JP4798521B2 - Sugar phosphorylating agent and sugar phosphorylation method - Google Patents
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Description
本発明は、新規な糖リン酸化活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードする核酸、該核酸を含む組換えベクター、及び該組換えベクターで形質転換された形質転換体に関する。また本発明は、上記タンパク質、核酸、組換えベクター及び形質転換体を用いた、糖リン酸化剤及び糖リン酸化方法に関する。さらに本発明は、上記糖リン酸化剤を用いたα−糖１リン酸を含有する食品添加物又は医薬品添加物の製造方法に関する。 The present invention relates to a protein having a novel sugar phosphorylation activity, a nucleic acid encoding the protein, a recombinant vector containing the nucleic acid, and a transformant transformed with the recombinant vector. The present invention also relates to a sugar phosphorylating agent and a sugar phosphorylation method using the protein, nucleic acid, recombinant vector and transformant. Furthermore, the present invention relates to a method for producing a food additive or pharmaceutical additive containing α-sugar monophosphate using the sugar phosphorylating agent.
キナーゼはＡＴＰのリン酸を転移する反応を触媒する酵素の総称であり、糖リン酸エステルの製造に有用な酵素が含まれる。従来、糖１リン酸エステルを合成するキナーゼはガラクトキナーゼのみが知られていた（例えば、特許文献１参照）。この酵素はガラクトース及びＡＴＰを基質としαガラクトース１リン酸及びＡＤＰを生成するが、その基質特異性は比較的厳密でありガラクトース以外の糖をリン酸化する活性は示さない。ヒト由来のガラクトキナーゼがガラクトースのみならずＮアセチルガラクトサミンを基質にすることが報告されているが、Ｎアセチルグルコサミンなど他の糖は全くリン酸化できない。従来、Ｎアセチルグルコサミンから直接Ｎアセチルグルコサミン１リン酸への変換を触媒する酵素は発見されておらず、その合成は化学合成あるいは多段階の酵素反応を用いざるをえなかった。 Kinase is a general term for enzymes that catalyze the reaction of transferring ATP phosphate, and includes enzymes useful for the production of sugar phosphates. Conventionally, only galactokinase has been known as a kinase that synthesizes a sugar monophosphate (see, for example, Patent Document 1). This enzyme produces α-galactose monophosphate and ADP using galactose and ATP as substrates, but the substrate specificity is relatively strict and does not show the activity to phosphorylate sugars other than galactose. It has been reported that human-derived galactokinase uses not only galactose but also N-acetylgalactosamine as a substrate, but other sugars such as N-acetylglucosamine cannot be phosphorylated at all. Conventionally, an enzyme that catalyzes the conversion of N acetylglucosamine directly to N acetylglucosamine monophosphate has not been discovered, and its synthesis has to use chemical synthesis or multistage enzymatic reactions.
また、糖１リン酸エステルは、食品用素材及び医薬品用素材などとして、今後の開発が期待されている有用な物質である（例えば、特許文献２参照）。 In addition, sugar monophosphate is a useful substance that is expected to be developed in the future as a food material and a pharmaceutical material (see, for example, Patent Document 2).
そのため、幅広い基質特異性を示し、かつ糖リン酸化反応を高効率で触媒する酵素の開発が望まれていた。 Therefore, it has been desired to develop an enzyme that exhibits a wide range of substrate specificities and catalyzes a sugar phosphorylation reaction with high efficiency.
本発明は、糖リン酸化活性を有する新規な酵素を見出し、またこれを利用して糖を効率的にリン酸化し、糖１リン酸エステルを製造することを目的とする。 An object of the present invention is to find a novel enzyme having sugar phosphorylation activity, and to use this to efficiently phosphorylate a sugar to produce a sugar monophosphate ester.
本発明者らは、ビフィドバクテリウム属細菌の機能未同定遺伝子ＢＬ１６４２（配列番号１）の配列情報に基づいて単離された核酸によりコードされるタンパク質が、糖リン酸化活性、すなわち糖の１位の炭素原子にＡＴＰのリン酸基を転移し、α−糖１リン酸及びＡＤＰを生成する反応を触媒する活性を有することを見出し、この活性を糖リン酸化に利用することができるという知見を得、本発明を完成するに至った。 The present inventors have found that the protein encoded by the nucleic acid isolated based on the sequence information of the unidentified gene BL1642 (SEQ ID NO: 1) of Bifidobacterium belongs to sugar phosphorylation activity, that is, sugar 1 Finding that it has the activity of catalyzing the reaction of transferring the phosphate group of ATP to the carbon atom at the position to produce α-sugar monophosphate and ADP, and this activity can be utilized for sugar phosphorylation The present invention has been completed.
すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、糖リン酸化活性を有するタンパク質であって、但し配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するものではない、上記タンパク質。
That is, the present invention is the following protein (a) or (b):
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, And a protein having sugar phosphorylation activity, wherein the protein does not have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
また本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸である：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、又は
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、糖リン酸化活性を有するタンパク質であって、但し配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するものではない、上記タンパク質をコードする核酸。
The present invention also provides the following nucleic acid (a) or (b):
(A) a nucleic acid encoding a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or (b) an amino acid in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 A nucleic acid encoding the above protein, which consists of a sequence and has sugar phosphorylation activity, but does not have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
さらに本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸である：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなる核酸、又は
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、糖リン酸化活性を有するタンパク質をコードする核酸であって、但し配列番号７に示される塩基配列を有するものではない、上記核酸。
Furthermore, the present invention is the following nucleic acid (a) or (b):
(A) a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) a nucleic acid comprising a sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, and sugar phosphorus A nucleic acid encoding a protein having oxidative activity, provided that the nucleic acid does not have the base sequence shown in SEQ ID NO: 7.
