JP4790013B2 - β−アミロイドの血中分解速度測定によるアルツハイマー病の検定に用いられる方法及び診断試薬 - Google Patents

Description

本発明は、検体血液中のβ−アミロイドの分解速度を測定することによる、アルツハイマー病などβ−アミロイドが関与する疾患の検定方法に関するものである。

β−アミロイド（以下、Ａβと記す）は、アルツハイマー病（ＡＤ）患者脳に特徴的に認められるアミロイドプラークの主な構成成分であり、Ａβは、その前駆体タンパク質（ＡＰＰ）Ｎ−末端のβ部位を切断するβ−セクレターゼと、細胞膜内に存在するＡＰＰ−Ｃ−末端を切断するプレセリニンのγ−セクレターゼによって切り出されることで産生されることが知られている。
Ａβの分子種は、様々な分子量サイズのものが知られているが、それらの中で神経細胞毒性と関連して最もよく知られているのが、４２個のアミノ酸からなるＡβ（以下、Ａβ１−４２と記す）である。Ａβ１−４２は、容易に繊維化する性質を持っており、ＡＤの早期から沈着しアミロイドプラークを形成することが知られており、ＡＤ発症の原因物質のひとつであると考えられている。
上記のように、Ａβの合成過程及びＡβとＡＤ発症の関係についてはこれまでにも盛んに研究が進められている。一方、産生したＡβの分解経路についても近年になって徐々にではあるが解明されつつある。特に、西道らのグループは脳の神経細胞内に特異的に局在するＡβ分解酵素であるネプリライシンの存在を突き止め、この酵素の働きが低下するとＡβの脳内沈着量が増加し、ＡＤを引き起こす可能性について示唆した（非特許文献１〜３）。一方、Ａβは脳内で産生した後、脊髄液を経由して最終的に血中まで移行すると考えられているが、血中を含む脳組織以外でのＡβ分解に関しては、分解経路や分解酵素の存在の有無も含めて未だ不明である。

診断の面からＡＤを見ると、Ａβ１−４２がＡＤの発症と密接に関係しているため、ＡＤ患者の診断に関してＡβ１−４２を疾患マーカーとする試みが以前から検討されてきた。これまでには脳脊髄液中のＡβ１−４２に関して、ＡＤ患者でその濃度が低下していることが報告されている（非特許文献４〜７）。しかし脳脊髄液を検体とするのは、検体採取時の患者への身体的負担・身体機能損傷のリスクが大きく、実際上は脳脊髄液を検体として使用することは現実的でない為、一般には普及していないのが現状である。一方、体外診断薬として最も一般的で、且つ身体的負担・リスクが低い検体として、血液検体（血清又は血漿）が考えられる。しかし血清中でのＡβ測定は、これまで行われてきた一般的測定手法、たとえば二抗体サンドイッチ免疫測定法では血液中からはほとんど検出されておらず、臨床的有用性も見出せていない。このことから血液検体でＡβ１−４２を測定することによりＡＤ患者を診断することは非常に困難だと考えられる（非特許文献８）。体外診断薬として一般的な血液検体での診断が不可能であることはＡＤの診断学的研究において、現在大きな課題となっている。
Takaki Y, et al., J.Biochem(Tokyo).2000;128(6):897-902. Shirotani K, et al., J. Biol.Chem.2001 276(24);21895-901. Iwata N, et al., Science.2001 292(5521);1550-2. Tamaoka A, et al., J. Neurol. Sci.1997; 148:41-45. Andreasen N, et al., Arch.Neurol.1999; 56:673-680. Galasko D, et al., Arch. Neurol. 1998; 55:937-945. Motter R, et al., Ann Neurol 1995; 38:643-648. Tamaoka A, et al., J.Neurol. Sci.1996; 141:65-68. 難波et al.、電気化学発光法（Electrochemiluminescence：ＥＣＬ）による高感度免疫学的測定法の検討、日本臨床検査自動化学会会誌（ＪＪＣＬＡ）、1996, Vol. 21 No. 5. Nature, 256, 459-497(1975)

