JP4781972B2 - 角層酸化タンパク質の検査方法及びキット - Google Patents
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Description
角層酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識するための蛍光物質を含むゲル;
を含んで成ることを特徴とするキットを供する。
―NHNH2
を有するものが好ましい。そのような蛍光物質の例には、フルオレセイン−5−チオセミカルバジド、テキサスレッドヒドラジド、ルシファーイエローヒドラシド等が挙げられる。
(1)角層試料を例えばテープストリッピングにより、採取する;
(2)前記試料とヒドラジノ基含有蛍光物質を含むゲルとを室温にて約15分間接触させる;
(3)テープをゲルからはがし、蛍光顕微鏡にてテープ表面上の染色された酸化タンパク質を検出する;
(4)任意的に、蛍光顕微鏡撮影する。
健常人の皮膚、例えば非露光部位たる腹部に粘着テープを貼付して直ちにはがし、角層最外層を非侵襲的に採取する。角層の付着したテープを、酸化剤と一定濃度の候補薬剤が混合した水溶液中でインキュベートする。インキュベート終了後に十分に洗浄した後、酸化されたタンパク質の角層酸化タンパク質のカルボニル基を上記のとおり特異的に蛍光標識した後、蛍光顕微鏡などにて観察することで、候補薬剤が、酸化剤による酸化タンパク質の増加をどの程度抑制するかを評価する。評価は、例えば酸化剤のみでインキュベートした時の値と水のみでインキュベートした時の値の中間値まで酸化タンパクの増加を抑制する薬剤の濃度を基準に選定してよく、例えばその濃度が1mM以下、好ましくは500μM以下、より好ましくは250μM以下の場合、酸化タンパク質の増加を抑制する薬剤とすることができる。また、酸化タンパク質の増加を抑制する薬剤の効果は、ヒト皮膚へ酸化剤と同時に塗布した後に採取した角層試料の酸化タンパク質の値に基づき評価することもできる。
健常人の顔面(頬)及び上腕内側の皮膚の表層をエタノールで浄化して皮脂、汚れ等を取り除き、5×5cmに切った粘着テープ片(資生堂社)を皮膚表面の上に軽く載せ、テープ全体に均等な力を加えて平たく押さえ付け、その後均等な力で粘着テープ直ちに剥がし、角層最外層を非侵襲的に採取し、角層試料とした。
3gのアガロース21(ワコー社)を100mlのMESバッファー(pH5.0)(和光純薬社)に添加し、そして良く撹拌した。生じた混合物を電子レンジにおいて、1分間加熱した。加熱された混合物が固まらないうちに、最終濃度が2μMとなるように、蛍光ヒドラジド/DMSO(モレキュラ・プローブ社)を添加し、セットしたガラスケースに混合溶液を流し込み、室温にて30分間冷却して染色用ゲルを調製した。
前記試料中の酸化タンパク質に蛍光ヒドラジドを結合させるために前記の角層が付着したテープを前述のとおり調製した染色用ゲルに接触させ、遮光条件下において、室温で15分間維持して、角層酸化タンパク質を蛍光染色させた。その後テープをゲルからはがし、以下の蛍光測定に備えた。
テープに付着した前述のプロトコルにより蛍光染色された角質試料中の酸化タンパク質を蛍光顕微鏡(オリンパス社)で撮影した(図1)。図1の写真は、前述の染色プロトコルに従う場合、角層試料中の角層酸化タンパク質の蛍光が十分に検出レベルに達していることを示している。一方、角層が付着していないテープのみをゲルに2時間接触させた場合には、蛍光バックグランドは検出されなかった(図2)。
特開2004-340935号公報に開示される方法により調製された、ヒドラジン溶液中で蛍光染色した試料と前述のプロトコルにより蛍光染色した試料を、それぞれインキュベーション時間を15分及び30分として調製し、更にこれらの試料をタバコの煙に暴露させて酸化させた試料と未処理の試料に分けた。またそれぞれの試料は更に、蛍光染色後にPBSでリンス処理された試料とリンス処理なしの試料に分けた。このようにして調製した各試料中のカルボニル化蛋白値をそれぞれ比較した(図3)。従来法(特開2004-340935号公報)と比較して、本願のアガロース染色法において、カルボニル化蛋白値は低値であるが、リンス操作をしない場合であってもその値に対する影響が少なく、そして15分間の反応時間でも検出が可能であることが示された。更にアガロース染色法においては、CV値も15分と30分の反応時間において有意な変化は観察されなかった(図4)。
Claims (6)
- 角層酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に検出するための方法であって、当該方法が、皮膚から採取した角層試料を角層酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識するための蛍光物質を含むゲルに直接接触させる工程、及び当該蛍光を検出する工程、を含んで成る方法。
- 前記接触工程において、室温で5分〜30分間維持される、請求項1に記載の方法。
- 前記蛍光物質がヒドラジノ基含有蛍光物質であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 角層酸化タンパク質の角層上での存在を二次元的に評価する方法に利用するためのキットであって、テープストリッピングにより角層試料を採取するための粘着テープ;及び
角層酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識するための蛍光物質を含むゲル;
を含んで成ることを特徴とするキット。 - 酸化タンパク質の増加を抑制する薬剤のスクリーニング方法であって、適当な酸化を促進する条件において、角層試料を候補薬剤で処理し、しかる後に角層酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識するための蛍光物質を含むゲルに直接接触させ、接触表面上において、試料中の酸化タンパク質のカルボニル基がゲル中の蛍光物質と特異的に結合することにより、角層上の酸化タンパク質が蛍光標識され、その蛍光を検出することで、当該薬剤の酸化タンパク質の増加を抑制する活性を評価することを特徴とする方法。
- 前記蛍光物質がヒドラジノ基含有蛍光物質である、請求項5に記載の方法。
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