JP4779069B2 - Drug sensitivity test medium - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
薬剤感受性試験に使用するための培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床微生物検査では、起因菌の薬剤感受性検査の結果を少しでも迅速に報告することが要求される。しかしながら、微量液体希釈法により最小発育阻止濃度（以下、MICと称する）を測定する場合、正確な結果を得るためには、菌種毎に適切な培地を選択する必要がある。適切な培地を選択する場合、同定検査の終了を待ち、その結果に応じて培地を選択した上で感受性検査を行わなくてはならい。このような段階的な検査を必要とする従来の培地では、十分に迅速な検査結果の報告は期待できない。
【０００３】
現在、一般的に使用される培地は、主に、日本化学療法学会推奨培地（以下、化療培地と略す）と米国臨床検査標準委員会推奨培地（以下、ＮＣＣＬＳ培地と略す）であり、検査する菌種の栄養要求性に応じて、夫々、３種類の培地を用意している。これらのうち、高栄養要求性の菌種の検出用培地には、検査の迅速性を得るために、溶血処理により赤血球を破壊し、そこに含まれる成分を溶出させた血液が使用されている。そのため、培地の透明度が十分ではない。そのため、菌の発育状態の観察が行いにくく、目視判定における個人差が生じ易い。また、吸光度計を使用した場合には、血液添加による培地の着色は、正確な判定を困難する原因となっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記の状況に鑑み、本発明は、全ての菌種に対して良好な発育を保証する薬剤感受性試験用の培地を提供することを目的とする。また、本発明は、透明度の高い薬剤感受性試験用の培地を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明者らは、以下の手段を見出した。即ち、薬剤感受性試験に使用する培地であって、ブロスと、カルシルムイオンおよびマグネシウムイオンと、精製水と、並びに赤色成分および赤血球由来の膜画分を除いた脱線維血とを含有することを特徴とする培地である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の薬剤感受性試験用の培地は、ブロスと、カルシルムイオンと、マグネシウムイオンと、精製水と、並びに赤色成分および赤血球由来の膜画分を除いた脱線維血とを含有することを特徴とする培地である。
【０００７】
本発明で使用するブロスは、一般的に使用される何れのブロスでよいが、日本化学療法学会推奨培地（以下、化療培地と称する）および米国臨床検査標準委員会推奨培地（以下、ＮＣＣＬＳ培地と称する）のＭＩＣ値との相互比較を容易にするため、ミュラーヒントンブロス（ミューラーヒントンブロスまたはミュラーヒントン培地と称することもある。Mueller,et al.:Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,48:330,1941を参照されたい）を使用することが望ましい。本培地中でのブロス含有量は、使用するブロスに応じて適切な濃度で使用すればよい。
【０００８】
カルシウムイオン（Ca²⁺）は、塩化カルシウムとして添加すればよく、添加濃度の例は、本培地中で塩化カルシウムとして５０ｍｇ／Ｌである。また、マグネシウムイオン（Ma²⁺）は、塩化マグネシウムとして添加すればよく、添加濃度の例は、本培地中で塩化マグネシウムとして２５ｍｇ／Ｌである。また、培地の調製に使用される精製水は、一般的に培地に使用する際に使用されるグレードで精製された水を使用すればよい。
【０００９】
