JP4788002B2 - Method for introducing nucleic acid into cells using Agrobacterium, including the use of reduced pressure treatment / pressurization treatment - Google Patents

Method for introducing nucleic acid into cells using Agrobacterium, including the use of reduced pressure treatment / pressurization treatment Download PDF

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Description

本発明は、減圧処理または加圧処理と、アグロバクテリウムを用いて、所望の核酸を細胞または組織（植物組織を含む）へ導入し、核酸導入体（形質転換体を含む）を作出する方法に関する。さらに、本発明は、減圧処理または加圧処理と、エレクトロポーレーションを組み合わせることによって、所望の核酸を含むアグロバクテリウムのような細菌を細胞または組織に導入して、核酸導入体（形質転換体を含む）を作出する方法に関する。   The present invention is a method for producing a nucleic acid transductant (including a transformant) by introducing a desired nucleic acid into a cell or tissue (including a plant tissue) using reduced pressure treatment or pressure treatment and Agrobacterium. About. Furthermore, the present invention introduces a nucleic acid transductant (transformant) by introducing a bacterium such as Agrobacterium containing a desired nucleic acid into a cell or tissue by combining reduced pressure treatment or pressurized treatment with electroporation. ).

コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズなどの主要穀物は人類の生存にとって必須のものであるが、世界的な人口増加に見合った食料を確保していくためには、現在より収量の多い作物を開発していく必要がある。収率を上げる品種改良の一つとして、組換えＤＮＡ技術を用いた形質転換作物の開発が行われている。   Major crops such as wheat, barley, rice, corn, and soybean are essential for the survival of mankind, but in order to secure food commensurate with the global population growth, crops with higher yields than current crops must be used. It is necessary to develop it. As one of the varietal improvements that increase the yield, development of transformed crops using recombinant DNA technology has been carried out.

また、例えば、ハクサイ、トマト、キュウリなどの野菜類は食生活を豊かにし、栄養面でも必須の作物である。しかしながら、これらの野菜は様々な病虫害に弱く、遺伝子組換え技術の利用により耐病虫害性を付与することができるならば、収穫量を安定させることが可能となる。そのため、有用な遺伝子の単離と共にこれらの遺伝子を用いる形質転換方法が開発されてきた。   For example, vegetables such as Chinese cabbage, tomatoes, and cucumbers are essential crops in terms of nutrition and enrichment. However, these vegetables are vulnerable to various pests and diseases, and if the pest resistance can be imparted by using gene recombination techniques, the yield can be stabilized. Therefore, transformation methods using these genes have been developed along with the isolation of useful genes.

形質転換を行うためには、植物の場合、一般に、植物に対して直接的に遺伝子導入を行う方法（直接的遺伝子導入法）、または植物に対して間接的に遺伝子導入を行う方法（間接的遺伝子導入法）が行われる。   In order to perform transformation, in the case of a plant, generally, a method of directly introducing a gene into a plant (direct gene transfer method) or a method of indirectly transferring a gene into a plant (indirect Gene transfer method).

現在までに、間接的な遺伝子導入法として、アグロバクテリウムを利用した方法が広く利用されている。例えばイネの完熟種子を培養して３週間後に得られたカルスに対してアグロバクテリウムを感染させる方法（Ｈｉｅｉら，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，６：２７１−２８２，１９９４を参照）あるいは、数日間、前培養した種子に対してアグロバクテリウムを感染させて形質転換体を迅速に得ることができる方法（田中ら、特許第３１４１０８４号を参照）を挙げることができる。しかし、間接的遺伝子導入法を用いた場合、培養時間を短くすると、遺伝子導入ができなくなるか、または遺伝子導入効率が低下するという欠点がある。   To date, as an indirect gene transfer method, a method using Agrobacterium has been widely used. For example, a method of infecting callus obtained after 3 weeks of culturing mature rice seeds with Agrobacterium (see Hiei et al., Plant Journal, 6: 271-282, 1994) or pre-culture for several days A method (see Tanaka et al., Japanese Patent No. 3141084) that can rapidly obtain a transformant by infecting the seeds with Agrobacterium can be mentioned. However, when the indirect gene transfer method is used, there is a disadvantage that if the culture time is shortened, the gene transfer cannot be performed or the gene transfer efficiency is lowered.

また、コムギについては、従来：（１）コムギの形質転換については、品種間差が大きく、培養に必要な期間も長いという問題があったこと（非特許文献２）；（２）コムギの形質転換においてアグロバクテリウムを利用する方法は成功していなかったこと（非特許文献２）；ならびに、（３）コムギの形質転換では、その対象に開花後１０日から２週間程度の未熟胚を用いなければならないという材料調製の困難性に加え、形質転換頻度が低いことなどから未だにパンコムギ等のコムギの形質転換は敬遠されがちであるという現状がある。   As for wheat, conventional: (1) Regarding the transformation of wheat, there was a problem that the difference between cultivars was large and the period required for cultivation was long (Non-patent Document 2); (2) Characteristics of wheat The method using Agrobacterium in conversion was not successful (Non-patent Document 2); and (3) In the transformation of wheat, immature embryos were used for 10 to 2 weeks after flowering for the subject. In addition to the difficulty in preparing the material that must be present, transformation of wheat such as bread wheat is still apt to be avoided due to the low transformation frequency.

そこで、間接的遺伝子導入法のこれら欠点を改善する必要がある。また、簡便かつ迅速な間接的遺伝子導入法を開発することによって、核酸導入体（特に、形質転換植物体）を、迅速かつ大量に得ることが可能になる。従って、本発明は、植物形質転換体を得ることが必要な産業分野のみならず、植物を用いる開発研究においても大量処理・大量解析を容易にせしめ、ひいては飛躍的な研究の進歩を誘発し、画期的な組換え作物の開発につながる。
田中ら、特許第３１４１０８４号 Ｈｉｅｉら，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，６：２７１−２８２，１９９４ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ４６、Ｔｒａｎｇｅｎｉｃ Ｃｒｏｐｓ Ｉ、Ｙ．Ｐ．Ｓ．Ｂａｊａｊ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ社発行、２０００年、特に３３頁のＴ．Ａ．Ｌｏｅｂによる記載 Therefore, it is necessary to improve these disadvantages of the indirect gene transfer method. In addition, by developing a simple and rapid indirect gene transfer method, it is possible to rapidly and in large quantities obtain a nucleic acid transfer body (particularly, a transformed plant body). Therefore, the present invention facilitates mass processing and analysis not only in the industrial field where it is necessary to obtain plant transformants, but also in development research using plants, and thus induces dramatic research advances, It leads to the development of innovative recombinant crops.
Tanaka et al., Japanese Patent No. 3141084 Hiei et al., Plant Journal, 6: 271-282, 1994. Biotechnology in Agricultural and Forestry 46, Transgenic Crops I, Y. et al. P. S. Edited by Bajaj, published by Springer, 2000, in particular T. 33 on page 33. A. Description by Loeb

本発明の解決しようとする課題は、迅速かつ高効率な間接的遺伝子導入法が確立されていないという上記現状に鑑み、当該分野において、迅速かつ高効率な間接的遺伝子導入法を提供することである。   The problem to be solved by the present invention is to provide a rapid and highly efficient indirect gene transfer method in the field in view of the above situation that a rapid and highly efficient indirect gene transfer method has not been established. is there.

簡便かつ迅速な本発明の方法を用いることによって、アグロバクテリウムを用いて、形質転換植物体を、迅速かつ大量に得ることが可能になる。従って、本発明は、植物形質転換体を得ることが必要な産業分野のみならず、植物を用いる開発研究においても大量処理・大量解析を容易にせしめ、ひいては飛躍的な研究の進歩を誘発し、画期的な組換え作物の開発につながる。   By using the simple and rapid method of the present invention, transformed plants can be obtained quickly and in large quantities using Agrobacterium. Therefore, the present invention facilitates mass processing and analysis not only in the industrial field where it is necessary to obtain plant transformants, but also in development research using plants, and thus induces dramatic research advances, It leads to the development of innovative recombinant crops.

上記課題は、
ａ）細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する工程；および
ｂ）該細胞を、核酸を含むアグロバクテリウムと接触させる工程
を包含し、必要に応じて、さらに
ｃ）前記工程（ｂ）の後に、前記細胞と前記アグロバクテリウムとを、エレクトロポーレーションが起きる条件下に配置する工程
を包含する形質転換植物を作製する方法によって達成された。The above issues
a) maintaining the cell under a pressure different from atmospheric pressure; and b) contacting the cell with Agrobacterium comprising the nucleic acid, optionally c) as in step (b) above. Later, this was achieved by a method for producing a transformed plant comprising the step of placing the cells and the Agrobacterium under conditions where electroporation occurs.

一つの実施形態では、本発明の方法は、植物細胞（例えば、完熟種子）を用いて実施される。   In one embodiment, the methods of the invention are performed using plant cells (eg, mature seeds).

具体的には、本願明細書において発明者らは、植物に対してアグロバクテリウムを用いる遺伝子導入を行う際に、核酸が取り込まれやすいように細胞を処理する方法として各種試みた。その結果、（１）植物を真空状態に保ち、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる核酸導入法は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ以外の植物には効果的でないこと、および（２）アグロバクテリウムを用いる核酸導入のためには、植物を真空状態に保つ必要がないこと（Ｂｅｎｔ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１２４：１５４０−１５４７，２０００年１２月）、という従来の知見に反して、実施例に示すように、アグロバクテリウムを用いる植物核酸導入において、植物組織を大気圧と異なる圧力下に維持する工程を用いることによって、迅速な遺伝子導入が可能であることを見出した。この本発明の方法は、植物細胞のみならず任意の細胞に対して行われ得る。さらに、本発明の遺伝子導入方法に、エレクトロポーレーションを組み合わせることによって、細胞への核酸導入効率を顕著に改善し得る。   Specifically, in the present specification, the inventors have made various attempts as a method for treating cells so that nucleic acids are easily taken up when a gene is introduced into a plant using Agrobacterium. As a result, (1) nucleic acid introduction method using Agrobacterium (Agrobacterium) is not effective for plants other than Arabidopsis, and (2) nucleic acid introduction using Agrobacterium Contrary to the conventional knowledge that plants do not need to be kept in a vacuum state (Bent, Plant Physiology, 124: 1540-1547, December 2000), In the introduction of plant nucleic acid to be used, it has been found that rapid gene introduction is possible by using a step of maintaining plant tissue under a pressure different from atmospheric pressure. This method of the present invention can be performed not only on plant cells but also on arbitrary cells. Furthermore, the efficiency of nucleic acid introduction into cells can be significantly improved by combining electroporation with the gene introduction method of the present invention.

本方法は極めて簡便である。さらに、本発明の方法は、核酸導入操作後に通常必要な培養過程を必要としないため、得られる形質導入体が培養変異を含まないという利点も有する。従来の核酸導入操作後に必要とされた培養過程では、必然的に、培養変異が起こることが知られている。培養変異とは、当業者が通常理解し得る通り、培養過程で生じる遺伝学的変異を意味し、培養過程の間に、核酸導入される細胞がもともと有していた核酸配列および／または導入する核酸配列において生じる任意の配列改変（例えば、置換、欠失、挿入、転座、逆位、重複など）をいう。意図されない培養変異は、核酸導入した核酸導入体に望ましくない形質を付与することが多い。従って、この培養変異を全く起こさずに所望の核酸導入体を得ることができる本発明の方法は、非常に有益である。   This method is very simple. Furthermore, since the method of the present invention does not require a culture process that is usually required after a nucleic acid transfer operation, the resulting transductant has the advantage that it does not contain a culture mutation. It is known that culture mutations inevitably occur in the culture process required after a conventional nucleic acid introduction operation. The culture mutation means a genetic mutation that occurs during the culture process, as can be generally understood by those skilled in the art. During the culture process, the nucleic acid sequence originally introduced by the cell into which the nucleic acid is introduced and / or introduced. Any sequence modification (eg, substitution, deletion, insertion, translocation, inversion, duplication, etc.) that occurs in a nucleic acid sequence. Unintended culture mutations often impart undesirable traits to the nucleic acid transductant into which the nucleic acid has been introduced. Therefore, the method of the present invention that can obtain a desired nucleic acid transductant without causing any culture mutation is very useful.

本発明はまた、従来の間接的遺伝子導入法で必須とされていた、数日〜数週間の対象細胞（組織）の前培養を必要とせず、その結果、従来法よりも迅速に遺伝子導入が可能であるという利点を提供する。   The present invention also does not require pre-culture of target cells (tissues) for several days to several weeks, which has been essential in the conventional indirect gene transfer method, and as a result, gene transfer can be performed more rapidly than the conventional method. Provides the advantage of being possible.

従って、本発明は以下を提供する。
１．核酸を細胞内に導入する方法であって、以下の工程：
ａ）細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する工程；および
ｂ）該細胞を、核酸を含むアグロバクテリウムと接触させる工程
を包含する方法。
２．前記細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する工程が、前記細胞を減圧処理する工程である、項目１に記載の方法。
３．前記細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する工程が、前記細胞を加圧処理する工程である、項目１に記載の方法。
４．前記細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する工程が、該細胞を、前記核酸を含むアグロバクテリウムと接触させる工程の前に行われる、項目１に記載の方法。
５．前記減圧処理する工程が、大気圧よりも０．０９６ＭＰａ低い減圧下で行われる、項目２に記載の方法。
６．項目１に記載の方法であって、さらに
ｃ）前記工程（ｂ）の後に、前記細胞と前記アグロバクテリウムとを、エレクトロポーレーションが起きる条件下に配置する工程、
を包含する方法。
７．項目６に記載の方法であって、前記ｃ）工程が、少なくとも二種類の方向で、前記細胞と前記アグロバクテリウムとに電圧パルスをかけることを含む、方法。
８．前記細胞が植物細胞である、項目１に記載の方法。
９．前記植物細胞が、植物の休眠組織の細胞である、項目８に記載の方法。
１０．前記植物の休眠組織が種子である、項目９に記載の方法。
１１．前記植物の種子が完熟種子である、項目１０に記載の方法。
１２．前記植物細胞が、単子葉植物由来である項目８に記載の方法。
１３．前記単子葉植物がイネ科植物である、項目１２に記載の方法。
１４．前記イネ科植物がコムギである、項目１３に記載の方法。
１５．前記イネ科植物がイネである、項目１３に記載の方法。
１６．前記イネ科植物がトウモロコシである、項目１３に記載の方法。
１７．前記植物細胞が、双子葉植物由来である項目８に記載の方法。
１８．前記双子葉植物がマメ科植物である、項目１７に記載の方法。
１９．前記マメ科植物がダイズである、項目１８に記載の方法。
２０．前記双子葉植物がアブラナ科植物である、項目１７に記載の方法。
２１．前記アブラナ科植物がハクサイである、項目２０の方法。
２２．前記アブラナ科植物がシロイヌナズナである、項目２０の方法。
２３．前記双子葉植物がヒルガオ科植物である、項目１７に記載の方法。
２４．前記ヒルガオ科植物がアサガオである、項目２３に記載の方法。
２５．前記双子葉植物がナス科植物である、項目１７に記載の方法。
２６．前記ナス科植物がトマトである、項目２５に記載の方法。
２７．前記双子葉植物がウリ科植物である、項目１７に記載の方法。
２８．前記ウリ科植物がウリである、項目２７に記載の方法。
２９．前記アグロバクテリウムが、Agrobacterium tumefaciensである、項目１に記載の方法。
３０．核酸を細胞内に導入した植物を作製する方法であって、以下の工程：
ａ）植物細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する工程；および
ｂ）該植物細胞を、核酸を含むアグロバクテリウムと接触させる工程
を包含する方法。
３１．項目３０に記載の方法であって、さらに
ｃ）前記工程（ｂ）の後に、前記植物細胞と前記アグロバクテリウムとを、エレクトロポーレーションが起きる条件下に配置する工程、
を包含する方法。
３２．項目３０に記載の方法であって、前記植物細胞を、分化、成長および／または増殖させる工程をさらに包含する、方法。
３３．項目３０に記載の方法であって、前記ａ）工程が、前記植物細胞を含む種子を大気圧と異なる圧力下に維持する工程を含み、かつ、前記ｂ）工程が、該植物細胞を含む該種子を、該アグロバクテリウムと接触させる工程を含む、方法。
３４．前記種子が、単子葉植物の種子である項目３３に記載の方法。
３５．前記単子葉植物の種子が完熟種子である、項目３４に記載の方法。
３６．前記単子葉植物の種子がイネ科の種子である、項目３４に記載の方法。
３７．前記イネ科種子がコムギ種子である、項目３６に記載の方法。
３８．前記イネ科種子がイネ種子である、項目３６に記載の方法。
３９．前記イネ科種子がトウモロコシ種子である、項目３６に記載の方法。
４０．前記種子が、双子葉植物の種子である項目３３に記載の方法。
４１．前記双子葉植物の種子がマメ科植物の種子である、項目４０に記載の方法。
４２．前記マメ科植物がダイズである、項目４１に記載の方法。
４３．前記双子葉植物の種子がアブラナ科植物の種子である、項目４０に記載の方法。
４４．前記アブラナ科植物がハクサイである、項目４３の方法。
４５．前記アブラナ科植物がシロイヌナズナである、項目４３の方法。
４６．前記双子葉植物の種子がヒルガオ科植物の種子である、項目４０に記載の方法。
４７．前記ヒルガオ科植物がアサガオである、項目４６に記載の方法。
４８．前記双子葉植物の種子がナス科植物の種子である、項目４０に記載の方法。
４９．前記ナス科植物がトマトである、項目４８に記載の方法。
５０．前記双子葉植物の種子がウリ科植物の種子である、項目４０に記載の方法。
５１．前記ウリ科植物がウリである、項目５０に記載の方法。
５２．項目３０〜５１のいずれか１項に記載の方法によって作製された、植物。
５３．培養変異を含まない、項目５２に記載の植物。
５４．自動化して核酸を細胞内に導入する装置であって、該装置は、以下：
ａ）核酸を含むアグロバクテリウムと細胞とを含む混合液を入れる容器；
ｂ）該ａ）の容器中に核酸を含むアグロバクテリウムを入れる手段；
ｃ）該ａ）の容器中に細胞を入れる手段；
ｄ）細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する容器であって、大気圧と異なる圧力に耐える能力を有する、容器；
ｅ）該細胞を、該ｄ）の容器中に配置する手段；
ｆ）該ｄ）の容器中を、大気圧と異なる圧力に維持する手段；および
ｇ）該ｂ）、ｃ）、ｅ）、およびｆ）の手段を自動化して実行する手段
を備え、ここで該ｂ）の手段、該ｃ）の手段、および該ｅ）の手段は、同一であるかまたは異なり、そして該ａ）の容器、および該ｄ）の容器は、同一であるかまたは異なる、装置。
５５．少なくとも２つ以上の対の電極を有する、エレクトロポーレーション用電極。
５６．少なくとも３対の電極を有する、項目５５に記載のエレクトロポーレーション用電極。Accordingly, the present invention provides the following.
1. A method for introducing a nucleic acid into a cell, comprising the following steps:
a) maintaining the cell under a pressure different from atmospheric pressure; and b) contacting the cell with Agrobacterium comprising the nucleic acid.
2. Item 2. The method according to Item 1, wherein the step of maintaining the cells under a pressure different from atmospheric pressure is a step of subjecting the cells to reduced pressure treatment.
3. Item 2. The method according to Item 1, wherein the step of maintaining the cells under a pressure different from atmospheric pressure is a step of pressurizing the cells.
4). Item 2. The method according to Item 1, wherein the step of maintaining the cell under a pressure different from atmospheric pressure is performed before the step of contacting the cell with Agrobacterium containing the nucleic acid.
5. Item 3. The method according to Item 2, wherein the depressurizing step is performed under a reduced pressure of 0.096 MPa lower than the atmospheric pressure.
6). The method according to item 1, further comprising: c) after the step (b), placing the cells and the Agrobacterium under conditions that cause electroporation;
Including the method.
7). 7. The method according to item 6, wherein the step c) includes applying voltage pulses to the cells and the Agrobacterium in at least two directions.
8). Item 2. The method according to Item 1, wherein the cell is a plant cell.
9. Item 9. The method according to Item 8, wherein the plant cell is a cell of a dormant tissue of a plant.
10. Item 10. The method according to Item 9, wherein the dormant tissue of the plant is a seed.
11. Item 11. The method according to Item 10, wherein the seed of the plant is a mature seed.
12 Item 9. The method according to Item 8, wherein the plant cell is derived from a monocotyledonous plant.
13. Item 13. The method according to Item 12, wherein the monocotyledonous plant is a gramineous plant.
14 14. The method according to item 13, wherein the gramineous plant is wheat.
15. 14. The method according to item 13, wherein the gramineous plant is rice.
16. 14. The method according to item 13, wherein the gramineous plant is corn.
17. Item 9. The method according to Item 8, wherein the plant cell is derived from a dicotyledonous plant.
18. Item 18. The method according to Item 17, wherein the dicotyledonous plant is a legume.
19. Item 19. The method according to Item 18, wherein the legume is soybean.
20. 18. A method according to item 17, wherein the dicotyledonous plant is a cruciferous plant.
21. 21. The method of item 20, wherein the cruciferous plant is Chinese cabbage.
22. 21. The method of item 20, wherein the cruciferous plant is Arabidopsis thaliana.
23. Item 18. The method according to Item 17, wherein the dicotyledonous plant is a convolvulaceae plant.
24. 24. A method according to item 23, wherein the convolvulaceae plant is morning glory.
25. Item 18. The method according to Item 17, wherein the dicotyledonous plant is a solanaceous plant.
26. 26. A method according to item 25, wherein the solanaceous plant is a tomato.
27. Item 18. The method according to Item 17, wherein the dicotyledonous plant is a Cucurbitaceae plant.
28. 28. A method according to item 27, wherein the cucurbitaceae plant is cucumber.
29. Item 2. The method according to Item 1, wherein the Agrobacterium is Agrobacterium tumefaciens.
30. A method for producing a plant into which a nucleic acid has been introduced into a cell, comprising the following steps:
a) maintaining the plant cell under a pressure different from atmospheric pressure; and b) contacting the plant cell with Agrobacterium comprising the nucleic acid.
31. The method according to item 30, further comprising: c) after the step (b), placing the plant cell and the Agrobacterium under conditions that cause electroporation;
Including the method.
32. 31. The method according to item 30, further comprising the step of differentiating, growing and / or expanding the plant cell.
33. 30. The method according to Item 30, wherein the step a) includes a step of maintaining seeds containing the plant cells under a pressure different from atmospheric pressure, and the step b) includes the plant cells. Contacting the seed with the Agrobacterium.
34. 34. A method according to item 33, wherein the seed is a monocotyledonous seed.
35. 35. A method according to item 34, wherein the monocotyledonous plant seed is a mature seed.
36. 35. The method of item 34, wherein the monocotyledonous plant seed is a grass seed.
37. 38. A method according to item 36, wherein the grass seed is wheat seed.
38. The method according to item 36, wherein the grass seed is a rice seed.
39. 38. A method according to item 36, wherein the grass seed is a corn seed.
40. 34. A method according to item 33, wherein the seed is a dicotyledonous seed.
41. 41. The method of item 40, wherein the dicotyledonous seed is a legume seed.
42. 42. A method according to item 41, wherein the legume is soybean.
43. 41. A method according to item 40, wherein the dicotyledonous seed is a cruciferous seed.
44. 44. The method of item 43, wherein the cruciferous plant is Chinese cabbage.
45. 44. The method of item 43, wherein the cruciferous plant is Arabidopsis thaliana.
46. 41. A method according to item 40, wherein the dicotyledonous seed is a convolvulaceae seed.
47. 47. A method according to item 46, wherein the convolvulaceae plant is a morning glory.
48. 41. The method of item 40, wherein the dicotyledonous seed is a solanaceous plant seed.
49. 49. A method according to item 48, wherein the solanaceous plant is a tomato.
50. 41. The method of item 40, wherein the dicotyledonous seeds are cucurbitaceae seeds.
51. 51. A method according to item 50, wherein the cucurbitaceae plant is cucumber.
52. Item 52. A plant produced by the method according to any one of items 30 to 51.
53. 53. The plant according to item 52, which does not contain a culture mutation.
54. An apparatus for automated introduction of nucleic acids into cells, the apparatus comprising:
a) a container for containing a mixture containing Agrobacterium containing nucleic acids and cells;
b) means for placing Agrobacterium containing nucleic acid in the container of a);
c) means for placing the cells in the container of a);
d) a container for maintaining the cells under a pressure different from atmospheric pressure, the container having the ability to withstand a pressure different from atmospheric pressure;
e) means for placing the cells in the container of d);
f) means for maintaining the container in d) at a pressure different from atmospheric pressure; and g) means for automating and executing the means in b), c), e), and f), wherein The means of b), the means of c), and the means of e) are the same or different, and the container of a) and the container of d) are the same or different .
55. An electroporation electrode having at least two pairs of electrodes.
56. 56. Electroporation electrode according to item 55, comprising at least three pairs of electrodes.

