JP4810638B2 - Antibacterial oligosaccharide and method for producing the same - Google Patents

Description

本発明は、抗菌性オリゴ糖、およびその製造方法に関するものである。   The present invention relates to an antibacterial oligosaccharide and a method for producing the same.

ヒトの赤血球は無核であり、溶血などの操作で比較的簡単に血球膜が単離できる。そのため生体膜の材料としてよく研究が行われているが、哺乳類以外の鳥類や魚類の赤血球膜の研究は非常に少ない。その理由としてこれらの赤血球は有核であり、赤血球膜から核を除去する操作が困難を伴うからである。ヒトの赤血球膜中の糖タンパク質であるグリコホリンは１９６０年代から研究されているが、哺乳類以外では鳥類で若干行われたにすぎず、しかも検出が困難であるとされている。   Human erythrocytes are anucleate, and blood cell membranes can be isolated relatively easily by procedures such as hemolysis. For this reason, much research has been carried out as a material for biological membranes, but there are very few studies on erythrocyte membranes of birds and fish other than mammals. This is because these erythrocytes are nucleated, and it is difficult to remove the nuclei from the erythrocyte membrane. Glycophorin, a glycoprotein in the human erythrocyte membrane, has been studied since the 1960s, but it has only been used in birds except for mammals, and is difficult to detect.

魚類の場合は上述の理由と血液採取の困難さから、殆ど行われていないが、唯一ドイツMax-Planck研究所のRudloff博士のグループがニジマス血球膜中の糖タンパク質であるバンド３の研究を行っている。しかしながら、グリコホリンは検出が困難であったため、その存在は知られていなかった。ヒトグリコホリンは、病原性ウィルスの受容体、レクチンへの接着能など生体防御機能や血液型決定基などの種々の生理活性を有していると云われている。本発明者は、もし魚類赤血球膜にもグリコホリン様の物質が存在すれば、ヒトグリコホリンと同様の生理機能を持つ可能性があり、魚病の防止や抗生物質に頼らない新規な薬物の開発にもつながるのではないかと考えた。   In the case of fish, this is rarely done due to the reasons mentioned above and the difficulty in collecting blood, but only Dr. Rudloff's group at the Max-Planck Institute in Germany conducted a study on band 3, a glycoprotein in rainbow trout blood cell membranes. ing. However, since glycophorin was difficult to detect, its presence was not known. Human glycophorin is said to have various physiological activities such as a host defense function such as a pathogenic virus receptor, an ability to adhere to a lectin, and a blood group determinant. The present inventor has the possibility of having a physiological function similar to that of human glycophorin if a glycophorin-like substance is also present in a fish erythrocyte membrane, and development of a novel drug that does not depend on antibiotics or prevention of fish diseases. I thought it would lead to

特に、食の安全性やプロバイオティクスが注目されている現在において、抗生物質などの人工的な合成抗菌剤を用いて薬物残留の問題を引き起こすよりも、生体内由来の抗生物質が開発できれば問題解決につながると思われる。
古来より、コイの血液は日本の民間療法でも用いられており、何らかの生体防御機能が期待できる（例えば、特開2002-308789）。
特開２００２−３０８７８９号公報 In particular, when food safety and probiotics are currently attracting attention, it would be a problem if antibiotics derived in vivo could be developed rather than causing problems with drug residues using artificial synthetic antibacterial agents such as antibiotics. It seems to lead to a solution.
Since ancient times, carp blood has been used in Japanese folk remedies, and some biological defense function can be expected (for example, JP-A-2002-308789).
JP 2002-308789 A

しかしながら、コイ血液からの作用本体の分離精製については、従来には全く試みられていなかった。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、コイ血液中から分離精製された抗菌活性物質を提供すること、及びその精製方法を提供することにある。 However, no attempt has been made to separate and purify the action body from carp blood.
The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide an antibacterial active substance separated and purified from carp blood, and to provide a purification method thereof.

課題を解決するための手段、発明の作用、及び発明の効果Means for solving the problems, action of the invention, and effect of the invention

本発明者は、鋭意検討に基づき、コイ赤血球膜に存在するグリコホリン及びその結合糖鎖を分離精製することに成功し、加えて、グリコホリン及びグリコホリンに含まれる多糖類に抗菌活性があることを見出し、基本的には本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明者は、コイ赤血球膜の調製を試み、コイの赤血球膜の調製法を確立した。ついで、コイ赤血球膜中の膜構成タンパク質をSDS-PAGEで検出したところ、主要な膜構成タンパク質の分子量および含有量はほぼヒトと同様であることを確認した。
次に、赤血球膜から糖タンパク質を検出したところ、コイ赤血球膜にはヒトと同様グリコホリンが存在していた。コイにおける主要なグリコホリンは電気泳動上でバンド３とほぼ同様の移動度を示したことから、これらのグリコホリンは移動度で観るとヒトグリコホリンＡの２量体(PAS-1)に相当すると判断した。 The present inventor succeeded in separating and purifying glycophorin and its binding sugar chain present in carp erythrocyte membrane based on earnest studies, and in addition, found that glycophorin and polysaccharides contained in glycophorin have antibacterial activity. Basically, the present invention has been completed.
That is, the present inventor tried to prepare a carp erythrocyte membrane and established a method for preparing a carp erythrocyte membrane. Subsequently, when the membrane constituent proteins in the carp erythrocyte membrane were detected by SDS-PAGE, it was confirmed that the molecular weight and content of the main membrane constituent proteins were almost the same as those of humans.
Next, when glycoprotein was detected from the erythrocyte membrane, glycophorin was present in the carp erythrocyte membrane as in humans. The main glycophorins in carp showed mobility similar to that of band 3 on electrophoresis, so these glycophorins were judged to correspond to the dimer of human glycophorin A (PAS-1) when viewed in terms of mobility. did.

ここでコイでは主要なグリコホリンが１種類のみ検出されたこと、またコイの血液採取が比較的容易であること、さらに日本の民間療法でも古来からコイの血液が用いられており何らかの生体防御機能が期待できると考え、コイ血液中のグリコホリンの抽出・単離およびその生理活性探索を試みた。
そこで、単離されたコイグリコホリンの血液型活性を検討し、更に糖鎖に含まれているシアル酸の同定および中性糖・アミノ糖の分析を行い、併せて糖鎖の単離・精製を行った。また、コイグリコホリンを用いて魚病性細菌を含む数種の細菌と反応させ、相互作用を凝集反応や電子顕微鏡で観察した。さらに、グリコホリンや糖鎖画分を用いて、感受性ディスク法で抗菌活性を検討した。 Here, only one major glycophorin was detected in carp, and it was relatively easy to collect carp blood. Furthermore, Japanese folk remedies have used carp blood since ancient times, and have some biological defense function. We thought it was promising and tried to extract and isolate glycophorin from carp blood and to explore its physiological activity.
Therefore, we examined the blood group activity of isolated carp glycophorin, further identified sialic acid contained in the sugar chain and analyzed neutral sugars and amino sugars, and also isolated and purified the sugar chains. Went. In addition, carp glycophorin was used to react with several kinds of bacteria including fish-borne bacteria, and the interaction was observed with an agglutination reaction or an electron microscope. Furthermore, antibacterial activity was examined by the sensitive disk method using glycophorin and sugar chain fractions.

こうして、上記課題を解決するための抗菌性オリゴ糖には、ＧａｌＮＡｃと、Ｇａｌと、Ｇｌｃと、Ｆｕｃと、シアル酸であるＮＧＮＡとを含むオリゴ糖がある。
ＧａｌＮＡｃとは、Ｎ−アセチルガラクトサミンを意味しており、ムチン型糖鎖（Ｏ結合型糖鎖（O-linked
sugar chain））として、タンパク質のセリン(Ser)又はスレオニン(Thr)に結合することができる。
Ｇａｌとはガラクトースを、Ｇｌｃとはグルコースを、Ｆｕｃとはフコースを、ＮＧＮＡとはシアル酸の一種であるＮ−グリコリルノイラミン酸をそれぞれ意味する。
ヒトグリコホリンは、血液型活性を有するが抗菌活性は知られていない。しかしながら、本発明者の検討によれば、驚くべきことに、コイ赤血球膜に含まれるグリコホリンには、弱い血液型活性とともに、グリコホリンに結合している糖鎖由来の抗菌活性があることが確認された。この抗菌オリゴ糖に含まれる糖類としては、上記５種類のものである。 Thus, the antimicrobial oligosaccharides for solving the above problems, there are a GalNAc, and Gal, and Glc, and Fuc, is including oligosaccharides and NGNA is sialic acid.
GalNAc means N-acetylgalactosamine, which is a mucin-type sugar chain (O-linked sugar chain (O-linked sugar chain)).
As a sugar chain)), it can bind to serine (Ser) or threonine (Thr) of proteins.
Gal means galactose, Glc means glucose, Fuc means fucose, and NGNA means N-glycolylneuraminic acid which is a kind of sialic acid.
Human glycophorin has blood group activity but no antibacterial activity. However, according to the study of the present inventor, it was surprisingly confirmed that glycophorin contained in carp erythrocyte membrane has a weak blood group activity and an antibacterial activity derived from a sugar chain bound to glycophorin. It was. The saccharides contained in this antibacterial oligosaccharide are the above five types.

上記５種類の糖類の結合順序、結合位置については、特に拘らないが、ＧａｌＮＡｃとＧａｌとが結合し、更にＧａｌ側にＧｌｃとＦｕｃが結合していることが好ましい。ＧａｌＮＡｃは、ムチン型糖鎖を構成する際に、四種類のコア構造（コアＩ〜コアＩＶ）を取ることが知られている。本発明の抗菌性多糖類は、このうちのコアＩ構造（Ｇａｌ→ＧａｌＮＡｃ→Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）によって、タンパク質と結合していることが明らかとなった。このため、ＧａｌＮＡｃとＧａｌとが結合し、Ｇａｌ側にＧｌｃとＦｕｃとＮＧＮＡとが結合するという構造を取ることが好ましい。更に、ＮＧＮＡは、最外位置に配置することから、ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−（Ｇｌｃ，Ｆｕｃ）−ＮＧＮＡ、又は ＮＧＮＡ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−（Ｇｌｃ，Ｆｕｃ）という構造が好ましい。   The binding order and the binding position of the five kinds of saccharides are not particularly limited, but it is preferable that GalNAc and Gal are bonded, and further that Glc and Fuc are bonded to the Gal side. It is known that GalNAc takes four types of core structures (core I to core IV) when constituting a mucin-type sugar chain. It was revealed that the antibacterial polysaccharide of the present invention is bound to a protein by the core I structure (Gal → GalNAc → Ser / Thr). Therefore, it is preferable to adopt a structure in which GalNAc and Gal are bonded and Glc, Fuc, and NGNA are bonded to the Gal side. Furthermore, since NGNA is arranged at the outermost position, a structure of GalNAc-Gal- (Glc, Fuc) -NGNA or NGNA-GalNAc-Gal- (Glc, Fuc) is preferable.