赤色成分および赤血球由来の膜画分を除いた脱線維血は、以下のような処理により得られた脱線維血を加熱変性およびフィルタ処理を行うことにより、赤色成分および赤血球由来の膜画分を除くことにより得られる。脱線維血は、ウマおよびウサギ等、何れかの動物から採取した血液に対して、全血中のフィブリンの働きを不活化するためのヘパリン処理を行うことにより、非凝固処理した血液をいう。例えば、ウマ血液である場合、採取した血液にでヘパリン処理し、得られた脱線維血を後述する工程に処することにより、目的とする赤色成分および赤血球由来の膜画分を除いた脱線維血を含有する本培地を得ることが可能である。
【００１０】
実施例にて試験結果を示す通り、本発明の培地は、生血液を添加することなく、栄養要求の厳しい菌、例えば、ヘモフィルス菌、肺炎球菌、ナイセリア菌およびブランハメラ菌等の菌に対しても良好な発育を保証する。ここで「生血液」の語は、血液採取の後に如何なる処理も行っていない血液をいう。また、実施例に詳細に記載するが、何れの栄養要求性の菌の本培地における発育、および薬剤存在下での発育は、化療培地およびＮＣＣＬＳ培地と同等である。
【００１１】
また、本発明の培地は、淡黄色透明である。従って、従来の培地に比較して、菌の発育状態を明瞭に観察することが可能である。従って、観察時の個人差や、吸光度計による判定に誤差が生じにくい。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例を示し本発明を更に説明する。
【００１３】
１．培地の製造方法
（１）少量を調製する方法
少量の本発明の培地を製造する方法の例を図１のスキームを用いて説明する（図１）。精製水を用いてミュラーヒントンブロスを１Ｌ調製し、そこにヘパリン処理したウマ脱線維血液の１００ｍＬを添加する。これを混合した後に、加熱変性し、一部分のタンパク変性を行う。冷却した後に精製水を添加し、更にｐＨ６．６に調整する。これを粗濾過し、更に、０．４５μｍのミリポアフィルタにより濾過滅菌する。次に、予め調製し滅菌した５０ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム溶液と、同様に予め調製し滅菌した２５ｍｇ／Ｌの塩化マグネシウム溶液を添加する。これらを混合した後に、０．４５μｍのミリポアフィルタにより濾過滅菌しながら滅菌した所望の瓶に分注し、冷蔵庫内で保存する。
【００１４】
（２）量産する方法
本発明の培地を量産する方法を例を図２のスキームを用いて説明する（図２）。多量に製造する場合には、ウマ脱線維血液とミュラーヒントンブロスを含有する濃縮液と、その他の成分とを別個に調製して混合する。
【００１５】
まず、濃縮液を調製する。ここでは、例として１０倍濃縮液を調製するが、これに限られるものではない。ミュラーヒントンブロスを、使用時の最終濃度の１０倍濃度予め調製し、これと、ヘパリン処理したウマ脱線維血液の最終濃度の１０倍量とを混合し、加熱変性して粗濾過する。続いて、０．４５μｍのミリポアフィルタにより濾過滅菌する。これを濃厚原液として保存する。また、製品化する場合には、精製水により所望する濃度に希釈して出荷することが好ましい。
【００１６】
上記の濃厚原液を用いて、以下の通り、本培地を調製する。上記濃厚原液を、例えば、１０倍濃縮液であれば、１０倍希釈することにより所望する濃度に希釈する。
【００１７】
予め調製し濾過滅菌した５０ｍｇ／Ｌの塩化カルシウムと、同様に予め調製し滅菌した２５ｍｇ／Ｌの塩化マグネシウム溶液とを添加して混合する。これをｐＨ６．６に調整する。これらを混合して溶解する。上記、希釈した濃厚原液を添加する。これらを混合し、０．４５μｍのミリポアフィルタにより濾過滅菌しながら滅菌した所望の瓶に分注し、冷蔵庫内で保存する。
【００１８】
ここで、濃厚原液の調製において、ミュラーヒントンブロスに代わり、塩化ナトリウム溶液を使用すれば、コストを低くすることが可能である。我々は、塩化ナトリウム溶液を使用して調製した培地を用いて菌株を培養した。この結果、ヘモフィルス属菌、連鎖球菌（腸球菌を除く）、ナイセリア菌、ブランハメラ菌等では発育の得られない菌があった。この理由は、塩化ナトリウム溶液では、ウマ血液から赤血球内の成分が抽出できないので栄養要求の厳しい菌にとっての栄養分が足りないことによると考えられた。即ち、塩濃度の上昇に伴って浸透圧も上昇したため、加熱変性を行っても赤血球がパンクしないのである。従って、この場合、浸透圧を低くして赤血球をパンクさせることが必要である。