本発明の遺伝子導入方法によって、対象となる細胞（組織）に対して、迅速かつ高効率な間接的遺伝子導入が可能となる。   The gene transfer method of the present invention enables rapid and highly efficient indirect gene transfer to a target cell (tissue).

簡便な本発明の方法は、この分野の開発研究において重要な大量処理・大量解析を容易にせしめ、ひいては飛躍的な研究の進歩を誘発し、画期的な組換え作物の開発につながる。   The simple method of the present invention facilitates large-scale processing and large-scale analysis important in development research in this field, and as a result, induces dramatic progress in research and leads to the development of innovative recombinant crops.

図１は、Ｔ−ＤＮＡ上に有するバイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３９０−ｓＧＦＰを模式的に示した図である。FIG. 1 is a diagram schematically showing a binary vector pCAMBIA1390-sGFP possessed on T-DNA. 図２Ａは、イネについて、アグロバクテリウムによる感染処理後６日目の種子を白色光で観察した結果を示す。左は、減圧処理、アグロバクテリウム感染、およびエレクトロポーレーションを行った種子であり、右は、減圧処理のみを行った種子である。FIG. 2A shows the results of observing the seeds of rice with white light on the 6th day after infection treatment with Agrobacterium. The left is a seed that has been subjected to reduced pressure treatment, Agrobacterium infection, and electroporation, and the right is a seed that has been subjected to reduced pressure treatment only. 図２Ｂは、図２Ａで観察した種子を、励起光を照射して観察した結果を示す。ＧＦＰを発現する細胞が、緑色に明るく光っている。FIG. 2B shows the result of observing the seed observed in FIG. 2A by irradiating it with excitation light. Cells expressing GFP are brightly shining green. 図３Ａは、イネについて、アグロバクテリウムによる感染処理後８日目の種子を白色光で観察した結果を示す。左は、減圧処理、アグロバクテリウム感染、およびエレクトロポーレーションを行った種子であり、右は、減圧処理のみを行った種子である。FIG. 3A shows the result of observing the seeds of rice with white light on the 8th day after the infection treatment with Agrobacterium. The left is a seed that has been subjected to reduced pressure treatment, Agrobacterium infection, and electroporation, and the right is a seed that has been subjected to reduced pressure treatment only. 図３Ｂは、図３Ａで観察した種子を、励起光を照射して観察した結果を示す。ＧＦＰを発現する細胞が、緑色に明るく光っている。FIG. 3B shows the result of observing the seed observed in FIG. 3A by irradiating it with excitation light. Cells expressing GFP are brightly shining green. 図４Ａは、イネについて、アグロバクテリウムによる感染処理後１４日目の種子を白色光で観察した結果を示す。左は、減圧処理、アグロバクテリウム感染、およびエレクトロポーレーションを行った種子であり、右は、エレクトロポーレーションを行わずに、減圧処理後、菌液に浸したのみの種子である。FIG. 4A shows the results of observing the seeds of rice on the 14th day after infection treatment with Agrobacterium with white light. The left is a seed that has been subjected to vacuum treatment, Agrobacterium infection, and electroporation, and the right is a seed that has been soaked in a bacterial solution after vacuum treatment without performing electroporation. 図４Ｂは、図４Ａで観察した種子を、励起光を照射して観察した結果を示す。ＧＦＰを発現する細胞が、緑色に明るく光っている。FIG. 4B shows the result of observing the seed observed in FIG. 4A by irradiating excitation light. Cells expressing GFP are brightly shining green. 図５Ａは、コムギについて、アグロバクテリウムによる感染処理後８日目の種子を白色光で観察した結果を示す。左は、減圧処理、アグロバクテリウム感染、およびエレクトロポーレーションを行った種子であり、中央は、減圧処理のみを行った種子であり、右は、エレクトロポーレーションを行わずに、減圧処理後、菌液に浸したのみの種子である。FIG. 5A shows the results of observing white seeds of wheat on the 8th day after infection treatment with Agrobacterium. The left is a seed subjected to decompression treatment, Agrobacterium infection, and electroporation, the center is a seed subjected to decompression treatment only, and the right is subjected to decompression treatment without performing electroporation, The seeds are only immersed in the fungus. 図５Ｂは、図５Ａで観察した種子を、励起光を照射して観察した結果を示す。ＧＦＰを発現する細胞が、緑色に明るく光っている。FIG. 5B shows the result of observing the seed observed in FIG. 5A by irradiating excitation light. Cells expressing GFP are brightly shining green. 図６Ａは、インディカイネについて、アグロバクテリウムによる感染処理後７日目の種子を白色光で観察した結果を示す。左は、減圧処理、アグロバクテリウム感染、およびエレクトロポーレーションを行った種子であり、右は、エレクトロポーレーションを行わずに、減圧処理後、菌液に浸したのみの種子である。FIG. 6A shows the results of observing the seeds of Indica rice with white light on day 7 after the infection treatment with Agrobacterium. The left is a seed that has been subjected to vacuum treatment, Agrobacterium infection, and electroporation, and the right is a seed that has been soaked in a bacterial solution after vacuum treatment without performing electroporation. 図６Ｂは、図６Ａで観察した種子を、励起光を照射して観察した結果を示す。ＧＦＰを発現する細胞が、緑色に明るく光っている。FIG. 6B shows the result of observing the seed observed in FIG. 6A by irradiating it with excitation light. Cells expressing GFP are brightly shining green. 図７Ａは、ハクサイについて、アグロバクテリウムによる感染処理後４日目の種子を白色光で観察した結果を示す。左は、減圧処理、アグロバクテリウム感染、およびエレクトロポーレーションを行った種子であり、右は、エレクトロポーレーションを行わずに、減圧処理後、菌液に浸したのみの種子である。FIG. 7A shows the results of observing seeds of Chinese cabbage with white light on the 4th day after infection treatment with Agrobacterium. The left is a seed that has been subjected to vacuum treatment, Agrobacterium infection, and electroporation, and the right is a seed that has been soaked in a bacterial solution after vacuum treatment without performing electroporation. 図７Ｂは、図７Ａで観察した種子を、励起光を照射して観察した結果を示す。ＧＦＰを発現する細胞が、緑色に明るく光っている。FIG. 7B shows the result of observing the seed observed in FIG. 7A by irradiating it with excitation light. Cells expressing GFP are brightly shining green. 図８Ａは、ダイズについて、アグロバクテリウムによる感染処理後４日目の種子を白色光で観察した結果を示す。左は、減圧処理、アグロバクテリウム感染、およびエレクトロポーレーションを行った種子であり、右は、エレクトロポーレーションを行わずに、減圧処理後、菌液に浸したのみの種子である。FIG. 8A shows the result of observing the seeds of soybean on the fourth day after infection treatment with Agrobacterium with white light. The left is a seed that has been subjected to vacuum treatment, Agrobacterium infection, and electroporation, and the right is a seed that has been soaked in a bacterial solution after vacuum treatment without performing electroporation. 図８Ｂは、図８Ａで観察した種子を、励起光を照射して観察した結果を示す。ＧＦＰを発現する細胞が、緑色に明るく光っている。FIG. 8B shows the results of observing the seeds observed in FIG. 8A by irradiating them with excitation light. Cells expressing GFP are brightly shining green. 図９Ａは、トマトについて、アグロバクテリウムによる感染処理後４日目の種子を白色光で観察した結果を示す。左は、減圧処理、アグロバクテリウム感染、およびエレクトロポーレーションを行った種子であり、右は、エレクトロポーレーションを行わずに、減圧処理後、菌液に浸したのみの種子である。FIG. 9A shows the results of observing seeds of tomatoes with white light on the 4th day after infection treatment with Agrobacterium. The left is a seed that has been subjected to vacuum treatment, Agrobacterium infection, and electroporation, and the right is a seed that has been soaked in a bacterial solution after vacuum treatment without performing electroporation. 図９Ｂは、図９Ａで観察した種子を、励起光を照射して観察した結果を示す。ＧＦＰを発現する細胞が、緑色に明るく光っている。FIG. 9B shows the result of observing the seed observed in FIG. 9A by irradiating it with excitation light. Cells expressing GFP are brightly shining green. 図１０Ａは、アサガオについて、アグロバクテリウムによる感染処理後４日目の種子を白色光で観察した結果を示す。左は、減圧処理、アグロバクテリウム感染、およびエレクトロポーレーションを行った種子であり、右は、エレクトロポーレーションを行わずに、減圧処理後、菌液に浸したのみの種子である。FIG. 10A shows the result of observation of seeds of morning glory with white light on the 4th day after infection treatment with Agrobacterium. The left is a seed that has been subjected to vacuum treatment, Agrobacterium infection, and electroporation, and the right is a seed that has been soaked in a bacterial solution after vacuum treatment without performing electroporation. 図１０Ｂは、図１０Ａで観察した種子を、励起光を照射して観察した結果を示す。ＧＦＰを発現する細胞が、緑色に明るく光っている。FIG. 10B shows the result of observing the seed observed in FIG. 10A by irradiating it with excitation light. Cells expressing GFP are brightly shining green. 図１１は、六角形の横断面を有するエレクトロポーレーションチャンバーの斜視図である。FIG. 11 is a perspective view of an electroporation chamber having a hexagonal cross section. 図１２は、図１１に示したエレクトロポーレーションチャンバーのＸ線に沿った断面図である。FIG. 12 is a cross-sectional view along the X-ray of the electroporation chamber shown in FIG. 図１３は、試験管に挿入するタイプのエレクトロポーレーション電極の斜視図である。FIG. 13 is a perspective view of an electroporation electrode of the type inserted into a test tube. 図１４は、図１３に示したエレクトロポーレーション電極を、試験管に挿入した様子を示す図である。FIG. 14 is a diagram illustrating a state where the electroporation electrode illustrated in FIG. 13 is inserted into a test tube.

配列番号１：ＮＰＴ ＩＩ遺伝子を検出するための正方向プライマー。
配列番号２：ＮＰＴ ＩＩ遺伝子を検出するための逆方向プライマー。
配列番号３：ＮＰＴ ＩＩ遺伝子を検出するための正方向プライマー。
配列番号４：ＮＰＴ ＩＩ遺伝子を検出するための逆方向プライマー。SEQ ID NO: 1: Forward primer for detecting NPT II gene.
SEQ ID NO: 2: Reverse primer for detecting the NPT II gene.
SEQ ID NO: 3: Forward primer for detecting the NPT II gene.
SEQ ID NO: 4: Reverse primer for detecting the NPT II gene.

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。   The present invention will be described below. Throughout this specification, it should be understood that the singular forms also include the plural concept unless specifically stated otherwise. In addition, it is to be understood that the terms used in the present specification are used in the meaning normally used in the art unless otherwise specified.

以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。   Listed below are definitions of terms particularly used in the present specification.

本明細書において、用語「核酸導入」とは、人為的に核酸を細胞内または組織内に導入することを意味する。「核酸導入」によって核酸を導入した細胞または組織の表現型は、変化しても変化しなくても良い。本明細書において、用語「遺伝子導入」とは、遺伝形質を規定する因子である遺伝子を含む核酸を、人為的に細胞内または組織内に導入することを意味する。「遺伝子導入」によって遺伝子を含む核酸を導入した細胞または組織の表現型は、変化しても変化しなくても良い。本明細書において、用語「形質転換」とは、細胞内または組織内に、遺伝子を含む核酸を導入することによって、その細胞またはその組織の表現型に変化を生じることを意味する。ただし本明細書では、用語「核酸導入」と「遺伝子導入」と「形質転換」とが互換可能に使用される場合がある。本明細書中において、これらの用語が指す意味は、その用語が含まれる文脈から明らかである。   In this specification, the term “nucleic acid introduction” means that a nucleic acid is artificially introduced into a cell or tissue. The phenotype of the cell or tissue into which the nucleic acid has been introduced by “nucleic acid introduction” may or may not change. In this specification, the term “gene transfer” means that a nucleic acid containing a gene, which is a factor defining a genetic trait, is artificially introduced into a cell or tissue. The phenotype of a cell or tissue into which a nucleic acid containing a gene has been introduced by “gene transfer” may or may not change. As used herein, the term “transformation” means that a phenotype of a cell or tissue is changed by introducing a nucleic acid containing a gene into the cell or tissue. However, in the present specification, the terms “nucleic acid introduction”, “gene introduction”, and “transformation” may be used interchangeably. In this specification, the meaning of these terms is clear from the context in which the terms are included.

用語「核酸導入体」、「遺伝子導入体」および「形質転換体」とは、それぞれ、核酸導入、遺伝子導入、および形質転換された細胞または組織から発生する生命体の全部または一部をいう。ただし本明細書では、用語「核酸導入体」と「遺伝子導入体」と「形質転換体」とが互換可能に使用される場合がある。本明細書中において、これらの用語が指す意味は、その用語が含まれる文脈から明らかである。核酸導入体、遺伝子導入体、および形質転換体は、任意の生命体であり得、例えば、原核細胞、および真核細胞（植物細胞等を含む）または組織から発生する生命体が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。同様のことが、核酸導入体および遺伝子導入体においても当てはまる。   The terms “nucleic acid transductant”, “gene transfectant” and “transformant” refer to all or part of a living organism generated from a nucleic acid transduced, gene transduced and transformed cell or tissue, respectively. However, in the present specification, the terms “nucleic acid introduced body”, “gene introduced body”, and “transformant” may be used interchangeably. In this specification, the meaning of these terms is clear from the context in which the terms are included. The nucleic acid transductant, the gene transductant, and the transformant can be any living organism, and examples thereof include prokaryotic cells and eukaryotic cells (including plant cells and the like) or living organisms generated from tissues. A transformant is also referred to as a transformed cell, transformed tissue, transformed host, etc., depending on the subject, and encompasses all of these forms herein, but may refer to a particular form in a particular context. . The same applies to nucleic acid transducers and gene transfectants.

用語「細胞」は、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）、真菌類など）、単細胞生物（例えば、細菌（例えば、大腸菌）など）由来の細胞）でもよい。好ましくは、本発明において使用される細胞は、細胞壁を有する細胞であり、特に好ましくは、植物細胞である。   The term “cell” refers to a cell from any organism (eg, any type of multicellular organism (eg, animal (eg, vertebrate, invertebrate), plant (eg, monocotyledonous, dicotyledonous, etc.), Fungi and the like) and unicellular organisms (eg, cells derived from bacteria (eg, E. coli), etc.). Preferably, the cell used in the present invention is a cell having a cell wall, particularly preferably a plant cell.

本明細書において「組織」（ｔｉｓｓｕｅ）とは、多細胞生物において、実質的に同一の機能および／または形態をもつ細胞集団をいう。通常「組織」は、同じ起源を有するが、異なる起源を持つ細胞集団であっても、同一の機能および／または形態を有するのであれば、組織と呼ばれ得る。通常、組織は、器官の一部を構成する。植物では、構成細胞の発達段階によって***組織と永久組織とに大別され、また構成細胞の種類によって単一組織と複合組織とに分けるなど、いろいろな分類が行われている。動物の組織は，形態的、機能的または発生的根拠に基づき、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などに区別される。   As used herein, “tissue” refers to a population of cells having substantially the same function and / or morphology in a multicellular organism. A “tissue” usually has the same origin, but even cell populations with different origins can be referred to as a tissue if they have the same function and / or morphology. Usually, tissue constitutes part of an organ. Plants are roughly classified into meristems and permanent tissues according to the stage of development of the constituent cells, and are classified into single tissues and composite tissues according to the types of constituent cells. Animal tissues are classified into epithelial tissues, connective tissues, muscle tissues, nerve tissues, etc. based on morphological, functional or developmental basis.

本明細書中において、用語「組織」は、どの生物由来のどの組織（たとえば、任意の種類の多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）、真菌類など）由来の組織）でもよい。好ましくは、本発明において使用される組織は、細胞壁を含む組織であり、特に好ましくは、植物組織である。「植物組織」としては、休眠組織、生殖質、生長点、および花芽が挙げられるが、これに限定されない。好ましい休眠組織としては、完熟種子、未熟種子、冬芽、および塊茎が挙げられ、特に好ましくは完熟種子であるが、これに限定されない。   As used herein, the term “tissue” refers to any tissue from any organism (eg, any type of multicellular organism (eg, animal (eg, vertebrate, invertebrate), plant (eg, monocotyledonous plant)). Or a tissue derived from a dicotyledonous plant) or a fungus. Preferably, the tissue used in the present invention is a tissue containing a cell wall, particularly preferably a plant tissue. “Plant tissues” include, but are not limited to, dormant tissues, germplasm, growth points, and flower buds. Preferred dormant tissues include ripe seeds, immature seeds, winter buds, and tubers, particularly preferably ripe seeds, but are not limited thereto.

用語「器官」は、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物、真菌類）では器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのような器官としては、植物の場合には、根、葉、茎、および花などが挙げられ、動物の場合には、皮膚、心臓、血管、角膜、網膜、腎臓、肝臓、膵臓、腸、胎盤、臍帯、肺、脳、神経、四肢末梢などが挙げられるが、それらに限定されない。   The term “organ” refers to a structure in which a function of an individual organism is localized and operates in a specific part of the individual, and that part is morphologically independent. In general, in multicellular organisms (eg animals, plants, fungi), an organ consists of several tissues with a specific spatial arrangement, and a tissue consists of many cells. Such organs include roots, leaves, stems and flowers in the case of plants, and skin, heart, blood vessels, cornea, retina, kidney, liver, pancreas, intestine, in the case of animals. Examples include, but are not limited to, placenta, umbilical cord, lungs, brain, nerves, peripheral limbs, and the like.

