analysis system for identifying the amino acid sequence of a peptide mixture.

また本発明において「ＭＳ／ＭＳ分析」とは、所定のプリカーサイオンを開裂させ、得られたイオン（プロダクトイオン）を質量電荷比に基づいて分離・検出することを指し、１回の開裂を行うＭＳ／ＭＳ分析のみならず、目的分子を複数回開裂させる、いわゆるＭＳ^ｎ分析をも含むものとする。
In the present invention, “MS / MS analysis” means that a predetermined precursor ion is cleaved, and the obtained ion (product ion) is separated and detected based on a mass-to- charge ratio. It includes not only MS / MS analysis but also so-called MS ⁿ analysis in which the target molecule is cleaved multiple times.

また、上記質量分析手段における「一部のピーク」としては、複数本のピークを選択するようにしてもよいが、データの解析を容易にするため、同位体ピーク群の中から単一のピークを選択してＭＳ／ＭＳ分析を行うようにすることが望ましい。さらにまた、好ましくは、該単一のピークとしてＭＳ分析で得られた同位体ピーク群の中でイオン強度が最大のものを選択するようにするとよい。 In addition, as the “partial peak” in the mass spectrometry means, a plurality of peaks may be selected. However, in order to facilitate data analysis, a single peak is selected from the group of isotope peaks. It is desirable to select to perform MS / MS analysis. Furthermore, it is preferable to select the single peak having the maximum ionic strength from the group of isotope peaks obtained by MS analysis.

また「質量分析手段」はとくにその形態や方式を問わないが、典型的な一例として、三次元四重極イオントラップを備えた質量分析装置であって、該イオントラップの内部でプリカーサイオンの開裂を行うものとすることができる。特に単一ピークを選択してＭＳ／ＭＳ分析を実行するためには、高い分離能でプリカーサイオンを選択してＭＳ／ＭＳ分析（又はＭＳ^ｎ分析）を行うことが可能な質量分析装置である必要があるが、三次元四重極イオントラップと飛行時間型質量分離部とを組み合わせたＩＴ−ＴＯＦ型の構成はこうした条件に適合する。また、質量分析装置のイオン源はマトリックス支援レーザー脱離イオン化（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization：ＭＡＬＤＩ）法による試料のイオン化を行うものとするとよい。或いは、シリコン上脱離イオン化法（Desorption/Ionization on (porous）Silicon：ＤＩＯＳ）などの公知の表面支援レーザー脱離イオン化法（Surface Assisted Laser Desorption/Ionization：ＳＡＬＤＩ）や、その他の公知のレーザーイオン化法を利用してもよい。 The “mass analysis means” is not particularly limited in its form or method, but a typical example is a mass spectrometer equipped with a three-dimensional quadrupole ion trap, in which precursor ions are cleaved inside the ion trap. Can be performed. In particular, in order to perform MS / MS analysis by selecting a single peak, this is a mass spectrometer capable of performing MS / MS analysis (or MS ⁿ analysis) by selecting a precursor ion with high resolution. Although necessary, an IT-TOF type configuration combining a three-dimensional quadrupole ion trap and a time-of-flight mass separation unit meets these conditions. In addition, the ion source of the mass spectrometer is preferably configured to ionize a sample by a matrix assisted laser desorption / ionization (MALDI) method. Alternatively, known surface-assisted laser desorption / ionization (SALDI) such as desorption / ionization on (porous) silicon (DIOS) or other known laser ionization methods May be used.

また、「配列同定手段」は、ピークリスト作成手段によって作成されたピークリストに基づいて、それらのピークが由来する試料の配列、例えばペプチドのアミノ酸配列を同定するものである。ピークリストからアミノ酸配列を同定する方法としては、例えば、ピークリストをデータベースと照会することでスペクトルパターンの一致する既知ペプチドを検索する方法や、各ピークリストを数理的に解析することで、そのアミノ酸配列を推定する方法など、周知の各種の方法を用いることができる。 The “sequence identification means” is for identifying the sequence of a sample from which these peaks are derived, for example, the amino acid sequence of a peptide, based on the peak list created by the peak list creation means. Examples of methods for identifying an amino acid sequence from a peak list include a method of searching a known peptide with a matching spectral pattern by querying the peak list with a database, and a mathematical analysis of each peak list to obtain the amino acid sequence. Various well-known methods such as a method for estimating a sequence can be used.

上記質量分析手段による同位体ピーク群の一部のみをプリカーサイオンとしたＭＳ／ＭＳ分析では、該プリカーサイオンの開裂によって生じたプロダクトイオンの同位体ピーク群を構成するピークの本数は、該プリカーサイオンに含まれていた主同位体以外の同位体の個数の最大値によって制限される。但し、場合によっては同位体ピーク群を構成する一部のピークの強度が非常に小さく、明確にはピークとして認識されにくい場合がある。そこで、本発明に係る構造解析システムにおいて、ピークリスト作成手段は、上記質量分析手段によるＭＳ／ＭＳマススペクトル上に現れる複数組の同位体ピーク群のそれぞれについて、各同位体ピーク群を構成する複数のピークの強度比に基づいてそのＭＳ／ＭＳ分析の元となったプリカーサイオンに含まれる主同位体以外の同位体の個数を推定することでクラス分けする。
In the MS / MS analysis using only a part of the isotope peak group by the mass spectrometry means as a precursor ion, the number of peaks constituting the isotope peak group of the product ion generated by cleavage of the precursor ion is the number of the precursor ion. It is limited by the maximum number of isotopes other than the main isotope contained in. However, in some cases, the intensity of some of the peaks constituting the isotope peak group is very small, and it may not be clearly recognized as a peak. Therefore, in the structural analysis system according to the present invention, the peak list creating means includes a plurality of isotope peak groups that constitute each isotope peak group for each of a plurality of isotope peak groups appearing on the MS / MS mass spectrum by the mass analyzing means. Classification is performed by estimating the number of isotopes other than the main isotope contained in the precursor ion that is the basis of the MS / MS analysis based on the intensity ratio of the peaks.