【００１９】
また、塩化ナトリウム溶液では、培地の濾過滅菌の工程後で不要物が析出して沈殿が生じる。これにより細菌のための栄養物が減ってしまうため、ヘモフィルス属菌、連鎖球菌（腸球菌を除く）、ナイセリア菌およびブランハメラ菌等で発育が得られない菌が生じるという欠点がある。
【００２０】
２．最小発育阻止濃度測定
（１）実験材料および実験方法
上述の（１）または（２）に示した製造方法により調製した本発明の培地を使用して、最小発育阻止濃度（以下、MICと称す）を測定した。同時に、化療培地およびＮＣＣＬＳ培地を使用しての測定も実施し、夫々の結果を比較した。使用した本発明の培地、化療培地およびＮＣＣＬＳ培地の組成の比較を表１に示す。
【００２１】
【表１】

【００２２】
ここで、化療培地およびＮＣＣＬＳ培地において、各成分は次の通りである。即ち、ミュラーヒントンブロス１Ｌに対して、カルシウムイオン（Ｃａ^２＋）が２０から２５ｍｇ／Ｌ、マグネシウムイオン（Ｍｇ^２＋）が１０から１２．５ｍｇ／Ｌ、ウマ溶血液が５０ｍＬ／Ｌ、酵母エキスが５ｇ／Ｌ、ＮＡＤが１５ｍｇ／Ｌおよびウシ血清１５ｍｇ／Ｌである。また、ウマ溶血液は、赤血球を破壊し、赤血球に含まれる成分を溶出させた血液をいう。
【００２３】
薬剤感受性用標準菌株および臨床分離株は、以下の菌株を使用した。また、菌株名の後の括弧内のＡ、ＢおよびＣの語は、表１の栄養要求性による分類の何れの群に属するかを示す。ここでは、便宜的にＡ群はヘモフィルス菌群を示し、Ｂ群は連鎖球菌群、リステリア菌群、ブランハメラ菌群および腸球群を示し、並びにＣ群はその他の菌種を示す。
【００２４】
薬剤感受性用標準菌株は、ヘモフィールス インフルエンザ(H.influenzae,ATCC49247)(A)、エンテロコッカス フェカーリス(E.faecalis,ATCC29212)(B)、エッシェリヒア コリ(E.coli,ATCC25922)(C)、シュードモナス エルギノーサ(P.aeruginosa,ATCC27853)(C)、スタヒロコッカス アウレウス(S.aureus,ATCC29213)(C)を使用した。
【００２５】
臨床分離株は、ヘモフィールス インフルエンザ(H,influenzae)(A)、ストレプトコッカス ニューモニエ(S.pneumoniae)(B)、リステリア モノサイトゲネス(L.monocytogenes)(B)、ブランハメラ カタラーリス(B.catarrhalis)(B)、エンテロコッカス フェカーリス(E.faecalis)(B)、スタヒロコッカス アウレウス(S.aureus)(C)、スタヒロコッカス エピデルミディス(S.epidermidis)(C)、シュードモナス エルギノーサ(P.aeruginosa)(C)、エッシェリヒア コリ(E.coli)(C)、サイトロバクター フレウンディー(C.freundii)(C)、エンテロバクター クロアカ(E.cloacae)(C)、クレブシエラ ニューモニエ(K.pneumoniae)(C)、セラチア マルセッセンス(S.marcescens)(C)、プロテウス ミラビリス(P.mirabilis)(C)、プロテウス ブルガリス(P.vulgariss)(C)を使用した（以下、夫々の菌種の属名は、その頭文字により表記することもある）。
【００２６】
使用した薬剤は、アンピシリン(ABPC)、チカルシリン(TIPC)、セファゾリン(CEZ)、セフチゾキシム(CZX)、ゲンタマイシン(GM)、イミペネム(IPM)、エリスロマイシン(EM)、ミノサイクリン(MINO)およびクロラムフェニコール(CP)である。ここで、各薬剤名の後の括弧内のアルファベットは夫々の略語であり、以下、これらの略語により記す。各薬剤は、ドライプレート（栄研化学社製）を使用し、夫々の薬剤に応じて０．０３〜３２μｇ／ｍＬの２倍段階希釈を行って各々の培地に溶解した。
【００２７】
菌株の接種は、ＭＩＣ２０００−ＤＰ１００（長瀬産業社製）を用いて行い、培養は、３５℃で１６から２０時間行った。また、判定は、直径１ｍｍ以下の微小コロニーを菌発育マイナスとして行った。
