JP4776107B2 - ステビア品種のdna鑑定による識別 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
RAPD法(Random Amplified Polymorphic DNA method)によるステビオサイドに対してレバウディオサイドAの比率の高いステビア・レバウディアナ・ベルトニーの品種の識別方法、識別された植物体またはその乾燥葉、その抽出物を含む甘味料およびその製造方法に関する。
【0002】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ステビアは南米パラグアイを原産地とする菊科多年生植物で、学名をステビア・レバウディアナ・ベルトニー(Stevia Rebaudiana Bertoni)という。ステビアは砂糖の300倍以上の甘味を持つ甘味成分を含むので、この甘味成分を抽出して天然甘味料として用いる為に栽培されている。
【0003】
ステビアの甘味成分としては、ステビオサイド(C38H60O18、分子量804)、レバウディオサイドA(C44H70O23、分子量966)、レバウディオサイドC、D、E、ズルコサイドA等が知られている。一般に栽培されているステビア品種では上記甘味成分の内ステビオサイド(ST)が主成分でレバウディオサイドA(RA)の含有量はステビオサイドの10分の3〜4程度、レバウディオサイドCの含量はそれよりやや少ないが、品種によってはレバウディオサイドA、及びCを含まないもの、更にレバウディオサイドCを主成分とするものなど種々である。
【0004】
渋み、辛み等の舌で知覚される味の中でも甘みの質は非常に微妙である。ステビオサイドは砂糖の300倍の甘味度を有するので天然甘味料として食品工業界で用いられている。その甘味は比較的砂糖に似ているが、苦み等の不快味が後味に残るという欠点がある。それゆえステビオサイドを多量に含むことは甘味料として好ましいことではない。これに対して、レバウディオサイドAは良質の甘味質とステビオサイドの1.3倍〜1.5倍の甘味度を有する。
【0005】
生産コストの削減と安定した収穫量を保ち、甘味料原料として甘味質の優れたレバウディオサイドAを高含有したステビア品種を開発し、同時に、それらを継続維持し、それらを基に優れた甘味料を製造する必要がある。
【0006】
本発明者らは従来品種から交配選抜を繰り返し品種改良を行い、ステビオサイド(ST)に対してレバウディオサイドA(RA)が高い含有比率を示すステビア品種を得、これらの植物から甘味成分を抽出しステビオサイドに対してレバウディオサイドAの含有比の高い優れた甘味料を製造してきた(特開昭59−045848号、特開昭60−160823号、特開昭61−202667号など)。
【0007】
一方、ステビア植物を特定する問題点である改良品種の識別方法として、草丈、葉形等による識別が考えられるが、ステビアは自家不和合性であり雑種になりやすい。
【0008】
また、ステビア特有の病原菌による耐病性による比較特定もあるが、ステビア特有に発現する枯葉、黒斑点病はセプトリア菌、アルタナリア菌に起因して発生するが、それらの菌は土壌に生息する菌であり、これらの症状のみによる品種の特定は日本のみならず世界的に発生することからこれら特性のみで品種を特定するには不十分である。
【0009】
甘味成分の含有量が高くステビオサイドに対してレバウディオサイドAの含有比率の高い改良品種にいたっては、生育期間の気象条件、収穫時期等により甘味成分比率が変動するのは避けられないから、常に同じというわけにはいかない。従って、甘味成分の含有量および比率を測定する方法しかないが、識別の対象となる甘味成分は化学構造式が類似しているため不十分であった。
【0010】
【課題を解決するための手段】
本発明の第1は、ステビオサイド1重量部に対してレバウデイオサイドA3重量部以上を含むステビア・レバウディアナ・ベルトニー品種の識別方法であって、配列番号1および2に示される塩基配列を有するプライマーミックスを用いるRAPD法によって、DNA鑑定により識別を行うことを特徴とする方法である。
【0011】
上記の方法によって、ステビオサイド1重量部に対してレバウデイオサイドA3重量部以上を含むステビア・レバウディアナ・ベルトニー品種に属する植物体またはその乾燥葉を識別することができる。
【0012】
本発明の第2は、本発明の方法によって識別された植物体またはその乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出して得られるステビオサイド1重量部に対してレバウデイオサイドA3重量部以上を含む甘味料である。