本発明は、検体血液中に添加したＡβペプチドの分解速度を測定する方法により、ＡＤ診断に応用することにある。

上記課題を解決するために本発明者らは、ヒト血清中でのＡβペプチドの分解代謝の有無を測定できるかどうかを検討した。Ａβ１−４２の血中分解を確認する為、Ａβ１−４２合成ペプチドをヒト血清に添加し、経時的にＡβ１−４２の残存量を測定した。測定法は、一次抗体としてＡβ１−４２のＮ末端部分に特異性を有する抗体、第二抗体としてＡβ１−４２のＣ末端部分に特異性を有する抗体を使用し、電気化学発光法（非特許文献９）を利用する二抗体サンドイッチ免疫測定法にて測定した。この方法は、全長Ａβ１−４２の測定は可能であるが、分解を受けて断片化したＡβ１−４２は測定が不可能である測定系である。
測定の結果、添加したＡβ１−４２合成ペプチドの測定値は時間の経過とともに低下していくことを確認した。また、Ａβ１−４２合成ペプチドを血清に添加する際に、血清中に酵素活性を阻害するプロテアーゼインヒビターをあらかじめ投入しておくと、時間経過によるＡβ１−４２測定値低下が大幅に抑えられることについても確認した。
これらの事実は、Ａβが血液中で、速やかにプロテアーゼにより分解・断片化していることを意味しており、添加したＡβ１−４２合成ペプチドが血液中で酵素消化され、断片化していくことで、全長Ａβ１−４２のみを測定できる二抗体サンドイッチ免疫測定法での測定が不可能となっていくことを意味する。

次いで、ＡＤ患者と健常人血清検体にＡβ１−４２合成ペプチドを任意の量添加し、２５℃で２０時間保存した検体について、上記二抗体サンドイッチ免疫測定法にて測定を行ったところ、ＡＤ患者、健常人血清ともにＡβ１−４２合成ペプチド添加直後に測定した測定値と比べて、測定値の低下が見られ、いずれの検体についても検体中のプロテアーゼがＡβ１−４２合成ペプチドを分解していることが確認された。さらに、ＡＤ患者と健常人の血清における測定値の低下率を比較すると、両者の間に有意差があり、ＡＤ診断に利用しえる可能性があることを確認し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明のアルツハイマー病の検定に用いられるβ−アミロイド分解活性の測定方法は、検体血液成分の、Ａβ分解活性を測定することを特徴とする。Ａβ分解活性を測定する方法としては、検体血液にＡβペプチドを添加して、一定時間経過後、該ペプチドを分解する活性を測定して、健常者血液の該分解活性と比較する方法が用いられる。検体に添加するＡβペプチドは、Ａβペプチド１−４２が用いられる。添加したＡβペプチドの残存量の測定方法は、感度、簡便性に優れる免疫学的測定方法により、特に該ペプチドのＮ末端部分を認識する抗体とＣ末端部分を認識する抗体を使用した二抗体サンドイッチ免疫測定法により行う。検体血液は、血清又は血漿が好ましい。

本発明のＡＤ診断試薬は、本発明方法に用いられるアルツハイマー病の診断試薬であって、検体血液に添加するＡβペプチド、該ＡβペプチドのＮ末端部分を認識する抗体及び該ＡβペプチドのＣ末端部分を認識する抗体を必須の構成成分とし、前記β−アミロイドペプチドが、β−アミロイド１−４２であり、検体血液に添加したＡβペプチドの残存量を測定することにより、検体血液のＡβペプチド分解酵素活性を測定することを特徴とする。該診断試薬は、採用する免疫測定方法及び添加するＡβペプチドの種類により試薬の構成は異なるが、例えば、Ａβ１−４２ペプチド及び二抗体サンドイッチ免疫測定法を採用した場合は、固相化したＡβ１−４２のＮ末端部分認識抗体と標識物で標識したＡβ１−４２のＣ末端部分認識抗体を構成成分とする。あるいは固相化したＡβ１−４２のＣ末端部分認識抗体と標識物で標識したＡβ１−４２のＮ末端部分認識抗体を構成成分としてもよい。Ａβ１−４２のＣ末端部分認識抗体は特に限定されないが、２１Ｆ１２が好ましい。