本願明細書において使用する場合、用語「選抜」とは、抗生物質に対する耐性検定および／または遺伝子工学的手法（例えば、ＰＣＲ、サザンブロット法、ノーザンブロット法など）によって、核酸導入された核酸導入体を、核酸導入されていないものと区別することを意味する。特定の場合では、用語「選抜」は、形質転換植物を薬物存在下で培養および／または育成することによって、薬物耐性遺伝子によって形質転換された形質転換体を、形質転換されていない植物とを区別する工程を意味する。   As used herein, the term “selection” refers to a nucleic acid transductant introduced with a nucleic acid by an antibiotic resistance test and / or genetic engineering techniques (eg, PCR, Southern blotting, Northern blotting, etc.). Is distinguished from that into which no nucleic acid has been introduced. In certain cases, the term “selection” distinguishes transformants transformed with a drug resistance gene from untransformed plants by culturing and / or growing the transformed plant in the presence of a drug. It means the process to do.

単子葉植物の形質転換に用いられるアグロバクテリウムは、任意のアグロバクテリウム属細菌であり得、好ましくはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓである。アグロバクテリウムは、所望の組換え遺伝子を含む植物発現用ベクターで（例えば、エレクトロポレーションによって）形質転換される。形質転換されたアグロバクテリウムで種子を感染することにより、所望の組換え遺伝子を植物に導入し得る。導入された組換え遺伝子は、植物中のゲノムに組み込まれて存在する。なお、植物中のゲノムとは、核染色体のみならず、植物細胞中の各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）に含まれるゲノムを含んでいう。   The Agrobacterium used for transformation of the monocotyledonous plant can be any Agrobacterium, preferably Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium is transformed with a plant expression vector containing the desired recombinant gene (eg, by electroporation). A desired recombinant gene can be introduced into a plant by infecting seed with transformed Agrobacterium. The introduced recombinant gene is integrated in the genome of the plant. In addition, the genome in a plant includes not only a nuclear chromosome but the genome contained in various organelles (for example, a mitochondria, a chloroplast, etc.) in a plant cell.

単子葉植物に所望の組換え遺伝子を導入するために、所望の組換え遺伝子を含む適切な植物発現用ベクターが構築される。このような植物発現用ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。アグロバクテリウム形質転換法において使用するための植物発現用ベクターの構築には、例えば、ｐＢＩ系またはｐＰＺＰ系のベクターが好適に用いられるが、これらに限定されない。   In order to introduce a desired recombinant gene into a monocotyledonous plant, an appropriate plant expression vector containing the desired recombinant gene is constructed. Such a plant expression vector can be prepared using gene recombination techniques well known to those skilled in the art. For the construction of a plant expression vector for use in the Agrobacterium transformation method, for example, a pBI-type or pPZP-type vector is preferably used, but is not limited thereto.

本明細書において使用する場合、「成長調節因子」とは、多細胞の成長に影響を与える因子であって、多細胞生物（例えば、植物）の器官や細胞で合成され、体液によって他の器官や部分に運ばれる化学物質またはその誘導体であって、１つまたは数多くの器官の機能、活性および／または構造を変える作用を有する物質をいう。植物細胞に対する成長調節因子を、植物成長調節因子という。植物成長調節因子としては、植物ホルモンが挙げられるが、これに限定されない。植物ホルモンとしては、オーキシン、ジベレリン、サイトカイニン、アブシジン酸、およびエチレンが挙げられるが、これらに限定されない。オーキシンとしては、２，４−ＤおよびＩＡＡ（インドール酢酸）、ＮＡＡ（ナフタリン酢酸）、およびＩＢＡ（インドール酪酸）が挙げられるが、これに限定されない。   As used herein, a “growth regulator” is a factor that affects multicellular growth, is synthesized in an organ or cell of a multicellular organism (for example, a plant), and other organs by body fluids. A chemical substance or a derivative thereof that is delivered to the body or part thereof and has a function of changing the function, activity and / or structure of one or many organs. Growth regulators for plant cells are referred to as plant growth regulators. Plant growth regulators include, but are not limited to, plant hormones. Plant hormones include, but are not limited to, auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid, and ethylene. Auxins include, but are not limited to, 2,4-D and IAA (indole acetic acid), NAA (naphthalene acetic acid), and IBA (indole butyric acid).

本明細書において使用する場合、用語「エレクトロポーレーション」とは、直流の高電圧パルスを用いて物理的に細胞（例えば、植物細胞）に小孔をあけ、そこから核酸（例えば、遺伝子を含む核酸）を細胞内に導入する方法をいう。エレクトロポーレーションの条件は、使用する種、組織、細胞などに依存して、当業者が適宜選択し得る。代表的なエレクトロポーレーションの電圧の条件は、１０Ｖ／ｃｍ〜２００Ｖ／ｃｍ、好ましくは２０Ｖ／ｃｍ〜１５０Ｖ／ｃｍ、より好ましくは３０Ｖ／ｃｍ〜１２０Ｖ／ｃｍ、なおより好ましくは４０Ｖ／ｃｍ〜１００Ｖ／ｃｍ、最も好ましくは５０Ｖ／ｃｍ〜１００Ｖ／ｃｍであるが、これらに限定されない。代表的なエレクトロポーレーションのパルス幅の条件は、１マイクロ秒〜９０ミリ秒、好ましくは１０ミリ秒〜９０ミリ秒、より好ましくは１０ミリ秒〜９０ミリ秒、なお好ましくは２０ミリ秒〜８０ミリ秒、なおより好ましくは３０ミリ秒〜８０ミリ秒、さらになおより好ましくは４０ミリ秒〜７０ミリ秒、最も好ましくは５０ミリ秒〜６０ミリ秒であるが、これらに限定されない。また、エレクトロポーレーションのパルス幅は、１ミリ秒未満であってもよく、例えば、１０マイクロ秒〜９０マイクロ秒、２０マイクロ秒〜８０マイクロ秒、３０マイクロ秒〜８０マイクロ秒、４０マイクロ秒〜７０マイクロ秒、５０マイクロ秒〜６０マイクロ秒であるが、これらに限定されない。代表的なエレクトロポーレーションのパルスの回数は、１回〜２００回、好ましくは１０回〜１５０回、より好ましくは２０回〜１２０回、なおより好ましくは３０回〜１１０回、最も好ましくは４０回〜１００回であるが、これらに限定されない。   As used herein, the term “electroporation” is used to physically puncture a cell (eg, a plant cell) using a direct current high voltage pulse from which a nucleic acid (eg, a gene is included). (Nucleic acid) is a method of introducing into a cell. Electroporation conditions can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the species, tissue, cells, and the like used. Typical electroporation voltage conditions are 10 V / cm to 200 V / cm, preferably 20 V / cm to 150 V / cm, more preferably 30 V / cm to 120 V / cm, and even more preferably 40 V / cm to 100 V. / Cm, most preferably 50 V / cm to 100 V / cm, but is not limited thereto. Typical electroporation pulse width conditions are 1 microsecond to 90 milliseconds, preferably 10 milliseconds to 90 milliseconds, more preferably 10 milliseconds to 90 milliseconds, and even more preferably 20 milliseconds to 80 milliseconds. Milliseconds, even more preferred 30 milliseconds to 80 milliseconds, even more preferred 40 milliseconds to 70 milliseconds, and most preferred 50 milliseconds to 60 milliseconds, but not limited thereto. The pulse width of electroporation may be less than 1 millisecond, for example, 10 microseconds to 90 microseconds, 20 microseconds to 80 microseconds, 30 microseconds to 80 microseconds, 40 microseconds to 40 microseconds. Although it is 70 microseconds and 50 microseconds-60 microseconds, it is not limited to these. The number of typical electroporation pulses is 1 to 200 times, preferably 10 to 150 times, more preferably 20 to 120 times, still more preferably 30 to 110 times, most preferably 40 times. Although it is -100 times, it is not limited to these.

本明細書において使用する場合、句「細胞（または組織）と核酸とを、エレクトロポーレーションが起きる条件下に配置する」とは、細胞（または組織）と核酸とを、それらの間でエレクトロポーレーションが起きる（すなわち、細胞（または組織）への核酸導入が起こる）ために必須のすべての条件（電圧条件、パルス幅条件、パルス回数条件、細胞（または組織）と核酸との間の位置関係、エレクトロポーレーションの実行時間などを含む）を備えた状態に配置することを意味する。エレクトロポーレーションが起きるために必須の条件は、当業者に容易に明らかであり、当業者はその条件を適宜決定し得る。   As used herein, the phrase “place cell (or tissue) and nucleic acid under conditions in which electroporation occurs” means that the cell (or tissue) and nucleic acid are electroporated between them. All conditions (voltage conditions, pulse width conditions, pulse frequency conditions, positional relationship between cells (or tissues) and nucleic acids that are essential for the formation of nucleic acids (ie, introduction of nucleic acids into cells (or tissues)) , Including the execution time of electroporation). Conditions essential for electroporation to occur will be readily apparent to those skilled in the art, and those skilled in the art can appropriately determine the conditions.

さらに、本発明に従ってエレクトロポーレーションを行う際に、細胞（または組織）と核酸とに、少なくとも二種類の方向で電圧パルスをかけることが好ましい。最も簡単には、細胞（または組織）と核酸とに一定時間電圧パルスをかけた後で、その電圧パルス処理に使用した電極のアノードとカソードとを逆にして電圧パルスをかけ直すことによって、これは達成され得る。さらにこれは、エレクトロポーレーションチャンバー内で別の位置に配置された電極対を使用しても達成され得る。このようにして少なくとも二種類の方向で電圧パルスをかけることによって、核酸導入効率が顕著に高まる。   Furthermore, when performing electroporation according to the present invention, it is preferable to apply voltage pulses to cells (or tissues) and nucleic acids in at least two directions. The simplest is to apply a voltage pulse to a cell (or tissue) and nucleic acid for a certain period of time, and then reverse the voltage pulse by reversing the anode and cathode of the electrode used for the voltage pulse treatment. Can be achieved. This can also be accomplished using electrode pairs located at different locations within the electroporation chamber. By applying voltage pulses in at least two directions in this way, the nucleic acid introduction efficiency is significantly increased.

本発明においてエレクトロポーレーションを行う際に使用されるエレクトロポーレーションチャンバーは、核酸導入の対象となる細胞および／または組織を収容できるものであれば、どのような大きさであってもよい。特に好ましくは、エレクトロポーレーションチャンバーは、植物組織（例えば、植物種子）を収容し得る大きさを有する。本発明のエレクトロポーレーションチャンバーは、任意の形状であり得る。この形状としては、立方体、直方体、円筒形、チューブ形（例えば、胴体が均一であるかまたは均一でない横断面を有し、かつ底が先細りしてもしなていなくてもよい形状）などが挙げられるが、これらに限定されない。植物種子を収容し得る大きさであるために、本発明のエレクトロポーレーションチャンバーの内面の少なくとも３点に接する最大の内接円の直径は、例えば、以下の長さであり得る：少なくとも約５ｍｍであるかまたは約５ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約６ｍｍであるかまたは約６ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約７ｍｍであるかまたは約７ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約８ｍｍであるかまたは約８ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約９ｍｍであるかまたは約９ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約１ｃｍであるかまたは約１ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約２ｃｍであるかまたは約２ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約３ｃｍであるかまたは約３ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約４ｃｍであるかまたは約４ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約５ｃｍであるかまたは約５ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約６ｃｍであるかまたは約６ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約７ｃｍであるかまたは約７ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約８ｃｍであるかまたは約８ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約９ｃｍであるかまたは約９ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約１０ｃｍであるかまたは約１０ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約１５ｃｍであるかまたは約１５ｃｍよりも長い、そして好ましくは、少なくとも約２０ｃｍであるかまたは約２０ｃｍよりも長い。本発明のエレクトロポーレーションチャンバーの内面の少なくとも３点に接する最大の内接円の直径の上限は、例えば、以下であり得るが、これらに限定されない：約２５ｃｍ、約２０ｃｍ、約１５ｃｍ、約１０ｃｍ、約９ｃｍ、約８ｃｍ、約７ｃｍ、約６ｃｍ、約５ｃｍ、約４ｃｍ、約３ｃｍ、約２ｃｍ、約１ｃｍ、約９ｍｍ、約８ｍｍ、約７ｍｍ、または約６ｍｍ。当然ながら、この長さは、上記に明示した数値の間の長さ（例えば、１．５ｃｍなど）であり得る。本明細書中において「内接円」とは、チャンバー容器の内面上における少なくとも３つの任意の点に接するように描かれる任意の円を指す。ここで、チャンバー内に配置された電極も容器の一部とみなされ、従って、チャンバー容器の内面は、電極表面も含む。ただし、代表的に、使用される電極の厚みは、無視できるほど非常に薄い（例えば、０．１ｍｍなど）。   The electroporation chamber used for electroporation in the present invention may have any size as long as it can accommodate cells and / or tissues to which nucleic acid is introduced. Particularly preferably, the electroporation chamber is sized to accommodate plant tissue (eg, plant seeds). The electroporation chamber of the present invention can be of any shape. Examples of the shape include a cube, a rectangular parallelepiped, a cylinder, and a tube (for example, a shape having a uniform or non-uniform cross section of the body and a bottom that may or may not be tapered). However, it is not limited to these. In order to be able to accommodate plant seeds, the diameter of the largest inscribed circle that touches at least three points on the inner surface of the electroporation chamber of the present invention can be, for example, the following length: at least about 5 mm Or longer than about 5 mm, preferably at least about 6 mm or longer than about 6 mm, preferably at least about 7 mm or longer than about 7 mm, preferably at least about 8 mm. Or longer than about 8 mm, preferably at least about 9 mm or longer than about 9 mm, preferably at least about 1 cm or longer than about 1 cm, preferably at least about 2 cm, or Longer than about 2 cm, preferably at least about 3 cm or longer than about 3 cm. Or at least about 4 cm or longer than about 4 cm, preferably at least about 5 cm or longer than about 5 cm, preferably at least about 6 cm or longer than about 6 cm, preferably At least about 7 cm or longer than about 7 cm, preferably at least about 8 cm or longer than about 8 cm, preferably at least about 9 cm or longer than about 9 cm, preferably at least It is about 10 cm or longer than about 10 cm, preferably at least about 15 cm or longer than about 15 cm, and preferably at least about 20 cm or longer than about 20 cm. The upper limit of the diameter of the largest inscribed circle that contacts at least three points on the inner surface of the electroporation chamber of the present invention can be, for example, but is not limited to: about 25 cm, about 20 cm, about 15 cm, about 10 cm About 9 cm, about 8 cm, about 7 cm, about 6 cm, about 5 cm, about 4 cm, about 3 cm, about 2 cm, about 1 cm, about 9 mm, about 8 mm, about 7 mm, or about 6 mm. Of course, this length can be a length between the values specified above (eg, 1.5 cm, etc.). In the present specification, the “inscribed circle” refers to an arbitrary circle drawn so as to touch at least three arbitrary points on the inner surface of the chamber container. Here, the electrode disposed in the chamber is also regarded as a part of the container, and therefore the inner surface of the chamber container also includes the electrode surface. However, typically, the thickness of the electrode used is negligibly thin (for example, 0.1 mm).

一つの局面において、本発明のエレクトロポーレーションチャンバーは、四角形の横断面を有し、かつ内寸（例えば、縦×横×高さ）が、１ｃｍ×２ｃｍ×２ｃｍである。別の局面では、本発明のエレクトロポーレーションチャンバーは、円形の横断面を有し、かつ内寸（例えば、直径×高さ）が、１ｃｍ×４ｃｍである。   In one aspect, the electroporation chamber of the present invention has a rectangular cross section and has an internal dimension (eg, length × width × height) of 1 cm × 2 cm × 2 cm. In another aspect, the electroporation chamber of the present invention has a circular cross section and has an internal dimension (eg, diameter x height) of 1 cm x 4 cm.

さらなる局面において、本発明のエレクトロポーレーションチャンバーは、六角形の横断面を有する。例えば、図１１および図１２に示すように、六角形の横断面を有するエレクトロポーレーションチャンバー１は、上面が開口する有底の筒体１８と、その筒体１８の各内面に備えられた電極１１〜１６とを有する。電極１１〜１６には、エレクトロポーレーションによる高電圧パルスをかけるためのコード（示さず）が電気的に連結する。筒体１８は、底部１７を有し、その内部に試料を導入して、エレクトロポーレーションを行う。好ましい実施形態において、このエレクトロポーレーションチャンバーの電極は、各々が１０ｍｍ×１５ｍｍの大きさを有するが、これに限定されない。なお別の局面において、本発明のエレクトロポーレーションチャンバーは、ｎ角形（ｎ＝整数）の横断面を有する。ここで、電極の占める領域は、チャンバーの内寸から除かれる。ただし上記の通り、代表的に、使用される電極の厚みは、無視できるほど非常に薄い。本明細書中において横断面とは、チャンバーの長軸方向に直交する断面をいう。本明細書中において内寸とは、チャンバー容器内面上の任意の２点を結ぶ長さを指し、特に、四角形の横断面を有するチャンバーの場合には、その横断面の縦および横、ならびに高さを指し、そして円形の横断面を有するチャンバーの場合には、その横断面の直径、および高さを指す。   In a further aspect, the electroporation chamber of the present invention has a hexagonal cross section. For example, as shown in FIGS. 11 and 12, the electroporation chamber 1 having a hexagonal cross section includes a bottomed cylinder 18 having an open top surface and electrodes provided on the inner surfaces of the cylinder 18. 11-16. A cord (not shown) for applying a high voltage pulse by electroporation is electrically connected to the electrodes 11-16. The cylindrical body 18 has a bottom portion 17 and introduces a sample therein to perform electroporation. In a preferred embodiment, the electrodes of the electroporation chamber each have a size of 10 mm x 15 mm, but are not limited thereto. In yet another aspect, the electroporation chamber of the present invention has an n-gonal (n = integer) cross section. Here, the area occupied by the electrode is excluded from the internal dimensions of the chamber. However, as described above, typically, the thickness of the electrode used is very thin enough to be ignored. In this specification, the transverse section refers to a section perpendicular to the major axis direction of the chamber. In the present specification, the internal dimension refers to the length connecting any two points on the inner surface of the chamber container. In particular, in the case of a chamber having a rectangular cross section, the length and width of the cross section, and the height And in the case of a chamber having a circular cross section, it refers to the diameter and height of the cross section.

一つの実施形態では、本発明のエレクトロポーレーションチャンバーは、植物種子を収容し得る大きさに変動可能である。大きさの変動は、任意の手段によって達成され得る。例えば、ネジなどを利用して適切な大きさに調整され得る。   In one embodiment, the electroporation chamber of the present invention can vary in size to accommodate plant seeds. The size variation can be achieved by any means. For example, it can be adjusted to an appropriate size using a screw or the like.

本発明のエレクトロポーレーションチャンバーは、任意の材料から作製され得る。エレクトロポーレーションチャンバーの材料としては、固体を形成し得る任意の材料が使用され得る。例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）などが挙げられるがそれらに限定されない。チャンバーは、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、酸化珪素、炭化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用することができる。ポリアミド、ポリカーボネート、（変性）ポリフェニレンオキサイド、ポリブチレンテレフタレート、強化ポリエチレンテレフタレート、ポリエーテルスルホン、ポリフェニレンスルフィド、ポリアリレート、ポリエーテルイミド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリスルホンなどの有機材料なども使用され得る。好ましくは、本発明のエレクトロポーレーションチャンバーは、大気圧と異なる圧力に耐える能力（例えば、大気圧と異なる圧力にさらされても、破壊、亀裂および変形しない能力）を有し、特に好ましくは、減圧処理に耐える能力を有する。特に好ましくは、本発明のエレクトロポーレーションチャンバーは、ポリプロピレン、シリコーン樹脂、およびガラスから作製され、そして白金製またはステンレス製の電極を備える。   The electroporation chamber of the present invention can be made from any material. As the material of the electroporation chamber, any material capable of forming a solid can be used. Examples include, but are not limited to, glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastics, metals (including alloys), natural and synthetic polymers (eg, polystyrene, cellulose, chitosan, dextran, and nylon). Not. The chamber may be formed from a plurality of layers of different materials. For example, an inorganic insulating material such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon oxide, silicon carbide, or silicon nitride can be used. Polyamide, polycarbonate, (modified) polyphenylene oxide, polybutylene terephthalate, reinforced polyethylene terephthalate, polyethersulfone, polyphenylene sulfide, polyarylate, polyetherimide, polyetheretherketone, polyimide, polyester, polyethylene, polypropylene, polyisobutylene, unsaturated Polyester, fluorinated resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylic resin, polyacrylonitrile, polystyrene, acetal resin, phenol resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene / acrylonitrile Copolymer, acrylonitrile butadiene styrene copolymer, silicone resin, polysulfur And organic materials such emissions may also be used. Preferably, the electroporation chamber of the present invention has the ability to withstand pressures different from atmospheric pressure (eg, the ability to not break, crack and deform when exposed to pressures different from atmospheric pressure), particularly preferably Ability to withstand decompression. Particularly preferably, the electroporation chamber of the present invention is made of polypropylene, silicone resin, and glass and comprises an electrode made of platinum or stainless steel.

