JP4778629B2 - Collagen degradation accelerator - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はコンドロイチナーゼの新規な用途に関する。より詳細には、コンドロイチナーゼを含有するコラゲナーゼ産生促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コンドロイチナーゼは、コンドロイチン硫酸（以下、「ＣＳ」ともいう）の分解を触媒する酵素である。コンドロイチナーゼには種々の種類が知られており、例えばコンドロイチナーゼＡＢＣ(chondroitinase ABC)〔EC 4.2.2.4〕は、哺乳動物軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ａ、鮫軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｃ及び哺乳動物皮膚由来のコンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）の分解を強力に触媒し、ヒアルロン酸（以下「ＨＡ」ともいう）の分解を弱く触媒する酵素である。
【０００３】
一方、椎間板ヘルニアは、椎間板内の髄核の突出等に起因する疾患であり、突出した髄核が付近の神経を刺激するために、腰痛等の症状が現れる。
近年、コンドロイチナーゼを椎間板に投与して突出した髄核を融解して椎間板ヘルニアを治療する方法が試みられている〔米国特許4696816号明細書、Clinical Orthopaedics, 253,301-308(1990)〕。
【０００４】
Ｓｐｉｎｅ（１９９６年）第２１巻、第２４０５−２４１１頁には、コンドロイチナーゼＡＢＣを椎間板に注入して髄核を融解し、融解前後の組織の乾燥重量を比較したところ、「融解処理による組織の減少量」が「組織に含有されるＣＳ等の重量」を上回るという現象が観察され、タンパク質分解の可能性が示唆されることが記載されている。ところがカゼインの分解活性によりタンパク質分解を評価したところ、これを裏付ける結果は得られず、結局その原因は不明のままである旨が記載されている。
【０００５】
また、Ｓｐｉｎｅ（１９９７年）第２２巻、第１０６５−１０７３頁には、椎間板の変性やヘルニアに、マトリックスメタロプロテイナーゼが関与している旨が記載されている。さらに、コラゲナーゼはマトリックスメタロプロテイナーゼの一種であることが知られている。
【０００６】
しかしコンドロイチナーゼがコラゲナーゼの産生を促進することについては知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、コンドロイチナーゼ、特にコンドロイチナーゼＡＢＣの新規な用途、具体的にはコラゲナーゼ産生促進剤を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、コンドロイチナーゼを含有するコラゲナーゼ産生促進剤（以下、「本発明促進剤」ともいう）、及び本発明促進剤からなる医薬（以下、「本発明医薬」ともいう）を提供するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）コンドロイチナーゼを含有する、コラゲナーゼ産生促進剤。
（２）コンドロイチナーゼが、コンドロイチナーゼＡＢＣである、（１）に記載の促進剤。
（３）（１）又は（２）に記載の促進剤からなる医薬。
（４）椎間板又は脊髄硬膜外腔投与用の（３）に記載の医薬。
【００１０】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明促進剤に用いるコンドロイチナーゼ
本発明促進剤に用いることができるコンドロイチナーゼは、ＣＳを分解する酵素である限りにおいて特に限定されるものではない。コンドロイチナーゼとして、具体的には、コンドロイチナーゼＡＢＣ（Proteus vulgaris由来；特開平６−１５３９４７号公報、T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, S. Suzuki,J. Biol. Chem., 243, 1523(1968)、S. Suzuki, H. Saito, T. Yamagata, K. Anno, N. Seno, Y. Kawai, T. Furuhashi, J. Biol. Chem., 243, 1543(1968))、コンドロイチナーゼＡＣ(Flavobacterium heparinum由来；T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523(1968))、コンドロイチナーゼＡＣII(Arthrobacter aurescens由来；K. Hiyama, S. Okada, J. Biol.Chem.,250, 1824 (1975)、K. Hiyama, S. Okada, J. Biochem.(Tokyo), 80, 1201(1976))、コンドロイチナーゼＡＣIII(Flavobacterium sp. Hp102由来；宮園博文、菊池博、吉田圭一、森川清志、徳安清親、生化学、61、1023(1989))、コンドロイチナーゼＢ(Flavobacterium heparinum由来；Y. M. Michelacci, C. P.Dietrich, Biochem. Biophys. Res. Commun.,56, 973(1974)、Y. M. Michelacci, C. P. Dietrich, Biochem. J., 151, 121(1975)、前山賢一、多和田明、上野暁子、吉田圭一、生化学、57, 1189(1985))、コンドロイチナーゼＣ(Flavobacterium sp. Hp102由来；宮園博文、菊池博、吉田圭一、森川清志、徳安清親、生化学、61、1023(1989))等が知られており、これらのコンドロイチナーゼのいずれをも用いることができる。また、特開平９−１６８３８４号公報に記載されているヒト由来のコンドロイチン硫酸分解酵素や、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼ(chondroitin sulfate ABC exolyase； A. Hamai, N. Hashimoto, H. Mochizuki, F. Kato, Y. Makiguchi, K. Horie and S. Suzuki, J. Biol. Chem.,272, 9123-9130(1997))等のコンドロイチナーゼも、本発明促進剤に用いることができる。
【００１１】
これらの各種コンドロイチナーゼはあくまで例示であり、本発明促進剤で用いることができるコンドロイチナーゼはこれらに限定されるものではない。なお、本発明促進剤において用いるコンドロイチナーゼは、１種類のコンドロイチナーゼであってもよく、あるいは複数種のコンドロイチナーゼの組み合わせであってもよく、本明細書において単に「コンドロイチナーゼ」といった場合には、これら両方の意味を包含する。