本発明の方法及び試薬において、前記抗体として、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体いずれも用いることができる。また前記抗体のうち、Ａβ１−４２のＣ末端部分認識抗体に関してはＡβ１−４２に特異性の高い抗体であることが好ましいが、この限りではない。なお、前記血液検体が血清または血漿であることが好適であるが、全血を使用することもできる。標識物質として、蛍光物質、酵素、色素、発光物質などが挙げられ特に限定されないが、ルテニウム錯体が好ましい。固定化する支持体も特に限定されず、好ましくは磁気ビーズである。
なお、添加したＡβペプチドの残存量の測定方法は上記の二抗体サンドイッチ免疫測定法に限らず、例えば発光物質や蛍光物質を標識したＡβ合成ペプチドを作製して血中に添加し、添加Ａβペプチド分解による発光、蛍光量の変化を測定する方法などを使用することも可能であり、本発明の趣旨は、検体血液成分のＡβ分解活性を測定することにある。言い換えれば、検体血液に含まれるプロテアーゼ活性又は量を測定してＡＤを検定する方法である。その一つの手法として、検体血液に添加したＡβペプチドの分解速度、つまり血液中でのＡβ分解酵素の活性を測定することによりＡＤ診断に利用することにある。

血液中のＡβ分解酵素の活性を測定する別法は、放射性同位元素や蛍光物質等で標識したＡβペプチドを使う方法である。具体的には、例えば、Ａβの特定の部位を蛍光物質で標識して被検血液に添加し、一定時間後に蛍光検出器を有するＨＰＬＣ分析器にて分析して、蛍光物質が溶出される時間を測定する。分解されていない蛍光標識Ａβペプチドのピークとは異なる溶出時間に検出される、蛍光標識Ａβペプチド断片のピークを検出することにより、Ａβペプチドの分解を測定することができる。
本発明方法によれば、複数のＡβペプチドの分解物が存在した場合でも、ＡＤに特異的に現れるピークを測定することにより、より特異的な診断が可能になる。また、ＡＤに特異的に現れるピークが特定できれば、ＡＤ特異的なＡβペプチドの切断位置を特定することができ、より特異的なＡＤ診断薬の開発につなげることが可能となる。

本発明は、Ａβペプチドを特異的に認識する抗体を用いる二抗体サンドイッチ免疫測定法を用いて、血液検体に添加したＡβ合成ペプチドの分解度合いを測定することにより、Ａβペプチド分解酵素活性の強弱を確認し、ＡＤを診断することを可能としたものである。本発明によれば、血漿や血清などの血液検体にてＡＤを診断することが可能となる。

実験例１の結果を示すグラフである。 実験例２の結果を示すグラフである。 実施例１の結果を示すグラフである。 実施例２の結果を示すグラフである。

以下に本発明の実施の形態を説明するが、本発明の技術思想から逸脱しない限り、様々な変形が可能であることはいうまでもない。

検体血液として血清を用い、検体血清に添加するＡβペプチドとしてＡβ１−４２合成ペプチドを使用し、該ペプチドの定量法として二抗体サンドイッチ免疫測定法を採用した場合を一例として以下に記載する。
検体血清にＡβ１−４２合成ペプチドを添加して２５℃で保温した後、その一定量を分取して残存するＡβ１−４２合成ペプチドを二抗体サンドイッチ免疫測定法にて定量し、検体血清の該ペプチド分解活性を算定する。この値と健常者血清の分解活性とを比較することにより、ＡＤの疾患の有無を検定するものである。
二抗体サンドイッチ免疫測定法は、Ａβ１−４２のＮ末端部分に特異的な抗体を磁気ビーズに固相化したものと、ルテニウム錯体で標識したＣ末端部分に特異的な抗体を使用し、手法は常法に準ずる。すなわち、分取したサンプルと、抗体を固相化した磁気ビーズを反応させて、Ａβ１−４２合成ペプチドを結合させた後洗浄する（ＢＦ分離）。次いで標識した二次抗体を反応させて、磁気ビーズに結合したＡβ１−４２合成ペプチドと結合させた後洗浄し、最後に、磁気ビーズに結合している標識物質ルテニウム錯体の量を、トリプトピルアミン存在下で電気エネルギーを加えて発光させ、発光の強度を測定する方法である。