好ましくは、本発明のエレクトロポーレーションチャンバーは、温度制御手段を備える。温度制御手段は、例えば、センサーなどで温度変化を感知し、手動または自動で、チャンバーの温度を制御し得る。温度制御手段は、代表的に、チャンバーの温度を冷却するように作用する冷却手段である。冷却手段は任意の手段であり得、例えば、氷、冷却ゲルなどを利用した手段であり得る。   Preferably, the electroporation chamber of the present invention comprises temperature control means. The temperature control means senses a temperature change with a sensor or the like, and can control the temperature of the chamber manually or automatically. The temperature control means is typically a cooling means that acts to cool the temperature of the chamber. The cooling means may be any means, for example, means utilizing ice, cooling gel or the like.

本発明のエレクトロポーレーションチャンバーには、少なくとも一対（二個）の電極が備えられる。従って、特定の実施形態では、本発明のチャンバーは、一対（二個）より多い電極（例えば、二対（四個）の電極、三対（六個）の電極、四対（八個）の電極、五対（十個）の電極、またはより多い対の電極）を備え得る。例えば、四角形の横断面を有するチャンバーにおいて、向かい合う内面に沿って電極を配置すると、二対（四個）の電極を取り付けることが可能である。さらなる例として、六角形の横断面を有するチャンバーにおいて、向かい合う内面に沿って電極を配置すると、三対（六個）の電極を取り付けることが可能である。このように、本発明のチャンバー内に配置される電極対は、任意の数であり得、そして任意の空間的位置関係をとり得る。一対（二個）より多い電極を用いる場合、各対をなす電極に同時に電圧を印加しても、各対をなす電極に順番に電圧を印加してもよい。各対をなす電極に十番に電圧を印加する場合、印加する電圧を順次切り替える装置は、市販されており。例えば、ネッパジーン株式会社（日本国千葉県市川市）のＣＵ９０１を用いることが可能である。例えば、一対（二個）より多い電極に順次電圧を印加する場合、電圧を切り替える間隔としては、１２０秒から１ミリ秒、好ましくは６０秒から１０ミリ秒、より好ましくは３０秒から１００ミリ秒、なお好ましくは１０秒から５００ミリ秒、なおより好ましくは５秒から７５０ミリ秒、さらになおより好ましくは３秒から８００ミリ秒、最も好ましくは１．１秒から９００ミリ秒であるが、これらに限定されない。   The electroporation chamber of the present invention includes at least a pair (two) of electrodes. Thus, in certain embodiments, the chamber of the present invention comprises more than one (two) electrodes (eg, two (four) electrodes, three (six) electrodes, four (eight) electrodes, Electrode, five pairs (ten), or more pairs of electrodes). For example, in a chamber having a rectangular cross section, two electrodes (four electrodes) can be attached by arranging electrodes along the inner surfaces facing each other. As a further example, in a chamber having a hexagonal cross-section, it is possible to attach three pairs (six) of electrodes by placing the electrodes along the opposing inner surfaces. Thus, the number of electrode pairs arranged in the chamber of the present invention can be any number and can take any spatial positional relationship. When using more than a pair (two) of electrodes, a voltage may be applied simultaneously to each pair of electrodes, or a voltage may be applied sequentially to each pair of electrodes. In the case where a voltage is applied to the electrodes of each pair, the device for sequentially switching the applied voltage is commercially available. For example, it is possible to use CU901 of Neppagene Corporation (Ichikawa City, Chiba Prefecture, Japan). For example, when a voltage is sequentially applied to more than a pair (two) of electrodes, the voltage switching interval is 120 seconds to 1 millisecond, preferably 60 seconds to 10 milliseconds, more preferably 30 seconds to 100 milliseconds. More preferably 10 to 500 milliseconds, even more preferably 5 to 750 milliseconds, still more preferably 3 to 800 milliseconds, most preferably 1.1 to 900 milliseconds, It is not limited to.

本発明のエレクトロポーレーションチャンバー内に配置される電極の間の距離は任意の距離であり得、核酸導入の対象となる細胞および／または組織の大きさに応じて変動し得る。特に好ましくは、電極間の距離は、植物組織（例えば、植物種子）を収容し得る距離である。植物種子を収容し得る距離であるために、電極間の距離は、例えば、以下の長さであり得る：少なくとも約５ｍｍであるかまたは約５ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約６ｍｍであるかまたは約６ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約７ｍｍであるかまたは約７ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約８ｍｍであるかまたは約８ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約９ｍｍであるかまたは約９ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約１ｃｍであるかまたは約１ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約２ｃｍであるかまたは約２ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約３ｃｍであるかまたは約３ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約４ｃｍであるかまたは約４ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約５ｃｍであるかまたは約５ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約６ｃｍであるかまたは約６ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約７ｃｍであるかまたは約７ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約８ｃｍであるかまたは約８ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約９ｃｍであるかまたは約９ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約１０ｃｍであるかまたは約１０ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約１５ｃｍであるかまたは約１５ｃｍよりも長い、そして好ましくは、少なくとも約２０ｃｍであるかまたは約２０ｃｍよりも長い。電極間の距離の上限は、例えば、以下であり得るが、これらに限定されない：約２５ｃｍ、約２０ｃｍ、約１５ｃｍ、約１０ｃｍ、約９ｃｍ、約８ｃｍ、約７ｃｍ、約６ｃｍ、約５ｃｍ、約４ｃｍ、約３ｃｍ、約２ｃｍ、約１ｃｍ、約９ｍｍ、約８ｍｍ、約７ｍｍ、または約６ｍｍ。当然ながら、電極間の距離は、上記に明示した数値の間の長さ（例えば、１．５ｃｍなど）であり得る。   The distance between the electrodes disposed in the electroporation chamber of the present invention can be any distance, and can vary depending on the size of the cells and / or tissues to which the nucleic acid is to be introduced. Particularly preferably, the distance between the electrodes is a distance capable of accommodating a plant tissue (for example, a plant seed). In order to be able to accommodate plant seeds, the distance between the electrodes can be, for example, the following length: at least about 5 mm or longer than about 5 mm, preferably at least about 6 mm Or longer than about 6 mm, preferably at least about 7 mm or longer than about 7 mm, preferably at least about 8 mm or longer than about 8 mm, preferably at least about 9 mm or about More than 9 mm, preferably at least about 1 cm or longer than about 1 cm, preferably at least about 2 cm or longer than about 2 cm, preferably at least about 3 cm or more than about 3 cm Longer, preferably at least about 4 cm or longer than about 4 cm, preferably less Is also about 5 cm or longer than about 5 cm, preferably at least about 6 cm or longer than about 6 cm, preferably at least about 7 cm or longer than about 7 cm, preferably at least about 8 cm or longer than about 8 cm, preferably at least about 9 cm or longer than about 9 cm, preferably at least about 10 cm or longer than about 10 cm, preferably at least about 15 cm Or longer than about 15 cm, and preferably at least about 20 cm or longer than about 20 cm. The upper limit of the distance between the electrodes can be, for example, but is not limited to: about 25 cm, about 20 cm, about 15 cm, about 10 cm, about 9 cm, about 8 cm, about 7 cm, about 6 cm, about 5 cm, about 4 cm , About 3 cm, about 2 cm, about 1 cm, about 9 mm, about 8 mm, about 7 mm, or about 6 mm. Of course, the distance between the electrodes can be a length between the values specified above (eg, 1.5 cm, etc.).

一つの実施形態では、電極間の距離は、対になった電極間の距離が植物種子を収容し得る距離となるように変動可能である。電極間の距離の変動は、任意の手段によって達成され得る。例えば、ネジなどを利用して適切な距離に調整され得る。   In one embodiment, the distance between the electrodes can be varied such that the distance between the pair of electrodes is a distance that can accommodate a plant seed. Variation in the distance between the electrodes can be achieved by any means. For example, it can be adjusted to an appropriate distance using a screw or the like.

電極は、電流を流し得るという性質を有する限りにおいて任意の材料から作製され得る。電極の材料としては、例えば、白金、金、ステンレス、炭素、導電性ポリマーなどが挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましくは、電極は白金電極である。   The electrode can be made of any material as long as it has the property of allowing current to flow. Examples of the material for the electrode include, but are not limited to, platinum, gold, stainless steel, carbon, conductive polymer, and the like. Particularly preferably, the electrode is a platinum electrode.

例示的なエレクトロポーレーションチャンバーは、白金電極を備える縦１ｃｍ×横２ｃｍ×高さ２ｃｍの直方形チャンバーであり、その白金電極間の距離は、約１ｃｍである。このエレクトロポーレーションチャンバーは、中程度の大きさ（約５〜１５ｍｍ程度）の植物種子（例えば、コムギ、イネ、トウモロコシなど）を処理する際に特に有用である。このチャンバーを使用することにより、中程度の大きさの植物種子を大量にまとめて（例えば、約１０〜３０粒）処理することが可能である。   An exemplary electroporation chamber is a 1 cm long, 2 cm wide, 2 cm high rectangular chamber with platinum electrodes, and the distance between the platinum electrodes is about 1 cm. This electroporation chamber is particularly useful when treating medium-sized (about 5-15 mm) plant seeds (eg, wheat, rice, corn, etc.). By using this chamber, it is possible to process a large amount of medium-sized plant seeds (for example, about 10 to 30 grains).

他の例示的なエレクトロポーレーションチャンバーは、ステンレス電極を備える内径１ｃｍ×高さ４ｃｍのマイクロチューブ型チャンバーであり、ステンレス電極間の距離は、約１ｃｍである。このマイクロチューブ型チャンバーは、市販のマイクロチューブの内面に、ステンレス箔（例えば、約５×４０ｍｍ（厚さ約０．１ｍｍ））を接着剤などで貼り付けることによって、容易に作製され得る。このマイクロチューブ型チャンバーは、遠心分離にかけて、細胞、組織および／または種子を底に沈殿させることができるため、溶液の交換を簡単にする。このため、このマイクロチューブ型チャンバーは、微小な（約０．１〜５ｍｍ程度の）植物種子（例えば、シロイヌナズナなど）を処理する際に特に有用である。このチャンバーを使用することにより、微小な大きさの植物種子を大量にまとめて処理することが可能である。   Another exemplary electroporation chamber is a 1 cm internal diameter x 4 cm high microtube chamber with stainless steel electrodes, and the distance between the stainless steel electrodes is about 1 cm. This microtube type chamber can be easily manufactured by attaching a stainless steel foil (for example, about 5 × 40 mm (thickness: about 0.1 mm)) to the inner surface of a commercially available microtube with an adhesive or the like. This microtube chamber simplifies solution exchange because it can be centrifuged to precipitate cells, tissues and / or seeds at the bottom. For this reason, this microtube-type chamber is particularly useful when processing minute (about 0.1 to 5 mm) plant seeds (for example, Arabidopsis thaliana). By using this chamber, it is possible to process a large amount of minute-sized plant seeds.

本発明の別の局面において、エレクトロポーレーション電極は、例えば、図１３に示すように、試験管に挿入するタイプの電極であってもよい。図１３〜１４に示すエレクトロポーレーション電極２は、一対の平板状電極２１および２２、ならびに、キャップ２３および電気コード２４を備える。図１４に示すように、エレクトロポーレーション電極２の平板状電極２１および２２は、試験管２５に挿入して用いる。必要に応じて、キャップ２３または試験管２５に通気口を設けて、試験管内の圧力を、加圧、減圧してもよい。試験管２５内に試料を入れて、エレクトロポーレーション電極２によって、エレクトロポーレーションを行う。   In another aspect of the present invention, the electroporation electrode may be, for example, an electrode that is inserted into a test tube as shown in FIG. The electroporation electrode 2 shown in FIGS. 13 to 14 includes a pair of flat electrodes 21 and 22, a cap 23 and an electric cord 24. As shown in FIG. 14, the plate-like electrodes 21 and 22 of the electroporation electrode 2 are inserted into a test tube 25 and used. If necessary, a vent may be provided in the cap 23 or the test tube 25 to increase or decrease the pressure in the test tube. A sample is put in the test tube 25 and electroporation is performed by the electroporation electrode 2.

本願明細書において使用する場合、細胞／組織（植物組織を含む）を、「大気圧と異なる圧力下に維持する」とは、細胞／組織（植物組織を含む）を、大気圧（通常は、１気圧＝１０１．３２５ｋＰａ＝約０．１ＭＰａ）よりも高い圧力下に維持する工程（加圧処理）、または低い圧力下に維持する工程（減圧処理）をいう。   As used herein, “maintaining a cell / tissue (including plant tissue) under a pressure different from atmospheric pressure” means that the cell / tissue (including plant tissue) is at atmospheric pressure (usually, 1 atm = 101.325 kPa = about 0.1 MPa) A step of maintaining a pressure higher than (pressure treatment) or a step of maintaining a lower pressure (decompression treatment).

理論に拘束されることを意図しないが、細胞／組織（植物組織を含む）を大気圧と異なる圧力下に維持することによって、細胞／組織が受ける環境中の圧力が変化し、ＤＮＡなどの核酸を含む緩衝液が組織間・細胞間に浸透しやすくなり、その結果、従来不可能であった細胞壁を有する細胞および組織（特に、植物細胞および植物組織）を標的とするエレクトロポーレーションによる核酸導入／形質転換が可能になったものと考えられる。   Although not intending to be bound by theory, by maintaining cells / tissues (including plant tissues) under a pressure different from atmospheric pressure, the pressure in the environment received by the cells / tissues changes, and nucleic acids such as DNA Nucleic acid introduction by electroporation targeting cells and tissues (especially plant cells and plant tissues) having cell walls that have been impossible in the past. / It is considered that transformation has become possible.

本明細書において使用する場合、用語「減圧処理」とは、核酸導入／形質転換される細胞／組織（植物組織（例えば、種子）を含む）を大気圧より低い気圧下に維持する処理をいう。本発明において、減圧処理は、大気圧よりも、０．０２ＭＰａ低い圧力、好ましくは０．０４ＭＰａ低い圧力、より好ましくは０．０６ＭＰａ低い圧力、さらにより好ましくは０．０８ＭＰａ低い圧力、最も好ましくは０．０９６ＭＰａ低い圧力で行われるが、これらに限定されない。減圧処理の時間は、１分〜１２０分、好ましくは１０分〜１００分、より好ましくは１５分〜９０分、さらにより好ましくは３０分〜７０分、最も好ましくは約６０分であるが、これらに限定されない。   As used herein, the term “reduced pressure treatment” refers to a treatment that maintains cells / tissues (including plant tissues (eg, seeds)) into which nucleic acid is introduced / transformed, at a pressure lower than atmospheric pressure. . In the present invention, the pressure reduction treatment is a pressure 0.02 MPa lower than the atmospheric pressure, preferably 0.04 MPa lower pressure, more preferably 0.06 MPa lower pressure, even more preferably 0.08 MPa lower pressure, most preferably 0. Although it is performed at a pressure as low as 0.096 MPa, it is not limited thereto. The time of the decompression treatment is 1 minute to 120 minutes, preferably 10 minutes to 100 minutes, more preferably 15 minutes to 90 minutes, even more preferably 30 minutes to 70 minutes, and most preferably about 60 minutes. It is not limited to.

本明細書において使用する場合、用語「加圧処理」とは、核酸導入／形質転換される細胞／組織（植物組織（例えば、種子）を含む）を大気圧より高い気圧下に維持する処理をいう。   As used herein, the term “pressure treatment” refers to a treatment that maintains cells / tissues (including plant tissues (eg, seeds)) to be introduced / transformed at a pressure higher than atmospheric pressure. Say.

一つの局面において、本発明は、エレクトロポーレーション装置に関する。本発明のエレクトロポーレーション装置は、顕著に高い効率で任意の細胞または組織に対して核酸導入し得、そして特に、これまでエレクトロポーレーションによる核酸導入が不可能であった、細胞壁を有する細胞または組織（例えば、植物細胞または植物組織）に核酸導入するために有用である。一つの実施形態では、本発明のエレクトロポーレーション装置は、ａ）細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する手段、および、ｂ）エレクトロポーレーション手段の両方の手段を備える。   In one aspect, the present invention relates to an electroporation apparatus. The electroporation apparatus of the present invention can introduce nucleic acid into any cell or tissue with remarkably high efficiency, and in particular, a cell having a cell wall or Useful for introducing nucleic acids into tissues (eg, plant cells or plant tissues). In one embodiment, the electroporation device of the present invention comprises both a) means for maintaining cells under a pressure different from atmospheric pressure, and b) electroporation means.

細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する手段としては、減圧および／または加圧する能力を有する任意の手段が利用され得る。市販の減圧装置（例えば、真空デシケーターなど）および／または加圧装置もまた利用され得る。エレクトロポーレーション手段としては、任意のエレクトロポーレーション手段が利用され得る。市販のエレクトロポーレーション手段（例えば、ＣＵＹ２１ＥＤＩＴ遺伝子導入装置、ネッパジーン社、日本国千葉県市川市）もまた利用され得る。好ましくは、上記のエレクトロポーレーション手段に配置される２つの電極（第一電極および第二電極）の間の距離は、上記で定義付けられたような、植物種子を収容し得る距離にある。   As a means for maintaining the cells under a pressure different from the atmospheric pressure, any means having the ability to reduce pressure and / or pressurize can be used. Commercially available decompression devices (eg, vacuum desiccators, etc.) and / or pressurization devices can also be utilized. Any electroporation means can be used as the electroporation means. Commercially available electroporation means (eg, CUY21 EDIT gene transfer device, Neppagene, Ichikawa City, Chiba, Japan) can also be used. Preferably, the distance between the two electrodes (first electrode and second electrode) arranged in the electroporation means is a distance capable of accommodating plant seeds as defined above.

別の実施形態では、本発明のエレクトロポーレーション装置は、植物種子を収容し得る距離にある二つの電極を含み、そしてこのエレクトロポーレーション装置は、細胞／組織を大気圧と異なる圧力下に維持することと組み合わせて使用される。この実施形態では、このエレクトロポーレーション装置と、細胞／組織を大気圧と異なる圧力下に維持する手段とが、同一の機器の中に存在する必要はない。   In another embodiment, the electroporation device of the present invention comprises two electrodes at a distance that can accommodate plant seeds, and the electroporation device maintains cells / tissue under a pressure different from atmospheric pressure. Used in combination with. In this embodiment, the electroporation device and the means for maintaining the cells / tissue under a pressure different from atmospheric pressure need not be in the same instrument.

従来のエレクトロポーレーション装置は、極めて小さい細胞に対して電圧パルスをかけることを目的としていたため、チャンバーの内寸および電極間の距離をできるだけ小さくする必要があった。このため、従来のエレクトロポーレーション装置のチャンバーの内寸および電極間の距離は、代表的に、１ｍｍまたは２ｍｍ程度であり、長くてもせいぜい４ｍｍであった。従って、本発明のような、植物種子をも収容し得るほど大きなチャンバーおよび植物種子をも収容し得るほど長い距離で配置された電極を備えたエレクトロポーレーション装置は、これまで知られていない。   Since the conventional electroporation apparatus was intended to apply a voltage pulse to extremely small cells, it was necessary to make the inner dimensions of the chamber and the distance between the electrodes as small as possible. For this reason, the inner dimension of the chamber of the conventional electroporation apparatus and the distance between the electrodes are typically about 1 mm or 2 mm, and at most 4 mm at most. Therefore, an electroporation apparatus including a chamber that is large enough to accommodate plant seeds and an electrode disposed at a long distance enough to accommodate plant seeds as in the present invention has not been known.

さらに、本発明のエレクトロポーレーション装置は、自動化して実行され得る。本発明の自動化エレクトロポーレーション装置において、緩衝液などの溶液の注入および／または交換は、自動分注機により行われ得る。自動分注機は、例えば、市販のｅｐＭｏｔｉｏｎ５０７０ ワークステーション（エッペンドルフ株式会社 日本国東京都千代田区東神田３）などが利用され得るが、これに限定されない。特に、核酸と細胞とを含む混合液を入れる容器中に、核酸および／または細胞を入れる手段として、このような自動分注機が有利に使用され得る。   Furthermore, the electroporation apparatus of the present invention can be automated. In the automated electroporation apparatus of the present invention, injection and / or exchange of a solution such as a buffer can be performed by an automatic dispenser. As the automatic dispensing machine, for example, a commercially available epMotion 5070 workstation (Eppendorf Co., Ltd. 3 Higashi Kanda, Chiyoda-ku, Tokyo, Japan) can be used, but is not limited thereto. In particular, such an automatic dispenser can be advantageously used as a means for placing nucleic acid and / or cells in a container containing a mixture containing nucleic acid and cells.