【0013】
本発明の第3は、ステビオサイド1重量部に対してレバウデイオサイドA3重量部以上を含む甘味料の製造方法であって、本発明の植物体またはその乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出することを特徴とする方法である。
【0014】
本発明の識別に用いられるRAPD法(Random Amplified Polymorphic DNA method)はDNAの解析手法の1つであり、複数のプライマーを用いてPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)を行うと、用いたプライマーと同一または類似の配列に挟まれたDNAの領域が増幅され、その増幅されたDNAのパターンを電気泳動で解析する方法である。また、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB:Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)は長鎖アルキル基をもつ第4級アンモニウム塩基であり、核酸のようなポリアニオンと不溶性の複合体を形成するために核酸の単離に利用することができる。
【0015】
【発明の実施の態様】
本発明は甘味成分含量、甘味成分含有比の優れた品種を創造し、その特徴を維持するためにRAPD法で遺伝子を識別することにより他系統、他品種のステビア植物と区別し、それらより甘味質の優れた甘味料を得ることである。
【0016】
DNA塩基配列を特定する手段はCTABにより植物体からゲノムDNAを単離し、リボ核酸(RNA)を除去し、プライマーミックスを用いてPCR法により得られたPCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動法によって得られるDNAフィンガープリントの違いにより区別する。
【0017】
選択的に沈殿させたゲノムDNAを雛型とし、プライマーとしてA06(塩基配列;ACTGGCCGAGGG) とA48(塩基配列;CCGCAGGGACCA)のセットおよび rTaq(TAKARA)を用いて94度(30秒)、55度(30秒)、72度(60秒)で35サイクル反応を行った後、72度で10分間反応させる。その後、PCR増幅産物をアガロース電気泳動法によって確認し、特定のDNAバンドを確認した植物体、またはその乾燥葉から水、または含水有機溶媒にて抽出し、次いで抽出液をそのまま濃縮するか、または必要に応じて陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂でイオン性不純物を除去し、吸着樹脂に甘味成分を吸着させ親水性溶媒でして溶離液を濃縮、乾燥して甘味料が得られる。甘味料の製造方法はその他脱色等の慣用精製手段を適宣施すことが出来る。得られた甘味料は他の甘味料、希釈剤等を加える事が出来、さらに再結晶により高純度レバウデイオサイドAおよび酵素処理ステビア甘味料の原料とすることも出来る。
【0018】
レバウディオサイドAを比較的高含有する品種の育種過程
育種はレバウディオサイドAを比較的高含有する品種のかけ合わせ選抜にて行い、まず、レバウディオサイドAを高含有するSF5−1、SF5−2(特願平9−16531号記載)を人工的に交配し、得られた種子の苗を耐病性をも調査すべくセプトリア菌、アルタナリア菌の発生が顕著な圃場に移植する。セプトリア菌、アルタナリア菌に抵抗性を有する品種を選抜し、その甘味成分を分析し、ステビオサイドに対してレバウディオサイドAを3倍以上含み、甘味含有量が高く、比較的耐病性に優れた品種TD−1を選抜した。さらに、甘味成分含量、甘味成分比率、生育状況を再度確認し、TD−1の遺伝子を検索した。
【0019】
【実施例】
以下に、育種過程およびその特性等を具体的に記載する。本発明は本育種過程、栽培方法に限定されるものでない。
実施例1
レバウディオサイドAを比較的高含有する品種のかけ合わせで得られた種子より、1995年にレバウディオサイドAを含有するSF−1、SF5−2品種(特願平9−16531号記載)を新見工場内ビニールハウス内で人工的にかけ合わせ、得られた種子を96年3月に新見工場内のビニールハウスに播種、発芽した苗を育苗ポットに移植し、5月上旬に苗丈8cm程度以上の苗600本を長年ステビア栽培を行いセプトリア菌、アルタナリア菌の発生が顕著な工場内圃場に10アール当たり窒素、燐、カリの肥料成分各20kgを施肥し2週間に移植した。
7月上旬に追肥として10アール当たり窒素、燐、カリの肥料成分各10kgを追肥した。
【0020】
