JP4772693B2 - Immunotherapeutic composition, method for making and using the same - Google Patents

Immunotherapeutic composition, method for making and using the same Download PDF

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Description

本願は、それぞれ、2003年12月11日に出願されたU.S. Provisional Application Serial No.60/528,613及び2004年8月31日に出願されたU.S. Provisional Application Serial No.60/605,554からの優先権を主張する。両provisional applicationの全体は、参照により本明細書に組み込まれる。   This application claims priority from US Provisional Application Serial No. 60 / 528,613 filed on December 11, 2003 and US Provisional Application Serial No. 60 / 605,554 filed on August 31, 2004, respectively. To do. The entirety of both provisional applications is incorporated herein by reference.

発明の背景
本発明は、免疫治療の分野に関する。更に詳しくは、本発明は、内因性ｆａｓ関連デスドメイン分子(fas-associated death domain molecule)（ＦＡＤＤ）−ＲＩＰ１依存性シグナリング経路及び外因性Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）依存性経路のいずれか又は両方を活性化することができる組成物及び自然適応的免疫応答(innate adaptive immune responses)をより有効にカップリングさせるための方法に関する。組成物は、ウイルス、真菌(fungal)及びバクテリア病原体に対する自然免疫応答をモジュレーションする(modulate)のに特に有用であり、そしてガンを処置するのにも特に有用である。 The present invention relates to the field of immunotherapy. More particularly, the present invention relates to either or both of an endogenous fas-associated death domain molecule (FADD) -RIP1-dependent signaling pathway and an exogenous Toll-like receptor (TLR) -dependent pathway. And a method for more effectively coupling innate adaptive immune responses. The compositions are particularly useful for modulating innate immune responses against viral, fungal and bacterial pathogens, and are also particularly useful for treating cancer.

技術の背景
微生物病原体、例えば、ウイルス、バクテリア及び真菌(fungi)への宿主暴露は、自然免疫応答の活性化をトリガーして、初期宿主防御機構を刺激し(galvanize)、そして細胞傷害性Ｔ細胞活性及び抗体産生を伴う適応的免疫応答の活性化を促す(invigorate) [Medzhitov, et al., Semin. Immunol., 10:351-353, (1998)]。病原性微生物の認識及び自然免疫カスケードのトリガリングは、過去数年間にわたる熱心な研究の対象となった。 Technical background Host exposure to microbial pathogens such as viruses, bacteria and fungi triggers the activation of innate immune responses, galvanize initial host defense mechanisms, and cytotoxic T cells Invigorate activation of adaptive immune responses with activity and antibody production [Medzhitov, et al., Semin. Immunol., 10: 351-353, (1998)]. Recognition of pathogenic microorganisms and triggering of the innate immune cascade has been the subject of intense research over the past few years.

病原性微生物の保存された成分（病原体関連分子パターン−ＰＡＭＰｓと呼ばれる）、例えば、リポ多糖及びＣｐＧ ＤＮＡ（図１）を認識することを担っている重要表面分子として現れたＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲｓ）の役割に最近特に注目が集まった[Medzhitov, et al., Semin. Immunol., 10:351-353, (1998)]。ＴＬＲｓは、最初Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（ショウジョウバエ）において同定され、そしてハエ発生並びに真菌及びグラム陽性菌に対する宿主の防御において重要な役割を演じていることが証明された。[Impler, et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 270:53-79, (2002)]。   Toll-like receptors (TLRs) emerged as key surface molecules responsible for recognizing conserved components of pathogenic microorganisms (called pathogen-associated molecular patterns—PAMPs), such as lipopolysaccharide and CpG DNA (FIG. 1) ) Has recently received particular attention [Medzhitov, et al., Semin. Immunol., 10: 351-353, (1998)]. TLRs were first identified in Drosophila and proved to play an important role in fly development and host defense against fungi and gram-positive bacteria. [Impler, et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 270: 53-79, (2002)].

ＴＬＲの関与は、細胞の核にシグナルを伝達し、細胞がある種のタンパク質、例えばサイトカインを産生するのを開始することを誘発させ、宿主防御の他の成分に警報を出す。哺乳動物細胞では、少なくとも１０種のＴＬＲメンバーが存在するらしく、その各々は細胞外リポ多糖（ＬＰＳ）及びｄｓＲＮＡを含む種々の異なる刺激に応答する[Takeda, et al., Ann. Rev. Immunol., 21:335-376, 2003]。リガンド結合に続いて、すべてのＴＬＲｓの細胞質ゾル領域に存在するＴｏｌｌ／インターロイキン（ＩＬ）−１受容体（ＴＩＲ）ドメインによりトリガーされるホモフィリック相互作用(homophilic interactions)をとおして、シグナリング経路が開始される[Akira,Jour.Biol.Chem., 278:38105-38108, 2003]。ＴＬＲ−２、−４及び−5を含む多くのＴＬＲｓは、ＭＹＤ８８と呼ばれる共通のアダプタータンパク質を使用し、このＭＹＤ８８はＴＩＲドメイン及びデスドメイン（ＤＤ）を含有する。ＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ、ＴＲＡＭ及びＴＩＲＡＰ／Ｍａｌと呼ばれるＭＹＤ８８と同様に機能する（ＤＤを欠いているけれども）他のアダプター分子が今や単離され、そしてＴＬＲ活性のモジュレーションにおいて同様に機能する[Horng, et al., Nat. Immunol., 2:835-841, (2001); Oshiumi, et al., Nat. Immunol., 4:161-167, (2003); Yamamoto, et al., Science, 301:640-643, (2003); Yamamoto, et al., Natl. Immunol., 4: 1144-1150, (2003)]。ＭＹＤ８８の常在性ＤＤ(resident DD)は、ＩＬ−１受容体関連キナーゼ(IL-1 receptor-associated kinase)(IRAK)ファミリーのメンバー、例えば、ＴＲＡＦ−６のリン酸化及び活性化に関与するＤＤ含有セリン−トレオニンキナーゼであるＩＲＡＫ−１及び−４、との相互作用を多分促進する[Cao, et al., Science, 271:1128-1131, (1996); Ishida, et al., J. Biol. Chem., 271: 28745-28748, (1996); Muzio, et al., Science, 278:1612-1615, (1997); Suzuki, et al., Nature, 416: 750-756, (2002)]。   The involvement of TLRs signals to the nucleus of the cell, triggers the cell to begin producing certain proteins, such as cytokines, and alerts other components of host defense. In mammalian cells, there appear to be at least 10 TLR members, each of which responds to a variety of different stimuli including extracellular lipopolysaccharide (LPS) and dsRNA [Takeda, et al., Ann. Rev. Immunol. , 21: 335-376, 2003]. Following ligand binding, signaling pathways through homophilic interactions triggered by Toll / interleukin (IL) -1 receptor (TIR) domains present in the cytosolic region of all TLRs Started [Akira, Jour. Biol. Chem., 278: 38105-38108, 2003]. Many TLRs, including TLR-2, -4 and -5, use a common adapter protein called MYD88, which contains a TIR domain and a death domain (DD). Other adapter molecules that function similarly to MYD88 called TRIF / TICAM, TRAM and TIRAP / Mal (although they lack DD) have now been isolated and function similarly in the modulation of TLR activity [Horng, et al ., Nat. Immunol., 2: 835-841, (2001); Oshiumi, et al., Nat. Immunol., 4: 161-167, (2003); Yamamoto, et al., Science, 301: 640- 643, (2003); Yamamoto, et al., Natl. Immunol., 4: 1144-1150, (2003)]. Resident DD of MYD88 is a member of the IL-1 receptor-associated kinase (IRAK) family, for example, DD involved in phosphorylation and activation of TRAF-6 Probably promotes the interaction with IRAK-1 and -4, which are serine-threonine kinases containing [Cao, et al., Science, 271: 1128-1131, (1996); Ishida, et al., J. Biol Chem., 271: 28745-28748, (1996); Muzio, et al., Science, 278: 1612-1615, (1997); Suzuki, et al., Nature, 416: 750-756, (2002)] .

すべてのＴＬＲｓは、結局、転写因子ＮＦ−κＢ並びにマイトジェンで活性化されるタンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫｓ）、細胞外シグナルで調節されるキナーゼ（ＥＲＫ）、ｐ３８及びｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化をもたらす共通のシグナリング経路をトリガーする[Akira, J. Biol. Chem., 278:38105-38108, (2003)]。更に、ＴＬＲ−３又は−４の刺激は、正確な機構はまだ明らかにされていないけれども、多分、非正統的ＩκＢキナーゼ相同体(noncanonical IκB kinase homologues)、ＩκＢキナーゼ−ε（ＩＫＫε）及びＴＡＮＫ結合キナーゼ１(TANK-binding kinase-1)（ＴＢＫ１）のＴＲＩＦ媒介活性化によって、転写因子インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）−３を活性化することができる[Doyle, et al., Immunity, 17: 251-263,(2002): Fitzgerald, et al., Nat. Immunol., 4: 491-496, (2003)]。   All TLRs are ultimately activated by the transcription factors NF-κB and mitogen-activated protein kinases (MAPKs), extracellular signal-regulated kinases (ERK), p38 and c-JunN-terminal kinase (JNK). Triggers a common signaling pathway that results in [Akira, J. Biol. Chem., 278: 38105-38108, (2003)]. Furthermore, although the exact mechanism of TLR-3 or -4 stimulation has not yet been clarified, it is likely that noncanonical IκB kinase homologues, IκB kinase-ε (IKKε) and TANK binding TRIF-mediated activation of kinase 1 (TANK-binding kinase-1) (TBK1) can activate the transcription factor interferon regulator (IRF) -3 [Doyle, et al., Immunity, 17: 251- 263, (2002): Fitzgerald, et al., Nat. Immunol., 4: 491-496, (2003)].

ＮＦ−κＢ、ＥＲＫ／ＪＮＫ及びＩＲＦ−３応答シグナリングカスケードの活性化は、結局、炎症応答を含む自然免疫応答及び適応的免疫応答を調節する多数の遺伝子の転写刺激をもたらす。   Activation of the NF-κB, ERK / JNK and IRF-3 response signaling cascades ultimately results in transcriptional stimulation of numerous genes that regulate innate and adaptive immune responses, including inflammatory responses.

一次自然免疫応答遺伝子、例えば、ＩＦＮ−βの活性化は、抗ウイルス遺伝子を誘発するのみならず、ＮＫ細胞が関与する自然免疫応答、ＤＣｓの成熟並びにケモカイン及びＴ細胞応答を促進するＭＨＣの如き分子のアップレギュレーション、を促進する分子も誘発する。ＩＦＮは、抗体応答の産生のために決定的に重要であることも示された。かくして、自然免疫応答を理解し、そして強力に調節することは、自然免疫応答及び適応的免疫応答の両方のための、新規な治療及びワクチン接種方法並びに疾患をターゲティングする組成物を開発するための好機を与える。   Activation of primary innate immune response genes, such as IFN-β, not only induces antiviral genes, but also innate immune responses involving NK cells, maturation of DCs and MHC that promote chemokine and T cell responses. It also induces molecules that promote molecular up-regulation. IFN has also been shown to be critical for the production of antibody responses. Thus, understanding and strongly modulating the innate immune response is to develop new therapeutic and vaccination methods and disease targeting compositions for both innate and adaptive immune responses. Give an opportunity.

免疫治療の重要な観点は、有効な薬物／抗原送達システムの開発である。細胞に薬物、抗原及び他のシグナル分子を送達するための粒子担体が考案された[Aideh, et al., J. Microencapsul., 14:567-576 (1997); Akbuga, et al., Microencapsul., 13:161-167(1996); Akbuga, et al., Int. J.(1994); Aral, et al., STP Pharm. Sci., 10:83-88(2000)]。これらの送達担体の要件は用途に依存して異なる。例えば、ケモカインの担体は、長期間の時間（通常、日）ロードされた分子の安定な勾配を与える必要があり、そして粒子はファゴサイトーシスされるのを回避するために、相対的に大きい（２００〜７００μm）ことが必要である。   An important aspect of immunotherapy is the development of effective drug / antigen delivery systems. Particle carriers have been devised to deliver drugs, antigens and other signal molecules to cells [Aideh, et al., J. Microencapsul., 14: 567-576 (1997); Akbuga, et al., Microencapsul. 13: 161-167 (1996); Akbuga, et al., Int. J. (1994); Aral, et al., STP Pharm. Sci., 10: 83-88 (2000)]. The requirements for these delivery carriers vary depending on the application. For example, chemokine carriers need to provide a stable gradient of molecules loaded for long periods of time (usually days), and the particles are relatively large to avoid phagocytosis ( 200-700 μm).

他方、抗原がより小さな粒子により担われ、該粒子はそれらの表面を介して細胞と相互作用するのみならず、樹状細胞、マクロファージ又は他の抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）により飲み込まれることもできる場合、免疫感作はより強い。ファゴサイトーシスは、１０μmより小さい粒子で最適であり、これは抗原担体のサイズを規定する。   On the other hand, when antigens are carried by smaller particles that not only interact with cells through their surface, but can also be swallowed by dendritic cells, macrophages or other antigen presenting cells (APCs) Immunization is stronger. Phagocytosis is optimal with particles smaller than 10 μm, which defines the size of the antigen carrier.

キトサンはキチン由来の天然産物である。それは、植物繊維の主要構成物であるセルロースに化学的に類似しており、そして繊維としての多くの性質を有する。キトサンは、粘膜に対する高い付着力(adhesion)及び良好な生物分解性を有し、そして粘膜表面を横切る大きな分子の侵入(penetration)を高める能力も有することが示された[Illum, et al., Pharm. Res., 9: 1326-1331 (1992)]。キトサンナノ粒子は、インシュリンの鼻吸収を改善するのに非常に有効であり、そして破傷風トキソイドに対する局部的及び全身系免疫応答においても非常に有効であることが証明された[Vila, et al., J Controlled Release, 17; 78(1-3): 15-24 (2002)]。免疫系の同様なブーストが、ジフテリアに対するキトサンマイクロ粒子による粘膜ワクチン接種 [Inez, et al., Vaccine, 21:1400-1408(2003)]：経口ワクチン接種後のＤＲに対する保護的全身系及び局所免疫応答及び鼻投与後のＩｇＧ産生の有意な増強において証明された。最近、キトサンは、結腸への送達薬物のための担体として有望であることが示された[Zhang, et al., Biomaterials, 23:2761-2766 (2002)]。   Chitosan is a natural product derived from chitin. It is chemically similar to cellulose, the main constituent of plant fibers, and has many properties as a fiber. Chitosan has been shown to have high adhesion to the mucosa, good biodegradability, and also the ability to enhance penetration of large molecules across the mucosal surface [Illum, et al., Pharm. Res., 9: 1326-1331 (1992)]. Chitosan nanoparticles have been shown to be very effective in improving nasal absorption of insulin and in local and systemic immune responses against tetanus toxoid [Vila, et al., J Controlled Release, 17; 78 (1-3): 15-24 (2002)]. A similar boost of the immune system is mucosal vaccination with chitosan microparticles against diphtheria [Inez, et al., Vaccine, 21: 1400-1408 (2003)]: Protective systemic and local immunity against DR after oral vaccination Demonstrated in response and significant enhancement of IgG production after nasal administration. Recently, chitosan has shown promise as a carrier for drugs delivered to the colon [Zhang, et al., Biomaterials, 23: 2761-2766 (2002)].

発明の要約
本発明の１つの観点は、哺乳動物における自然免疫系をモジュレーションするための組成物に関する。この組成物は、ポリカチオンポリマーを含むマイクロ粒子；ＦＡＤＤ依存性経路のモジュレーター及びＴＬＲ経路のモジュレーターを含み、該ＦＡＤＤ依存性経路のモジュレーター及び該ＴＬＲ経路のモジュレーターは、該マイクロ粒子と会合しており、そして、該マイクロ粒子は抗原提示細胞によりファゴサイトーシスされることができる。 SUMMARY OF THE INVENTION One aspect of the present invention relates to a composition for modulating the innate immune system in a mammal. The composition comprises a microparticle comprising a polycationic polymer; a modulator of a FADD-dependent pathway and a modulator of a TLR pathway, wherein the modulator of the FADD-dependent pathway and the modulator of the TLR pathway are associated with the microparticle And the microparticles can be phagocytosed by antigen presenting cells.