【００２８】
（２）成績
本培地を用いた薬剤感受性標準株のＭＩＣは、化療標準値に対しては、該３培地共に、±１管差以内の範囲内であり、ＭＩＣが１００％で一致した。また、ＮＣＣＬＳ標準値に対しても、同様に±１管差以内で１００％で一致した。
【００２９】
菌種別での、本培地の化療培地に対するＭＩＣ一致率は、B.カタラーリス(B.catarrahalis)で９１．１％であり、H.インフルエンザ(H.influenzae)で９２．８％であり、更に他の菌種では、９７．２から１００％であった。また、ＮＣＣＬＳ培地の化療培地に対するＭＩＣ一致率は、何れの菌株の場合も、９７．４から１００％であった。
【００３０】
菌種別での、本培地のＮＣＣＬＳ培地に対するＭＩＣ一致率は、B.カタラーリス(B.catarrahalis)で９１．１％であり、H.インフルエンザ(H.influenzae)で９３．７％であり、更に他の菌種では、９５．３から９９．７％であった。また、化療培地のＮＣＣＬＳ培地に対するＭＩＣ一致率は、何れの菌株の場合も、９７．４から１００％であった。
【００３１】
薬剤別での化療培地とのＭＩＣ一致率は、本培地およびＮＣＣＬＳ培地、共に、栄養要求性の非常に高いH.インフルエンザで最も低く、特に、本培地においてはＣＥＺを用いた場合の８２．５％、ＮＣＣＬＳ培地においてはＣＥＺを用いた場合の７９．４％が最低であった。更に、その他の薬剤については、８２．８から１００％で一致した。
【００３２】
更に、３種類の培地の発育支持力を比較した。栄養要求の厳しい３菌種について、経時的に菌数測定を行った結果、菌量のピークは、本培地が最も高かった。使用した３菌種は、H.インフルエンザ、B.カタラーリスおよびS.ニューモニエにである。
【００３３】
以上の結果を纏める。本願の薬剤感受性試験用培地における薬剤感受性用標準菌株のＭＩＣは、化療培地およびＮＣＣＬＳの夫々の３培地に対して１００％で一致した。また、菌種別の一致率は、本培地と化療培地を比較した場合、B.カタラーリスで９１．１％であり、ＮＣＣＬＳ培地と化療培地を比較した場合、H.インフルエンザで９１．１％であった。また、薬剤別では、化療培地と、本発明の培地またはＮＣＣＬＳ培地との一致率は、各培地とも、ＣＥＺを使用した場合に、H.インフルエンザに対して最も低く、６５．５から８２．５％であった。
【００３４】
また、全ての判定において、他の何れの推奨培地と比べても、本培地における発育は明瞭であり、判定を容易に行うことができた。これは、本培地が無色透明に近い淡黄色であることによる。これに対して、他の２種類の推奨培地では、対象となる菌種によっては発育が不明瞭なものがありしばしば判定が困難であった。また、他の２種類の標準培地では、テーリング（tailing）現象も観察され、エンドポイントの判定が困難であった。本培地においては、エンドポイントの判定が容易であり、テーリング現象も少なく判定が容易であった。
【００３５】
【発明の効果】
本発明の薬剤感受性試験用培地は、無色透明に近い淡黄色であるため、発育した菌が明瞭に観察できる。更に、テーリング現象も少ないので、日常検査での判定が容易に行うことが可能である。また、種々の栄養要求性の菌株について同様に発育を可能にするため、同定検査の結果を待たずして、感受性検査を開始でき、検査を効率的且つ迅速に行うことが可能である。従って、本発明の薬剤感受性試験用培地は、栄養要求性に影響されることなく種々の菌種に対し、従来の推奨培地に同等またはそれ以上の発育効果を有し、且つ生育した菌を明瞭に観察することが可能である。
【００３６】
更に、酵母エキスやＮＡＤを添加する必要がないため、低コスト化が実現できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本培地を少量で製造する方法を示すスキーム図。
【図２】本培地を多量で製造する方法を示すスキーム図。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a medium for use in a drug sensitivity test.