添加したＡβ１−４２合成ペプチド残存量の測定法としては、免疫学的手法に限られず、Ａβ１−４２量を測定することができる方法であれば特に限定されない。
前記二抗体サンドイッチ免疫測定法に用いられる抗体は、Ａβ１−４２のＮ末端部分に特異的な抗体と、Ｃ末端部分に特異的な抗体であれば、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体いずれも使用することが可能である。
Ａβ１−４２のＮ末端部分認識抗体に関しては、必ずしも最Ｎ末端部である必要はなく、市販品としては、例えば、Ａβ１−４２のアミノ酸１−５部位認識抗体である３Ｄ６抗体（イノジェネティクス社製）やアミノ酸１０−１６部位認識抗体である６Ｅ１０抗体（ケミコン社製）、アミノ酸１７−２４部位認識抗体である４Ｇ８抗体（ケミコン社製）などが使用可能である。
Ａβ１−４２のＣ末端部分認識抗体は、市販品としては、例えば、マウスモノクローナル抗体である２１Ｆ１２（イノジェネティクス社製）、８Ｇ７（ナノツール社製）、あるいはウサギポリクローナル抗体であるＡＢ５０７８Ｐ（ケミコン社製）などが挙げられる。
Ａβ１−４０のＣ末端部分認識抗体とＮ末端部分認識抗体の二抗体サンドイッチ免疫測定系を用いて、Ａβ１−４０合成ペプチドの血液検体中での分解速度を測定する方法などを用いる事も可能である。また、Ｎ末端部分認識抗体として、アミノ酸１０−１６部位認識抗体６Ｅ１０抗体を使用する場合は、添加するＡβ合成ペプチドのＮ末端部分を短くすることも可能である。さらに、Ａβ合成ペプチドの分解（切断）部位を認識する抗体を用いることにより、検体中での分解の有無を測定することもできる。
このように、検体血液に添加するＡβ合成ペプチドは、Ａβ１−４２合成ペプチドに限らず、血液中で分解されうる長さを有しておれば特に限定されるものではなく、該ペプチドの測定法として免疫学的測定法を採用した場合は、使用する抗体の認識部位の特異性等を考慮して、ペプチドの長さは適宜選択することができる。本発明方法において、基質として使用するＡβ１−４２合成ペプチドは、ヒト由来Ａβ１−４２と同一アミノ酸配列であれば製造メーカーを問わず使用可能である。前記ペプチドは、固相合成法など常法に従い合成することが出来る。

抗体を固相化する支持体の材料としては、例えば、ガラス、プラスチック（例えばポリスチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、金属などが挙げられる。支持体の形状は、カップ型、平板、粒子など、特に限定されない。好ましくは、マグネティックマイクロビーズ（磁気ビーズ）である。
抗体を支持体に固相化する方法は、常法に準ずればよい。支持体として磁気ビーズを使用する場合、該ビーズと抗体を緩衝液中で反応させた後、磁気ビーズをブロッキング剤で処理し、使用時までブロッキング剤下で保存することが好ましい。
本発明に使用する標識物質は、酵素、発光物質、蛍光物質、同位元素などに限定されず、好ましくはルテニウム錯体である。標識抗体の調製方法は常法に準ずる。例えば、抗体とルテニウム錯体（ＩＧＥＮ社製、ORIGEN TAG-NHS ESTER）を緩衝液中で反応させた後、２Ｍグリシンを加えてさらに反応させる。次いで、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより標識抗体を精製することにより調製できる。

本発明の二抗体サンドイッチ免疫測定法に基づく診断試薬（キット）は、Ａβ１−４２のＮ末端部分に特異性を有する抗体、Ｃ末端部分に特異性を有する抗体及びＡβ１−４２合成ペプチドを必須の構成成分とするものである。なお、反応に使用する緩衝液、測定器具などを診断試薬に添付することは自由である。なお、上記に記載したように、使用する抗体の特異性に応じて、検体に添加するＡβ合成ペプチドは適宜選択することができる。