本発明は、コイグリコホリン及び結合糖鎖の精製方法であって、コイ全血から赤血球を単離し、赤血球膜を調製した後に、リチウム塩とフェノール更には核酸除去剤を用いることによって、グリコホリンを精製し、更にグリコホリン中の結合糖鎖をグリコホリンから遊離させ、得られたオリゴ糖を脱塩・精製することを特徴とする。
リチウム塩には、例えば、Lithium 3,5-Diiodosalicylate（LIS）、Lithium
Dodecyl Sulfate（LDS）などが例示されるが、これらの中でLithium 3,5-Diiodosalicylate(LIS)を用いることが好ましい。赤血球膜中のタンパク質を可溶化した後に、フェノール処理を施すことでグリコホリンを抽出することができる。さらにストレプトマイシン水溶液を用いて、混在した核酸を除去し、グリコホリンを精製することができる。
このように本発明によれば、従来には単離精製することが困難であったコイグリコホリン及び、コイグリコホリンから遊離した抗菌性オリゴ糖を得ることができる。
The present invention relates to a method for purifying carp glycophorin and a conjugated sugar chain, and after isolating red blood cells from carp whole blood and preparing a red blood cell membrane , glycophorin is obtained by using a lithium salt, phenol, and a nucleic acid removing agent. It is characterized by further purifying and releasing the linked sugar chain in glycophorin from glycophorin, and desalting and purifying the resulting oligosaccharide.
Lithium salts include, for example, Lithium 3,5-Diiodosalicylate (LI S), Lithium
Examples include Dodecyl Sulfate (LDS), among which Lithium 3,5-Diiodosalicylate (LIS) is preferably used. After solubilizing the protein in the erythrocyte membrane, glycophorin can be extracted by applying phenol treatment. Furthermore, the mixed nucleic acid can be removed and glycophorin can be purified using an aqueous streptomycin solution.
Thus, according to the present invention, carp glycophorin that has been difficult to isolate and purify in the past and antibacterial oligosaccharides released from carp glycophorin can be obtained.

次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。   Next, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. However, the technical scope of the present invention is not limited by the following embodiments, and various changes can be made without changing the gist thereof. It can be carried out with modification. Further, the technical scope of the present invention extends to an equivalent range.

＜実施例１：コイ赤血球の単離＞
供試魚として、三重県津市の活魚店より購入した平均体重約1,000gのコイ(Cyprinus carpio)を用いた。赤血球の単離精製には、ファルマシア（Pharmacia）製Ficoll-Paqueを用いた。また、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、Dithiothreitol(DTT)、Coomassie brilliant blue R-250はフルカ（Fluka）製、Bromophenol blue(BPB)、SDS電気泳動用分子量標品は Sigma製、他の試薬は全て和光純薬工業製の生化学用または特級を用いた。 <Example 1: Isolation of carp erythrocytes>
As a test fish, a carp (Cyprinus carpio) with an average weight of about 1,000 g purchased from a live fish shop in Tsu City, Mie Prefecture was used. For the isolation and purification of erythrocytes, Ficoll-Paque manufactured by Pharmacia was used. In addition, sodium dodecyl sulfate (SDS), Dithiothreitol (DTT), Coomassie brilliant blue R-250 are manufactured by Fluka, Bromophenol blue (BPB), molecular weight preparation for SDS electrophoresis is manufactured by Sigma, and all other reagents are Japanese. A biochemical or special grade made by Kojun Pharmaceutical Co., Ltd. was used.

水槽に飼育しているコイ(約1,000g)を200 ppm のMS-222(m-aminobenzoic acid ethyl-ester methanesulfonate)溶液に5分間薬浴させた後、ヘパリン処理をしたシリンジを用いて背部動脈より血液を採取した。得られた血液約 30 ml(5匹分)を直ちに魚類リンゲル液(145 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 1 mM MgSO₄,10 mM KCl, 10 mM Hepes, 5 mM Glucose, pH 7.9)で等倍に希釈した後、Ficoll-Paque に重層し、400 x gで 40分間 室温で遠心分離した。上層および中層に存在する血漿および白血球を除去し、下層の赤血球のみを採取した。得られた赤血球を魚類リンゲル液に再度懸濁し、700 x g で 5 分間の遠心分離を行い洗浄した。この操作を3回繰り返した。 After carp the carp (about 1,000 g) kept in the aquarium in 200 ppm MS-222 (m-aminobenzoic acid ethyl-ester methanesulfonate) solution for 5 minutes, use a heparinized syringe from the dorsal artery. Blood was collected. Blood obtained about 30 ml (5 rats min) immediately fish Ringer solution (145 mM NaCl, 5 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 5 mM Glucose, pH 7.9) to a magnification in After dilution, it was overlaid on Ficoll-Paque and centrifuged at 400 xg for 40 minutes at room temperature. Plasma and white blood cells present in the upper and middle layers were removed, and only the lower red blood cells were collected. The obtained erythrocytes were resuspended in fish Ringer's solution and washed by centrifugation at 700 xg for 5 minutes. This operation was repeated three times.

＜実施例２：赤血球から赤血球膜の調製＞
以下の操作は特記しない限り、全て 4℃で行った。前節で得られた赤血球を 15〜20倍量の氷冷水に攪拌しながら加え、溶血させた。溶血液に最終濃度 0.15 mM になるように PMSF(phenylmethansulfonyl fluoride)を添加し、氷冷しながら 5分間放置した。さらに Potter 型ホモジナイザーでホモジナイズ（10往復）した後、緩衝液 A (12.5 mM MgCl₂ および 15 mM EDTA含有, 75 mM Tris-HCl緩衝液, pH 7.5)を等量加え、さらに最終濃度0.15 mMになるように PMSFを添加した。次に血球懸濁液を 40,000 x g で 25分間遠心し、得られた沈殿に 2倍希釈した緩衝液 A および PMSFを加えて同様にホモジナイズした後、スイング式ローターを用いて 1,400 x g で 2分間遠心分離した。 <Example 2: Preparation of erythrocyte membrane from erythrocytes>
The following operations were all performed at 4 ° C unless otherwise specified. The erythrocytes obtained in the previous section were added to 15 to 20 times the amount of ice-cold water with stirring to cause hemolysis. PMSF (phenylmethansulfonyl fluoride) was added to the hemolyzed blood to a final concentration of 0.15 mM, and the mixture was allowed to stand for 5 minutes with ice cooling. After homogenization (10 reciprocations) with a Potter type homogenizer, add an equal volume of buffer A (containing 12.5 mM MgCl ₂ and 15 mM EDTA, 75 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5) to a final concentration of 0.15 mM. PMSF was added as follows. Next, centrifuge the blood cell suspension at 40,000 xg for 25 minutes, add the 2-fold diluted buffer A and PMSF to the resulting precipitate, homogenize in the same way, and then centrifuge at 1,400 xg for 2 minutes using a swing rotor. separated.

上澄液を回収した後、沈殿を同様の方法でホモジナイズし、遠心分離を行った。この操作を3回繰り返し、核酸を除去した。 4回の操作で得られた上澄液を集め、40,000 x g で 25分間 遠心分離した。得られた沈殿を分取して 50 mlの緩衝液 A に懸濁後、ホモジナイズした。さらに懸濁液 約25 mlを 20 mlのショ糖層(10 mM Tris-HCl緩衝液、40%ショ糖および 10 mM MgCl₂含有、pH 7.5)に重層し、スイング式ローターを用いて 2,000 x g で 15分間 遠心分離した。上層および中層を採取した後、40,000 x g で 25分間 遠心分離を行った。得られた沈殿を緩衝液 B (2 mM EDTA含有、20 mM Tris-HCl 緩衝液、PH 7.5)で懸濁し、これを赤血球膜調製液として -80℃で保存した。 After collecting the supernatant, the precipitate was homogenized by the same method and centrifuged. This operation was repeated three times to remove the nucleic acid. The supernatants obtained by the four operations were collected and centrifuged at 40,000 × g for 25 minutes. The resulting precipitate was collected, suspended in 50 ml of buffer A, and then homogenized. Furthermore, about 25 ml of the suspension was layered on a 20 ml sucrose layer (containing 10 mM Tris-HCl buffer, 40% sucrose and 10 mM MgCl ₂ , pH 7.5), and 2,000 xg using a swing rotor. Centrifuge for 15 minutes. After collecting the upper and middle layers, centrifugation was performed at 40,000 xg for 25 minutes. The obtained precipitate was suspended in buffer B (containing 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl buffer, PH 7.5) and stored at −80 ° C. as an erythrocyte membrane preparation solution.

