JP4804467B2 - 多重rnaポリメラーゼiiiプロモーター発現構築物 - Google Patents
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Description
本出願は、2004年8月23日出願の米国仮出願第60/603,622号、および2004年11月22日出願の米国仮出願第60/629,942号の利益を主張するが、その各々はその全体が参照により本明細書で援用される。
本発明の分野は、概して、疾患または異常な細胞機能に関係する遺伝子の阻害に有用である小さな人工的に作り出されたRNA分子の豊富な産生を、効果的に(細胞、組織、または生物内で)方向づける能力を有する新規組換えDNA分子の使用方法および組成物である。具体的には、本発明は、ヒト治療用に適切なデザインを用いる単一組換えDNA分子から多量(2、3、4、5もしくはそれ以上)の相異なる小さなRNA分子の同時の産生のための手段を提供する。
最近、RNAiまたは二本鎖RNA(dsRNA)介在遺伝子サイレンシングの現象が認められているが、それによって細胞または生物における標的遺伝子の領域と相補的なdsRNAは、標的遺伝子の発現を阻害する(例えば、1999年7月1日公開の国際公開第99/32619号パンフレット、ファイアー(Fire)ら、米国特許第6,506,559号明細書:「二本鎖RNAによる遺伝子阻害(Genetic Inhibition by Double− Stranded RNA)」、国際公開第00/63364号パンフレット: 「ポリヌクレオチド配列を阻害するための方法および組成物(Methods and Compositions for Inhibiting the Function of Polynucleotide Sequences)」、パチュック(Pachuk)とサチシュチャンドラン(Satishchandran)、および米国仮特許出願第60/419,532号明細書、2002年10月18日出願、(国際公開第2004/035765号パンフレット、2004年4月29日公開:「二本鎖RNA構造物および構築物、およびその生成および使用の方法(Double−Stranded RNA Structures and Constructs,and Methods for Generating and Using the Same)」を参照)。二本鎖RNA(dsRNA)遺伝子サイレンシングは、核酸に基づく技術の特に面白い潜在的な応用を提供する。二本鎖RNAは多くの異なる生物において遺伝子サイレンシングを誘発することが証明されている。遺伝子サイレンシングはさまざまな機序により発生しうるが、その1つは転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)である。転写後遺伝子サイレンシングにおいて、標的遺伝子座の転写は影響されないが、RNA半減期は減少する。外因性dsRNAは、線虫、トリパノソーマ、昆虫、および哺乳類を含む植物および動物におけるPTGSの有力な誘導因子であることが証明されている。転写遺伝子サイレンシング(TGS)は、遺伝子発現が調節されうる別の機序である。TGSにおいて、遺伝子の転写は阻害される。PTGSにおいて、細胞の細胞質コンパートメントはサイレンシング複合体の機構の位置である。TGSにおいて、dsRNAのエフェクターは細胞の核コンパートメントにおける表面上の活性である。調査、治療、および予防的適応に対するdsRNA介在遺伝子サイレンシングを利用する潜在的可能性はきわめて大きい。PTGSと関連した標的mRNA分解の優れた配列および体系的な特性は、この現象を機能的ゲノムおよび薬剤開発のために理想的なものにする。
一般に、本発明は、生物活性核酸、具体的には短いRNAエフェクター分子を製造するための新規核酸発現構築物およびそれらの使用する方法に関する。
配列番号1は、ヌクレオチド235−240の代わりに挿入されたSal I制限部位を有するヒト7SKプロモーターのヌクレオチド1−240を表す。
出願人は、具体的には、すべての引例の全内容を本開示において組込む。さらに、量、濃度、もしくは他の値またはパラメータが、範囲、好ましい範囲、または上限の好ましい値、および下限の好ましい値のリストとして示されると、これは範囲が個別に開示されているか否かに関係なく、上範囲限界もしくは好ましい値と下範囲限界もしくは好ましい値のいずれかの対によって形成されるすべての範囲を具体的に開示していると理解すべきである。数値の範囲が本明細書で挙げられる場合、別段に記載されていない限り、その範囲はそのエンドポイント、およびその範囲内のすべての整数および分数を含むことが意図されている。本発明の範囲は、範囲を規定する場合に開示された特定の値に限定されることは意図されていない。
本開示において、以下の次の語が、本明細書でより具体的に定義されているように、当業者の通例の理解に従って使用される。