【００１２】
本発明促進剤に用いるコンドロイチナーゼとして、コンドロイチナーゼＡＢＣを用いることが極めて好ましい。また、コンドロイチナーゼＡＢＣの中でも、特に、Proteus vulgaris由来のコンドロイチナーゼＡＢＣを用いることが好ましい。
【００１３】
ここでコンドロイチナーゼの由来とは、当該コンドロイチナーゼをコードする遺伝子を元来保有する生物を起源とすることをいう。従って、例えばProteus vulgaris由来のコンドロイチナーゼＡＢＣとは、Proteus vulgarisが元来保有する遺伝子によって産生されるコンドロイチナーゼＡＢＣを意味する。よって、Proteus vulgaris由来のコンドロイチナーゼＡＢＣには、Proteus vulgaris自体により産生されるものはもちろん、Proteus vulgarisから取得されたコンドロイチナーゼＡＢＣ遺伝子を利用して他の細胞で産生させたもの等も含まれる。
【００１４】
本発明促進剤に用いるコンドロイチナーゼの純度は特に限定されず、使用の目的等に応じて適宜選択することができる。例えば、本発明促進剤を後述の「本発明医薬」とする場合には、用いるコンドロイチナーゼは、医薬として使用できる程度に精製され、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まない酵素であることが好ましい。
【００１５】
例えば本発明促進剤に用いるコンドロイチナーゼは、300U/mg蛋白以上の比活性を有する精製されたコンドロイチナーゼであることが好ましく、300U/mg蛋白以上の比活性を有し、エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、プロテアーゼ含量が検出限界以下である精製されたコンドロイチナーゼがより好ましく、このような特性をもつ精製されたコンドロイチナーゼＡＢＣが特に好ましい。
【００１６】
なお、本明細書においてコンドロイチナーゼの１Ｕ(単位)は、至適ｐＨ及び至適温度付近の条件において、ＣＳから１分間に１マイクロモルの反応生成物を遊離させる酵素量である。念のため、以下に各種コンドロイチナーゼの１Ｕの定義を示す。
【００１７】
コンドロイチナーゼＡＢＣの１Ｕとは、pH8.0、37℃で１分間にコンドロイチン 6-硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。またコンドロイチナーゼＡＣ(Flavobacterium heparinum由来)の１Ｕとは、pH7.3、37℃で１分間にコンドロイチン 6-硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。
【００１８】
また、コンドロイチナーゼＡＣII(Arthrobacter aurescens由来)の１Ｕとは、pH6.0、37℃で１分間にコンドロイチン 6-硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。
【００１９】
また、コンドロイチナーゼＢ(Flavobacterium heparinum由来)の１Ｕとは、pH8.0、30℃で１分間にデルマタン硫酸から１マイクロモルのヘキスロン酸残基に相当するUV吸収物質を遊離させる酵素量と定義される。
【００２０】
例えば、比活性が300U/mg蛋白以上であるコンドロイチナーゼＡＢＣを使用することにより、本発明促進剤を本発明医薬（後述）として生体内に投与した際にも目的部位のプロテオグリカン（ＣＳやＨＡを含む）を効率的に分解することができ、かつ、コラゲナーゼ産生を効果的に促進することができる。このようなコンドロイチナーゼＡＢＣは、例えば、特開平６−１５３９４７号公報に記載の方法で得ることができる。
【００２１】
＜２＞本発明促進剤の形態等
本発明促進剤は、上記のようなコンドロイチナーゼを、コラゲナーゼの産生を促進するために有効な量含有する。ここで「コラゲナーゼの産生を促進するために有効な量」とは、コラゲナーゼの産生の促進を検知可能な程度とすることができる量を意味する。この量は、用いるコンドロイチナーゼの種類、コラゲナーゼの産生を企図する細胞や組織等（以下、単に「組織等」という）の種類や状態、組織等が由来する哺乳動物の種類や症状等によっても異なるものであり、当業者が適宜決定することができるが、例えばコンドロイチナーゼとしてコンドロイチナーゼＡＢＣを用い、健常なウサギから摘出した椎間板組織においてコラゲナーゼの産生を促進せしめる場合には、当該組織を０．０１〜１０００Ｕ/ｍｌ程度の酵素溶液に接触させることによって、コラゲナーゼの産生を促進することができる。
【００２２】
例えば、１回の投与に用いられる本発明促進剤中のコンドロイチナーゼＡＢＣの含量としては５Ｕ以上が例示され、５〜４００Ｕ程度がより好ましく、５〜２００Ｕ程度がさらに好ましい。
【００２３】
本発明促進剤は、コンドロイチナーゼ以外に、さらに医薬的あるいは試薬的に許容される担体を含有していてもよい。
このような担体としては、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤等、通常医薬あるいは試薬に用いられる成分が例示され、使用の目的や、本発明促進剤の形態（剤型等）に応じて適宜選択することができる。例えば本発明促進剤は、溶液状態、凍結状態、乾燥形態のいずれの形態であってもよいが、保存安定性等の面では乾燥形態、特に凍結乾燥形態が好ましい。
【００２４】
本発明促進剤中に含有させることができる担体としては、特開平１１−２３６３３６号公報に記載されているものを採用することが好ましい。本発明促進剤の調製は、コンドロイチナーゼと所望の担体を用い、製剤学的に公知の方法により行なうことができる。
【００２５】
＜３＞本発明促進剤の使用方法等
本発明促進剤は、組織等のコラゲナーゼの産生促進を目的として使用することができる。かかる使用目的が意図される限りにおいて、本発明促進剤の具体的な用途は限定されず、試薬用途・医薬用途のいずれにも使用することができる。また具体的な用途に応じて、使用方法等を適宜決定することができる。
【００２６】
試薬用途として使用する場合には、例えば、生体から分離された組織等に本発明促進剤を接触させ、コラゲナーゼの産生を促進せしめることができる。また医薬用途として使用する場合については、後述の「本発明医薬」において詳細に説明する。
【００２７】
＜４＞本発明医薬
本発明医薬は本発明促進剤からなる医薬であり、本発明促進剤を医薬用途に応用したものである。本発明医薬は、本発明促進剤の医薬用途への使用が意図される限りにおいて、その具体的な使用方法等も限定されず、具体的な目的に応じて適宜決定することができる。
【００２８】
本明細書中で「医薬」とは、医療に用いられる薬品を意味する。従って、医療に用いられる薬品である限りにおいては、名称の如何にかかわらず、ここでいう「医薬」に包含される。
【００２９】
本発明医薬は、コラゲナーゼの産生の促進が望まれる組織等に投与することにより、本発明医薬に含有されるコンドロイチナーゼの作用が発揮され、当該組織及び周辺組織のコラゲナーゼの産生を促進することができる。
【００３０】
