JP4820963B2 - Functional silica particles and uses thereof - Google Patents
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Description
本発明は、機能性シリカ粒子及びその用途に関する。より詳細には、本発明は特定の化合物をシリカ粒子に固定化することによって、新たな特性を発現してなる新規機能性シリカ粒子、並びにその用途に関する。 The present invention relates to functional silica particles and uses thereof. In more detail, this invention relates to the novel functional silica particle which expresses a new characteristic by fix | immobilizing a specific compound to a silica particle, and its use.
従来、信号強度を得るための色素分子の高濃度化は、会合体や凝集体の生成を引き起こし、色素分子自身の特性とは異なった好ましくない特性を引き起こしていた。それは、例えば蛍光分子であれば濃度消光であり、色素であれば凝集形成による吸収の変化であり、安定ラジカルであればスピンスピン相互作用によるESRピークのブロード化、それによる強度低下であった（例えば、非特許文献１〜３参照のこと）。 Conventionally, increasing the concentration of a dye molecule for obtaining signal intensity has caused the formation of aggregates and aggregates, and has caused undesirable characteristics different from the characteristics of the dye molecule itself. For example, in the case of fluorescent molecules, concentration quenching, and in the case of dyes, absorption changes due to aggregation formation, and in the case of stable radicals, ESR peaks are broadened by spin-spin interaction, resulting in intensity reduction ( For example, see non-patent documents 1 to 3).
色素分子を高濃度化する一つの方法として、色素を何らか支持体に固定化する方法が考えられる。かかる支持体として、種々のガラスビーズが提案されている（例えば、非特許文献４参照のこと）。 As one method for increasing the concentration of the dye molecule, a method of immobilizing the dye on a support may be considered. Various glass beads have been proposed as such a support (see, for example, Non-Patent Document 4).
しかしながらそれらは、粒子サイズがマイクロメーター以上と大きく、所望の大きさに調整できないので、例えばナノ領域やマイクロ領域での使用はできないという短所がある。
本発明は、上記分子としてメチルビオロゲン、キシレノールオレンジ、または4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)を利用することにより、新規でしかも有用な特性を発現した機能性材料を提供することを目的とする。特に本発明は、当該機能性材料として、ナノ領域やマイクロ領域で有効に使用できる、機能性シリカ粒子を提供することを目的とする。 The present invention provides novel and useful properties by utilizing methyl viologen, xylenol orange, or 4-amino- (2,3,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy) as the molecule. It aims at providing the expressed functional material. In particular, an object of the present invention is to provide functional silica particles that can be effectively used in the nano region and the micro region as the functional material.
本発明者は、上記目的を達成するために日夜鋭意検討していたところ、シリカ粒子にメチルビオロゲン、キシレノールオレンジ、または4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)といった化合物を固定化することによって、これらの化合物が本来有さない新たな機能を有するシリカ粒子が得られるか、またはこれらの化合物の機能をより一層効果的に発揮し得るシリカ粒子が得られることを見いだし、これらがいずれも機能性シリカ粒子として極めて有用な材料となることを確認するに至った。 The present inventor has been diligently studying day and night in order to achieve the above object. As a result, the silica particles are treated with methyl viologen, xylenol orange, or 4-amino- (2,3,6,6-tetramethyl-1-piperidin. By immobilizing a compound such as (nyloxy), silica particles having a new function that these compounds do not originally have can be obtained, or silica particles that can exhibit the function of these compounds more effectively. As a result, the inventors have found that these materials are extremely useful as functional silica particles.
本発明は、かかる知見に基づいて完成したものである。 The present invention has been completed based on such findings.
すなわち、本発明は第１に、シリカナノ粒子内に、メチルビオロゲン、キシレノールオレンジ、及び4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)よりなる群から選択される１種の化合物を含有してなる、機能性シリカ粒子を要旨とするものである。 That is, the present invention is first selected from the group consisting of methyl viologen, xylenol orange, and 4-amino- (2,3,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy) in silica nanoparticles. The functional silica particles containing one kind of compound are summarized as follows.
かかる機能性シリカ粒子は、下記（１）〜（３）に分類することができる：
（１）シリカ粒子内に、メチルビオロゲンを含有する機能性シリカ粒子（以下、便宜上「メチルビオロゲン／SiO2粒子」ともいう）
当該機能性シリカナノ粒子の特性として、（ａ）蛍光を有する、（ｂ）酸素存在下、紫外線照射することにより無色透明から黄色に変色する、及び（ｃ）紫外線照射により励起／蛍光波長が長波長側にシフトする、ことを挙げることができる。Such functional silica particles can be classified into the following (1) to (3):
(1) Functional silica particles containing methyl viologen in silica particles (hereinafter also referred to as “methyl viologen / SiO 2 particles” for convenience)
The functional silica nanoparticles have the following characteristics: (a) having fluorescence, (b) being colorless and transparent to yellow when irradiated with ultraviolet light in the presence of oxygen, and (c) excitation / fluorescence wavelength is long when irradiated with ultraviolet light. Can shift to the side.
（２）シリカ粒子内に、キシレノールオレンジを含有する機能性シリカ粒子（以下、便宜上「キシレノールオレンジ／SiO2粒子」ともいう）
当該機能性シリカ粒子の特性として、（ｄ）酸性下で黄色、アルカリ下で赤色を呈する、及び（ｅ）酸性下でＦｅ3＋の存在により紫色を呈する、ことを挙げることができる。なお、機能性シリカ粒子は、アルカリ下ではＦｅ3＋の存在の有無に関わらず赤色を呈している。(2) Functional silica particles containing xylenol orange in the silica particles (hereinafter also referred to as “xylenol orange / SiO 2 particles” for convenience)
As the characteristics of the functional silica particles, (d) yellow under acidity, red under alkali, and (e) purple due to the presence of Fe 3+ under acidity can be mentioned. The functional silica particles are red in the presence of alkali regardless of the presence or absence of Fe 3+ .
（３）シリカ粒子内に、4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)を含有する機能性シリカ粒子（以下、便宜上「4-アミノTempo／SiO2粒子」ともいう）
当該機能性シリカ粒子の特徴として、内部に「4-アミノTempo」をシリカ層に保護された状態で安定に包含することによって、安定した（ｆ）ラジカルを有する、ことを挙げることができる。(3) Functional silica particles containing 4-amino- (2,3,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy) in the silica particles (hereinafter referred to as “4-amino Tempo / SiO 2 for convenience. Also called "particles")
The functional silica particles can be characterized by having stable (f) radicals by stably including “4-amino Tempo” in the protected state in the silica layer.
更に本発明は、上記機能性シリカ粒子の製造方法として、下記の方法を提供する：
メチルビオロゲン、キシレノールオレンジ、及び4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)よりなる群から選択される１種の化合物を、(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランと混合し、次いでアンモニアの存在下でテトラエチルオルソシリケートと混合する工程を有する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載する機能性シリカ粒子の製造方法。Furthermore, this invention provides the following method as a manufacturing method of the said functional silica particle:
One compound selected from the group consisting of methyl viologen, xylenol orange, and 4-amino- (2,3,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy) is added to (3-thiocyanatopropyl) tri The method for producing functional silica particles according to any one of the above (1) to (3), which comprises a step of mixing with ethoxysilane and then mixing with tetraethylorthosilicate in the presence of ammonia.
以下、本発明について説明する。 The present invention will be described below.
（１）メチルビオロゲン／SiO2粒子
本発明のメチルビオロゲン／SiO2粒子は、シリカから形成される微粒子（シリカ粒子）に複数のメチルビオロゲン分子が固定化されてなるものである。固定化の態様は、シリカ粒子の内部にメチルビオロゲン分子が取り込まれた形で存在していればよく、特に制限されるものではない。シリカ粒子はシリカ（SiO2）が幾層もの層をなして形成されているが、当該シリカ粒子内におけるメチルビオロゲン分子の存在様式としては、例えば図１に示すように、シリカ粒子の当該層と層との間に、複数のメチルビオロゲンが存在している態様を例示することができる。但し、これに制限されるものではない。(1) methyl viologen / SiO 2 particles of methyl viologen / SiO 2 particles present invention has a plurality of methyl viologen molecules to the microparticle (silica particles) formed from silica is immobilized. The mode of immobilization is not particularly limited as long as it exists in a form in which methyl viologen molecules are incorporated into the silica particles. Silica particles are formed by forming several layers of silica (SiO 2 ). As the mode of presence of methyl viologen molecules in the silica particles, for example, as shown in FIG. An embodiment in which a plurality of methyl viologens are present between the layers can be exemplified. However, it is not limited to this.