RNA pol IIによって核で転写されたdsRNAによってPTGSを強化するには、1つもしくはそれ以上のイントロンおよび/またはポリアデニル化シグナルをdsRNAに添加し、転写RNAのプロセッシングを可能にすることができる。このプロセッシングは、スプライシングおよびポリアデニル化が核から細胞質への輸送を促進するため好ましい。また、ポリアデニル化はRNA pol II転写産物を安定化する。これらの同じ方法は、タンパク質へ翻訳される機能的mRNAの発現に有用となる。一部の実施形態において、原核抗生物質耐性遺伝子、例えば、ゼオマイシン発現カセットがイントロンに配置されている。他の例の原核の選択可能なマーカーとしては、米国特許第5,851,804号明細書のキメラカナマイシン抵抗性遺伝子を含むカナマイシン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、およびアンピシリンなど他の抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。ゼオマイシン遺伝子は原核プロモーターの調節制御下にあり、宿主細菌におけるゼオマイシンの翻訳は、開始ATGの上流の約10塩基対内に位置したシャイン・ダルガノ(Shine−Dalgarno)配列の存在によって確実にされる。あるいは、ゼオマイシン発現カセットは、ヘアピンの逆方向反復配列間(すなわち、サイレンシングされる標的核酸との実質的な同一性を有するセンスとアンチセンス配列間)の位置に配置されうる。
本発明の多重RNAポリメラーゼIIIプロモーター発現系は、本明細書の他の箇所に記載されているようにさまざまな医薬用途に有利に使用されうる。さまざまな実施形態において、医薬組成物は、約1ng〜約20mgの核酸、例えば、RNA、DNA、プラスミド、ウイルス、ベクター、組換えウイルス、またはその混合物を含むが、これらは所望の量の核酸分子(標的核酸と相同および相補のdsRNA、mRNA、ミクロRNA、アンチセンスRNA、三重形成RNA等)を提供する。一部の実施形態において、この組成物は、約10ng〜約10mgの核酸、約0.1mg〜約500mg、約1mg〜約350mg、約25mg〜約250mg、または約100mgの核酸を含有する。臨床薬理学の当業者は、ルーチンの実験を使用するかかる投与スケジュールに容易に達することができる。
本発明のDNAおよび/またはRNA構築物は、トランスフェクション促進剤なしに医薬ビヒクル中に調製された「裸の」DNA、RNA、またはDNA/RNAとして宿主細胞/組織/生物に投与されうる。より効果的な送達は、例えば、RNAおよび/またはDNA送達の当業者に周知のかかるポリヌクレオチドトランスフェクション促進剤を使用してDNAおよびRNA送達の当業者に周知のように達成されうる。以下は例として薬剤である。すなわち、ブピバカイン、陽イオン性脂質、リポソーム、または脂質粒子など局所麻酔剤を含む陽イオン性両親媒性化合物、ポリリシンなどポリカチオン、デンドリマーなど分岐三次元ポリカチオン、糖質、洗剤、または塩化ベンジルコニウムなどベンジルアンモニウム界面活性剤を含む界面活性剤。本発明において有用なかかる促進剤または架橋助剤の非限定的例は、米国特許第5,593,972号明細書、同第5,703,055号明細書、同第5,739,118号明細書、同第5,837,533号明細書、同第5,962,482号明細書、同第6,127,170号明細書、および同第6,379,965号明細書のほか、国際特許出願第03/093449号明細書、2003年11月13日公開(多機能的分子複合体および油/水陽イオン性両親媒性乳剤(multifunctional molecular complexes and oil/water cationic amphiphile emulsions))、および同第99/21591号明細書1999年5月6日公開(「遺伝物質の送達のための組成物および方法(Compositions and Methods for Delivery of Genetic Material)」に記載されており、その開示は参照により本明細書で援用される。米国特許第5,824,538号明細書、同第5,643,771号明細書、および同第5,877,159号明細書(参照により本明細書で援用)は、ポリヌクレオチド組成物以外の組成物、例えば、本発明の発現構築物を含有するトランスフェクトされたドナー細胞または細菌の送達を開示している。
本発明の態様のさらに別の実施形態において、細胞は真核植物細胞または動物細胞である。好ましくは、動物細胞は無脊椎動物または脊椎動物細胞(例えば、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞)である。細胞はエクスビボまたはin vivoでありうる。細胞は分化または未分化であり、配偶子、胚幹細胞を含む胚細胞、体細胞、例えば、癌細胞、成人または体幹細胞、免疫系の細胞、ニューロン細胞、平滑筋または心筋細胞を含む筋細胞、ホルモン産生細胞、血液細胞、肝細胞、脂肪細胞等でありうる。一部の実施形態において、ダイサー(Dicer)またはアルゴノート(Argonaut)など遺伝子サイレンシングに関与する1つもしくはそれ以上のタンパク質が、細胞または動物において過剰発現または活性化され、遺伝子発現の阻害の量を増大する。