本発明医薬は、ヒトを含む哺乳類全般に投与することができるが、ヒトに投与されるものであることが特に好ましい。
本発明医薬が投与される組織等は、コラゲナーゼの産生促進を所望する組織である限りにおいて特に限定されないが、産生されたコラゲナーゼの作用によるコラーゲン等のタンパク質分解が望まれる組織であることが好ましく、産生されたコラゲナーゼの作用によるタンパク質分解に加えてコンドロイチナーゼ本来の作用によるＣＳ及び/又はＨＡの分解が望まれる組織であることが好ましい。
【００３１】
このような組織等として好ましいのは、椎間板ヘルニアに罹患した哺乳動物の椎間板組織、あるいは硬膜外遊走型椎間板ヘルニアや経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアに罹患した哺乳動物の脊髄硬膜外腔である。従って本発明医薬は、椎間板又は脊髄硬膜外腔投与用とすることが好ましい。
【００３２】
本発明医薬をこのような椎間板組織等に投与することにより、コンドロイチナーゼ本来の作用によって髄核中のＣＳやＨＡが分解され、髄核中のＣＳ量、ＨＡ量及びこれらによって保持されていた水分量が減少し、その結果として髄核自体の体積を減ずることができるのみならず、コンドロイチナーゼによって産生が促進されたコラゲナーゼの作用によって髄核自体やその周辺部位のコラーゲン等のタンパク質の分解を促進することができることから、髄核自体の体積をさらに減ずることができ、加えて髄核が納まるスペースをも増加させることができる。この結果、突出した髄核による神経への刺激を速やかに除去することができ、腰痛等の椎間板ヘルニアの諸症状を効果的に改善することができる。
尚、後記実施例に示した結果では、コンドロイチナーゼＡＢＣの投与によるコラゲナーゼ産生促進は、髄核組織よりも線維輪組織において顕著であったが、髄核にコンドロイチナーゼを投与した場合であっても、コンドロイチナーゼは線維輪にも拡散し、線維輪内でコラゲナーゼ産生が促進され、この産生されたコラゲナーゼが髄核にも拡散して、髄核の融解が促進されると考えられる。
【００３３】
従って本発明医薬は、椎間板ヘルニアの処置（症状の改善、悪化防止、治療等）のために用いられるものであることが好ましい。
また本発明医薬はコラゲナーゼの産生を促進することから、線維症等のコラーゲン増加に起因する疾患の処置にも用いることができる。
【００３４】
このような本発明医薬は、コンドロイチナーゼを含有する注射用製剤として主に使用される。本発明医薬を溶液状態の注射用製剤として提供する場合には、溶液状態の本発明医薬を、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、そのまま流通させあるいは保存し、注射剤として投与に供することができる。また凍結状態の注射用製剤として提供する場合には、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器中に凍結状態の本発明医薬を密封状態で保持させて、流通させあるいは保存し、投与前に融解させて注射剤として投与に供することができる。また、本発明医薬を乾燥形態の注射用製剤として提供する場合には、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器中に乾燥状態の本発明医薬を密封状態で保持させて、流通させあるいは保存し、投与前に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液又はソルビトール水溶液等で溶解し、注射剤として投与に供することができる。乾燥形態の本発明医薬は、溶解用の溶媒とセットで提供してもよい。このような種々の形態の注射用製剤の中でも、乾燥形態、特に凍結乾燥形態のものが好ましい。すなわち、本発明医薬は注射用凍結乾燥製剤の形態であることが特に好ましい。
【００３５】
本発明医薬の投与量は、用いるコンドロイチナーゼの種類、投与される哺乳動物の種類や症状等、投与対象となる組織等の種類やその状態等によって個別に設定されるべきものであり、特に限定されないが、例えばコンドロイチナーゼとしてコンドロイチナーゼＡＢＣを用い、成人の椎間板ヘルニア症患者の椎間板１箇所に投与する場合、１回あたりコンドロイチナーゼＡＢＣの量として概ね０．１〜２００Ｕ程度、好ましくは０．５〜１００Ｕ程度、特に好ましくは０．５〜 ５０Ｕ程度を投与することができる。
【００３６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。
【００３７】
以下の実施例では、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の一種であるゼラチナーゼ（MMP-2、MMP-9）及びコラゲナーゼの産生に対するコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｃ−ＡＢＣ）の効果を、インビトロで検討した。
【００３８】
Ｃ−ＡＢＣがインビボで椎間板内注射されると、椎間板細胞は、周囲のマトリックス内でのＣＳの分解という変化によって活性化されることが知られている（Clin Orthop, 253, 301-308(1990)）。以下の実施例では、培養組織中の細胞を活性化してよりインビボに近い細胞状態を再現するための刺激剤として、ＩＬ−１を用いた。
【００３９】
＜１＞椎間板組織の培養
（１）組織の調製
新鮮な線維輪及び髄核を、６匹の雌の日本白ウサギ（３．８〜４．４Ｋｇ）の腰椎椎間板（Ｌ１−Ｌ２及びＬ５−Ｌ６間）から切開して得た。各ウサギから得た椎間板組織は、異なる群に割り当てた。各群それぞれ６つの線維輪又は髄核を用いた。２５ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸及び１０％のウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（日水製薬、東京、日本）を、完全培地として用いた。各組織を生理的食塩水で洗浄し、完全培地（線維輪：２ｍｌ、髄核：１ｍｌ）で満たされたカルチャープレート（線維輪：１２ウェルプレート、髄核：２４ウェルプレート）の各ウェルに入れた。
【００４０】
（２）培養手順
用意された組織は、３７℃で５％ ＣＯ₂ガス中で、培地を毎日交換する４日間の予備培養及び３日間の連続培養でからなる７日間の培養を行った。高純度精製医薬品グレードのＣ−ＡＢＣ（生化学工業株式会社製；比活性３８０Ｕ／ｍｇ蛋白、エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、プロテアーゼ含量は検出限界以下）、及び市販の組み換えヒトインターロイキン−１ｂ（ＩＬ−１ｂ）（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ、米国）を、培地への添加物として使用した。各組織は、１日目は完全培地のみで培養した。以下に示すＣ−ＡＢＣ群及びＩＬ−１＋ＡＢＣ群においては、２〜４日目に２０Ｕ／ｍｌの濃度でＣ−ＡＢＣを添加した。
【００４１】