＜実施例３：赤血球膜からグリコホリンの抽出＞
コイ赤血球膜からLIS-フェノール法に従ってグリコホリンを抽出した。すなわち、実施例２で得られた赤血球膜調製液
約50 mlに 0.3 M Lithium 3,5-Diiodosalicylate(LIS)含有 0.05 M Tris-HCl 緩衝液、pH7.5 を、タンパク質量が約25 mg/ml となるように加えて懸濁した後、ホモジナイズ(10往復)し、室温で5〜10分間 攪拌した。懸濁液に2倍量の蒸留水を加え、さらに 4℃で30分間 攪拌した。以下の操作は全て4℃で行った。
懸濁液を 45,000 x g で 90分間 遠心分離し、得られた上澄液に 等量の 50%(w/w)フェノール水溶液を加え、15分間激しく振盪した。振盪後、4,000 x g で60分間 遠心分離し、中間層が混入しないように上層を採取し、蒸留水に対して 24時間以上透析した。透析内液を凍結乾燥した後、氷冷した 100%エタノールを加え、1〜2時間 攪拌した。生じた懸濁物を 18,000 x gで20分間 遠心分離して採取し、得られた沈殿に100%エタノールを添加した。攪拌後、18,000 x gで20分間の遠心分離を行い、エタノールを除去した。同様の洗浄操作を再度繰り返し、得られた沈殿を少量の蒸留水で溶解した。次に残存する核酸を除去するため、5%硫酸ストレプトマイシン溶液を数滴添加後再度遠心分離して上澄液を採取し、蒸留水に対して一晩以上透析した。透析内液中に生じた沈殿を 10,000 x gで30分間 遠心分離して除去し、上澄液をグリコホリン標品とした。 <Example 3: Extraction of glycophorin from erythrocyte membrane>
Glycophorin was extracted from carp erythrocyte membrane according to the LIS-phenol method. That is, about 50 ml of the erythrocyte membrane preparation solution obtained in Example 2 was added 0.3 M Lithium 3,5-Diiodosalicylate (LIS) -containing 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 7.5, and the protein amount was about 25 mg / ml. After adding and suspending, the mixture was homogenized (10 reciprocations) and stirred at room temperature for 5 to 10 minutes. Two times the amount of distilled water was added to the suspension, and the mixture was further stirred at 4 ° C for 30 minutes. The following operations were all performed at 4 ° C.
The suspension was centrifuged at 45,000 xg for 90 minutes, an equal volume of 50% (w / w) aqueous phenol was added to the resulting supernatant, and the mixture was shaken vigorously for 15 minutes. After shaking, the mixture was centrifuged at 4,000 xg for 60 minutes, the upper layer was collected so that the intermediate layer was not mixed, and dialyzed against distilled water for 24 hours or more. The dialyzed solution was lyophilized, ice-cooled 100% ethanol was added, and the mixture was stirred for 1 to 2 hours. The resulting suspension was collected by centrifugation at 18,000 xg for 20 minutes, and 100% ethanol was added to the resulting precipitate. After stirring, the mixture was centrifuged at 18,000 xg for 20 minutes to remove ethanol. The same washing operation was repeated again, and the resulting precipitate was dissolved with a small amount of distilled water. Next, in order to remove the remaining nucleic acid, a few drops of 5% streptomycin sulfate solution was added and centrifuged again to collect the supernatant, which was dialyzed against distilled water overnight. The precipitate formed in the dialyzed solution was removed by centrifugation at 10,000 xg for 30 minutes, and the supernatant was used as a glycophorin sample.

＜実施例４：電気泳動法＞
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法については、試料調製液には4% SDS, 20% Glycerol, 160mM DTT, 0.2mg/ml BPB, 25mM Tris-HCl, pH6.8を用い、泳動条件として 0.1% SDSを含む 8.5% スラブゲルを用い、通電 15 mAで行った。また、タンパク質の染色は Coomassie brilliant blue R-250 (CBB)を用い、糖タンパク質の染色は PAS（Periodic acid Schiff stain）染色を行った。 <Example 4: Electrophoresis>
For SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, 4% SDS, 20% Glycerol, 160 mM DTT, 0.2 mg / ml BPB, 25 mM Tris-HCl, pH 6.8 was used as the sample preparation, and 0.1% SDS as the electrophoresis conditions. A 8.5% slab gel containing was used and energized at 15 mA. Coomassie brilliant blue R-250 (CBB) was used for protein staining, and PAS (Periodic acid Schiff stain) staining was used for glycoprotein staining.

＜実施例５：各種定量法＞
タンパク質は Lowry法に従って測定した。標準物質として牛血清アルブミンを用いた。シアル酸の定量は、過ヨウ素酸-レソルシノール法を用い、反応後 630 nmの吸光度を測定した。標準物質として、NANA(N-アセチルノイラミン酸)を用いた。中性糖の測定は、フェノール硫酸法を用いた。 <Example 5: Various quantitative methods>
Protein was measured according to the Lowry method. Bovine serum albumin was used as a standard substance. The sialic acid was quantified using the periodic acid-resorcinol method, and the absorbance at 630 nm was measured after the reaction. NANA (N-acetylneuraminic acid) was used as a standard substance. Neutral sugars were measured using the phenol sulfate method.

＜実施例６：アミノ酸分析＞
グリコホリンのアミノ酸組成を、Moore と Stein のニンヒドリン分解法に従い、ATTO MLC-203型 アミノ酸自動分析機を用いて分析した。タンパク質の加水分解は 6N HCl(低沸点)を用い、110℃ 24時間加熱で行った。標準物質として アミノ酸混合標準液H型(和光)を用いた。 <Example 6: Amino acid analysis>
The amino acid composition of glycophorin was analyzed using an ATTO MLC-203 type amino acid automatic analyzer according to the ninhydrin decomposition method of Moore and Stein. Protein hydrolysis was carried out using 6N HCl (low boiling point) and heating at 110 ° C. for 24 hours. Amino acid mixed standard solution H type (Wako) was used as a standard substance.

＜実施例７：シアル酸の分取・同定＞
コイグリコホリン 160μg に 1 mlの 0.01 N HClを加えて N₂ガス下で80℃ 50分間反応させ、シアル酸を遊離させた。反応液を 1M 酢酸を用いて氷冷下で中和した後、水に対して24時間透析を行った。得られた透析外液を Dowex 1 x 8カラムに負荷した後、1.1M ギ酸塩緩衝液、pH 4.6で溶出させた。溶出液を減圧乾固により濃縮し、薄層クロマトグラフィーで展開した。薄層は Kieselgel 60 (Merk製)を用い、展開溶媒は n-プロパノール：水；7 : 3(v/v)、発色剤はオルシノール試薬を用いた。 <Example 7: Fractionation and identification of sialic acid>
Sialic acid was liberated by adding 1 ml of 0.01 N HCl to 160 μg of cariglycophorin and reacting under N ₂ gas at 80 ° C. for 50 minutes. The reaction solution was neutralized with 1M acetic acid under ice-cooling, and dialyzed against water for 24 hours. The resulting dialyzed external solution was loaded onto a Dowex 1 × 8 column and then eluted with 1.1 M formate buffer, pH 4.6. The eluate was concentrated by drying under reduced pressure and developed by thin layer chromatography. The thin layer was Kieselgel 60 (manufactured by Merk), the developing solvent was n-propanol: water; 7: 3 (v / v), and the color former was an orcinol reagent.

NGNA(N-グリコリルノイラミン酸)の呈色反応は以下の方法で行った。減圧乾固した遊離シアル酸に 1 mlの 1 N H₂SO₄を加え、60分間 湯煎を行った。反応溶液に活性炭を加えて脱色および夾雑物を除去した後 ろ過し、ろ液を蒸留水で 10 mlに定容した。その内から 0.1 ml 採取し、2.0 mlの Eegriwe 試薬( 10 mg 2,7-dihydroxy-naphthalene/ 100 ml H₂SO₄)を添加し、よく混合した後 20分間 湯煎を行った。赤紫色の呈色を 530 nm の吸光度で測定した。
HPLCでのシアル酸同定は以下の方法で行った。カラムは Sugar-Pak Pb(7.8 x 300 mm)およびガードカラムを用い、移動相はMilli-Q水、流速は 0.5 ml/min、カラム温度は 80℃とし、検出器はWatersの464型電気化学検出器（インテグレーテッドアンペロメトリーモード）を用いた。各ステップにおける印加電圧と接続時間は、E1=50mv(T1=0.330msec), E2=600mv(T2=0.166msec), E3=-800mv(T3=0.166msec)で行った。 The color reaction of NGNA (N-glycolylneuraminic acid) was carried out by the following method. 1 ml of 1 NH ₂ SO ₄ was added to the free sialic acid dried under reduced pressure, and water bathing was performed for 60 minutes. Activated carbon was added to the reaction solution to remove the color and impurities, followed by filtration. The filtrate was made up to 10 ml with distilled water. 0.1 ml was sampled from this, 2.0 ml of Eegriwe reagent (10 mg 2,7-dihydroxy-naphthalene / 100 ml H ₂ SO ₄ ) was added and mixed well, and then bathed for 20 minutes. The reddish purple color was measured by absorbance at 530 nm.
Identification of sialic acid by HPLC was performed by the following method. The column uses a Sugar-Pak Pb (7.8 x 300 mm) and guard column, the mobile phase is Milli-Q water, the flow rate is 0.5 ml / min, the column temperature is 80 ° C, and the detector is Waters type 464 electrochemical detection. A vessel (integrated amperometry mode) was used. The applied voltage and connection time in each step were E1 = 50 mv (T1 = 0.330 msec), E2 = 600 mv (T2 = 0.166 msec), E3 = −800 mv (T3 = 0.166 msec).

＜実施例８：アミノ糖の分取・同定＞
グリコホリン糖鎖中のアミノ糖の分取は、Boasの方法を用いて行った。タンパク質量 約0.8mgのグリコホリンに 2.5M トリフルオロ酢酸 1 mlを加えて溶封後、100℃ 6.5時間 加水分解を行った。反応液を減圧乾固後、蒸留水を加えて再度減圧乾固し、酢酸臭がなくなるまで上記の操作を繰り返した。得られた残査に蒸留水600μlを加えて溶解し、Dowex 50 x 2(H^＋)陽イオン交換樹脂カラム(1.0 x 25 cm)に負荷した。カラム体積の3倍量の蒸留水でカラムを洗浄した後、30 mlの 2N HClでヘキソサミンを溶出した。溶出液を塩酸臭がなくなるまで減圧乾固を繰り返した後、蒸留水に溶解して Elson- Morgan 法でヘキソサミンを定量した。さらに得られたヘキソサミン溶液をエタノール(精密分析用)で洗浄後、薄層クロマトグラフィーで展開した。薄層は Kieselgel 60 (Merk製)を用い、展開溶媒は n-ブタノール：酢酸：水；８：８：１(v/v)、発色剤はジフェニルアミン-アニリン-リン酸試薬を用いた。 <Example 8: Sorting and identification of amino sugar>
The fractionation of amino sugars in glycophorin sugar chains was performed using the Boas method. After adding 1 ml of 2.5M trifluoroacetic acid to glycophorin having a protein content of about 0.8 mg, hydrolysis was performed at 100 ° C. for 6.5 hours. After the reaction liquid was dried under reduced pressure, distilled water was added and the mixture was again dried under reduced pressure, and the above operation was repeated until the acetic acid odor disappeared. The obtained residue was dissolved by adding 600 μl of distilled water, and loaded onto a Dowex 50 × 2 (H ⁺ ) cation exchange resin column (1.0 × 25 cm). After washing the column with 3 column volumes of distilled water, hexosamine was eluted with 30 ml of 2N HCl. The eluate was repeatedly dried under reduced pressure until the odor of hydrochloric acid disappeared, then dissolved in distilled water, and hexosamine was quantified by the Elson-Morgan method. Further, the obtained hexosamine solution was washed with ethanol (for precision analysis) and then developed by thin layer chromatography. The thin layer was Kieselgel 60 (manufactured by Merk), the developing solvent was n-butanol: acetic acid: water; 8: 8: 1 (v / v), and the color former was diphenylamine-aniline-phosphate reagent.