上記の病原菌に対する抵抗性を目視により9月上旬に調査し、生育が良く耐病性を有する株を選抜し、その甘味成分を分析し、ステビオサイドに対してレバウディオサイドAを3倍以上含み、その含有量が多い株を選抜し、電照下で各50本挿し木した。97年4月中旬にそれらより萌芽した芽を200本挿し木した。5月上旬に同様に工場内圃場に植え付け7月末に耐病性、生育を再度調査し、甘味成分比、含量が優れている事を確認しTD−1品種とした。
【0021】
TD−1、STおよびSNの比較試験1
比較のために、97年4月中旬にステビオサイドを主甘味成分とするステビア品種(ST)、ステビオサイドを主甘味成分とし、レバウデイオサイドAを副甘味成分とするステビア品種(SN)各40本も同様に挿し木し、同様に工場内圃場に植え付けた。
【0022】
上記の5月上旬に圃場に移植した挿し木により増殖させた品種TD―1の苗200本と、品種ST、SN苗各40本のうち、6月下旬に任意に選んだ各品種10本中での発病の有無を調査した後、TD−1を地上から15cmで刈り取り、ST、SNの各品種は20本を地上部から刈り取り後、葉部を分離し、乾燥後分析試料とした。
【0023】
分析結果は次のとおりであった。
【表1】
【0024】
TD−1、STおよびSNの比較試験2
7月上旬に追肥を行い、9月上旬に各品種1区画20株を選択しセプトリア菌、アルタナリア菌の発病状況を調査した後、各品種を地上部から刈り取った後、葉部を分離し、乾燥後分析試料とした。
【0025】
分析結果次のとおりであった。
【表2】
【0026】
品種TD−1は枯れ葉の発病割合は比較的低く、甘味成分含量、乾燥葉収量も他品種より優れていた。品種STはセプトリア菌により下葉の4節までの部分で既に葉の1/2程度がセプトリア菌により発病した葉が多数あり黄色く変色しており、最下部の葉は枯葉になっていた。品種SNはセプトリア菌により下葉の3節までの部分で既に葉の1/2程度がセプトリア菌による黄変が見られ、地上より1節の葉は枯れ葉となっていた。
【0027】
98年3月にTD−1から萌芽した穂先を200本挿し木し、4月下旬に圃場に移植し、5月末、6月末、7月末、8月末、9月末、10月末に地上部を刈り取り、葉のみを分離した後、乾燥し、甘味成分含量を測定した。
甘味成分の測定は高速液体クロマトグラフィ−により行った。
【0028】
【表3】
【0029】
TD一1は生育期間により甘味成分含量、甘味成分比が異なり、生育期間が長くなるにつれて甘味成分含量が増え、一方、ステビオサイド含量が減少する傾向が見られた。開花時期の10月末には甘味成分含量の減少がみられる。
【0030】
遺伝子塩基配列の特定
甘味成分含量、甘味成分比、収量からTD−1が最も優れていたことから、TD−1を識別すべくそのDNA塩基配列を決定した。
【0031】
乾熱滅菌した乳鉢にTD−1の葉を約1グラム入れ、液体窒素を加えて完全にすりつぶし、15mlのチューブに粉砕した植物組織を移した。5mlの2%CTAB溶液(2%CTAB溶液(50ml):組成1M Tris−HCl 2.5ml、0.5M EDTA 1.0ml、2% CTAB 0.5g、4M NaCl 4.1g)を加え、転倒混和した後、30分間65℃でウォターバスにて加温し、5mlのクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)を加え、5分間穏やかに攪拌する。8000rpmで30分遠心した後、2層に分かれた内容物の上層の水層を新しいチューブに移す。
【0032】
加温後の上記操作をもう一度繰り返し、水層を新しいチューブに移す。7mlの1%CTAB溶液(1%CTAB溶液(50ml):組成1M Tris−HCl 2.5ml、0.5M EDTA 1.0ml、1% CTAB 0.5g)を加え、転倒混和後、1時間室温で静置し、8000rpmで15分間遠心を行う。
【0033】
上清を捨てて、1mlの1MCsCL(1M CsCl溶液(50ml):組成CsCl 8.4g)を加え、沈殿を完全に溶かす。2.5倍量の100%エタノールを加え、転倒混和後、−20℃で20分以上静置し、エタノール沈殿を行う。上清を捨て、沈殿を真空乾燥機で風乾し、100mlの超純水に溶解する。溶液をアガロースゲル電気泳動でDNAが単離されていることを確認した。
【0034】
RNAを除去する為にRNase溶液500μl(組成:上記DNA単離溶液100μl、RNase(5g/ml) 5μl)で37℃にて1時間反応させ、反応液にPCI溶液(組成:フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール、25:24:1を穏やかに混合した後、15000rpmで5分間遠心し、水層を分離した溶液)を等量加える。蓋をして穏やかに混合した後、15000rpmで5分間遠心した。