本発明はまた、上記いずれかの核酸を含む組換えベクターである。
本発明は、上記組換えベクターで形質転換された形質転換体である。
本発明はさらに、上記形質転換体を培養し、得られる培養物からタンパク質を採取することを特徴とする、糖リン酸化活性を有するタンパク質の製造方法である。
The present invention is also a recombinant vector containing any of the above nucleic acids.
The present invention is a transformant transformed with the above recombinant vector.
The present invention further provides a method for producing a protein having sugar phosphorylation activity, which comprises culturing the transformant and collecting the protein from the obtained culture.
またさらに本発明は、以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つを含むことを特徴とする糖リン酸化剤である：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、糖リン酸化活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、糖リン酸化活性を有するタンパク質をコードする核酸
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなる核酸、又は配列番号１に示される塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、糖リン酸化活性を有するタンパク質をコードする核酸
（ｄ）上記（ｂ）又は（ｃ）の核酸を含む組換えベクター
（ｅ）上記（ｄ）の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
Furthermore, the present invention is a sugar phosphorylating agent comprising at least one of the following (a) to (e):
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a sugar Protein having phosphorylation activity (b) Nucleic acid encoding a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are substituted, deleted, inserted or added A nucleic acid encoding the protein having sugar phosphorylation activity (c) a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 A protein that hybridizes under stringent conditions and has sugar phosphorylation activity. Nucleic acid encoding (d) above (b) or transformant which is transformed with a recombinant vector of the recombinant vector (e) (d) above comprising a nucleic acid of (c).
上記糖リン酸化剤において、糖としては、限定されるものではないが、ヘキソース、Ｎアセチルヘキソサミン、及びデオキシヘキソースからなる群より選択される少なくとも１つである。より具体的には、糖は、例えばグルコース、ガラクトース、マンノース、タロース、Ｎアセチルグルコサミン、Ｎアセチルガラクトサミン、Ｎアセチルマンノサミン、及び２−デオキシグルコースからなる群より選択される少なくとも１つである。また、糖リン酸化活性は、例えばＮアセチルヘキソサミンキナーゼ活性である。 In the sugar phosphorylating agent, the sugar is not limited, but is at least one selected from the group consisting of hexose, N-acetylhexosamine, and deoxyhexose. More specifically, the sugar is at least one selected from the group consisting of glucose, galactose, mannose, talose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, N-acetylmannosamine, and 2-deoxyglucose, for example. The sugar phosphorylation activity is, for example, N acetylhexosamine kinase activity.
上記糖リン酸化剤に含まれる（ａ）のタンパク質、又は（ｂ）若しくは（ｃ）の核酸は、好ましくはビフィドバクテリウム・ロンガム由来でありうる。
上記糖リン酸化剤は、さらにＡＴＰ及び／又はマグネシウムを含んでもよい。
The protein (a) or the nucleic acid (b) or (c) contained in the sugar phosphorylating agent may preferably be derived from Bifidobacterium longum.
The sugar phosphorylating agent may further contain ATP and / or magnesium.
本発明はまた、上記いずれかの糖リン酸化剤の存在下にて糖とＡＴＰとを反応させてα−糖１リン酸を生成することを特徴とするα−糖１リン酸の製造方法である。
上記方法において、使用する糖は、限定されるものではないが、ヘキソース、Ｎアセチルヘキソサミン、及びデオキシヘキソースからなる群より選択される少なくとも１つである。具体的には、使用する糖は、例えばグルコース、ガラクトース、マンノース、タロース、Ｎアセチルグルコサミン、Ｎアセチルガラクトサミン、Ｎアセチルマンノサミン、及び２−デオキシグルコースからなる群より選択される少なくとも１つである。
The present invention also provides a method for producing α-sugar monophosphate, wherein α-sugar monophosphate is produced by reacting sugar with ATP in the presence of any of the above sugar phosphorylating agents. is there.
In the above method, the sugar to be used is at least one selected from the group consisting of hexose, N-acetylhexosamine, and deoxyhexose, although not limited thereto. Specifically, the sugar used is, for example, at least one selected from the group consisting of glucose, galactose, mannose, talose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, N-acetylmannosamine, and 2-deoxyglucose. .