[0002]
[Prior art]
In clinical microbiology testing, it is required to report the results of drug susceptibility testing of causative bacteria as quickly as possible. However, when measuring the minimum inhibitory concentration (hereinafter referred to as MIC) by the micro liquid dilution method, it is necessary to select an appropriate medium for each bacterial species in order to obtain an accurate result. When selecting an appropriate medium, it is necessary to wait for the end of the identification test, select a medium according to the result, and perform a sensitivity test. With a conventional medium that requires such a step-by-step test, it is not possible to expect a sufficiently rapid report of the test result.
[0003]
Currently, the media that are generally used are mainly the Japan Chemotherapy Society recommended medium (hereinafter abbreviated as chemical medium) and the American Clinical Laboratory Standards recommended medium (hereinafter abbreviated as NCCLS medium). Three types of media are prepared according to the nutritional requirements of the bacterial species. Among these, in order to obtain a rapid examination, the medium for detecting highly auxotrophic bacterial species uses blood that has broken down red blood cells by hemolysis and eluted the components contained therein. . Therefore, the transparency of the medium is not sufficient. Therefore, it is difficult to observe the growth state of the bacteria, and individual differences in visual determination are likely to occur. In addition, when an absorptiometer is used, the coloration of the medium due to the addition of blood is a cause of difficulty in accurate determination.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
In view of the above situation, an object of the present invention is to provide a medium for drug susceptibility testing that ensures good growth for all bacterial species. Moreover, an object of this invention is to provide the culture medium for a drug sensitivity test with high transparency.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present inventors have found the following means. That is, it is a medium used for a drug sensitivity test, and contains broth, calcium and magnesium ions, purified water, and defibrinated blood excluding the red component and red blood cell-derived membrane fraction. It is a characteristic culture medium.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The culture medium for drug sensitivity test of the present invention contains broth, calcium ion, magnesium ion, purified water, and defibrinated blood excluding the red component and the membrane fraction derived from erythrocytes. Medium.
[0007]
The broth used in the present invention may be any broth commonly used. However, the recommended culture medium of the Japanese Chemotherapy Society (hereinafter referred to as chemical medium) and the recommended medium of the American Clinical Laboratory Standards (hereinafter referred to as NCCLS medium). Muller Hinton Broth (Muller Hinton Broth or Müller Hinton Medium.Mueller, et al .: Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 48 : 330,1941) is preferred. What is necessary is just to use the broth content in this culture medium by a suitable density | concentration according to the broth to be used.
[0008]
Calcium ions (Ca ²⁺ ) may be added as calcium chloride, and an example of the addition concentration is 50 mg / L as calcium chloride in this medium. Magnesium ions (Ma ²⁺ ) may be added as magnesium chloride, and an example of the addition concentration is 25 mg / L as magnesium chloride in this medium. Moreover, the purified water used for preparation of a culture medium should just use the water refine | purified by the grade generally used when using for a culture medium.
[0009]
The defibrinated blood excluding the red component and the red blood cell-derived membrane fraction is obtained by subjecting the defibrinated blood obtained by the following treatment to heat denaturation and filtering to obtain a red component and red blood cell-derived membrane fraction. It is obtained by removing. Defibrinated blood refers to blood that has been non-coagulated by subjecting blood collected from any animal such as horses and rabbits to heparinization to inactivate the function of fibrin in whole blood. For example, in the case of horse blood, the collected blood is heparinized, and the resulting defibrinated blood is subjected to the steps described below, thereby removing the desired red component and the red blood cell-derived membrane fraction. It is possible to obtain the present medium containing
[0010]
As shown in the test results in the Examples, the medium of the present invention can be used against bacteria with high nutritional requirements, for example, Haemophilus, pneumococci, Neisseria, and Blanchamella, without adding live blood. Guarantee good growth. Here, the term “live blood” refers to blood that has not undergone any treatment after blood collection. In addition, as described in detail in the Examples, the growth of any auxotrophic bacterium in this medium and in the presence of a drug are equivalent to those of the chemical medium and the NCCLS medium.
[0011]
The medium of the present invention is light yellow and transparent. Therefore, the growth state of the bacteria can be clearly observed as compared with the conventional medium. Therefore, it is difficult for errors to occur in individual differences during observation and determination by an absorptiometer.
[0012]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be further described with reference to examples.