核酸と細胞とを含む混合液を入れる第一容器、細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する第二容器、および核酸と細胞とを含む混合液に電圧パルスをかける第三容器は、任意の容器であり得る。これらの容器は、同一であっても異なってもよい。この容器の材質としては、固体を形成し得る任意の材質が使用され得る。例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）などが挙げられるがそれらに限定されない。容器は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、酸化珪素、炭化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用することができる。ポリアミド、ポリカーボネート、（変性）ポリフェニレンオキサイド、ポリブチレンテレフタレート、強化ポリエチレンテレフタレート、ポリエーテルスルホン、ポリフェニレンスルフィド、ポリアリレート、ポリエーテルイミド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリスルホンなどの有機材料なども使用され得る。   A first container for containing a mixture containing nucleic acid and cells, a second container for maintaining cells under a pressure different from atmospheric pressure, and a third container for applying a voltage pulse to the mixture containing nucleic acid and cells may be any Can be a container. These containers may be the same or different. As the material of the container, any material capable of forming a solid can be used. Examples include, but are not limited to, glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastics, metals (including alloys), natural and synthetic polymers (eg, polystyrene, cellulose, chitosan, dextran, and nylon). Not. The container may be formed from a plurality of layers of different materials. For example, an inorganic insulating material such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon oxide, silicon carbide, or silicon nitride can be used. Polyamide, polycarbonate, (modified) polyphenylene oxide, polybutylene terephthalate, reinforced polyethylene terephthalate, polyethersulfone, polyphenylene sulfide, polyarylate, polyetherimide, polyetheretherketone, polyimide, polyester, polyethylene, polypropylene, polyisobutylene, unsaturated Polyester, fluorinated resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylic resin, polyacrylonitrile, polystyrene, acetal resin, phenol resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene / acrylonitrile Copolymer, acrylonitrile butadiene styrene copolymer, silicone resin, polysulfur And organic materials such emissions may also be used.

好ましくは、本発明の第一容器は、透明度が高く材料観察を容易にする材料（例えば、ポリスチレン）から作製される。好ましくは、本発明の第二容器は、大気圧と異なる圧力（特に、減圧）に耐える能力を有する材料（例えば、ポリアミド、ポリカーボネート、（変性）ポリフェニレンオキサイド、ポリブチレンテレフタレート、強化ポリエチレンテレフタレート、ポリエーテルスルホン、ポリフェニレンスルフィド、ポリアリレート、ポリエーテルイミド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミドおよびエポキシ樹脂）から作製され、より好ましくは、透明度が高く材料観察を容易にする性質も備えた材料（例えば、アクリル樹脂）から作製される。好ましくは、本発明の第三容器は、細胞との親和性を示す材料（例えば、ポリプロピレン、シリコーン樹脂、およびガラス）から作製され、白金製、金製、ステンレス製、炭素製、または導電性ポリマー製の電極を備える。これらの材料は、所望の性質を付与するために（例えば、容器本体に絶縁性を付与するために、または電極の導電性を高めるために）、任意の適切な材料でコーティングされてもよい。   Preferably, the first container of the present invention is made of a material that has high transparency and facilitates material observation (for example, polystyrene). Preferably, the second container of the present invention is made of a material (for example, polyamide, polycarbonate, (modified) polyphenylene oxide, polybutylene terephthalate, reinforced polyethylene terephthalate, polyether) capable of withstanding a pressure different from atmospheric pressure (particularly reduced pressure). Material made of sulfone, polyphenylene sulfide, polyarylate, polyetherimide, polyetheretherketone, polyimide and epoxy resin, and more preferably a material having high transparency and easy material observation (for example, acrylic resin) Made from. Preferably, the third container of the present invention is made of a material (for example, polypropylene, silicone resin, and glass) showing affinity with cells, and is made of platinum, gold, stainless steel, carbon, or conductive polymer. The electrode made of is provided. These materials may be coated with any suitable material to impart desired properties (eg, to provide insulation to the container body or to increase the conductivity of the electrode).

上記の第一容器および第二容器について、好ましくは、これらの容器は、大気圧と異なる圧力に耐える能力を有し、特に好ましくは、減圧処理に耐える能力を有する。例えば、上記の第一容器は、上記の第二容器内および／または上記の第三容器内に収容されてもよい。または、核酸と細胞とを含む混合液は、上記の第一容器から、上記の第二容器（または、その内部に収容される別の容器）内および／または上記の第三容器（または、その内部に収容される別の容器）内に注入されてもよい。   For the first and second containers described above, preferably these containers have the ability to withstand pressures different from atmospheric pressure, and particularly preferably have the ability to withstand vacuum processing. For example, the first container may be accommodated in the second container and / or the third container. Alternatively, the mixed solution containing the nucleic acid and the cells is transferred from the first container to the second container (or another container accommodated therein) and / or the third container (or the container). It may be injected into a separate container).

細胞を、上記の第二容器中に配置する手段、および核酸と細胞とを含む混合液を、上記の第三容器中に配置する手段には、ベルトコンベアなどが有利に使用され得るが、これに限定されず、任意の手段が利用され得る。自動ポンプなどを利用して、第一容器、第二容器および第三容器中に配置された液体を、吸引／排出することによって移動させる方法もまた利用され得る。   A belt conveyor or the like can be advantageously used for the means for placing the cells in the second container and the means for placing the mixed solution containing the nucleic acid and the cells in the third container. However, any means can be used. A method of moving the liquid disposed in the first container, the second container, and the third container by suction / discharge using an automatic pump or the like can also be used.

本発明の自動化エレクトロポーレーション装置は、各操作手段を自動化して実施するための制御装置を含む。さらに本発明のエレクトロポーレーション装置は、電源装置を含む。このような制御装置および電源装置は、エレクトロポーレーション装置と同一の機器内に配置されても、別々の機器としてコードで接続されてもよい。   The automated electroporation apparatus of the present invention includes a control device for automating and implementing each operation means. Furthermore, the electroporation device of the present invention includes a power supply device. Such a control apparatus and a power supply apparatus may be arrange | positioned in the same apparatus as an electroporation apparatus, or may be connected with a cord as separate apparatuses.

種子に対してエレクトロポーレーションを行う場合、好ましくは、減圧処理または加圧処理をする種子を、処理前に、水（例えば、水道水）中に放置する。処理前の種子を水中に放置する場合、その放置時間は、６時間〜４８時間、好ましくは１２時間〜３６時間、より好ましくは１８時間〜３０時間、さらにより好ましくは２０時間〜２６時間、最も好ましくは約２４時間であるが、これらに限定されない。   When electroporation is performed on seeds, it is preferable to leave seeds subjected to reduced pressure treatment or pressurized treatment in water (for example, tap water) before the treatment. When the seed before treatment is left in water, the standing time is 6 hours to 48 hours, preferably 12 hours to 36 hours, more preferably 18 hours to 30 hours, and even more preferably 20 hours to 26 hours. Although it is preferably about 24 hours, it is not limited thereto.

本発明における例示的な核酸導入の条件は、種子を２５℃で一晩水道水中に放置し、翌日、真空装置の中に置き、大気圧より０．０９６ＭＰａ低い圧力にて１時間減圧処理を行い、その後、減圧処理した種子に対して、エレクトロポーレーションによる高電圧パルス（１００Ｖ、５０ミリ秒、ただし、電極間の距離は１ｃｍ）を５０回程度かけ、核酸導入／遺伝子導入を行うという条件である。電圧およびパルス回数は作物によって変化し得、当業者は、必要に応じて、そのエレクトロポーレーション条件を適宜選択し得る。その後、抗生物質を含む培地において選抜し、その後鉢上げ（ポットでの育成）により通常の植物個体を得ることができる。   Exemplary conditions for introducing nucleic acid in the present invention are as follows: seeds are left in tap water at 25 ° C. overnight, placed in a vacuum device the next day, and subjected to a vacuum treatment at a pressure lower than atmospheric pressure by 0.096 MPa for 1 hour. Then, a high-voltage pulse (100 V, 50 milliseconds, where the distance between the electrodes is 1 cm) is applied about 50 times to the seeds subjected to reduced pressure treatment under the condition that nucleic acid introduction / gene introduction is performed. is there. The voltage and the number of pulses can vary depending on the crop, and those skilled in the art can appropriately select the electroporation conditions as necessary. Thereafter, a normal plant individual can be obtained by selecting in a medium containing antibiotics and then raising the pot (growing in a pot).

本明細書において用いられる「植物」とは、植物界に属する生物の総称であり、葉緑体、硬い細胞壁、豊富な永続性の胚的組織の存在，および運動する能力がない生物により特徴付けられる。植物の種類は、例えば、「原色牧野植物大図鑑」（北隆館（１９８２））などにおいて広範に分類されており、そこに記載されるすべての種類の植物が、本発明において使用され得る。代表的には、植物は、細胞壁の形成・葉緑体による同化作用をもつ顕花植物をいう。「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。単子葉植物としては、イネ科植物が挙げられる。好ましい単子葉植物としては、トウモロコシ、コムギ、イネ、エンバク、オオムギ、ソルガム、ライムギ及びアワが挙げられ、さらに好ましくは、トウモロコシ、コムギ、イネが挙げられるが、これらに限定されない。コムギには、従来法では形質転換体を得ることが困難であったコムギ品種農林６１号も含まれる。双子葉植物としては、アブラナ科植物、マメ科植物、ナス科植物、ウリ科植物、ヒルガオ科植物が挙げられるが、これらに限定されない。アブラナ科植物としては、ハクサイ、ナタネ、キャベツ、カリフラワーが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいアブラナ科植物は、ハクサイおよびナタネである。特に好ましいアブラナ科植物は、ナタネである。マメ科植物としては、ダイズ、アヅキ、インゲンマメ、ササゲが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいマメ科植物は、ダイズである。ナス科植物としては、トマト、ナス、バレイショが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいナス科植物は、トマトである。ウリ科植物としては、マクワウリ、キュウリ、メロン、スイカが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいウリ科植物は、マクワウリである。ヒルガオ科植物としては、アサガオ、カンショ、ヒルガオが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいヒルガオ科植物は、アサガオである。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。特定の実施形態では、植物は、植物体を意味し得る。   As used herein, “plant” is a general term for organisms belonging to the plant kingdom, characterized by chloroplasts, hard cell walls, the presence of abundant permanent embryonic tissues, and organisms that are not capable of motility. It is done. Plant types are broadly classified in, for example, “Primary Color Makino Botanical Encyclopedia” (Kitatakakan (1982)), and all types of plants described therein can be used in the present invention. Typically, a plant refers to a flowering plant having cell wall formation and anabolism by chloroplasts. “Plant” includes both monocotyledonous and dicotyledonous plants. Monocotyledonous plants include gramineous plants. Preferred monocotyledonous plants include corn, wheat, rice, oat, barley, sorghum, rye and millet, and more preferably, corn, wheat and rice are not limited thereto. Wheat includes wheat cultivar Norin 61, for which it was difficult to obtain transformants by conventional methods. Examples of dicotyledonous plants include cruciferous plants, legumes, eggplants, cucurbits and convolvulaceae, but are not limited thereto. Brassicaceae plants include but are not limited to Chinese cabbage, rapeseed, cabbage and cauliflower. Preferred cruciferous plants are Chinese cabbage and rapeseed. A particularly preferred cruciferous plant is rapeseed. Leguminous plants include, but are not limited to, soybean, azuki bean, kidney bean, and cowpea. A preferred legume is soybean. Examples of solanaceous plants include, but are not limited to, tomatoes, eggplants, and potatoes. A preferred solanaceous plant is tomato. Cucurbitaceae plants include, but are not limited to, cucumber, cucumber, melon and watermelon. A preferred cucurbitaceae plant is cucumber. Convolvulaceae plants include, but are not limited to, morning glory, sweet potato and convolvulus. A preferred convolvulaceae plant is morning glory. Unless otherwise indicated, a plant means any plant, plant organ, plant tissue, plant cell, and seed. Examples of plant organs include roots, leaves, stems and flowers. Examples of plant cells include callus and suspension culture cells. In certain embodiments, a plant can mean a plant.

別の実施形態において、本発明において使用され得る植物種の例としては、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科、ヒルガオ科、キク科などの植物が挙げられる。さらに、本発明において使用され得る植物種の例としては、任意の樹木種、任意の果樹種、クワ科植物（例えば、ゴム）、およびアオイ科植物（例えば、綿花）が挙げられる。   In another embodiment, examples of plant species that can be used in the present invention include solanaceae, gramineous, cruciferous, rose, leguminous, cucurbitaceae, perillaceae, liliaceae, red crustaceae, ciliaceae, bindweed Plants such as family and asteraceae are listed. Furthermore, examples of plant species that can be used in the present invention include any tree species, any fruit tree species, mulberry plants (eg, rubber), and mallow (eg, cotton).

簡便には、本発明の方法は、植物組織（休眠組織（完熟種子、未熟種子、冬芽、および塊茎を含む）、生殖質、生長点、および花芽を含む）に対してエレクトロポーレーションを行い、最も簡便には、種子に対してエレクトロポーレーションを行う。本発明のエレクトロポーレーション方法により核酸導入された種子はそのまま、例えば、土に植えて栽培することにより、容易に核酸導入体／形質転換体となり得る。種子は通常、胚、胚乳および種皮の三部分から構成される（野口弥吉・川田信一郎監修，該当部分は千坂英夫著，農学大事典，養賢堂，８９６頁，１９８７を参照のこと）。胚が、植物のすべての遺伝情報を備え、そして植物体へと生育する部分である。すべての単子葉植物および双子葉植物は胚を有する。本発明のエレクトロポーレーション方法により核酸導入すると、胚の部分において、導入した核酸の発現が認められた。従って、胚を含む種子を有するあらゆる植物で、本発明のこの最も簡便な方法により、容易に核酸導入植物体／形質転換植物体を得ることができる。   Conveniently, the method of the invention performs electroporation on plant tissue (including dormant tissue (including ripe seeds, immature seeds, winter buds, and tubers), germplasm, growth points, and flower buds), Most simply, electroporation is performed on the seed. The seed into which nucleic acid has been introduced by the electroporation method of the present invention can be easily converted into a nucleic acid introducer / transformant, for example, by planting and cultivating it in soil. Seeds usually consist of three parts: embryo, endosperm, and seed coat (supervised by Yoshikichi Noguchi and Shinichiro Kawada, see Hideo Chisaka, Encyclopedia of Agriculture, Yokendo, p. 896, 1987). The embryo is the part that contains all the genetic information of the plant and grows into the plant body. All monocotyledonous and dicotyledonous plants have embryos. When nucleic acid was introduced by the electroporation method of the present invention, expression of the introduced nucleic acid was observed in the embryo part. Therefore, a nucleic acid-introduced plant / transformed plant can be easily obtained from any plant having seeds including embryos by this simplest method of the present invention.

アブラナ科の植物の例としては、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、大根、アブラナ、シロイヌナズナ、ワサビ、ナズナなどを含む。   Examples of cruciferous plants include plants belonging to Raphanus, Brassica, Arabidopsis, Wasabia, or Capsella, and include, for example, radish, rape, Arabidopsis thaliana, horseradish, and tuna.

イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、またはＺｅａに属する植物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、サトウキビ、ソルガム、トウモロコシなどを含む。   Examples of gramineous plants include plants belonging to Oryza, Triticum, Hordeum, Secale, Saccharum, Sorghum, or Zea, and include, for example, rice, barley, rye, sugarcane, sorghum, corn, and the like.

本明細書において用いられる「動物」とは、動物界に属する生物の総称であり、酸素と有機性食物を必要とし，植物や鉱物と違って任意的に動くことができる生物により特徴付けられる。動物は、大きく脊椎動物と無脊椎動物とに分類される。脊椎動物としては、例えば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物などが用いられ、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）が用いられる。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）が用いられる。最も好ましくはヒト由来の細胞または器官などが用いられる。無脊椎動物としては、例えば、甲殻綱、ヤスデ綱、エダヒゲムシ綱、ムカデ綱、コムカデ綱、昆虫綱などが用いられる。より好ましくは、昆虫(例えば、チョウ目（カイコなどを含む）)が用いられる。   As used herein, “animal” is a collective term for organisms belonging to the animal kingdom, and is characterized by organisms that require oxygen and organic food and can move arbitrarily unlike plants and minerals. Animals are broadly classified into vertebrates and invertebrates. As the vertebrate, for example, larvae, lampreys, cartilaginous fish, teleosts, amphibians, reptiles, birds, mammals and the like are used, and more preferably mammals (for example, single pores, marsupials, poor Teeth, wings, wings, carnivores, carnivores, long noses, odd hoofs, even hoofs, rodents, scales, sea cattle, cetaceans, primates, rodents, Rabbit eyes, etc.) are used. More preferably, a primate (for example, chimpanzee, Japanese monkey, human) is used. Most preferably, human-derived cells or organs are used. As the invertebrates, for example, crustaceans, millipede, Edahi beetle, centipede, komcade, insects and the like are used. More preferably, insects (for example, Lepidoptera (including silkworms)) are used.

本明細書において、「トランスジェニック生物」とは、特定の遺伝子が組み込まれた生物をいう。「トランスジェニック植物」とは、特定の遺伝子が組み込まれた植物をいい、同様に「トランスジェニック動物」とは、特定の遺伝子が組み込まれた動物をいう。   As used herein, “transgenic organism” refers to an organism into which a specific gene has been incorporated. “Transgenic plant” refers to a plant into which a specific gene has been incorporated, and similarly “transgenic animal” refers to an animal into which a specific gene has been incorporated.

本発明の方法により核酸導入／形質転換された細胞および組織は、当該分野において公知の任意の方法によって、分化、成長および／または増殖され得る。植物種の場合、細胞または組織を分化、成長および／または増殖させる工程は、例えば、その植物細胞もしくは植物組織またはそれらを含む植物体を栽培することによって達成され得る。本明細書では、植物の栽培は当該分野において公知の任意の方法により行うことができる。植物の栽培方法は、例えば、監修 島本功および岡田清，「モデル植物の実験プロトコール−イネ・シロイヌナズナ編−」：細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ４；イネの栽培法（奥野員敏）ｐｐ．２８−３２、ならびに、丹羽康夫著，シロイヌナズナの栽培法，ｐｐ．３３−４０に例示されており、当業者であれば容易に実施することができることから本明細書では詳述する必要はない。例えば、シロイヌナズナの栽培は土耕、ロックウール耕、水耕いずれでも行うことができる。白色蛍光灯（６０００ルクス程度）の下、恒明条件で栽培すれば播種後４週間程度で最初の花が咲き、開花後１６日程度で種子が完熟する。１さやで約４０〜５０粒の種子が得られ、播種後２〜３ケ月で枯死するまでの間に１００００粒程度の種子が得られる。また、例えば、コムギの栽培においては、播種後に一定期間の低温短日条件にさらされなければ、出穂および開花しないことが周知である。従って、例えば、人工環境下（例えば、温室やグロスチャンバー）においてコムギを栽培する場合には、生育初期段階で、コムギ幼植物に低温短日処理（例えば、２０℃ 明期８時間（約２０００ルクス）および８℃ 暗期１６時間での処理など）を行う必要がある。この処理は春化処理（ｖｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）と呼ばれる。このような各植物種ごとに必要とされる栽培条件は、当該分野において一般に広く知られており、従って、本明細書中で詳述する必要はない。   Cells and tissues that have been transfected / transformed by the methods of the present invention can be differentiated, grown and / or expanded by any method known in the art. In the case of plant species, the process of differentiating, growing and / or proliferating cells or tissues can be achieved, for example, by cultivating the plant cells or plant tissues or plants containing them. In the present specification, plant cultivation can be performed by any method known in the art. See, for example, supervised by Isao Shimamoto and Kiyoshi Okada, “Experimental Protocol for Model Plants—Edited by Rice and Arabidopsis thaliana”: Cell Engineering, Separate Volume, Plant Cell Engineering Series 4; 28-32, and Niwa Yasuo, Arabidopsis cultivation method, pp. 33-40 and can be easily implemented by those skilled in the art and need not be described in detail herein. For example, Arabidopsis can be cultivated by soil cultivation, rock wool cultivation, or hydroponics. When cultivated under a white fluorescent lamp (about 6000 lux) under constant light conditions, the first flower will bloom about 4 weeks after sowing, and the seed will ripen about 16 days after flowering. About 40 to 50 seeds can be obtained with one pod, and about 10,000 seeds can be obtained in 2 to 3 months after sowing. In addition, for example, in the cultivation of wheat, it is well known that it does not head and bloom unless it is exposed to low-temperature short-day conditions for a certain period after sowing. Therefore, for example, when cultivating wheat in an artificial environment (for example, a greenhouse or a gross chamber), the wheat seedlings are treated at a low temperature and short day (for example, 20 ° C., light period 8 hours (about 2000 lux) in the early stage of growth. ) And 8 ° C. treatment in the dark period of 16 hours). This process is called vernalization. The cultivation conditions required for each plant species are generally well known in the art, and therefore need not be described in detail herein.

植物以外の種（例えば、動物種）の場合においても、核酸導入／形質転換された細胞および組織は、当該分野において公知の任意の方法によって、分化、成長および／または増殖され得る（例えば、泉美治ら編，生物化学実験のてびき ４．動物・組織実験法，化学同人，１９８７年などを参照のこと）。例えば、エレクトロポーレーションにより核酸導入した細胞および／または組織は、市販の飼料を供給しながら常温下（約２５℃）で育成され得る。   In the case of species other than plants (eg, animal species), the nucleic acid introduced / transformed cells and tissues can be differentiated, grown and / or propagated (eg, Izumi) by any method known in the art. Oji, et al., Biochemistry Experiments 4. See Animal and Tissue Experiments, Chemistry Dojin, 1987). For example, cells and / or tissues into which nucleic acid has been introduced by electroporation can be grown at room temperature (about 25 ° C.) while supplying a commercial feed.