さらに本発明は、上記いずれかの糖リン酸化剤の存在下にて糖とＡＴＰとを反応させ、生成されたα−糖１リン酸を製剤化することを特徴とするα−糖１リン酸を含有する食品添加物又は医薬品添加物の製造方法である。 Furthermore, the present invention provides an α-sugar monophosphate characterized in that a sugar and ATP are reacted in the presence of any of the above sugar phosphorylating agents to formulate the produced α-sugar monophosphate. Is a method for producing a food additive or pharmaceutical additive containing
本発明により、糖リン酸化剤及び糖リン酸化方法が提供される。本発明において使用するタンパク質などは、糖のリン酸化反応を効率的に触媒するものであり、かつ糖基質特異性が低いため、あらゆる種類の糖をリン酸化することが可能である。かかる糖リン酸化剤及び糖リン酸化方法は、例えば、食品加工及び医薬品工業の分野において有用な各種α−糖１リン酸を効率よく製造するために有用である。 According to the present invention, a sugar phosphorylating agent and a sugar phosphorylation method are provided. Proteins and the like used in the present invention efficiently catalyze the phosphorylation reaction of sugars and have a low sugar substrate specificity, and therefore can phosphorylate all kinds of sugars. Such sugar phosphorylating agents and sugar phosphorylation methods are useful for efficiently producing various α-sugar monophosphates useful in the fields of food processing and pharmaceutical industry, for example.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明は、ビフィドバクテリウム属細菌の機能未同定遺伝子ＢＬ１６４２（配列番号１）の配列情報に基づいて、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ １２１７株より単離された核酸によりコードされるタンパク質が、糖リン酸化活性を有するという知見に基づくものである。従って、本発明に係る糖リン酸化剤及び糖リン酸化方法においては、以下の（ａ）〜（ｄ）の少なくとも１つを使用する：
（ａ）糖リン酸化活性を有するタンパク質
（ｂ）糖リン酸化活性を有するタンパク質をコードする核酸
（ｃ）上記（ｂ）の核酸を含む組換えベクター
（ｄ）上記（ｂ）の核酸又は上記（ｃ）の組換えベクターを含有する形質転換体。
The present invention relates to a protein encoded by a nucleic acid isolated from Bifidobacterium longum JCM 1217 strain based on the sequence information of Bifidobacterium genus function unidentified gene BL1642 (SEQ ID NO: 1). This is based on the knowledge that it has sugar phosphorylation activity. Accordingly, in the sugar phosphorylating agent and the sugar phosphorylation method according to the present invention, at least one of the following (a) to (d) is used:
(A) a protein having sugar phosphorylation activity (b) a nucleic acid encoding a protein having sugar phosphorylation activity (c) a recombinant vector comprising the nucleic acid of (b) above (d) the nucleic acid of (b) above or ( A transformant containing the recombinant vector of c).
本発明において「糖リン酸化活性」とは、糖とＡＴＰを基質として、糖をリン酸化する（糖リン酸を生成する）反応を触媒する活性を意味する。より具体的には、糖リン酸化活性とは、糖の１位の炭素原子にＡＴＰのリン酸基を転移し、α−糖１リン酸及びＡＤＰを生成する反応を触媒する活性を意味する。このような活性を有するタンパク質は、これまでに報告例がなく、従って本発明に係るタンパク質は新規な活性を有する酵素である。 In the present invention, “sugar phosphorylation activity” means an activity that catalyzes a reaction of phosphorylating sugar (producing sugar phosphate) using sugar and ATP as substrates. More specifically, the sugar phosphorylation activity means the activity of catalyzing the reaction of transferring the phosphate group of ATP to the carbon atom at the 1-position of sugar to produce α-sugar monophosphate and ADP. A protein having such an activity has not been reported so far, and therefore the protein according to the present invention is an enzyme having a novel activity.
ここで、糖リン酸化反応における糖としては、限定されるものではないが、ヘキソース（六炭糖）、例えばＤ−及びＬ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース及びＤ−タロース等；ヘキソサミン（ヘキソースのヒドロキシル基がアミノ基で置換された化合物９、例えばＤ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン及びＤ−マンノサミン、並びにそれらのＮ−アセチル体（Ｎアセチルグルコサミン、Ｎアセチルガラクトサミン、Ｎアセチルマンノサミン）等；ヘキソシラミン（ヘキソースのヘミアセタールヒドロキシル基がアミノ基で置換された化合物）；デオキシヘキソース、例えば２−デオキシグルコース等が挙げられる。
Here, the sugar in the sugar phosphorylation reaction is not limited, but hexose (hexose sugar), for example, D- and L-galactose, D-glucose, D-mannose, D-talose and the like; hexosamine (
本発明に係るタンパク質をコードする核酸の塩基配列を配列番号１に、該タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に例示する。ここで、配列番号１の５４１番目〜１６２０番目の塩基配列がタンパク質をコードする領域である。 The base sequence of the nucleic acid encoding the protein according to the present invention is exemplified in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the protein is exemplified in SEQ ID NO: 2. Here, the 541st to 1620th base sequence of SEQ ID NO: 1 is a region encoding a protein.
また、上述したビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ １２１７株由来のタンパク質と同等又はそれ以上の糖リン酸化活性を保持するタンパク質を、ビフィドバクテリウム・ロンガムの他の細菌株、ビフィドバクテリウム属に属する他の細菌及びその他の属に属する細菌、並びにこれらの細菌の変異株から単離することができるが、このようなタンパク質は配列番号２に示されるアミノ酸配列とは若干異なるアミノ酸配列を有することが予想される。さらに、当技術分野においては、アミノ酸配列において若干のアミノ酸変異を有していても、その活性又は機能を保持するタンパク質の存在が知られている。 In addition, a protein having a sugar phosphorylation activity equivalent to or higher than that of the above-mentioned Bifidobacterium longum JCM 1217 strain is added to another Bifidobacterium longum bacterial strain, Bifidobacterium genus. Although it can be isolated from other bacteria belonging to the genus and bacteria belonging to other genera, and mutants of these bacteria, such a protein has an amino acid sequence slightly different from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Is expected. Furthermore, in this technical field, even if there are some amino acid mutations in the amino acid sequence, the existence of a protein that retains its activity or function is known.