本発明のメチルビオロゲン／SiO2粒子の大きさは、特に制限されず、目的に応じて適宜調整することができる。例えば、後述するメチルビオロゲン／SiO2粒子の製造方法において、アンモニア存在下でのテトラオルソシリケートとの反応回数を調整したり、また当該反応に使用するテトラオルソシリケートの濃度を調整することによって、メチルビオロゲン／SiO2粒子を、数ｎｍから数百ｎｍといったナノオーダーの粒径（直径）を有するナノ粒子として調製したり、また数μｍから十数μｍといったマイクロオーダーの粒径（直径）を有するマイクロ粒子として調製したりと、所望に応じて自在にその粒径を調整することができる。好ましいメチルビオロゲン／SiO2粒子は、直径がナノオーダーであるナノ粒子（シリカナノ粒子）であり、かかるナノ粒子として、例えば直径2〜1000nm、好ましくは直径2〜100nm、より好ましくは直径5〜60nm程度、さらにより好ましくは直径10〜40nm程度、一層好ましくは直径15〜30nm程度、特に好ましくは直径20〜30nm程度のシリカナノ粒子を挙げることができる。The size of the methyl viologen / SiO 2 particles of the present invention is not particularly limited and can be appropriately adjusted according to the purpose. For example, in the method for producing methyl viologen / SiO 2 particles described later, by adjusting the number of reactions with tetraorthosilicate in the presence of ammonia, or by adjusting the concentration of tetraorthosilicate used in the reaction, The viologen / SiO 2 particles are prepared as nanoparticles having a nano-order particle size (diameter) of several nanometers to several hundreds of nanometers, or a microparticle having a micro-order particle diameter (diameter) of several μm to several tens of μm. When prepared as particles, the particle size can be freely adjusted as desired. Preferred methyl viologen / SiO 2 particles are nanoparticles (silica nanoparticles) having a diameter of the order of nanometers. As such nanoparticles, for example, a diameter of 2 to 1000 nm, preferably a diameter of 2 to 100 nm, more preferably about 5 to 60 nm. Still more preferably, silica nanoparticles having a diameter of about 10 to 40 nm, more preferably about 15 to 30 nm, and particularly preferably about 20 to 30 nm can be mentioned.
シリカ粒子内にはメチルビオロゲン分子を複数含ませることが可能である。例えば、直径30nmのシリカナノ粒子を例にすると、その１粒子中には１〜５分子、好ましくは５〜10分子、より好ましくは15分子程度のメチルビオロゲン分子を含めることができる。なお、１粒子中にメチルビオロゲンを15分子の割合で含有する粒子の場合、当該メチルビオロゲンの粒子内濃度は約1.8 mMとなる。 A plurality of methyl viologen molecules can be contained in the silica particles. For example, when silica nanoparticles having a diameter of 30 nm are taken as an example, 1 to 5 molecules, preferably 5 to 10 molecules, more preferably about 15 molecules of methyl viologen molecules can be contained in one particle. In the case of particles containing 15 molecules of methyl viologen in one particle, the concentration of the methyl viologen in the particles is about 1.8 mM.
メチルビオロゲン（Methyl Viologen）は、パラコートとも呼ばれる、下記式で示される公知の化合物である。 Methyl viologen is a known compound represented by the following formula, also called paraquat.
当該メチルビオロゲンそれ自体は、蛍光を有さない無色透明な化合物であるが、これをシリカ粒子に保有させることにより、新たに下記（ａ）〜（ｃ）の特性を有するようになる。
（ａ）蛍光を有する
波長357nmの励起光を照射することによって、波長430nmの発光を生じる。
（ｂ）酸素存在下、紫外線照射することにより無色透明から黄色に変色する
なお、メチルビオロゲンそのものは無色透明であり、酸素存在下で紫外線照射しても色の変化は生じない。但し、酸素非存在下で紫外線照射すると無色透明から青色に変色する。
（ｃ）紫外線照射により励起／蛍光波長が長波長側にシフトする
後述する実施例１に示すように、紫外線（ピーク波長365nm）を照射すると、照射前の励起光／発光の極大ピーク波長（357nm／430nm）が、長波長側にシフトする。かかる長波長側へのシフト幅は、シリカ粒子に保有させるメチルビオロゲンの割合を変更することによって調整することができる。The methyl viologen itself is a colorless and transparent compound that does not have fluorescence. However, when the methyl viologen is contained in silica particles, the following properties (a) to (c) are newly obtained.
(A) Fluorescent light is emitted at a wavelength of 430 nm by irradiation with excitation light having a wavelength of 357 nm.
(B) It turns from colorless and transparent to yellow when irradiated with ultraviolet rays in the presence of oxygen Methylviologen itself is colorless and transparent, and no color change occurs even when irradiated with ultraviolet rays in the presence of oxygen. However, when it is irradiated with ultraviolet rays in the absence of oxygen, it turns from colorless and transparent to blue.
(C) Excitation / fluorescence wavelength shifts to longer wavelength side by UV irradiation As shown in Example 1 described later, when UV irradiation (peak wavelength 365 nm) is irradiated, the maximum peak wavelength (357 nm of excitation light / emission before irradiation) / 430 nm) shifts to the longer wavelength side. The shift width toward the long wavelength side can be adjusted by changing the proportion of methyl viologen held in the silica particles.
上記に示すように、本発明のメチルビオロゲン／SiO2粒子は、紫外線照射により可視光領域に蛍光を発するため、蛍光標識剤として有効に利用することができる。また、紫外線照射によって400〜500nmの範囲で連続的に蛍光波長を変化させることも可能であることから、400-500nmの蛍光に関して細胞等の波長選択的蛍光標識剤として有効に利用できると考えられる。As described above, the methyl viologen / SiO 2 particles of the present invention emit fluorescence in the visible light region when irradiated with ultraviolet rays, and thus can be effectively used as a fluorescent labeling agent. In addition, since it is possible to change the fluorescence wavelength continuously in the range of 400 to 500 nm by ultraviolet irradiation, it is considered that it can be effectively used as a wavelength-selective fluorescent labeling agent for cells and the like with respect to 400-500 nm fluorescence. .
さらに、メチルビオロゲンの還元体は、メチルビオロゲンラジカルと呼ばれ、生体内で容易に酸素分子を還元して活性酸素ラジカルを生じることが知られている（Bahnemann, D. W.; Fisher, C.-H.; Janata, E.; Henglein, A.; The Two-electron Oxidation of Methyl Viologen;J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1, 1987(83);pp2559-2571.）。 Furthermore, the reduced form of methyl viologen is called methyl viologen radical, and it is known that oxygen molecules are easily reduced in vivo to generate active oxygen radicals (Bahnemann, DW; Fisher, C.-H. Janata, E .; Henglein, A .; The Two-electron Oxidation of Methyl Viologen; J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1, 1987 (83); pp2559-2571.).
一般に、腫瘍の放射線治療は、γ線を腫瘍部に照射して腫瘍周辺にある水の放射線分解によって生じたラジカルや、γ線直接の高エネルギーによって、腫瘍を破壊するというものである。このときに、水だけでなく、本発明のメチルビオロゲン／SiO2粒子を腫瘍部に取り込ませておけば、照射されるγ線によって、水が分解して生成するラジカルに加えて、メチルビオロゲン／SiO2粒子に担持されているメチルビオロゲンが還元されて電子が貯まり、その還元力によって、腫瘍を攻撃することが可能になると考えられる。こうすることにより、通常のγ線照射量を低くすることが可能であり、γ線照射によって生じる副作用を低減できるものと考えられる。このように、本発明のメチルビオロゲン／SiO2粒子は、放射線治療におけるγ線照射の増感剤としての用途も期待される。Generally, tumor radiotherapy involves irradiating a tumor site with γ-rays to destroy the tumor by radicals generated by radiolysis of water around the tumor or high energy directly from γ-rays. At this time, if not only water but also the methyl viologen / SiO 2 particles of the present invention are taken into the tumor part, in addition to radicals generated by the decomposition of water by irradiated γ rays, methyl viologen / It is considered that methyl viologen carried on SiO 2 particles is reduced and accumulates electrons, and the reducing power makes it possible to attack the tumor. By carrying out like this, it is possible to make the normal amount of γ-ray irradiation low and to reduce the side effects caused by the γ-ray irradiation. Thus, the methyl viologen / SiO 2 particles of the present invention are expected to be used as a sensitizer for γ-ray irradiation in radiotherapy.
また、生体内で生じたラジカルを非侵襲に測定するための装置としてESR-CTが知られており、これを利用することによって、生きたままで生体内でのラジカルを追跡することができる。従って、例えば、メチルビオロゲン／SiO2粒子で、標的の薬物を標識することにより、その体内での代謝を観測することが可能である。また、放射線治療の際に生じたラジカルがどのように生成し消滅し、腫瘍を攻撃するか、あるいは、正常細胞がどのように攻撃されて副作用が起こるかについて、リアルタイムで観測するためにも利用することが可能である。Further, ESR-CT is known as a device for noninvasively measuring radicals generated in a living body, and by using this, radicals in a living body can be traced while living. Therefore, for example, by labeling a target drug with methyl viologen / SiO 2 particles, metabolism in the body can be observed. It can also be used to observe in real time how radicals generated during radiation therapy are generated and disappear, attack tumors, and how normal cells are attacked and cause side effects. Is possible.