１つの態様では、ＦＡＤＤ依存性経路のモジュレーターは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ポリ（ＩＣ）、ＦＡＤＤ依存性経路の成分、ＦＡＤＤ依存性経路の成分をコードするＤＮＡプラスミド、バクテリア及び真菌(fungus)よりなる群から選ばれる。   In one embodiment, the modulator of the FADD-dependent pathway is a double-stranded RNA (dsRNA), poly (IC), a component of the FADD-dependent pathway, a DNA plasmid encoding a component of the FADD-dependent pathway, bacteria and fungus ).

他の態様では、ＴＬＲ経路のモジュレーターは、ｄｓＲＮＡ、ポリ（ＩＣ）、ウイルスｄｓＲＮＡの合成模倣物(synthetic mimetic)及びＴＬＲのリガンド、バクテリア及び真菌よりなる群から選ばれる。   In another aspect, the modulator of the TLR pathway is selected from the group consisting of dsRNA, poly (IC), a synthetic mimetic of viral dsRNA and a TLR ligand, bacteria and fungi.

他の態様では、マイクロ粒子は、抗原提示細胞に特異的に結合するターゲティング分子で更にコーティングされる。   In other embodiments, the microparticles are further coated with targeting molecules that specifically bind to antigen presenting cells.

本発明の他の観点は、核酸及びタンパク質をロードされたファゴサイトーシス可能なキトサンマイクロ粒子を含む、宿主における免疫系をモジュレーションするための組成物に関する。   Another aspect of the present invention relates to a composition for modulating the immune system in a host comprising phagocytosable chitosan microparticles loaded with nucleic acids and proteins.

本発明のなお更に他の観点は、有効量の上記した組成物を対象(subject)に投与することを含む、対象におけるウイルス、バクテリア、真菌感染及びガンを処置する方法に関する。   Yet another aspect of the present invention relates to a method of treating viruses, bacteria, fungal infections and cancer in a subject comprising administering to the subject an effective amount of the composition described above.

本発明の更に他の観点は、免疫モジュレーションのための多機能性マイクロ粒子を製造する方法に関する。この方法は、沈殿、ゲル化及び噴霧によりキトサンマイクロ粒子を製造する(fabricating)工程、及びキトサンマイクロ粒子を、核酸、タンパク質又はその両方を含む溶液中でインキュベーションする工程を含む。   Yet another aspect of the present invention relates to a method for producing multifunctional microparticles for immune modulation. This method comprises the steps of producing chitosan microparticles by precipitation, gelling and spraying, and incubating the chitosan microparticles in a solution containing nucleic acids, proteins or both.

本発明の他の観点は、自然及び適応的免疫応答を活性化することができる多重／多機能作用物質(multiple/multifunctional agents)を有する粒子を創造することに関する。   Another aspect of the present invention relates to creating particles with multiple / multifunctional agents that can activate natural and adaptive immune responses.

本発明の更に他の観点は、ＦＡＤＤシグナリング経路に関する抗ウイルス遺伝子を同定する方法に関する。この方法は、ＦＡＤＤ欠如細胞(FADD-deficient cells)及び対応する野生型細胞をポリ（ＩＣ）で処理する工程、ポリ（ＩＣ）処理されたＦＡＤＤ欠如細胞及びポリ（ＩＣ）処理された野生型細胞からＲＮＡｓを単離させる工程；単離されたＲＮＡｓを遺伝子アレイにハイブリダイゼーションさせる工程、及びポリ（ＩＣ）処理された野生型細胞と比べてポリ（ＩＣ）処理されたＦＡＤＤ欠如細胞において差次的に発現される(differentially expressed)遺伝子を同定する工程を含む。   Yet another aspect of the invention relates to a method for identifying an antiviral gene associated with a FADD signaling pathway. This method comprises the steps of treating FADD-deficient cells and corresponding wild type cells with poly (IC), poly (IC) treated FADD deficient cells and poly (IC) treated wild type cells. Isolating RNAs from the cells; hybridizing the isolated RNAs to a gene array and differentially in poly (IC) treated FADD deficient cells compared to poly (IC) treated wild type cells Identifying a differentially expressed gene.

発明の詳細な説明
本発明は、抗原に対する自然免疫応答をモジュレーションするための方法及び組成物を提供する。この組成物は、ｆａｓ関連デスドメイン分子（ＦＡＤＤ）／ＲＩＰ依存性経路のためのアクチベーターを含有する。ＦＡＤＤを含むシグナリング経路は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）非依存性であることが見出され、それ故、ＦＡＤＤは、Ｉ型ＩＦＮの産生を含む、重要な抗ウイルス応答の誘発のために決定的に重要な細胞内ｄｓＲＮＡ種の認識において機能することにより、ウイルス感染に対する自然免疫において必須の役割を演じ、そしてそのＦＡＤＤは、バクテリア及び真菌の如き他の病原体の認識にも関与している。その結果として、ＦＡＤＤ関連経路(FADD-related pathway)は、殆ど確実に、病原体による破壊(disruption)のための重要なターゲットであり、そして感染性疾患及びガンを含む種々の疾患における重要な役割を演じることができる。 Detailed Description of the Invention The present invention provides methods and compositions for modulating the innate immune response to an antigen. The composition contains an activator for fas associated death domain molecule (FADD) / RIP dependent pathway. Signaling pathways involving FADD were found to be Toll-like receptor (TLR) independent and hence FADD was determined for the induction of important antiviral responses, including production of type I IFN It plays an essential role in innate immunity against viral infection by functioning in the recognition of important intracellular dsRNA species, and its FADD is also involved in the recognition of other pathogens such as bacteria and fungi. As a result, the FADD-related pathway is almost certainly an important target for disruption by pathogens and plays an important role in various diseases including infectious diseases and cancer. Can play.

特許請求の範囲に与えられた範囲を含めて、明細書及び特許請求の範囲の明白な且つ首尾一貫した理解を提供するために、下記の定義が与えられる。   In order to provide a clear and consistent understanding of the specification and claims, including the scope given in the claims, the following definitions are given.

以後使用される「抗原提示細胞」とは、抗原をプロセッシングし、そしてＴ細胞受容体に提示することにより細胞免疫応答を媒介する免疫担当細胞の異種グループ(heterogeneous group)を指す。伝統的抗原提示細胞は、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞及びＢリンパ球を含むが、それらに限定はされない。濾胞樹状細胞も抗原提示細胞であると考えられる。   As used hereinafter, “antigen-presenting cells” refers to heterogeneous groups of immunocompetent cells that mediate cellular immune responses by processing antigen and presenting it to T cell receptors. Traditional antigen presenting cells include, but are not limited to, macrophages, dendritic cells, Langerhans cells and B lymphocytes. Follicular dendritic cells are also considered to be antigen presenting cells.

「自然免疫応答」は、身体が、微生物、ウイルス、及び身体に対して異物であり、そして潜在的に有害と認識された物質、に対してそれ自体を認識し、そして防御する方法である。自然免疫応答は、広範囲の感染性及び毒性作用物質に対する最初の防御線として機能する。歴史的には、この応答は、ファゴサイトーシス活性を有する細胞、例えばマクロファージ及び多形核細胞、及び／又は強力な細胞傷害性活性を有する細胞、例えば、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マスト細胞及び好酸球に帰されてきた。これらの異なる細胞集団の活性は、集約的に急性期タンパク質として知られている多数の異なる可溶性分子、例えば、インターフェロン、補体カスケードの特異的成分及びサイトカインにより支援され(aided)そして支持され(abetted)、これらの分子は、ファゴサイトーシス及び細胞傷害性活性を高める働きをし、そして組織損傷の部位にこれらの細胞を蓄積させる。これらの最初の防御線が突破されると、次いで、適応的免疫応答の活性化が続いて起こり、多数の異なる特徴のいずれかを発揮することができる特異的免疫応答の形成をもたらす。この獲得免疫応答の発生は、リンパ球の専門的特性である。   An “innate immune response” is a way in which the body recognizes itself and protects against microorganisms, viruses, and substances that are foreign to the body and are perceived as potentially harmful. The innate immune response serves as the first line of defense against a wide range of infectious and toxic agents. Historically, this response has been attributed to cells with phagocytosis activity, such as macrophages and polymorphonuclear cells, and / or cells with strong cytotoxic activity, such as natural killer cells (NK cells), mast cells. And have been attributed to eosinophils. The activities of these different cell populations are aided and supported by a number of different soluble molecules collectively known as acute phase proteins such as interferons, specific components of the complement cascade and cytokines. ), These molecules serve to increase phagocytosis and cytotoxic activity, and accumulate these cells at the site of tissue damage. Once these initial lines of defense are breached, then adaptive immune response activation occurs, resulting in the formation of a specific immune response that can exert any of a number of different features. The development of this acquired immune response is a specialized characteristic of lymphocytes.

自然免疫と比較して、適応的免疫は、身体が種々の抗原にさらされるとき発生し、そしてその抗原に対して特異的な防御を構築する。   Compared to innate immunity, adaptive immunity occurs when the body is exposed to various antigens and builds specific defenses against that antigen.

以後使用される「免疫応答」とは、問題の抗原に対して体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答の哺乳動物対象における発生である抗原を指す。「細胞性免疫応答」とは、Ｔリンパ球及び／又は他の白血球により媒介される免疫応答である。細胞性免疫の１つの重要な観点は、細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」ｓ）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬｓは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によりコードされたタンパク質と会合して存在し、そして細胞の表面に発現されたペプチド抗原、に対する特異性を有する。ＣＴＬｓは、細胞内微生物の破壊又はこのような微生物に感染した細胞の溶解を誘発し、そして促進するのを助ける。   As used hereinafter, “immune response” refers to an antigen that is the occurrence in a mammalian subject of a humoral and / or cellular immune response against the antigen in question. A “cellular immune response” is an immune response mediated by T lymphocytes and / or other leukocytes. One important aspect of cellular immunity involves antigen-specific responses by cytotoxic T lymphocytes (“CTL” s). CTLs have specificity for peptide antigens that exist in association with proteins encoded by the major histocompatibility complex (MHC) and are expressed on the surface of cells. CTLs help to induce and promote the destruction of intracellular microorganisms or the lysis of cells infected with such microorganisms.

本明細書で使用された「抗原」という用語は、抗体により認識されるいかなる作用物質（例えば、いかなる物質、化合物、分子[巨大分子を含む]又は他の部分(moiety)）をも指すが、「免疫原」という用語は、個体において免疫学的応答を誘発することができるいかなる作用物質（例えば、如何なる物質、化合物、分子[巨大分子を含む]又は他の部分(moiety)）をも指す。これらの用語は、個々の巨大分子を指すか、又は抗原性巨大分子の均質又は不均質集団を指すのに使用されうる。この用語は、１つ以上のエピトープを含有するタンパク質分子又はタンパク質分子の少なくとも１つの部分を包含することが意図される。多くの場合に、抗原は免疫原でもあり、かくして「抗原」という用語は、「免疫原」という用語と相互に交換可能にしばしば使用される。その場合に、この物質は、免疫感作された動物の血清中の適切な抗体の存在を検出するためのアッセイにおいて抗原として使用することができる。   As used herein, the term “antigen” refers to any agent (eg, any substance, compound, molecule [including macromolecule] or other moiety) recognized by an antibody, The term “immunogen” refers to any agent (eg, any substance, compound, molecule [including macromolecules] or other moiety) that can elicit an immunological response in an individual. These terms can be used to refer to individual macromolecules or to homogenous or heterogeneous populations of antigenic macromolecules. The term is intended to encompass a protein molecule or at least a portion of a protein molecule that contains one or more epitopes. In many cases, an antigen is also an immunogen, and thus the term “antigen” is often used interchangeably with the term “immunogen”. In that case, the substance can be used as an antigen in an assay to detect the presence of the appropriate antibody in the serum of the immunized animal.

「腫瘍特異的抗原」は、哺乳動物において腫瘍発生の時点で腫瘍細胞中にのみ存在する抗原を指す。例えば、メラノーマ特異的抗原は、メラノーマ細胞においてのみ発現されるが、正常なメラニン細胞では発現されない抗原である。 “Tumor-specific antigen” refers to an antigen that is present only in tumor cells at the time of tumor development in a mammal. For example, a melanoma-specific antigen is an antigen that is expressed only in melanoma cells but not in normal melanocytes.

図２に示されたとおり、ウイルス感染の主要な結果、相当なｄｓＲＮＡ種を発生する事象は、一次自然免疫応答遺伝子、例えばＩＦＮ−βの活性化を含む。ＩＦＮ−βの産生は、抗ウイルス遺伝子を誘発するのみならず、ＮＫ細胞が関与する免疫応答、ＤＣｓの成熟、並びにケモカイン及びＴ細胞応答を促進する分子、例えばＭＨＣのアップレギュレーションを促進する分子も誘発する。   As shown in FIG. 2, events that generate significant dsRNA species as a result of viral infection include the activation of primary innate immune response genes such as IFN-β. The production of IFN-β not only induces antiviral genes, but also promotes immune responses involving NK cells, maturation of DCs, and molecules that promote chemokine and T cell responses, such as MHC upregulation Trigger.

図３に示されたとおり、細胞内及び細胞外ｄｓＲＮＡは多岐シグナリング経路を利用してＩＦＮ−βを誘発する。特に、ウイルス複製の結果として発生した細胞内ｄｓＲＮＡ種は、ＴＬＲ非依存性ＦＡＤＤ関連経路により認識される。簡単に言えば、ウイルスｄｓＲＮＡは細胞内受容体分子により認識され、これは、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１を動員して「インネイテオソーム」複合体('innateosome' complex)とし、ＮＦ−κＢ、ＥＲＫ／ＪＮＫ及びＩＲＦ−３経路を活性化する。ＮＦ−κＢ、ＥＲＫ／ＪＮＫ及びＩＲＦ−３応答性シグナリングカスケードの活性化は、炎症性応答を含む自然及び適応的免疫応答を調節する多数の遺伝子の発現をもたらす。他方、ｄｓＲＮＡ及びＬＰＳを含む細胞外ＰＡＭＰｓは、ＴＬＲ関連経路を介して認識され、これはＮＦ−κＢ、ＥＲＫ／ＪＮＫ及びＩＲＦ−３応答シグナリングカスケードの活性化ももたらする。ウイルス感染に加えて、ＦＡＤＤ依存性経路及びＴＬＲ依存性経路の両方共他の病原体、例えば、バクテリア及び真菌の認識にも関与している（例えば、Imler et al. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 270: 53-79, (2002)及び実施例６を参照のこと）。   As shown in FIG. 3, intracellular and extracellular dsRNA induces IFN-β using diverse signaling pathways. In particular, intracellular dsRNA species generated as a result of viral replication are recognized by a TLR-independent FADD-related pathway. Briefly, viral dsRNA is recognized by intracellular receptor molecules, which recruit FADD and RIP1 to an “innateosome” complex, NF-κB, ERK / JNK. And activates the IRF-3 pathway. Activation of NF-κB, ERK / JNK and IRF-3 responsive signaling cascades results in the expression of numerous genes that regulate natural and adaptive immune responses, including inflammatory responses. On the other hand, extracellular PAMPs, including dsRNA and LPS, are recognized via TLR-related pathways, which also results in activation of NF-κB, ERK / JNK and IRF-3 response signaling cascades. In addition to viral infection, both FADD-dependent and TLR-dependent pathways are also involved in the recognition of other pathogens such as bacteria and fungi (see, eg, Immler et al. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 270: 53-79, (2002) and Example 6).