続いて、各組織をリン酸緩衝生理食塩水及び上記血清フリー培地ですすいだ。培地を各々、何も含まない（コントロール群）、２０Ｕ／ｍｌ濃度のＣ−ＡＢＣを含む（Ｃ−ＡＢＣ群）、１０ｎｇ／ｍｌ濃度のＩＬ−１を含む（ＩＬ−１群）、又は１０ｎｇ／ｍｌ濃度のＩＬ−１及び２０Ｕ／ｍｌ濃度のＣ−ＡＢＣを含む（ＩＬ−１＋Ｃ−ＡＢＣ群）無血清培地に交換した。さらに、各組織を７２時間培養した後、培地及び組織を採収した。
【００４２】
＜２＞採収した組織の乾燥重量の統計学的分析
採収した組織を凍結乾燥し、乾燥重量を測定した。ダンネットの多重比較検定（Dunnett's multiple comparison test）を用いて、コントロール群及び他の群との間の統計学的分析を行った。
【００４３】
結果を表１に示す。各群間で統計学的な有意差はなかった。したがって、コラゲナーゼの値を乾燥重量によって標準化して差し支えない。
【００４４】
【表１】

【００４５】
＜３＞マトリックスメタロプロテイナーゼの検出
（１）培地中のゼラチナーゼの検出
ゼラチナーゼは、ザイモグラフィー法を用いて、以下のように検出した。培地の一部を用いて、０．１％のゼラチンを含むポリアクリルアミドゲルを用いて非還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルを２．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００で洗浄し、ＣａＣｌ₂及びＺｎＣｌ₂を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．５）中で２２時間、３７℃でインキュベートした。その後、ゲルをクマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色し、ゼラチン分解性のバンドを可視化した。スタンダードとして、ヒトのｐｒｏＭＭＰ−２（ＭＭＰ−２の前駆体）及びｐｒｏＭＭＰ−９（ＭＭＰ−９の前駆体）（ノヴァス モレキュラー、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）を、同じゲルの１レーンに添加した。
【００４６】
結果を図１に示す。線維輪については、いずれの群においても同程度ｐｒｏＭＭＰ−２（６６ｋＤａ）の産生が見られた。ＩＬ−１は高分子量のゼラチン分解性の産物（１０７ｋＤａ、上部矢印）を誘導した（ＩＬ−１群）。しかしながら、Ｃ−ＡＢＣではその誘導は見られず、低分子量のゼラチン分解性の産物（５６ｋＤａ、下部矢印）を誘導した（ＩＬ−１＋Ｃ−ＡＢＣ群）。高分子量及び低分子量のゼラチン分解性のバンドが何であるかは不明であるが、後者はＭＭＰ−１及びＭＭＰ−３の可能性がある（Dev Biol, 147, 425-439(1991); J Clin Invest, 92, 179-185(1993)）。髄核においては、Ｃ−ＡＢＣは単独でｐｒｏＭＭＰ−２を若干誘導した（Ｃ−ＡＢＣ群）。しかしながら、ＩＬ−１は、Ｃ−ＡＢＣの存在下又は非存在下で、ｐｒｏＭＭＰ−２産生を減少させた（ＩＬ−１群及びＩＬ−１＋Ｃ−ＡＢＣ群）。ｐｒｏＭＭＰ−９（８８ｋＤａ）は、両組織のどの群でも若干検出されるだけであった。
【００４７】
還元条件下で９８又は１００ｋＤａに泳動するＣ−ＡＢＣに相当するバンド（J Biol Chem, 272, 9123-9130(1997); Carbohydr Res, 255, 145-163(1994)）は、Ｃ−ＡＢＣ群及びＩＬ−１＋Ｃ−ＡＢＣ群において、９４ｋＤａの分子量の位置に観察された。これらのゼラチン分解活性の産生は、各グループの他の３つの組織から得られた培地を用いた場合にも、再現性よく観察された。
【００４８】
また、線維輪におけるＣ−ＡＢＣを伴うＩＬ−１刺激下でのゼラチン分解プロファイルは、ＩＬ−１単独によるＩＬ−１刺激下でのプロファイルとは明らかに異なる。したがって、Ｃ−ＡＢＣ処理は、線維輪のマトリックスにおける浸透性に関連したＩＬ−１効果を単に促進するものではないと考えられる。
【００４９】
（２）培地中のコラゲナーゼ活性の検定
椎間板によるＭＭＰ産生に対するＣ−ＡＢＣの効果をさらに検討するために、培地中のコラゲナーゼ活性を検定した。
【００５０】
コラゲナーゼの検定は、アイソトープ標識基質の代わりにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識Ｉ型コラーゲン（ヤガイ、山形、日本）を用いて、以前に報告されている方法に準じて行った（Anal. Biochem., 99, 340-345(1979)）。ＦＩＴＣ標識コラーゲンを、潜在的な酵素前駆体の活性化処理を行った培地、及びＣａＣｌ₂とＺｎＣｌ₂を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．５）で２０時間、３７℃でインキュベートした。反応を、ｏ−フェナンスロリンで停止し、反応液の上清の蛍光強度をマイクロプレートフルオロメーター（Fluoroskan II、ラボシステムズ、ヘルシンキ、フィンランド）を用い、９６−ブラックウェルマイクロプレートで測定した。培地中のコラゲナーゼ活性は、市販のＭＭＰ−１（ヤガイ）を用いて作成した標準曲線から検量した。
【００５１】
結果を図２に示す。なお、図２中の＊は、ＩＬ−１群に対してｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）で有意差があることを示す。線維輪において、Ｃ−ＡＢＣ及びＩＬ−１は、それぞれコラゲナーゼ産生を若干増加させた（ＩＬ−１群及びＣ−ＡＢＣ群）。さらに、ＩＬ−１＋Ｃ−ＡＢＣ群は、コラゲナーゼ産生を顕著に増加させ、それはＩＬ−１群よりも有意に高かった。髄核においては、各群におけるコラゲナーゼ産生のプロファイルは、ｐｒｏＭＭＰ−２（図１）のプロファイルに似た傾向を示した。すなわち、ＩＬ−１は、Ｃ−ＡＢＣの存在下又は非存在下でコラゲナーゼ産生を減少させた（ＩＬ−１群及びＩＬ−１＋Ｃ−ＡＢＣ群）。
【００５２】
（３）結果
以上のように、Ｃ−ＡＢＣがＭＭＰの一種であるコラゲナーゼの産生を有意に促進させることが明らかにされた。産生されたＭＭＰにより、Ｃ−ＡＢＣが、コラーゲンを間接的に分解することが示唆された。
【００５３】
【発明の効果】
本発明により、コラゲナーゼ産生促進剤が提供される。本発明のコラゲナーゼ産生促進剤は、試薬として、又は椎間板若しくは脊髄硬膜外腔投与用の医薬、具体的には例えば椎間板ヘルニアの処置用の医薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ウサギ椎間板の線維輪組織（上）及び髄核組織（下）の培養後の培地のザイモグラフィー分析を示す図である。
【図２】 線維輪及び髄核による培地中へのコラゲナーゼ産生を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel use of chondroitinase. More specifically, the present invention relates to a collagenase production promoter containing chondroitinase.