本発明のメチルビオロゲン／SiO2粒子は、まずメチルビオロゲンを(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランと混合し、次いでシリカ粒子形成の触媒としてのアンモニア水溶液の存在下で、テトラエチルオルソシリケートと混合することによって製造することができる。The methyl viologen / SiO 2 particles of the present invention are prepared by first mixing methyl viologen with (3-thiocyanatopropyl) triethoxysilane, and then mixing with tetraethyl orthosilicate in the presence of an aqueous ammonia solution as a catalyst for silica particle formation. Can be manufactured by.
始めの工程として、メチルビオロゲンを(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランと混合する工程を採用することにより、シリカ粒子内にメチルビオロゲンを高濃度（例えば、粒径30nmのナノ粒子に15分子/粒子以上、好ましくは粒径20nmのナノ粒子に5分子/粒子以上の割合）に固定化することができる。かかる操作は、具体的には、メチルビオロゲンをジメチルスルホキシド溶液に溶解し、これと(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランとを混合することによって実施することができる。この場合、メチルビオロゲンと(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランとの配合割合として、例えば、メチルビオロゲン2.5 mgに対する(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランの配合割合として、通常0.5〜1μｌ、好ましくは1〜2μｌ、より好ましくは2.3μl程度の割合を例示することができる。また、これをモル比の割合で示すと、メチルビオロゲン１モルに対して使用される(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランの配合割合としては、通常0.5〜1モル、好ましくは1〜2モル、より好ましくは１モル程度を挙げることができる。 The first step is to mix methyl viologen with (3-thiocyanatepropyl) triethoxysilane, thereby increasing the concentration of methyl viologen in the silica particles (for example, 15 molecules / particles for 30 nm nanoparticles) As described above, it is possible to immobilize at a rate of 5 molecules / particle or more on nanoparticles having a particle diameter of 20 nm. Specifically, this operation can be performed by dissolving methyl viologen in a dimethyl sulfoxide solution and mixing it with (3-thiocyanatopropyl) triethoxysilane. In this case, the blending ratio of methylviologen and (3-thiocyanatepropyl) triethoxysilane, for example, the blending ratio of (3-thiocyanatepropyl) triethoxysilane to 2.5 mg of methylviologen is usually 0.5 to 1 μl, preferably 1 A ratio of about 2 μl, more preferably about 2.3 μl can be exemplified. Moreover, when this is shown by the ratio of molar ratio, as a compounding ratio of (3-thiocyanate propyl) triethoxysilane used with respect to 1 mol of methyl viologen, it is 0.5-1 mol normally, Preferably it is 1-2 mol, More preferably, about 1 mol can be mentioned.
ここで混合条件は特に制限されない。例えば混合時の温度として、通常室温を挙げることができる。その他の混合条件も特に制限されないが、攪拌しながら、20〜24時間程度、十分混合することが好ましい。 Here, the mixing conditions are not particularly limited. For example, normal temperature can be mentioned as temperature at the time of mixing. Other mixing conditions are not particularly limited, but it is preferable to mix well for about 20 to 24 hours while stirring.
次いで、得られた反応液をテトラエチルオルソシリケートと混合する。この場合の反応は、シリカ粒子を形成するためのテトラエチルオルソシリケートの重縮合反応であるが、この反応（シリカ粒子生成）は、触媒としてアンモニアの存在下で用いて行うことが好ましい。さらにかかる反応は、溶媒として含水アルコール、好ましくは含水エタノールの中で行うことが好ましい。ここで反応系のアルコール濃度として、制限されないが、好ましくは80容量％程度を挙げることができる。 Subsequently, the obtained reaction liquid is mixed with tetraethyl orthosilicate. The reaction in this case is a polycondensation reaction of tetraethylorthosilicate for forming silica particles, and this reaction (silica particle formation) is preferably performed in the presence of ammonia as a catalyst. Further, this reaction is preferably performed in a hydrous alcohol, preferably hydrous ethanol, as a solvent. Here, the alcohol concentration in the reaction system is not limited, but preferably about 80% by volume.
当該反応に使用するテトラエチルオルソシリケートの割合は、特に制限されないが、前工程で使用したメチルビオロゲンの量8.5μmol/mlに対して、400〜500倍、好ましくは500〜600倍、より好ましくは500〜550倍の割合で用いられることが好ましい。これをモル比で示すと、メチルビオロゲン１モルに対して使用されるテトラエチルオルソシリケートの配合割合として400〜500モル、好ましくは500〜600モル、より好ましくは500〜550モルを挙げることができる。 The ratio of tetraethyl orthosilicate used in the reaction is not particularly limited, but is 400 to 500 times, preferably 500 to 600 times, and more preferably 500 times the amount of methyl viologen used in the previous step 8.5 μmol / ml. It is preferably used at a ratio of ˜550 times. When this is shown by molar ratio, 400-500 mol, Preferably it is 500-600 mol, More preferably, 500-550 mol can be mentioned as a mixture ratio of the tetraethyl orthosilicate used with respect to 1 mol of methyl viologen.
かかる混合条件も特に制限されないが、例えば20〜25℃の条件下、攪拌しながら20〜24時間程度、十分混合する方法を例示することができる。 Such mixing conditions are not particularly limited, and examples thereof include a method of sufficiently mixing for 20 to 24 hours with stirring under conditions of 20 to 25 ° C.
次いで得られた反応液を、例えばメンブランフィルターをセットした限外濾過装置等を利用して固液分離し、また必要に応じて水で洗浄することにより、本発明のメチルビオロゲン／SiO2粒子を取得することができる。Next, the obtained reaction solution is subjected to solid-liquid separation using, for example, an ultrafiltration device in which a membrane filter is set, and washed with water as necessary, so that the methyl viologen / SiO 2 particles of the present invention can be obtained. Can be acquired.
（２）キシレノールオレンジ／SiO2粒子
本発明のキシレノールオレンジ／SiO2粒子は、シリカから形成される微粒子（シリカ粒子）に複数のキシレノールオレンジ分子が固定されてなるものである。固定化の態様は、シリカ粒子の内部にキシレノールオレンジ分子が取り込まれた形で存在していればよく、特に制限されるものではない。例えば、シリカ粒子の内部におけるキシレノールオレンジ分子の存在様式としては、（１）で説明したメチルビオロゲン／SiO2粒子と同様に、粒子を形成しているシリカ（SiO2）の層と層との間に、複数のキシレノールオレンジが存在している態様を例示することができるが、これに制限されるものではない。(2) xylenol orange / SiO 2 particles of xylenol orange / SiO 2 particles present invention has a plurality of xylenol orange molecules to the microparticle (silica particles) formed from silica is fixed. The mode of immobilization is not particularly limited as long as it exists in a form in which xylenol orange molecules are incorporated inside silica particles. For example, the existence mode of xylenol orange molecules inside the silica particles is similar to the methyl viologen / SiO 2 particles described in (1), and between the silica (SiO 2 ) layers forming the particles. In addition, an embodiment in which a plurality of xylenol oranges are present can be exemplified, but the present invention is not limited thereto.
本発明のキシレノールオレンジ／SiO2粒子の大きさは、特に制限されず、目的に応じて適宜調整することができる。例えば、後述するキシレノールオレンジ／SiO2粒子の製造方法において、アンモニア存在下でのテトラオルソシリケートとの反応回数を調整したり、また当該反応に使用するテトラオルソシリケートの濃度を調整することによって、キシレノールオレンジ／SiO2粒子を、数ｎｍから数百ｎｍといったナノオーダーの粒径（直径）を有するナノ粒子として調製したり、また数μｍから十数μｍといったマイクロオーダーの粒径（直径）を有するマイクロ粒子として調製したりと、所望に応じて自在にその粒径を調整することができる。好ましいキシレノールオレンジ／SiO2粒子は、直径がナノオーダーであるナノ粒子（シリカナノ粒子）であり、かかるナノ粒子として、例えば直径2〜1000nm、好ましくは直径2〜100nm、より好ましくは直径5〜60nm程度、さらにより好ましくは直径10〜40nm程度、一層好ましくは直径15〜30nm程度、特に好ましくは直径20〜30nm程度のシリカナノ粒子を挙げることができる。The size of the xylenol orange / SiO 2 particles of the present invention is not particularly limited and can be appropriately adjusted according to the purpose. For example, in the method for producing xylenol orange / SiO 2 particles, which will be described later, by adjusting the number of reactions with tetraorthosilicate in the presence of ammonia, or by adjusting the concentration of tetraorthosilicate used in the reaction, Orange / SiO 2 particles can be prepared as nanoparticles having a nano-order particle size (diameter) of several nanometers to several hundred nanometers, and micro particles having a micro-order particle diameter (diameter) of several μm to several tens of μm. When prepared as particles, the particle size can be freely adjusted as desired. Preferred xylenol orange / SiO 2 particles are nanoparticles having a nano-order diameter (silica nanoparticles). As such nanoparticles, for example, a diameter of 2 to 1000 nm, preferably a diameter of 2 to 100 nm, more preferably about 5 to 60 nm. Still more preferably, silica nanoparticles having a diameter of about 10 to 40 nm, more preferably about 15 to 30 nm, and particularly preferably about 20 to 30 nm can be mentioned.