免疫活性化における他の重要な問題は、ＭＨＣ分子によるタンパク質抗原の有効な送達である。図４に示されたとおりＭＨＣ分子への抗原プロセッシング及び送達の経路、細胞質ゾルタンパク質は、プロテオソームにより分解されてペプチド断片を発生し、これは特殊化されたペプチドトランスポーター（ＴＡＰ）により小胞体に輸送される。ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子に結合された後に、ＭＨＣ／ペプチド複合体は、小胞体から放出されてゴルジ装置により細胞表面に移行する。ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体はＣＤ８Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲｓ）に対するリガンドである。細胞外異物抗原は、細胞内小胞、エンドソームに取り込まれる。エンドソーム内のｐＨが次第に下がるにつれて、プロテアーゼが活性化されて、抗原を消化してペプチド断片にする。ＭＨＣクラスＩＩ分子を含有する小胞と融合した後、抗原ペプチドは抗原結合溝に配置される。ロードされたＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体は細胞表面に輸送され、そこでそれらはＣＤ４Ｔ細胞のＴＣＲｓにより認識される。更に、図４に示されたとおり、細胞外又は外因性抗原は、ＤＣｓによりファゴサイトーシスされ、このＤＣは、次いでこれらの抗原をリソソーム区画に局在化させ、そこでタンパク質分解酵素が抗原を消化し、そしてプロセッシングする。次いで抗原は、ＭＨＣクラスＩＩ分子上で細胞表面に移動させられ、決してＤＣの細胞質ゾル中にはない。対照的に、ＤＣの細胞質ゾル中に存在する可溶性タンパク質は、プロテアソームにより連続的に分解される。これらの抗原性分子は、小胞体中のクラスＩＭＨＣと組み合わされ、小胞体はそれらを小胞を介して細胞表面に移動させる。   Another important issue in immune activation is the efficient delivery of protein antigens by MHC molecules. As shown in FIG. 4, the pathway of antigen processing and delivery to MHC molecules, cytosolic proteins, are degraded by the proteosome to generate peptide fragments that are specialized into the endoplasmic reticulum by a specialized peptide transporter (TAP). Transported. After the peptide is bound to the MHC class I molecule, the MHC / peptide complex is released from the endoplasmic reticulum and translocates to the cell surface by the Golgi apparatus. MHC class I / peptide complexes are ligands for T cell receptors (TCRs) of CD8 T cells. Extracellular foreign antigens are taken up into intracellular vesicles and endosomes. As the endosomal pH gradually decreases, proteases are activated to digest the antigen into peptide fragments. After fusing with vesicles containing MHC class II molecules, the antigenic peptide is placed in the antigen binding groove. Loaded MHC class II / peptide complexes are transported to the cell surface where they are recognized by TCRs of CD4 T cells. Furthermore, as shown in FIG. 4, extracellular or exogenous antigens are phagocytosed by DCs, which then localize these antigens to the lysosomal compartment where proteolytic enzymes digest the antigens. And processing. The antigen is then transferred to the cell surface on MHC class II molecules and is never in the cytosol of DC. In contrast, soluble proteins present in the cytosol of DC are continuously degraded by the proteasome. These antigenic molecules are combined with class IMHC in the endoplasmic reticulum, which moves them through the vesicle to the cell surface.

最近、ＭＨＣＩ経路とＭＨＣＩＩ経路の厳密な二分(strict dichotomy)は、外因性タンパク質から発生したペプチドが細胞質ゾルへのアクセスを得ることができ、それ故クラスＩＭＨＣ分子上に提示されることができることを示したいくつかの研究によりチャレンジされた[Roake, et al., J. Exp. Med., 181:2237-2247, 1995; Cumbertach, et al., Immunology, 75:257, 1992; Paglia, et al., J. Exp. Med., 178: 1893-1901, 1993: Porgador, et al., J. Exp. Med., 182:255-260, 1995; Celluzzi, et al., J. Exp. Med., 183:283-287, 1996; Zitvogel, et al., J. exp. Med., 183: 87-97, 1996; Bender, et al., J. Exp. Med., 182:1663-1671, 1995 ]。固体ポリマー微小球(microspheres)に吸収された[Raychaudhuiri, et al., Nat. Biotechnol. 16:1025-1031, 1998］、微小球中にカプセル化された[Maloy, et al., IMMUNOLOGY, 81: 661-667, 1994]、又は抗体との免疫複合体の形態で凝集させた[Rodriguez, et al., Nat. Cell Biol., 1:362-368, 1999]、粒子状形態で送達された抗原は、抗原がクラスＩＭＨＣ上にロードされることを可能とする有効な「交差提示("cross-presentation")」経路をトリガーすることが発見された。   Recently, the strict dichotomy of the MHCI and MHCII pathways has shown that peptides generated from exogenous proteins can gain access to the cytosol and can therefore be presented on class IMHC molecules. [Roake, et al., J. Exp. Med., 181: 2237-2247, 1995; Cumbertach, et al., Immunology, 75: 257, 1992; Paglia, et al ., J. Exp. Med., 178: 1893-1901, 1993: Porgador, et al., J. Exp. Med., 182: 255-260, 1995; Celluzzi, et al., J. Exp. Med. , 183: 283-287, 1996; Zitvogel, et al., J. exp. Med., 183: 87-97, 1996; Bender, et al., J. Exp. Med., 182: 1663-1671, 1995 ]. Absorbed in solid polymer microspheres [Raychaudhuiri, et al., Nat. Biotechnol. 16: 1025-1031, 1998] and encapsulated in microspheres [Maloy, et al., IMMUNOLOGY, 81: 661-667, 1994], or aggregated in the form of immune complexes with antibodies [Rodriguez, et al., Nat. Cell Biol., 1: 362-368, 1999], antigen delivered in particulate form Has been found to trigger an effective “cross-presentation” pathway that allows antigens to be loaded onto the class IMHC.

この理解に基づいて、本発明の１つの観点は、細胞内経路及び細胞外経路の両方を交差シグナリングすることができる自然免疫応答をモジュレーションするための組成物を提供する。更に、この組成物は、抗原がクラスＩＭＨＣにロードされることを可能とし、そしてウイルス感染又は腫瘍形成が起こる前にウイルス又は悪性腫瘍抗原に対する免疫反応の発生を可能とする「交差提示」経路をトリガーすることができる。   Based on this understanding, one aspect of the present invention provides a composition for modulating an innate immune response that can cross-signal both intracellular and extracellular pathways. Furthermore, the composition provides a “cross-presentation” pathway that allows antigens to be loaded into class IMHC and allows the generation of immune responses against viral or malignant tumor antigens before viral infection or tumor formation occurs. Can be triggered.

１つの態様では、組成物は、細胞内ＦＡＤＤ依存性シグナリング経路のための第１モジュレーター及び細胞外ＴＬＲ非依存性シグナリング経路のための第２モジュレーターを含有する。モジュレーターは、専門的ＡＰＣ、例えばＤＣによりファゴサイトーシスされうるキトサンをベースとするマイクロ粒子にロードされる。本明細書で使用した、「ロードされた」という用語は、カプセル化又は表面付着によるマイクロ粒子へのアクチベーターの会合を指す。   In one aspect, the composition contains a first modulator for an intracellular FADD-dependent signaling pathway and a second modulator for an extracellular TLR-independent signaling pathway. Modulators are loaded onto chitosan-based microparticles that can be phagocytosed by specialized APCs such as DC. As used herein, the term “loaded” refers to the association of activators to microparticles by encapsulation or surface attachment.

ＦＡＤＤ依存性シグナリング経路のモジュレーターの例は、ｄｓＲＮＡ、ポリ（ＩＣ）、ウイルスｄｓＲＮＡの合成模倣物、ＦＡＤＤ依存性経路の成分、例えば、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１、ＦＡＤＤ経路の成分をコードするＤＮＡ、並びにバクテリア、真菌、及びＦＡＤＤ依存性経路を活性化又は抑制することが知られている他の抗原を含むが、それらに限定はされない。   Examples of modulators of FADD-dependent signaling pathways include dsRNA, poly (IC), synthetic mimics of viral dsRNA, components of FADD-dependent pathways such as FADD and RIP1, DNA encoding components of FADD pathway, and bacteria, Including but not limited to fungi and other antigens known to activate or inhibit FADD-dependent pathways.

ＴＬＲ依存性シグナリング経路のモジュレーターの例は、ＴＬＲリガンド、例えば、ｄｓＲＮＡ、ポリ（ＩＣ）、ウイルスｄｓＲＮＡの合成模倣物及びＬＰＳ；ＴＬＲ依存性経路の成分、例えば、ＭＹＤ８８、ＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ、ＴＲＡＭ及びＴＩＲＡＰ／Ｍａｌ、並びにバクテリア、真菌、及びＴＬＲ依存性経路を活性化又は抑制することが知られている他の抗原を含むが、それらに限定はされない。   Examples of modulators of TLR-dependent signaling pathways include TLR ligands such as dsRNA, poly (IC), synthetic mimics of viral dsRNA and LPS; components of TLR-dependent pathways such as MYD88, TRIF / TICAM, TRAM and TIRAP / Mal and other antigens known to activate or inhibit bacterial, fungal, and TLR dependent pathways, including but not limited to:

ＦＡＤＤ依存性経路のモジュレーターはＴＬＲ依存性経路のモジュレーターとしても機能することができることに留意されるべきである。故に、本発明の組成物中の第１モジュレーターと第２モジュレーターは同じ分子であってもよい。例えば、ｄｓＲＮＡ分子は、ＦＡＤＤ依存性経路とＴＬＲ依存性経路の両方を活性化することができる。ｄｓＲＮＡがＦＡＤＤ依存性経路のサプレッサーをコードするならば、同じ分子が、ＦＡＤＤ依存性経路を抑制しながら、ＴＬＲ依存性経路を活性化することができる。逆に、もしｄｓＲＮＡがＴＬＲ依存性経路のサプレッサーをコードするならば、同じ分子が、ＴＬＲ依存性経路を抑制しながら、ＦＡＤＤ依存性経路を活性化することができる。   It should be noted that modulators of FADD-dependent pathways can also function as modulators of TLR-dependent pathways. Therefore, the first modulator and the second modulator in the composition of the present invention may be the same molecule. For example, dsRNA molecules can activate both FADD-dependent and TLR-dependent pathways. If the dsRNA encodes a suppressor of the FADD-dependent pathway, the same molecule can activate the TLR-dependent pathway while suppressing the FADD-dependent pathway. Conversely, if the dsRNA encodes a suppressor of the TLR dependent pathway, the same molecule can activate the FADD dependent pathway while suppressing the TLR dependent pathway.

ＦＡＤＤ依存性経路のモジュレーターは、ウイルス、バクテリア又は真菌感染により誘発又は抑制される遺伝子産物であることもできる。これに関して、本発明は、ＦＡＤＤ−／−及びＦＡＤＤ＋／＋細胞を使用してＦＡＤＤ依存性経路を介して誘発された抗ウイルス遺伝子、抗バクテリア遺伝子及び抗真菌遺伝子を同定する方法も提供する。図５は、ＦＡＤＤシグナリング経路を介して誘発された抗ウイルス遺伝子を同定するための１つの態様を示す。簡単に言えば、ＦＡＤＤ−／−及びＦＡＤＤ＋／＋細胞をポリ（ＩＣ）で処理する。処理された細胞から単離されたＲＮＡを、遺伝子のＤＮＡアレイにハイブリダイゼーションさせて、ｄｓＲＮＡで誘発された遺伝子を決定する。ｄｓＲＮＡで誘発された遺伝子の発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより更に確認する。   Modulators of FADD-dependent pathways can also be gene products that are induced or suppressed by viral, bacterial or fungal infection. In this regard, the present invention also provides methods for identifying antiviral, antibacterial and antifungal genes induced via FADD-dependent pathways using FADD − / − and FADD + / + cells. FIG. 5 shows one embodiment for identifying antiviral genes induced via the FADD signaling pathway. Briefly, FADD − / − and FADD + / + cells are treated with poly (IC). RNA isolated from treated cells is hybridized to a DNA array of genes to determine dsRNA-induced genes. The expression level of dsRNA-induced genes is further confirmed by quantitative RT-PCR.

他の態様では、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を発生させてｄｓＲＮＡで誘発された遺伝子の発現を阻害し、そしてＲＮＡｉ処理された細胞におけるウイルス感染に対する感受性を検査する。ＲＮＡｉは、相同性ｍＲＮＡの分解を引起すある種の生物及び細胞型へのｄｓＲＮＡの導入の現象である。   In other embodiments, RNA interference (RNAi) is generated to inhibit dsRNA-induced gene expression and the susceptibility to viral infection in RNAi-treated cells is examined. RNAi is a phenomenon of introduction of dsRNA into certain organisms and cell types that causes degradation of homologous mRNA.

ＲＮＡｉは、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓにおいて最初に発見され、そしてそれはそれ以来広範囲の生物で作動することが見出された。近年では、ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡｓ（ｄｓＲＮＡ）を使用して特定の転写産物をマークしてｉｎ ｖｉｖｏで分解する、外因性の、有効で強力な遺伝子特異的サイレンシング技術となった。ＲＮＡｉ技術は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，９１９，６１９及びＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｓ．ＷＯ９９／１４３４６及びＷＯ０１／２９５０８に開示されている。   RNAi was first discovered in the nematode Caenorhabditis elegans and it has since been found to work in a wide range of organisms. In recent years, RNAi has become an exogenous, effective, and powerful gene-specific silencing technology that uses double-stranded RNAs (dsRNA) to mark specific transcripts and degrade in vivo. RNAi technology is described, for example, in U.S. Pat. S. Patent No. 5,919,619 and PCT Publication Nos. It is disclosed in WO99 / 14346 and WO01 / 29508.

１つの態様では、本発明の組成物の第１及び第２モジュレーターは、同じｄｓＲＮＡである。ｄｓＲＮＡをロードされたマイクロ粒子は、ＴＬＲに結合し、そしてＴＬＲ依存性シグナリング経路を活性化するであろう。一方、ｄｓＲＮＡをロードされたマイクロ粒子は、ファゴサイトーシスされ（マクロファージ、ＤＣｓ、単球により）、そしてＦＡＤＤ依存性シグナリング経路を活性化するであろう。好ましくは、ｄｓＲＮＡは、免疫アクチベーターをコードする。細胞の内側に入ると、ｄｓＲＮＡは開かれ(opened)、そして翻訳されて、自然免疫経路を更に活性化する免疫アクチベーターを産生する。例えば、ｄｓＲＮＡは、ＴＬＲ経路の成分、例えば、細胞に導入されるとＩＦＮ−βのＴＬＲ媒介活性化及び他の自然免疫応答を増大させるＴＲＩＦ又はＩＲＡＫｓをコードすることができる。   In one aspect, the first and second modulators of the composition of the invention are the same dsRNA. Microparticles loaded with dsRNA will bind to the TLR and activate the TLR-dependent signaling pathway. On the other hand, microparticles loaded with dsRNA will be phagocytosed (by macrophages, DCs, monocytes) and activate FADD-dependent signaling pathways. Preferably, the dsRNA encodes an immune activator. Once inside the cell, the dsRNA is opened and translated to produce an immune activator that further activates the innate immune pathway. For example, a dsRNA can encode a component of the TLR pathway, such as TRIF or IRAKs that, when introduced into a cell, increases TLR-mediated activation of IFN-β and other innate immune responses.

他の態様では、第１モジュレーターはｄｓＲＮＡであり、そして第２モジュレーターはＴＬＲ経路の成分及びＴＬＲ経路の成分をコードするＤＮＡ分子である。   In other embodiments, the first modulator is a dsRNA and the second modulator is a DNA molecule encoding a component of the TLR pathway and a component of the TLR pathway.

他の態様では、第１モジュレーターはＦＡＤＤ依存性経路の成分、例えば、ＦＡＤＤ、又はＦＡＤＤ依存性経路の成分をコードするＤＮＡ分子であり、そして第２モジュレーターはｄｓＲＮＡである。   In other embodiments, the first modulator is a component of a FADD-dependent pathway, eg, FADD, or a DNA molecule that encodes a component of a FADD-dependent pathway, and the second modulator is a dsRNA.

他の態様では、第１及び第２モジュレーターは、抗原性産物、ＦＡＤＤ経路の成分及び／又は免疫応答を更に高める産物、例えばサイトカイン、のいかなる組み合わせもコードするｄｓＲＮＡ又はＤＮＡ分子である。コードされた産物は、一旦細胞内で発現されると、それぞれ、細胞表面でのＭＨＣＩ又はＭＨＣＩＩ提示のためにエンドソーム経路又はリソソーム経路を介してプロセッシングされるであろう。ｄｓＲＮＡはＦＡＤＤ依存性自然免疫経路を活性化するであろう。このシナリオは、図６に略図で示される。細胞内経路は、免疫応答を促進するのに役割を演じることが提唱されたＰＫＲの活性化もするようである。   In other embodiments, the first and second modulators are dsRNA or DNA molecules that encode any combination of antigenic products, components of the FADD pathway and / or products that further enhance the immune response, such as cytokines. The encoded product, once expressed in the cell, will be processed via the endosomal or lysosomal pathway for MHCI or MHCII presentation at the cell surface, respectively. dsRNA will activate the FADD-dependent innate immune pathway. This scenario is shown schematically in FIG. Intracellular pathways also appear to activate PKR, which has been proposed to play a role in promoting immune responses.