本発明に使用する前記抗体は、常法により調製することができる。モノクローナル抗体の調製は、Ａβ１−４２のＣ末端部分を保有するペプチドを抗原として、必要に応じてキャリアー蛋白質との複合体を作り、これを動物に接種して免疫する。上記免疫動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合し、Ａβ１−４２のＣ末端部分に強い特異性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより調製される。その操作は従来既知の方法に準ずればよい。
免疫抗原はＡβ１−４２も使用できるが、目的の抗体がＡβ１−４２のＣ末端部分に特異性を有する抗体であるので、Ａβ１−４２のＣ末端部分を保有するペプチド、例えば、Ａβ３３−４２など適宜選択することができる。通常、キャリアー蛋白質との複合体を抗原として使用するが、その調製は種々の縮合剤、例えばグルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル等が使用される。キャリアー蛋白質はウシ血清アルブミン、サイログロブリン、ヘモシアニン等を使用し、通常１〜５倍量の割合でカップリングさせる方法が用いられる。
免疫される動物としてはマウス、モルモットなどがあげられ、接種方法は皮下、筋肉あるいは腹腔内に投与される。投与に際しては、完全フロイントアジュバンドや不完全フロイントアジュバンドと混和して投与してもよく、投与は通常２〜５週毎に１回ずつ行われる。免疫された動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞と細胞融合させられ、ハイブリドーマとして単離される。骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来のものであることが好ましいが、異種間においても可能な場合もある。

細胞融合の操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法（非特許文献１０）に従い実施できる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコールやセンダイウイルスなどが挙げられ、通常２０〜５０％程度の濃度のポリエチレングリコール（平均分子量１０００〜４０００）を用いて２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃の温度下、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常１：１〜１０程度、約１〜１０分間程度反応させることにより細胞融合を実施することができる。
Ａβ１−４２のＣ末端部分に特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、種々の免疫化学的方法が使用できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、競合法等があげられる。また、Ａβ１−４２ペプチド及びＡβ１−４０ペプチドを使用することにより、Ａβ１−４２に反応しＡβ１−４０に反応しない抗体を選択することができる。
このように選択されたウエルから更に、例えば限界希釈法によってクローニングを行い、目的とするクローンを得ることができる。ハイブリドーマの選択、育種は、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２０％ウシ胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）で行われる。このようにして得られたクローンは、あらかじめブリスタンを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取し、抗体精製の原料とすることができる。また、該クローンを培養し、その培養液を抗体精製の原料とすることもできる。モノクローナル抗体の回収は、免疫グロブリンの精製法として既知の方法を用いればよく、例えば、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体の利用、さらにアフィニティクロマトグラフィなどの手段により達成することができる。
ポリクローナル抗体も常法により調製することができる。抗原はＡβ１−４２のＣ末端部分を主な構成とするペプチドを採用し、前記と同様な手法により、複合体としてウサギ、モルモットなどの動物に免疫して調製することができる。適宜採血して抗体力価を測定し、高力価の血清を抗体の精製原料として、前記の手法により精製することによりポリクローナル抗体を得ることができる。

本発明の一つである二抗体サンドイッチ免疫測定法による検体血液（血漿、血清）に添加したＡβ合成ペプチド分解速度測定によるＡＤ診断方法は、血液検体でのＡＤ診断が可能な優れた方法である。これまでに血液検体を使用してＡＤを診断する体外診断薬は存在せず、血中のＡβ分解酵素に着目し、Ａβ１−４２の分解度合いを測定することでＡＤ診断を行う試みはこれまでに報告がない。よって本発明の手法がＡＤ診断に有用であることは、本発明者が始めて見出したものであり、本発明はＡβペプチドの分解測定によってＡＤ患者と健常者の血液検体間での臨床的有用性を証明し、ＡＤの血液検体での診断を可能にしたものである。また、本発明の趣旨から、Ａβ分解酵素そのものを測定する手法も採用することができ、Ａβが原因の一つとなる疾患の診断にも利用できる可能性がある。