[0002]
[Prior art]
Chondroitinase is an enzyme that catalyzes the degradation of chondroitin sulfate (hereinafter also referred to as “CS”). Various types of chondroitinase are known. For example, chondroitinase ABC (EC 4.2.2.4) is chondroitin sulfate A derived from mammalian cartilage, chondroitin sulfate C derived from shark cartilage, and mammals. It is an enzyme that strongly catalyzes the degradation of skin-derived chondroitin sulfate B (dermatan sulfate) and weakly catalyzes the degradation of hyaluronic acid (hereinafter also referred to as “HA”).
[0003]
On the other hand, intervertebral hernia is a disease caused by protrusion of the nucleus pulposus in the intervertebral disk, and the protruding nucleus pulposus stimulates nearby nerves, and symptoms such as low back pain appear.
In recent years, an attempt has been made to treat intervertebral hernia by administering chondroitinase to the intervertebral disc to melt the protruding nucleus pulposus [US Pat. No. 4696816, Clinical Orthopedics, 253, 301-308 (1990)].
[0004]
Spine (1996) Vol. 21, pages 2405-2411, chondroitinase ABC was injected into the intervertebral disc to melt the nucleus pulposus and the dry weight of the tissue before and after melting was compared. It is described that the phenomenon that “the amount of decrease” exceeds the “weight of CS or the like contained in the tissue” is observed, suggesting the possibility of proteolysis. However, when proteolysis was evaluated based on the degradation activity of casein, no results were confirmed, and it was described that the cause remained unclear.
[0005]
Also, Spine (1997) Vol. 22, pages 1065-1073 describes that matrix metalloproteinases are involved in intervertebral disc degeneration and hernia. Furthermore, collagenase is known to be a kind of matrix metalloproteinase.
[0006]
However, it is not known that chondroitinase promotes collagenase production.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel use of chondroitinase, particularly chondroitinase ABC, specifically, a collagenase production promoter.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that a collagenase production promoter containing chondroitinase (hereinafter, also referred to as “the promoter of the present invention”) and a pharmaceutical comprising the promoter of the present invention (Hereinafter also referred to as “the pharmaceutical of the present invention”).
[0009]
That is, the present invention is as follows.
(1) A collagenase production promoter containing chondroitinase.
(2) The promoter according to (1), wherein the chondroitinase is chondroitinase ABC.
(3) A medicament comprising the promoter according to (1) or (2).
(4) The medicament according to (3) for administration to an intervertebral disc or spinal epidural space.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
<1> Chondroitinase used in the promoter of the present invention The chondroitinase that can be used in the promoter of the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme that degrades CS. Specific examples of chondroitinase include chondroitinase ABC (derived from Proteus vulgaris; JP-A-6-153947, T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968), S. Suzuki, H. Saito, T. Yamagata, K. Anno, N. Seno, Y. Kawai, T. Furuhashi, J. Biol. Chem., 243, 1543 (1968)), Chondroitinase AC (from Flavobacterium heparinum; T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968)), chondroitinase ACII (from Arthrobacter aurescens; K Hiyama, S. Okada, J. Biol. Chem., 250, 1824 (1975), K. Hiyama, S. Okada, J. Biochem. (Tokyo), 80, 1201 (1976)), chondroitinase ACIII ( From Flavobacterium sp. Hp102; Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi, Junichi Yoshida, Kiyoshi Morikawa, Kiyochika Tokuyasu, Biochemistry, 61, 1023 (1989)), Chondroitinase B (derived from Flavobacterium heparinum; YM Michelacci, CPDietrich, Biochem. Biophys. Res. Commun., 56, 973 (1974), YM Mi chelacci, CP Dietrich, Biochem. J., 151, 121 (1975), Kenichi Maeyama, Akira Tawada, Keiko Ueno, Junichi Yoshida, Biochemistry, 57, 1189 (1985)), chondroitinase C (derived from Flavobacterium sp. Hp102) Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi, Junichi Yoshida, Kiyoshi Morikawa, Kiyochika Tokuyasu, Biochemistry, 61, 1023 (1989)) are known, and any of these chondroitinases can be used. In addition, chondroitin sulfate ABC exolyase (A. Hamai, N. Hashimoto, H. Mochizuki, F. Kato, Y), chondroitin sulfate ABC exolyase described in JP-A-9-168384 Chondroitinase such as Makiguchi, K. Horie and S. Suzuki, J. Biol. Chem., 272, 9123-9130 (1997)) can also be used as the promoter of the present invention.
[0011]
These various chondroitinases are merely examples, and chondroitinases that can be used in the promoter of the present invention are not limited to these. The chondroitinase used in the promoter of the present invention may be one type of chondroitinase or a combination of a plurality of types of chondroitinases. In such cases, both meanings are included.