通常、ヒト医薬用途に望ましいとみなされていないが、ヒトまたは哺乳類の複製起点が、他の用途、例えば、非臨床調査用に本発明の発現構築物に含まれうる。複製起点は、DNAプラスミドの核局在で複製されることを可能にし、したがって、発現を、発現のレベルおよび持続時間の両方を増強する。その利点は、より多くのプラスミドが核転写のために利用可能であり、したがって、より多くのエフェクター分子が作られることである(例えば、より多くのアンチセンス、mRNA、dsRNAヘアピン、ミクロRNA、および/またはより多くのdsRNA二本鎖)。多くの起点は種特異的であり、一部の哺乳類種で作用するが、全種で作用するわけではない。例えば、SV40T複製起点(例えば、クロンテック(Clontech)からのプラスミドpDsRed1−Mito由来;米国特許第5,624,820号明細書)はマウスでは機能的であるが、ヒトでは機能的ではない。したがって、この起点は、マウスで使用され、または試験されるベクター用に使用されうる。ヒト用途に使用されうる他の起点は、例えば、エプスタイン・バー核抗原(EBNA)起点などのものである(例えば、キアゲン(Qiagen)からのプラスミドpSES.TkおよびpSES.B)。これらの要素を含有するDNAベクターは市販されており、起点をコードするDNA部分は、起点を含有する制限断片を分離し、または起点をPCR増幅することによって、標準方法を使用して得られる。これらのベクターの制限マップおよび配列は公的に入手可能であり、当業者がこれらの配列を増幅し、または適切な制限断片を単離することを可能にする。これらのベクターは、SV40 TAgおよびEBNAなど適切な補助因子を発現する細胞の核で複製する。これらの因子の発現は、対応する複製起点を含有する市販ベクターの一部(例えば、キアゲン(Qiagen)からのプラスミドpSES.TkおよびpSES.B)もSV40 TagまたはEBNAを発現するため容易に達成される。複製起点を含有するこれらのDNA分子は、目的とするベクター(例えば、ヘアピンまたは二本鎖などdsRNAを発現するベクター)へ当業者によって容易にクローン化されうる。次いで、これらのベクターは、EBNAまたはTagを発現するベクターと共トランスフェクトされ、注入され、または投与され、それぞれ、EBNAまたはTag複製起点を持っているプラスミドの複製を可能にする。あるいは、EBNAまたはTagをコードする遺伝子は、標準方法を使用して目的とする細胞、動物、または生物において作用するようにデザインされた別の発現ベクターへクローン化される。EBNAおよびTagをコードする遺伝子は複製起点を持っている同じベクターへもクローン化されうる。適切な複製起点は、TagおよびEBNAに限定されておらず、例えば、レプリコール社(REPLICor Inc.)(Montreal、ケベック州(Quebec)は、付着されるDNA配列が複製するのを可能にする36個の塩基対の哺乳類起点コンセンサス配列を特定した(BioWorld Today、1999年、8月16日、第10巻、第157号で検討)。この配列は、複製を可能にする補助配列の共発現を必要としない。
ウイルス性肝炎は、それに対する十分な治療が未だ利用可能ではない主な世界の健康上の問題となっている。ワクチンがヒトB型肝炎に対する予防として利用可能であるが、ヒトC型肝炎、およびB型またはC型肝炎ウイルス、例えば、ヒトB型肝炎ウイルス(HBV)またはヒトC型肝炎ウイルス(HCV)のいずれかの感染に対しては利用可能ではなく、これらは多くの場合、結果として慢性ウイルス性肝疾患をもたらす。
本発明はさらに以下の実施例で規定される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示の目的で示されていることを理解すべきである。上記の議論およびこれらの実施例から、当業者は本発明の好ましい特徴を確認することができ、かつその精神および範囲を逸脱せずに、本発明のさまざまな変更および修正を行い、それをさまざまな使用および条件に適合させることができる。
標準の組換えDNA技術を使用することにより、細菌抗生物質選択マーカーおよび複製起点を含有するプラスミドを、以下の特異的プロモーター/shRNAの組合せの開始点として選択した。広く利用可能なpUC18ベクター(ヤニッシュ−ペロン(Yanish−Perron)ら、Gene 33:103−19頁(1985年)、erratum in Gene 114:81−83頁(1992年))のおよそ1kbの断片(アンピシリン耐性遺伝子と多重クローニング部位との間に細菌の複製起点を含有)を最初に米国特許第5,851,804号明細書で開示されたキメラカナマイシン耐性遺伝子と混合することによってプラスミドを製造した。インビトロジェン(Invitrogen)、クロンテック(Clontech)、ストラタジーン(Stratagene)、およびその他など供給元から得られるさまざまな市販のプラスミドベクターをベクター要素の代替源として使用し、または出発原料として使用するための出願人のベクターの代わりにし、以下のベクターの機能的に同等の変異体を製造することができる。ソース配列からベクターをアセンブルするために使用される方法としては、制限酵素消化、ゲル電気泳動、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、DNA配列決定、酵素ライゲーション、および米国特許第6,143,527号明細書に記載された「連鎖反応クローニング」、「架橋オリゴヌクレオチドを使用する連鎖反応クローニング」、パチュック(Pachuk)ら、および当業者に一般的かつ公知の他の方法が挙げられる。