本明細書において使用される場合、「界面活性剤」とは、液体の表面張力を減らし，また液体間または液体と固体間の界面張力を減じる可溶性の化合物をいう。界面活性剤は、好ましくは、細胞・組織への細菌（例えば、アグロバクテリウム）の浸透を促進する作用を有する。本発明にもいて用いられる界面活性剤としては、例えば、Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７の商品名でＬｏｖｅｌａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社より農薬の展着剤として市販されている、植物に対する毒性の低い界面活性剤である、ポリアルキレンオキシド修飾ヘプタメチルトリシロキサン（Ｐｏｌｙａｌｋｙｌｅｎｅｏｘｉｄｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｈｅｐｔａｍｅｔｈｙｌｔｒｉｓｉｌｏｘａｎｅ）、および動植物に対する毒性の低い界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、が挙げられるがこれらに限定されない。   As used herein, “surfactant” refers to a soluble compound that reduces the surface tension of a liquid and reduces the interfacial tension between liquids or between a liquid and a solid. The surfactant preferably has an action of promoting the penetration of bacteria (for example, Agrobacterium) into cells / tissues. Examples of the surfactant used in the present invention include, for example, a surfactant that is commercially available as a pesticide spreading agent from Loveland Industries under the trade name of Silwet L-77, and is a low-toxic surfactant for plants. Examples include, but are not limited to, alkylene oxide-modified heptamethyltrisiloxane (Polyalkylene Modified Modified Hexamethyltrisiloxane) and Tween 20® (polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate), a surfactant that is less toxic to animals and plants. .

本明細書において使用される場合、Ｔｉプラスミドの「ｖｉｒ領域転写誘導物質」とは、Ｔｉプラスミドのｖｉｒ領域に存在する遺伝子群の転写を誘導する物質をいう。Ｖｉｒ領域転写誘導物質は、本来は植物が傷などのストレスを受けたときに誘導される植物内在性のフェノール化合物(アセトシリンゴンを含む)に由来する。Ｖｉｒ領域転写誘導物質の代表例は、アセトシリンゴンであるが、アセトシリンゴンおよびその誘導体の他に、タバコ葉切片の滲出液から単離されたリグニン合成の前駆体であるシリングアルデヒドやフェルラ酸あるいは、これらの誘導体であって、ｖｉｒ領域に存在する遺伝子群の転写を誘導する物質も含まれる。また、植物には内在性のアセトシリンゴンがあるため、本発明の実施においては、アセトシリンゴンの添加は必ずしも必要ではなく、アセトシリンゴンを用いなくても、細胞・組織への核酸および／または細菌の導入は可能である。   As used herein, the “vir region transcription inducer” of Ti plasmid refers to a substance that induces transcription of genes present in the vir region of Ti plasmid. The Vir region transcription inducer is originally derived from a plant endogenous phenol compound (including acetosyringone) that is induced when a plant is subjected to stress such as a wound. A typical example of a vir region transcription inducer is acetosyringone, but in addition to acetosyringone and its derivatives, syringaldehyde and ferulic acid, which are precursors of lignin synthesis isolated from exudates of tobacco leaf sections. Alternatively, a derivative that induces transcription of a gene group present in the vir region is also included. In addition, since plants have endogenous acetosyringone, it is not always necessary to add acetosyringone in the practice of the present invention. Even if acetosyringone is not used, nucleic acids and / or Or introduction of bacteria is possible.

本明細書において使用される場合、「Ｔｉプラスミド」とは、Agrobacterium tumefaciensの約２００ｋｂｐのプラスミドであって、クラウンゴール腫瘍の原因因子である。Ｔｉプラスミドは、ｖｉｒ領域、Ｔ−ＤＮＡ領域などを有する。   As used herein, a “Ti plasmid” is an approximately 200 kbp plasmid of Agrobacterium tumefaciens that is a causative factor for crown gall tumors. The Ti plasmid has a vir region, a T-DNA region, and the like.

本明細書において使用される場合、「ｖｉｒ領域」とは、Ｔｉプラスミド中の病原性を担っている遺伝子の領域であって、ｖｉｒＡ、Ｂ、Ｇ、Ｃ、Ｄ、およびＥの６つの転写単位を有する。   As used herein, a “vir region” is a region of a gene responsible for pathogenicity in a Ti plasmid, which is a six transcription unit of virA, B, G, C, D, and E. Have

本明細書において使用される場合、導入される遺伝子は、ポリヌクレオチドからなる。   As used herein, the introduced gene consists of a polynucleotide.

本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：５０８１，１９９１；Ｏｈｔｓｕｋａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：２６０５−２６０８，１９８５；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１−９８，１９９４）。用語「核酸」はまた、本明細書において、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。   As used herein, the terms “polynucleotide”, “oligonucleotide”, and “nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to a polymer of nucleotides of any length. The term also includes “derivative oligonucleotide” or “derivative polynucleotide”. A “derivative oligonucleotide” or “derivative polynucleotide” refers to an oligonucleotide or polynucleotide that includes a derivative of a nucleotide or that has an unusual linkage between nucleotides and is used interchangeably. Specific examples of such an oligonucleotide include, for example, 2′-O-methyl-ribonucleotide, a derivative oligonucleotide in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and a phosphodiester bond in an oligonucleotide. Is an N3′-P5 ′ phosphoramidate bond derivative oligonucleotide, a ribose and phosphodiester bond in the oligonucleotide converted to a peptide nucleic acid bond, uracil in the oligonucleotide is C− A derivative oligonucleotide substituted with 5-propynyluracil, a derivative oligonucleotide where uracil in the oligonucleotide is substituted with C-5 thiazole uracil, and cytosine in the oligonucleotide is C-5 propynylcytosine Substituted derivative oligonucleotides, derivative oligonucleotides in which the cytosine in the oligonucleotide is replaced with phenoxazine-modified cytosine, derivative oligos in which the ribose in the oligonucleotide is replaced with 2′-O-propyl ribose Examples thereof include derivative oligonucleotides in which ribose in nucleotides and oligonucleotides is substituted with 2′-methoxyethoxyribose. Unless otherwise indicated, a particular nucleic acid sequence may also be conservatively modified (eg, degenerate codon substitutes) and complementary sequences, as well as those explicitly indicated. Is contemplated. Specifically, a degenerate codon substitute creates a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue. (Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19: 5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260: 2605-2608, 1985; Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91). -98, 1994). The term “nucleic acid” is also used herein interchangeably with gene, cDNA, mRNA, oligonucleotide, and polynucleotide. Particular nucleic acid sequences also include “splice variants”. Similarly, a particular protein encoded by a nucleic acid implicitly encompasses any protein encoded by a splice variant of that nucleic acid. As the name suggests, a “splice variant” is the product of alternative splicing of a gene. After transcription, the initial nucleic acid transcript can be spliced such that different (another) nucleic acid splice products encode different polypeptides. The production mechanism of splice variants varies, but includes exon alternative splicing. Other polypeptides derived from the same nucleic acid by read-through transcription are also encompassed by this definition. Any product of a splicing reaction (including recombinant forms of splice products) is included in this definition.

本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。   As used herein, “gene” refers to a factor that defines a genetic trait. Usually arranged in a certain order on the chromosome. A gene that defines the primary structure of a protein is called a structural gene, and a gene that affects its expression is called a regulatory gene. As used herein, “gene” may refer to “polynucleotide”, “oligonucleotide”, and “nucleic acid”. As used herein, “homology” of genes refers to the degree of identity of two or more gene sequences with respect to each other. Therefore, the higher the homology between two genes, the higher the sequence identity or similarity. Whether two genes have homology can be examined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, hybridization methods under stringent conditions. When directly comparing two gene sequences, the DNA sequence between the gene sequences is typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, more preferably at least 80%, 90% , 95%, 96%, 97%, 98% or 99% are identical, the genes are homologous.

本明細書では塩基配列の同一性の比較および相同性の算出は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。   In this specification, comparison of base sequence identity and calculation of homology are calculated using BLAST, which is a sequence analysis tool, using default parameters.

本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。   In the present specification, “expression” of a gene, polynucleotide, polypeptide or the like means that the gene or the like undergoes a certain action in vivo to take another form. Preferably, a gene, polynucleotide or the like is transcribed and translated into a polypeptide form. However, transcription and production of mRNA can also be an aspect of expression. More preferably, such polypeptide forms may be post-translationally processed.

本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。   In the present specification, the “nucleotide” may be natural or non-natural. “Derivative nucleotide” or “nucleotide analog” refers to a nucleotide that is different from a naturally occurring nucleotide but has the same function as the original nucleotide. Such derivative nucleotides and nucleotide analogs are well known in the art. Examples of such derivative nucleotides and nucleotide analogs include, but are not limited to, phosphorothioates, phosphoramidates, methyl phosphonates, chiral methyl phosphonates, 2-O-methyl ribonucleotides, peptide-nucleic acids (PNA). .

本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。   In the present specification, the “fragment” refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length of 1 to n−1 with respect to a full-length polypeptide or polynucleotide (length is n). The length of the fragment can be appropriately changed according to the purpose. For example, the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, Examples include 15, 20, 25, 30, 40, 50 and more amino acids, and lengths expressed in integers not specifically listed here (eg, 11 etc.) are also suitable as lower limits. obtain. In the case of polynucleotides, examples include 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 and more nucleotides. Non-integer lengths (eg, 11 etc.) may also be appropriate as a lower limit.

本発明において利用され得る一般的な分子生物学的手法としては、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８８；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８７などを参酌して当業者であれば容易に実施をすることができる。   General molecular biology techniques that can be utilized in the present invention include Ausubel F. et al. A. Et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY, 1988; Sambrook J. et al. Et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1987, etc., can be easily implemented by those skilled in the art.

本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、原核生物細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体等の宿主細胞、好ましくは植物細胞において自律複製が可能であるか、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。   In the present specification, when referring to a gene, a “vector” refers to one that can transfer a target polynucleotide sequence into a target cell. Such vectors can be autonomously replicated in prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, host cells such as animal individuals and plant individuals, preferably plant cells, or into the chromosome. Examples are those that can be integrated and contain a promoter at a position suitable for transcription of the polynucleotide of the present invention.

「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、植物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。選抜のための選択マーカーとしては、抗生物質カナマイシンに対する耐性を与える酵素ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするｎｅｏ遺伝子（Ｂｅｃｋら，Ｇｅｎｅ，１９：３２７，１９８２；抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を与える酵素ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするｈｙｇ遺伝子（Ｇｒｉｔｚ及びＤａｖｉｅｓ，Ｇｅｎｅ，２５：１７９，１９８３）；及び除草剤ホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対する耐性を与えるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするｂａｒ遺伝子（ＥＰ ２４２２３６）；ストレプトマイシンフォスフォトランスフェラーゼをコードするｓｐｔ遺伝子；ストレプトマイシン耐性遺伝子；スペクチノマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子（例えば、Ｈ．Ｓ．Ｃｈａｗｌａ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２ｎｄ：３６３，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，単行本，２００２）；ならびにβ−グルクロニダーゼをコードするｇｕｓ遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６：３９０１，１９８６）およびルシフェラーゼ遺伝子（Ｏｗら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：８５６，１９８６）、およびＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）コード遺伝子（例えば、フナコシ株式会社、東京都文京区本郷から入手可能）のようなスクリーン可能なマーカー遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。   “Expression vector” refers to a nucleic acid sequence in which various regulatory elements are operably linked in a host cell in addition to a structural gene and a promoter that regulates its expression. Regulatory elements can preferably include terminators, selectable markers such as drug resistance genes, and enhancers. It is well known to those skilled in the art that the type of organism (eg, plant) expression vector and the type of regulatory elements used can vary depending on the host cell. As a selection marker for selection, the neo gene encoding the enzyme neomycin phosphotransferase that confers resistance to the antibiotic kanamycin (Beck et al., Gene, 19: 327, 1982; the enzyme hygromycin phosphotransferase that confers resistance to the antibiotic hygromycin The hyg gene (Gritz and Davies, Gene, 25: 179, 1983); and the bar gene (EP 242236) encoding phosphinothricin acetyltransferase conferring resistance to the herbicide phosphinothricin (EP 242236); Spt gene encoding transferase; streptomycin resistance gene; spectinomycin resistance residue Drug resistance genes such as offspring (eg HS Chawla, Introduction to Plant Biotechnology 2nd: 363, Science Publishers, Inc., Monograph, 2002); and the gus gene encoding β-glucuronidase (Jefferson et al., Procson et al., Procson et al. Acad.Sci.USA, 6: 3901, 1986) and the luciferase gene (Ow et al., Science, 234: 856, 1986) and the GFP (green fluorescent protein) coding gene (eg, Funakoshi Co., Ltd., Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo) Screenable marker genes such as, but not limited to:

本発明において選抜に使用する薬剤としては、カナマイシン、ハイグロマイシン、ジェネティシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシンが挙げられるがこれらに限定されない。   Examples of the drug used for selection in the present invention include, but are not limited to, kanamycin, hygromycin, geneticin, gentamicin, streptomycin, and spectinomycin.

「組換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、植物細胞、および植物個体等の宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。   “Recombinant vector” refers to a vector capable of transferring a target polynucleotide sequence to a target cell. Such vectors can be autonomously replicated in plant cells and host cells such as plant individuals, or can be integrated into the chromosome, and contain a promoter at a position suitable for transcription of the polynucleotide of the present invention. What is present is exemplified.

植物細胞に対する「組換えベクター」としては、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター、ジェミニウイルスベクターなどが例示される。   Examples of “recombinant vectors” for plant cells include Ti plasmids, tobacco mosaic virus vectors, geminivirus vectors, and the like.

「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターとしては、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、タバコＰＲ１ａ遺伝子のターミネーターが挙げられるが、これに限定されない。本明細書において用いられる「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、通常構造遺伝子の上流にあるが、好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。   A “terminator” is a sequence that is located downstream of a region encoding a protein of a gene and is involved in termination of transcription when DNA is transcribed into mRNA and addition of a poly A sequence. It is known that the terminator is involved in the stability of mRNA and affects the expression level of the gene. Examples of the terminator include, but are not limited to, CaMV35S terminator, terminator of nopaline synthase gene (Tnos), and terminator of tobacco PR1a gene. As used herein, the term “promoter” refers to a region on DNA that determines the transcription start site of a gene and directly regulates its frequency, and is a base sequence that initiates transcription when RNA polymerase binds. is there. Since the promoter region is usually a region within about 2 kbp upstream of the first exon of the putative protein coding region, if the protein coding region in the genomic base sequence is predicted using DNA analysis software, The promoter region can be estimated. The putative promoter region is usually upstream of the structural gene, but preferably the putative promoter region is present within about 2 kbp upstream from the first exon translation start point.

本明細書において、遺伝子の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、生物（例えば、植物）の部位（例えば、植物の場合、根、茎、幹、葉、花、種子、胚芽、胚、果実など）におけるその遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、生物（たとえば、植物）の発達段階（例えば、植物であれば生長段階（例えば、発芽後の芽生えの日数）に応じたその遺伝子の発現の特異性をいう。そのような特異性は、適切なプロモーターを選択することによって、所望の生物に導入することができる。   In the present specification, when used for expression of a gene, “site specificity” generally means a part of an organism (eg, a plant) (eg, in the case of a plant, a root, a stem, a stem, a leaf, a flower, a seed, Germ, embryo, fruit, etc.) the specificity of the gene expression. “Time specificity” refers to the specificity of expression of a gene according to the stage of development of an organism (eg, a plant) (eg, if it is a plant, the growth stage (eg, the number of days after germination)). Such specificity can be introduced into the desired organism by selecting an appropriate promoter.

本明細書において、本発明のプロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物のすべての組織において、その生物の生長の幼若期または成熟期のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、本明細書の実施例と同様の条件でノーザンブロット分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上（例えば、５日目および１５日目））の同一または対応する部位のいずれにおいても、ほぼ同程度の発現量がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。本発明のプロモーターの発現が「ストレス応答性」であるとは、少なくとも１つのストレスが生物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を「ストレス誘導性」といい、発現量が減少する性質を「ストレス抑制性」という。「ストレス抑制性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、生物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することにより決定することができる。ストレス誘導性のプロモーターを本発明のポリペプチドをコードする核酸とともに組み込んだベクターで形質転換された植物または植物の部分（特定の細胞、組織など）は、そのプロモーターの誘導活性をもつ刺激因子を用いることにより、ある条件下での特定の遺伝子の発現を行うことができる。   In the present specification, the expression of the promoter of the present invention is “constitutive” in an almost constant amount in all tissues of an organism, whether it is in the juvenile stage or the mature stage of the organism. It refers to the property that is expressed. Specifically, when Northern blot analysis is performed under the same conditions as in the examples of the present specification, for example, the same or corresponding at any time point (for example, 2 points or more (for example, 5th day and 15th day)) Expression is said to be constitutive by definition of the present invention when almost the same level of expression is observed at any of the sites. Constitutive promoters are thought to play a role in maintaining homeostasis of organisms in normal growth environments. The expression of the promoter of the present invention being “stress responsive” refers to the property that the expression level changes when at least one stress is applied to an organism. In particular, the property of increasing the expression level is called “stress inducibility”, and the property of decreasing the expression level is called “stress suppression”. The expression of “stress suppression” is a concept that overlaps with “constitutive” expression because it is premised on that expression is observed in a normal state. These properties can be determined by extracting RNA from any part of the organism and analyzing the expression level by Northern blot analysis or quantifying the expressed protein by Western blot. Plants or plant parts (specific cells, tissues, etc.) transformed with a vector incorporating a stress-inducible promoter together with a nucleic acid encoding the polypeptide of the present invention use a stimulating factor having inducible activity of the promoter. Thus, a specific gene can be expressed under certain conditions.

「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。植物において使用する場合、エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好ましい。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。   An “enhancer” can be used to increase the expression efficiency of a target gene. When used in plants, an enhancer region containing an upstream sequence in the CaMV35S promoter is preferred as an enhancer. A plurality of enhancers may be used, but one may be used or may not be used.

本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、プロモーターと構造遺伝子との間に介在する配列が存在してもよいため、プロモーターと構造遺伝子とは必ずしも隣接して配置される必要はない。   As used herein, “operably linked” refers to a transcriptional translational regulatory sequence (eg, promoter, enhancer, etc.) or a translational regulatory sequence that has the expression (operation) of a desired sequence. That means. In order for a promoter to be operably linked to a gene, the promoter is usually placed immediately upstream of the gene, but there may be a sequence intervening between the promoter and the structural gene. It does not necessarily have to be placed adjacent to the structural gene.

導入した遺伝子の存在は、サザンブロット法またはＰＣＲ法によって確認し得る。導入した遺伝子の転写は、ノーザンブロット法またはＰＣＲ法により、検出し得る。必要に応じて、遺伝子産物たるタンパク質の発現を、例えば、ウェスタンブロット法により確認し得る。   The presence of the introduced gene can be confirmed by Southern blotting or PCR. Transcription of the introduced gene can be detected by Northern blotting or PCR. If necessary, the expression of a protein as a gene product can be confirmed by, for example, Western blotting.

以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。   The present invention will be described below based on examples, but the following examples are provided for illustrative purposes only. Accordingly, the scope of the present invention is not limited to the above detailed description of the invention nor the following examples, but is limited only by the scope of the claims.

（エレクトロポーレーションの装置）
本発明に用いたエレクトロポーレーションの装置には、市販のエレクトロポーレーション手段（例えば、ＣＵＹ２１ＥＤＩＴ遺伝子導入装置、ネッパジーン社、千葉県市川市）を使用し得る。本実施例においてエレクトロポーレーションを行う際に使用されるエレクトロポーレーションチャンバーは、形質転換の対象となる植物組織を収容できるものであれば、どのような大きさであってもよいが、冷却可能なチャンバーが好ましい。本実施例では、白金電極を備える縦１ｃｍ×横２ｃｍ×高さ２ｃｍの特注のエレクトロポーレーションチャンバーを使用した。(Electroporation equipment)
As the electroporation apparatus used in the present invention, commercially available electroporation means (for example, CUY21 EDIT gene transfer apparatus, Neppagene, Ichikawa City, Chiba Prefecture) can be used. The electroporation chamber used for electroporation in this example may be any size as long as it can accommodate the plant tissue to be transformed, but can be cooled. A preferred chamber is preferred. In this example, a custom-made electroporation chamber with a platinum electrode of 1 cm long × 2 cm wide × 2 cm high was used.