更に他の態様では、ｄｓＲＮＡ含有マイクロ粒子は、ＴＬＲ３に対するリガンドで更にコーティングして、ＴＬＲ３経路を活性化するか、あるいはｇｐ９６又はＶＳＶＧタンパク質のような熱ショックタンパク質で更にコーティングして、専門的ＡＰＣｓ、例えば、ＤＣｓをターゲットとすることができる。   In yet other embodiments, the dsRNA-containing microparticles are further coated with a ligand for TLR3 to activate the TLR3 pathway, or further coated with a heat shock protein such as gp96 or VSVG protein, For example, DCs can be targeted.

他の態様では、マイクロ粒子は、貪食に続いて抑制のための遺伝子をターゲットとすることができるサイレンシングＲＮＡｉ（ｓｉＲＮＡｓ）を表現するｄｓＲＮＡをロードされることができる。１つの態様では、ｓｉＲＮＡは、ＦＡＤＤ依存性経路の成分、例えばＦＡＤＤの発現を抑制し、そして抗原プロセッシングをダウンレギュレーションする。   In other embodiments, the microparticles can be loaded with dsRNA expressing silencing RNAi (siRNAs) that can target genes for suppression following phagocytosis. In one embodiment, the siRNA suppresses expression of a component of a FADD-dependent pathway, such as FADD, and down-regulates antigen processing.

他の態様では、組成物は、ポジティブ鎖ウイルス（例えば、ペスチウイルス、ウシ下痢症ウイルス［ＢＶＤＶ］又はアルファウイルスからの）に基づく自己複製性ＲＮＡ（レプリコン）を含有する。これらのＲＮＡ構築物は、バイシストロンであり(bicistronic)、レプリコンＩＲＥＳ機能にとって重要な５’末端ＯＲＦｓからなり、そして翻訳のための天然開始コドンを含有する。異物遺伝子、例えば、インフルエンザウイルス又は他の病原体からの遺伝子は、第２ＩＲＥＳの下流に配置されることができる。レプリコンは、キトサン粒子上にロードすることができ、そしてｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで抗原特異的細胞をターゲットとするのに使用することができる。一旦ファゴサイトーシスされると、レプリコンは、それ自身を高いレベルに再現して、相当なｄｓＲＮＡを発生させることができ、それは、ＦＡＤＤ／ＲＩＰ依存性経路を活性化し、上記したとおりアジュバントとして機能する。更に、レプリコンは、異物遺伝子を翻訳して、抗原を産生し、この抗原はＭＨＣクラスＩ又はＩＩ経路を介してプロセッシングされて、使用される抗原に対して特異的なＣＤ４及びＣＤ８細胞を刺激する。レプリコンは、プロアポトーシス分子(pro-apoptotic molecules)、例えば、カスパーゼを共発現するために使用することができ、又は細胞死を誘発させるための精製されたプロアポトーシス分子（又は精製されたターゲット抗原）を共ロードされることができ、これは抗原提示プロセスを高めることができる。   In other embodiments, the composition contains a self-replicating RNA (replicon) based on a positive strand virus (eg, from pestivirus, bovine diarrhea virus [BVDV] or alphavirus). These RNA constructs are bicistronic, consist of 5 'terminal ORFs important for replicon IRES function, and contain a natural start codon for translation. Foreign genes, such as genes from influenza viruses or other pathogens, can be placed downstream of the second IRES. The replicon can be loaded onto chitosan particles and used to target antigen-specific cells ex vivo or in vivo. Once phagocytosed, the replicon can reproduce itself to a high level to generate substantial dsRNA, which activates the FADD / RIP-dependent pathway and functions as an adjuvant as described above . In addition, the replicon translates the foreign gene to produce an antigen that is processed through the MHC class I or II pathway to stimulate CD4 and CD8 cells specific for the antigen used. . Replicons can be used to co-express pro-apoptotic molecules, eg, caspases, or purified pro-apoptotic molecules (or purified target antigens) to induce cell death Can be co-loaded, which can enhance the antigen presentation process.

他の態様では、ｄｓＲＮＡ（上記したとおり）のごとき細胞内又は細胞外ＦＡＤＤ又はＴＯＬＬ活性化分子をロードされたキトサン粒子は、精製された抗原、例えば、インフルエンザウイルス又はプロセッシングされてＣＤ４、ＣＤ８細胞を刺激することができる他の病原体関連分子を共ロードされることができる。   In other embodiments, chitosan particles loaded with intracellular or extracellular FADD or TOLL activating molecules, such as dsRNA (as described above), can be purified antigens such as influenza virus or processed CD4, CD8 cells. Other pathogen-related molecules that can be stimulated can be co-loaded.

本発明は、ＦＡＤＤ依存性経路及びＴＬＲ依存性経路のモジュレーターのための送達システムとしてポリカチオンマイクロ粒子を利用する。キチン及びキトサン（キチノサン（chitinosanes））は、水素イオンとの会合を介して中性ｐＨで正の電荷を獲得する多数のアミノ基を有する生物分解性ポリマーである（図７）。他のポリマーから作られたマイクロ粒子と比較して、キトサンをベースとするマイクロ粒子は、減少した凝集及び負に帯電した分子、特に核酸のためのより良好なローディング能力を与える。プロタサン、キトサンのより精製されたバージョンは、本明細書では相互に交換可能に使用されるであろう。   The present invention utilizes polycation microparticles as a delivery system for modulators of FADD-dependent and TLR-dependent pathways. Chitin and chitosan (chitinosanes) are biodegradable polymers with multiple amino groups that acquire a positive charge at neutral pH through association with hydrogen ions (FIG. 7). Compared to microparticles made from other polymers, chitosan-based microparticles provide reduced aggregation and better loading capacity for negatively charged molecules, especially nucleic acids. Protasan, a more purified version of chitosan, will be used interchangeably herein.

本発明の組成物のマイクロ粒子は、３重の目標：送達、身体における（主として）酵素による破壊からの一時的保護及びロードされた生物分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質及びペプチド、モード抗原等）の暴露又は放出、を達成するようにデザインされる。一般に、本発明のマイクロ粒子は、会合したＲＮＡ／ＤＮＡ／タンパク質分子をターゲット細胞に入った後に急速に放出又は暴露して、激しい免疫応答を与えるようにデザインされる。しかしながら、ある用途では、会合した分子、例えば、サイトカインを時間依存的方式で放出することが望ましいことがある。   The microparticles of the composition of the present invention have triple targets: delivery, temporary protection from (mainly) enzymatic destruction in the body and loaded biomolecules (eg dsRNA, DNA, proteins and peptides, modal antigens, etc. ) Exposure or release. In general, the microparticles of the present invention are designed to rapidly release or expose the associated RNA / DNA / protein molecule after entering the target cell to give a vigorous immune response. However, in some applications it may be desirable to release associated molecules, such as cytokines, in a time-dependent manner.

サイトカインの例は、ＩＬ−１２、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１６、ＴＮＦα及びＭＩＦ；並びにケモカイン、例えば、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−３β、ＳＬＣ、ｆＭＬＰ、ＩＬ−８、ＳＤＦ−１α及びＢＬＣを含むが、それらに限定はされない。   Examples of cytokines are IL-12, IL-1α, IL-1β, IL-15, IL-18, IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-4, IL-10, IL-6, IL-17, IL-16 And chemokines such as, but not limited to, MIP-3α, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, MIP-3β, SLC, fMLP, IL-8, SDF-1α and BLC .

キトサンマイクロ粒子は、当該技術分野で知られた方法を使用して製造することができる。Ravi Kumar et al.[Ravi Kumar, et al., Biomaterials, in press, 2003]は、その表面にＤＮＡを有するキトサンで安定化されたＰＬＧＡカチオンナノ粒子を示し；このＤＮＡは水溶液から簡単な混合により結合され、かくして分子の統合性(integrity)及びコンホメーション(conformation)を保存している。他方、担体溶液との激しい混合を伴う標準エマルジョン技術及びエマルゲーションスキーム(emulgation scheme)も、タンパク質抗原と共にプラスミドのキトサンカプセル化にも適当である[Thiele, et al., J.Controlled Release, 76:59-71, 2001]。これらのプロトコールを利用して、前記したｄｓＲＮＡ及び／又はＤＮＡプラスミドと共にサイトカイン又は熱ショックタンパク質の種々の組を有する粒子を調製することができる。   Chitosan microparticles can be produced using methods known in the art. Ravi Kumar et al. [Ravi Kumar, et al., Biomaterials, in press, 2003] shows PLGA cationic nanoparticles stabilized with chitosan with DNA on its surface; Bound, thus preserving the integrity and conformation of the molecule. On the other hand, standard emulsion techniques and emulgation schemes with vigorous mixing with carrier solutions are also suitable for chitosan encapsulation of plasmids along with protein antigens [Thiele, et al., J. Controlled Release, 76: 59-71, 2001]. These protocols can be used to prepare particles having various sets of cytokines or heat shock proteins with the dsRNA and / or DNA plasmids described above.

小さなマイクロ粒子（０．５〜５０ミクロン）を製造するための好ましい方法は、マイクロガン及び改変されたエレクトロスプレー技術であり、これは実施例でより詳細に述べられる。「しわくちゃの紙("crumpled paper")」形状は、タンパク質及び核酸のための高い吸着容量のための高い表面積を有するこれらの粒子を可能とした。   Preferred methods for producing small microparticles (0.5-50 microns) are microguns and modified electrospray techniques, which are described in more detail in the examples. The “crumpled paper” shape allowed these particles with high surface area for high adsorption capacity for proteins and nucleic acids.

キトサンポリマーは、架橋剤で架橋することができる。架橋剤の例は、無機ポリイオン、例えば、トリポリホスフェート（ＴＰＰ），硫酸ナトリウム及び有機作用物質、例えば、グルタルアルデヒド及びゲニピン(genipin)を含むが、それらに限定はされない。   The chitosan polymer can be crosslinked with a crosslinking agent. Examples of cross-linking agents include, but are not limited to, inorganic polyions such as tripolyphosphate (TPP), sodium sulfate and organic agents such as glutaraldehyde and genipin.

キトサン粒子中への核酸及び／又はタンパク質のローディングは、核酸及び／又はタンパク質をマイクロ粒子の製造期間中にキトサンと直接混合すること、予備製造されたマイクロ粒子を核酸及び／又はタンパク質溶液で外部的に飽和させること、又はそれらの組み合わせにより達成することができる。実施例で示されたとおり、外部的飽和方法は直接混合法よりも高いローディング効率を与える。しかしながら、２つの方法の組み合わせは、ローディング効率を高めるのに相乗効果を示した。   The loading of nucleic acids and / or proteins into chitosan particles can be achieved by mixing nucleic acids and / or proteins directly with chitosan during the production of microparticles, pre-manufactured microparticles externally with nucleic acid and / or protein solutions. Saturation or a combination thereof. As demonstrated in the examples, the external saturation method gives higher loading efficiency than the direct mixing method. However, the combination of the two methods showed a synergistic effect in increasing loading efficiency.

本発明のマイクロ粒子は、ＡＰＣｓ、例えばＤＣｓ及びマクロファージ並びにそれらの前駆体、例えば、単球により有効にファゴサイトーシスされ、そしてプロセッシングされるのに十分に小さい。好ましい態様では、マイクロ粒子のサイズは、０．５〜７０ミクロンの範囲にあり、更に好ましくは、０．５〜２０ミクロンの範囲にある。例えば、図8は、単球由来のヒトＤＣｓによりファゴサイトーシスされたポリスチレンビーズ、４．５μmを示す[(Thiele et al., J cont. release 76:59-71(2001))   The microparticles of the present invention are small enough to be effectively phagocytosed and processed by APCs such as DCs and macrophages and their precursors such as monocytes. In a preferred embodiment, the microparticle size is in the range of 0.5 to 70 microns, more preferably in the range of 0.5 to 20 microns. For example, FIG. 8 shows 4.5 μm polystyrene beads phagocytosed by monocyte-derived human DCs [(Thiele et al., J cont. Release 76: 59-71 (2001)).

他の態様では、マイクロ粒子のファゴサイトーシス的性質は、親水性キトサンポリマーと１種以上の疎水性ポリマーとの混合物を使用することにより改変される。マイクロ粒子のサイズ及び表面性質のモジュレーションは、ＴＲＲ／ＦＡＤＤ経路の活性化の相対的有効性を制御するための格別の手段となるであろうということが考えられる。ファゴサイトーシスには不適当なより大きく且つより親水性の粒子に切り替えることにより、ｄｓＲＮＡシグナル分子を主としてＴＲＲ表面に暴露することが可能である。ナノサイズのキトサン粒子は、実施例に記載の方法を使用して製造することができる。数百マイクロメートルまでのより大きいキトサン粒子は、Denkbas et al.のプロトコールを使用して合成することができる[Denkbas, et al.,Rreactive & Functional Polymers, 50: 225-232, (2002)]   In other embodiments, the phagocytotic properties of the microparticles are modified by using a mixture of hydrophilic chitosan polymer and one or more hydrophobic polymers. It is conceivable that modulation of microparticle size and surface properties would be an exceptional tool to control the relative effectiveness of TRR / FADD pathway activation. By switching to larger and more hydrophilic particles unsuitable for phagocytosis, it is possible to expose dsRNA signal molecules primarily to the TRR surface. Nano-sized chitosan particles can be produced using the methods described in the examples. Larger chitosan particles up to several hundred micrometers can be synthesized using the protocol of Denkbas et al. [Denkbas, et al., Rreactive & Functional Polymers, 50: 225-232, (2002)]

キトサン粒子からの核酸及び／又はタンパク質の放出速度は、キトサンの分子量、キトサンの脱アセチル化の程度、及びキトサンとロードされた生物分子間の重量／チャージ比(weight/charge ratios)を含むいくつかの因子を調節することにより制御されうる。   Nucleic acid and / or protein release rates from chitosan particles include several factors including the molecular weight of chitosan, the degree of chitosan deacetylation, and the weight / charge ratios between the chitosan and loaded biomolecules. Can be controlled by adjusting these factors.

１つの態様では、キトサンをベースとする、ｄｓＲＮＡ／ＤＮＡ／タンパク質をロードされたマイクロ粒子は、サイトカイン又は抗原を含有するポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）マトリックス／マイクロ粒子内にカプセル化される。ＰＬＧＡは生物分解性であることが示され、そしてそれは身体から最終的に除去される毒物学的に許容されうる乳酸及びグリコール酸に分解する。サイトカイン及びキトサン粒子の放出速度は、モノマー比／ＰＬＧＡの分子量を含む、ＰＬＧＡカプセル化に関与するパラメーターを調節することにより更に制御されうる。キトサン／プロタサン（protasan）は親水性であるので、より疎水性のＰＬＧＡ中にキトサン／プロタサン粒子をカプセル化することにより、細胞膜を横切る細胞への粒子の取り込みは高められうる。   In one embodiment, dsRNA / DNA / protein loaded microparticles based on chitosan are encapsulated in poly (lactide-co-glycolide) (PLGA) matrix / microparticles containing cytokines or antigens. The PLGA has been shown to be biodegradable and it degrades to toxicologically acceptable lactic and glycolic acids that are ultimately removed from the body. The release rate of cytokines and chitosan particles can be further controlled by adjusting parameters involved in PLGA encapsulation, including monomer ratio / PLGA molecular weight. Since chitosan / protasan is hydrophilic, encapsulating chitosan / protasan particles in a more hydrophobic PLGA can enhance uptake of the particles into cells across the cell membrane.

あるいは、他のタイプのポリマーを、キトサンをベースとするマイクロ粒子に組み込んで、ロードされた生物分子のための可変放出プロフィルを達成することができる。１つの例では、疎水性ポリマー、例えば、ＰＬＧＡをより親水性のキトサンとブレンドして、カチオンＰＬＧＡ粒子を形成することができる。他の適当なポリマーは、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（オキシブチレート）を含むが、それらに限定はされない。   Alternatively, other types of polymers can be incorporated into chitosan-based microparticles to achieve a variable release profile for loaded biomolecules. In one example, a hydrophobic polymer, such as PLGA, can be blended with more hydrophilic chitosan to form cationic PLGA particles. Other suitable polymers include, but are not limited to, poly (caprolactone), poly (oxybutyrate).

他の別法として、分岐した両親媒性ポリアミン、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を、ＰＬＧＡ又は他の疎水性ポリマーとの組み合わせでキトサンの代わりに使用することができる（図９）。   As another alternative, branched amphiphilic polyamines, poly (ethyleneimine) (PEI) can be used in place of chitosan in combination with PLGA or other hydrophobic polymers (FIG. 9).