実施例1:B型肝炎RNAの産生および複製を削減するshRNAの産生のためのトリシストロンRNAポリメラーゼIIIに基づく発現構築物。
3つの個別のRNAポリメラーゼIIIプロモーターの独立した制御下にshRNAを標的とする3つの異なるB型肝炎を発現するように一連のプラスミドを構成した。U6および7SKプロモーター/shRNAカセットをベクターの多重クローニング部位において互いに隣接して配置したが、遠位クローニング部位(カナマイシン耐性遺伝子に隣接)を第3のプロモーター配列(U6プロモーターまたはH1プロモーターの第2のコピーのいずれか)のために使用した。各々のshRNA要素の5’末端を、便利な制限部位、例えば、プロモーターの3’末端とshRNA配列の開始との間に6ntを導入することによって人工的に作り出されたSal IまたはHindIIIを使用して各々のプロモーターの3’末端と結合した。プロモーター要素の各々の配列は図4に示されている。トリシストロンベクターに配置され、2791、1907、および1737で識別された、HBV保存領域由来の3つのshRNA配列が図5に示されている。各々のshRNAgは、HBV配列の21bpで開始したのち、9個の塩基ループ要素(AGAGAACTT)、次いで第1の21bpの逆相補体である21のbp配列が続く。各々のプロモーターカセットは、転写ターミネーターとなる3’末端で5つのチミン残基の伸長を含有する。したがって、dsRNAヘアピンを含む予測転写産物は、実際に、追加の5’および3’配列を含有する。すなわち、6個の塩基から成る5’リーダー(例えば、Sal IもしくはHind IIIまたは他の選択認識配列)の後、dsRNAヘアピン配列が続いた後、短い3’末端U経路が続き、通常、2つ(1、2、3、もしくは4つ)のU残基が転写終結中に組込まれる。Sal IもしくはHind III部位の選択は便宜上のことであり、任意の数の他の制限部位、好ましくは、6または8つのカッター(例えば、Aat II、Acc65 I、Aci I、Afl II、Age I、Apa I、ApaL I、Asc I、Ase I、AsiS I、Avr II、BamH I、Bcl I、BfrB I、Bgl II、BmgB I、BseY I、BsiW I、BspD I、BspE I、BspH I、BsrB I BsrG I、BssH II、BssS I、BstB I、BstZ17 I、Cla I、Dra I、Eag I、EcoR I、EcoR V、Fse I、Fsp I、Hind III、Hpa I、Kas I、Kpn I、Mfe I、Mlu I、Msc I、Nae I、Nar I、Nco I、Nde I、NgoM IV、Nhe I、Not I、Nru I、Nsi I、Pac I、PaeR7 I、Pme I、Pml I、Pst I、PvuI、Pvu II、Sac I、Sac II、Sal I、Sbf I、Sca I、Sfo I、Sma I、SnaB I、Spe I、Sph I、Ssp I、Stu I、Swa I、Tli I、Xba I、Xho I、Xma I、好ましくはAvr I(CCTAGG)、BamH I(GGATCC)、EcoR I(GAATTC)、Hind III(AAGCTT)、Kpn I(GGTACC)、Nde I(CATATG)、Not I(GCGGCCGC)、Pst I(CTGCAG)、Sal I(GTCGAC)、またはXba I(TCTAGA))が代わりに使用されうるが、その場合、dsRNAヘアピン転写産物は異なる5’リーダー配列を含むことが認められるであろう。dsRNAヘアピンをフランキングする5’および3’転写産物配列の長さおよび組成物のこれらの差は、dsRNAヘアピンのdsRNA介在サイレンシングをもたらす能力に有害な影響を及ぼすようには思われなかったが、これは、合成dsRNA二本鎖と異なり、外因性に発現されたdsRNAヘアピン構築物が、多くの点、例えば、約19−29bs間のdsRNA「幹」の長さ、一本鎖ループの長さおよび組成物、追加の短い5’および/または3’配列の存在または非存在の点で変動にもかかわらず有効であることを示す。標的配列はHBVの多数の異なる単離株(菌株)間で同一であるものを明示的に表すように選択されたが、参照のために、shRNA配列は元のHBV単離株AYWにマッピングされ、位置779で開始し、799を通じて伸長する配列を含むshRNA 799を除く、shRNA 2791が単離株AYW(ジェンバンク(GenBank)(登録商標)登録番号V01460)の位置2791で開始し、shRNA 1907がジェンバンク(GenBank)(登録商標)基準配列等の位置1907で開始するようになりうる。