＜実施例９：免疫活性測定法、或いは血液型活性測定法＞
グリコホリンの抗原性（血液型活性）を検出するために二重拡散法を用いた。支持体には 1.2% (w/v)アガロースおよび 0.9% NaCl含有、0.02M Tris-HCl, pH 6.0を用い、37℃で 48時間保温した。抗血清には抗Ｍ血清(ウサギ由来)、抗Ｓ血清、抗ｓ血清(ヒト由来)を用いた(オーソ・ダイアグノスティック・システムズ製)。沈降線の観察には0.1% CBB染色を行い、肉眼で観察した。コイ赤血球を用いた凝集試験は載せガラス法を用いた。魚類生理食塩(1.7% NaCl, 1mM Tris-HCl,pH 8.0)で赤血球を懸濁し、700 x g で5分間遠心分離を行って洗浄した。この操作を 3回繰り返した。10% 赤血球浮遊液になるように魚類生理食塩水を赤血球に加えて調製した後、抗血清を1滴載せたプレパラートに同赤血球浮遊液を 1滴添加し、攪拌棒でよく混和した後 顕微鏡を用いて凝集を観察した。 <Example 9: Immunological activity measurement method or blood group activity measurement method>
A double diffusion method was used to detect the antigenicity (blood group activity) of glycophorin. The support was 1.2% (w / v) agarose and 0.9% NaCl-containing 0.02M Tris-HCl, pH 6.0, and incubated at 37 ° C. for 48 hours. Anti-M serum (from rabbit), anti-S serum, and anti-s serum (from human) were used as antisera (manufactured by Ortho Diagnostics Systems). For observation of sedimentation lines, 0.1% CBB staining was performed and observed with the naked eye. For the agglutination test using carp erythrocytes, the glass-on-glass method was used. Red blood cells were suspended in fish physiological saline (1.7% NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 8.0), and washed by centrifuging at 700 × g for 5 minutes. This operation was repeated three times. After adding fish saline to the erythrocytes to make 10% erythrocyte suspension, add 1 drop of the erythrocyte suspension to a preparation containing 1 drop of antiserum and mix well with a stir bar. Was used to observe aggregation.

＜実施例１０：レクチンとの相互作用＞
グリコホリン中の糖鎖の構造を推定するため、レクチンカラムを用いて吸着試験を行った。レクチンカラムはレクチン-アガロース セット-ＩおよびII(生化学工業)を用いた。また、ABA(ホーネンコーポレーション製)とホルミルセルロファイン(生化学工業製)を用いてABAカラムを作製し、同様の吸着試験を行った。溶出液からのグリコホリンの検出はシアル酸量を過ヨウ素酸-レソルシノール法で測定することにより行った。 <Example 10: Interaction with lectin>
In order to estimate the structure of the sugar chain in glycophorin, an adsorption test was performed using a lectin column. As the lectin column, lectin-agarose set-I and II (Seikagaku Corporation) were used. In addition, an ABA column was prepared using ABA (manufactured by Honen Corporation) and formyl cellulose fine (manufactured by Seikagaku Corporation), and the same adsorption test was performed. Glycophorin was detected from the eluate by measuring the amount of sialic acid by the periodic acid-resorcinol method.

＜実施例１１：各種細菌およびウィルスとコイグリコホリンの相互作用＞
各種細菌およびウィルスとコイグリコホリンの相互作用を観察するため、上記＜実施例９：免疫活性測定法＞と同様の凝集試験を行った。使用した菌はコイなどで発病する立鱗病、赤斑病、鰭赤病などの原因菌である Aeromonas hydrophila ATCC 7966(東大医科研微生物株保存施設)、ウナギのパラコロ病の原因菌であるEdwardsiella tarda SU226、ビブリオ病の原因菌である Vibrio anguillarum ATCC19264(両菌とも東京水産大学の廣野育生博士より分与)、さらにグラム陽性菌の Micrococcus luteus ATCC9341(研究室保存株)を用いた。また、魚病性ウィルスとして三重大学の宮田雅人博士より分与されたIPN(VR-299)を用いた。コイグリコホリンまたはコイ赤血球を各供試菌・ウィルス懸濁液に滴下して、顕微鏡で凝集反応を判定した。 <Example 11: Interaction between various bacteria and viruses and carp glycophorin>
In order to observe the interaction between various bacteria and viruses and carp glycophorin, the same agglutination test as in the above <Example 9: Immunoassay> was performed. The fungi used were Aeromonas hydrophila ATCC 7966 (the University of Tokyo Microbial Stock Storage Facility), which is the causative bacterium that causes disease such as carp and other diseases, and Edwardsiella tarda, which is the causative agent for eel paracorticosis. We used SU226, Vibrio anguillarum ATCC19264, which is the causative bacterium of Vibrio disease (both bacteria were distributed by Dr. Ikuo Kanno, Tokyo Suisan University), and the gram-positive bacterium Micrococcus luteus ATCC9341 (laboratory stock). In addition, IPN (VR-299) distributed by Dr. Masato Miyata of Mie University was used as a fish disease virus. Carp glycophorin or carp erythrocytes were dropped into each test bacteria / virus suspension, and the agglutination reaction was judged with a microscope.

さらに、電子顕微鏡を用いて相互作用を観察した。供試した細菌は、V.anguillarum およびグラム陽性菌の M. luteusとした。V. anguillarum にグリコホリンを添加した供試液はグルタールアルデヒドで固定し、ポリ-L-リジン処理したカバーグラスに吸着させた。さらに等張リン酸緩衝液(PBS; phosphate buffered saline)で洗浄後、エタノールを用いて脱水した。酢酸イソアミルで置換後、臨界点乾燥装置(日立 HCP-2型)で乾燥させ、イオンスパッタリング装置(JEOL JFC-1100型)を用いて白金パラジウムをコーティングし、走査型電子顕微鏡(SEM)で観察を行った。走査型電子顕微鏡はJSM-T200型(JEOL)を用いた。
M. luteus にグリコホリンを添加した供試液は、ポリカチオン処理を行ったカーボンプレートに吸着させた。グルタールアルデヒドで固定した後 PBSで洗浄を行い、さらに四酸化オスミウムで 後固定を行った。次にPBSで洗浄後、導電染色を行い、ついでPBSで洗浄を行った後 エタノールを用いて脱水した。脱水以降の操作はV. anguillarumと同様の方法で行った。走査型電子顕微鏡は S-4000(日立)を用いた。 Furthermore, the interaction was observed using an electron microscope. The bacteria tested were V. anguillarum and the Gram-positive bacterium M. luteus . A test solution obtained by adding glycophorin to V. anguillarum was fixed with glutaraldehyde and adsorbed on a cover glass treated with poly-L-lysine. Furthermore, after washing with an isotonic phosphate buffer (PBS), it was dehydrated using ethanol. After substituting with isoamyl acetate, dried with a critical point dryer (Hitachi HCP-2 type), coated with platinum palladium using an ion sputtering device (JEOL JFC-1100 type), and observed with a scanning electron microscope (SEM). went. The scanning electron microscope used was JSM-T200 type (JEOL).
A test solution obtained by adding glycophorin to M. luteus was adsorbed on a carbon plate subjected to polycation treatment. After fixation with glutaraldehyde, washing was performed with PBS, and post-fixation was further performed with osmium tetroxide. Next, after washing with PBS, conductive staining was performed, followed by washing with PBS and dehydration using ethanol. Operations after dehydration were performed in the same manner as V. anguillarum . S-4000 (Hitachi) was used as the scanning electron microscope.

＜実施例１２：グリコホリンから糖鎖の遊離と調製＞
グリコホリンに結合している糖鎖を調製するため、β-脱離を行った。すなわち、グリコホリン約 500μgに 1N NaBH₄(0.4N NaOH 含有)を 50μl加え、N₂ガス存在下の暗室で 48時間 37℃で反応を行った。その後 氷冷下で 1 M 酢酸を用いて中和した。得られた反応液を 減圧乾固したした後、メタノール5 ml(HPLC grade)を添加して再度減圧乾固を行った。この操作を 4回繰り返した。得られた残査を少量の蒸留水に溶かした後、5 mlの 95%エタノールを添加し、2,500 x gで 10分間遠心分離した。採取した上澄液を減圧乾固し、残査に 5 mlの Milli-Q 水を加えて溶解した後、再度減圧乾固した。得られた残査に 5 mlの Milli-Q 水を加えて溶解した。この溶液を遊離糖鎖溶液とし、HPLCに供した。 <Example 12: Release and preparation of sugar chain from glycophorin>
Β-elimination was performed to prepare sugar chains bound to glycophorin. That is, 50 μl of 1N NaBH ₄ (containing 0.4N NaOH) was added to about 500 μg of glycophorin, and the reaction was performed at 37 ° C. for 48 hours in a dark room in the presence of N ₂ gas. Thereafter, the mixture was neutralized with 1 M acetic acid under ice cooling. The obtained reaction solution was dried under reduced pressure, methanol 5 ml (HPLC grade) was added, and the solution was again dried under reduced pressure. This operation was repeated 4 times. The resulting residue was dissolved in a small amount of distilled water, 5 ml of 95% ethanol was added, and the mixture was centrifuged at 2,500 xg for 10 minutes. The collected supernatant was dried under reduced pressure, and 5 ml of Milli-Q water was added to the residue for dissolution, and then again dried under reduced pressure. The resulting residue was dissolved by adding 5 ml of Milli-Q water. This solution was used as a free sugar chain solution and subjected to HPLC.