キトサン粒子へのより疎水性のドメインの付加は、細胞膜を横切る輸送を促進することができる。他の例は、Liu et al.により述べられたとおり[Liu, et al., k. J. Controlled Release, 43:65-74, 1997]、ポリカチオンキトサンにポリアニオンアルギン酸ナトリウムを添加することにより多孔性粒子を形成することを含む。ポリマーの比を調節することにより、細孔のサイズを制御し、それ故粒子からのｄｓＲＮＡ／サイトカインの放出速度を制御することができる。   The addition of more hydrophobic domains to chitosan particles can facilitate transport across the cell membrane. Other examples are described by Liu et al. [Liu, et al., K. J. Controlled Release, 43: 65-74, 1997] by adding polyanionic sodium alginate to polycationic chitosan. Forming a conductive particle. By adjusting the polymer ratio, the size of the pores can be controlled and hence the rate of dsRNA / cytokine release from the particles.

本発明は、送達ビヒクルとしてカチオンリポソームを使用することも意図する。カチオンリポソームは、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びペプチドのための良好な担体である[Honda, et al., J. Virol. Meth., 58: 41-58, 1996; Nastruzzi, et al., J. Controlled Release, 68: 237-249, 2000; Borgatti, et al., Biochemical Pharmacology, 64: 609-616, 2002; Sioud, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 312:1220-1225; 2003]。一般に、リポソームは、合理的な放出速度論と共にＲＮＡのためのより適切な保護及びより良好な安定化を与える。ファゴサイトーシス、表面電荷及び親水性に関する考慮はリポソームにそのまま適用可能である。リポソームを使用して、ｄｓＲＮＡ及びそその免疫原性代替物、例えば、ポリ（ＩＣ）又はポリ（ＩＣＬＣ）を、小胞(vesicle)中にカプセル化するか及び／又は表面に付着させることができる。脂質カチオン粒子のファゴサイトーシスは、リポソーム表面の疎水性のため親水性コロイドキトサン粒子の場合よりもより顕著でありうる。脂質粒子の適切な１〜５μmサイズを制御してファゴサイトーシスを高めることに特別の注意が払われるであろう。   The present invention also contemplates the use of cationic liposomes as delivery vehicles. Cationic liposomes are good carriers for RNA, DNA and peptides [Honda, et al., J. Virol. Meth., 58: 41-58, 1996; Nastruzzi, et al., J. Controlled Release, 68: 237-249, 2000; Borgatti, et al., Biochemical Pharmacology, 64: 609-616, 2002; Sioud, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 312: 1220-1225; 2003]. In general, liposomes provide better protection for RNA and better stabilization with reasonable release kinetics. Considerations for phagocytosis, surface charge and hydrophilicity can be applied directly to liposomes. Liposomes can be used to encapsulate dsRNA and its immunogenic substitutes, such as poly (IC) or poly (ICLC), in vesicles and / or attached to surfaces. . The phagocytosis of lipid cation particles can be more pronounced than in the case of hydrophilic colloidal chitosan particles due to the hydrophobic nature of the liposome surface. Special care will be taken to control the appropriate 1-5 μm size of the lipid particles to enhance phagocytosis.

１つの態様では、ファゴサイトーシスを介して内部ＦＡＤＤ経路を刺激するためにリポソーム担体が使用されるが、これに対してｄｓＲＮＡを表面ＴＬＲｓに暴露する表面担体として、大きなキトサンマイクロ粒子が使用される。多くの組み合わせをもくろむことができる。   In one embodiment, liposomal carriers are used to stimulate the internal FADD pathway via phagocytosis, whereas large chitosan microparticles are used as surface carriers that expose dsRNA to surface TLRs. . Many combinations can be envisaged.

中心にｄｓＲＮＡを、そして表面にタンパク質ＨＩＶ抗原を有するリポソーム様構造を使用してウイルス様粒子を創り出すことも可能である[Karpenko, et al., Vaccine, 21: 386-302, 2003]（図１０）。図１０は、（１）酵母ｄｓＲＮＡ、（２）スペルミジン−ポリグルシン(polyglucin)−グルタチオンコンジュゲート及び（３）ハイブリッドタンパク質ＴＢＩ−ＧＳＴを含む人工的ウイルス様粒子を示す。１つの態様では、表面にｄｓＲＮＡを、そして中心にタンパク質抗原を有する逆粒子を創り出す。   It is also possible to create virus-like particles using liposome-like structures with dsRNA at the center and protein HIV antigen on the surface [Karpenko, et al., Vaccine, 21: 386-302, 2003] (FIG. 10 ). FIG. 10 shows artificial virus-like particles comprising (1) yeast dsRNA, (2) spermidine-polyglucin-glutathione conjugate, and (3) hybrid protein TBI-GST. In one embodiment, a reverse particle is created having a dsRNA on the surface and a protein antigen in the center.

１つの態様では、交差シグナリング自然免疫経路は、ファゴサイトーシスを受けるマイクロ粒子中にカプセル化されたバクテリア又は真菌で達成される。データは、ＴＬＲ経路はグラム陽性菌に対する宿主防御に影響を与えるが、これに対してｉｍｄ（ＦＡＤＤ）経路は、グラム陰性菌及び真菌に対する活性を及ぼすことを示す。   In one aspect, cross-signaling innate immune pathways are achieved with bacteria or fungi encapsulated in microparticles that undergo phagocytosis. The data show that the TLR pathway affects host defense against gram positive bacteria, whereas the imd (FADD) pathway exerts activity against gram negative bacteria and fungi.

他の態様では、交差シグナリング自然免疫経路は、ファゴサイトーシスを受けるマイクロ粒子にカプセル化された腫瘍抗原又は腫瘍抗原をコードするポリヌクレオチドにより達成される。   In other embodiments, the cross-signaling innate immunity pathway is achieved by a tumor antigen or polynucleotide encoding a tumor antigen encapsulated in a microparticle that undergoes phagocytosis.

本発明の化合物及び方法の好ましい態様は、説明することを意図しており、限定することを意図しない。修飾(modifications)及び変異(variations)は、上記教示に照らして当業者によりなされうる。本発明を、ガスサンプル中のアセトンレベルを測定するという他の目的、例えば空気品質を監視するために使用することができることも、当業者には考えられうる。故に、特許請求の範囲により定められるとおりに記載されているその範囲内にある開示された特定の態様において変更(changes)がなされうることは理解されるべきである。   Preferred embodiments of the compounds and methods of the present invention are intended to be illustrative and not limiting. Modifications and variations can be made by those skilled in the art in light of the above teachings. It can also be considered by those skilled in the art that the present invention can be used for other purposes of measuring the acetone level in a gas sample, for example to monitor air quality. Thus, it is to be understood that changes may be made in the particular embodiments disclosed which are within the scope of the claims as defined by the claims.

本発明のなお更なる観点は、本発明の免疫活性化組成物を使用して種々の疾患を予防又は処置する方法に関する。   A still further aspect of the present invention relates to a method for preventing or treating various diseases using the immunostimulatory composition of the present invention.

1つの態様では、本発明の組成物は、感染性疾患の予防又は処置のために哺乳動物に投与される。感染性疾患の例は、ウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；インフルエンザウイルス（ＩＮＶ）；脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、パラインフルエンザウイルス；ライノウイルス；Ａ型肝炎ウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス；アプトウイルス(apthovirus)；コクサッキーウイルス；風疹ウイルス；ロタウイルス；デンクウイルス(Denque virus)；黄熱ウイルス；日本脳炎ウイルス；感染性気管支炎ウイルス；ブタ伝染性胃腸炎ウイルス；呼吸器合胞体ウイルス；パピローマウイルス；単純ヘルペスウイルス；水痘ウイルス(varicellovirus)、サイトメガロウイルス；痘瘡ウイルス；ワクシニアウイルス；スイポックスウイルス及びコロナウイルスにより引起される疾患を含むが、それらに限定はされない。   In one embodiment, the composition of the invention is administered to a mammal for the prevention or treatment of infectious diseases. Examples of infectious diseases are viruses such as human immunodeficiency virus (HIV); influenza virus (INV); encephalomyocarditis virus (EMCV), stomatitis virus (VSV), parainfluenza virus; rhinovirus; hepatitis A virus Hepatitis B virus; hepatitis C virus; apthovirus; coxsackie virus; rubella virus; rotavirus; denque virus; yellow fever virus; Japanese encephalitis virus; infectious bronchitis virus; Gastroenteritis virus; respiratory syncytial virus; papilloma virus; herpes simplex virus; varicella virus, cytomegalovirus; variola virus; vaccinia virus; diseases caused by suipox virus and coronavirus Limited No.

感染性疾患の更なる例は、微生物、例えば、Actinobacillus actinomycetemcomitans; Bacille Calmette-Gurin; Blastomyces dermatitidis; Bordetella pertussis; Campylobactor consisus; Campylobacter recta; Candida albicans; Capnocytophaga sp.; Chlamydia trachomatis; Eikenella corrodens; Entamoeba histolitica; Enterococcus sp.; Escherichia coli; Eubacterium sp.; Haemophilus influenzae; Lactobacillus acidophilus; Leishmania sp.; Listeria monocytogenes; Mycobacterium vaccae; Neisseria gonorrhoeae; Neisseria meningitidis; Nocardia sp.; Pasteurella multocida; Plasmodium falciparum; Porphyromonas gingivalis; Prevotella intermedia; Pseudomonas aeruginosa; Rothia dentocarius; Salmonella typhi; Salmonella typhimurium; Serratia marcescens; Shigella dysenteriae; Streptococcus mutants; Streptococcus pneumoniae; Streptococcus pyogenes; Treponema denticola; Trypanosoma cruzi; Vibrio cholera; 及びYersinia enterocoliticaにより引起される疾患を含むが、それらに限定はされない。   Additional examples of infectious diseases are microorganisms such as Actinobacillus actinomycetemcomitans; Bacille Calmette-Gurin; Blastomyces dermatitidis; Bordetella pertussis; Campylobactor contaus; Campylobacter recta; Candida albicans; sp .; Escherichia coli; Eubacterium sp .; Haemophilus influenzae; Lactobacillus acidophilus; Leishmania sp .; Listeria monocytogenes; Mycobacterium vaccae; Neisseria gonorrhoeae; Neisseria meningocdis; Nocardia sp .; Pasteurella multocida; Plasmodium falciparum; ; Rothia dentocarius; Salmonella typhi; Salmonella typhimurium; Serratia marcescens; Shigella dysenteriae; Streptococcus mutants; Streptococcus pneumoniae; Streptococcus pyogenes; Treponema denticola; Trypanosoma cruzi; Vibrtic cholera; The No.

他の態様では、本発明の組成物は、ガンの処置のために哺乳動物に投与される。ガンの例は、乳ガン、結腸−直腸ガン、肺ガン、前立腺ガン、皮膚ガン、骨ガン(osteocarcinoma)及び肝臓ガンを含むが、それらに限定はされない。   In other embodiments, the compositions of the invention are administered to a mammal for the treatment of cancer. Examples of cancer include but are not limited to breast cancer, colon-rectal cancer, lung cancer, prostate cancer, skin cancer, osteocarcinoma and liver cancer.

本発明は、更に、ＦＡＤＤアクチベーター及び薬学的に許容されうる担体を含む医薬組成物に関する。この医薬組成物は、皮下に、非経口的に、静脈内に、皮内に、筋肉内に、経皮的に、腹腔内に又は肺への吸入又はミストスプレー送達のどれかにより投与することができる。   The present invention further relates to a pharmaceutical composition comprising a FADD activator and a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutical composition should be administered subcutaneously, parenterally, intravenously, intradermally, intramuscularly, transdermally, intraperitoneally or by pulmonary inhalation or mist spray delivery. Can do.

担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）又はそれらの適当な混合物及び／又は植物油、固体マイクロ粒子又はリポソームを含有する溶媒又は分散媒質であることができる。適当な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用、ディスパージョンの場合には必要な粒子サイズの維持及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗バクテニア剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により行うことができる。多くの場合に、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいことがある。吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物において使用することにより、注射可能な組成物の長期の吸収をもたらすことができる。   The carrier can be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (for example, glycerin, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol, and the like), or suitable mixtures thereof, and / or vegetable oils, solid microparticles, or liposomes. Can do. The proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by the maintenance of the required particle size in the case of dispersion and by the use of surfactants. Prevention of the action of microorganisms can be carried out with various antibactenial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal and the like. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars or sodium chloride. Agents that delay absorption, for example, aluminum monostearate and gelatin, can be used in the compositions to provide long-term absorption of the injectable compositions.

水性溶液における非経口投与のためには、例えば、溶液は必要ならば適当に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤は最初に十分な塩又はグルコースにより等張性とされる。これらの特定の水性溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内及び腹腔内投与に特に適当である。これに関連して、使用することができる無菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に知られるであろう。例えば、１用量(one dosage)を等張性ＮａＣｌ溶液１ml中に溶解させ、そして大量皮下注射流体(hypodermoclysis fluid)１０００mlに加えるか、又は提唱された注入部位に注射することができる（例えば、"Remington's Pharmaceutical Science" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580）。用量のいくらかの変動は、処置される対象の条件に依存してやむを得ず行われるであろう。いずれにせよ、投与の責任者が、個々の対象について適当な服用量(dose)を決定する。更に、ヒト投与では、製剤は、FDA Office of Biologics標準により要求される、無菌性、発熱原性(pyrogenicity)、一般的安全性及び純度標準を満足する必要がある。 For parenteral administration in aqueous solutions, for example, the solution should be suitably buffered if necessary, and the liquid diluent is first made isotonic with sufficient salt or glucose. These particular aqueous solutions are particularly suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous, intratumoral and intraperitoneal administration. In this regard, sterile aqueous media that can be used will be known to those of skill in the art in light of the present disclosure. For example, one dosage can be dissolved in 1 ml of isotonic NaCl solution and added to 1000 ml of hypodermoclysis fluid or injected into a proposed infusion site (eg, “ Remington's Pharmaceutical Science "15 th Edition , pages 1035-1038 and 1570-1580). Some variation in dosage will be inevitable depending on the condition of the subject being treated. In any case, the person responsible for administration will determine the appropriate dose for the individual subject. In addition, for human administration, the formulation must meet sterility, pyrogenicity, general safety and purity standards as required by the FDA Office of Biologics standards.

無菌注射液は、必要に応じて上記に列挙された種々の他の成分と共に適当な溶媒中に必要な量で活性化合物を加え、続いてろ過滅菌することにより製造される。一般に、ディスパージョンは、基本的分散媒体及び上記に列挙された成分からの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル中に種々の滅菌された活性成分を加えることにより製造される。無菌の注射液の製造用の無菌粉末の場合には、好ましい製造方法は、活性成分＋任意の追加の所望の成分の粉末を、先に無菌ろ過されたそれらの溶液から生じさせる真空乾燥及び凍結乾燥技術である。本発明のマイクロ粒子は、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Chiron, Corp. Emeryville, CA）を使用して表皮に投与することもできる。Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔの送達技術は、ヘリウムガスジェット内で超音速に微細な粒子を加速することにより働き、そして医薬及びワクチンを苦痛なしに又は針を使用しないで、皮膚及び粘膜注射部位に送達する。   Sterile injectable solutions are prepared by adding the active compound in the required amount, in an appropriate solvent, together with the various other ingredients listed above as required, followed by filter sterilization. Generally, dispersions are made by adding various sterilized active ingredients in a sterile vehicle that contains the basic dispersion medium and the required other ingredients from those enumerated above. In the case of sterile powders for the production of sterile injectable solutions, the preferred method of manufacture is to vacuum dry and freeze the active ingredient plus any additional desired ingredient powder from those previously sterile filtered solutions It is a drying technique. The microparticles of the present invention can also be administered to the epidermis using the Powdersystem (Chiron, Corp. Emeryville, CA). Powderject's delivery technology works by accelerating fine particles at supersonic speeds in a helium gas jet and delivers drugs and vaccines to the skin and mucosal injection sites without pain or using needles.