[0012]
It is extremely preferable to use chondroitinase ABC as the chondroitinase used in the promoter of the present invention. Of chondroitinase ABC, it is particularly preferable to use chondroitinase ABC derived from Proteus vulgaris.
[0013]
Here, the origin of chondroitinase means that it originates from an organism that originally possesses the gene encoding the chondroitinase. Therefore, for example, chondroitinase ABC derived from Proteus vulgaris means chondroitinase ABC produced by a gene originally possessed by Proteus vulgaris. Accordingly, chondroitinase ABC derived from Proteus vulgaris includes not only those produced by Proteus vulgaris itself, but also those produced in other cells using the chondroitinase ABC gene obtained from Proteus vulgaris. It is.
[0014]
The purity of the chondroitinase used in the promoter of the present invention is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose of use. For example, when the promoter of the present invention is the “medicine of the present invention” described later, the chondroitinase used is an enzyme that is purified to the extent that it can be used as a drug and does not substantially contain substances that are not allowed to be mixed as a drug. Preferably there is.
[0015]
For example, the chondroitinase used in the promoter of the present invention is preferably a purified chondroitinase having a specific activity of 300 U / mg protein or more, has a specific activity of 300 U / mg protein or more, and substantially contains endotoxin. And purified chondroitinase having a nucleic acid and protease content below the detection limit is more preferred, and purified chondroitinase ABC having such characteristics is particularly preferred.
[0016]
In the present specification, 1 U (unit) of chondroitinase is the amount of enzyme that liberates 1 micromole of reaction product per minute from CS under conditions near optimum pH and optimum temperature. As a precaution, the definition of 1U of various chondroitinases is shown below.
[0017]
1 U of chondroitinase ABC is defined as the amount of enzyme that liberates 1 micromole of unsaturated disaccharide from chondroitin 6-sulfate per minute at pH 8.0 and 37 ° C. Further, 1U of chondroitinase AC (derived from Flavobacterium heparinum) is defined as the amount of enzyme that liberates 1 micromole of unsaturated disaccharide from chondroitin 6-sulfate per minute at pH 7.3 and 37 ° C.
[0018]
Moreover, 1U of chondroitinase ACII (derived from Arthrobacter aurescens) is defined as the amount of enzyme that liberates 1 micromole of unsaturated disaccharide from chondroitin 6-sulfate per minute at pH 6.0 and 37 ° C.
[0019]
In addition, 1U of chondroitinase B (derived from Flavobacterium heparinum) is defined as the amount of enzyme that releases a UV-absorbing substance corresponding to 1 micromole of hexuronic acid residue from dermatan sulfate for 1 minute at pH 8.0 and 30 ° C. Is done.
[0020]
For example, by using chondroitinase ABC having a specific activity of 300 U / mg protein or more, the proteoglycan (CS or HA) at the target site can be obtained even when the promoter of the present invention is administered in vivo as the pharmaceutical of the present invention (described later). Can be efficiently decomposed, and collagenase production can be effectively promoted. Such chondroitinase ABC can be obtained, for example, by the method described in JP-A-6-153947.
[0021]
<2> Form of the Accelerator of the Present Invention The accelerant of the present invention contains the above chondroitinase in an amount effective for promoting the production of collagenase. Here, the “effective amount for promoting the production of collagenase” means an amount capable of detecting the promotion of the production of collagenase. This amount also depends on the type of chondroitinase used, the type and state of cells and tissues etc. (hereinafter simply referred to as “tissue etc.”) intended to produce collagenase, the type and condition of mammals from which the tissues are derived, etc. Although it is different and can be appropriately determined by those skilled in the art, for example, when chondroitinase ABC is used as chondroitinase and the production of collagenase is promoted in the intervertebral disc tissue extracted from a healthy rabbit, Collagenase production can be promoted by contacting with an enzyme solution of about 0.01 to 1000 U / ml.
[0022]
For example, the content of chondroitinase ABC in the promoter of the present invention used for one administration is exemplified by 5 U or more, more preferably about 5 to 400 U, further preferably about 5 to 200 U.
[0023]
In addition to chondroitinase, the promoter of the present invention may further contain a pharmaceutically or reagent acceptable carrier.
Such carriers include conventional excipients, binders, lubricants, colorants, disintegrants, buffers, isotonic agents, preservatives, soothing agents, and the like, which are usually used in pharmaceuticals or reagents. And can be appropriately selected depending on the purpose of use and the form (form etc.) of the accelerator of the present invention. For example, the promoter of the present invention may be in any form of a solution state, a frozen state, and a dry form, but a dry form, particularly a freeze-dried form is preferable in terms of storage stability.
[0024]
As the carrier that can be contained in the accelerator of the present invention, those described in JP-A-11-236336 are preferably employed. The promoter of the present invention can be prepared by a known pharmacological method using chondroitinase and a desired carrier.
[0025]
<3> Method for Using the Promoter of the Present Invention, etc. The promoter of the present invention can be used for the purpose of promoting production of collagenase such as tissue. As long as the purpose of use is intended, the specific use of the promoter of the present invention is not limited, and can be used for both reagent use and pharmaceutical use. Moreover, according to a specific use, a usage method etc. can be determined suitably.
[0026]
When used as a reagent, for example, the promoter of the present invention can be brought into contact with a tissue separated from a living body to promote the production of collagenase. Moreover, the case where it uses as a pharmaceutical use is demonstrated in detail in the below-mentioned "medicament of this invention".
[0027]
<4> Medicinal product of the present invention The medicinal product of the present invention is a drug comprising the promoter of the present invention, which is an application of the promoter of the present invention to pharmaceutical use. As long as the use of the promoter of the present invention for pharmaceutical purposes is intended, the method of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the specific purpose.
[0028]
In the present specification, the “medicine” means a drug used for medical treatment. Therefore, as long as it is a medicine used for medical treatment, it is included in the “medicine” here regardless of the name.