具体的には、例えば、プリカーサイオンの元素組成を推定した上でその中に所定個数（１個、２個、…）の同位体が含まれると仮定し、その仮定の下でＭＳ／ＭＳ分析で得られる同位体ピーク群に含まれるピークに対応する元素組成を推定し、各ピークの強度比を計算する。即ちこれは上記主同位体以外の同位体の個数の仮定の下での理論的な強度比である。そして、実測のＭＳ／ＭＳマススペクトル上に現れる同位体ピーク群におけるピークの強度比と上記理論的な強度比を比較し、一致しているとみなせる場合には、その同位体ピーク群をその仮定した主同位体以外の同位体の個数のクラスに振り分ける。こうして各同位体ピーク群を各クラスに分類して、各クラス毎にピークの質量電荷比を情報とするピークリストを作成する。
Specifically, for example, it is assumed that a predetermined number (1, 2,...) Of isotopes is included in the elemental composition of the precursor ion and the MS / MS analysis is performed under the assumption. The elemental composition corresponding to the peak included in the isotope peak group obtained in step 1 is estimated, and the intensity ratio of each peak is calculated. That is, this is a theoretical intensity ratio under the assumption of the number of isotopes other than the main isotope . Then, the peak intensity ratio in the isotope peak group appearing on the measured MS / MS mass spectrum is compared with the above theoretical intensity ratio. Assign to the class of the number of isotopes other than the main isotope . In this way, each isotope peak group is classified into each class, and a peak list using the mass-to- charge ratio of the peak as information for each class is created.

同位体ピーク群のクラス分けにピーク強度比を利用しているため、例えば或る同位体ピーク群を構成する複数のピークの中で質量電荷比が最も小さなピークの強度が非常に小さく、明確にピークが存在すると識別しにくいような場合でも、ピーク強度比に基づいてその質量電荷比に対応するピークの強度がもともと小さいことが判明しているので、この同位体ピーク群を正確にクラス分けすることが可能となる。
Since the peak intensity ratio is used to classify the isotope peak group, for example, the intensity of the peak with the smallest mass-to- charge ratio among the plurality of peaks constituting a certain isotope peak group is very small and clearly Even if it is difficult to identify the presence of a peak, it is known that the intensity of the peak corresponding to the mass-to- charge ratio is originally small based on the peak intensity ratio, so this isotope peak group is accurately classified. It becomes possible.

本発明に係る構造解析システムによれば、例えばペプチド混合物をＭＳ分析したＭＳマススペクトルにおいて、異なるペプチドに由来する同位体ピーク群が重なり合っている場合でも、選択したプリカーサイオンに含まれる主同位体以外の同位体の個数に基づいて、ＭＳ／ＭＳマススペクトル上に現れる個々のペプチドに由来する同位体ピーク群を正確に分類することができる。これにより、正確なピークリストをアミノ酸配列や塩基配列の同定のために供することができるので、アミノ酸配列や塩基配列を従来よりも高い精度で同定することができる。
According to the structural analysis system of the present invention, for example, in the MS mass spectrum obtained by MS analysis of a peptide mixture, even when isotope peaks derived from different peptides overlap , other than the main isotope contained in the selected precursor ion Based on the number of isotopes, isotope peaks derived from individual peptides appearing on the MS / MS mass spectrum can be accurately classified. As a result, an accurate peak list can be provided for identification of amino acid sequences and base sequences, so that amino acid sequences and base sequences can be identified with higher accuracy than before.

以下、本発明に係る構造解析システムの一実施例として、ペプチド混合物のアミノ酸配列を同定するためのシステムを例示して説明する。 Hereinafter, a system for identifying the amino acid sequence of a peptide mixture will be described as an example of the structural analysis system according to the present invention.

図１は本実施例に係る構造解析システムの概略構成図である。本実施例の構造解析システムは、大きく分けて質量分析部１０と制御／処理部２０とから成る。質量分析部１０は、ＭＡＬＤＩ法によってペプチド混合物を含む試料をイオン化するイオン化部１１と、所定の質量電荷比を有するイオンをプリカーサイオンとして選択すると共に、該プリカーサイオンを開裂させてプロダクトイオンを生成する三次元四重極型のイオントラップ部１２と、イオンを質量電荷比に基づいて時間方向に分離する飛行時間型の質量分離部１３と、分離されたイオンを順次検出するイオン検出器１４とを備えている。
FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a structural analysis system according to the present embodiment. The structural analysis system of the present embodiment is roughly composed of a mass analysis unit 10 and a control / processing unit 20. The mass analysis unit 10 selects an ion having a predetermined mass-to- charge ratio as a precursor ion and ionizes the sample containing the peptide mixture by MALDI, and cleaves the precursor ion to generate a product ion. A three-dimensional quadrupole ion trap unit 12, a time-of-flight mass separation unit 13 that separates ions in the time direction based on a mass-to- charge ratio , and an ion detector 14 that sequentially detects the separated ions. I have.

制御／処理部２０は、質量分析部１０の各部を制御する制御部２１と、イオン検出器１４により得られる検出信号を処理してマススペクトル（ＭＳマススペクトル、ＭＳ／ＭＳマススペクトル）を作成するＭＳデータ処理部２２と、ＭＳ及びＭＳ／ＭＳマススペクトルデータを処理することによりピークリストを作成するピークリスト作成部２３と、該ピークリストに基づいてアミノ酸配列の同定処理を行う配列同定処理部２４と、同定の際に使用される同定用データベース２５とから成る。配列同定処理部２４は例えばＭＡＳＣＯＴ（Matrix Science社製）等の検索エンジンを含み、公共のゲノムデータベースやタンパク質データベース等を同定用データベース２５として同定処理を行うものとすることができる。また、De Novoシーケンスなどのソフトウエアを用いて数理的にアミノ酸配列を同定する処理を行うものであってもよい。なお、制御／処理部２０の機能は、パーソナルコンピュータに搭載した所定のソフトウエアを実行することにより実現することができる。 The control / processing unit 20 creates a mass spectrum (MS mass spectrum, MS / MS mass spectrum) by processing the detection signal obtained by the ion detector 14 and the control unit 21 that controls each unit of the mass analysis unit 10. MS data processing unit 22, peak list creation unit 23 that creates a peak list by processing MS and MS / MS mass spectrum data, and sequence identification processing unit 24 that performs amino acid sequence identification processing based on the peak list And an identification database 25 used for identification. The sequence identification processing unit 24 includes, for example, a search engine such as MASCOT (manufactured by Matrix Science), and can perform identification processing using a public genome database or protein database as an identification database 25. Alternatively, a process for mathematically identifying an amino acid sequence may be performed using software such as a De Novo sequence. The function of the control / processing unit 20 can be realized by executing predetermined software installed in a personal computer.

以下、本実施例の構造解析システムを用いてペプチド混合物のアミノ酸配列を同定する際の全体的な手順について、図２のフローチャートに基づいて説明する。 The overall procedure for identifying the amino acid sequence of the peptide mixture using the structural analysis system of this example will be described below based on the flowchart of FIG.