なお、シリカ粒子内にはキシレノールオレンジ分子を複数含ませることが可能である。例えば、直径30nmのシリカナノ粒子を例にすると、その１粒子中には１〜10分子、好ましくは50〜150分子、より好ましくは100〜150分子、さらにより好ましくは112分子程度のキシレノールオレンジ分子を含めることができる。なお、１粒子中にキシレノールオレンジを112分子の割合で含有する粒子の場合、当該キシレノールオレンジの粒子内濃度は約13mMとなる。 The silica particles can contain a plurality of xylenol orange molecules. For example, when silica nanoparticles having a diameter of 30 nm are taken as an example, 1 to 10 molecules, preferably 50 to 150 molecules, more preferably 100 to 150 molecules, and even more preferably about 112 molecules of xylenol orange molecules are contained in one particle. Can be included. In the case of particles containing 112 molecules of xylenol orange in one particle, the concentration of xylenol orange in the particle is about 13 mM.
キシレノールオレンジは下記式で示される公知の化合物である。 Xylenol orange is a known compound represented by the following formula.
キシレノールオレンジはｐＨの変化に応じて異なる色を呈するという性質を有し（酸性下で黄色、アルカリ下で赤色を有する）、それ自体ｐＨ指示薬としての用途を有する化合物である。また、これをシリカナノ粒子に保有させることによっても、同様に下記（ｄ）に示す性質を有する：
（ｄ）酸性下（例えばｐＨ２）で黄色、アルカリ下（例えばｐＨ９）で赤色を呈する
当該本発明のキシレノールオレンジ／SiO2粒子は、前述するようにナノオーダーやマイクロオーダーの微粒子に調整することができ、しかもその内部にキシレノールオレンジをその性質を損なうことなく濃縮した形で包含させることができるため、従来キシレノールオレンジ単独使用では難しかった、マクロファージ内部や微小細胞ならびに微細組織などのマイクロ領域におけるｐＨの測定やｐＨの変化の測定に、ｐＨ指示薬として有効に利用することができる。
（ｅ）酸性下で、Ｆｅ3＋の存在により紫色を呈する
前述するように、キシレノールオレンジ／SiO2粒子は、酸性条件下で、例えばFe2＋が存在する場合であってもFe３＋非存在下では黄色を呈するが、Fe3＋の存在下ではFe3＋と配位して紫色を呈する。但し、アルカリ条件下では、Fe3＋の存在・非存在に関わらず赤色を呈している。Xylenol orange has a property of exhibiting different colors according to changes in pH (having yellow under acidic conditions and red under alkaline conditions), and is itself a compound having a use as a pH indicator. In addition, the silica nanoparticles have the same properties as shown in the following (d):
(D) Yellow under acidic conditions (for example, pH 2) and red under alkaline conditions (for example, pH 9) The xylenol orange / SiO 2 particles of the present invention can be adjusted to nano-order or micro-order fine particles as described above. In addition, since xylenol orange can be contained in a concentrated form without impairing its properties, it is difficult to use xylenol orange alone, and the pH in the micro area such as inside macrophages, microcells and fine tissues is difficult. It can be effectively used as a pH indicator for measurement and measurement of changes in pH.
(E) It appears purple due to the presence of Fe 3+ under acidic conditions. As described above, xylenol orange / SiO 2 particles are under acidic conditions, for example, in the absence of Fe 3+ even when Fe 2+ is present. Although yellow, it coordinates with Fe 3+ in the presence of Fe 3+ and appears purple. However, under alkaline conditions, the color is red regardless of the presence or absence of Fe 3+ .
かかる現象は、キシレノールオレンジをSiO2粒子に固定化することによって、Fe3＋に対する配位能力が増大したことによると考えられる。本発明のキシレノールオレンジ／SiO2粒子のこうした性質は、細胞等におけるFe3+の検出薬として利用することができる。Such a phenomenon is considered to be due to the fact that the coordination ability to Fe 3+ was increased by immobilizing xylenol orange on SiO 2 particles. These properties of the xylenol orange / SiO 2 particles of the present invention can be used as a detection agent for Fe 3+ in cells and the like.
また、本発明のキシレノールオレンジ／SiO2は、下記に説明するように、放射線感光用色素として放射線に係る個人被ばく管理・汚染管理・医療被曝管理、あるいは放射線線量計測のための化学線量計に利用することができる：
Fe2+を含む水溶液は、γ線照射されると、まず水の放射線分解が起こり、OHラジカルやHラジカル、水和電子など生成する。これらのラジカルは、溶存酸素と反応し、過酸化水素やOHラジカルを多く生成し、この中にFe2+が共存する場合には、これらが酸化剤となってFe2+をFe3+へと酸化する。従って、この酸化量（Fe2+→Fe3+）から、どれだけの放射線を受けたか、放射線の吸収線量を測定することができる。本発明のキシレノールオレンジ/SiO2粒子は、１つのSiO2粒子内にキシレノールオレンジ分子が高濃度に含まれているので（言い換えると、１粒子中にキシレノールオレンジが濃縮されて含まれている）、わずかの線量でFe2+から生じたFe3+を効果的に捕捉することができ、わずかの線量を色変化（黄色→紫）によって定性的にまた定量的に示すことが可能である。In addition, xylenol orange / SiO 2 of the present invention is used as a radiation-sensitive dye for chemical dosemeters for personal exposure management, contamination management, medical exposure management, or radiation dose measurement as radiation-sensitive dyes, as described below. can do:
When an aqueous solution containing Fe 2+ is irradiated with γ-rays, first, radiolysis of water occurs, generating OH radicals, H radicals, hydrated electrons, and the like. These radicals react with dissolved oxygen to generate a large amount of hydrogen peroxide and OH radicals. When Fe 2+ coexists in these, these act as oxidizing agents to convert Fe 2+ to Fe 3+ . And oxidize. Therefore, it is possible to measure the absorbed dose of radiation from the amount of oxidation (Fe 2+ → Fe 3+ ). Since the xylenol orange / SiO 2 particle of the present invention contains a high concentration of xylenol orange molecules in one SiO 2 particle (in other words, xylenol orange is concentrated and contained in one particle), Fe 3+ generated from Fe 2+ can be effectively captured with a small dose, and a slight dose can be qualitatively and quantitatively indicated by a color change (yellow → purple).
本発明のキシレノールオレンジ／SiO2粒子は、まずキシレノールオレンジを(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランと混合し、次いでシリカ粒子形成の触媒としてのアンモニア水溶液の存在下で、テトラエチルオルソシリケートと混合することによって製造することができる。The xylenol orange / SiO 2 particles of the present invention are prepared by first mixing xylenol orange with (3-thiocyanatepropyl) triethoxysilane, and then mixing with tetraethylorthosilicate in the presence of an aqueous ammonia solution as a catalyst for silica particle formation. Can be manufactured by.
始めの工程として、キシレノールオレンジを(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランと混合することにより、シリカ粒子内にキシレノールオレンジを高濃度（例えば、30nmのナノ粒子に112分子／粒子以上の割合で）に固定化することができる。かかる操作は、具体的には、キシレノールオレンジをジメチルスルホキシド溶液に溶解し、これと(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランとを混合することによって実施することができる。この場合、キシレノールオレンジと(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランとの配合割合として、例えばキシレノールオレンジ14μmol/mlに対して、(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランをモル比として0.5〜2、好ましくは0.5〜1.5、より好ましくは0.5程度の割合で混合する方法を挙げることができる。 As a first step, xylenol orange is mixed with (3-thiocyanatepropyl) triethoxysilane to increase the concentration of xylenol orange in silica particles (eg, at a rate of 112 molecules / particle or more per 30 nm nanoparticle). Can be immobilized. Specifically, this operation can be carried out by dissolving xylenol orange in a dimethyl sulfoxide solution and mixing it with (3-thiocyanatopropyl) triethoxysilane. In this case, as a blending ratio of xylenol orange and (3-thiocyanate propyl) triethoxysilane, for example, xylenol orange 14 μmol / ml, (3-thiocyanate propyl) triethoxysilane as a molar ratio is 0.5 to 2, preferably A method of mixing at a ratio of 0.5 to 1.5, more preferably about 0.5 can be mentioned.
ここで混合条件は特に制限されない。例えば混合時の温度として、通常室温を挙げることができる。その他の混合条件も特に制限されないが、攪拌しながら、20〜24時間程度、十分混合することが好ましい。 Here, the mixing conditions are not particularly limited. For example, normal temperature can be mentioned as temperature at the time of mixing. Other mixing conditions are not particularly limited, but it is preferable to mix well for about 20 to 24 hours while stirring.