以下に実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。

（実験例１）３Ｄ６抗体と２１Ｆ１２抗体での電気化学発光二抗体サンドイッチ免疫測定法
一次抗体としてＡβ１−４２の１−５アミノ酸部位を認識する３Ｄ６マウスモノクローナル抗体（イノジェネティクス社製）を使用し、二次抗体としてＡβ１−４２のＣ末端部分認識抗体である２１Ｆ１２マウスモノクローナル抗体（イノジェネティクス社製）をルテニウム錯体標識して使用した。

以下に試薬の各構成成分の調製方法について記す。
（１）３Ｄ６抗体結合磁気ビーズの調製方法
３Ｄ６マウスモノクローナル抗体を１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で１ｍｇ／ｍＬ抗体濃度に希釈し、この抗体０．５ｍＬを、３０ｍｇ／ｍＬの磁気ビーズ（ＤＹＮＡＬ社製、DYNABEADS M-450 Epoxy）０．５ｍＬと混合した。混合液を２５℃、１６時間攪拌し、磁気ビーズと抗体を結合させた。その後、この磁気ビーズ溶液より溶液のみを抜き取ることで、溶液中に残存していた磁気ビーズ未結合の遊離抗体を除去した。次にブロッキング剤として１ｍＬの４％ブロックエース試薬（大日本製薬社製）を抗体結合磁気ビーズに加え、２５℃、３時間攪拌した。その後、前述の４％ブロックエース試薬１０ｍＬで磁気ビーズを洗浄（２ｍＬの４％ブロックエース／５回洗浄）した。洗浄後の３Ｄ６抗体結合磁気ビーズは前述の４％ブロックエース試薬０．５ｍＬと混合し、使用時まで４℃で保存した。

（２）ルテニウム錯体標識２１Ｆ１２抗体の調製方法
ルテニウム標識抗体の調製方法は、２１Ｆ１２マウスモノクローナル抗体（イノジェネティクス社製）を１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で１ｍｇ／ｍＬ抗体濃度に希釈した。１ｍｇ／ｍＬ抗体０．５ｍＬに１０ｍｇ／ｍＬのルテニウム（ＩＧＥＮ社製、ORIGEN TAG-NHS ESTER）を１７．６μＬ加え、２５℃、３０分間攪拌した。その後、２ｍｏｌ／Ｌグリシンを３０μＬ添加し、２５℃、３０分間攪拌した。
次いで、直径１ｃｍ、高さ３０ｃｍのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス社製、sephadex G-25）にルテニウム標識抗体液をアプライし、未標識のルテニウムとルテニウム標識抗体を単離精製した。溶出は１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて行った。

（３）二抗体サンドイッチ免疫測定法によるＡβ１−４２ペプチドの測定
５００μＬ容ポリスチレンカップ（以下、反応カップと記述）を必要量用意し、それぞれに２００μＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳ／１％（Ｗ／Ｖ）ブロックエース（大日本製薬社製）／０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ／０．０１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０／１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ２Ｎａ／０．１％ＣＨＡＰＳ ｐＨ７．２（以下、反応用溶液と記述）を分注した。そこにＡβ１−４２合成ペプチド（ペプチド研究所社製）、Ａβ１−４０合成ペプチド（ペプチド研究所社製）、Ａβ１−１１合成ペプチド（バヘム社製）、及びＡβ３４−４２合成ペプチド（シグマ社製）を反応用溶液で０、１、５、１０、５０、１００、２００又は４００ｐｇ／ｍＬに希釈してから２０μＬずつ混合した。次に反応用溶液で１ｍｇ／ｍＬ濃度に希釈した３Ｄ６抗体結合磁気ビーズを２５μＬずつ添加し、３０℃で９分間反応させた（第一反応）。
その後、磁気ビーズを磁石でトラップしておいてから反応カップ中の液体を抜き取り、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＴｒｉｓＨＣＬ／ｔｗｅｅｎ２０／０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ ｐＨ７．５（以下、洗浄液と記述）３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した。次に反応用溶液で４μｇ／ｍＬ濃度に希釈したルテニウム標識２１Ｆ１２抗体を２００μＬ加えて３０℃で９分間反応させた（第二反応）。反応後の磁気ビーズを磁石でトラップしておいてから反応カップ中の液体を抜き取り、３５０μＬの洗浄液で２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した。
その後、反応カップに発光基質である３００μＬのトリプトピルアミンを入れ、磁気ビーズと混合した。この状態で電気エネルギーを与えることでルテニウムが発光し、その発光強度を検出機で検出した。なお、上記の反応カップへの磁気ビーズ添加測定操作以降は、ルテニウム発光自動測定機であるピコルミ８２２０（三光純薬社製）上で行った。結果を表１及び図１に示す。