まず、制御部２１の制御の下に、ペプチド混合物を含む試料に対し質量分析部１０によりＭＳ分析を実行する（ステップＳ１）。これにより、ＭＳデータ処理部２２では、横軸を質量電荷比、縦軸を強度とするＭＳマススペクトルが作成される。このＭＳマススペクトルには、それぞれ異なるペプチドに由来する複数の同位体ピーク群が現れる。いま、図４に示すように、得られたＭＳマススペクトルにおいて、質量電荷比が４０００[Ｄａ]であるペプチドＡ由来の同位体ピーク群と、質量電荷比が４００１[Ｄａ]であるペプチドＢ由来の同位体ピーク群とが重なり合っているとする。
First, under the control of the control unit 21, MS analysis is performed by the mass analysis unit 10 on the sample containing the peptide mixture (step S <b> 1). As a result, the MS data processing unit 22 creates an MS mass spectrum with the horizontal axis representing the mass-to- charge ratio and the vertical axis representing the intensity. In this MS mass spectrum, a plurality of isotope peak groups derived from different peptides appear. Now, as shown in FIG. 4, in the obtained MS mass spectrum, an isotope peak group derived from peptide A having a mass-to- charge ratio of 4000 [Da] and derived from peptide B having a mass-to- charge ratio of 4001 [Da] It is assumed that the isotope peak groups overlap.

次に、例えば同位体ピーク群の中から最も強度が大きいピークに対応するイオンをプリカーサイオンとして選択する（ステップＳ２）。例えば図４の例では、ペプチドＡの４番目のピークと、ペプチドＢの３番目のピークが重なり合った、質量電荷比４００３[Ｄａ]のピーク（４００３[Ｄａ]）をプリカーサイオンとして選択する。
Next, for example, an ion corresponding to a peak having the highest intensity is selected as a precursor ion from the isotope peak group (step S2). For example, in the example of FIG. 4, a peak (4003 [Da]) having a mass-to- charge ratio of 4003 [Da] in which the fourth peak of peptide A and the third peak of peptide B overlap is selected as the precursor ion.

そして、制御部２１の制御の下に、質量分析部１０は上記プリカーサイオンとして選択されたイオンのＭＳ／ＭＳ分析を実行する（ステップＳ３）。即ち、イオントラップ部１２によってプリカーサイオンが選択された上で開裂され、該プリカーサイオンの開裂によって生じたプロダクトイオンが質量分離部１３で分離してイオン検出器１４により検出される。そして、ＭＳデータ処理部２２ではＭＳ／ＭＳマススペクトルが作成される。 Then, under the control of the control unit 21, the mass analysis unit 10 performs MS / MS analysis of the ions selected as the precursor ions (step S3). That is, the precursor ions are selected by the ion trap unit 12 and then cleaved, and the product ions generated by the cleavage of the precursor ions are separated by the mass separation unit 13 and detected by the ion detector 14. Then, the MS data processing unit 22 creates an MS / MS mass spectrum.

ステップＳ２でプリカーサイオンとして選択された上記ＭＳマススペクトル上のピーク（４００３[Ｄａ]）は、ペプチドＡの主イオンのピーク（４０００[Ｄａ]）よりも質量電荷比が３[Ｄａ]大きいものであるため、該ピークに含まれるペプチドＡの同位体イオンには、主同位体以外の同位体が最大で３つ含まれていることになる。同様に該ピークはペプチドＢの主イオンのピーク（４００１[Ｄａ]）よりも質量電荷比が２[Ｄａ]大きいものであるため、該ピークに含まれるペプチドＢの同位体イオンには主同位体以外の同位体が最大で２つ含まれることになる。したがって、該ピークの開裂によって生じるペプチドＡ由来のプロダクトイオンには、それぞれ０〜３個の主同位体以外の同位体が含まれることになるため、ペプチドＡ由来のプロダクトイオンは、ＭＳ／ＭＳマススペクトル上において４本のピークから成る同位体ピーク群（四連ピーク）を形成する筈である。同様に、ペプチドＢ由来のプロダクトイオンには、それぞれ０〜２個の主同位体以外の同位体が含まれることになるため、ペプチドＢ由来のプロダクトイオンは、ＭＳ／ＭＳマススペクトル上において３本のピークから成る同位体ピーク群（三連ピーク）を形成する筈である。
The peak (4003 [Da]) on the MS mass spectrum selected as the precursor ion in step S2 has a mass to charge ratio of 3 [Da] larger than the peak of the main ion of peptide A (4000 [Da]). some reason, the isotopic ion of peptide a contained in the peak, so that the isotope other than the main isotope is contained up to three. Similarly, since the peak has a mass-to- charge ratio of 2 [Da] larger than the peak of the main ion of peptide B (4001 [Da]), the isotope ion of peptide B contained in the peak is the main isotope. 2 isotopes other than are included at the maximum. Therefore, since the product ions derived from peptide A generated by cleavage of the peak contain isotopes other than 0 to 3 main isotopes, the product ions derived from peptide A are MS / MS masses. It should form an isotope peak group (quadruple peak) consisting of four peaks on the spectrum. Similarly, since the product ions derived from peptide B each contain isotopes other than 0 to 2 main isotopes, there are 3 product ions derived from peptide B on the MS / MS mass spectrum. This should form an isotope peak group (triple peak) consisting of the peaks.

次に、上記ＭＳ／ＭＳマススペクトルにおいて、所定値以上の強度を持つピークを含み、１[Ｄａ]毎にピークが現れるピーク群を同位体ピーク群とみなして抽出する（ステップＳ４）。先にプリカーサイオンとして選択したピークが、異なるペプチド由来のピークが重なり合ったものである場合に、該プリカーサイオンに含まれる主同位体以外の同位体の最大数が各ペプチド間で異なってさえいれば、該プリカーサイオンから生じるプロダクトイオンは、ＭＳ／ＭＳマススペクトル上でペプチド毎にピーク数が異なる同位体ピーク群を形成する。したがって、原則的には、ピーク本数の違いに基づいてＭＳ／ＭＳマススペクトル上の同位体ピーク群をクラス分けすれば、各クラスには、それぞれ同一ペプチドに由来するプロダクトイオンの同位体ピーク群のみが含まれることになる。
Next, in the MS / MS mass spectrum, a peak group including a peak having an intensity equal to or higher than a predetermined value and appearing every 1 [Da] is regarded as an isotope peak group (step S4). If the peak previously selected as the precursor ion is an overlap of peaks derived from different peptides, the maximum number of isotopes other than the main isotope contained in the precursor ion may be different between the peptides. The product ions generated from the precursor ions form isotope peak groups having different numbers of peaks for each peptide on the MS / MS mass spectrum. Therefore, in principle, if isotopic peak groups on the MS / MS mass spectrum are classified based on the difference in the number of peaks, only isotopic peak groups of product ions derived from the same peptide are included in each class. Will be included.