次いで、得られた反応液をテトラエチルオルソシリケートと混合する。この場合の反応は、シリカ粒子を形成するためのテトラエチルオルソシリケートの重縮合反応であるが、この反応（シリカ粒子生成）は、触媒としてアンモニアの存在下で行うことが好ましい。さらにかかる反応は、溶媒として含水アルコール、好ましくは含水エタノールの中で行うことが好ましい。ここで反応系のアルコール濃度として、制限はされないが好ましくは80容量％程度を挙げることができる。 Subsequently, the obtained reaction liquid is mixed with tetraethyl orthosilicate. The reaction in this case is a polycondensation reaction of tetraethylorthosilicate for forming silica particles, but this reaction (silica particle formation) is preferably performed in the presence of ammonia as a catalyst. Further, this reaction is preferably performed in a hydrous alcohol, preferably hydrous ethanol, as a solvent. Here, the alcohol concentration in the reaction system is not limited, but is preferably about 80% by volume.
当該反応に使用するテトラエチルオルソシリケートの割合は、制限されないが、前工程で使用したキシレノールオレンジの量 7μmol/mlに対して、200〜500倍、好ましくは500〜700倍、より好ましくは600〜650倍の割合で用いられることが好ましい。これをモル比で示すと、キシレノールオレンジ１モルに対して使用されるテトラエチルオルソシリケートの配合割合として200〜500モル、好ましくは500〜700モル、より好ましくは600〜650モルを挙げることができる。 The ratio of tetraethyl orthosilicate used in the reaction is not limited, but is 200 to 500 times, preferably 500 to 700 times, more preferably 600 to 650, with respect to the amount of xylenol orange used in the previous step 7 μmol / ml. It is preferable to be used at a double ratio. When this is shown by molar ratio, 200-500 mol, Preferably it is 500-700 mol, More preferably, 600-650 mol can be mentioned as a mixture ratio of the tetraethyl orthosilicate used with respect to 1 mol of xylenol orange.
かかる混合条件も特に制限されないが、例えば20〜25℃の条件下、攪拌しながら20〜24時間程度、十分混合する方法を例示することができる。 Such mixing conditions are not particularly limited, and examples thereof include a method of sufficiently mixing for 20 to 24 hours with stirring under conditions of 20 to 25 ° C.
次いで得られた反応液を、例えばメンブランフィルターをセットした限外濾過装置等を利用して固液分離し、また必要に応じて水で洗浄することにより、本発明のキシレノールオレンジ／SiO2粒子を取得することができる。Next, the obtained reaction solution is subjected to solid-liquid separation using, for example, an ultrafiltration device on which a membrane filter is set, and washed with water as necessary, so that the xylenol orange / SiO 2 particles of the present invention can be obtained. Can be acquired.
（３）4-アミノTempo／SiO2粒子
本発明の4-アミノTempo／SiO2粒子は、シリカから形成される微粒子（シリカ粒子）に複数の4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)〔4-アミノTempo〕分子が固定化されてなるものである。固定化の態様は、シリカナノ粒子の内部に4-アミノTempo分子が取り込まれた形で存在していればよく、特に制限されるものではない。例えば、シリカナノ粒子の内部における4-アミノTempo分子の存在様式としては、（１）で説明したメチルビオロゲン／SiO2粒子と同様に、粒子を形成しているSiO2の層と層との間に、複数の4-アミノTempo存在している態様を例示することができるが、これに制限されるものではない。(3) 4-Amino Tempo / 4-Tempo / SiO 2 particles of SiO 2 particles present invention, a plurality of the fine particles (silica particles) formed from silica 4-amino - (2,3,6,6- Tetramethyl-1-piperidinyloxy) [4-aminoTempo] molecule is immobilized. The immobilization mode is not particularly limited as long as the 4-amino Tempo molecule is incorporated inside the silica nanoparticles. For example, the presence mode of 4-amino Tempo molecules inside silica nanoparticles is similar to the methyl viologen / SiO 2 particles described in (1), between the SiO 2 layers forming the particles. An embodiment in which a plurality of 4-amino Tempo is present can be exemplified, but is not limited thereto.
本発明の4-アミノTempo／SiO2粒子の大きさは、特に制限されず、目的に応じて適宜調整することができる。例えば、後述する4-アミノTempo／SiO2粒子の製造方法において、
アンモニア存在下でのテトラオルソシリケートとの反応回数を調整したり、また当該反応に使用するテトラオルソシリケートの濃度を調整することによって、4-アミノTempo／SiO2粒子を、数ｎｍから数百ｎｍといったナノオーダーの粒径（直径）を有するナノ粒子として調製したり、また数μｍから十数μｍといったマイクロオーダーの粒径（直径）を有するマイクロ粒子として調製したりと、所望に応じて自在にその粒径を調整することができる。好ましい4-アミノTempo／SiO2粒子は、直径がナノオーダーであるナノ粒子（シリカナノ粒子）であり、かかるナノ粒子として、例えば直径2〜1000nm、好ましくは直径2〜100nm、より好ましくは直径5〜60nm程度、さらにより好ましくは直径10〜40nm程度、一層好ましくは直径15〜30nm程度、特に好ましくは直径20〜30nm程度のシリカナノ粒子を挙げることができる。The size of the 4-amino Tempo / SiO 2 particles of the present invention is not particularly limited and can be appropriately adjusted according to the purpose. For example, in the method for producing 4-amino Tempo / SiO 2 particles described below,
By adjusting the number of times of reaction with tetraorthosilicate in the presence of ammonia, or by adjusting the concentration of tetraorthosilicate used in the reaction, 4-amino Tempo / SiO 2 particles are changed from several nm to several hundred nm. It can be prepared as nanoparticles having a nano-order particle size (diameter), or as micro-particles having a micro-order particle size (diameter) of several μm to several tens of μm, as desired. The particle size can be adjusted. Preferred 4-amino Tempo / SiO 2 particles are nanoparticles (silica nanoparticles) having a diameter of the order of nanometers, and as such nanoparticles, for example, a diameter of 2 to 1000 nm, preferably a diameter of 2 to 100 nm, more preferably a diameter of 5 to Examples thereof include silica nanoparticles having a diameter of about 60 nm, more preferably about 10 to 40 nm, more preferably about 15 to 30 nm, and particularly preferably about 20 to 30 nm.
なお、シリカ粒子内には4-アミノTempo分子を複数含ませることが可能である。例えば、直径30nmのシリカナノ粒子を例にすると、その１粒子中には、１〜100分子、好ましくは100〜200分子、より好ましくは150分子程度の4-アミノTempo分子を含めることができる。なお、１粒子中に4-アミノTempoを150分子の割合で含有する粒子の場合、当該4-アミノTempoの粒子内濃度は約17mMとなる。 The silica particles can contain a plurality of 4-amino Tempo molecules. For example, taking silica nanoparticles having a diameter of 30 nm as an example, one particle can contain 1 to 100 molecules, preferably 100 to 200 molecules, more preferably about 150 molecules of 4-amino Tempo molecules. In the case of particles containing 4-amino Tempo at a ratio of 150 molecules in one particle, the intra-particle concentration of 4-amino Tempo is about 17 mM.
4-アミノTempo（4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)）は下記式で示される公知の化合物である。 4-Amino Tempo (4-amino- (2,3,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy)) is a known compound represented by the following formula.
当該4-アミノTempo分子はラジカル分子であり、それ自体、標識試薬としての用途を有する化合物である。本発明の4-アミノTempo／SiO2粒子は、シリカ粒子内に、4-アミノTempo分子をラジカル分子として安定に、またシリカ層内でそれを保護する状態で保有することによって下記（ｆ）に示す性質を有する：
（ｆ）ラジカルを有する
4-アミノTempo／SiO2粒子のこうした性質は、生体内にラジカルを投与する場合に、ラジカルの酸化や消失を防ぎ、有効な標識物質として利用することができる。The 4-amino Tempo molecule is a radical molecule, and as such is a compound having use as a labeling reagent. The 4-amino Tempo / SiO 2 particles of the present invention are retained in the following (f) by having 4-amino Tempo molecules stably as radical molecules in the silica particles and protecting them in the silica layer. Has the following properties:
(F) having radicals
These properties of 4-amino Tempo / SiO 2 particles can prevent oxidation and disappearance of radicals and can be used as an effective labeling substance when radicals are administered in vivo.
本発明の4-アミノTempo／SiO2粒子は、まず4-アミノTempoを（3-チオシアネートプロピル）トリエトキシシランと混合し、次いでシリカ粒子形成の触媒としてのアンモニア水溶液の存在下で、テトラエチルオルソシリケートと混合することによって製造することができる。The 4-amino Tempo / SiO 2 particles of the present invention are prepared by first mixing 4-amino Tempo with (3-thiocyanatopropyl) triethoxysilane, and then tetraethylorthosilicate in the presence of aqueous ammonia as a catalyst for silica particle formation. It can be manufactured by mixing with.