＜実施例１３：遊離糖鎖の分画＞
糖鎖の分画はGlyco-Pak DEAE カラム（Waters）を用いた HPLC法で行った。移動相は 10 mM Tris-HCl, pH 7.6を用い、流速は 0.6 ml/min、カラム温度は室温とした。遊離糖鎖溶液 50μlをカラムに注入した後カラムを移動相で洗浄し、100 mM NaClを含む同移動相を用いて勾配 5 mM/min で塩濃度勾配溶出を行った。検出は Waters 486型 UV検出器を用い、波長 205 nmで行った。
また、遊離糖鎖サンプルについては、以下のように脱塩・精製処理を行った。予めMilliQ水で膨潤させたグラファイトカーボンカートリッジ（CARBOGRAPH 300mg/6mL, ジーエルサイエンス製）に、４mlの0.1% TFA含有80%アセトニトリルを負荷した後、MilliQ水で充分に洗浄した。ついで2.5%重炭酸アンモニウム含有45%アセトニトリルを4ml負荷し、MilliQ水で充分に洗浄した後、0.1% TFA含有80%アセトニトリル4ml負荷して再度MilliQ水で充分に洗浄した。次に凍結乾燥を行った糖鎖試料に1.0% NaClを加えて溶解し、糖鎖濃度が12-30μg/mlになるように調整した。この試料液をカートリッジに負荷した。
MilliQ水でカートリッジを充分に洗浄した後、40mlの2.5%重炭酸アンモニウム含有45%アセトニトリルで糖鎖を溶出させた。溶出画分を集め、減圧乾固を行った。 <Example 13: Fractionation of free sugar chain>
Sugar chain fractionation was performed by HPLC using a Glyco-Pak DEAE column (Waters). The mobile phase was 10 mM Tris-HCl, pH 7.6, the flow rate was 0.6 ml / min, and the column temperature was room temperature. After injecting 50 μl of the free sugar chain solution onto the column, the column was washed with a mobile phase, and using the same mobile phase containing 100 mM NaCl, salt concentration gradient elution was performed at a gradient of 5 mM / min. Detection was performed using a Waters 486 UV detector at a wavelength of 205 nm.
The free sugar chain sample was subjected to desalting / purification treatment as follows. A graphite carbon cartridge (CARBOGRAPH 300 mg / 6 mL, manufactured by GL Science) previously swollen with MilliQ water was loaded with 4 ml of 80% acetonitrile containing 0.1% TFA, and then thoroughly washed with MilliQ water. Then, 4 ml of 45% acetonitrile containing 2.5% ammonium bicarbonate was loaded and thoroughly washed with MilliQ water, and then 4 ml of 80% acetonitrile containing 0.1% TFA was loaded and washed thoroughly again with MilliQ water. Next, 1.0% NaCl was added to the lyophilized sugar chain sample and dissolved, and the sugar chain concentration was adjusted to 12-30 μg / ml. This sample solution was loaded onto the cartridge.
After thoroughly washing the cartridge with MilliQ water, the sugar chain was eluted with 40 ml of 45% acetonitrile containing 2.5% ammonium bicarbonate. The eluted fractions were collected and dried under reduced pressure.

＜実施例１４：糖鎖中の中性糖測定＞
実施例１３で得られた遊離糖鎖画分を Sephadex G-25カラムを用いて部分脱塩した。減圧乾固した後 200μlの水に溶解し、5M トリフルオロ酢酸 200μlを加えた。封管した後 100℃で 6時間加水分解を行った。反応液を減圧乾固した後 Milli-Q水を少量加えて減圧乾固を繰り返し、トリフルオロ酢酸を完全に除去した。減圧乾固後 Milli-Q水に溶解し、Dowex 50 x 8(H^＋)陽イオン交換樹脂カラムおよび Dowex 1 x 8(CO₃ ^2-)陰イオン交換樹脂カラムに連続的に素通りさせた。素通り画分を集めた後濃縮し、HPLCに供した。カラムは CarboPac PA10カラム（DIONEX）、移動相は 5 mM NaOH、流速は 1.0 ml/min、カラム温度は室温とし、検出器はDIONEXのED40型電気化学検出器（インテグレーテッドアンペロメトリーモード）を用いた。
各ステップにおける印加電圧と接続時間は、E1 = 100mv (T1 = 0.20 msec), E2 = -2,000 mv (T2=0.02msec), E3=-600mv(T3=0.01msec)で行った。標準溶液としてグルコース(Glc)、ガラクトース(Gal)、マンノース(Man)、フコース(Fuc)およびキシロース(Xyl)各500μg/l水溶液を等量混合したものを用いた。
＜実施例１５：グリコホリンの抗菌活性測定＞
グリコホリンの抗菌活性を、次の菌株を用いて測定した。Edwardsiella tarda（E. tarda） SU 226、及び Vibrio anguillarum （V. anguillarum）ATCC 19264は、東京水産大学の廣野育生博士より分譲された。Bacillus Subtilis （B. subtilis） ATCC 6633は、愛知県水産試験場より分譲された。Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) ATCC 7966は東京大学医科学研究所微生物株保存施設より分譲された。Micrococcus luteus (M. luteus) ATCC 9341は本発明者が保存する菌株を使用した。
細菌は、保存培養（ハートインフージョン「ニッスイ」寒天培地）から同液体培地に移植し、20℃で１日間培養して菌液を調製した。基層寒天平板培地上に供試菌株が10^5-7細胞/mlになるように混入した同組成の寒天培地を重層して二重寒天平板培地を作成し、30分間放置した。平板上に供試液を添加したディスク（ADVANTEC TOYO, Thick 8 mm）をのせて20℃で保温し、2-3日後に出現した発育阻止帯の直径を測定した。各細菌には、以下の平板培地を用いた。B.subtilis および M.luteus には、感性ディスク用培地-Ｎ「ニッスイ」を、E.tardaには、1%マンニトール含有SS寒天培地「ニッスイ」を、A.hydrophilaには、ハートインフージョンブイヨン「ニッスイ」寒天培地を、V.anguillarum には1.5% NaCl含有ハートインフージョンブイヨン「ニッスイ」寒天培地をそれぞれ用いた。 <Example 14: Measurement of neutral sugar in sugar chain>
The free sugar chain fraction obtained in Example 13 was partially desalted using a Sephadex G-25 column. After drying under reduced pressure, the residue was dissolved in 200 μl of water, and 200 μl of 5M trifluoroacetic acid was added. After sealing, hydrolysis was performed at 100 ° C for 6 hours. After the reaction solution was dried under reduced pressure, a small amount of Milli-Q water was added and the solution was repeatedly dried under reduced pressure to completely remove trifluoroacetic acid. After drying under reduced pressure, the product was dissolved in Milli-Q water and passed through a Dowex 50 × 8 (H ⁺ ) cation exchange resin column and a Dowex 1 × 8 (CO ₃ ²⁻ ) anion exchange resin column continuously. The flow-through fractions were collected, concentrated and subjected to HPLC. The column is a CarboPac PA10 column (DIONEX), the mobile phase is 5 mM NaOH, the flow rate is 1.0 ml / min, the column temperature is room temperature, and the detector is a DIONEX ED40 electrochemical detector (integrated amperometry mode). It was.
The applied voltage and connection time in each step were E1 = 100 mv (T1 = 0.20 msec), E2 = −2,000 mv (T2 = 0.02 msec), E3 = −600 mv (T3 = 0.01 msec). As a standard solution, a mixture of 500 μg / l aqueous solutions of glucose (Glc), galactose (Gal), mannose (Man), fucose (Fuc) and xylose (Xyl) was used.
<Example 15: Measurement of antibacterial activity of glycophorin>
The antibacterial activity of glycophorin was measured using the following strains. Edwardsiella tarda ( E. tarda ) SU 226 and Vibrio anguillarum ( V. anguillarum ) ATCC 19264 were sold by Dr. Ikuo Kanno of Tokyo Suisan University. Bacillus Subtilis ( B. subtilis ) ATCC 6633 was sold by the Aichi Prefectural Fisheries Experiment Station. Aeromonas hydrophila ( A. hydrophila ) ATCC 7966 was sold by the microbial strain storage facility of the Institute of Medical Science, the University of Tokyo. Micrococcus luteus ( M. luteus ) ATCC 9341 used a strain preserved by the present inventor.
Bacteria were transferred from preservation culture (Heart Infusion “Nissui” agar medium) to the same liquid medium and cultured at 20 ° C. for 1 day to prepare a bacterial solution. A double agar plate medium was prepared by overlaying an agar medium of the same composition mixed with the test strain at 10 ^5-7 cells / ml on the base layer agar plate medium and left for 30 minutes. A disc (ADVANTEC TOYO, Thick 8 mm) to which the test solution was added was placed on a flat plate and kept at 20 ° C., and the diameter of the growth inhibitory zone that appeared after 2-3 days was measured. The following plate medium was used for each bacterium. The B.subtilis and M.luteus, the medium -N "Nissui" for sensitivity disc, to E.tarda, the "Nissui" 1% mannitol containing SS agar medium, the A.hydrophila, Heart Fu John bouillon ""Nissui" agar medium and 1.5% NaCl-containing heart infusion bouillon "Nissui" agar medium were used for V.anguillarum , respectively.

＜結果と考察＞
＜コイおよびニジマス赤血球膜とヒト赤血球膜との比較＞
実施例１の方法により、コイから血液を採取し、赤血球を単離した後、得られた赤血球から赤血球膜を MichelとRudloffの方法を改変した実施例２の方法で調製した。コイ血液 30 mlあたり、タンパク質量 約90 mgの赤血球膜を調製した。
次に、得られたコイ赤血球膜を SDSによって可溶化してSDS-電気泳動を行い、CBB染色を行った。結果を図１に示した。ヒト赤血球膜と比較してみると、赤血球膜中に含まれる主要タンパク質はコイではバンド 4.1および 4.2の含量に若干の差異が認められたが、ほぼヒト赤血球膜の泳動パターンと一致した結果となった。ヒトで主要な膜タンパク質である バンド３ や、骨格タンパク質であるバンド1,2 やバンド 5,6,7など、ヒトと対応するタンパク質が検出された。コイのバンド３ はヒトと同様に主要な膜タンパク質として検出され、泳動上の分子量は 約105kDa でヒト(95 kDa)とほぼ同様の結果となった。この結果より、スペクトリンやアンキリン、アクチンおよびバンド３などの赤血球膜の形状を構成するタンパク質はコイとヒトでは差異がない事が示された。 <Results and discussion>
<Comparison between carp and rainbow trout erythrocyte membrane and human erythrocyte membrane>
After collecting blood from carp by the method of Example 1 and isolating erythrocytes, an erythrocyte membrane was prepared from the obtained erythrocytes by the method of Example 2 in which the method of Michel and Rudloff was modified. An erythrocyte membrane having a protein amount of about 90 mg per 30 ml carp blood was prepared.
Next, the obtained carp erythrocyte membrane was solubilized with SDS, subjected to SDS-electrophoresis, and CBB staining was performed. The results are shown in FIG. Compared with the human erythrocyte membrane, the major protein contained in the erythrocyte membrane showed a slight difference in the contents of bands 4.1 and 4.2 in carp, but the results almost coincided with the migration pattern of the human erythrocyte membrane. It was. Proteins corresponding to humans were detected, such as band 3 which is a major membrane protein in humans, and band 1 and 2 and bands 5, 6 and 7 which are skeleton proteins. Carp band 3 was detected as a major membrane protein like humans, and the molecular weight on electrophoresis was about 105 kDa, which was almost the same as that of humans (95 kDa). From this result, it was shown that the proteins constituting the shape of erythrocyte membrane such as spectrin, ankyrin, actin and band 3 are not different between carp and human.