[0029]
When the pharmaceutical of the present invention is administered to a tissue or the like where the production of collagenase is desired, the action of chondroitinase contained in the pharmaceutical of the present invention is exerted, and the production of collagenase in the tissue and surrounding tissues is promoted. Can do.
[0030]
The medicament of the present invention can be administered to all mammals including humans, but is particularly preferably administered to humans.
The tissue or the like to which the pharmaceutical of the present invention is administered is not particularly limited as long as it is a tissue desired to promote the production of collagenase, but is preferably a tissue in which proteolysis such as collagen due to the action of the produced collagenase is desired, It is preferably a tissue in which CS and / or HA degradation by chondroitinase original action is desired in addition to proteolysis by the action of the produced collagenase.
[0031]
As such a tissue, the nucleus pulposus is preferably caused by protrusion or release such as a disc tissue of a mammal affected by a herniated disc, or an epidural migrating disc herniation or a transligament prolapse disc herniation. It is the spinal epidural space of a mammal afflicted with an extramembrane type of herniated disc. Accordingly, the medicament of the present invention is preferably used for intervertebral disc or spinal epidural space administration.
[0032]
By administering the medicament of the present invention to such an intervertebral disc tissue or the like, CS and HA in the nucleus pulposus were decomposed by the original action of chondroitinase, and the CS amount and HA amount in the nucleus pulposus were retained by these. Not only can the water content be reduced, resulting in a reduction in the volume of the nucleus pulposus itself, but also the degradation of proteins such as collagen in the nucleus pulposus itself and its surrounding sites by the action of collagenase, which is promoted by chondroitinase. Therefore, the volume of the nucleus pulposus itself can be further reduced, and in addition, the space for accommodating the nucleus pulposus can be increased. As a result, nerve stimulation caused by the protruding nucleus pulposus can be quickly removed, and various symptoms of disc herniation such as low back pain can be effectively improved.
In the results shown in Examples below, the promotion of collagenase production by administration of chondroitinase ABC was more prominent in the annulus fibrosus than in the nucleus pulposus tissue, but this was the case when chondroitinase was administered to the nucleus pulposus. However, it is considered that chondroitinase diffuses also into the annulus fibrosus and collagenase production is promoted in the annulus fibrosus, and the produced collagenase also diffuses into the nucleus pulposus to promote melting of the nucleus pulposus.
[0033]
Therefore, the medicament of the present invention is preferably used for the treatment of disc herniation (improvement of symptoms, prevention of deterioration, treatment, etc.).
In addition, since the pharmaceutical of the present invention promotes the production of collagenase, it can be used for the treatment of diseases caused by increased collagen such as fibrosis.
[0034]
Such a medicament of the present invention is mainly used as an injectable preparation containing chondroitinase. When providing the pharmaceutical preparation of the present invention as a solution injectable preparation, the pharmaceutical preparation of the solution is filled and sealed in an appropriate container such as an ampoule, vial, syringe for injection, and distributed or stored as it is. It can be used for administration as an injection. In the case of providing a frozen preparation for injection, the frozen medicament of the present invention is held in a sealed state in an appropriate container such as an ampoule, vial, or syringe for injection, distributed or stored, and before administration. It can be melted and then administered as an injection. In the case where the pharmaceutical of the present invention is provided as an injectable preparation in a dry form, the dried pharmaceutical of the present invention is held in a sealed state in an appropriate container such as an ampoule, a vial, or a syringe for injection, or distributed. It can be stored and dissolved in distilled water for injection, physiological saline, aqueous glucose solution, aqueous sorbitol solution or the like before administration and used as an injection. The medicament of the present invention in a dry form may be provided as a set with a solvent for dissolution. Among these various forms of injectable preparations, those in dry form, particularly freeze-dried form are preferred. That is, the medicament of the present invention is particularly preferably in the form of a freeze-dried preparation for injection.
[0035]
The dosage of the medicament of the present invention should be set individually depending on the type of chondroitinase used, the type and condition of the mammal to be administered, the type of tissue to be administered, its state, etc. Although it is not limited, for example, when chondroitinase ABC is used as chondroitinase and administered to one disc of an adult herniated disc patient, the amount of chondroitinase ABC is about 0.1 to 200 U per dose, preferably Can be administered in an amount of about 0.5 to 100 U, particularly preferably about 0.5 to 50 U.
[0036]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention should not be limited by these.
[0037]
In the following examples, the effects of chondroitinase ABC (C-ABC) on the production of gelatinase (MMP-2, MMP-9), which is a kind of matrix metalloproteinase (MMP), and collagenase were examined in vitro.
[0038]
It is known that when C-ABC is injected in vivo, intervertebral disc cells are activated by changes in CS degradation within the surrounding matrix (Clin Orthop, 253, 301-308 (1990). )). In the following examples, IL-1 was used as a stimulator for activating cells in a cultured tissue and reproducing a cell state closer to in vivo.
[0039]
<1> Intervertebral disk tissue culture (1) Tissue preparation Fresh annulus and nucleus pulposus were prepared from lumbar discs (L1-L2 and L5-L6) of 6 female Japanese white rabbits (3.8-4.4 Kg). Incision from between). Intervertebral disc tissue obtained from each rabbit was assigned to different groups. Six annulus fibrosus or nucleus pulposus were used for each group. Dulbecco's modified Eagle medium (Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan) supplemented with 25 mg / ml ascorbic acid and 10% fetal bovine serum was used as the complete medium. Each tissue was washed with physiological saline and placed in each well of a culture plate (annulus: 12 well plate, nucleus pulposus: 24 well plate) filled with complete medium (annulus fibrosus: 2 ml, nucleus pulposus: 1 ml). It was.
[0040]
(2) Culture procedure The prepared tissue was cultured in 37% at 5% CO ₂ gas for 7 days consisting of 4 days of pre-culture for daily medium change and 3 days of continuous culture. High-purity purified pharmaceutical grade C-ABC (manufactured by Seikagaku Corporation; specific activity 380 U / mg protein, substantially free of endotoxin, nucleic acid, protease content below detection limit), and commercially available recombinant human interleukin- 1b (IL-1b) (R & D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA) was used as an additive to the medium. Each tissue was cultured in complete medium only on the first day. In the following C-ABC group and IL-1 + ABC group, C-ABC was added at a concentration of 20 U / ml on the 2nd to 4th days.