【0035】
水層(上層)を新しいマイクロチューブに移し、室温で保存していたCIA溶液(組成:クロロホルム/イソアミルアルコール、容量比24:1)を等量加え、穏やかに混合した後、15000rpmで3分間遠心し、水層を新しいマイクロチューブに移し、もう一度CIA処理を行い、得られた上清の1/10倍量の3M酢酸ナトリウムと2.5倍量の100%エタノールを加え、よく混ぜた後、−20゜Cで30分間冷却し、15000rpmで20分間遠心し、DNAをペレットにし、上清を捨て、ペレットに冷却しておいた70%エタノールを1mlを加えた後、15000rpmで10分間遠心し、上清を捨て、もう一度冷却した70%エタノールを1ml加えた後、15000rpmで10分間遠心し、上清を捨て、減圧デシケーターを用いて5分間乾燥させた。
【0036】
得られたゲノムDNAをテンプレートとしてPCR用組成物(表4)にて、94℃30秒、55℃30秒、72℃60秒を35サイクル反応を行った後、72℃で10分間反応させる。反応後、4℃に保ちPCR増幅産物を得た。PCR増幅産物を1%アガロースゲル電気でDNAバンドを確認すると、図1の▲4▼が示すように、およそ2300および900bpに特徴的なDNA断片が確認できた。
【0037】
【表4】
【0038】
比較遺伝子塩基配列の特定
同様にステビオサイドを主成分とする品種(ST)、ステビオサイドを主成分としレバウディオサイドAを副成分とする品種(SN)を上記と同様に処理したDNAバンドを図1の▲2▼、▲3▼に示す。
【0039】
TD―1はおよそ2300、および900bpに特徴的な塩基配列を有するDNAをアガロースゲル電気泳動で検出することによって、他の品種と容易に区別することが出来る。
【0040】
実施例2
甘味料の製造
9月末にTD−1の乾燥葉20gを20倍量の水で甘味が感じられなくなるまで数回抽出し、抽出液を陽イオン交換樹脂(アンバーライトIR−120B)20mlを充填したカラムおよび陰イオン交換樹脂(デュオライトA−4)20mlを充填したカラムに通液し、通過液を吸着樹脂(ダイヤイオンHP−20)100mlを充填したカラムに通して甘味成分を吸着させ、十分水洗後メタノール300mlで溶離する。溶離液を減圧下に濃縮し、乾燥して淡黄白色の粉末を得た。比較のためにSNからも同様の処理をして甘味成分を得、これを分析した。
【0041】
分析方法 高速液体クロマトグラフィー法
使用カラム リクロソルブNH2 5μ 4mm(直径)×250mm
流速 1.5ml/分
展開溶媒 アセトニトリル:水=82:18
測定波長 210nm
【0042】
表5に抽出精製物の分析結果を示す。表中のSTはステビオサイド、RAはレバウディオサイドAである。
【表5】
【0043】
官能試験
実施例2で得られた淡黄色の粉末の各0.1%溶液を調製し、ステビア甘味料の味質に精通したパネラ−10人により苦み、渋み、甘味質を比較した。
苦み TD−1<SN
渋み TD−1<SN
甘味質 TD−1>SN
各試料においてTD−1は苦み、渋みが他の試料より改善されており、甘味質において優れていた。
【0044】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】 TD−1、STおよびSNのDNA塩基配列の電気泳動図である。
【符号の説明】
▲1▼・・100bpDNALadderマーカー ▲2▼・・ST品種 ▲3▼・・SN品種
▲4▼・・TD−1品種 ▲5▼・・λ−Hind III digestマーカー
Claims (3)
- ステビア・レバウディアナ・ベルトニー品種間の交配により得られる植物体から、ステビオサイド1重量部に対してレバウデイオサイドAを3重量部以上含む植物体を選択し、次いで配列番号1および2に示される塩基配列を有するプライマーミックスを用いるRAPD法によりDNA鑑定を実施することを特徴とする、同植物体の選別方法。
- 植物体の選別にあたり、セプトリア菌およびアルタナリア菌に対する耐病性に優れた植物体の選別をさらに行う、請求項1に記載の選別方法。
- 最初に請求項1または2に記載の方法を実施し、次いで、当該方法により選別されたステビア・レバウディアナ・ベルトニー品種の植物体またはその乾燥葉を水または含水溶媒で抽出することを特徴とする、ステビオサイド1重量部に対してレバウデイオサイドAを3重量部以上含む甘味料の製造方法。
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