[0013]
1. Method for producing medium (1) Method for preparing a small amount An example of a method for producing a small amount of the medium of the present invention will be described with reference to the scheme of FIG. 1 (FIG. 1). Prepare 1 L of Mueller Hinton broth using purified water, and add 100 mL of heparinized equine defibrinated blood. After mixing this, heat denaturation is carried out, and partial protein denaturation is performed. After cooling, purified water is added to adjust the pH to 6.6. This is roughly filtered and further sterilized by filtration through a 0.45 μm Millipore filter. Next, a 50 mg / L calcium chloride solution prepared and sterilized in advance and a 25 mg / L magnesium chloride solution prepared and sterilized in the same manner are added. After mixing them, they are dispensed into desired bottles sterilized by filtration sterilization through a 0.45 μm Millipore filter and stored in a refrigerator.
[0014]
(2) Method for Mass Production A method for mass production of the medium of the present invention will be described with reference to an example of the scheme of FIG. 2 (FIG. 2). In the case of production in large quantities, a concentrate containing horse defibrinated blood, Muller Hinton broth, and other components are separately prepared and mixed.
[0015]
First, a concentrated solution is prepared. Here, a 10-fold concentrated solution is prepared as an example, but the present invention is not limited to this. Muller Hinton broth is prepared in advance 10 times the final concentration at the time of use, mixed with 10 times the final concentration of heparinized equine defibrinated blood, heat-denatured and coarsely filtered. Subsequently, the solution is sterilized by filtration through a 0.45 μm Millipore filter. This is stored as a concentrated stock solution. Moreover, when commercializing, it is preferable to dilute and ship to the density | concentration desired with purified water.
[0016]
Using the concentrated stock solution, prepare the medium as follows. If the concentrated stock solution is, for example, a 10-fold concentrated solution, it is diluted to a desired concentration by 10-fold dilution.
[0017]
50 mg / L calcium chloride prepared and sterilized by filtration and 25 mg / L magnesium chloride solution prepared and sterilized in the same manner are added and mixed. This is adjusted to pH 6.6. These are mixed and dissolved. Add diluted concentrated stock solution as above. These are mixed and dispensed into desired bottles sterilized by filtration sterilization through a 0.45 μm Millipore filter and stored in a refrigerator.
[0018]
Here, in the preparation of the concentrated stock solution, it is possible to reduce the cost by using a sodium chloride solution instead of Müller Hinton broth. We cultured strains using media prepared using sodium chloride solution. As a result, there were bacteria that could not be developed by Haemophilus spp., Streptococcus (excluding enterococci), Neisseria, and Blanchamella. The reason for this is thought to be that the sodium chloride solution cannot extract the components in the erythrocytes from the horse blood, and thus lacks nutrients for the highly demanding bacteria. That is, since the osmotic pressure also increased with the increase in the salt concentration, the red blood cells did not puncture even after heat denaturation. Therefore, in this case, it is necessary to puncture the red blood cells by lowering the osmotic pressure.
[0019]
Moreover, in a sodium chloride solution, an unnecessary thing precipitates after the process of filter sterilization of a culture medium, and precipitation arises. As a result, nutrients for bacteria are reduced, and there is a disadvantage that bacteria that cannot be grown are generated such as Haemophilus, Streptococcus (excluding enterococci), Neisseria and Blanchamella.
[0020]
2. Minimum Growth Inhibitory Concentration Measurement (1) Experimental Material and Experimental Method Minimum growth inhibitory concentration (hereinafter referred to as MIC) using the medium of the present invention prepared by the production method shown in (1) or (2) above Was measured. At the same time, measurements using chemical treatment medium and NCCLS medium were also performed, and the results were compared. Table 1 shows a comparison of the composition of the medium of the present invention, chemical medium and NCCLS medium used.
[0021]
[Table 1]

[0022]
Here, in the chemical treatment medium and the NCCLS medium, each component is as follows. That is, for 1 L of Mueller Hinton broth, calcium ion (Ca ²⁺ ) is 20 to 25 mg / L, magnesium ion (Mg ²⁺ ) is 10 to 12.5 mg / L, horse hemolyzed blood is 50 mL / L, and yeast extract is 5 g. / L, NAD 15 mg / L and bovine serum 15 mg / L. Further, equine hemolyzed blood refers to blood in which red blood cells are destroyed and components contained in the red blood cells are eluted.