[0041]
Subsequently, each tissue was rinsed with phosphate buffered saline and the above serum-free medium. Each medium contains nothing (control group), contains 20 U / ml concentration of C-ABC (C-ABC group), contains 10 ng / ml concentration of IL-1 (IL-1 group), or 10 ng / The serum-free medium containing IL-1 at a ml concentration and C-ABC at a 20 U / ml concentration (IL-1 + C-ABC group) was replaced. Furthermore, after culturing each tissue for 72 hours, the medium and the tissue were collected.
[0042]
<2> Statistical analysis of dry weight of collected tissue The collected tissue was freeze-dried and the dry weight was measured. Statistical analysis between the control group and other groups was performed using Dunnett's multiple comparison test.
[0043]
The results are shown in Table 1. There were no statistically significant differences between groups. Therefore, collagenase values can be normalized by dry weight.
[0044]
[Table 1]

[0045]
<3> Detection of matrix metalloproteinase (1) Detection of gelatinase in medium Gelatinase was detected as follows using a zymography method. Using a portion of the medium, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed under non-reducing conditions using a polyacrylamide gel containing 0.1% gelatin. After electrophoresis, the gel was washed with 2.5% Triton-X 100 and incubated in Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing CaCl ₂ and ZnCl ₂ for 22 hours at 37 ° C. Subsequently, the gel was stained with Coomassie Brilliant Blue R-250 to visualize gelatin degradable bands. As standards, human proMMP-2 (a precursor of MMP-2) and proMMP-9 (a precursor of MMP-9) (Novas Molecular, San Diego, California, USA) were added to one lane of the same gel.
[0046]
The results are shown in FIG. Regarding the annulus fibrosus, production of proMMP-2 (66 kDa) was observed to a similar degree in any group. IL-1 induced a high molecular weight gelatinolytic product (107 kDa, top arrow) (IL-1 group). However, the induction was not observed in C-ABC, and a low molecular weight gelatinolytic product (56 kDa, lower arrow) was induced (IL-1 + C-ABC group). It is unclear what high and low molecular weight gelatinolytic bands are, but the latter may be MMP-1 and MMP-3 (Dev Biol, 147, 425-439 (1991); J Clin Invest, 92, 179-185 (1993)). In the nucleus pulposus, C-ABC alone induced some proMMP-2 alone (C-ABC group). However, IL-1 reduced proMMP-2 production in the presence or absence of C-ABC (IL-1 group and IL-1 + C-ABC group). ProMMP-9 (88 kDa) was only slightly detected in any group of both tissues.
[0047]
A band corresponding to C-ABC (J Biol Chem, 272, 9123-9130 (1997); Carbohydr Res, 255, 145-163 (1994)) that migrates to 98 or 100 kDa under reducing conditions is observed in the C-ABC group and In the IL-1 + C-ABC group, it was observed at a molecular weight of 94 kDa. The production of these gelatinolytic activities was also observed with good reproducibility when using media obtained from the other three tissues of each group.
[0048]
In addition, the gelatin degradation profile under IL-1 stimulation with C-ABC in the annulus is clearly different from the profile under IL-1 stimulation with IL-1 alone. Thus, it is believed that C-ABC treatment does not merely promote the IL-1 effect associated with permeability in the annulus matrix.
[0049]
(2) Assay of collagenase activity in medium In order to further examine the effect of C-ABC on MMP production by the intervertebral disc, collagenase activity in the medium was assayed.
[0050]
Collagenase assay was performed in accordance with a previously reported method using fluorescein isothiocyanate (FITC) labeled type I collagen (Yagai, Yamagata, Japan) instead of the isotope labeled substrate (Anal. Biochem., 99, 340-345 (1979)). FITC-labeled collagen was incubated at 37 ° C. for 20 hours in a medium subjected to activation treatment of a potential enzyme precursor and Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing CaCl ₂ and ZnCl ₂ . The reaction was stopped with o-phenanthroline, and the fluorescence intensity of the reaction supernatant was measured on a 96-black well microplate using a microplate fluorometer (Fluoroskan II, Labsystems, Helsinki, Finland). Collagenase activity in the medium was calibrated from a standard curve prepared using commercially available MMP-1 (goat).
[0051]
The results are shown in FIG. In addition, * in FIG. 2 shows that there is a significant difference in p <0.05 (Student t-test) with respect to the IL-1 group. In the annulus fibrosus, C-ABC and IL-1 slightly increased collagenase production, respectively (IL-1 group and C-ABC group). Furthermore, the IL-1 + C-ABC group significantly increased collagenase production, which was significantly higher than the IL-1 group. In the nucleus pulposus, the collagenase production profile in each group tended to resemble the profile of proMMP-2 (FIG. 1). That is, IL-1 decreased collagenase production in the presence or absence of C-ABC (IL-1 group and IL-1 + C-ABC group).
[0052]
(3) Results As described above, it was revealed that C-ABC significantly promotes the production of collagenase, which is a kind of MMP. The produced MMP suggested that C-ABC indirectly degraded collagen.
[0053]
【The invention's effect】
According to the present invention, a collagenase production promoter is provided. The collagenase production promoter of the present invention is useful as a reagent or a medicament for administering an intervertebral disc or spinal epidural space, specifically, for example, a medicament for treating disc herniation.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a zymography analysis of a medium after culturing of annulus fibrosus tissue (upper) and nucleus pulposus tissue (lower) of a rabbit intervertebral disc.
FIG. 2 is a diagram showing collagenase production in a medium by annulus fibrosus and nucleus pulposus.

Claims (2)

コンドロイチナーゼＡＢＣを含有する、線維輪組織におけるコラーゲン分解促進剤。A collagen degradation promoter in annulus fibrosus tissue containing chondroitinase ABC . コンドロイチナーゼＡＢＣ及びインターロイキン−１を含有する、線維輪組織におけるコラーゲン分解促進剤。A collagen degradation promoter in annulus fibrosus tissue comprising chondroitinase ABC and interleukin-1.

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