始めの工程として、4-アミノTempoを、(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランと混合することにより、シリカ粒子内に4-アミノTempoを高濃度（例えば、30nmの粒子として150分子／粒子以上の割合で）に固定化することができる。かかる操作は、具体的には、4-アミノTempoをジメチルスルホキシド溶液に溶解し、これと(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランとを混合することによって実施することができる。この場合、4-アミノTempoと(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランとの配合割合として、例えば、4-アミノTempo分子7μmol/mlに対して、(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランをモル比で0.5〜2、好ましくは0.5〜1.5、より好ましくは１程度の割合で混合する方法を挙げることができる。 As a first step, 4-amino Tempo is mixed with (3-thiocyanatepropyl) triethoxysilane to give a high concentration of 4-amino Tempo in the silica particles (for example, more than 150 molecules / particle as 30 nm particles). Can be immobilized in proportions). Specifically, such an operation can be carried out by dissolving 4-amino Tempo in a dimethyl sulfoxide solution and mixing it with (3-thiocyanatopropyl) triethoxysilane. In this case, as a mixing ratio of 4-amino Tempo and (3-thiocyanate propyl) triethoxysilane, for example, (3-thiocyanate propyl) triethoxysilane in a molar ratio with respect to 4-amino Tempo molecule 7 μmol / ml. A method of mixing at a ratio of 0.5 to 2, preferably 0.5 to 1.5, more preferably about 1 can be mentioned.
ここで混合条件は特に制限されない。例えば混合時の温度として、通常室温を挙げることができる。その他の混合条件も特に制限されないが、攪拌しながら、20〜24時間程度、十分混合することが好ましい。 Here, the mixing conditions are not particularly limited. For example, normal temperature can be mentioned as temperature at the time of mixing. Other mixing conditions are not particularly limited, but it is preferable to mix well for about 20 to 24 hours while stirring.
次いで、得られた反応液をテトラエチルオルソシリケートと混合する。この場合の反応は、シリカ粒子を形成するためのテトラエチルオルソシリケートの重縮合反応であるが、この反応（シリカ粒子生成）は、触媒としてアンモニアの存在下で行うことが好ましい。さらにかかる反応は、溶媒として含水アルコール、好ましくは含水エタノールの中で行うことが好ましい。ここで反応系のアルコール濃度として、制限されないが、好ましくは80容量％程度を挙げることができる。 Subsequently, the obtained reaction liquid is mixed with tetraethyl orthosilicate. The reaction in this case is a polycondensation reaction of tetraethylorthosilicate for forming silica particles, but this reaction (silica particle formation) is preferably performed in the presence of ammonia as a catalyst. Further, this reaction is preferably performed in a hydrous alcohol, preferably hydrous ethanol, as a solvent. Here, the alcohol concentration in the reaction system is not limited, but preferably about 80% by volume.
当該反応に使用するテトラエチルオルソシリケートの割合は、制限されないが、前工程で使用した4-アミノTempoの量 7μmol/mlに対して、200〜400倍、好ましくは400〜550倍、より好ましくは550〜600倍の割合で用いられることが好ましい。これをモル比で示すと、4-アミノTempo１モルに対して使用されるテトラエチルオルソシリケートの配合割合として200〜400モル、好ましくは400〜550モル、より好ましくは550〜600モルを挙げることができる。 The proportion of tetraethyl orthosilicate used in the reaction is not limited, but is 200 to 400 times, preferably 400 to 550 times, more preferably 550 times, with respect to the amount of 4-amino Tempo used in the previous step 7 μmol / ml. It is preferably used at a rate of ˜600 times. When this is shown by molar ratio, 200 to 400 mol, preferably 400 to 550 mol, more preferably 550 to 600 mol can be mentioned as the proportion of tetraethyl orthosilicate used per 1 mol of 4-amino Tempo. .
かかる混合条件も特に制限されないが、例えば20〜25℃の条件下、攪拌しながら20〜24時間程度、十分混合する方法を例示することができる。 Such mixing conditions are not particularly limited, and examples thereof include a method of sufficiently mixing for 20 to 24 hours with stirring under conditions of 20 to 25 ° C.
次いで得られた反応液を、例えばメンブランフィルターをセットした限外濾過装置等を利用して固液分離し、また必要に応じて水で洗浄することにより、本発明の4-アミノTempo／SiO2粒子を取得することができる。Subsequently, the obtained reaction solution is subjected to solid-liquid separation using, for example, an ultrafiltration device in which a membrane filter is set, and washed with water as necessary, whereby the 4-amino Tempo / SiO 2 of the present invention is obtained. Particles can be acquired.
本発明によれば、メチルビオロゲン、キシレノールオレンジ、または4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)を、シリカ粒子中に安定に、また高濃度に、保持させることができ、その結果、上記各分子単品では得られなかった新しい機能または特性を得ることが可能となった。 According to the present invention, methylviologen, xylenol orange, or 4-amino- (2,3,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy) is stably and highly concentrated in silica particles. As a result, it became possible to obtain new functions or properties that could not be obtained with the above-mentioned individual molecules.
以下に、本発明の構成ならびに効果をより明確にするために、実施例を記載する。但し本発明は、これらの実施例に何ら影響されるものではない。 Hereinafter, examples will be described in order to clarify the configuration and effects of the present invention. However, the present invention is not affected by these examples.
メチルビオロゲンを含有するシリカ粒子（メチルビオロゲン／SiO 2 粒子）
（１）メチルビオロゲンｎ水和物（和光純薬工業株式会社製）2.1mgを、１mlのジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、これに、(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシラン〔(3-Thiocyanatopropyl)triethoxy silane〕原液をDMSOで10倍に希釈した溶液 18μlを混合して、約25℃で約１時間混合した。次いでこの反応溶液１mlに、エタノール3ml、テトラエチルオルソシリケート（TEOS）0.1ml、 蒸留水1ml、及び 30容量％ アンモニア水溶液 0.1mlを加えて、約25℃で約１日中攪拌しながら混合した。その後、得られた反応液を、Amicon YM-100メンブランフィルター（Amicon社製、孔径:15nm）をセットした限外ろ過装置を利用して濾過して、メチルビオロゲン／SiO2粒子（粒径：20〜30nm）を濾取し、これを蒸留水で洗浄した。 Silica particles containing methyl viologen (methyl viologen / SiO 2 particles)
(1) 2.1 mg of methyl viologen n hydrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in 1 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO), and (3-thiocyanatopropyl) triethoxysilane [(3-Thiocyanatopropyl ) triethoxy silane] stock solution diluted 10 times with DMSO was mixed with 18 μl and mixed at about 25 ° C. for about 1 hour. Next, 3 ml of ethanol, 0.1 ml of tetraethylorthosilicate (TEOS), 1 ml of distilled water, and 0.1 ml of 30% by volume aqueous ammonia solution were added to 1 ml of this reaction solution, and the mixture was stirred at about 25 ° C. for about 1 day. Thereafter, the obtained reaction solution was filtered using an ultrafiltration device in which an Amicon YM-100 membrane filter (Amicon, pore size: 15 nm) was set, and methyl viologen / SiO 2 particles (particle size: 20 ˜30 nm) was collected by filtration and washed with distilled water.
（２）得られたメチルビオロゲン／SiO2粒子を水で30倍に希釈した水溶液の260nmの吸光度を測定したところ、吸光度0.072であった。分子吸光係数が204170であることから、濃度は10.5μMとなる。この溶液が20ml得られたので、20mlあたり0.21μmolとなる。したがって、30nmの粒子としてその粒子内のメチルビオロゲン濃度は、約1.8mMである。いままでに、このような濃度でメチルビオロゲン分子をシリカナノ粒子に固定された例は知られていない。(2) The absorbance at 260 nm of an aqueous solution obtained by diluting the obtained methyl viologen / SiO 2 particles 30 times with water was 0.072. Since the molecular extinction coefficient is 204170, the concentration is 10.5 μM. Since 20 ml of this solution was obtained, it becomes 0.21 μmol per 20 ml. Therefore, the methyl viologen concentration in the 30 nm particles is about 1.8 mM. To date, no example has been known in which methylviologen molecules are immobilized on silica nanoparticles at such concentrations.
（３）原料に使用したメチルビオロゲンは蛍光を発しない物質であるのに対し、上記で得られたメチルビオロゲン／SiO2粒子は蛍光を有しており、スリット幅（Ex/Em）=5/5nmで、励起光357nmで430nmにブロードな発光が観測された。このことから、メチルビオロゲン／SiO2粒子は、それ自体蛍光物質として有用であり、例えば、紫外線照射により可視光領域に蛍光を発する蛍光標識等として利用できると考えられる。(3) The methyl viologen used as a raw material is a substance that does not emit fluorescence, whereas the methyl viologen / SiO 2 particles obtained above have fluorescence, and the slit width (Ex / Em) = 5 / Broad emission was observed at 430 nm with excitation light of 357 nm at 5 nm. From this, it is considered that methyl viologen / SiO 2 particles are useful as a fluorescent substance per se, and can be used as, for example, a fluorescent label that emits fluorescence in the visible light region when irradiated with ultraviolet rays.