保存HBVおよびHCV配列の選択については、例えば、国際公開第2005/014806号パンフレット、2005年2月17日公開、および米国仮特許出願第60/638,294号明細書、2004年12月22日出願、「遺伝子サイレンシングのために有用な保存HBVおよびHCV配列(Conserved HBV and HCV Sequences Useful for Gene Silencing)」を参照。好ましくは、19〜29個のヌクレオチド、例えば、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、または29個の連続保存ヌクレオチドのHBV標的配列が、本明細書で開示されているように発現されるdsRNAヘアピンにおいて使用するために選択されうる。本実施例の実験1において、プラスミドベクターは、7SKプロモーター1つのコピーおよび6プロモーターの2つのコピーを含有する。実験2におけるベクターでは、3つの異なるRNAポリメラーゼIIIプロモーター(7SKおよびU6に加えてH1プロモーター)が使用される。両方の実験において、7SKプロモーターの配向が逆である各々のプラスミドの別の変異体が使用される。本明細書の実施例では基本のSKプロモーターが使用されたが(図4A)、しかし、7SK−eおよび7SK−4A(それぞれ、図4dおよび4e)と呼ばれる、7SKプロモーターの2つの変異体の配列は、7SKプロモーターが示されているところで置換されうる。したがって、本実施例で使用される一連のベクターは4つの異なるプラスミドを含み、4つのベクターすべては、HBV RNAがトランスフェクトされた組織培養細胞で生成される2つの実験系においてHBV RNA発現の削減における有効性について試験されている。第1の系では、ルシフェラーゼタンパク質をコードするmRNAと結合される合成RNA分子を生成するために使用される無関係の一連のプラスミド構築物(融合構築物)が使用される。評価段階にあるプラスミドベクターのHBV RNA融合構築物の発現を削減する能力は、トランスフェクトされた細胞において生成されるルシフェラーゼ酵素活性の量を測定することによって評価される。第2の実験系では、評価段階にあるプラスミドベクターであるHBVレプリコンモデルが、クローン化HBVで共トランスフェクトされる。HBV複製および機能を阻害するプラスミドベクターの能力は、HBV表面抗原(HBV sAg)の測定によって評価される。
図9は、4つのポリメラーゼIIIプロモーターshRNAカセットを含有するベクターpHB4の図である。図のラベリングは、プロモーター名、関連shRNA(HBVゲノムの標的)、および各々のカセットの転写の方向を示す。ベクターは、shRNAカセットを段階的に追加する反復法を使用して上記のように構成された。図10におけるデータ(実施例1で使用されたものと基本的に同様のルシフェラーゼアッセイ)は、ベクターおよび測定可能な物質(ここではshRNA−799構築物を含む、実施例1におけるようにルシフェラーゼ融合構築物)を供給された4つのプロモーター/shRNAカセットすべてが細胞におけるその標的配列のサイレンシングにおいて活性であったことを示す。図10における表は、pHB4および陽性対照としての三通りの独立した実験を示し、単一ヘアピンベクターからの結果も示されている。図12におけるデータは、同じ構築物が、試験ベクターおよびHBVレプリコンでトランスフェクトされた細胞、および実施例1で説明されたIC50測定においてHBV遺伝子発現をサイレンシングし得たことを示す。図12は、一連のベクター(図8に示されている1〜4個のshRNA)の効力および活性が、細胞培養を複製するプラスミドのさまざまなインプット濃度で評価された実験結果を要約している。第一に、HBV抗原の産生(表面抗原「sAg」または「e」抗原「eAg」)は、HBVレプリコンのみを受ける細胞におけるELISAイムノアッセイによって測定された。ベクターのいくつかの試験インプット量(濃度)の各々で、産生したELISA抗原の量を試験ベクターなしで産生したレベルと比較する。産生した抗原がベクターの供給を受けなかった細胞に対して50%減少するベクターの濃度はIC50と定義される(50%阻害を達成する阻害濃度)。IC50値が低いほど薬剤または薬物はより強力である。図は、1つのプロモーター/shRNAカセットベクターを4つのプロモーター/shRNAカセットを含有するpHB4の例に増加させると、IC50値が実質的に減少したことを示す。ここで留意すべきは、IC50値が各々shRNA分子の相対効力および転写レベルによっても影響されうるとともに、ベクターの濃度のみに対する単純な関係を反映することはなかったことであり、これは実際に4つの薬剤が細胞に入り、4つのコードされたdsRNA分子を発現した後に機能した。言い換えれば、効力の増加は、ベクターによって生成された総shRNA転写産物が相当に多数であることだけではなく、各々のshRNAが標的ウイルスRNA分子の分解によってsAgまたはeAgの削減をもたらす必要がある個別の効力も表している。図12のIC50データを図10のルシフェラーゼレポーターデータとともに総括すると、shRNAカセットの漸進的な追加は明らかに量的な形でベクターの効力を増大させ、さらにHBV標的の4つの異なった部位を阻害することによってHBV標的に対して薬理活性を増大させたことが明らかである。しかし、本発明の多重ポリメラーゼIII発現構築物の多重の個別の抗ウイルスdsRNAヘアピン分子を発現する能力がそれ自体、顕著な値であるが、それが「効力」の関連増加によるものではないことを認めることが重要である。抗ウイルス効果のレベルが高い場合、各々の追加のdsRNA分子で確認されるウイルス阻害における付加的な量的増大は、本質的に、本発明の構築物の、実質的に多剤レジメンを送達する能力よりも重要ではないとみられるが、これはウイルス耐性の発生に高い耐性があるという固有の利点を示す。