一方、コイ赤血球膜をSDS-電気泳動後、PAS染色した結果、CBB染色で バンド３が検出された位置付近に主要な糖タンパク質のバンドが検出された。コイの主要な糖タンパク質のバンドが示す分子量は約112 kDaであり、主要なバンドの上部にあるバンドは 約203 kDaであった。ヒトの主要なグリコホリンであるグリコホリンＡは、２量体としてコイの主要なグリコホリンが検出された位置とほぼ同じ位置に検出された。SDS-電気泳動の挙動で観ると、コイのグリコホリンはヒトグリコホリンＡに相当するものと考えられたが、ヒトのように低分子域に出現する他のグリコホリンは検出されなかった。   On the other hand, the carp erythrocyte membrane was subjected to SDS-electrophoresis followed by PAS staining. As a result, a major glycoprotein band was detected in the vicinity of the position where band 3 was detected by CBB staining. The molecular weight of the carp major glycoprotein band was approximately 112 kDa, and the band above the major band was approximately 203 kDa. Glycophorin A, which is a major human glycophorin, was detected as a dimer at almost the same position where the major glycophorin of carp was detected. Looking at the behavior of SDS-electrophoresis, carp glycophorin was considered to correspond to human glycophorin A, but other glycophorins appearing in a low molecular weight region like humans were not detected.

＜コイ赤血球膜からのグリコホリン抽出＞
実施例２の方法に従って調製したコイ赤血球膜より、LIS-フェノール法とストレプトマイシン処理を用いてコイのグリコホリンを抽出した（実施例３）。コイ血液 20mlあたりグリコホリンはタンパク質量で 約270μg得られた。
SDS-電気泳動を行った結果、CBB染色で一本のバンドが検出された位置とPAS染色でバンドが検出された位置が一致した事から、コイグリコホリンは糖タンパク質として単離されたと判断した。PAS染色での主要なバンドの上部に検出されたバンドは、二次元電気泳動およびHPLCを用いたゲルろ過クロマトグラフィーの結果により(データ未掲載)、主要なバンドとして出現した糖タンパク質の２量体であると判断した。以上の結果より、コイ赤血球膜中には主要なグリコホリンが１種類のみ存在すると思われるが、ヒトグリコホリンＡのように通常２量体として存在しているかどうかは確認できなかった。 <Glycophorin extraction from carp erythrocyte membrane>
Carp glycophorin was extracted from carp erythrocyte membranes prepared according to the method of Example 2 using the LIS-phenol method and streptomycin treatment (Example 3). About 20 µg of glycophorin was obtained per 20 ml of carp blood.
As a result of SDS-electrophoresis, the position where a single band was detected by CBB staining coincided with the position where a band was detected by PAS staining. Therefore, it was judged that carp glycophorin was isolated as a glycoprotein. . The band detected at the top of the main band in PAS staining is a dimer of glycoprotein that appeared as the main band based on the results of two-dimensional electrophoresis and gel filtration chromatography using HPLC (data not shown). It was judged that. From the above results, it seems that only one major glycophorin is present in the carp erythrocyte membrane, but it was not possible to confirm whether it was normally present as a dimer like human glycophorin A.

＜コイグリコホリンのアミノ酸組成＞
コイグリコホリンのアミノ酸組成の結果を表１に示す。コイグリコホリンのアミノ酸組成は、プロリン、リジンの割合が多かったが、報告されているヒトグリコホリン（J. Azuma et al., J.Biochem 73, 1127(1973)）との差異はあまり認められなかった。
<Amino acid composition of carp glycophorin>
The results of the amino acid composition of carp glycophorin are shown in Table 1. The amino acid composition of carp glycophorin was high in proline and lysine, but there was not much difference from the reported human glycophorin (J. Azuma et al., J. Biochem 73, 1127 (1973)). There wasn't.

＜コイグリコホリン中のシアル酸同定＞
コイグリコホリンに含まれるシアル酸を実施例７に述べた方法で同定を行った。薄層クロマトグラフィーでのスポットの Rf値が NGNA(N-グリコリルノイラミン酸)と一致し（図２、NGNAの呈色反応でも陽性になり、さらにSugar Pack Pbを用いた結果もNGNAと保持時間が一致した事から(図３)、グリコホリンに含まれる主要なシアル酸は NGNAであると判断した。ヒトグリコホリンに含まれるシアル酸は NANAであり、ヒトグリコホリンとは含有シアル酸の種類で異なっていた。
コイの赤血球膜の構成タンパク質やグリコホリンのタンパク質は、ヒトと比較して大きな差異は認められず、コイグリコホリンの糖鎖の構成に差異が認められた。 <Identification of sialic acid in carp glycophorin>
The sialic acid contained in cariglycophorin was identified by the method described in Example 7. The Rf value of the spot in thin-layer chromatography agrees with that of NGNA (N-glycolylneuraminic acid) (Figure 2, NGNA color reaction is also positive, and the results using Sugar Pack Pb are also retained with NGNA. Since the time coincided (Fig. 3), the main sialic acid contained in glycophorin was determined to be NGNA, which is NANA, which is the type of sialic acid contained in human glycophorin. It was different.
The carp erythrocyte membrane protein and glycophorin protein were not significantly different from humans, and the sugar chain composition of carp glycophorin was different.

＜コイグリコホリン中のアミノ糖の同定＞
コイグリコホリンに含まれるアミノ糖を実施例６で述べた方法で同定をおこなった。薄層クロマトグラフィーでのスポットの Rf値が ガラクトサミンと一致した（図４）。アミノ糖は加水分解時にN-アセチル基が遊離するため、グリコホリンの結合糖鎖に含まれるアミノ糖はN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)と推定した。 <Identification of amino sugar in carp glycophorin>
The amino sugar contained in carp glycophorin was identified by the method described in Example 6. The Rf value of the spot in thin layer chromatography was consistent with galactosamine (Figure 4). Since amino sugars liberate N-acetyl groups upon hydrolysis, the amino sugar contained in the glycophorin binding sugar chain was assumed to be N-acetylgalactosamine (GalNAc).

＜コイグリコホリンの血液型活性＞
単離したコイグリコホリンの生理活性として MN型および Ss型の抗原性を実施例９に述べた方法で検討した。その結果、抗Ｎ血清を用いた支持体に明確な沈降線が観察された（図５）。さらに抗Ｎ血清とコイ赤血球を用いた反応で、顕微鏡下において部分凝集が観察されたことからコイグリコホリンは弱い抗Ｎ活性を有すると推察した。しかしながら、ヒトグリコホリンで観察される他の血液型活性は確認できなかった。さらに、遊離糖鎖画分(実施例１２参照)のみでは抗Ｎ活性は確認できず、沈降線も検出されなかった。ヒトのMN型決定基でも、糖鎖とそのタンパク質結合部分が活性を持つとされており、コイも糖鎖のみでは血液型活性は確認できなかった。 <Blood group activity of carp glycophorin>
As the physiological activity of the isolated carp glycophorin, the antigenicity of MN type and Ss type was examined by the method described in Example 9. As a result, clear sedimentation lines were observed on the support using anti-N serum (FIG. 5). Furthermore, in the reaction using anti-N serum and carp erythrocytes, partial aggregation was observed under a microscope, so that carp glycophorin was presumed to have weak anti-N activity. However, other blood group activities observed with human glycophorin could not be confirmed. Furthermore, anti-N activity could not be confirmed only with the free sugar chain fraction (see Example 12), and no sedimentation line was detected. Even in human MN-type determinants, sugar chains and their protein binding parts are said to have activity, and blood group activity could not be confirmed with carp or sugar chains alone.

＜レクチンとの相互作用＞
レクチンとの吸着試験の結果を図６〜図８に示した。ABAカラムに吸着する事から、O-グリコシド型糖鎖であり、コアＩ構造(Gal→GalNAc→Ser/Thr)を持っていると推定された。さらに PHA L4および E4に吸着しない事から、コイグリコホリンには N-グリコシド型糖鎖は含まれていないと推定した。PNAに吸着せず、WGAに吸着する事から、シアル酸が含まれており、RCAＩに吸着することから、非還元末端の一部にGalかシアル酸が存在すると推定された。また、ConA, LCA および UEAに吸着する結果より、糖鎖には αGlcと Fucが含まれると推定した。 <Interaction with lectins>
The results of the adsorption test with lectins are shown in FIGS. Since it adsorbs to the ABA column, it was presumed that it was an O-glycoside type sugar chain and had a core I structure (Gal → GalNAc → Ser / Thr). Furthermore, because it does not adsorb to PHA L4 and E4, it was estimated that carp glycophorin does not contain N-glycoside type sugar chains. It was presumed that Gal or sialic acid was present in a part of the non-reducing end because sialic acid was contained because it did not adsorb to PNA but adsorbed to WGA, and adsorbed to RCI. From the results of adsorption to ConA, LCA and UEA, it was estimated that αGlc and Fuc were included in the sugar chain.

＜各種細菌およびウィルスとコイグリコホリンの相互作用＞
単離したコイグリコホリンと各種細菌およびウィルスの相互作用を検討するため、実施例１１に記載の方法を用いて凝集反応を行った。供試したA. hydrophila, E. tarda, V.anguillarum, M. luteus および魚病ウィルスであるIPNにおいて凝集反応は見られず、またコイ赤血球への吸着能も確認できなかった。
V. anguillarum および M. luteus とグリコホリンの反応をＳＥＭで観察した結果、共にグリコホリン添加のものとコントロールで差異が認められた（図９）。
V. anguillarumでは菌体には変化がなかったが（図９（Ａ）及び（Ｂ））、鞭毛に球状の物質(直径約 80〜150 nm)が吸着しており、また M. luteusでは菌体の表面が球状の物質によって覆われているように観察された（図９（Ｃ）及び（Ｄ））。 <Interaction between various bacteria and viruses and carp glycophorin>
In order to examine the interaction between the isolated carp glycophorin and various bacteria and viruses, an agglutination reaction was performed using the method described in Example 11. In the tested A. hydrophila , E. tarda , V. anguillarum , M. luteus and IPN which is a fish disease virus, no agglutination reaction was observed, and the ability to adsorb to carp erythrocytes could not be confirmed.
As a result of observing the reaction of V. anguillarum and M. luteus with glycophorin by SEM, there was a difference between the glycophorin added and the control (FIG. 9).
In V. anguillarum , there was no change in the cells (FIGS. 9A and 9B), but a spherical substance (approximately 80 to 150 nm in diameter) was adsorbed on flagella, and in M. luteus It was observed that the surface of the body was covered with a spherical substance (FIGS. 9C and 9D).