（４）次いで、このメチルビオロゲン／SiO2粒子の30倍希釈水溶液に、500W超高圧水銀ランプ(Ushio-500)を用いて、紫外線を約10分間照射した後、再び蛍光を測定した。すると、上記水溶液が黄色に着色し、表１及び図２に示すように、励起光および発光波長がいずれも長波長側にシフトしていることが観察された。(4) Next, this methyl viologen / SiO 2 particle 30-fold diluted aqueous solution was irradiated with ultraviolet rays for about 10 minutes using a 500 W ultra-high pressure mercury lamp (Ushio-500), and then fluorescence was measured again. Then, it was observed that the aqueous solution was colored yellow and both the excitation light and the emission wavelength were shifted to the long wavelength side as shown in Table 1 and FIG.
このように、メチルビオロゲン／SiO2粒子に紫外線照射することで蛍光波長が長波長（低エネルギー側）にシフトすることから、メチルビオロゲン／SiO2粒子内には、メチルビオロゲン分子の重なりが起こり、生じた電子が非局在化していると考えられる。限定されるものではないが、上記で得られたメチルビオロゲン／SiO2粒子は、図１に示すように、複数のメチルビオロゲン分子が、SiO2が形成する層の間に内包されて、粒子を形成していると考えられる。In this way, since the fluorescence wavelength shifts to a long wavelength (low energy side) by irradiating methyl viologen / SiO 2 particles with ultraviolet rays, methyl viologen molecules overlap in the methyl viologen / SiO 2 particles, The generated electrons are considered to be delocalized. Although not limited thereto, the methyl viologen / SiO 2 particles obtained above are composed of a plurality of methyl viologen molecules encapsulated between layers formed by SiO 2 as shown in FIG. It is thought that it has formed.
また、かかるメチルビオロゲン／SiO2粒子は、内包させるメチルビオロゲン分子の量を変えることで、紫外線照射後の蛍光波長のシフト波長が変わるとともに１粒子あたりの電子の補足量も増加し得るので、例えば、400-500nmの蛍光に関して細胞等の波長選択的蛍光標識として有効に利用できると考えられる。In addition, by changing the amount of methyl viologen molecules to be included in the methyl viologen / SiO 2 particles, the fluorescence wavelength shift wavelength after ultraviolet irradiation can be changed and the amount of electrons captured per particle can be increased. Therefore, it is considered that the fluorescence of 400-500 nm can be effectively used as a wavelength selective fluorescent label for cells and the like.
キシレノールオレンジを含有するシリカナノ粒子（キシレノールオレンジ／SiO 2 粒子）
（１）キシレノールオレンジ（Aldrich社製）2.1mgを、2mlのジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、これに、(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシラン〔(3-Thiocyanatopropyl)triethoxy silane〕原液を3.8μl混合して、反応液中に含まれるキシレノールオレンジ：(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランの重量比が２：１になるように調整した。これを約25℃で約１時間攪拌混合した。次いでこの反応溶液 2mlに、エタノール 6ml、 テトラエチルオルソシリケート（TEOS）0.1ml、 蒸留水2ml、及び 30容量％ アンモニア水溶液 0.2mlを加えて、約25℃で約１日中攪拌しながら混合した。その後、得られた反応液を、Amicon YM-100メンブランフィルター（Amicon社製、孔径：15nm）をセットした限外ろ過装置を利用して濾過して、キシレノールオレンジ／SiO2粒子（粒径20〜30nm）を濾取し、これを蒸留水で洗浄した。なお、限定されるものではないが、得られたキシレノールオレンジ／SiO2粒子は、メチルビオロゲン／SiO2粒子と同様に、SiO2が層をなして形成する粒子の各層の間に、複数のキシレノールオレンジ分子が内包されてなる形態を有していると考えられる。 Silica nanoparticles containing xylenol orange (xylenol orange / SiO 2 particles)
(1) 2.1 mg of xylenol orange (manufactured by Aldrich) is dissolved in 2 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO), and 3.8 μl of (3-thiocyanatopropyl) triethoxysilane stock solution is added to this solution The mixture was mixed so that the weight ratio of xylenol orange: (3-thiocyanatepropyl) triethoxysilane contained in the reaction solution was 2: 1. This was stirred and mixed at about 25 ° C. for about 1 hour. Next, 6 ml of ethanol, 0.1 ml of tetraethylorthosilicate (TEOS), 2 ml of distilled water, and 0.2 ml of 30% by volume ammonia aqueous solution were added to 2 ml of this reaction solution, and mixed at about 25 ° C. with stirring for about one day. Thereafter, the obtained reaction solution was filtered using an ultrafiltration device in which an Amicon YM-100 membrane filter (Amicon, pore size: 15 nm) was set, and xylenol orange / SiO 2 particles (particle size 20 to 20). 30 nm) was collected by filtration and washed with distilled water. Although not limited, the obtained xylenol orange / SiO 2 particles are composed of a plurality of xylenols between each layer of particles formed by SiO 2 in the same manner as methyl viologen / SiO 2 particles. It is considered to have a form in which orange molecules are encapsulated.
（２）得られたキシレノールオレンジ／SiO2粒子を水で10倍に希釈した水溶液の578nmの吸光度を測定したところ、2.173であった（図３）。分子吸光係数が47000であることから、0.462 mMのキシレノールオレンジ分子がシリカ粒子内に固定されたこと、すなわち原料として使用したキシレノールオレンジの約6.6％がシリカ粒子内に固定されたことが確認された。したがって、30nmの粒子としてその粒子内のキシレノールオレンジ分子濃度は、約13mMとなる。いままでに、このような濃度でキシレノールオレンジ分子をシリカナノ粒子に固定された例は知られていない。(2) The absorbance at 578 nm of an aqueous solution obtained by diluting the resulting xylenol orange / SiO 2 particles 10 times with water was 2.173 (FIG. 3). Since the molecular extinction coefficient was 47000, it was confirmed that 0.462 mM xylenol orange molecule was fixed in silica particles, that is, about 6.6% of xylenol orange used as a raw material was fixed in silica particles. . Therefore, the xylenol orange molecular concentration in the 30 nm particles is about 13 mM. Until now, there is no known example in which xylenol orange molecules are immobilized on silica nanoparticles at such a concentration.
（３）上記のキシレノールオレンジ／SiO2粒子の10倍希釈水溶液は、原料として用いたキシレノールオレンジと同様に、酸性条件下（pH＜7）で黄色、アルカリ条件下（pH＞７）で赤色を呈した。キシレノールオレンジは、それ自体ｐＨ指示薬であるが（酸性条件下で黄色、アルカリ条件下で赤色を示す）、上記のことから、キシレノールオレンジは、SiO2に担持されて濃縮された状態でもｐＨ指示薬として使用できることが確認できた。さらに、SiO2に担持させることによって、キシレノールオレンジをそのまま使用する場合では難しかった、特定領域のpH測定（例えば水溶液中に分散された物質あるいは細胞などの内部のpH測定）に使用することが可能である。このことから本発明のキシレノールオレンジ／SiO2粒子によれば、例えばマクロファージ等の生体内の微小組織内のｐＨを測定することも可能と考えられる。(3) The above 10-fold diluted aqueous solution of xylenol orange / SiO 2 particles is yellow under acidic conditions (pH <7) and red under alkaline conditions (pH> 7), similar to xylenol orange used as a raw material. Presented. Xylenol orange itself is a pH indicator (shows yellow under acidic conditions and red under alkaline conditions). From the above, xylenol orange is a pH indicator even when it is supported on SiO 2 and concentrated. It was confirmed that it could be used. Furthermore, by supporting it on SiO 2 , it can be used for pH measurement in a specific region (for example, internal pH measurement of substances dispersed in an aqueous solution or cells), which was difficult when using xylenol orange as it is. It is. From this, it is considered that the xylenol orange / SiO 2 particles of the present invention can also measure the pH in a living tissue such as macrophages.
（４）前述するように、キシレノールオレンジ／SiO2粒子の10倍希釈水溶液は、酸性条件下（pH＜7）で黄色を示した。次いで、この中にFe3＋を添加したところ、紫色に色が変化した。キシレノールオレンジ／SiO2粒子のこの現象を利用することによって、SiO2で保護されたキシレノールオレンジによって細胞中等のFe3+を検出することが可能である。(4) As described above, a 10-fold diluted aqueous solution of xylenol orange / SiO 2 particles showed a yellow color under acidic conditions (pH <7). Next, when Fe 3+ was added thereto, the color changed to purple. By utilizing this phenomenon of xylenol orange / SiO 2 particles, it is possible to detect Fe 3+ in cells by xylenol orange protected with SiO 2 .