従って、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質は、糖リン酸化活性を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸に置換、欠失、挿入、付加、逆位等の変異が生じてもよい。糖リン酸化活性は、変異を有するタンパク質の存在下にて、基質となる糖とＡＴＰとを反応させ、生成されるα−糖１リン酸の量を当技術分野で公知の方法（例えば高速液体クロマトグラフィー、高速イオン交換クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなど）により測定することによって確認することができる。本発明において使用可能なタンパク質は、それらの配列から公知の方法に従って化学合成又は組換え手法により作製することができるし、あるいは公知の手法に従って細菌から単離してもよい。 Therefore, as long as the protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 has sugar phosphorylation activity, substitution, deletion, insertion, addition, inversion of a plurality of amino acid sequences, preferably one or several amino acids, is possible. Etc. may occur. The sugar phosphorylation activity is determined by reacting a sugar serving as a substrate with ATP in the presence of a protein having a mutation, and determining the amount of α-sugar monophosphate produced by a method known in the art (for example, a high-speed liquid). Chromatography, high-speed ion exchange chromatography, thin layer chromatography, etc.). Proteins that can be used in the present invention can be prepared from these sequences by chemical synthesis or recombinant techniques according to known methods, or may be isolated from bacteria according to known techniques.
例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明において用いることができる。 For example, 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 may be deleted, and 1 to 10 amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, preferably 1 to Five amino acids may be added, or those in which 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are substituted with other amino acids are used in the present invention. Can do.
本発明に係るタンパク質の活性により、糖の１位にリン酸基が付加されたα−糖１リン酸が生成される。 By the activity of the protein according to the present invention, α-sugar monophosphate having a phosphate group added at the 1-position of the sugar is produced.
本発明において使用可能な核酸は、細菌から調製したＤＮＡ又はそのｃＤＮＡライブラリーを用いて、配列番号１に示される塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行うことにより調製することができる。例えば、配列番号３及び４に示される塩基配列を含むプライマーセット、又は配列番号５及び６に示される塩基配列を含むプライマーセットを用いて、目的の核酸を単離することができる。ここで、核酸を単離するための供与源となる細菌は、ビフィドバクテリウム属に属する細菌、例えばビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレベ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス等が挙げられるが、特に限定されるものではない。好ましくはビフィドバクテリウム属に属する細菌を供与源として、特に好ましくはビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ １２１７株を供与源として使用する。 The nucleic acid that can be used in the present invention is obtained by performing PCR (polymerase chain reaction) using a primer prepared based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 using DNA prepared from bacteria or a cDNA library thereof. Can be prepared. For example, the target nucleic acid can be isolated using a primer set containing the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, or a primer set containing the base sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 6. Here, a bacterium that is a source for isolating nucleic acids is a bacterium belonging to the genus Bifidobacterium, such as Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium brebe, Bifido Examples thereof include, but are not particularly limited to, bacterial infantis and Bifidobacterium addressestis. Bacteria belonging to the genus Bifidobacterium are preferably used as the source, and Bifidobacterium longum JCM 1217 strain is particularly preferably used as the source.
また、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明に係る核酸の変異型であって上記機能又は活性を有するものを合成することもできる。なお、核酸に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した市販の変異導入用キットなどを用いて変異の導入が行われる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、核酸への変異導入やキメラ遺伝子の構築も可能である。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えばエラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャッフリングについてはStemmer, W. P. 1994, Nature, 370:389-391及びStemmer W. P., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 10747-10751を参照されたい。 In addition, a variant of the nucleic acid according to the present invention having the above function or activity can be synthesized by site-directed mutagenesis. In order to introduce a mutation into a nucleic acid, a known method such as Kunkel method or Gapped duplex method or a method according to this can be employed. For example, mutation is introduced using a commercially available mutation introduction kit using site-directed mutagenesis. In addition, mutation introduction into a nucleic acid and construction of a chimeric gene can be performed by techniques such as error introduction PCR and DNA shuffling. Error introduction PCR and DNA shuffling are techniques known in the art. For example, for error introduction PCR, Chen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5618-5622 See also Stemmer, WP 1994, Nature, 370: 389-391 and Stemmer WP, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751 for DNA shuffling.
変異を有する核酸により作製される組換えタンパク質が目的の機能（すなわち糖リン酸化活性）を有するか否かは、変異核酸を形質転換体において発現させ、得られる組換えタンパク質の糖リン酸化活性を、上述したように当技術分野で公知の方法により測定することにより確認することができる。 Whether or not a recombinant protein produced by a nucleic acid having a mutation has a target function (ie, sugar phosphorylation activity) is determined by expressing the mutant nucleic acid in a transformant and determining the sugar phosphorylation activity of the resulting recombinant protein. As described above, it can be confirmed by measuring by a method known in the art.
さらに、上記塩基配列からなる核酸の全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、糖リン酸化活性を有するタンパク質をコードする核酸も本発明において用いることができる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性（相同性が６０％以上、好ましくは８０％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。このようなハイブリダイゼーション条件は当技術分野で公知であり、例えばSambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989などに記載されている。 Furthermore, a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a sequence complementary to all or part of the nucleic acid consisting of the above base sequence and encodes a protein having sugar phosphorylation activity is also used in the present invention. Can do. Stringent conditions refer to conditions in which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, it refers to conditions under which DNA having high homology (homology is 60% or more, preferably 80% or more) hybridizes. Such hybridization conditions are known in the art and are described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
本発明において使用する組換えベクターは、適当なベクターに上記核酸を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明で使用するベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどが挙げられ、直鎖状であっても環状であってもよい。 The recombinant vector used in the present invention can be obtained by ligating (inserting) the nucleic acid into an appropriate vector. The vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can replicate in the host. For example, bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like can be mentioned, which may be linear or circular.