[0023]
The following strains were used as standard strains and clinical isolates for drug sensitivity. In addition, the words A, B and C in parentheses after the strain name indicate which group in the classification according to auxotrophy in Table 1. Here, for convenience, the A group represents a Haemophilus group, the B group represents a streptococcal group, a Listeria group, a Blanchamella group, and an intestinal group, and the C group represents other species.
[0024]
Standard strains for drug sensitivity include Haemophilus influenzae (H. influenzae, ATCC 49247) (A), Enterococcus faecalis (ATCC29212) (B), Escherichia coli (E. coli, ATCC25922) (C), Pseudomonas aeruginosa (P) .aeruginosa, ATCC 27853) (C) and S. aureus, ATCC 29213 (C).
[0025]
Clinical isolates include Haemophilus influenzae (A), Streptococcus pneumoniae (B), L. monocytogenes (B), B. catarrhalis (B) , Enterococcus faecalis (B), S. aureus (C), S. epidermidis (C), P. aeruginosa (C), Escherichia E. coli (C), Cytolobacter Freundi (C), Enterobacter cloacae (C), Klebsiella pneumoniae (C), Serratia marcescens (S) .marcescens) (C), Proteus mirabilis (C), and Proteus bulgaris (C) (Hereafter, the genus name of each bacterial species is expressed by its initials. Sometimes).
[0026]
The drugs used were ampicillin (ABPC), ticarcillin (TIPC), cefazolin (CEZ), ceftizoxime (CZX), gentamicin (GM), imipenem (IPM), erythromycin (EM), minocycline (MINO) and chloramphenicol ( CP). Here, the alphabets in parentheses after each drug name are respective abbreviations, and are hereinafter referred to by these abbreviations. Each drug was dissolved in each medium by using a dry plate (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) and performing 2-fold serial dilution of 0.03-32 μg / mL according to each drug.
[0027]
Inoculation of the strain was performed using MIC2000-DP100 (manufactured by Nagase Sangyo Co., Ltd.), and the culture was performed at 35 ° C. for 16 to 20 hours. In addition, the determination was made with a micro colony having a diameter of 1 mm or less as a bacterial growth minus.
[0028]
(2) Results The MIC of the drug-sensitive standard strain using this medium was within the range of ± 1 tube difference with respect to the chemical standard value, and the MIC was consistent with 100%. Similarly, the NCCLS standard value also agreed with 100% within ± 1 tube difference.
[0029]
The MIC concordance rate of this medium to the treatment medium for each type of bacteria is 91.1% for B. catarrahalis, 92.8% for H. influenzae, and others. In the microbial species, it was 97.2 to 100%. In addition, the MIC agreement rate of the NCCLS medium with the chemical treatment medium was 97.4 to 100% in all the strains.
[0030]
The MIC concordance rate of this medium to NCCLS medium by bacteria type is 91.1% for B. catarrahalis, 93.7% for H. influenzae, and others. In 9 to 99.7% of the bacterial species. Moreover, the MIC agreement rate with respect to the NCCLS culture medium of the chemical treatment medium was 97.4 to 100% in any strain.
[0031]
The MIC agreement rate with the chemical medium for each drug is the lowest in H. influenza with extremely high auxotrophy in both this medium and NCCLS medium, and in particular, 82.5 when CEZ was used in this medium. In NCCLS medium, 79.4% was the lowest when CEZ was used. In addition, for other drugs, there was a match between 82.8 and 100%.
[0032]
Furthermore, the growth support ability of the three types of media was compared. As a result of measuring the number of bacteria over time for three bacterial species with strict nutritional requirements, the peak of the amount of bacteria was the highest in this medium. The three species used are H. influenza, B. catarrhalis and S. pneumoniae.
[0033]
The above results are summarized. The MIC of the standard strain for drug susceptibility in the drug susceptibility test medium of the present application was 100% consistent with each of the three mediums of the chemical medium and NCCLS. In addition, the concordance rate of the bacterial type was 91.1% for B. catarrhalis when this medium and the chemical medium were compared, and 91.1% for H. influenza when NCCLS medium and the chemical medium were compared. It was. In addition, by drug, the concordance rate between the chemical medium and the medium of the present invention or the NCCLS medium is the lowest for H. influenza when CEZ is used, and 65.5 to 82.5. %Met.