ところが、実際には、前述したようにピーク強度がかなり小さいものが含まれている可能性があり、そうした場合にはピークの有無を確定的に判断できないため、ピークの本数だけでは正確なクラス分けができない。そこでここでは、同位体ピーク群に含まれる複数のピークの強度比を利用することで強度が小さなピークも確実に識別した上で、プリカーサイオンに含まれる主同位体以外の同位体の個数を推定してそれに基づくクラス分けを行う（ステップＳ５）。なお、具体的な方法は後述する。
However, in reality, there is a possibility that the peak intensity is quite small as described above. In such a case, the existence of the peak cannot be determined deterministically. I can't. Therefore, here we estimate the number of isotopes other than the main isotope contained in the precursor ion after reliably identifying low-intensity peaks by using the intensity ratio of multiple peaks contained in the isotope peak group. Then, classification is performed based on the classification (step S5). A specific method will be described later.

クラス分けがなされたならば、各クラスのＭＳ／ＭＳマススペクトルにおいて、所定のアルゴリズムに従って同位体ピーク群内のモノアイソトピックピーク（天然存在比が最大の同位体から構成されるイオンのピーク）を決定し、その質量電荷比等を記載したピークリストを作成する（ステップＳ６）。
Once classified, in each class of MS / MS mass spectrum, monoisotopic peaks (ion peaks composed of isotopes having the highest natural abundance ratio) within the isotope peak group according to a predetermined algorithm. A peak list describing the mass-to- charge ratio and the like is created (step S6).

以上により、ペプチドＡに関するピークリストＬａと、ペプチドＢに関するピークリストＬｂとが得られるので、各ピークリストＬａ、Ｌｂを配列同定処理部２４に引き渡す。配列同定処理部２４は各ピークリストＬａ、Ｌｂについてデータベースの検索、或いはDe Novoシーケンス等によるＭＳ／ＭＳマススペクトルパターンの数理的解析処理を実行することにより、ペプチドＡ及びペプチドＢのアミノ酸配列を同定する（ステップＳ７）。 As described above, the peak list La for the peptide A and the peak list Lb for the peptide B are obtained, and the peak lists La and Lb are delivered to the sequence identification processing unit 24. The sequence identification processing unit 24 identifies the amino acid sequences of peptide A and peptide B by searching the database for each of the peak lists La and Lb or by performing mathematical analysis processing of the MS / MS mass spectrum pattern by De Novo sequence or the like. (Step S7).

続いて、上記ステップＳ５の処理を図３のフローチャートに従ってより詳細に説明する。まず選択されたプリカーサイオンの元素組成を推定する（ステップＳ１１）。そして初期値として変数ｎを１にセットし（ステップＳ１２）、プリカーサイオンに主同位体以外の同位体がｎ個、つまり当初は１個含まれるものと仮定する（ステップＳ１３）。その仮定の下でＭＳ／ＭＳ分析により得られるピークの組成を推定し、ＭＳ／ＭＳマススペクトルに現れる同位体ピーク群の各ピークの強度比を理論的に計算する（ステップＳ１４）。
Subsequently, the process of step S5 will be described in more detail with reference to the flowchart of FIG. First, the element composition of the selected precursor ion is estimated (step S11). Then, the variable n is set to 1 as an initial value (step S12), and it is assumed that the precursor ion includes n isotopes other than the main isotope , that is, one is initially included (step S13). Under the assumption, the composition of the peak obtained by the MS / MS analysis is estimated, and the intensity ratio of each peak of the isotope peak group appearing in the MS / MS mass spectrum is theoretically calculated (step S14).

いま図５に示すような、４個のピークＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４から成る同位体ピーク群を想定すると、ピーク強度比とは各ピークＰ１〜Ｐ４の強度Ｕ１〜Ｕ４の比Ｕ１：Ｕ２：Ｕ３：Ｕ４であり、後述のような比較のためには最大強度（この場合にはＵ４）を１として他を規格化して表せばよい。即ち、強度比はＵ１／Ｕ４：Ｕ２／Ｕ４：Ｕ３／Ｕ４：１となる。それから、その求まった理論計算による強度比と、実測によるＭＳ／ＭＳマススペクトル上の上記同位体ピーク群の各ピーク強度比との相関を示す相関値Ｔｎを計算する（ステップＳ１５）。ピーク強度比の相似性が高いほど高い相関値を示す。 Assuming an isotope peak group consisting of four peaks P1, P2, P3, and P4 as shown in FIG. 5, the peak intensity ratio is the ratio U1: U2 of the intensities U1 to U4 of the peaks P1 to P4: U3: U4. For comparison as will be described later, the maximum intensity (U4 in this case) may be set to 1, and the others may be normalized. That is, the intensity ratio is U1 / U4: U2 / U4: U3 / U4: 1. Then, a correlation value Tn indicating a correlation between the obtained intensity ratio by theoretical calculation and each peak intensity ratio of the isotope peak group on the MS / MS mass spectrum by actual measurement is calculated (step S15). The higher the similarity of the peak intensity ratio, the higher the correlation value.

次に変数ｎが或る既定値Ｎに一致したか否かを判定する（ステップＳ１６）。既定値Ｎはプリカーサイオンに含まれる主同位体以外の同位体の個数の最大値を制限する値であり、例えばプリカーサイオンが１個、２個又は３個の主同位体以外の同位体を含むことを想定する場合にはＮ＝３と設定しておく。そして、変数ｎがＮに達していなければｎに１を加算したものを新たなｎとし（ステップＳ１７）、ステップＳ１３に戻る。一方、ステップＳ１６において変数ｎがＮに達していれば、それまでに算出した相関値Ｔ１〜ＴＮの中で値が最大であるものを最大値Ｔmaxとして抽出する（ステップＳ１８）。そして、この最大値Ｔmaxが或る閾値以上であるか否かを判定する（ステップＳ１９）。
Next, it is determined whether or not the variable n matches a certain default value N (step S16). The predetermined value N is a value that limits the maximum number of isotopes other than the main isotope contained in the precursor ion. For example, the precursor ion includes isotopes other than one, two, or three main isotopes. If this is assumed, N = 3 is set. If the variable n has not reached N, a value obtained by adding 1 to n is set as a new n (step S17), and the process returns to step S13. On the other hand, if the variable n has reached N in step S16, the correlation value T1 to TN calculated so far is extracted as the maximum value Tmax (step S18). Then, it is determined whether or not the maximum value Tmax is greater than or equal to a certain threshold value (step S19).