プラスミドＤＮＡとしては、放線菌由来のプラスミド（例えばｐＫ４、ｐＲＫ４０１、ｐＲＦ３１等）、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。 Plasmid DNA includes actinomycete-derived plasmids (eg, pK4, pRK401, pRF31, etc.), E. coli-derived plasmids (eg, pET, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, etc.), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5). Etc.), yeast-derived plasmids (eg, YEp13, YEp24, YCp50, etc.) and the like, and phage DNAs include λ phage (λgt10, λgt11, λZAP, etc.).
ベクターに核酸を挿入するには、まず、精製された核酸を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。 In order to insert a nucleic acid into a vector, first, a method in which the purified nucleic acid is cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of an appropriate vector, and linked to the vector is employed.
核酸は、目的のタンパク質が発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明において使用するベクターには、プロモーター、核酸のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。 The nucleic acid needs to be incorporated into a vector so that the protein of interest is expressed. Therefore, in addition to a promoter and a nucleic acid, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, a ribosome binding sequence (SD sequence) and the like can be linked to the vector used in the present invention, if desired. .
本発明においては、上記組換えベクターで形質転換された形質転換体を使用することができる。形質転換体は、上記組換えベクターを、目的とするタンパク質が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、特に限定されるものではなく、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム等のビフィドバクテリウム属、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等の酵母、その他動物細胞又は昆虫細胞が挙げられる。 In the present invention, a transformant transformed with the above recombinant vector can be used. The transformant can be obtained by introducing the above recombinant vector into a host so that the target protein can be expressed. Here, the host is not particularly limited, and for example, Bifidobacterium genus such as Bifidobacterium longum, Escherichia genus such as Escherichia coli, Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) Bacteria such as Bacillus, Pseudomonas putida, etc., yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, other animal cells or insect cells .
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、上記核酸、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（Cohen, S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110-2114 (1972)）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。 When a bacterium such as Escherichia coli is used as a host, it is preferable that the recombinant vector is capable of autonomous replication in the bacterium and at the same time is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the nucleic acid, and a transcription termination sequence. Moreover, the gene which controls a promoter may be contained. Any promoter can be used as long as it can be expressed in a host such as Escherichia coli. The method for introducing a recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria. For example, a method using calcium ions (Cohen, S.N. et al .: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69: 2110-2114 (1972)), electroporation method and the like can be mentioned.
酵母を宿主とする場合は、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されるものではない。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法（Becker, D.M. et al., Methods. Enzymol. 194,182-187(1990)）、スフェロプラスト法（Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75,1929-1933 (1978)）、酢酸リチウム法（Itoh, H. J. Bacteriol., 153,163-168 (1983)）等が挙げられる。 When yeast is used as a host, the promoter is not particularly limited as long as it can be expressed in yeast. The method for introducing a recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into yeast. For example, electroporation (Becker, DM et al., Methods. Enzymol. 194, 182-287 (1990) ), Spheroplast method (Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75,1929-1933 (1978)), lithium acetate method (Itoh, HJ Bacteriol., 153,163-168 ( 1983)).
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ＰＣ１２若しくはＮＧ１０８−１５細胞、又はヒトＦＬ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ若しくはＪｕｒｋａｔ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、β−アクチンプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。 When using animal cells as a host, monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), mouse L cells, rat GH3, PC12 or NG108-15 cells, or human FL, HEK293, HeLa or Jurkat cells Etc. are used. As the promoter, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, β-actin promoter and the like may be used, and human cytomegalovirus early gene promoter and the like may be used. Examples of methods for introducing a recombinant vector into animal cells include an electroporation method, a calcium phosphate method, and a lipofection method. When insect cells are used as hosts, Sf9 cells, Sf21 cells and the like are used. As a method for introducing a recombinant vector into insect cells, for example, calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method and the like are used.
以上のようにして得られる形質転換体は、糖リン酸化活性を有するタンパク質を生成するものであるため、かかるタンパク質の製造や、それ自体を糖リン酸化において使用することができる。 Since the transformant obtained as described above produces a protein having sugar phosphorylation activity, it can be used for the production of such a protein or itself for sugar phosphorylation.
本発明において用いることができるタンパク質は、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。 The protein that can be used in the present invention can be obtained by culturing the transformant and collecting it from the culture. “Culture” means any of culture supernatant, cultured cells, cultured cells, or disrupted cells or cells. The method of culturing the transformant is performed according to a usual method used for culturing a host.
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。 A medium for culturing transformants obtained using microorganisms such as Escherichia coli and yeast as a host contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganisms, and efficiently cultures the transformants. As long as the medium can be used, either a natural medium or a synthetic medium may be used. Examples of the carbon source include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol. Examples of the nitrogen source include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids such as ammonium phosphate or other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, corn steep liquor, and the like. Examples of the inorganic substance include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３６〜３７℃で１０〜４８時間、好ましくは１日間行う。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が挙げられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で４０〜４８時間行う。
The culture is usually performed at 36 to 37 ° C. for 10 to 48 hours, preferably for 1 day under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture.
Examples of a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host include generally used RPMI 1640 medium, DMEM medium, or a medium obtained by adding fetal calf serum or the like to these mediums. The culture is usually performed at 37 ° C. for 40 to 48 hours in the presence of 5% CO 2 .
培養後、目的のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより上記タンパク質を採取する。また、当該タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。 When the target protein is produced in the cells or cells after culturing, the protein is collected by crushing the cells or cells by performing ultrasonic treatment, repeated freeze-thawing, homogenizer treatment, and the like. When the protein is produced outside the cells or cells, the culture solution is used as it is, or the cells or cells are removed by centrifugation or the like. Thereafter, by using general biochemical methods used for protein isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. alone or in appropriate combination, From the above, the protein of the present invention can be isolated and purified.