多重Pol IIIプロモーターベクターを含む本発明の別の実施形態において、単一プロモーターから2つ以上のshRNAエフェクター分子を発現することが可能であり、したがって、RNA配列の数を増大させることにより、プロモーター要素を大節約して標的とすることが可能である。例えば、本発明を使用し、2つのみのPol IIIプロモーターを使用して3つのshRNA分子を発現し、3つのみのPol IIIプロモーターを使用して4、5、もしくは6つのshRNA分子を発現し、4つのPol IIIプロモーター等を使用して5、6、7、もしくは8つのshRNA分子を発現することができる。「二重ヘアピン」またはバイフィンガーdsRNAの発現は、ここでは、HBV標的shRNAコード配列の2つ(図5)が短いスペーサー要素によって接続され、2つの活性shRNA要素を含有する1つの長いRNA分子(長いスペーサーを使用しておよそ140個のヌクレオチド、短いスペーサーを使用しておよそ60個の塩基の全長)を生成するU6プロモーターベクターを作成することによって明らかにされ、この場合に1737および2791配列を含む。実施例1に記載されたルシフェラーゼ融合標的をこの実験では使用し、結果は図13の底面に示されている。二重ヘアピン構築物の両方の形態は、ルシフェラーゼ融合アッセイにおける両方の標的配列の大幅な分解の仲介において有効であった。これらの構築物におけるスペーサー配列の役割は表面上、ヘアピン形成配列を2つの異なったドメインへ分離し、一本鎖エンドヌクレアーゼによる開裂を促進することである。当業者は、スペーサーの多くの変異体の長さおよび配列により、適切な二重ヘアピン構造が二重標的配列分解を形成し、これをもたらすことが可能であることを認めるであろう。しかし、それ自体、二次構造を形成し、またはフランキングshRNAの配列と対をなすことが可能である長さおよび組成物のスペーサー配列が、二重ヘアピンの機能に干渉する可能性が高いことも理解されるであろう。
サイレンシングHBV遺伝子発現について本明細書で開示された多重プロモーター発明が医薬品として適切である重要な適応が、HBV表面抗原RNAおよびタンパク質を生成したDNAベクターといっしょにマウスの血流へそれらを直接注射することによって明らかにされた。これらの実験では、pHB4ベクター(図9を参照)を、具体的には肝におけるHBV表面抗原を発現したsAgプラスミドといっしょに流体力学的尾静脈注射によってマウスへ送達した(このプラスミドは、アルブミンプロモーターの制御下にsAgを発現し、チサリ(Chisari)ら、J.Virol.60:880−87頁(1986年)によって記載されたプラスミドpAlb−hGH由来であった)。流体力学的尾静脈注射は当業者によって、生きた動物における外因性薬剤で肝組織を迅速に灌流するために一般的に使用されている。sAgはこのモデルにおける肝細胞によって分泌されるため、マウスの血清中でDNAの注射後4日間測定された。CMVプロモーター下にルシフェラーゼを発現する第3のベクターを同時注入し、sAg値の肝ルシフェラーゼへの正常化を可能にし、それによって、肝における全DNA取込みおよびDNAの発現を制御した。この実験の結果は図14に示されている。2組のマウスを同時注射のために使用し、それぞれ、0.07および0.08OD単位の血清sAgの値を得た。shRNA pHB4ベクターを含まないsAg発現ベクターのみの導入により0.47OD単位の平均値が得られたため、sAgのサイレンシングがpHB4によりin vivoで劇的に達成されたことが明らかである。
ヒト7SKプロモーターはその機能のために「上流」配列(転写の開始部位のその5’)に主に依存していることが報告されているが、転写開始部位の下流に位置したヌクレオチド配列もプロモーターの機能を調節しうる(サンドロック(Sandrock)とベネッケ(Benecke)、Gene Expr.8:105−14頁(1999年)およびコパー−エムデ(Koper−Emde)ら、Biol.Chem.385:791−94頁(2004年)を参照。出願人は以前、遺伝子サイレンシングのための配列を標的とするdsRNAヘアピン分子が、標的配列に対応しないいくつかの追加のヌクレオチドがRNAポリメラーゼIII転写開始部位と標的配列の開始との間に置かれる場合でもしばしば依然として機能的であることを確認した。