本明細書に開示された組成物は、中性又は塩形態で配合することができる。薬学的に許容されうる塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成された）を含み、該酸付加塩は、無機酸、例えば塩酸又はリン酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の如き有機酸と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄、並びにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の如き有機塩基から誘導することもできる。処方(formulation)されると、溶液は、投与処方(dosage formulation)に適合性の方式で且つ治療的に有効であるような量で投与されるであろう。配合物(formulations)は、注射液、薬物放出カプセル等の如き種々の投与形態で容易に投与することができる。   The compositions disclosed herein can be formulated in neutral or salt form. Pharmaceutically acceptable salts include acid addition salts (formed with the free amino group of the protein), which are inorganic acids such as hydrochloric acid or phosphoric acid, or acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, mandel Formed with organic acids such as acids. Salts formed with free carboxyl groups are derived from, for example, sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide, calcium hydroxide or ferric hydroxide, and organic bases such as isopropylamine, trimethylamine, histidine, procaine, etc. You can also Once formulated, the solution will be administered in a manner compatible with the dosage formulation and in an amount that is therapeutically effective. Formulations can be readily administered in a variety of dosage forms such as injection solutions, drug release capsules and the like.

「薬学的に許容されうる」又は「薬理学的に許容されうる」という語句は、ヒトに投与されるときアレルギー反応又は同様な都合の悪い反応を生じない分子実体(molecular entities)及び組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含有する水性組成物の製造は、当該技術分野で周知されている。典型的には、このような組成物は、注射可能な液体溶液又は懸濁液として製造され、注射の前に液体に溶解又は懸濁させるのに適当な固体形態も製造されうる。   The phrase “pharmaceutically acceptable” or “pharmacologically acceptable” refers to molecular entities and compositions that do not produce an allergic reaction or similar untoward reaction when administered to humans. Point to. The manufacture of aqueous compositions containing proteins as active ingredients is well known in the art. Typically, such compositions are prepared as injectable liquid solutions or suspensions, and solid forms suitable for dissolution or suspension in liquid prior to injection can also be prepared.

本明細書で使用された「治療的に有効な量」という用語は、器官又は組織における所望の治療効果又は予防効果を少なくとも部分的に達成するその量である。ＦＡＤＤ欠失関連疾患（例えば感染性疾患及びガン）又は状態の予防及び／又は治療処置をもたらすのに必要なＦＡＤＤアクチベーターの量は、それ自体固定されていない。有効量は、使用される組成物の本質及び形態、必要とされる保護の程度又は疾患の重篤性又は処置されるべき状態に必ず依存する。   The term “therapeutically effective amount” as used herein is that amount that at least partially achieves the desired therapeutic or prophylactic effect in the organ or tissue. The amount of FADD activator required to provide prophylactic and / or therapeutic treatment of FADD deficiency related diseases (eg infectious diseases and cancer) or conditions is not itself fixed. The effective amount necessarily depends on the nature and form of the composition used, the degree of protection required or the severity of the disease or condition to be treated.

本発明を下記の実施例により更に説明するが、該実施例は限定するものとみなすべきではない。本願全体にわたり引用されたすべての参考文献、特許及び公開された特許出願並びに図及び表は、参照により本明細書に組み込まれる。   The invention is further illustrated by the following examples, which should not be construed as limiting. All references, patents and published patent applications and figures and tables cited throughout this application are hereby incorporated by reference.

実施例１：ＦＡＤＤ欠如繊維芽細胞はウイルス感染に対して感受性である。
ＦＡＤＤを欠いたマウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）はウイルス感染に対して超感受性であるらしいと観察される[Balachandran, et al., J.Virol., 74:1513-1523, 2000]。この表現型を更に検査するために、ＩＦＮ感受性、原型ラブドウイルス水痘性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を使用するＦＡＤＤ＋／−及びＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓにおけるウイルス複製の詳細な分析を行った。 Example 1: FADD-deficient fibroblasts are susceptible to viral infection .
It is observed that mouse embryo fibroblasts (MEFs) lacking FADD appear to be supersensitive to viral infection [Balachandran, et al., J. Virol., 74: 1513-1523, 2000]. To further examine this phenotype, a detailed analysis of viral replication in FADD +/− and FADD − / − MEFs using IFN-susceptible, prototypical rhabdovirus varicella stomatitis virus (VSV) was performed.

簡単に言えば、ＦＡＤＤ＋／−及び−／−ＭＥＦｓを、１８時間のＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５ng/ml）予備処理のあるなしで、ＶＳＶ（ＭＯＩ＝５）を感染させ、そして顕微鏡写真を感染の４８時間後に撮った。感染の後、ＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓにおいてＶＳＶ複製が有意に増加した（＞１００倍）ことが観察され、これは付随的にその野生型対応物と比べて速い細胞溶解を受けた（図１１ａ）。   Briefly, FADD +/− and − / − MEFs were infected with VSV (MOI = 5) with or without 18 hours of IFNα / β (500 U / ml) or IFN-γ (5 ng / ml) pretreatment. And micrographs were taken 48 hours after infection. Following infection, a significant increase (> 100-fold) in VSV replication was observed in FADD − / − MEFs, which concomitantly received faster cell lysis compared to its wild type counterpart (FIG. 11a). .

更に、カスパーゼ−８＋／＋及び−／−ＭＥＦｓを、１８時間のＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５mg/ml）予備処理のあるなしで、ＶＳＶ（m.o.i.＝５）を感染させ、そして顕微鏡写真を感染の４８時間後に撮った。Ｉ型（α／β）又はＩＩ型（γ）ＩＦＮによる１２時間のＭＥＦｓの処置は、正常な細胞における有意な抗ウイルス活性を発揮すると思われたが、予想されたように、これらの重要な抗ウイルスサイトカインは、２４時間までの間ＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓにおいてウイルス複製の開始を遅らせただけであり、その後、ウイルス複製は抑制されないで進行した（図１１ｂ−ｅ）（図１１ｃにおいて、感染後の指示された時間に、培地をＢＨＫ細胞に関する標準プラークアッセイにより子孫ウイルスの存在を検査した）。観察された感染に対する感受性は、ＶＳＶに限定されなかった。何故ならば、ＦＡＤＤを欠いた細胞は、インフルエンザウイルス（ＩＮＶ）及び脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）を含む他のウイルス型にも感受性であったからである（図１２）。これらのデータは、ＦＡＤＤがウイルス感染に対する宿主防御において役割を発揮することを示すので、観察された抗ウイルス活性が規定カスパーゼ８依存性シグナリング経路により支配されているかどうかに関して更なる調査を行った[Muzio, et al., Cell, 85: 817-827, 1996]。しかしながら、カスパーゼ８を欠くＭＥＦｓは、コントロール細胞に比べてＶＳＶ感染に対する過剰な感受性を示さず、ＩＦＮの抗ウイルス効果に応答する能力を保持していた（図１１ｆ）。図１１ｆにおいて、ＩＦＮ予備処理は、カスパーゼ−８＋／＋及び−／−ＥＦｓの両方においてＶＳＶ複製を有意に阻害する。カスパーゼ−８＋／＋及び−／−ＭＥＦｓを、１８時間のＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５mg/ml）予備処理のあるなしで、ＶＳＶ（m.o.i.＝５）を感染させた。感染後の指示された時間に、培地をＢＨＫ細胞に関する標準プラークアッセイにより子孫ウイルスの存在を検査した。図１１は、ＦＡＤＤがカスパーゼ−８非依存性経路をとおして抗ウイルス活性を発揮することを証明する。   In addition, caspase-8 + / + and − / − MEFs were infected with VSV (moi = 5) with or without 18 hours of IFNα / β (500 U / ml) or IFN-γ (5 mg / ml) pretreatment. And photomicrographs were taken 48 hours after infection. Treatment of MEFs for 12 hours with type I (α / β) or type II (γ) IFN appeared to exert significant antiviral activity in normal cells, but as expected, these important Antiviral cytokines only delayed the onset of viral replication in FADD-/-MEFs for up to 24 hours, after which viral replication proceeded unrepressed (Fig. 11b-e) (Fig. 11c, post-infection At the indicated times, the medium was examined for the presence of progeny virus by a standard plaque assay for BHK cells). The observed susceptibility to infection was not limited to VSV. This is because cells lacking FADD were also sensitive to other virus types including influenza virus (INV) and encephalomyocarditis virus (EMCV) (FIG. 12). Since these data indicate that FADD plays a role in host defense against viral infection, further investigation was conducted as to whether the observed antiviral activity is governed by a defined caspase-8-dependent signaling pathway [ Muzio, et al., Cell, 85: 817-827, 1996]. However, MEFs lacking caspase-8 did not show excessive susceptibility to VSV infection compared to control cells and retained the ability to respond to the antiviral effect of IFN (FIG. 11f). In FIG. 11f, IFN pretreatment significantly inhibits VSV replication in both caspase-8 + / + and − / − EFs. Caspase-8 + / + and − / − MEFs were infected with VSV (m.o.i. = 5) with or without 18 hours of IFNα / β (500 U / ml) or IFN-γ (5 mg / ml) pretreatment. At the indicated time after infection, the medium was examined for the presence of progeny virus by a standard plaque assay for BHK cells. FIG. 11 demonstrates that FADD exerts antiviral activity through a caspase-8 independent pathway.

実施例２：ＩＦＮシグナリングはＦＡＤＤの不存在下に欠如しない
Ｉ型及びＩＩ型ＩＦＮへの暴露は、ＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓをウイルス複製から完全に保護することはできなかったので、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路による効果的なＩＦＮシグナリングは、活性のために機能的ＦＡＤＤを必要としうることはもっともと思われた。ＩＦＮ媒介シグナリングにおけるＦＡＤＤの潜在的要求を分析するために、ＦＡＤＤ＋／−及びＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓを、Ｉ型及びＩＩ型ＩＦＮで処理し、そして重要なＩＦＮシグナルトランスデューサーＳＴＡＴ１の発現及び活性を測定した[Levy, et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3: 651-662, (2002)]。 Example 2: IFN signaling is not absent in the absence of FADD Exposure to type I and type II IFNs could not completely protect FADD-/-MEFs from viral replication, so the JAK / STAT pathway It seems plausible that effective IFN signaling by may require functional FADD for activity. To analyze the potential requirements of FADD in IFN-mediated signaling, FADD +/− and FADD − / − MEFs are treated with type I and type II IFNs and the expression and activity of the critical IFN signal transducer STAT1 is measured [Levy, et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3: 651-662, (2002)].

しかしながら、Ｙ７０１のリン酸化もＩＦＮ媒介シグナリングも必要ではなく、ＳＴＡＴ１のその後の核トランスロケーションはＦＡＤＤ−／−細胞において害されないようである（図１３ａ−ｃ）。図１３ａでは、ＦＡＤＤ＋／−及び−／−ＭＥＦｓを、指示された時間ＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５mg/ml）で処理し、ＳＴＡＴ１ホスホ−トリオシン７０１特異的抗体(STAT1 phospho-tryosine 701-specific antibody)を使用するイムノブロッティングにより、ＳＴＡＴ１リン酸化状態を決定した。図１３ｂでは、ＦＡＤＤ＋／−及び−／−ＭＥＦｓを、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１融合タンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、ＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５mg/ml）により又はＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５mg/ml）なしで１時間処理し、そしてＳＴＡＴ１局在化をＧＦＰ蛍光顕微鏡法により決定した。図１３ｃでは、ＦＡＤＤ＋／−及び−／−ＭＥＦｓを、ＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５mg/ml）のあるなしで１8時間処理した。これらの細胞から調製された溶解物を、指示されたＩＦＮで誘発されたタンパク質についてイムノブロット分析に付した。   However, neither phosphorylation of Y701 nor IFN-mediated signaling is required, and subsequent nuclear translocation of STAT1 does not appear to be impaired in FADD − / − cells (FIGS. 13a-c). In FIG. 13a, FADD +/− and − / − MEFs were treated with IFNα / β (500 U / ml) or IFN-γ (5 mg / ml) for the indicated times, and STAT1 phospho-triosin 701 specific antibody (STAT1 phospho The STAT1 phosphorylation state was determined by immunoblotting using -tryosine 701-specific antibody). In FIG. 13b, FADD +/− and − / − MEFs were transfected with a plasmid encoding a GFP-STAT1 fusion protein. Twenty-four hours after transfection, the cells were allowed to incubate for 1 hour with IFNα / β (500 U / ml) or IFN-γ (5 mg / ml) or without IFNα / β (500 U / ml) or IFN-γ (5 mg / ml). STAT1 localization was determined by GFP fluorescence microscopy. In FIG. 13c, FADD +/− and − / − MEFs were treated for 18 hours with or without IFNα / β (500 U / ml) or IFN-γ (5 mg / ml). Lysates prepared from these cells were subjected to immunoblot analysis for the indicated IFN-induced proteins.

同様に、ＩＲＦ−１、ＰＫＲ及びＳＴＡＴ２を含む選ばれたＩ型及びＩＩ型ＩＦＮで誘発された遺伝子のＩＦＮに応答する発現は、ＦＡＤＤ−／−細胞では影響を受けなかったようである[Der, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 15623-15628, 1998]。最後に、Ｉ型ＩＦＮ（ＩＳＲＥ）又はＩＩ型（ＧＡＳ）の制御下のルシフェラーゼレポーター遺伝子は、ＩＦＮで処理されたＦＡＤＤ−／−細胞にトランスフェクションされると正常な活性を示した（図１０ｄ）。図１３ｄでは、ＦＡＤＤ＋／−及びＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓをインターフェロンで刺激される応答エレメント（ＩＳＲＥ−Ｌｕｃ）又はインターフェロンガンマアクチベート配列（ＧＡＳ−Ｌｕｃ）の制御下にルシフェラーゼを発現するプラスミドでトランスフェクションした。２４時間後、細胞をＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５ng/ml）のあるなしで刺激し、そしてルシフェラーゼ活性を処理の１８時間後に測定した。これらの観察は、ＩＦＮシグナリング自体はＦＡＤＤの不存在下で弱められないことを示す。   Similarly, expression in response to IFN of selected type I and type II IFN-induced genes including IRF-1, PKR and STAT2 appears to be unaffected in FADD-/-cells [Der , et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 15623-15628, 1998]. Finally, luciferase reporter genes under control of type I IFN (ISRE) or type II (GAS) showed normal activity when transfected into FADD-/-cells treated with IFN (Fig. 10d). . In FIG. 13d, FADD +/− and FADD − / − MEFs were transfected with a plasmid expressing luciferase under the control of an interferon stimulated response element (ISRE-Luc) or an interferon gamma activator sequence (GAS-Luc). After 24 hours, cells were stimulated with or without IFNα / β (500 U / ml) or IFN-γ (5 ng / ml) and luciferase activity was measured 18 hours after treatment. These observations indicate that IFN signaling itself is not weakened in the absence of FADD.

実施例３：ＦＡＤＤの不存在下における細胞内ｄｓＲＮＡによるＩＦＮ−βの欠如した誘発
実施例１及び２における観察にもかかわらず、外因性ＩＦＮへの１２時間の暴露により最初に確立された抗ウイルス状態は、短命であり、多分ウイルス感染の後絶え間ない新規な合成を必要とすることはもっともと思われる（図１１ａ）。例えば、ＶＳＶ感染の後にＦＡＤＤ−／−細胞の培地への組換えＩＦＮ−βの絶え間ない補充は細胞を細胞溶解から保護することが認められた（図１３ｅ−１３ｆ）。図１３ｅにおいて、ＩＦＮで処理したＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓをＶＳＶ（m.o.i.＝５）で感染させ、次いでＩＦＮ−β（５００U／ml）のあるなしで処理した。細胞を感染の４８時間後に写真に撮った。図１３ｆにおいて、ＩＦＮで処理したＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓをＶＳＶ（m.o.i.＝５）で感染させ、次いでＩＦＮ−β（５００U／ml）のあるなしで処理した。細胞生存性及びウイルス子孫収率を感染の４８時間後に測定した。 Example 3: Induction without IFN-β by intracellular dsRNA in the absence of FADD Despite observation in Examples 1 and 2, antivirals initially established by 12 hours exposure to exogenous IFN The condition is short-lived and most likely requires constant new synthesis after viral infection (FIG. 11a). For example, continuous supplementation of recombinant IFN-β to the media of FADD − / − cells after VSV infection was found to protect the cells from cytolysis (FIGS. 13e-13f). In FIG. 13e, FADD-/-MEFs treated with IFN were infected with VSV (moi = 5) and then treated with or without IFN-β (500 U / ml). Cells were photographed 48 hours after infection. In FIG. 13f, FADD-/-MEFs treated with IFN were infected with VSV (moi = 5) and then treated with or without IFN-β (500 U / ml). Cell viability and virus progeny yield were measured 48 hours after infection.