本発明に係る糖リン酸化剤及び糖リン酸化方法においては、上述したタンパク質、核酸、組換えベクター及び形質転換体のいずれをも用いることができる。また、例えば１種のタンパク質を単独で使用してもよいし、複数種のタンパク質を使用してもよく、核酸、組換えベクター及び形質転換体についても同様である。 In the sugar phosphorylating agent and the sugar phosphorylation method according to the present invention, any of the above-described proteins, nucleic acids, recombinant vectors, and transformants can be used. Further, for example, one kind of protein may be used alone, or a plurality of kinds of proteins may be used, and the same applies to nucleic acids, recombinant vectors, and transformants.
なお、本発明に係る糖リン酸化剤の形態は特に限定されず、タンパク質、核酸若しくは組換えベクターをそのまま、あるいはこれらを適当な溶媒中に溶解若しくは懸濁することにより液剤として、又はこれらを粉剤若しくは錠剤として調製することも可能であるし、さらには凍結乾燥物として調製することも可能である。また、形質転換体は、培養物から単離された形質転換体、培養物そのもの、培養物の希釈液、培養物の破砕物、及び培養上清などであってもよい。 The form of the sugar phosphorylating agent according to the present invention is not particularly limited, and the protein, nucleic acid or recombinant vector is used as it is or as a solution by dissolving or suspending them in an appropriate solvent, or these are powdered. Alternatively, it can be prepared as a tablet, and further can be prepared as a lyophilized product. The transformant may be a transformant isolated from a culture, the culture itself, a culture dilution, a disrupted culture, or a culture supernatant.
本発明に係る糖リン酸化剤及び糖リン酸化方法により、リン酸化される糖としては、ヘキソース（六炭糖）、例えばＤ−及びＬ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース及びＤ−タロース等；ヘキソサミン（ヘキソースのヒドロキシル基がアミノ基で置換された化合物９、例えばＤ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン及びＤ−マンノサミン、並びにそれらのＮ−アセチル体（Ｎアセチルグルコサミン、Ｎアセチルガラクトサミン、Ｎアセチルマンノサミン）等；ヘキソシラミン（ヘキソースのヘミアセタールヒドロキシル基がアミノ基で置換された化合物）；デオキシヘキソース、例えば２−デオキシグルコース等が挙げられる。また、上記例示した糖の誘導体又は類似体、及びこれらの糖の混合物をリン酸化することも可能である。
Examples of the sugar that is phosphorylated by the sugar phosphorylating agent and the sugar phosphorylation method according to the present invention include hexose (hexose sugar) such as D- and L-galactose, D-glucose, D-mannose, and D-talose. Hexosamine (
糖リン酸化は、上述した糖リン酸化剤の存在下にて、糖とＡＴＰ（又はＧＴＰ、ＩＴＰでもよい）とを反応させることにより行うことができる。糖リン酸化反応により、糖がα−糖１リン酸に変換される。 Sugar phosphorylation can be performed by reacting sugar with ATP (or GTP or ITP) in the presence of the sugar phosphorylating agent described above. By sugar phosphorylation reaction, sugar is converted into α-sugar monophosphate.
使用する糖リン酸化剤の量、反応時間及び反応条件などは、使用する糖リン酸化剤の種類、基質となる糖の存在量、ＡＴＰの存在量などを考慮して、望ましい結果が得られるように決定しうる。リン酸化される糖の濃度は特に限定されるものではないが０．０１ｍＭ以上４Ｍ以下、好ましくは１ｍＭ以上３Ｍ以下である。ＡＴＰの量は特に限定されるものではないが、リン酸化される糖の２当量以下、好ましくは１．２当量以下である。 The amount of sugar phosphorylating agent to be used, reaction time, reaction conditions, etc. can be obtained in consideration of the type of sugar phosphorylating agent to be used, the amount of sugar as a substrate, the amount of ATP, etc. Can be determined. The concentration of the phosphorylated saccharide is not particularly limited, but is 0.01 mM or more and 4M or less, preferably 1 mM or more and 3M or less. The amount of ATP is not particularly limited, but is 2 equivalents or less, preferably 1.2 equivalents or less of the sugar to be phosphorylated.
さらに、糖リン酸化反応をさらに効率的に行うために、本発明に係る糖リン酸化剤及び糖リン酸化反応においては、追加成分を使用してもよい。そのような追加成分としては、限定されるものではないが、マグネシウム及び／又はコバルトなどが挙げられる。このような追加成分の量は当業者であれば容易に決定することができる。例えば、マグネシウムの濃度は、好ましくは０．００１ｍＭ以上１Ｍ以下、より好ましくは０．０１ｍＭ以上１０ｍＭ以下、更に好ましくは０．１ｍＭ以上５ｍＭ以下である。 Furthermore, in order to perform the sugar phosphorylation reaction more efficiently, an additional component may be used in the sugar phosphorylation agent and the sugar phosphorylation reaction according to the present invention. Such additional components include, but are not limited to magnesium and / or cobalt. The amount of such additional components can be easily determined by those skilled in the art. For example, the magnesium concentration is preferably 0.001 mM to 1 M, more preferably 0.01 mM to 10 mM, and still more preferably 0.1 mM to 5 mM.
以上のように、本発明に係る糖リン酸化剤の存在下で糖とＡＴＰとを反応させることによって、糖を効率的にリン酸化し、α−糖１リン酸を生成することができる。 As described above, by reacting sugar and ATP in the presence of the sugar phosphorylating agent according to the present invention, sugar can be efficiently phosphorylated to produce α-sugar monophosphate.