これにより、制限部位またはスペーサー要素が追加されているPol IIIプロモーター/shRNAカセットの改善された機能の維持が可能である。出願人は、天然プロモーターの第1の234個の塩基を使用し、次いでSal I制限部位認識配列(または、好ましくは、制限部位認識配列を含む別の6個のヌクレオチド)を含む10個の合成塩基、および4A残基を使用する新規7SKプロモーター要素(図4e)を作成した。この新規プロモーター配列要素は7SK4aと呼ばれ、基本的に転写される配列GTCGACAAAAを挿入し、したがって、図5に示されているshRNA分子の5’末端に付着されている。図11に示されているように、3つのshRNA配列(1737、1943、および789)を3つの異なるプロモーター状況、すなわち、U6プロモーター(図4c)、7SKプロモーター(図4a)、および7SK4aプロモーター(図4e)におけるHBV抗原発現に対するサイレンシング効果について試験した。9つの構築物の効力は、先の実施例で記載されたsAgおよびeAgのIC50の測定によって評価された。試験された3つのshRNA配列のすべてにより、7SK4a配置はその他の2つのプロモーターより大幅に低いIC50値を示した。
Claims (42)
- 少なくとも2つの異なるRNAポリメラーゼIIIプロモーターを含み、各々のプロモーターが少なくとも1つのRNAエフェクター分子をコードする核酸に作動可能に連結されている発現構築物であって、前記RNAポリメラーゼIIIプロモーターの少なくとも1つが配列番号5を含む、発現構築物。
- 前記少なくとも2つの異なるRNAポリメラーゼIIIプロモーターがウイルスまたは真核生物由来である、請求項1に記載の発現構築物。
- 前記配列番号5を含む少なくとも1つのRNAポリメラーゼIIIプロモーター以外の前記RNAポリメラーゼIIIプロモーターが、1型RNAポリメラーゼIIIプロモーター、2型RNAポリメラーゼIIIプロモーター、および3型RNAポリメラーゼIIIプロモーターからそれぞれ独立に選択される、請求項1に記載の発現構築物。
- 前記少なくとも1つのRNAエフェクター分子がショートヘアピンRNAである、請求項1に記載の発現構築物。
- 前記ショートヘアピンRNAが、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、および配列番号11から選択され、UがTと置換されている核酸を含み、請求項4に記載の発現構築物。
- 前記発現構築物が、3〜8個のRNAポリメラーゼIIIプロモーターを含む、請求項1に記載の発現構築物。
- 前記発現構築物が4個のRNAポリメラーゼIIIプロモーターを含む、請求項6に記載の発現構築物。
- 7SKおよびU6プロモーターを含む、請求項7に記載の発現構築物。
- 前記配列番号5を含む少なくとも1つのRNAポリメラーゼIIIプロモーター以外の前記RNAポリメラーゼIIIプロモーターが、H1、7SK、およびU6から選択される、請求項6に記載の発現構築物。
- 前記少なくとも1つのRNAエフェクター分子が、標的遺伝子の発現調節能を有する、請求項1に記載の発現構築物。
- 前記標的遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項10に記載の発現構築物。
- 前記ウイルス遺伝子がHBVまたはHCV遺伝子である、請求項11に記載の発現構築物。
- 前記RNAポリメラーゼIIIプロモーターの少なくとも2つが、異なるRNAエフェクター分子をコードする核酸に作動可能に連結されている、請求項1に記載の発現構築物。
- 各々のRNAポリメラーゼIIIプロモーターが、同一のRNAエフェクター分子をコードする核酸に作動可能に連結されている、請求項1に記載の発現構築物。
- 同一のRNAポリメラーゼIIIプロモーターが2個コピー以下しか存在しない、請求項1に記載の発現構築物。
- 同一のRNAポリメラーゼIIIプロモーターが1個コピーしか存在しない、請求項15に記載の発現構築物。
- 配列番号5を含む単離された核酸。
- 7SKポリメラーゼIIIプロモーター核酸であって、3’末端にaaaaを含む、核酸。
- 2以上のRNAポリメラーゼIIIプロモーターを含み、少なくとも2つの前記RNAポリメラーゼIIIプロモーターがショートヘアピンRNA分子をコードする核酸に作動可能に連結されている発現構築物であって、前記RNAポリメラーゼIIIプロモーターの少なくとも1つが配列番号5を含む、発現構築物。
- 少なくとも2つの前記RNAポリメラーゼIIIプロモーターが、同一のショートヘアピンRNA分子をコードする核酸に作動可能に連結されている、請求項19に記載の発現構築物。
- 少なくとも2つの前記RNAポリメラーゼIIIプロモーターが、異なるショートヘアピンRNA分子をコードする核酸に作動可能に連結されている、請求項19に記載の発現構築物。
- 少なくとも2つの前記RNAポリメラーゼIIIプロモーターが、同一のRNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項19、20、または21に記載の発現構築物。