（エレクトロポーレーション）
減圧処理の後、シャーレの中の種子と緩衝液をチャンバーに移し、氷上に１分間静置する。そして、実施例に示すように、１００Ｖあるいは５０Ｖの電圧で（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）、パルス幅５０ミリ秒の矩形波（５０ミリ秒の間、電圧を加え、５０ミリ秒〜７５ミリ秒休む周期を繰り返す）、パルス回数５０回あるいは９９回行う。さらに氷上にチャンバーを２分間静置した後、緩衝液を捨て、元のシャーレに処理した種子を戻す。この種子を戻したシャーレに、２ｍｌの０．５％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）水溶液を入れる。このＰＶＰ水溶液は、雑菌の繁殖を抑えるために次亜塩素酸ナトリウム水溶液を含む（有効塩素濃度が約０．０１％となるように調整した）。
シャーレを４℃で約１時間保存した後、２５℃で一晩静置する。(Electroporation)
After decompression, the seeds and buffer in the petri dish are transferred to a chamber and left on ice for 1 minute. Then, as shown in the examples, a rectangular wave with a voltage of 100 V or 50 V (however, the distance between the electrodes is 1 cm) and a pulse width of 50 milliseconds (a voltage is applied for 50 milliseconds, 50 milliseconds to 75 seconds). Repeat cycle of resting for milliseconds), 50 times or 99 times. Further, after allowing the chamber to stand on ice for 2 minutes, the buffer solution is discarded, and the treated seed is returned to the original petri dish. 2 ml of 0.5% polyvinylpyrrolidone (PVP) aqueous solution is put into the petri dish where the seeds are returned. This aqueous PVP solution contains an aqueous sodium hypochlorite solution (supplied so that the effective chlorine concentration is about 0.01%) in order to suppress the propagation of various bacteria.
The petri dish is stored at 4 ° C. for about 1 hour and then allowed to stand at 25 ° C. overnight.

（ＧＵＳ分析）
Ｘ−Ｇｌｕｃ液（１００ ｍＭ ｐＨ７．０ リン酸緩衝液、０．０５％ Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド シクロヘキシルアンモニウム塩）、０．５ｍＭ フェリシアン化カリウム、０．５ｍＭ フェロシアン化カリウム、０．３％ トリトンＸ−１００、２０％ メタノール）を２ｍｌ加え、２５℃で一晩静置した。染色の程度からＧＵＳ遺伝子の発現を確認した。(GUS analysis)
X-Gluc solution (100 mM pH 7.0 phosphate buffer, 0.05% X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide cyclohexylammonium salt), 0.5 mM potassium ferricyanide 2 ml of 0.5 mM potassium ferrocyanide, 0.3% Triton X-100, 20% methanol) was added and allowed to stand overnight at 25 ° C. The expression of the GUS gene was confirmed from the degree of staining.

（抗生物質培地による選抜）
ＧＵＳ分析を行わず、以下のように生育させる。
ａ）７ｃｍのろ紙を敷いた９ｃｍ×１５ｍｍのシャーレに、種子を移す。
ｂ）蒸留水に溶かした抗生物質の水溶液を１０ｍｌ添加する。コムギの種子をジェネティシンで選抜するときは濃度２０００ｐｐｍまたは１２００ｐｐｍを用いる。なお、イネの種子をジェネティシンで選抜するときの濃度は、２００ｐｐｍである。
ｃ）培養室で、２５℃ 明期１６時間（約２０００ルクス） 暗期８時間の条件下または２０℃ 明期８時間（約２０００ルクス）および８℃ 暗期１６時間の条件下にて、育成する。(Selection with antibiotic medium)
Without GUS analysis, grow as follows.
a) Transfer the seeds to a 9 cm × 15 mm petri dish with 7 cm filter paper.
b) Add 10 ml of an aqueous solution of antibiotics dissolved in distilled water. When wheat seeds are selected with geneticin, a concentration of 2000 ppm or 1200 ppm is used. In addition, the density | concentration when selecting a rice seed with geneticin is 200 ppm.
c) Growing in a culture room under conditions of 25 ° C. light period 16 hours (approximately 2000 lux) dark period 8 hours or 20 ° C. light period 8 hours (approximately 2000 lux) and 8 ° C. dark period 16 hours. To do.

（形質転換体の育成）
抗生物質培地による選抜の後、植物を、園芸用培土（ニューマジックソイル；株式会社サカタのタネ、横浜市都筑区）を入れた直径８．５ｃｍ、高さ５．５ｃｍのポット（植木鉢）を用いて、隔離型のグロスチャンバーで育成する（１５℃ 明期８時間（ナトリウムランプ、約５００００ルクス）、暗期１６時間の条件または２０℃ 明期８時間（約２０００ルクス）および８℃ 暗期１６時間の条件）。(Raising transformants)
After selection with antibiotic medium, the plant was used in a pot (flower pot) with a diameter of 8.5 cm and a height of 5.5 cm containing horticultural soil (New Magic Soil; Sakata Seed, Tsuzuki-ku, Yokohama). And grow in an isolated gross chamber (15 ° C light period 8 hours (sodium lamp, about 50000 lux), dark condition 16 hours or 20 ° C light period 8 hours (approximately 2000 lux) and 8 ° C dark period 16 Time condition).

（ＤＮＡの抽出）
遺伝子導入を確認するＰＣＲを行うために、形質転換植物の葉および茎を採取して、ＤＮＡを抽出する。ＤＮＡの抽出には、任意の周知の方法を使用し得る。代表的なＤＮＡ抽出方法は、ＣＴＡＢ法である（内宮博文「植物遺伝子操作マニュアル トランスジェニック植物の作り方」講談社サイエンティフィック，７１−７４頁，単行本，１９８９）。(DNA extraction)
In order to perform PCR for confirming gene transfer, leaves and stems of the transformed plant are collected and DNA is extracted. Any known method may be used for DNA extraction. A typical DNA extraction method is the CTAB method (Hirofumi Uchimiya “Plant Gene Manipulation Manual How to Make Transgenic Plants” Kodansha Scientific, pages 71-74, book, 1989).

（ＰＣＲ分析）
エレクトロポーレーション後の個体の葉からＤＮＡを抽出し、ＮＰＴ ＩＩ遺伝子を検出する一対のプライマー（５’−ｃｔｇｃｇｔｇｃａａｔｃｃａｔｃｔｔｇ−３’：配列番号１、５’−ａｃｔｃｇｔｃａａｇａａｇｇｃｇａｔａｇａａｇ−３’：配列番号２）を用いてＰＣＲを行った。また、さらなる一対のプライマー（５’−ｃａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃ−３’：配列番号３、５’−ｃａｇａａｇａａｃｔｃｇｔｃａａｇａａｇｇｃｇａｔａｇａａｇｇｃｇａｔ−３’：配列番号４）もまた使用され得、このプライマー対は、より特異的にＮＰＴ II遺伝子を検出し得るので、より好ましい。ポリメラーゼは、株式会社パーキンエルマージャパン（横浜市西区）のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを、製造業者の指示に従って、使用する。増幅に使用するサーマルサイクラーの条件は：
（ａ）９５℃ １０分間を１サイクル；
（ｂ）９５℃ １分間、６４℃ ２分間、７２℃ ２分間を５０サイクル；
（ｃ）７２℃ ７分間を１サイクル；および
（ｄ）その後４℃にて保存
である。(PCR analysis)
Using a pair of primers (5′-ctgcgtgcaatcccatcttg-3 ′: SEQ ID NO: 1, 5′-actcgtcaagaggcgatagaag-3 ′: SEQ ID NO: 2) for extracting DNA from the leaves of the individual after electroporation and detecting the NPT II gene PCR was performed. In addition, an additional pair of primers (5′-catgattgaacaagagatgattgcacgcaggttctc-3 ′: SEQ ID NO: 3, 5′-cagaagaactcgtcaagaagcccagagaggcgat-3 ′: SEQ ID NO: 4) can also be used. Since it can detect, it is more preferable. As the polymerase, AmpliTaq Gold manufactured by Perkin Elmer Japan Co., Ltd. (Nishi-ku, Yokohama) is used according to the manufacturer's instructions. The thermal cycler conditions used for amplification are:
(A) 1 cycle of 95 ° C. for 10 minutes;
(B) 50 cycles of 95 ° C. for 1 minute, 64 ° C. for 2 minutes, 72 ° C. for 2 minutes;
(C) 72 ° C. for 7 minutes for 1 cycle; and (d) then stored at 4 ° C.

（サザンブロット分析）
エレクトロポーレーション後、上記ＰＣＲ分析により導入遺伝子の存在が確認される場合、その個体由来のＤＮＡを用いて、サザンブロット分析を行う。サザンブロット法は当該分野において周知であり、当業者は、その条件を必要に応じて適宜選択し得る。本実施例のサザンブロット分析では、導入したＮＰＴ ＩＩ遺伝子に特異的な配列（配列表において、配列番号５として示される）を、プローブとして使用する。(Southern blot analysis)
When the presence of the transgene is confirmed by the PCR analysis after electroporation, Southern blot analysis is performed using DNA derived from the individual. Southern blotting is well known in the art, and those skilled in the art can appropriately select the conditions as necessary. In the Southern blot analysis of this example, a sequence specific to the introduced NPT II gene (shown as SEQ ID NO: 5 in the sequence listing) is used as a probe.

（遺伝解析）
サザンブロット分析により導入遺伝子が確認される場合、その植物については、さらに生育させ、自家受粉により多数の完熟種子を得る。その中からランダムに約１０個の種子を取り、土を詰めたポットで栽培する。幼植物の葉からＤＮＡを抽出し、このＤＮＡをテンプレートとして上記ＰＣＲ分析に記載の条件下でＰＣＲを行う。
（実施例１：本発明の方法によるイネ植物の形質転換）
（材料）
ジャポニカイネの完熟種子として、コシヒカリの玄米を使用した。コムギ種子として、農林６１号を使用した。インディカイネの完熟種子として、ＩＲ２４の玄米を使用した。ハクサイ種子として、「無双」を使用した。ダイズ種子として、「Ｆａｙａｔｔｅ」を使用した。トマト種子として、「ミニキャロル」を使用した。アサガオ種子として、「サンスマイル曜白大輪」を使用した。種子は当研究所で生育したもの、あるいは種苗会社から購入したものを用いた。目視により適当な完熟種子を約１０〜３０粒選択し（種子の大きさにより異なる）、水道水中にて２５℃で一晩吸水させた。好ましくは、吸水に使用される水道水は、雑菌の繁殖を抑えるために次亜塩素酸ナトリウム水溶液を含む（有効塩素濃度が約０．０１％となるように調整する）。コムギの形質転換植物体作出を目的とした実験においては、この吸水は１０℃で二晩にわたって行った。アグロバクテリウムとして、ＥＨＡ１５０菌を使用した。(Genetic analysis)
If the transgene is confirmed by Southern blot analysis, the plant is further grown and a large number of fully mature seeds are obtained by self-pollination. About 10 seeds are randomly picked from them and cultivated in pots filled with soil. DNA is extracted from the leaves of the young plant, and PCR is performed under the conditions described in the PCR analysis using this DNA as a template.
(Example 1: Transformation of rice plant by the method of the present invention)
(material)
Brown rice of Koshihikari was used as a ripe seed of japonica rice. Agricultural forest No. 61 was used as wheat seeds. As a mature seed of Indica rice, brown rice of IR24 was used. As a Chinese cabbage seed, “Musou” was used. “Fayatté” was used as a soybean seed. As a tomato seed, “Mini Carol” was used. As the morning glory seeds, “Sun Smile White White Wheel” was used. The seeds grown at our laboratory or purchased from a seed company were used. About 10 to 30 appropriate mature seeds were visually selected (depending on the size of the seeds), and water was absorbed overnight at 25 ° C. in tap water. Preferably, the tap water used for water absorption contains an aqueous sodium hypochlorite solution (adjusted so that the effective chlorine concentration is about 0.01%) in order to suppress the growth of various bacteria. In an experiment aimed at producing a transgenic plant of wheat, this water absorption was carried out at 10 ° C. for 2 nights. EHA150 was used as an Agrobacterium.

なお、完熟種子をアグロバクテリウム菌液に浸す時間を長くすることによって、吸水工程に代えることも可能である。   In addition, it is also possible to replace with a water absorption process by lengthening the time which immerses a mature seed in an Agrobacterium liquid.

（種子の滅菌）
７０％エタノールで３０秒、続けて２．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液で２０分間滅菌した後、滅菌水で洗浄した。(Seed sterilization)
The mixture was sterilized with 70% ethanol for 30 seconds and then with a 2.5% sodium hypochlorite solution for 20 minutes, and then washed with sterile water.

（ベクター）
形質転換細胞を選抜するマーカー遺伝子であるハイグロマイシン耐性遺伝子と、形質転換細胞のレポーターとなるＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子をＴ−ＤＮＡ上に有するバイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３９０−ｓＧＦＰ（図１）をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０５菌に形質転換し実験に用いた。(vector)
Agrobacterium tumefaciens EHA105 has a binary vector pCAMBIA1390-sGFP (FIG. 1) having a hygromycin resistance gene which is a marker gene for selecting transformed cells and a GFP (Green Fluorescent Protein) gene serving as a reporter for transformed cells on T-DNA. The fungus was transformed and used for the experiment.

（形質転換）
蒸留水中に懸濁し、ＯＤ６００＝約０．５に調製したアグロバクテリウムを、１時間静置した。次に、３９９５μＬのアグロバクテリウム菌液に、１μＬのＳｉｌｗｅｔ Ｌ−７７および４μＬの１０ｍｇ/ｍｌアセトシリンゴンを添加した。この菌液に種子を入れ、１時間、減圧下（０．０９６ＭＰａ）に置いた。必要に応じて、以下のエレクトロポーレーションを行った。(Transformation)
Agrobacterium suspended in distilled water and adjusted to OD 600 = about 0.5 was allowed to stand for 1 hour. Next, 1 μL of Silwet L-77 and 4 μL of 10 mg / ml acetosyringone were added to 3995 μL of Agrobacterium solution. Seeds were put into this bacterial solution and placed under reduced pressure (0.096 MPa) for 1 hour. The following electroporation was performed as necessary.

（エレクトロポーレーション）
減圧処理の後、シャーレの中の種子と緩衝液をチャンバーに移し、氷上に１分間静置した。そして、実施例に示すように、５０Ｖ／ｃｍの電圧で（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）、パルス幅５０ミリ秒の矩形波（５０マイクロ秒電圧を加え、５０ミリ秒休む周期を繰り返す）、パルス回数９９回行った。さらに氷上にチャンバーを２分間静置した後、緩衝液を捨て、元のシャーレに処理した種子を戻した。この種子を戻したシャーレに、２ｍｌの０．５％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）水溶液を入れた。このＰＶＰ水溶液は、雑菌の繁殖を抑えるために次亜塩素酸ナトリウム水溶液を含んだ（有効塩素濃度が約０．０１％となるように調整した）。シャーレを４℃で約１時間保存した後、２５℃で一晩静置した。(Electroporation)
After the decompression treatment, the seeds and the buffer in the petri dish were transferred to a chamber and left on ice for 1 minute. Then, as shown in the example, at a voltage of 50 V / cm (however, the distance between the electrodes is 1 cm), a rectangular wave having a pulse width of 50 milliseconds (applying a 50 microsecond voltage and repeating a period of resting for 50 milliseconds) The number of pulses was 99. Further, the chamber was allowed to stand on ice for 2 minutes, and then the buffer solution was discarded, and the treated seeds were returned to the original petri dish. 2 ml of a 0.5% polyvinylpyrrolidone (PVP) aqueous solution was placed in the petri dish where the seeds were returned. This PVP aqueous solution contained a sodium hypochlorite aqueous solution in order to suppress the propagation of various bacteria (adjusted so that the effective chlorine concentration was about 0.01%). The petri dish was stored at 4 ° C. for about 1 hour and then allowed to stand at 25 ° C. overnight.

（遺伝子導入後の種子の処理）
アグロバクテリウムによる感染処理の４日後、０．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液に種子を移して、滅菌処理をした。イネについての、アグロバクテリウムによる感染処理後６日目、８日目、および１４日目の結果を図２〜４に示す。コムギについての、アグロバクテリウムによる感染処理後８日目の結果を図５に示す。(Treatment of seeds after gene transfer)
Four days after the infection treatment with Agrobacterium, the seeds were transferred to a 0.5% sodium hypochlorite solution and sterilized. The results of rice on the 6th, 8th, and 14th days after the infection treatment with Agrobacterium are shown in FIGS. FIG. 5 shows the results of wheat on the 8th day after the infection treatment with Agrobacterium.

（ジャポニカイネの結果）
アグロバクテリウムによる処理の６日後（図２）、８日後（図３）、および１４日後（図４）にＧＦＰによる蛍光の観察を行った。アグロバクテリウムとエレクトロポーレーションを組み合わせた遺伝子導入の結果、強い蛍光が確認された（図２Ｂ、図３Ｂ、および図４Ｂの各々の左側の個体）。また、遺伝子導入を行った個体中、約５０％の個体という高い効率でＧＦＰの発現を肉眼で確認した。従来、エレクトロポーレーションのような直接的遺伝子導入法と、アグロバクテリウム法のような間接的遺伝子導入法を組み合わせた例はないが、これらの方法を組み合わせることで、本実施例に示されるように高い効率で、遺伝子導入ができたことは、全く予測され得なかったことである。また、本実施例に示されるような強い発現量も、全く予想されなかったことである。その一方で、減圧処理のみを行った場合は、ＧＦＰの発現は確認されなかった（図２Ｂ、および図３Ｂの各々の右側の個体）。(Results of Japonica rice)
The fluorescence by GFP was observed 6 days after the treatment with Agrobacterium (FIG. 2), 8 days (FIG. 3), and 14 days (FIG. 4). As a result of gene transfer combining Agrobacterium and electroporation, strong fluorescence was confirmed (the individual on the left side of each of FIGS. 2B, 3B, and 4B). In addition, the expression of GFP was confirmed with the naked eye at a high efficiency of about 50% of the individuals into which the gene was introduced. Conventionally, there is no example of combining a direct gene transfer method such as electroporation and an indirect gene transfer method such as the Agrobacterium method, but by combining these methods, as shown in this Example It was impossible to predict that the gene could be introduced with high efficiency. Also, a strong expression level as shown in this example was not expected at all. On the other hand, when only the decompression treatment was performed, the expression of GFP was not confirmed (individuals on the right side of each of FIGS. 2B and 3B).

エレクトロポーレーションを用いずに、減圧処理後にアグロバクテリウムによる感染を行い遺伝子導入を行った場合のＧＦＰ発現量は、エレクトロポーレーションを行った場合と比較して、低かった（図４Ｂの右側の個体）。また、エレクトロポーレーションを用いずに、減圧処理後にアグロバクテリウムによる感染を行い遺伝子導入を行った場合には、約５％の個体において、ＧＦＰの発現を肉眼で確認した。従来のアグロバクテリウム法では、アグロバクテリウムによる感染を行う前に、対象となる細胞（組織）を２，４−Ｄのような植物ホルモンによって処理（前培養）することが必須であると考えられていた。しかし、本実施例の結果は、そのような前培養を必要としない点において、迅速性・簡便性において予測され得なかった顕著な効果を有する。   Without electroporation, the amount of GFP expressed when Agrobacterium infection and gene transfer were performed after the reduced pressure treatment was lower than when electroporation was performed (on the right side of FIG. 4B). individual). In addition, when transfection was performed by Agrobacterium after gene reduction and gene transfer was performed without using electroporation, the expression of GFP was visually confirmed in about 5% of individuals. In the conventional Agrobacterium method, it is essential to treat (pre-culture) the target cells (tissue) with a plant hormone such as 2,4-D before infection with Agrobacterium. It was done. However, the result of this Example has a remarkable effect that could not be predicted in terms of rapidity and simplicity in that it does not require such pre-culture.

（コムギの結果）
エレクトロポレーション後、コムギ種子１００粒をエレクトロポレーション用バッファーと共に６ｃｍシャーレに移し、１０℃暗黒の培養器に入れた。翌日、エレクトロポレーション用バッファーを捨てて、５００ｐｐｍカルベニシリン液を５ｍｌ加えてアグロバクテリウムの除菌を行った。引き続き１０℃暗黒の培養器で育成を続けた。さらに翌日（エレクトロポレーション後２日目）、形質転換体作出を目指してジェネティシンによる選抜を開始した。カルベニシリン液を捨てて、種子を９ｃｍシャーレに移した。７５０ｐｐｍジェネティシン液８ｍｌと×１００ベンレート液を２ｍｌ加えた。ベンレートは殺菌剤（農薬）でカビの発生を予防する目的で添加した。(Wheat result)
After electroporation, 100 wheat seeds were transferred to a 6 cm petri dish together with an electroporation buffer and placed in a 10 ° C. dark incubator. On the next day, the electroporation buffer was discarded, and 5 ml of 500 ppm carbenicillin solution was added to sterilize Agrobacterium. Subsequently, the growth was continued in a dark incubator at 10 ° C. On the next day (second day after electroporation), selection with geneticin was started with the aim of producing transformants. The carbenicillin solution was discarded and the seeds were transferred to a 9 cm petri dish. 8 ml of 750 ppm geneticin solution and 2 ml of x100 benrate solution were added. Benrate was added with a fungicide (agrochemical) to prevent the generation of mold.

シャーレを照明付きの培養器に移して植物体を育成した。その条件は、以下のとおりである：蛍光灯照明 約３０００ルックス、温度１０℃、照明オンを８時間、照明オフを１６時間。   The petri dish was transferred to a lighted incubator to grow plants. The conditions are as follows: Fluorescent lighting approximately 3000 lux, temperature 10 ° C., lighting on for 8 hours, lighting off for 16 hours.