α−糖１リン酸は、味質改善のため又はカルシウム保持剤として用いることができるため、食品添加物又は医薬品添加物に配合することが好ましい。従って、上述のように生成されたα−糖１リン酸を、添加物として製剤化することによって、α−糖１リン酸を含有する食品添加物又は医薬品添加物を製造することが可能である。製剤化は、当技術分野で公知の添加剤、保存剤、賦形剤などと共に、当技術分野で公知の製剤化方法に従って容易に行うことができる。また、α−糖１リン酸は種々のオリゴ糖の酵素合成の出発原料として用いることが可能である。 Since α-sugar monophosphate can be used for improving the taste or as a calcium retention agent, it is preferably blended in a food additive or a pharmaceutical additive. Therefore, it is possible to produce a food additive or pharmaceutical additive containing α-sugar monophosphate by formulating the α-sugar monophosphate produced as described above as an additive. . Formulation can be easily performed according to a formulation method known in the art, together with additives, preservatives, excipients and the like known in the art. Further, α-sugar monophosphate can be used as a starting material for enzymatic synthesis of various oligosaccharides.
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to these Examples.
ビフィドバクテリウム・ロンガムのゲノム情報（機能未同定遺伝子ＢＬ１６４２）を基に、目的のＯＲＦに隣接する以下に示すフォーワードプライマー及びリバースプライマーをそれぞれ作製した：
フォーワードプライマー：GTGGTGCCGGACCACTTCATCACC（配列番号３）
リバースプライマー：GAAGAGGGCGAAGATTTGGTTGCGGGTCCA（配列番号４）。
Based on the genome information of Bifidobacterium longum (function unidentified gene BL1642), the following forward primer and reverse primer respectively adjacent to the target ORF were prepared:
Forward primer: GTGGTGCCGGACCACTTCATCACC (SEQ ID NO: 3)
Reverse primer: GAAGAGGGCGAAGATTTGGTTGCGGGTCCA (SEQ ID NO: 4).
上記プライマーを組み合わせて使用し、インスタジーン（バイオラッド社製）を用いて調製したビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ １２１７株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ反応により増幅させた。その結果、約１７９０ｂｐの明瞭なバンドが得られた。 The above primers were used in combination, and the Bifidobacterium longum JCM 1217 strain genomic DNA prepared using Instagene (manufactured by Bio-Rad) was used as a template and amplified by PCR reaction. As a result, a clear band of about 1790 bp was obtained.
得られたバンドをクローニングし、ＤＮＡシークエンサーで分析したところ、配列番号１に示されるＤＮＡ塩基配列が得られた。このＤＮＡ塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来遺伝子と相同な１０８０ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号２）が認められた。 When the obtained band was cloned and analyzed by a DNA sequencer, the DNA base sequence shown in SEQ ID NO: 1 was obtained. When this DNA base sequence was translated into amino acids, a 1080 bp open reading frame (ORF) (SEQ ID NO: 2) homologous to the gene derived from Bifidobacterium longum was observed.
次に、これらのＯＲＦによりコードされるタンパク質の活性を確認するために、大腸菌による遺伝子の発現系を構築した。具体的には、ＯＲＦの５’末端及び３’末端で作製したプライマー（以下参照）を用いて、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ １２１７株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＯＲＦ全長をＰＣＲにより増幅した：
フォーワードプライマー：AACGGACCCCATATGACCGAAAGCAATGAAGTTTTATTC（配列番号５）
リバースプライマー：GCTGACCTCGAGCCTGGCAGCCTCCATGATGTCGGCTAC（配列番号６）。
Next, in order to confirm the activity of the proteins encoded by these ORFs, a gene expression system using E. coli was constructed. Specifically, using the primers (see below) prepared at the 5 ′ and 3 ′ ends of the ORF, the full length of the ORF was amplified by PCR using the genomic DNA of Bifidobacterium longum JCM 1217 as a template:
Forward primer: AACGGACCCCATATGACCGAAAGCAATGAAGTTTTATTC (SEQ ID NO: 5)
Reverse primer: GCTGACCTCGAGCCTGGCAGCCTCCATGATGTCGGCTAC (SEQ ID NO: 6).
ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化後、同様に処理した市販の遺伝子発現用プラスミドｐＥＴ（ノバジェン社製）にＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。さらに、これらのプラスミドを用いてSambrook，J.，Fritsch, E. F. and Maniatis, T. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 第２版”1.７４章 Vo1. 1 (1989)に記載された方法に従い、大腸菌を形質転換した。 The PCR product was digested with restriction enzymes NcoI and XhoI, and then ligated to a commercially available gene expression plasmid pET (manufactured by Novagen) similarly treated using a DNA ligation kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.). Furthermore, according to the method described in Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Edition" 1.74 Vo1.1 (1989) using these plasmids. Was transformed.
以上のようにして得た形質転換体を用い、常法に従って該遺伝子の発現及び組換えタンパク質の生産を行った。得られた組換えタンパク質はＮｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製酵素標品を得た。 Using the transformant obtained as described above, expression of the gene and production of a recombinant protein were performed according to a conventional method. The obtained recombinant protein was purified by column chromatography using Ni-NTA agarose (Qiagen) to obtain a purified enzyme preparation.
実施例１において得られた精製酵素標品を用い、以下に示す方法によってＮアセチルヘキソサミンキナーゼ活性を確認した。 Using the purified enzyme preparation obtained in Example 1, N-acetylhexosamine kinase activity was confirmed by the method shown below.