＜遊離糖鎖の分画＞
コイグリコホリンに含まれる糖鎖はβ-脱離によって遊離した事から、O-グリコシド結合でタンパク質部分と結合していると判断した。さらに、HPLCを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより、遊離糖鎖は２つのピークとして検出された（図１０）。シアリルオリゴ糖のスタンダード(N-アセチルノイラミン酸、オリゴマーキット：マルキン醤油製)で解析した結果(データ未掲載)、ピーク１はシアル酸が１つ結合した糖鎖であり、ピーク２はシアル酸が２つ結合した糖鎖であった。しかし、205 nmの吸光度は糖以外の感受性も高く、画分中の糖含量はピーク１の方が高い結果となった。 <Fractionation of free sugar chains>
Since the sugar chain contained in carp glycophorin was released by β-elimination, it was judged that it was bound to the protein part by an O-glycoside bond. Furthermore, free sugar chains were detected as two peaks by anion exchange chromatography using HPLC (FIG. 10). Results of analysis using sialyl oligosaccharide standard (N-acetylneuraminic acid, oligomer kit: manufactured by Marquine Soy Sauce) (data not shown), peak 1 is a sugar chain to which one sialic acid is bound, and peak 2 is sialic acid Was a sugar chain in which two were bound. However, the absorbance at 205 nm was high in sensitivity other than sugar, and the sugar content in the fraction was higher in peak 1.

＜糖鎖中の中性糖測定＞
HPLCで分取した画分ピーク１およびピーク２を実施例１４に従って加水分解を行い、中性糖を調製した。それぞれの中性糖画分をHPLCと電気化学検出器を用いて分析した結果、ピーク１およびピーク２とも Fuc、Galおよび Glcが検出された（図１１）。GalとGluの中間にあるピークは、3,6-Anhydro-D-galactoseの標品(Sigma)を用いた分析やスサビノリ細胞壁の分析(データ未掲載)により、Galが加水分解時に脱水されて形成された3,6-Anhydro- D-galactoseであると判断した。上記試験の結果より、結合糖鎖は O-グリコシド型糖鎖であり、コアＩ構造(Gal→βGalNAc→Ser/Thr)を持ち、さらにαGlcとFucが含まれると推定されたが、それを裏付ける結果となった。
＜グリコホリンの抗菌活性＞
図１２及び図１３には、グリコホリンの抗菌活性を確認したときのディスクの写真図を示した。なお、図１２は透過光にて観察したもの、図１３は反射光にて観察したものである。
図１２は、E.tardaに対するグリコホリンの抗菌活性を測定した結果である。写真中の符号は、ディスク中に添加した物質を意味しており、それぞれ（ａ）コイ赤血球膜（5 mg protein / disc)、（ｂ）ストレプトマイシン処理を施していないグリコホリン（17 μg protein /disc）、（ｃ）グリコホリン画分（15 μg protein / disc）、（ｄ）コイグリコホリンからの炭水化物画分（4 μg / disc）、（ｅ）ＨＰＬＣによって分取した糖鎖画分（Ｐ−１）（0.3μg / disc）である。（ａ）〜（ｅ）のいずれにおいても、中央のディスクの周囲には、E.tarda の増殖を阻止する円（阻止円）が観察された。特に、グリコホリン画分（ｃ）のみならず、その糖鎖画分（ｅ）にも抗菌活性が認められた。
図１３は、各種細菌に対するコイグリコホリンの抗菌活性を測定した結果である。写真中の符号は、（ａ）B. subtilis に対して、ストレプトマイシン処理を施さないグリコホリン（17μg protein / disc）をディスクに添加したもの、（ｂ）B. subtilis に対して、グリコホリン（15 μg protein/ disc）をディスクに添加したもの、（ｃ）A. hydrophila に対して、ストレプトマイシン処理を施さないグリコホリン（17 μg protein / disc）をディスクに添加したもの、（ｄ）A. hydrophila に対して、グリコホリン（15 μg protein /disc）をディスクに添加したもの、（ｅ）M. luteus に対して、グリコホリン(15 μg protein / disc）をディスクに添加したもの、及び（ｆ）V.anguillarum に対して、グリコホリン(15 μg protein / disc）をディスクに添加したものである。（ａ）〜（ｆ）のいずれにおいても、グリコホリンは阻止円を形成したとこから、広いスペクトルの抗菌活性を備えていることが示唆された。
なお、ピーク２及びシアル酸が欠如したオリゴ糖では抗菌活性は示されなかった（データ未掲載）。 <Measurement of neutral sugars in sugar chains>
Fraction peaks 1 and 2 fractionated by HPLC were hydrolyzed according to Example 14 to prepare neutral sugars. As a result of analyzing each neutral sugar fraction using HPLC and an electrochemical detector, Fuc, Gal and Glc were detected in both peak 1 and peak 2 (FIG. 11). A peak in the middle of Gal and Glu is formed when Gal is hydrolyzed by analysis using a 3,6-Anhydro-D-galactose preparation (Sigma) or analysis of the Susavino cell wall (data not shown). Was determined to be 3,6-Anhydro-D-galactose. From the results of the above test, it was estimated that the linking sugar chain is an O-glycoside type sugar chain, has a core I structure (Gal → βGalNAc → Ser / Thr), and further contains αGlc and Fuc. As a result.
<Antimicrobial activity of glycophorin>
FIG. 12 and FIG. 13 show a photograph of the disc when the antibacterial activity of glycophorin was confirmed. Note that FIG. 12 is observed with transmitted light, and FIG. 13 is observed with reflected light.
FIG. 12 shows the results of measuring the antibacterial activity of glycophorin against E. tarda. The code in the photo means the substance added to the disc. (A) Carp erythrocyte membrane (5 mg protein / disc), (b) Glycophorin not treated with streptomycin (17 μg protein / disc) (C) glycophorin fraction (15 μg protein / disc), (d) carbohydrate fraction from carp glycophorin (4 μg / disc), (e) sugar chain fraction fractionated by HPLC (P-1) (0.3 μg / disc). In any of (a) to (e), a circle (blocking circle) that inhibits the growth of E.tarda was observed around the central disk. In particular, antibacterial activity was observed not only in the glycophorin fraction (c) but also in the sugar chain fraction (e).
FIG. 13 shows the results of measuring the antibacterial activity of carp glycophorin against various bacteria. The code in the photograph is (a) B. subtilis added with glycophorin (17 μg protein / disc) not subjected to streptomycin treatment, (b) B. subtilis , glycophorin (15 μg protein / disc) added to the disc, (c) A. hydrophila added with glycophorin without streptomycin treatment (17 μg protein / disc), (d) A. hydrophila added to the disc, Glycophorin (15 μg protein / disc) added to the disc, (e) M. luteus , glycophorin (15 μg protein / disc) added to the disc, and (f) V. anguillarum Glycophorin (15 μg protein / disc) was added to the disc. In any of (a) to (f), glycophorin formed a blocking circle, suggesting that it has a broad spectrum of antibacterial activity.
In addition, antimicrobial activity was not shown by the oligosaccharide lacking peak 2 and sialic acid (data not shown).

＜まとめ＞
ヒトグリコホリンはMN式やSs式血液型決定基を有し、さらにインフルエンザウィルスやマラリア、センダイウィルスなどの受容体として生体防御機能など種々の生理活性を有している。このグリコホリンが魚類にも存在すれば様々な生理機能、特に生体防御機能を持つと思われ、魚類のグリコホリンでの可能性を探索した。
赤血球膜を可溶化した後のSDS-電気泳動による分析の結果、コイやニジマスの赤血球膜にもヒトと同様にグリコホリンが存在するのが確認された。しかしながら、コイの場合はヒトと比較して検出し難く、種類も１種のみ確認された。コイグリコホリン中のタンパク質のアミノ酸組成は、ヒトグリコホリンと比較して大きな差異は認められなかったが、タンパク質に結合している糖鎖に含まれるシアル酸はヒトとは異なりNGNAであった。グリコホリン中のシアル酸がNANAでなく、NGNAであるという報告は、ウマ、ニホンサルなどでなされており、また魚類ではニジマスやシロザケ、ヤマメの卵にNGNAが含まれている事が報告されている。 <Summary>
Human glycophorin has MN-type and Ss-type blood group determinants, and also has various physiological activities such as a biological defense function as a receptor for influenza virus, malaria, Sendai virus and the like. If this glycophorin is also present in fish, it seems to have various physiological functions, in particular, a biological defense function, and we investigated the possibility of fish with glycophorin.
As a result of SDS-electrophoresis analysis after solubilizing the erythrocyte membrane, it was confirmed that glycophorin was also present in the erythrocyte membrane of carp and rainbow trout as in humans. However, carp was harder to detect than humans, and only one kind was confirmed. The amino acid composition of the protein in carp glycophorin was not significantly different from that of human glycophorin, but the sialic acid contained in the sugar chain bound to the protein was NGNA unlike humans. Reports that sialic acid in glycophorin is not NANA but NGNA have been made in horses, Japanese monkeys, etc. In fish, it has been reported that rainbow trout, chum salmon, and trout eggs contain NGNA.