表１及び図１に示した如く、本法での２抗体サンドイッチ免疫測定法は、全長Ａβ１−４２ペプチドのみを特異的に検出可能な測定系であり、断片化Ａβは測定不可能な測定系であることが確認された。

（実験例２）血清によるＡβ１−４２合成ペプチドの酵素分解確認試験
マイクロチューブ（ピアス社製、Immuno Ware Micro Tubes、以下マイクロチューブと記述）２本に、健常人の血清を９０μＬずつ分注した。２本の内の１本に９μＬのプロテアーゼインヒビターカクテル（ロッシュ社製）を添加し（以下、インヒビター添加サンプルと表記）、他方に９μＬ滅菌水を加えた（以下、インヒビター無しサンプルと表記）。その後、それぞれのチューブは２５℃で保温した。
サンプル作製直後（０時間）、保温開始６時間後、及び保温開始２０時間後に各サンプルから１０μＬずつを抜き取り、２００μＬの反応用溶液とマイクロチューブ内で混合した（以下、測定前希釈サンプルと表記）。測定前希釈サンプルは作製後、時間を置かずに実験例１と同様の方法でＡβ１−４２サンドイッチ免疫測定法にて測定を行った。

ＥＣＬ発光強度の測定結果を表２に示す。表２中、サンプル作製直後の測定値を１００％としたときの、各サンプルの測定値を相対比で示した。図２はその相対比を図示したグラフである。

表２及び図２に示した如く、プロテアーゼインヒビターを加えてからＡβ１−４２合成ペプチドを添加した血清の方が、明らかに時間経過による測定値の低下を抑えられるという結果が得られた。よって血清中にはＡβ１−４２を分解する酵素が存在し、添加したＡβ１−４２合成ペプチドは時間とともに酵素分解されて断片化する為、全長Ａβ１−４２のみを測定可能な二抗体サンドイッチ免疫測定系では測定値が時間とともに低下したと考えられる。一方、プロテアーゼインヒビターを加えた場合は、酵素によるＡβ１−４２分解が阻害される為、Ａβ１−４２がプロテアーゼインヒビターを加えない場合よりも多く残存し、結果、測定値の低下も抑えられたと示唆される。

（実施例１）ＡＤ患者及び健常人血清のＡβ１−４２分解速度比較
マイクロチューブを必要量用意し、３０例のＡＤ患者血清、及び３０例の健常人血清を１００μＬずつ分注した。各分注検体に１μＬの４００ｎｇ／ｍＬ Ａβ１−４２合成ペプチドを加えた。同時に血清検体の代わりに１００μＬの反応用溶液に１μＬの４００ｎｇ／ｍＬ Ａβ１−４２合成ペプチドを加えたものを標準品として作製した。Ａβ１−４２合成ペプチド添加血清及び標準品は２５℃で２０時間保温した。
保温開始２０時間後の各サンプルから１０μＬずつを抜き取り、２００μＬの反応用溶液とマイクロチューブ内で混合し、測定前希釈サンプルとした。測定前希釈サンプルは作製後、時間を置かずに実験例１と同様の方法で二抗体サンドイッチ免疫測定法にて測定を行った。