０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．５）、１ｍＭ Ｎアセチルグルコサミン、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ塩化マグネシウム及び適宜希釈した酵素溶液からなる標準反応溶液を３０℃で３０分間反応後、１００℃で３０分間加熱することで反応を停止し、生成したα−Ｎアセチルグルコサミン１リン酸を陰イオン交換カラムで分離した後、パルスドアンペロメトリ型検出器（ダイオネクス社製）を用いて測定した。 A standard reaction solution consisting of 0.1 M Tris buffer (pH 8.5), 1 mM N acetylglucosamine, 1 mM ATP, 1 mM magnesium chloride and an appropriately diluted enzyme solution is reacted at 30 ° C. for 30 minutes and then heated at 100 ° C. for 30 minutes. Then, the reaction was stopped, and the produced α-N acetylglucosamine monophosphate was separated by an anion exchange column, and then measured using a pulsed amperometry detector (manufactured by Dionex).
その結果、組換えＮアセチルヘキソサミンキナーゼはＮアセチルグルコサミン及びＡＴＰを基質としたときα−Ｎアセチルグルコサミン１リン酸の生成が確認され、クローニングした遺伝子がＮアセチルヘキソサミンキナーゼ遺伝子であることが確認された。また、このときのＫｍ値は０．１２ｍＭ、ｋ０値は１．８５ｓｅｃ−１であった。 As a result, recombinant N-acetylhexosamine kinase was confirmed to produce α-N-acetylglucosamine monophosphate when N-acetylglucosamine and ATP were used as substrates, and the cloned gene was confirmed to be the N-acetylhexosamine kinase gene. . At this time, the Km value was 0.12 mM, and the k0 value was 1.85 sec −1 .
単離されたタンパク質のＮアセチルヘキソサミンキナーゼ活性に関して、至適ｐＨは８．５であり（図１）、ｐＨ安定性は３０℃３０分処理においてｐＨ５から９．５までであり（図２）、反応至適温度は４０℃であり（図３）、温度安定性は３０分処理で３０℃までである（図４）。また、触媒反応にマグネシウムイオンを必要とし、コバルトイオンでも２０％の活性がある。また、ドナー基質としてＡＴＰに対する活性を１００％としたとき、ＧＴＰ及びＩＴＰは４４％及び３２％の活性を有する。
Regarding the N-acetylhexosamine kinase activity of the isolated protein, the optimum pH is 8.5 (FIG. 1), the pH stability is from
さらに、アクセプター側の基質としてはＮアセチルグルコサミンに対する活性を１００％としたとき、Ｎアセチルガラクトサミン、Ｎアセチルマンノサミン、タロース、マンノース、２デオキシグルコース、グルコース、ガラクトースに対してそれぞれ６０、１５、３、１．５、０．５、０．１、０．０１％の活性を有しており、各基質のα−糖１リン酸の生成が確認できた。 Furthermore, as an acceptor-side substrate, when the activity with respect to N acetylglucosamine is 100%, 60, 15, 3 for N acetylgalactosamine, N acetylmannosamine, talose, mannose, 2 deoxyglucose, glucose and galactose, respectively. 1.5, 0.5, 0.1, and 0.01%, and the production of α-sugar monophosphate of each substrate was confirmed.
以上の結果より、幅広い糖基質特異性を示す糖リン酸化活性を有するタンパク質を見出した。また、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ １２１７株においては、配列番号１に示される塩基配列における５４１番目以降１６２０番目までの間にタンパク質をコードする領域が存在することが確認された。 From the above results, a protein having sugar phosphorylation activity showing a wide range of sugar substrate specificities was found. Further, in Bifidobacterium longum JCM 1217 strain, it was confirmed that a protein-coding region was present between the 541th and 1620th positions in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
本発明により、糖リン酸化剤及び糖リン酸化方法が提供される。本発明において使用するタンパク質などは、糖のリン酸化反応を効率的に触媒するものであり、かつ糖基質特異性が低いため、あらゆる種類の糖をリン酸化することが可能である。かかる糖リン酸化剤及び糖リン酸化方法は、例えば、食品加工及び医薬品工業の分野において有用な各種α−糖１リン酸を効率よく製造するために有用である。 According to the present invention, a sugar phosphorylating agent and a sugar phosphorylation method are provided. Proteins and the like used in the present invention efficiently catalyze the phosphorylation reaction of sugars and have a low sugar substrate specificity, and therefore can phosphorylate all kinds of sugars. Such sugar phosphorylating agents and sugar phosphorylation methods are useful for efficiently producing various α-sugar monophosphates useful in the fields of food processing and pharmaceutical industry, for example.
配列番号３〜６：合成オリゴヌクレオチド SEQ ID NOs: 3-6: Synthetic oligonucleotides
Claims (6)
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、糖リン酸化活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、糖リン酸化活性を有するタンパク質をコードする核酸
（ｃ）上記（ｂ）の核酸を含む組換えベクター
（ｄ）上記（ｃ）の組換えベクターで形質転換された形質転換体 A sugar phosphorylating agent comprising at least one of the following (a) to ( d ) , wherein the sugar is glucose, mannose, talose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, or N-acetylmannosamine And the sugar phosphorylating agent, which is at least one selected from the group consisting of 2-deoxyglucose .
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a sugar Protein having phosphorylation activity (b) Nucleic acid encoding a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are substituted, deleted, inserted or added A nucleic acid encoding a protein having a sugar phosphorylation activity ( c ) and a recombinant vector comprising the nucleic acid of (b) above ( d ) transformed with the recombinant vector of ( c ) above Transformant
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