約２週間後に苗条部分にＧＦＰ蛍光が確認できる個体を選び出した、苗条部分にＧＦＰ蛍光が確認できる個体は約５−１０％程度であった。その個体を、土を詰めたポットに移植して育成させ、７個体を得た。これらの個体を、隔離グロスチャンバー内で育成した。   About 2 to 10% of the individuals who were able to confirm GFP fluorescence in the shoot portion were selected after about 2 weeks. The individual was transplanted and grown in a pot filled with soil to obtain 7 individuals. These individuals were grown in an isolated gloss chamber.

その一方で、減圧処理のみを行った場合は、ＧＦＰの発現は確認されなかった（図５中央）。   On the other hand, when only the decompression treatment was performed, the expression of GFP was not confirmed (center of FIG. 5).

従来、エレクトロポーレーションのような直接的遺伝子導入法と、アグロバクテリウム法のような間接的遺伝子導入法を組み合わせた例はないが、これらの方法を組み合わせることで、本実施例に示されるように高い効率で、遺伝子導入ができたことは、全く予測され得なかったことである。また、本実施例に示されるような強い発現量も、全く予想されなかったことである。コムギの形質転換についての技術レベルを考慮すれば、本発明の効果は顕著なものである。   Conventionally, there is no example of combining a direct gene transfer method such as electroporation and an indirect gene transfer method such as the Agrobacterium method, but by combining these methods, as shown in this Example It was impossible to predict that the gene could be introduced with high efficiency. Also, a strong expression level as shown in this example was not expected at all. In view of the technical level of wheat transformation, the effect of the present invention is remarkable.

エレクトロポーレーションを用いずに、減圧処理後にアグロバクテリウムによる感染を行い遺伝子導入を行った場合のＧＦＰ発現量は、エレクトロポーレーションを行った場合と比較して、低かった（図５右）。また、エレクトロポーレーションを用いずに、減圧処理後にアグロバクテリウムによる感染を行い遺伝子導入を行った場合には、約５％の個体において、ＧＦＰの発現を肉眼で確認した。従来のアグロバクテリウム法では、アグロバクテリウムによる感染を行う前に、対象となる細胞（組織）を２，４−Ｄのような植物ホルモンによって処理（前培養）することが必須であると考えられていた。しかし、本実施例の結果は、そのような前培養を必要としない点において、迅速性・簡便性において予測され得なかった顕著な効果を有する。   Without electroporation, the amount of GFP expressed when Agrobacterium infection and gene transfer were performed after the reduced pressure treatment was lower than when electroporation was performed (right side of FIG. 5). In addition, when transfection was performed by Agrobacterium after gene reduction and gene transfer was performed without using electroporation, the expression of GFP was visually confirmed in about 5% of individuals. In the conventional Agrobacterium method, it is essential to treat (pre-culture) the target cells (tissue) with a plant hormone such as 2,4-D before infection with Agrobacterium. It was done. However, the result of this Example has a remarkable effect that could not be predicted in terms of rapidity and simplicity in that it does not require such pre-culture.

（インディカイネの結果）
アグロバクテリウムによる処理の７日後（図６）にＧＦＰによる蛍光の観察を行った。アグロバクテリウムとエレクトロポーレーションを組み合わせた遺伝子導入の結果、強い蛍光が確認された（図６Ｂの左側の個体）。また、遺伝子導入を行った個体中、約６０％の個体という高い効率でＧＦＰの発現を肉眼で確認した。従来、エレクトロポーレーションのような直接的遺伝子導入法と、アグロバクテリウム法のような間接的遺伝子導入法を組み合わせた例はないが、これらの方法を組み合わせることで、本実施例に示されるように高い効率で、遺伝子導入ができたことは、全く予測され得なかったことである。また、本実施例に示されるような強い発現量も、全く予想されなかったことである。従来、インディカイネへの形質転換が困難であったことを考慮すれば、本発明の効果は、顕著なものである。しかも、本実施例の結果は、２，４−Ｄなどを添加した培地を用いる前培養を必要としない点において、迅速性・簡便性において予測され得なかった顕著な効果を有する。(Indicaine results)
The fluorescence by GFP was observed 7 days after the treatment with Agrobacterium (FIG. 6). As a result of gene introduction combining Agrobacterium and electroporation, strong fluorescence was confirmed (individual on the left side of FIG. 6B). In addition, the expression of GFP was confirmed with the naked eye at a high efficiency of about 60% of the individuals into which the gene was introduced. Conventionally, there is no example of combining a direct gene transfer method such as electroporation and an indirect gene transfer method such as the Agrobacterium method, but by combining these methods, as shown in this Example It was impossible to predict that the gene could be introduced with high efficiency. Also, a strong expression level as shown in this example was not expected at all. Considering the fact that transformation into indicaine has been difficult in the past, the effect of the present invention is remarkable. In addition, the results of this example have a remarkable effect that could not be predicted in terms of rapidity and simplicity in that pre-culture using a medium supplemented with 2,4-D or the like is not required.

（ハクサイの結果）
アグロバクテリウムによる処理の４日後（図７）にＧＦＰによる蛍光の観察を行った。アグロバクテリウムとエレクトロポーレーションを組み合わせた遺伝子導入の結果、強い蛍光が確認された（図７Ｂの左側の個体）。また、遺伝子導入を行った個体中、約６０％の個体という高い効率でＧＦＰの発現を肉眼で確認した。従来、エレクトロポーレーションのような直接的遺伝子導入法と、アグロバクテリウム法のような間接的遺伝子導入法を組み合わせた例はないが、これらの方法を組み合わせることで、本実施例に示されるように高い効率で、遺伝子導入ができたことは、全く予測され得なかったことである。また、本実施例に示されるような強い発現量も、全く予想されなかったことである。(Hakusai results)
Four days after the treatment with Agrobacterium (FIG. 7), the fluorescence by GFP was observed. As a result of gene introduction combining Agrobacterium and electroporation, strong fluorescence was confirmed (individual on the left side of FIG. 7B). In addition, the expression of GFP was confirmed with the naked eye at a high efficiency of about 60% of the individuals into which the gene was introduced. Conventionally, there is no example of combining a direct gene transfer method such as electroporation and an indirect gene transfer method such as the Agrobacterium method, but by combining these methods, as shown in this Example It was impossible to predict that the gene could be introduced with high efficiency. Also, a strong expression level as shown in this example was not expected at all.

（ダイズの結果）
アグロバクテリウムによる処理の４日後（図８）にＧＦＰによる蛍光の観察を行った。アグロバクテリウムとエレクトロポーレーションを組み合わせた遺伝子導入の結果、強い蛍光が確認された（図８Ｂの左側の個体）。また、遺伝子導入を行った個体中、約４０％の個体という高い効率でＧＦＰの発現を肉眼で確認した。従来、エレクトロポーレーションのような直接的遺伝子導入法と、アグロバクテリウム法のような間接的遺伝子導入法を組み合わせた例はないが、これらの方法を組み合わせることで、本実施例に示されるように高い効率で、遺伝子導入ができたことは、全く予測され得なかったことである。また、本実施例に示されるような強い発現量も、全く予想されなかったことである。(Result of soybean)
Four days after the treatment with Agrobacterium (FIG. 8), the fluorescence by GFP was observed. As a result of gene introduction combining Agrobacterium and electroporation, strong fluorescence was confirmed (individual on the left side of FIG. 8B). In addition, the expression of GFP was confirmed with the naked eye at a high efficiency of about 40% of the individuals into which the gene was introduced. Conventionally, there is no example of combining a direct gene transfer method such as electroporation and an indirect gene transfer method such as the Agrobacterium method, but by combining these methods, as shown in this Example It was impossible to predict that the gene could be introduced with high efficiency. Also, a strong expression level as shown in this example was not expected at all.

（トマトの結果）
アグロバクテリウムによる処理の４日後（図９）にＧＦＰによる蛍光の観察を行った。アグロバクテリウムとエレクトロポーレーションを組み合わせた遺伝子導入の結果、強い蛍光が確認された（図９Ｂの左側の個体）。また、遺伝子導入を行った個体中、約５０％の個体という高い効率でＧＦＰの発現を肉眼で確認した。従来、エレクトロポーレーションのような直接的遺伝子導入法と、アグロバクテリウム法のような間接的遺伝子導入法を組み合わせた例はないが、これらの方法を組み合わせることで、本実施例に示されるように高い効率で、遺伝子導入ができたことは、全く予測され得なかったことである。また、本実施例に示されるような強い発現量も、全く予想されなかったことである。(Result of tomato)
Four days after the treatment with Agrobacterium (FIG. 9), the fluorescence by GFP was observed. As a result of gene introduction combining Agrobacterium and electroporation, strong fluorescence was confirmed (individual on the left side of FIG. 9B). In addition, the expression of GFP was confirmed with the naked eye at a high efficiency of about 50% of the individuals into which the gene was introduced. Conventionally, there is no example of combining a direct gene transfer method such as electroporation and an indirect gene transfer method such as the Agrobacterium method, but by combining these methods, as shown in this Example It was impossible to predict that the gene could be introduced with high efficiency. Also, a strong expression level as shown in this example was not expected at all.

（アサガオの結果）
アグロバクテリウムによる処理の４日後（図１０）にＧＦＰによる蛍光の観察を行った。アグロバクテリウムとエレクトロポーレーションを組み合わせた遺伝子導入の結果、強い蛍光が確認された（図１０Ｂの左側の個体）。また、遺伝子導入を行った個体中、約５０％の個体という高い効率でＧＦＰの発現を肉眼で確認した。従来、エレクトロポーレーションのような直接的遺伝子導入法と、アグロバクテリウム法のような間接的遺伝子導入法を組み合わせた例はないが、これらの方法を組み合わせることで、本実施例に示されるように高い効率で、遺伝子導入ができたことは、全く予測され得なかったことである。また、本実施例に示されるような強い発現量も、全く予想されなかったことである。(Results of morning glory)
The fluorescence by GFP was observed 4 days after the treatment with Agrobacterium (FIG. 10). As a result of gene introduction combining Agrobacterium and electroporation, strong fluorescence was confirmed (individual on the left side of FIG. 10B). In addition, the expression of GFP was confirmed with the naked eye at a high efficiency of about 50% of the individuals into which the gene was introduced. Conventionally, there is no example of combining a direct gene transfer method such as electroporation and an indirect gene transfer method such as the Agrobacterium method, but by combining these methods, as shown in this Example It was impossible to predict that the gene could be introduced with high efficiency. Also, a strong expression level as shown in this example was not expected at all.

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。   As mentioned above, although this invention has been illustrated using preferable embodiment of this invention, this invention should not be limited and limited to this embodiment. It is understood that the scope of the present invention should be construed only by the claims. It is understood that those skilled in the art can implement an equivalent range based on the description of the present invention and the common general technical knowledge from the description of specific preferred embodiments of the present invention. Patents, patent applications, and documents cited herein should be incorporated by reference in their entirety, as if the contents themselves were specifically described herein. Understood.

簡便かつ迅速な植物形質転換方法が提供される。   A simple and rapid plant transformation method is provided.

簡便な本発明の方法はこの分野の開発研究において重要な大量処理・大量解析を容易にせしめ、ひいては飛躍的な研究の進歩を誘発し、画期的な組換え作物の開発につながる。   The simple method of the present invention facilitates large-scale processing and large-scale analysis important in development research in this field, and as a result, induces dramatic progress in research and leads to the development of innovative recombinant crops.

Claims (49)

核酸を細胞内に導入する方法であって、以下の工程：
ａ）細胞とアグロバクテリクムとを含む懸濁液を減圧下に維持する工程；および
ｂ）前記工程（ａ）の後に、エレクトロポーレーションを行なう工程、
を包含する方法。A method for introducing a nucleic acid into a cell, comprising the following steps:
step to maintain the suspension containing the a) cells with Agrobacterium Riku arm under reduced pressure; Contact and
b ) a step of performing electroporation after the step ( a );
Including the method. 前記減圧下に維持する工程が、０．０９６ＭＰａの減圧下に細胞を維持する工程である、請求項１に記載の方法。Step of maintaining under the reduced pressure is a step of maintaining the cell under a reduced pressure of 0.096MPa, The method of claim 1. 請求項１に記載の方法であって、前記ｂ）工程が、少なくとも二種類の方向で、前記細胞と前記アグロバクテリウムとに電圧パルスをかけることを含む、方法。The method of claim 1, wherein the step b ) comprises applying voltage pulses to the cells and the Agrobacterium in at least two directions. 前記細胞が植物細胞である、請求項１に記載の方法。The method of claim 1, wherein the cell is a plant cell. 前記植物細胞が、植物の休眠組織の細胞である、請求項４に記載の方法。5. The method of claim 4 , wherein the plant cell is a plant dormant tissue cell. 前記植物の休眠組織が種子である、請求項５に記載の方法。6. The method of claim 5 , wherein the plant dormant tissue is a seed. 前記植物の種子が完熟種子である、請求項６に記載の方法。The method of claim 6 , wherein the seed of the plant is a mature seed. 前記植物細胞が、単子葉植物由来である請求項４に記載の方法。The method according to claim 4 , wherein the plant cell is derived from a monocotyledonous plant. 前記単子葉植物がイネ科植物である、請求項８に記載の方法。The method according to claim 8 , wherein the monocotyledonous plant is a gramineous plant. 前記イネ科植物がコムギである、請求項９に記載の方法。The method according to claim 9 , wherein the gramineous plant is wheat. 前記イネ科植物がイネである、請求項９に記載の方法。The method according to claim 9 , wherein the gramineous plant is rice. 前記イネ科植物がトウモロコシである、請求項９に記載の方法。The method according to claim 9 , wherein the gramineous plant is corn. 前記植物細胞が、双子葉植物由来である請求項４に記載の方法。The method according to claim 4 , wherein the plant cell is derived from a dicotyledonous plant. 前記双子葉植物がマメ科植物である、請求項１３に記載の方法。It said dicotyledonous plant is a leguminous plant, a method according to claim 1 3. 前記マメ科植物がダイズである、請求項１４に記載の方法。The legume is soybean, the method according to claim 1 4. 前記双子葉植物がアブラナ科植物である、請求項１３に記載の方法。It said dicotyledonous plant is a crucifer The method of claim 1 3. 前記アブラナ科植物がハクサイである、請求項１６の方法。The method of claim 16 , wherein the cruciferous plant is Chinese cabbage. 前記アブラナ科植物がシロイヌナズナである、請求項１６の方法。The method of claim 16 , wherein the cruciferous plant is Arabidopsis thaliana. 前記双子葉植物がヒルガオ科植物である、請求項１３に記載の方法。It said dicotyledonous plant is a family Convolvulaceae plants The method of claim 1 3. 前記ヒルガオ科植物がアサガオである、請求項１９に記載の方法。20. The method of claim 19 , wherein the Convolvulaceae plant is a morning glory. 前記双子葉植物がナス科植物である、請求項１３に記載の方法。It said dicotyledonous plant is a solanaceous plant, a method according to claim 1 3. 前記ナス科植物がトマトである、請求項２１に記載の方法。The Solanaceae is tomato A process according to claim 2 1. 前記双子葉植物がウリ科植物である、請求項１３に記載の方法。It said dicotyledonous plant is a cucurbits The method of claim 1 3. 前記ウリ科植物がウリである、請求項２３に記載の方法。The Cucurbitaceae is Uri The method according to claim 2 3. 前記アグロバクテリウムが、Agrobacterium tumefaciensである、請求項１に記載の方法。The method according to claim 1, wherein the Agrobacterium is Agrobacterium tumefaciens. 核酸を細胞内に導入した植物を作製する方法であって、以下の工程：
ａ）植物細胞とアグロバクテリクムとを含む懸濁液を減圧下に維持する工程；および
ｂ）前記工程（ａ）の後に、エレクトロポーレーションを行なう工程、
を包含する方法。A method for producing a plant into which a nucleic acid has been introduced into a cell, comprising the following steps:
a) a step of maintaining the suspension containing the plant cells and Agrobacterium Riku arm under reduced pressure; Contact and
b ) a step of performing electroporation after the step ( a );
Including the method. 請求項２６に記載の方法であって、前記植物細胞を、分化、成長および／または増殖させる工程をさらに包含する、方法。27. The method of claim 26 , further comprising the step of differentiating, growing and / or proliferating the plant cell. 請求項２６に記載の方法であって、前記ａ）工程が、前記植物細胞を含む種子とアグロバクテリクムとを含む懸濁液を減圧下に維持する工程を含む、方法。The method according to claim 2 6, comprising the step of said a) step, to maintain the suspension containing the seed and Agrobacterium Riku beam comprising said plant cells under reduced pressure, a method. 前記種子が、単子葉植物の種子である請求項２８に記載の方法。The seed method of claim 2 8 is a monocot seeds. 前記単子葉植物の種子が完熟種子である、請求項２９に記載の方法。30. The method of claim 29 , wherein the monocotyledonous seed is a mature seed. 前記単子葉植物の種子がイネ科の種子である、請求項２９に記載の方法。30. The method of claim 29 , wherein the monocotyledonous seed is a grass seed. 前記イネ科種子がコムギ種子である、請求項３１に記載の方法。The family Gramineae seeds are wheat seeds The method of claim 3 1. 前記イネ科種子がイネ種子である、請求項３１に記載の方法。The family Gramineae seeds are rice seeds The method of claim 3 1. 前記イネ科種子がトウモロコシ種子である、請求項３１に記載の方法。The family Gramineae seeds are corn seeds The method of claim 3 1. 前記種子が、双子葉植物の種子である請求項２８に記載の方法。The seed method of claim 2 8 is a seed of dicotyledonous plants. 前記双子葉植物の種子がマメ科植物の種子である、請求項３６に記載の方法。Seeds of the dicotyledonous plant is a seed of leguminous plants, The method of claim 3 6. 前記マメ科植物がダイズである、請求項３６に記載の方法。The legume is soybean, The method of claim 3 6. 前記双子葉植物の種子がアブラナ科植物の種子である、請求項３５に記載の方法。Seeds of the dicotyledonous plant is a seed of crucifer The method of claim 35. 前記アブラナ科植物がハクサイである、請求項３８の方法。The cruciferous plant is Chinese cabbage The method of claim 3 8. 前記アブラナ科植物がシロイヌナズナである、請求項３８の方法。The cruciferous plant is Arabidopsis method of claim 3 8. 前記双子葉植物の種子がヒルガオ科植物の種子である、請求項３５に記載の方法。Seeds of the dicotyledonous plant is a seed of family Convolvulaceae plants The method of claim 35. 前記ヒルガオ科植物がアサガオである、請求項４１に記載の方法。The family Convolvulaceae plant is morning glory A method according to claim 4 1. 前記双子葉植物の種子がナス科植物の種子である、請求項３５に記載の方法。Seeds of the dicotyledonous plant is a seed of Solanaceae, The method of claim 35. 前記ナス科植物がトマトである、請求項４３に記載の方法。The Solanaceae is tomato A process according to claim 4 3. 前記双子葉植物の種子がウリ科植物の種子である、請求項３５に記載の方法。Seeds of the dicotyledonous plant is a seed of cucurbits The method of claim 35. 前記ウリ科植物がウリである、請求項４５に記載の方法。The Cucurbitaceae is Uri The method of claim 4 5. 自動化して核酸を細胞内に導入する装置であって、該装置は、以下：
ａ）核酸を含むアグロバクテリウムと細胞とを含む混合液を入れる容器；
ｂ）該ａ）の容器中に核酸を含むアグロバクテリウムを入れる手段；
ｃ）該ａ）の容器中に細胞を入れる手段；
ｄ）細胞を減圧下に維持する容器であって、減圧に耐える能力を有する、容器；
ｅ）該細胞を、該ｄ）の容器中に配置する手段；
ｆ）該ｄ）の容器中を、減圧下に維持する手段；
ｇ）エレクトロポーレーションを行なう手段；および
ｈ）該ｂ）、ｃ）、ｅ）、ｆ）、およびｇ）の手段を自動化して実行する手段
を備え、ここで該ｂ）の手段、該ｃ）の手段、および該ｅ）の手段は、同一であるかまたは異なり、そして該ａ）の容器、および該ｄ）の容器は、同一であるかまたは異なる、装置。An apparatus for automated introduction of nucleic acids into cells, the apparatus comprising:
a) a container for containing a mixture containing Agrobacterium containing nucleic acids and cells;
b) means for placing Agrobacterium containing nucleic acid in the container of a);
c) means for placing the cells in the container of a);
d) a container that maintains the cells under reduced pressure and has the ability to withstand the reduced pressure;
e) means for placing the cells in the container of d);
f) means for maintaining in the container of d) under reduced pressure;
g) means for performing electroporation; and h) means for automating the means of b), c), e), f), and g), wherein the means of b), c And the means of e) are the same or different, and the container of a) and the container of d) are the same or different. 前記エレクトロポーレーションを行なう手段が少なくとも２つ以上の対の電極を有する、請求項４７に記載の装置。48. The apparatus of claim 47, wherein the means for performing electroporation comprises at least two or more pairs of electrodes. 前記エレクトロポーレーションを行なう手段が少なくとも３対の電極を有する、請求項４７に記載の装置。48. The apparatus of claim 47, wherein the means for performing electroporation comprises at least three pairs of electrodes.
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