[0034]
In all the determinations, the growth in this medium was clear compared to any other recommended medium, and the determination was easy. This is due to the fact that this medium is a pale yellow that is almost colorless and transparent. On the other hand, in the other two types of recommended media, the growth was unclear depending on the target bacterial species, and the determination was often difficult. Further, in the other two types of standard media, a tailing phenomenon was also observed, and it was difficult to determine the end point. In this culture medium, the determination of the end point was easy, and the tailing phenomenon was small and the determination was easy.
[0035]
【The invention's effect】
Since the drug sensitivity test medium of the present invention is a pale yellow color that is nearly colorless and transparent, the grown bacteria can be clearly observed. Further, since there is little tailing phenomenon, it is possible to easily make a judgment in daily inspection. In addition, since various auxotrophic strains can be similarly grown, the sensitivity test can be started without waiting for the result of the identification test, and the test can be performed efficiently and quickly. Therefore, the drug susceptibility test medium of the present invention has a growth effect equal to or greater than that of the conventional recommended medium for various bacterial species without being affected by auxotrophy, and clearly shows the grown bacteria. It is possible to observe.
[0036]
Furthermore, since it is not necessary to add yeast extract or NAD, cost reduction can be realized.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing a method for producing the present medium in a small amount.
FIG. 2 is a schematic diagram showing a method for producing this medium in a large amount.

Claims (7)

薬剤感受性試験に使用する培地であって、ブロスと、カルシルムイオンおよびマグネシウムイオンと、精製水と、並びに加熱変性およびフィルタ処理を行って赤色成分および赤血球由来の膜画分を除いた脱線維血とを含有することを特徴とする培地。A medium used for drug susceptibility testing, including broth, calcium and magnesium ions, purified water, and heat-denatured and filtered to remove red components and red blood cell-derived membrane fractions A medium characterized by comprising: 薬剤感受性試験に使用する培地であって、赤色成分および赤血球由来の脱線維血に、加熱変性およびフィルタ処理を行うことにより膜画分を除いた栄養成分を抽出することと、この抽出液から抽出残渣を除去することと、および得られた透明な液体と、ブロス並びに塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含有する水溶液とを混合し、透明な培地を得ることとを具備する製造方法により製造した培地。This is a medium used for drug susceptibility testing. Extraction of nutrient components from the red component and red blood cell-derived defibrinated blood by heat denaturation and filtering to remove the membrane fraction and extraction from this extract A medium produced by the production method comprising removing a residue, and mixing the obtained transparent liquid with an aqueous solution containing broth and calcium chloride and magnesium chloride to obtain a transparent medium. 前記脱線維血が血液をヘパリン処理することにより得られる請求項１または２に記載の培地。  The medium according to claim 1 or 2, wherein the defibrinated blood is obtained by heparinizing blood. 前記ブロスがミューラーヒントブロスである請求項１〜３の何れか１項に記載の培地。  The culture medium according to any one of claims 1 to 3, wherein the broth is a Mueller hint broth. 前記血液がウマ血液である請求項１〜４の何れか１項に記載の培地。  The medium according to any one of claims 1 to 4, wherein the blood is horse blood. 前記薬剤感受性試験が、最小発育阻止濃度を測定することにより試験である請求項１〜５の何れか１項に記載の培地。  The culture medium according to any one of claims 1 to 5, wherein the drug sensitivity test is a test by measuring a minimum growth inhibitory concentration. 被検薬剤を含ませた請求項１〜６の何れか１項に記載の培地に被検菌を接種および培養し、当該菌のコロニーの大きさを測定することにより薬剤感受性を判定することを具備する最小発育阻止濃度を測定する方法。  7. Inoculating and culturing a test bacterium on the medium according to any one of claims 1 to 6 containing a test drug, and determining the drug sensitivity by measuring the size of the colony of the bacterium. A method for measuring the minimum growth inhibitory concentration provided.

Images