- 前記2以上のRNAポリメラーゼIIIプロモーターが、少なくとも2つの異なるRNAポリメラーゼIIIプロモーターを含む、請求項19、20、または21に記載の発現構築物。
- 前記2以上のRNAポリメラーゼIIIプロモーターが、3型RNAポリメラーゼIIIプロモーターを含む、請求項19に記載の発現構築物。
- 前記RNAポリメラーゼIIIプロモーターの少なくとも1つが、バイフィンガーまたはマルチフィンガーdsRNAヘアピンであるショートヘアピンRNA分子をコードする核酸に作動可能に連結されている、請求項19に記載の発現構築物。
- 前記配列番号5を含む少なくとも1つのRNAポリメラーゼIIIプロモーター以外の前記RNAポリメラーゼIIIプロモーターが、H1、7SK、およびU6から選択される、請求項19に記載の発現構築物。
- 標的遺伝子の発現調節能を有する請求項19に記載の発現構築物。
- 前記標的遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項27に記載の発現構築物。
- 前記ウイルス遺伝子がHBVまたはHCV遺伝子である、請求項28に記載の発現構築物。
- 標的遺伝子の活性を減少させることを必要とする哺乳類のための治療剤であって、
少なくとも2つの異なるRNAポリメラーゼIIIプロモーターを含み、各々のプロモーターが前記標的遺伝子の発現を減少させることができる少なくとも1つのRNAエフェクター分子をコードする核酸に作動可能に連結されている発現構築物の治療有効量を含み、前記RNAポリメラーゼIIIプロモーターの少なくとも1つが配列番号5を含む、治療剤。 - 標的遺伝子の活性を減少させることを必要とする哺乳類のための治療剤であって、
2以上のRNAポリメラーゼIIIプロモーターを含み、該RNAポリメラーゼIIIプロモーターの少なくとも2つが前記標的遺伝子の発現を減少させることができるショートヘアピンRNA分子をコードする核酸に作動可能に連結されている発現構築物の治療有効量を含み、前記RNAポリメラーゼIIIプロモーターの少なくとも1つが配列番号5を含む、治療剤。 - 前記標的遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項30または31に記載の治療剤。
- 前記ウイルス遺伝子がHBVまたはHCV遺伝子である、請求項32に記載の治療剤。
- 前記哺乳類がヒトである、請求項30または31に記載の治療剤。
- 少なくとも1つの標的遺伝子の発現を調節するための治療剤であって、
前記少なくとも1つの標的遺伝子を含む宿主細胞をトランスフェクトするための2以上のRNAポリメラーゼIIIプロモーターを含む発現構築物を含み、該RNAポリメラーゼIIIプロモーターの少なくとも2つが前記少なくとも1つの標的遺伝子の発現を調節することができるショートヘアピンRNA分子をコードする核酸に作動可能に連結され、前記RNAポリメラーゼIIIプロモーターの少なくとも1つが配列番号5を含む、治療剤。 - 少なくとも1つの標的遺伝子の発現を調節するための治療剤であって、
前記少なくとも1つの標的遺伝子を含む宿主細胞をトランスフェクトするための少なくとも2つの異なるRNAポリメラーゼIIIプロモーターを含む発現構築物を含み、各々のプロモーターが前記少なくとも1つの標的遺伝子の発現を調節することができる少なくとも1つのRNAエフェクター分子をコードする核酸に作動可能に連結され、前記RNAポリメラーゼIIIプロモーターの少なくとも1つが配列番号5を含む、治療剤。 - 前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項35または36に記載の治療剤。
- 前記少なくとも1つの標的遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項35または36に記載の治療剤。
- 前記ウイルス遺伝子がHBVまたはHCV遺伝子である、請求項38に記載の治療剤。
- 少なくとも1つの標的遺伝子を調節するための発現構築物を製造する方法であって、
(a)各々の発現構築物が少なくとも1つのRNAエフェクター分子をコードする核酸に作動可能に連結された1つのRNAポリメラーゼIIIプロモーターを含む、少なくとも2つの発現構築物であって、前記RNAポリメラーゼIIIプロモーターの少なくとも1つが配列番号5を含む発現構築物を生成する工程と、
(b)少なくとも1つの標的遺伝子の発現の調節における、工程(a)の各々の発現構築物の機能性を測定する工程と、
(c)工程(b)の測定に基づき、少なくとも2つの異なるRNAポリメラーゼIIIプロモーターを含み、各々のプロモーターが少なくとも1つのRNAエフェクター分子をコードする核酸に作動可能に連結されている発現構築物を生成する工程と、を含む方法。 - 工程(c)の発現構築物が、RNAポリメラーゼIIIプロモーター/RNAエフェクター分子カセットを前記発現構築物に繰り返し加えることによって生成される、請求項40に記載の方法。
- 請求項1または19に記載の発現構築物を含む医薬組成物。
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