ＩＦＮ産生が常に必要であることは、正常な細胞のＶＳＶ感染の後、分泌されたＩＦＮ−βの抗体媒介中和が、ウイルス感染に対する感受性を再び引起す（図１４ａ及び１４ｂ）ことを証明することにより更に強調された。図１４ａでは、ＦＡＤＤ＋／−細胞をＩＦＮα／β（５００U／ml）で処理し、又は未処理のままにした。次いでこれらの細胞をＶＳＶ（m.o.i.＝５）で感染させ、そして中和性抗ＩＦＮ−β抗血清の存在下又は不存在下に更に４８時間インキュベーションした。感染の４８時間後に写真を撮った（倍率、２００倍）。図１４ｂでは、図１４ａと同じく処理されたＦＡＤＤ＋／−細胞をＶＳＶ子孫収率又はトリパンブルー排除による細胞生存性について検査した。   The constant need for IFN production proves that after VSV infection of normal cells, antibody-mediated neutralization of secreted IFN-β evokes susceptibility to viral infection again (FIGS. 14a and 14b). This was further emphasized. In FIG. 14a, FADD +/− cells were treated with IFNα / β (500 U / ml) or left untreated. These cells were then infected with VSV (m.o.i. = 5) and incubated for an additional 48 hours in the presence or absence of neutralizing anti-IFN-β antiserum. Pictures were taken 48 hours after infection (magnification, 200x). In FIG. 14b, FADD +/− cells treated as in FIG. 14a were examined for VSV progeny yield or cell viability by trypan blue exclusion.

これらの分析は、ウイルス感染後のＩＦＮ−βの産生の欠如は、ウイルス感染に対するＦＡＤＤ−／−細胞の感受性を説明するかもしれないことを示した。この可能性を検査するために、ＦＡＤＤ＋／−及びＦＡＤＤ−／−細胞をＩＦＮ−βプロモーターの制御下にルシフェラーゼレポーター構築物でトランスフェクションし、次いでウイルス感染後のＩＦＮ産生の一次トリガーであると考えられるポリ（ＩＣ）、ウイルスｄｓＲＮＡの合成模倣物、を投与した[Kerr, et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 299:59-67, 1982]。簡単に言えば、ＦＡＤＤ＋／−及びＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓを、ヒトＩＦＮ−βプロモーターの制御下にルシフェラーゼをコードするプラスミドでトランスフェクションした（ＩＦＮ−β−Ｌｕｃ）。２４時間後、これらの細胞を、ポリ（ＩＣ）のみ[５０μg/ml]、トランスフェクションされたポリ（ＩＣ）[リポフェクタミン２０００中の４mg/ml]又はＬＰＳ（５ml／ml）で処理し、そしてルシフェラーゼ活性を処理後６又は２４時間目に測定した。データは、トランスフェクションされたポリ（ＩＣ）は、ＦＡＤＤ＋／−細胞においてＩＦＮ−βプロモーターの強い（＞１０倍）誘発をトリガーしたが、ＦＡＤＤを欠く細胞ではトリガーしなかったことを示す（図１５ａ）。   These analyzes indicated that the lack of production of IFN-β after viral infection may explain the susceptibility of FADD-/-cells to viral infection. To test this possibility, FADD +/− and FADD − / − cells are transfected with a luciferase reporter construct under the control of the IFN-β promoter and then considered to be the primary trigger for IFN production after viral infection Poly (IC), a synthetic mimic of viral dsRNA, was administered [Kerr, et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 299: 59-67, 1982]. Briefly, FADD +/− and FADD − / − MEFs were transfected with a plasmid encoding luciferase under the control of the human IFN-β promoter (IFN-β-Luc). After 24 hours, these cells were treated with poly (IC) alone [50 μg / ml], transfected poly (IC) [4 mg / ml in Lipofectamine 2000] or LPS (5 ml / ml) and luciferase Activity was measured 6 or 24 hours after treatment. The data show that transfected poly (IC) triggered strong (> 10-fold) induction of the IFN-β promoter in FADD +/− cells, but not in cells lacking FADD (FIG. 15a). ).

更に、ＦＡＤＤ＋／−及びＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓを、ポリ（ＩＣ）のみ[５０μg/ml]、トランスフェクションされたポリ（ＩＣ）[リポフェクタミン２０００中の４mg/ml]又はＬＰＳ（５mg／ml）で処理し、そして上清中のＩＦＮ−αを処理の６又は２４時間後にＥＬＩＳＡ（ＰＢＬ）により測定した。トランスフェクションされたｄｓＲＮＡ及びＶＳＶに応答するＩＦＮ産生の欠陥(defect)は、ＩＦＮ産生に特異的なＥＬＩＳＡの後のＦＡＤＤ欠如ＭＥＦｓにおいて確認された（図１５ｂ、そしてデータは示されていない）。   In addition, FADD +/− and FADD − / − MEFs were treated with poly (IC) alone [50 μg / ml], transfected poly (IC) [4 mg / ml in Lipofectamine 2000] or LPS (5 mg / ml). And IFN-α in the supernatant was measured by ELISA (PBL) 6 or 24 hours after treatment. Defects in IFN production in response to transfected dsRNA and VSV were confirmed in FADD-deficient MEFs after an ELISA specific for IFN production (FIG. 15b and data not shown).

図１５ｃにおいて、ＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓを、ＩＦＮ−β−Ｌｕｃと共に、空のベクター（ｐｃＤＮＡ３Ｎｅｏ）又は完全長ｍＦＡＤをコードするｐｃＤＮＡ３Ｎｅｏによりトランスフェクションした。２４時間後に、細胞をポリ（ＩＣ）[リポフェクタミン２０００中の４mg/ml]でトランスフェクションし、そしてルシフェラーゼ活性を６又は２４時間後に測定した。結果は、ＩＦＮ−βのポリ（ＩＣ）で誘発された活性化の回復は、ＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓにマウス（ｍ）ＦＡＤＤを一過性にトランスフェクションすることにより達成されうることを示す（図１５ｃ）。   In FIG. 15c, FADD − / − MEFs were transfected with empty vector (pcDNA3Neo) or pcDNA3Neo encoding full length mFAD along with IFN-β-Luc. After 24 hours, cells were transfected with poly (IC) [4 mg / ml in Lipofectamine 2000] and luciferase activity was measured after 6 or 24 hours. The results show that restoration of poly (IC) -induced activation of IFN-β can be achieved by transient transfection of FADD-/-MEFs with mouse (m) FADD (Figure 15c).

更に、カスパーゼ−８＋／＋及びＰＫＲ−／−細胞をＩＦＮ−β−Ｌｕｃでトランスフェクションした。２４時間後に、これらの細胞をポリ（ＩＣ） [リポフェクタミン２０００中の４mg/ml] でトランスフェクションし、そしてルシフェラーゼ活性を６時間後に測定した。ポリ（ＩＣ）で誘発されたＩＦＮ−β誘発の欠如は、カスパーゼ−８欠如ＭＥＦｓ(caspase-8 deficient MEFs)において明らかではなかった（図１５ｄ）。ＩＦＮ−βの誘発はトランスフェクションされていない外因性ポリ（ＩＣ）のみを使用して強くは観察されなかったので、正常なＭＥＦｓにおいて観察されたＩＦＮ誘発は、殆ど確実に、細胞内ｄｓＲＮＡ認識成分が関与し、そしてＴＬＲ３非依存性であると結論することができる（図１５ａ−ｂ）。しかしながら、シグナリングは、ｄｓＲＮＡで活性化された分子ＰＫＲが関与しないらしく、何故ならば、このキナーゼを欠いたＭＥＦｓは、トランスフェクションされたｄｓＲＮＡに応答してＩＦＮ−β誘発を保持していたからである（図１５ｅ−ｆ）。図１５ｅにおいて、ＰＫＲ＋／＋及びＰＫＲ−／−ＭＥＦｓを、ＩＦＮ−β−Ｌｕｃでトランスフェクションした。２４時間後、これらの細胞をポリ（ＩＣ）[リポフェクタミン２０００中の４mg/ml]でトランスフェクションし、そしてルシフェラーゼ活性を６時間後に測定した。   In addition, caspase-8 + / + and PKR − / − cells were transfected with IFN-β-Luc. After 24 hours, these cells were transfected with poly (IC) [4 mg / ml in Lipofectamine 2000] and luciferase activity was measured after 6 hours. The lack of poly (IC) -induced IFN-β induction was not evident in caspase-8 deficient MEFs (FIG. 15d). Since the induction of IFN-β was not strongly observed using only untransfected exogenous poly (IC), the IFN induction observed in normal MEFs almost certainly is an intracellular dsRNA recognition component. It can be concluded that is involved and is TLR3 independent (FIGS. 15a-b). However, signaling does not appear to involve the dsRNA-activated molecule PKR because MEFs lacking this kinase retained IFN-β induction in response to transfected dsRNA ( Figures 15e-f). In FIG. 15e, PKR + / + and PKR − / − MEFs were transfected with IFN-β-Luc. After 24 hours, these cells were transfected with poly (IC) [4 mg / ml in Lipofectamine 2000] and luciferase activity was measured after 6 hours.

図１５ｆでは、ＦＡＤＤのＲＮＡｉ媒介ノックダウンは、細胞内ｄｓＲＮＡシグナリング経路を無効にするが、ＰＫＲ又はＴＬＲ３はしなかった。ＨｅＬａ細胞をｍＦＡＤＤ、ｈＦＡＤＤ、ＰＫＲ又はＴＬＲ３からのｓｉＲＮＡ配列で処理し、そしてそれぞれの遺伝子産物のノックダウンを、イムノブロッティング及びＲＴ−ＰＣＲにより確認した（データは示されていない）。次いで、これらの細胞をＩＦＮ−β−Ｌｕｃでトランスフェクションし、次いでポリ（ＩＣ）（リポフェクタミン２０００中の４mg/ml）でトランスフェクションした。６時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。   In FIG. 15f, RNAi-mediated knockdown of FADD abolishes the intracellular dsRNA signaling pathway, but not PKR or TLR3. HeLa cells were treated with siRNA sequences from mFADD, hFADD, PKR or TLR3 and the knockdown of each gene product was confirmed by immunoblotting and RT-PCR (data not shown). These cells were then transfected with IFN-β-Luc and then with poly (IC) (4 mg / ml in Lipofectamine 2000). Luciferase activity was measured after 6 hours.

更に、ＶＳＶで感染したＰＫＲ欠如マウスが、ＩＦＮ−βを誘発する強い能力を保持していた（図１５）。観察されたウイルス／ｄｓＲＮＡ媒介活性はＴＬＲ３シグナリングをとおして説明することはできなかった。例えば、我々は、ＭＥＦｓ、ＨｅＬａ及び２９３Ｔ細胞において殆どＴＬＲ３活性を見出さなかった（図１５ｆ−ｇ）。ＨｅＬａ細胞において、ＦＡＤＤのみのｉＲＮＡ媒介欠乏(iRNA-mediated depletion)が、トランスフェクションされたポリ（ＩＣ）に応答してＩＦＮ−βプロモーター活性の殆ど完全な妨害をもたらし、ＰＫＲ又はＴＬＲ３（又は同時に両方）はそうではなかった（図１５ｇ）。図１５ｇにおいて、ＨｅＬａ又はＴＬＲ３を、ＴＬＲ３をコードするプラスミドでトランスフェクションし、そして発現をフローサイトメトリーにより確認した（左）。次いでこれらの細胞を、ＩＦＮ−β−ルシフェラーゼ構築物でトランスフェクションし、次いでポリ（ＩＣ）のみ[５０μg/ml]で処理するか又はポリ（ＩＣ）[リポフェクタミン２０００中の４mg/ml]でトランスフェクションし、そしてルシフェラーゼ活性を６時間後に測定した。   In addition, PKR-deficient mice infected with VSV retained a strong ability to induce IFN-β (FIG. 15). The observed virus / dsRNA-mediated activity could not be explained through TLR3 signaling. For example, we found little TLR3 activity in MEFs, HeLa and 293T cells (FIGS. 15f-g). In HeLa cells, FRNA-only iRNA-mediated depletion results in almost complete blockage of IFN-β promoter activity in response to transfected poly (IC), PKR or TLR3 (or both at the same time) ) Was not (FIG. 15g). In FIG. 15g, HeLa or TLR3 was transfected with a plasmid encoding TLR3 and expression was confirmed by flow cytometry (left). These cells were then transfected with the IFN-β-luciferase construct and then treated with poly (IC) alone [50 μg / ml] or transfected with poly (IC) [4 mg / ml in Lipofectamine 2000]. And luciferase activity was measured after 6 hours.

かくして、これらのデータは、真核細胞においてＴＬＲ３／ＰＫＲ非依存性ｄｓＲＮＡシグナリング経路を推論させるであろう。ＦＡＤＤ媒介抗ウイルス活性の性質を更に詳しく調べるために、ＩＦＮ−βプロモーター活性化に関与した頂点シグナリングカスケード(apical signaling cascades)の各々、即ち、ＮＦ−κＢ、ＡＰ−1及びＩＲＦ３を個々に活性化するためのＶＳＶ又はポリ（ＩＣ）の能力を調べた[Agalioti, et al., Cell, 103: 667-678,2000; Thanos, et al., Cell, 83:1091-1100, 1995]。これらの３つの転写因子の各々に応答するレポーター構築物を使用して、非常に少ないＩＲＦ活性及び適度のＡＰ−１／ＮＦ−κＢ活性が、トランスフェクションされたｄｓＲＮＡに応答して正常なＭＥＦｓにおいて検出された。結果は、多分、これらの細胞型をトランスフェクションすることにおける固有の困難及び個々のプロモーターの弱い活性による（データは示されていない）。しかしながら、ＨｅＬａ細胞におけるＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の強いシグナリングが、トランスフェクションされたポリ（ＩＣ）に応答して観察され、これは、ＦＡＤＤの不存在下に明らかに弱くなったように見えた（図１３ｆ）。かくして、ＦＡＤＤ媒介シグナリングは、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の活性化に関与する。   Thus, these data will infer a TLR3 / PKR-independent dsRNA signaling pathway in eukaryotic cells. To further investigate the nature of FADD-mediated antiviral activity, we individually activated each of the apical signaling cascades involved in IFN-β promoter activation, namely NF-κB, AP-1 and IRF3 The ability of VSV or poly (IC) to test [Agalioti, et al., Cell, 103: 667-678,2000; Thanos, et al., Cell, 83: 1091-1100, 1995]. Using reporter constructs that respond to each of these three transcription factors, very little IRF activity and moderate AP-1 / NF-κB activity is detected in normal MEFs in response to transfected dsRNA It was done. The result is probably due to the inherent difficulties in transfecting these cell types and the weak activity of individual promoters (data not shown). However, strong signaling of NF-κB and AP-1 in HeLa cells was observed in response to transfected poly (IC), which appeared to be clearly weakened in the absence of FADD. (FIG. 13f). Thus, FADD-mediated signaling is involved in the activation of NF-κB and AP-1.