最大値Ｔmaxが閾値を超えなければ、たとえ最大値Ｔmaxであっても実測によるピーク強度比が理論計算によるピーク強度比に類似しているとは結論付けることができない。そこで、ステップＳ１９でＮＯの場合には、その同位体ピーク群を、主同位体以外の同位体を含まないプリカーサ由来のピークリストのクラスに分類する（ステップＳ２１）。これに対し、ステップＳ１９でＹＥＳの場合には、その同位体ピーク群を、最大値Ｔmaxを与える主同位体以外の同位体の個数を含むプリカーサ由来のピークリストのクラスに分類する（ステップＳ２０）。即ち、例えばプリカーサイオンに主同位体以外の同位体が２個含まれていた（ｎ＝２）と仮定したときに計算されたピーク強度比に対する相関値Ｔ２がＴmaxであって且つＴmaxが閾値以上であった場合には、ＭＳ／ＭＳマススペクトルにおけるこの同位体ピーク群を同位体を２個を含むプリカーサイオン由来のクラスに分類する。
If the maximum value Tmax does not exceed the threshold value, it cannot be concluded that the peak intensity ratio obtained by actual measurement is similar to the peak intensity ratio obtained by theoretical calculation even if the maximum value Tmax is used. Therefore, if NO in step S19, the isotope peak group is classified into a precursor-derived peak list class that does not contain isotopes other than the main isotope (step S21). On the other hand, in the case of YES in step S19, the isotope peak group is classified into a class of precursor-derived peak lists including the number of isotopes other than the main isotope giving the maximum value Tmax (step S20). . That is, for example, when the precursor ion includes two isotopes other than the main isotope (n = 2), the correlation value T2 with respect to the peak intensity ratio calculated is Tmax, and Tmax is equal to or greater than the threshold value. In this case, this isotope peak group in the MS / MS mass spectrum is classified into a class derived from a precursor ion including two isotopes.

上記図３により説明した処理の具体例を挙げる。いま、ここではアンジオテンシンII（AngiotensinII：アミノ酸配列＝[ＤＲＶＹＩＨＰＦ］、質量電荷比＝１０４６．５[Ｄａ]）を解析する場合を例示する。ここで質量電荷比１０４７．２０[Ｄａ]であるピークに対応するイオンをプリカーサイオンとして選択するものとする。
A specific example of the processing described with reference to FIG. Here, the case of analyzing angiotensin II (Angiotensin II: amino acid sequence = [DRVYIHPF], mass to charge ratio = 1046.5 [Da]) is exemplified here. Here, an ion corresponding to a peak having a mass-to- charge ratio of 1047.20 [Da] is selected as a precursor ion.

同位体ピーク強度比を算出するためには、プリカーサイオンを構成する元素組成の推定が必要である。観測ピークの質量電荷比から構成元素を推定するために、センコらが提案した（Michel W. Senko et.al,「デターミネイション・オブ・モノアイソトピック・マシズ・アンド・イオン・ポピュレイションズ・フォー・ラージ・バイオモレキュルズ・フロム・リゾルブド・アイソトピック・ディストリビューションズ (Determination of monoisotopic masses and ion populations for large biomolecules from resolved isotopic distributions）」、Journal of American Soc. Mass Spectom., 6, pp.229-233,(1995)参照）アベレージネ（Averagine）モデルを利用することができる。Averagineモデルはタンパク質データベースの統計解析よりアミノ酸の平均組成を求めたもので、Ｃ_{４．９３８４}Ｈ_{７．７５８３}Ｎ_{１．３５７７}Ｏ_{１．４７７３}Ｓ_{０．０４１７}をユニットアミノ酸配列とする。このユニットはモノアイソトピックの元素質量で計算すると１１１．０５４３[Ｄａ]となる。例えば１０００[Ｄａ]における同位体ピーク群を計算するため使用する元素組成は９．００４６（＝１０００／１１１．０５４３）ユニットのAveragineモデルの構成元素数を四捨五入により整数化した後（Ｃ_４４Ｈ_７０Ｎ_１２Ｏ_１３、質量電荷比＝９７４．５１８５[Ｄａ]）、与えられた質量値に近付けるべくＨの数を適宜増減させて求める（Ｃ_４４Ｈ_９５Ｎ_１２Ｏ_１３、質量電荷比＝９９９．７１４２[Ｄａ]）。
In order to calculate the isotope peak intensity ratio, it is necessary to estimate the element composition constituting the precursor ion. Senko et al. (Michel W. Senko et.al, “Determination of Monoisotopic, Mathis and Ion Populations, etc.) proposed to estimate the constituent elements from the mass-to- charge ratio of the observed peaks. For Large Biomolecules from Resolved Isotopic Distributions ”, Journal of American Soc. Mass Spectom., 6, pp.229 -233, (1995)) The Averagine model can be used. Averagine model intended to determine the average composition of amino acids than the statistical analysis of the protein _database, the _{_{_{_{C 4.9384 H 7.7583 N 1.3577 O 1.4773}}}} S 0.0417 a unit amino acid sequence. This unit is 111.0543 [Da] when calculated by the elemental mass of monoisotopic. For example, the elemental composition used to calculate the isotope peak group at 1000 [Da] is 9.0046 (= 1000 / 111.0543) units after the number of constituent elements of the Averagine model is rounded to an integer (C ₄₄ H ₇₀ N ₁₂ O ₁₃ , mass-to- charge ratio = 974.5185 [Da]), and determined by appropriately increasing / decreasing the number of H to approach a given mass value (C ₄₄ H ₉₅ N ₁₂ O ₁₃ , mass-to- charge ratio = 999. 7142 [Da]).