ヒトグリコホリンＡで存在するMN式血液型活性を、コイグリコホリンで検討したところ、コイは弱い抗Ｎ活性を有した。しかしながら、ヒトグリコホリンで観察される他の血液型活性は確認できなかった。次いでレクチンとの作用を検討した結果、かなり多様なレクチンと結合する事から、コイグリコホリン中の結合糖鎖はヒトとは構成糖や構造上の差異があると推定された。
単離したコイグリコホリンと各種細菌およびウィルスの相互作用を検討したが、凝集反応は観察されなかった。しかしながら、電子顕微鏡観察では多数の球状物質がグラム陰性菌では鞭毛に、グラム陽性菌では菌体に吸着しているように観察された。
さらに、感受性ディスク試験の結果、グリコホリンの糖鎖部分が抗菌活性を有することが確認された。このことより、電子顕微鏡下で観察された多数の球状物質は、グリコホリンのタンパク質部分が疎水結合によって凝集したグリコホリン多量体であり、この表面を糖鎖が覆い、これにグラム陰性菌では鞭毛が、またグラム陽性菌では菌体が吸着することにより、抗菌活性が生じたと推定された。 When the MN blood group activity existing in human glycophorin A was examined with carp glycophorin, carp had weak anti-N activity. However, other blood group activities observed with human glycophorin could not be confirmed. Next, as a result of examining the action with lectins, it was presumed that the binding sugar chains in carp glycophorin had structural sugars and structural differences from humans because they bound to a wide variety of lectins.
The interaction between the isolated carp glycophorin and various bacteria and viruses was examined, but no aggregation reaction was observed. However, electron microscopic observations showed that many spherical substances were adsorbed on flagella in gram-negative bacteria and on cells in gram-positive bacteria.
Furthermore, as a result of the sensitivity disk test, it was confirmed that the sugar chain part of glycophorin has antibacterial activity. From this fact, many spherical substances observed under an electron microscope are glycophorin multimers in which the protein portion of glycophorin is aggregated by hydrophobic bonds, and this surface is covered with sugar chains, and flagella in gram-negative bacteria. In addition, it was estimated that antibacterial activity was caused by the adsorption of bacterial cells in Gram-positive bacteria.

このように本実施形態によれば、コイグリコホリン及び、そのグリコホリンから遊離した抗菌性オリゴ糖を得ることができる。   Thus, according to the present embodiment, carp glycophorin and antibacterial oligosaccharide released from the glycophorin can be obtained.

コイ赤血球膜をＳＤＳで可溶化して、ＳＤＳ−電気泳動を行ったときのゲルの写真図である。レーン１〜レーン５はＣＢＢ染色してタンパク質を検出した結果であり、レーン６及び７はＰＡＳ染色して糖タンパク質を検出した結果である。レーン１及びレーン５は、分子量マーカであり、ミオシン（２０５ｋＤａ）、β−ガラクトシダーゼ（１１６ｋＤａ）、フォスフォリラーゼｂ（９７ｋＤａ）、ウシアルブミン（６６ｋＤａ）、卵アルブミン（４５ｋＤａ）、カルボニックアンヒドラーゼ（２９ｋＤａ）を含む。また、レーン２はヒト赤血球膜、レーン３及びレーン６はコイ赤血球膜、レーン４及びレーン７は単離コイグリコホリンを電気泳動したものである。なお、レーン２及びレーン３に示した番号は、ヒト赤血球膜において同定されているタンパク質である。It is a photograph of a gel when a carp erythrocyte membrane is solubilized with SDS and subjected to SDS-electrophoresis. Lanes 1 to 5 are the results of detecting proteins by CBB staining, and lanes 6 and 7 are the results of detecting glycoproteins by PAS staining. Lanes 1 and 5 are molecular weight markers, myosin (205 kDa), β-galactosidase (116 kDa), phosphorylase b (97 kDa), bovine albumin (66 kDa), egg albumin (45 kDa), carbonic anhydrase (29 kDa). )including. Lane 2 is a human erythrocyte membrane, lane 3 and lane 6 are carp erythrocyte membranes, lane 4 and lane 7 are electrophoresed with isolated carp glycophorin. The numbers shown in lanes 2 and 3 are proteins that have been identified in the human erythrocyte membrane. コイグリコホリン中のシアル酸を薄層クロマトグラフィーにかけた結果を示す写真図である。図中、ＮＡＮＡは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（N-acetylneuraminic acid）を、ＮＧＮＡは、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（N-glycorylneuraminic acid）を、ＧＰは、コイグリコホリン中のシアル酸（sialic acid from glycophorin）をそれぞれ意味している。It is a photograph figure which shows the result of having applied the sialic acid in koi glycophorin to the thin layer chromatography. In the figure, NANA is N-acetylneuraminic acid, NGNA is N-glycorylneuraminic acid, and GP is sialic acid in koiglycophorin. acid from glycophorin).

Sugar Pack Pb カラムを用いて、シアル酸のクロマトグラフィを実施したときの結果を示すチャートである。（ａ）NGNA 及び NANA を含む標準溶液の結果、（ｂ）コイグリコホリン中のシアル酸の結果である。It is a chart which shows the result when the chromatography of sialic acid is implemented using Sugar Pack Pb column. (A) Result of standard solution containing NGNA and NANA, (b) Result of sialic acid in cariglycophorin. コイグリコホリン中のヘキソサミンを薄層クロマトグラフィーにかけた結果を示す写真図である。図中、ＧｌｕＮＡｃは、Ｎ−アセチルグルコサミン（N-acetylglucosamine）を、ＧａｌＮＡｃは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（N-acetylgalactosamine）を、ＧＰは、グリコホリン中のヘキソサミン（hexosamine from glycophorin）をそれぞれ意味している。なお、写真の関係で必ずしも明瞭ではないが、ＧＰには、ガラクトサミン（Galactosamine）と同じ位置にバンドが確認された。It is a photograph figure which shows the result of having applied the hexosamine in koi glycophorin to the thin layer chromatography. In the figure, GluNAc means N-acetylglucosamine, GalNAc means N-acetylgalactosamine, and GP means hexosamine from glycophorin. In addition, although it is not necessarily clear due to the relationship of photographs, a band was confirmed in GP at the same position as galactosamine.

コイグリコホリンの免疫活性測定（二重拡散法）を行ったときの結果を示す写真図である。中心のウエルには、（Ｎ）抗Ｎ血清（ウサギ）、（Ｍ）抗Ｍ血清（ウサギ）、（Ｓ）抗Ｓ血清（ヒト）、（ｓ）抗ｓ血清（ヒト）が含まれている。外側のウエルには、コイグリコホリンが、１２時の位置から始まって時計回りに２倍希釈列で含まれている。It is a photograph figure which shows the result when the immunoactivity measurement (double diffusion method) of carp glycophorin is performed. The central well contains (N) anti-N serum (rabbit), (M) anti-M serum (rabbit), (S) anti-S serum (human), (s) anti-s serum (human). . The outer well contains koiglycophorin in a 2-fold dilution series clockwise starting from the 12 o'clock position. レクチンカラムにおけるコイグリコホリンの挙動を示すグラフである。グラフは、それぞれＡＢＡ−Ｉ（Ａ）、ＰＨＡ−Ｌ4（Ｂ）、及びＰＨＡ−Ｅ4（Ｃ）レクチンカラムを用いたときのものである。図中の矢印は、溶出液を変更した時点を示す。It is a graph which shows the behavior of carp glycophorin in a lectin column. The graphs are obtained using ABA-I (A), PHA-L4 (B), and PHA-E4 (C) lectin columns, respectively. The arrow in the figure indicates the time when the eluate was changed. レクチンカラムにおけるコイグリコホリンの挙動を示すグラフである。グラフは、それぞれＰＮＡ（Ｄ）、ＷＧＡ（Ｅ）、及びＲＣＡ120（Ｆ）レクチンカラムを用いたときのものである。図中の矢印は、溶出液を変更した時点を示す。It is a graph which shows the behavior of carp glycophorin in a lectin column. The graphs are obtained using PNA (D), WGA (E), and RCA120 (F) lectin columns, respectively. The arrow in the figure indicates the time when the eluate was changed.

レクチンカラムにおけるコイグリコホリンの挙動を示すグラフである。グラフは、それぞれＣｏｎＡ（Ｇ）、ＬＣＡ（Ｈ）、及びＵＥＡ−Ｉ（Ｉ）レクチンカラムを用いたときのものである。図中の矢印は、溶出液を変更した時点を示す。It is a graph which shows the behavior of carp glycophorin in a lectin column. The graphs are obtained using ConA (G), LCA (H), and UEA-I (I) lectin columns, respectively. The arrow in the figure indicates the time when the eluate was changed. V. anguillarum （（Ａ）コントロール、（Ｂ）コイグリコホリン添加）、及びM. luteus （（Ｃ）コントロール、（Ｄ）コイグリコホリン添加）とグリコホリンの反応をＳＥＭで観察したときの写真図である。 In the photograph when the reaction of V. anguillarum ((A) control, (B) carp glycophorin addition) and M. luteus ((C) control, (D) carp glycophorin addition) and glycophorin is observed with SEM. is there. コイグリコホリンに含まれる遊離糖鎖をＨＰＬＣで分析したときのチャート及び、分析条件を示す図である。It is a figure which shows the chart when analyzing the free sugar chain contained in carp glycophorin by HPLC, and analysis conditions. ＨＰＬＣによる画分ピーク１及び２を加水分解し、ＨＰＬＣと電気化学検出器とを用いた分析した結果を示すチャートである。ピーク１（上図）及びピーク２（下図）のいずれにおいても、Ｆｕｃ、Ｇａｌ、及びＧｌｃが検出された。It is a chart which shows the result of having hydrolyzed the fraction peaks 1 and 2 by HPLC, and having analyzed using HPLC and an electrochemical detector. Fuc, Gal, and Glc were detected in both peak 1 (upper figure) and peak 2 (lower figure). E.tarda に対して、コイグリコホリンまたは、それに含まれる多糖類が示す抗菌活性を評価したときのディスクの様子を示す写真図である。It is a photograph figure which shows the mode of a disk when the antibacterial activity which koi glycophorin or the polysaccharide contained in it evaluates with respect to E.tarda is evaluated. 各種細菌に対して、コイグリコホリンが示す抗菌活性を評価したときのディスクの様子を示す写真図である。It is a photograph figure which shows the mode of a disk when the antibacterial activity which koi glycophorin shows with respect to various bacteria is evaluated.

Claims (1)

コイ血液から赤血球を単離し、赤血球から赤血球膜を調製した後に、Lithium3,5-Diiodosalicylate又は、Lithium
Dodecyl Sulfateの２つの群からなるリチウム塩と、フェノール及びストレプトマイシン水溶液を用いることによって、グリコホリンを抽出・精製し、更にグリコホリン中の結合糖鎖を遊離させ、精製することを特徴とするコイグリコホリン及び結合糖鎖の精製方法。 After isolating red blood cells from carp blood and preparing red blood cell membranes from red blood cells , Lithium 3,5-Diiodosalicylate or Lithium
By using lithium salt consisting of two groups of Dodecyl Sulfate , phenol and streptomycin aqueous solution, glycophorin is extracted and purified, and further , the binding sugar chain in glycophorin is released and purified, A method for purifying conjugated sugar chains.