（５）キシレノールオレンジ／シリカ粒子の水溶液0.4ml、10mMの硫酸アンモニウム鉄（II）(1N)水溶液0.1ml、及び1N 硫酸0.1mlを混合して、Fe2+／キシレノールオレンジ／SiO2試薬の水溶液（酸性、ｐＨ２、黄色）を調製した。次いで、このFe2+／キシレノールオレンジ／SiO2試薬水溶液に、室温でγ線を約10Gy照射（60-Coγ線照射装置で30分間照射）した。すると、上記水溶液が黄色から紫色へと色変化することが観測された。この色変化は、γ線照射によって水溶液中のFe2+が酸化されて生成したFe3+が、キシレノールオレンジに配位したことによって生じたものと思われる。また、600nmにおける吸光度を測定したところ、γ線照射による色変化によって、当該吸光度が約0.15増大することがわかった（図４、スペクトルｂからスペクトルａに変化）。以上のことから、キシレノールオレンジをシリカナノ粒子に固定した本発明のキシレノールオレンジ／SiO2粒子を利用することによって、γ線照射に伴って生じる吸光度変化が観測できることが判明した。(5) 0.4 ml of aqueous solution of xylenol orange / silica particles, 0.1 ml of 10 mM aqueous solution of ammonium iron (II) sulfate (1N), and 0.1 ml of 1N sulfuric acid were mixed to prepare an aqueous solution of Fe 2+ / xylenol orange / SiO 2 reagent ( Acid,
次いで、キシレノールオレンジ／シリカ粒子の水溶液0.4mlまたは0.2mlと、10mMの硫酸アンモニウム鉄(II)(1N)水溶液0.1ml、1N 硫酸0.1ml、及び蒸留水0.6〜2.4mlを混合してFe2+／キシレノールオレンジ／SiO2試薬の水溶液（酸性、ｐＨ２、黄色）を調製した後、これに0.2g/mlのゼラチンを1ml〜3mlの割合で配合し、これらの水溶液にγ線を約10Gy照射した（60-Coγ線照射装置で30分間照射）。その結果、上記と同様に、γ線照射によりFe2+の酸化により生じたFe3+がキシレノールオレンジに配位することにより色変化（黄色から紫色への変化）が観測できた。またこの色変化を吸光度測定によって観察したところ、0.2g/mlのゼラチンを1ml配合した場合に、紫色の吸光度が最大に変化することが確認された（586nmで1.329の吸光度）。この値から、本発明のキシレノールオレンジ／シリカ粒子によると、照射後のキシレノールオレンジの吸光度について、文献〔Radiation Physics and Chemistry, 61 (2001) 433-435〕の約1.2倍の感度が得られたことがわかった（図５）Next, 0.4 ml or 0.2 ml of an aqueous solution of xylenol orange / silica particles was mixed with 0.1 ml of 10 mM ammonium iron (II) sulfate (1N) aqueous solution, 0.1 ml of 1N sulfuric acid, and 0.6 to 2.4 ml of distilled water to obtain Fe 2+ / After preparing an aqueous solution of xylenol orange / SiO 2 reagent (acidic,
4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)を含有するシリカナノ粒子〔4-アミノTempo／SiO 2 粒子〕
（１）4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)〔以下、「4-アミノTempo」という〕（Aldrich社製）0.9mgを、1mlのジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、これに、(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシラン〔(3-Thiocyanatopropyl)triethoxy silane〕原液をDMSOで10倍に希釈した溶液 18μlと混合して、これを約25℃で約１時間攪拌混合した。次いでこの反応溶液 0.05mlに、エタノール3.95ml、テトラエチルオルソシリケート（TEOS）0.05ml、 蒸留水1ml、及び 30容量％ アンモニア水溶液 0.1mlを加えて、約25℃で約１日中攪拌しながら混合した。その後、得られた反応液を、Amicon YM-100メンブランフィルター（Amicon社製、孔径：15nm）をセットした限外ろ過装置を利用して濾過して、4-アミノTempo／SiO2粒子（粒径：20〜30nm）を濾取し、これを蒸留水で洗浄した。 Silica nanoparticles containing 4-amino- (2,3,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy) [4-amino Tempo / SiO 2 particles]
(1) 0.9 mg of 4-amino- (2,3,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy) [hereinafter referred to as “4-amino Tempo”] (manufactured by Aldrich), 1 ml of dimethyl sulfoxide Dissolved in (DMSO), this was mixed with 18 μl of a (3-thiocyanatopropyl) triethoxysilane ((3-Thiocyanatopropyl) triethoxysilane) stock solution diluted 10-fold with DMSO, and this was mixed at about 25 ° C. Stir and mix for about 1 hour. Next, 3.95 ml of ethanol, 0.05 ml of tetraethylorthosilicate (TEOS), 1 ml of distilled water, and 0.1 ml of 30% by volume ammonia aqueous solution were added to 0.05 ml of this reaction solution, and mixed at about 25 ° C. with stirring for about one day. . Thereafter, the obtained reaction solution was filtered using an ultrafiltration apparatus in which an Amicon YM-100 membrane filter (Amicon, pore size: 15 nm) was set, and 4-amino Tempo / SiO 2 particles (particle size) : 20-30 nm) was collected by filtration and washed with distilled water.
（２）得られた4-アミノTempo／SiO2粒子を蒸留水に分散してコロイド状態に調製し、このうち170μlを水溶液測定用石英製扁平セル（JEOL DATUM LC12）に採取して、室温下で電子スピン共鳴（ESR）スペクトルを測定した（日本電子株式会社製のJEOL TE-300 [X-band] 使用）。結果を図６に示す。(2) The obtained 4-amino Tempo / SiO 2 particles are dispersed in distilled water to prepare a colloidal state. Of this, 170 μl is collected in a quartz flat cell for measuring aqueous solution (JEOL DATUM LC12) and kept at room temperature. Were used to measure electron spin resonance (ESR) spectra (using JEOL TE-300 [X-band] manufactured by JEOL Ltd.). The results are shown in FIG.
図６に示すように、ピーク間隔は17.2gaussであり、4-アミノTempoそのものを同様に測定した場合のピーク間隔（15gauss）よりも少し大きくなっていた。これは、ラジカル（4-アミノTempo）の自由回転が抑えられていること、すなわち4-アミノTempo がSiO2に固定化されていることを示唆するものである。限定されるものではないが、これらのことから、得られた4-アミノTempo／SiO2粒子は、メチルビオロゲン／SiO2粒子と同様に、SiO2が層を成して形成する粒子の、当該各層の間に、複数の4-アミノTempo分子が内包され固定化されてなる形態を有していると考えられる。As shown in FIG. 6, the peak interval was 17.2 gauss, which was slightly larger than the peak interval (15 gauss) when 4-amino Tempo itself was measured in the same manner. This suggests that the free rotation of the radical (4-amino Tempo) is suppressed, that is, 4-amino Tempo is immobilized on SiO 2 . Although not limited thereto, the obtained 4-amino Tempo / SiO 2 particles are similar to methyl viologen / SiO 2 particles, and the particles of SiO 2 are formed in layers. It is considered that a plurality of 4-amino Tempo molecules are encapsulated and immobilized between each layer.
従来、生体内にラジカル（4-アミノTempo）を投与した場合に、生体内では酸化されたり、シグナルを消失するという問題があったが、本発明によれば、前述するようにラジカル（4-アミノTempo）を、SiO2粒子に安定に固定化できることから、こうした問題を生じることなく、ラジカル信号を観測することができる。このことから、4-アミノTempo／SiO2粒子は、生体内での薬物代謝等の動態を評価するための標識試薬として有効に利用できるものと考えられる。Conventionally, when a radical (4-amino Tempo) is administered in vivo, there is a problem that it is oxidized in the living body or a signal disappears. However, according to the present invention, as described above, the radical (4-aminotempo) is lost. Since amino Tempo) can be stably immobilized on SiO 2 particles, radical signals can be observed without causing such problems. From this, it is considered that 4-amino Tempo / SiO 2 particles can be effectively used as a labeling reagent for evaluating kinetics such as drug metabolism in vivo.
Claims (1)
シリカ粒子内に、上記メチルビオロゲン、キシレノールオレンジ、及び4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)よりなる群から選択される１種の化合物を含有してなる機能性シリカ粒子の製造方法。One compound selected from the group consisting of methyl viologen, xylenol orange, and 4-amino- (2,3,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy) is added to (3-thiocyanatopropyl) tri Mixing with ethoxysilane and then mixing with tetraethylorthosilicate in the presence of ammonia,
Silica particles contain one compound selected from the group consisting of methyl viologen, xylenol orange, and 4-amino- (2,3,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy). A method for producing functional silica particles.
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