上記Averagineモデルを用いると、プリカーサイオンの質量電荷比（１０４７．２０[Ｄａ]）から推定される元素組成はＣ_５０Ｈ_７１Ｎ_１３Ｏ_１２となる。いまプリカーサイオンによるピークがＭＳマススペクトルにおける２番目の同位体ピークであると仮定すると、プリカーサイオンには主同位体以外の同位体が１個含まれる（つまりｎ＝１）ことになる。したがって、この仮定の下では、このプリカーサイオンを開裂して得られるプロダクトイオンの元素組成は、^１２Ｃ_４９ ^１３Ｃ_１Ｈ_７１Ｎ_１３Ｏ_１２、Ｃ_５０ ^１Ｈ_７０ ^２Ｈ_１Ｎ_１３Ｏ_１２、Ｃ_５０Ｈ_７１ ^１４Ｎ_１２ ^１５Ｎ_１Ｏ_１２、又は、Ｃ_５０Ｈ_７１Ｎ_１３ ^１６Ｏ_１１ ^１７Ｏ_１、のいずれかであると考えられる。このとき、周知の二項定理によりこれら各分子の強度比を求めると、Ｃ_５０Ｈ_７１Ｎ_１３Ｏ_１２の強度０．５８４０（＝（０．９８９３）^５０）に対し、^１２Ｃ_４９ ^１３Ｃ_１Ｈ_７１Ｎ_１３Ｏ_１２の強度は０．３１５８（＝５０（０．９８９３）^４９×０．０１０７）となり、Ｃ_５０Ｈ_７１Ｎ_１３Ｏ_１２の強度を１とすれば^１２Ｃ_４９ ^１３Ｃ_１Ｈ_７１Ｎ_１３Ｏ_１２の強度は０．５４０８となる。
When the above Averagine model is used, the elemental composition estimated from the mass-to- charge ratio of the precursor ion (1047.20 [Da]) is C ₅₀ H ₇₁ N ₁₃ O ₁₂ . Assuming that the peak due to the precursor ion is the second isotope peak in the MS mass spectrum, the precursor ion includes one isotope other than the main isotope (that is, n = 1). Therefore, under this assumption, the elemental composition of product ions obtained by cleaving the precursor ions is ¹² C ₄₉ ¹³ C ₁ H ₇₁ N ₁₃ O ₁₂ , C ₅₀ ¹ H ₇₀ ² H ₁ N ₁₃ O ₁₂ , _{_{^{_{^{C 50 H 71 14 N 12 15}}}}} N 1 O 12, or _believed to _{_{^{_{^{C 50 H 71 N 13 16 O}}}}} 11 17 O 1, is either. At this time, when the strength ratio of these molecules is obtained by a well-known binomial theorem, the strength of C ₅₀ H ₇₁ N ₁₃ O ₁₂ is 0.5840 (= (0.9893) ⁵⁰ ), and ¹² C ₄₉ ¹³ C ₁ The strength of H ₇₁ N ₁₃ O ₁₂ is 0.3158 (= 50 (0.9893) ⁴⁹ × 0.0107), and if the strength of C ₅₀ H ₇₁ N ₁₃ O ₁₂ is 1, ¹² C ₄₉ ¹³ C ₁ H The strength of ₇₁ N ₁₃ O ₁₂ is 0.5408.

同様にして他の分子の強度比も求めると、
Ｃ_５０ ^１Ｈ_７０ ^２Ｈ_１Ｎ_１３Ｏ_１２：０．０１０５０（＝７１（０．９９９８５）^７０×０．０００１５／（０．９９９８５）^７１）
Ｃ_５０Ｈ_７１ ^１４Ｎ_１２ ^１５Ｎ_１Ｏ_１２：０．０４８０（＝１３（０．９９６３２）^１２×０．００３６８／（０．９９６３２）^１３）
Ｃ_５０Ｈ_７１Ｎ_１３ ^１６Ｏ_１１ ^１７Ｏ_１：０．００４６（＝１２（０．９９７５７）^１１×０．０００３８３／（０．９９７５７）^１２）
となる。 Similarly, when calculating the intensity ratio of other molecules,
C ₅₀ ¹ H ₇₀ ² H ₁ N ₁₃ O ₁₂ : 0.01050 (= 71 (0.99985) ⁷⁰ × 0.00015 / (0.99985) ⁷¹ )
_{_{^{_{^{C 50 H 71 14 N 12 15}}}}} N 1 O 12: 0.0480 (= 13 (0.99632) 12 × 0.00368 / (0.99632) 13)
C ₅₀ H ₇₁ N ₁₃ ¹⁶ O ₁₁ ¹⁷ O ₁ : 0.0046 (= 12 (0.99757) ¹¹ × 0.000383 / (0.99757) ¹² )
It becomes.

Averagineモデルを用いると、実測により得られたＭＳ／ＭＳマススペクトル上での同位体ピーク群の質量電荷比９３１．９[Ｄａ]から推定される元素組成はＣ_４６Ｈ_６６Ｎ_１３Ｏ_９となる。いま上記^１２Ｃ_４９ ^１３Ｃ_１Ｈ_７１Ｎ_１３Ｏ_１２の元素組成のプリカーサイオンが開裂して元素組成がＣ_４６Ｈ_６６Ｎ_１３Ｏ_９とあるプロダクトイオンが生成したものと仮定すると、プロダクトイオンが主同位体以外の同位体を含まない確率は、５０個の炭素（Ｃ）の中で４６個を選択する際に主同位体以外の同位体でない４９個の中から４６個を選択する確率であるから、４９／５０×４８／４９×…×４／５、書き直すと_４９Ｃ_４６／_５０Ｃ_４６となる。したがって、^１２Ｃ_４９ ^１３Ｃ_１Ｈ_７１Ｎ_１３Ｏ_１２由来のモノアイソトピックイオンのピーク強度は（_４９Ｃ_４６／_５０Ｃ_４６）×０．５４０８となる。同様にして他の分子由来のモノアイソトピックイオンのピーク強度を計算すると、このプロダクトイオンのモノアイソトピックピーク強度は次の式で計算できる。
（_４９Ｃ_４６／_５０Ｃ_４６）×０．５４０８＋（_７０Ｃ_６６／_７１Ｃ_６６）×０．０１０５＋（_１２Ｃ_１２／_１３Ｃ_１２）×０．０４８＋（_１１Ｃ_９／_１２Ｃ_９）×０．００４６＝（４／５０）×０．５４０８＋（５／７１）×０．０１０５＋（１／１３）×０．０４８＋（３／１２）×０．００４６＝０．０４８８
また同様の考え方で、主同位体以外の同位体を１個含むプロダクトイオンのピーク強度は次の式で計算できる。
｛１−（４／５０）｝×０．５４０８＋｛１−（５／７１）｝×０．０１０５＋｛１−（１／１３）｝×０．０４８＋｛１−（３／１２）｝×０．００４６＝０．５５５１
When the Averagine model is used, the elemental composition estimated from the mass-to- charge ratio 931.9 [Da] of the isotope peak group on the MS / MS mass spectrum obtained by actual measurement is C ₄₆ H ₆₆ N ₁₃ O _9. . Assuming that a precursor ion having an elemental composition of ¹² C ₄₉ ¹³ C ₁ H ₇₁ N ₁₃ O ₁₂ is cleaved and a product ion having an elemental composition of C ₄₆ H ₆₆ N ₁₃ O ₉ is generated, the product ion is The probability of not including isotopes other than the main isotope is the probability of selecting 46 out of 49 non- isotopes other than the main isotope when selecting 46 out of 50 carbons (C). because there, 49/50 × 48/49 × ... × 4/5, a rewritten when ₄₉ C _{_{_46/50}} C _46. ^Therefore, 12 the peak intensity of _{^{_{_{_{C 49 13 C 1 H 71 N}}}}} 13 O 12 from the monoisotopic ion becomes _{_{_{_{(49 C 46/50 C 46}}}} ) × 0.5408. Similarly, when the peak intensity of monoisotopic ions derived from other molecules is calculated, the monoisotopic peak intensity of this product ion can be calculated by the following equation.
_{_{_{_{(49 C 46/50 C 46}}}} ) × 0.5408 + (70 C 66/71 C 66) × 0.0105 + (12 C 12/13 C 12) × 0.048 + (11 C 9/12 C 9) × 0 .0046 = (4/50) × 0.5408 + (5/71) × 0.0105 + (1/13) × 0.048 + (3/12) × 0.0046 = 0.0488
In the same way, the peak intensity of a product ion containing one isotope other than the main isotope can be calculated by the following formula.
{1- (4/50)} × 0.5408 + {1- (5/71)} × 0.0105 + {1- (1/13)} × 0.048 + {1- (3/12)} × 0 .0046 = 0.5551