ＡＤ患者のＥＣＬ発光強度の測定結果を表３に示し、健常人のＥＣＬ発光強度の測定結果を表４に示した。表３及び４中、標準品の発光強度を１００％としたときの各サンプルの発光強度の相対比を残存率として表示した。さらにこの残存率より算出した、Ａβ１−４２の分解率（％）について表示した。分解率は下記式（１）により算出される。
分解率＝（１−サンプルの発光強度÷標準品の発光強度）×１００・・・（１）
また、ＡＤ患者及び健常者の分解率の平均値をそれぞれ表３及び表４に示した。図３は、ＡＤと健常人のＡβ１−４２の分解率を示したグラフである。

表３，４及び図３に示した如く、健常人群ではＡβ１−４２の分解率がＡＤ群と比較して高いことが確認された。このことは健常人群では血液中Ａβ１−４２の分解能がＡＤ群よりも高いことを示している。また、ｔ検定によると二群間には有意差があると判定された（ｐ＜０．０１）ことから、本発明の手法は血清検体でのＡＤ診断に使用しえることが確認された。

（実施例２）６Ｅ１０抗体と２１Ｆ１２抗体での電気化学発光二抗体サンドイッチ免疫測定法による、ＡＤ患者及び健常人血清のＡβ１−４２分解速度比較
一次抗体としてＡβ１−４２の１０−１６アミノ酸部位を認識する６Ｅ１０マウスモノクローナル抗体（ケミコン社製）を使用し、二次抗体としてＡβ１−４２のＣ末端部分認識抗体である２１Ｆ１２マウスモノクローナル抗体（イノジェネティクス社製）をルテニウム錯体標識して使用した。６Ｅ１０抗体結合磁気ビーズの調製方法、ルテニウム錯体標識２１Ｆ１２抗体の調製方法及び二抗体サンドイッチ免疫測定法は、実験例１と同様の方法で行った。結果を表５，６及び図４に示す。

表５，６及び図４に示した如く、健常人群ではＡβ１−４２の分解率がＡＤ群と比較して高いことが確認された。また、実施例１と同様に、ｔ検定においてＡＤ患者と健常人の二群の間には有意差があると判定された（Ｐ＜０．０１）。このことからＡβ１−４２のＮ末端の１−５アミノ酸部位を認識する３Ｄ６抗体の代わりに、１０−１６アミノ酸部位を認識する抗体である６Ｅ１０抗体を使用してサンドイッチ測定法を行っても、ＡＤ診断が可能であることが確認された。

血液中のＡβ１−４２分解酵素活性を確認できる本方法によって、血液検体（血清、血漿）でのアルツハイマー病を診断することにある。

Claims (4)

1. 検体血液成分の、β−アミロイド分解活性を測定する、アルツハイマー病の検定に用いられるβ−アミロイド分解活性の測定方法であって、
   β−アミロイド分解活性を測定する方法が、前記検体血液に、β−アミロイドペプチドを添加して、該ペプチドを分解する活性を測定し、健常者血液の該分解活性と比較することであり、
   前記検体血液に添加するβ−アミロイドペプチドが、β−アミロイド１−４２であり、
   前記検体血液に添加したβ−アミロイドペプチドの残存量を免疫学的測定法により測定して、前記検体血液のβ−アミロイドペプチドの分解活性を測定し、
   前記免疫学的測定法が、前記検体血液に添加するβ−アミロイドペプチドのＣ末端部分を認識する抗体及びＮ末端部分を認識する抗体を使用する二抗体サンドイッチ免疫測定法であることを特徴とする方法。
2. 前記検体血液が血清又は血漿であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
3. 請求項１又は２記載の方法に用いられるアルツハイマー病の診断試薬であって、
   検体血液に添加するβ−アミロイドペプチド、該β−アミロイドペプチドのＣ末端部分を認識する抗体及び該β−アミロイドペプチドのＮ末端部分を認識する抗体を必須の構成成分とし、
   前記β−アミロイドペプチドが、β−アミロイド１−４２であり、
   検体血液に添加した該β−アミロイドペプチドの残存量を測定することにより、検体血液のβ−アミロイドペプチド分解活性を測定することを特徴とする、アルツハイマー病の診断試薬。
4. 前記検体血液が血清又は血漿であることを特徴とする、請求項３記載のアルツハイマー病の診断試薬。

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