したがって、主同位体以外の同位体を１個含む（つまりｎ＝１）イオンをプリカーサイオンとしてＭＳ／ＭＳ分析を行ったと仮定すると、質量電荷比９３１．９[Ｄａ]におけるＭＳ／ＭＳマススペクトル上の同位体ピーク群の強度比は０．０４８８：０．５５５１、即ち０．０８７９：１となる。これがプリカーサイオンに１個の主同位体以外の同位体を含むと仮定したときの理論的なピーク強度比である。
Accordingly, assuming that MS / MS analysis was performed using an ion containing one isotope other than the main isotope (that is, n = 1) as a precursor ion, the MS / MS mass spectrum on the mass-to- charge ratio of 931.9 [Da] The intensity ratio of the isotope peak group is 0.0488: 0.5551, that is, 0.0879: 1. This is the theoretical peak intensity ratio when it is assumed that the precursor ion contains an isotope other than one main isotope .

同様にして主同位体以外の同位体を２個含む（つまりｎ＝２）イオンをプリカーサイオンとしてＭＳ／ＭＳ分析を行ったと仮定すると、質量電荷比９３１．９[Ｄａ]におけるＭＳ／ＭＳマススペクトル上の同位体ピーク群の強度比は０．０４１０：０．１６０２：１となる。これがプリカーサイオンに２個の主同位体以外の同位体を含むと仮定したときの理論的なピーク強度比である。
Similarly, assuming that MS / MS analysis was performed using an ion containing two isotopes other than the main isotope (that is, n = 2) as a precursor ion, an MS / MS mass spectrum at a mass-to- charge ratio of 931.9 [Da] The intensity ratio of the upper isotope peak group is 0.0410: 0.1602: 1. This is the theoretical peak intensity ratio when it is assumed that the precursor ion contains isotopes other than the two main isotopes .

いま前述の図８（ｃ）及び（ｄ）に示した同位体ピーク群を最大ピーク強度を１として描き直すと図６（ａ）及び（ｂ）に示すようになる。この図６（ａ）において質量電荷比１[Ｄａ]の間隔で現れる２本のピークのピーク強度比は、プリカーサイオンが主同位体以外の同位体を１個含むと仮定した場合の理論的なピーク強度比によく一致している。一方、図６（ｂ）において質量電荷比１[Ｄａ]の間隔で現れる３本のピークのピーク強度比は、プリカーサイオンが主同位体以外の同位体を２個含むと仮定した場合の理論的なピーク強度比によく一致している。したがって、ピーク強度が小さくて殆ど測定ノイズに埋もれてしまうようなレベルであっても、各同位体ピーク群を正確にクラス分けしてピークリストを作成することができる。
Now, when the isotope peak group shown in FIGS. 8C and 8D is redrawn with the maximum peak intensity being 1, the result is as shown in FIGS. 6A and 6B. In FIG. 6A, the peak intensity ratio of two peaks appearing at an interval of mass-to- charge ratio 1 [Da] is theoretical when the precursor ion is assumed to contain one isotope other than the main isotope. It is in good agreement with the peak intensity ratio. On the other hand, the peak intensity ratio of the three peaks appearing at an interval of mass-to- charge ratio 1 [Da] in FIG. 6B is theoretical when it is assumed that the precursor ion contains two isotopes other than the main isotope. The peak intensity ratio is in good agreement. Therefore, even if the peak intensity is small and the level is almost buried in measurement noise, each isotope peak group can be accurately classified to create a peak list.

なお、上述したようなピーク強度比に基づいたクラス分けの手法を利用することにより、例えば２本のピークから成る同位体ピーク群が抽出された場合に、モノアイソトピックイオンをプリカーサイオンとするプロダクトイオンに基づくピークが２本あるのか、或いは、同位体を１個含むイオンをプリカーサイオンとするプロダクトイオンに基づく２本のピークがあるのか、つまり擬似的な同位体ピーク群であるのか否かを判別することも可能である。 By using the classification method based on the peak intensity ratio as described above, for example, when an isotope peak group consisting of two peaks is extracted, a product using monoisotopic ions as precursor ions Whether there are two peaks based on ions, or whether there are two peaks based on a product ion whose precursor ion is an ion containing one isotope, that is, whether it is a pseudo isotope peak group. It is also possible to determine.

また、上述の方法を応用することにより、以下のように同定の信頼性を上げることができる。即ち、質量電荷比がＭ[Ｄａ]であるピークを先頭とする同位体ピーク群において、２番目（＝Ｍ＋１[Ｄａ]）、３番目（＝Ｍ＋２[Ｄａ]）の単一ピークに対応するイオンをそれぞれプリカーサイオンとしてＭＳ／ＭＳ分析を実行する。３番目のピークに対応するイオンをプリカーサイオンとして実行したＭＳ／ＭＳ分析からは、上述のクラス分けを利用して作成したプリカーサイオンに主同位体以外の同位体を２個含むと仮定したピークリストから、質量電荷比がＭ[Ｄａ]であるペプチドを同定することができる。２番目のピークに対応するイオンをプリカーサイオンとして実行したＭＳ／ＭＳ分析では、プリカーサイオンに主同位体以外の同位体を１個含むと仮定したピークリストから、質量電荷比がＭ[Ｄａ]であるペプチドを同定できる。３番目或いは２番目のピークに対応するイオンをプリカーサイオンとしたＭＳ／ＭＳ分析により、同じＭ[Ｄａ]のペプチドが同定できれば、このペプチドの同定信頼度は高いと考えることができる。このように、複数のＭＳ／ＭＳ分析を利用し、同一のペプチドの同定を試みることができる。
Further, by applying the above method, the reliability of identification can be improved as follows. That is, ions corresponding to the second (= M + 1 [Da]) and the third (= M + 2 [Da]) single peaks in the isotope peak group starting from the peak whose mass to charge ratio is M [Da]. MS / MS analysis is performed using each as a precursor ion. From the MS / MS analysis in which the ion corresponding to the third peak is executed as a precursor ion, the peak list assuming that the precursor ion created using the above classification includes two isotopes other than the main isotope. Thus, a peptide having a mass to charge ratio of M [Da] can be identified. In the MS / MS analysis in which the ion corresponding to the second peak is used as the precursor ion, the mass to charge ratio is M [Da] from the peak list assuming that the precursor ion contains one isotope other than the main isotope . A peptide can be identified. If a peptide having the same M [Da] can be identified by MS / MS analysis using the ion corresponding to the third or second peak as a precursor ion, it can be considered that the identification reliability of this peptide is high. In this way, identification of the same peptide can be attempted using multiple MS / MS analyses.

また、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変更、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは明らかである。 Moreover, the said Example is only an example of this invention, and it is clear that even if it changes suitably, amends, and is added within the meaning of this invention, it is included in the claim of this application.

本発明の一実施例である構造解析システムの概略構成図。1 is a schematic configuration diagram of a structural analysis system that is an embodiment of the present invention. 本実施例の構造解析システムを用いてペプチド混合物のアミノ酸配列を同定する際の全体的な手順を示すフローチャート。The flowchart which shows the whole procedure at the time of identifying the amino acid sequence of a peptide mixture using the structural analysis system of a present Example. 本実施例の構造解析システムにおけるＭＳ／ＭＳマススペクトル上の同位体ピーク群をクラス分けする際のフローチャート。The flowchart at the time of classifying the isotope peak group on the MS / MS mass spectrum in the structural analysis system of a present Example. ＭＳマススペクトル上で異なるペプチド由来の同位体ピーク群が重なり合っている状態を示す図。The figure which shows the state which isotope peaks derived from a different peptide overlap on MS mass spectrum. 同位体ピーク群を構成するピークの強度比を説明するための図。The figure for demonstrating the intensity ratio of the peak which comprises an isotope peak group. 図８（ｃ）及び（ｄ）に示した同位体ピーク群を最大ピーク強度を１として描き直した図。The figure which redrawn the isotope peak group shown in FIG.8 (c) and (d) as the maximum peak intensity | strength to 1. FIG. ＭＳマススペクトル上での同位体ピーク群の一例を示す図。The figure which shows an example of the isotope peak group on MS mass spectrum. ＭＳ分析で得られた同位体ピーク群の一部をプリカーサイオンとして選択してＭＳ／ＭＳ分析した結果の一部を示す図。The figure which shows a part of result of having selected a part of isotope peak group obtained by MS analysis as a precursor ion, and having performed MS / MS analysis.

符号の説明Explanation of symbols

１０…質量分析部
１１…イオン化部
１２…イオントラップ部
１３…質量分離部
１４…イオン検出器
２０…制御／処理部
２１…制御部
２２…ＭＳデータ処理部
２３…ピークリスト作成部
２４…配列同定処理部
２５…同定用データベース（ＤＢ）

DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 ... Mass analysis part 11 ... Ionization part 12 ... Ion trap part 13 ... Mass separation part 14 ... Ion detector 20 ... Control / processing part 21 ... Control part 22 ... MS data processing part 23 ... Peak list creation part 24 ... Sequence identification Processing unit 25 ... Identification database (DB)

Claims

質量分析を用いて試料のアミノ酸配列又は塩基配列を同定するための構造解析システムであって、
a)試料のＭＳ分析を実行してＭＳマススペクトルを取得するとともに、該ＭＳマススペクトルに現れる同位体ピーク群の中から、一部のピークを選択して該ピークに対応したイオンをプリカーサイオンとしてＭＳ／ＭＳ分析を実行してＭＳ／ＭＳマススペクトルを取得する質量分析手段と、
b)前記質量分析手段により得られたＭＳ／ＭＳマススペクトルに現れる同位体ピーク群を、各同位体ピーク群に含まれる複数のピークの強度比に基づいてその元となったプリカーサイオンに含まれる主同位体以外の同位体の個数を推定することにより、該個数に１対１で対応した複数のクラスにクラス分けし、該クラス毎に同位体ピーク群内のモノアイソトピックピークを決定し、少なくともそのモノアイソトピックピークの質量電荷比を挙げたピークリストを作成するピークリスト作成手段と、
c)前記ピークリスト作成手段によって作成されたピークリストを基に試料のアミノ酸配列又は塩基配列を同定する配列同定手段と、
を備えることを特徴とする構造解析システム。
A structural analysis system for identifying the amino acid sequence or base sequence of a sample using mass spectrometry,
a) MS analysis of the sample is performed to obtain an MS mass spectrum, and a part of the isotope peaks appearing in the MS mass spectrum is selected, and ions corresponding to the peaks are used as precursor ions. Mass spectrometry means for performing MS / MS analysis to obtain an MS / MS mass spectrum;
b) The isotope peak group appearing in the MS / MS mass spectrum obtained by the mass spectrometric means is included in the precursor ion that is based on the intensity ratio of a plurality of peaks included in each isotope peak group. By estimating the number of isotopes other than the main isotope, it is classified into a plurality of classes corresponding to the number one-to-one , and monoisotopic peaks within the isotope peak group are determined for each class , A peak list creating means for creating a peak list that lists at least the mass-to-charge ratio of the monoisotopic peak ;
c) sequence identification means for identifying the amino acid sequence or base sequence of the sample based on the peak list created by the peak list creation means;
A structural analysis system comprising:

前記試料はペプチド混合物であって、該ペプチド混合物のアミノ酸配列を同定するものであることを特徴とする請求項１に記載の構造解析システム。 The structural analysis system according to claim 1, wherein the sample is a peptide mixture and identifies an amino acid sequence of the peptide mixture.

前記質量分析手段は、ペプチド混合物のＭＳ分析によって得られた同位体ピーク群の中から、単一のピークを選択してＭＳ／ＭＳ分析を行うことを特徴とする請求項２に記載の構造解析システム。 3. The structural analysis according to claim 2, wherein the mass spectrometric means performs MS / MS analysis by selecting a single peak from a group of isotope peaks obtained by MS analysis of a peptide mixture. system.

前記単一のピークとして、ペプチド混合物のＭＳ分析によって得られた同位体ピーク群の中で最大のイオン強度を有するピークを選択することを特徴とする請求項３に記載の構造解析システム。 4. The structural analysis system according to claim 3, wherein a peak having the maximum ionic strength is selected from the group of isotope peaks obtained by MS analysis of the peptide mixture as the single peak.

前記質量分析手段は、三次元四重極イオントラップを備えた質量分析装置であって、該イオントラップの内部でプリカーサイオンの開裂を行うものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の構造解析システム。

The mass spectrometer is a mass spectrometer equipped with a three-dimensional quadrupole ion trap, and cleaves precursor ions inside the ion trap. The structural analysis system described in Crab.