実施例４：ＦＡＤＤの不存在下の正常なｔｏｌｌ受容体シグナリング
ＴＬＲ３は細胞外ｄｓＲＮＡの認識に関与しており、これはＩＲＡＫファミリーメンバー及びＴＲＡＦ６の活性化をとおしてＩＦＮ−βの誘発をもたらすことができる[Alexopoulou, et al., Nature, 413:732-738, 2001]ことが最近示された。ＦＡＤＤがＴＬＲ媒介シグナリングにおいて重要な役割を果たしているかどうかを更に明らかにするために、ＦＡＤＤ＋／−及び−／−ＭＥＦｓを、ＩＦＮ−β−ルシフェラーゼレポーター構築物及びＴＬＲシグナリング経路の種々の成分（例えば、ＴＬＲ３、ＩＲＡＫ−Ｍ、ＩＲＡＫ−１、ＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰ／ＭＡＬ、ＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ−１及びＴＲＡＦ６）をコードするプラスミドでトランスフェクションし、その多くは一過性過剰発現の後にＩＦＮ−β遺伝子発現を誘発することが示された[Akira, J. Biol. Chem., 278:38105-38108, 2003]。しかしながら、ＩＦＮ−βのＴＬＲ媒介誘発の抑止は、ＦＡＤＤ欠如細胞では観察されなかった（図１６ａ）。図１６ａでは、指示されたＴＬＲシグナリング成分をコードするプラスミドを、ＦＡＤＤ＋／−及びＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓにＩＦＮ−β−Ｌｕｃと共に共トランスフェクションし、そしてルシフェラーゼ活性をトランスフェクションの２４時間後に測定した。更に、ＴＬＲ３、ＴＲＩＦ及びＩＲＡＫ１過剰発現は、ＦＡＤＤ含有ＭＥＦｓ及びＦＡＤＤを欠いているＭＥＦｓの両方において、ＩＦＮ−βプロモーター活性の＞１０倍増加を刺激することができた（データは示されていない）。これらの結果は、ＴＲＩＦ欠如ＭＥＦｓは、ＦＡＤＤ−／−とは違って、トランスフェクションされたｄｓＲＮＡに応答してＩＦＮ−βを誘発する能力を保持していたことを証明することにより立証された。 Example 4: Normal toll receptor signaling TLR3 in the absence of FADD is involved in the recognition of extracellular dsRNA, which leads to induction of IFN-β through activation of IRAK family members and TRAF6 [Alexopoulou, et al., Nature, 413: 732-738, 2001] has recently been shown. To further elucidate whether FADD plays an important role in TLR-mediated signaling, FADD +/− and − / − MEFs were identified as IFN-β-luciferase reporter constructs and various components of the TLR signaling pathway (eg, TLR3 , IRAK-M, IRAK-1, MyD88, TIRAP / MAL, TRIF / TICAM-1 and TRAF6), many of which induce IFN-β gene expression after transient overexpression [Akira, J. Biol. Chem., 278: 38105-38108, 2003]. However, TLR-mediated inhibition of IFN-β was not observed in FADD-deficient cells (FIG. 16a). In FIG. 16a, plasmids encoding the indicated TLR signaling components were cotransfected with FFN +/− and FADD − / − MEFs with IFN-β-Luc and luciferase activity was measured 24 hours after transfection. Furthermore, TLR3, TRIF and IRAK1 overexpression could stimulate> 10-fold increase in IFN-β promoter activity in both FADD-containing MEFs and MEFs lacking FADD (data not shown) . These results were verified by demonstrating that TRIF-deficient MEFs, unlike FADD − / −, retained the ability to induce IFN-β in response to transfected dsRNA.

これらの発見を更に確認するために、ＩＦＮ−βのＮＦ−κＢ／ＡＰ−１活性化をモジュレーションすることを担当するＴＬＲ活性の重要な下流中間体[Wu et al., Bioessays, 25:1096-1105(2003)]、抗ウイルス免疫におけるＴＲＡＦ６の役割を調べた。従って、ＴＲＡＦ６＋／＋及びＴＲＡＦ６−／−繊維芽細胞を、１８時間のＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５ng/ml）予備処理の存在下又は不存在下にＶＳＶ（ＭＯＩ＝５）で感染させた。しかしながら、ＦＡＤＤ−／−細胞と違って、ＩＦＮへの暴露は、野生型コントロール細胞と同様なＶＳＶ感染に対してＴＲＡＦ６−／−ＭＥＦｓを有効に保護したことが見出された（図１６ｂ）（顕微鏡写真は感染の４８時間後に撮られた）。次に、細胞内ポリ（ＩＣ）のＴＲＡＦ６−／−ＭＥＦｓにおけるＩＦＮ−βプロモーターを活性化する能力を調べた。ＴＲＡＦ６＋／＋及びＴＲＡＦ６−／−ＥＦｓを、１８時間のＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５ng/ml）予備処理の存在下又は不存在下にＶＳＶ（ＭＯＩ＝５）で感染させた。細胞生存度を感染の４８時間後にトリパンブルー排除により決定した。この分析は、トランスフェクションされたポリ（ＩＣ）がＴＲＡＦ６の不存在下にＩＦＮ−βを活性化する能力を保持していたことを示し、これは、このアダプター分子が多分、ＦＡＤＤ媒介ｄｓＲＮＡ細胞内シグナリング(FADD-mediated dsRNA-intracellular signaling)において役割を演じないことを示す（図１６ｃ−ｄ）。   To further confirm these findings, an important downstream intermediate of TLR activity responsible for modulating NF-κB / AP-1 activation of IFN-β [Wu et al., Bioessays, 25: 1096- 1105 (2003)], the role of TRAF6 in antiviral immunity was investigated. Thus, TRAF6 + / + and TRAF6 − / − fibroblasts were treated with VSV (MOI = 5) in the presence or absence of 18 hours of IFNα / β (500 U / ml) or IFN-γ (5 ng / ml) pretreatment. ). However, unlike FADD − / − cells, exposure to IFN was found to effectively protect TRAF6 − / − MEFs against VSV infection similar to wild type control cells (FIG. 16b) (FIG. 16b). Micrographs were taken 48 hours after infection). Next, the ability of intracellular poly (IC) to activate the IFN-β promoter in TRAF6-/-MEFs was examined. TRAF6 + / + and TRAF6-/-EFs were infected with VSV (MOI = 5) in the presence or absence of 18 hours of IFNα / β (500 U / ml) or IFN-γ (5 ng / ml) pretreatment. It was. Cell viability was determined by trypan blue exclusion 48 hours after infection. This analysis showed that the transfected poly (IC) retained the ability to activate IFN-β in the absence of TRAF6, indicating that this adapter molecule was probably FADD-mediated dsRNA intracellular. It shows that it does not play a role in signaling (FADD-mediated dsRNA-intracellular signaling) (FIGS. 16c-d).

更に、他のＴＬＲ経路におけるＦＡＤＤの重要な役割は観察されなかった（データは示されていない）。ＴＬＲ3及びＩＲＡＫ１がＴＲＡＦ６−／−の不存在下にＩＦＮ−β誘発を媒介することができないことを証明することは、ＦＡＤＤがＴＬＲ３／ＴＲＡＦ６及びＴＲＩＦ経路とは独立に機能することを総合的に示すであろう（図１６ｅ）。図１６ｅは、ＩＦＮ予備処理が、ＴＲＡＦ６−／−ＭＥＦｓをＶＳＶから保護することを示す。ＴＲＡＦ６＋／＋及びＴＲＡＦ６−／−ＥＦｓを１８時間のＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５ng/ml）予備処理の存在下又は不存在下にＶＳＶ（m.o.i.＝５）で感染させた。この実験では、培地を、ＢＨＫ細胞に関する標準プラークアッセイによる感染の４８時間後の子孫ビリオン(progenyl virion)の存在について調べた。ＴＲＡＦ６の不存在下の正常な細胞内ｄｓＲＮＡシグナリング。ＴＲＡＦ６＋／＋及びＴＲＡＦ６−／−ＥＦｓを、ＩＦＮ−β−Ｌｕｃで２４時間トランスフェクションし、次いでポリ（ＩＣ）[リポフェクタミン２０００中の４mg/ml]で６時間トランスフェクションし、その後ルシフェラーゼ活性を測定した。ＴＬＲ３及びＩＲＡＫ−１はＩＦＮ−β遺伝子誘発のためにＴＲＡＦ６を必要とする。ＴＲＡＦ６＋／＋及びＴＲＡＦ６−／−ＥＦｓを、ＩＦＮ−β−Ｌｕｃと共に、ＴＬＲ３、ＩＲＡＫ−１又はＴＲＡＦ６をコードするプラスミドでトランスフェクションし、そしてトランスフェクションの２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。   Furthermore, an important role for FADD in other TLR pathways was not observed (data not shown). Proving that TLR3 and IRAK1 are unable to mediate IFN-β induction in the absence of TRAF6-/-indicates that FADD functions independently of the TLR3 / TRAF6 and TRIF pathways (FIG. 16e). FIG. 16e shows that IFN preprocessing protects TRAF6-/-MEFs from VSV. TRAF6 + / + and TRAF6-/-EFs were infected with VSV (moi = 5) in the presence or absence of 18 hours of IFNα / β (500 U / ml) or IFN-γ (5 ng / ml) pretreatment . In this experiment, the media was examined for the presence of progenyl virions 48 hours after infection by a standard plaque assay for BHK cells. Normal intracellular dsRNA signaling in the absence of TRAF6. TRAF6 + / + and TRAF6-/-EFs were transfected with IFN-β-Luc for 24 hours, then poly (IC) [4 mg / ml in Lipofectamine 2000] for 6 hours, after which luciferase activity was measured. . TLR3 and IRAK-1 require TRAF6 for IFN-β gene induction. TRAF6 + / + and TRAF6-/-EFs were transfected with plasmids encoding TLR3, IRAK-1 or TRAF6 along with IFN-β-Luc and luciferase activity was measured 24 hours after transfection.

実施例５：哺乳動物ＩＭＤ様経路は抗ウイルス自然免疫を与える。
データは、ＦＡＤＤはウイルス感染に対する自然免疫において重要な役割を演じ、そしてＴＲＡＦ６媒介ＴＬＲ３経路から独立であることを示す。更に、ＦＡＤＤは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるバクテリア感染に応答する自然免疫に関与していることが最近報告された。[Leulier, et al., Curr.Biol., 12: 996-1000, 2002; Naitza, et al., Immunity, 17: 575-581, 2002]。これらの生物では、免疫不全（ｉｍｄ）遺伝子産物、哺乳動物デスドメイン含有キナーゼのＤｒｏｓｏｐｈｌａホモログ、ＲＩＰは、ｄＦＡＤＤと会合してＮＦ−κＢ関連経路の活性化及びその後の抗バクテリア遺伝子の誘発をトリガーする[Hoffmann, Nature, 426:33-38, 2003]。ＦＡＤＤが関与するＩＭＤ様経路が哺乳動物細胞中に存在するかどうかを決定するために、ＩＦＮで処理された又は未処理のＲＩＰ−／−ＭＥＦｓをＶＳＶ（ＭＯＩ＝５）で感染させた。図１７ａは、ＲＩＰ−／−細胞ではＶＳＶで誘発された細胞溶解を示すが、コントロールでは示さない。この実験では、ＶＳＶで誘発された細胞溶解は、ＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓと同様、ＩＦＮの存在下ですら観察された。 Example 5: The mammalian IMD-like pathway provides antiviral innate immunity.
The data indicate that FADD plays an important role in innate immunity against viral infection and is independent of the TRAF6-mediated TLR3 pathway. Furthermore, it has recently been reported that FADD is involved in innate immunity in response to bacterial infection in Drosophila. [Leulier, et al., Curr. Biol., 12: 996-1000, 2002; Naitza, et al., Immunity, 17: 575-581, 2002]. In these organisms, the immunodeficiency (imd) gene product, the Drosophila homolog of mammalian death domain-containing kinase, RIP, associates with dFADD to trigger activation of NF-κB-related pathways and subsequent induction of antibacterial genes [Hoffmann, Nature, 426: 33-38, 2003]. To determine whether an IMD-like pathway involving FADD is present in mammalian cells, IFN-treated or untreated RIP-/-MEFs were infected with VSV (MOI = 5). FIG. 17a shows VSV-induced cell lysis in RIP − / − cells but not in the control. In this experiment, VSV-induced cell lysis was observed even in the presence of IFN, similar to FADD-/-MEFs.

図１７ｂ及び１７ｃに示されたとおり、野生型ＭＥＦｓに比べてＩＦＮで処理されたＲＩＰ−／−ＭＥＦｓにおいて約１０〜５０倍多くのＶＳＶが発生し、インフルエンザウイルス又はＥＭＣＶによる感染の後、同様な結果が得られる。図１７ｂでは、ＦＡＤＤ＋／−及びＦＡＤＤ−／−ＥＦｓを、１８時間のＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５ng/ml）予備処理の存在下又は不存在下にＶＳＶ（m.o.i.＝５）で感染させた。感染後の指示された時間に、培地を子孫ビリオン産生について調べた。図１７ｃでは、ＲＩＰ＋／＋及び−／−ＥＦｓを、１８時間のＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５ng/ml）予備処理の存在下又は不存在下にＶＳＶ（m.o.i.＝５）で感染させた。感染後の指示された時間に、培地を子孫ビリオン産生について調べた。   As shown in FIGS. 17b and 17c, approximately 10-50 times more VSV occurs in RIP-/-MEFs treated with IFN compared to wild-type MEFs, and similar after infection with influenza virus or EMCV. Results are obtained. In FIG. 17b, FADD +/− and FADD − / − EFs were measured in VSV (moi = 5) in the presence or absence of 18 hour IFNα / β (500 U / ml) or IFN-γ (5 ng / ml) pretreatment. ). At the indicated time after infection, the media was examined for progeny virion production. In FIG. 17c, RIP + / + and − / − EFs are expressed in VSV (moi = 5) in the presence or absence of 18 hours of IFNα / β (500 U / ml) or IFN-γ (5 ng / ml) pretreatment. Infected with. At the indicated time after infection, the media was examined for progeny virion production.

更に、ＲＮＡｉを使用してＲＩＰ発現が抑止されたＲＩＰ欠如ＭＥＦｓ及びＨｅＬａ細胞は、ＩＦＮ−βプロモーターの細胞内ｄｓＲＮＡ媒介シグナリングに選択的に応答不能及び完全な応答不能を示した（図１７ｄ−ｅ）。図１４ｅでは、ＲＩＰ＋／＋及び−／−ＥＦｓ（左）又はＲＩＰがＲＮＡｉにより特異的にノックダウンされた（右）ＨｅＬａ細胞を、ＩＦＮ−β−Ｌｕｃで２４時間トランスフェクションし、次いでポリ（ＩＣ）[リポフェクタミン２０００中の４mg/ml]で６時間トランスフェクションし、その後ルシフェラーゼ活性を測定した。図１７ｆにおいて、ＲＩＰ＋／＋及び−／−ＥＦｓを、ＩＦＮ−β−Ｌｕｃと共に、ＴＬＲ３、ＩＲＡＫ−１又はＴＲＡＦ６をコードするプラスミドでトランスフェクションし、そしてトランスフェクションの２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。これらの結果は、ＴＬＲ３、ＩＲＡＫ−１、ＴＲＡＦ６及びＴＲＩＦは、ＲＩＰ−／−ＭＥＦｓにおける一過性の過剰発現の後、ＩＦＮ−βプロモーター活性を強く誘発することができることを示し、これは、細胞内及び細胞外ｄｓＲＮＡが様々なシグナリング経路を利用してＩＦＮ−βを誘発させるという更なる証拠を与える。   In addition, RIP-deficient MEFs and HeLa cells, in which RIP expression was suppressed using RNAi, selectively and completely failed to respond to intracellular dsRNA-mediated signaling of the IFN-β promoter (FIGS. 17d-e). ). In FIG. 14e, HeLa cells with RIP + / + and − / − EFs (left) or RIP specifically knocked down by RNAi (right) were transfected with IFN-β-Luc for 24 hours, followed by poly (IC ) Transfected with [4 mg / ml in Lipofectamine 2000] for 6 hours, after which luciferase activity was measured. In FIG. 17f, RIP + / + and − / − EFs were transfected with a plasmid encoding TLR3, IRAK-1 or TRAF6 with IFN-β-Luc and luciferase activity was measured 24 hours after transfection. These results show that TLR3, IRAK-1, TRAF6 and TRIF can strongly induce IFN-β promoter activity after transient overexpression in RIP − / − MEFs, Further evidence provides that internal and extracellular dsRNAs utilize various signaling pathways to induce IFN-β.

Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて、ＩＫＫ−β／ＩＲＤ5及びＩＫＫ−γ／ＫｅｎｎｙからなるＩ−κＢキナーゼ（ＩＫＫ）複合体を介したＮＦ−κＢ相同体Ｒｅｌｉｓｈ(NF-κB homologue Relish)の活性化をとおして抗バクテリア遺伝子発現の誘発を刺激するのにｉｍｄ及びｄＦＡＤＤが必要とされる。哺乳動物細胞において、ＩＦＮ−βの誘発は、ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ−３の活性化も伴う。図１８ａにおいて、野生型、又はＩＫＫ−α、ＩＫＫ−β、ＩＫＫ−γ及びＩＫＫ−δ欠如ＭＥＦｓを、ＩＦＮα／β（１００Ｕｍ１２１）予備処理のあるなしでＶＳＶ（ＭＯＩ １／４ １０）で感染させた。結果は、ＩＦＮによる予備処理は、ウイルス感染に対するＩＫＫ−α、−β又は−γを欠いているＭＥＦｓを有効に保護することができたことを示す（図１８ａ）。この研究は、Ｔａｎｋ結合キナーゼ１（ＴＢＫ−１）／ＩＫＫ−δを欠いているＭＥＦｓを調べることにより補充された。何故ならば、この分子は、ＭＥＦｓにおいて一次ＩＲＦ−３キナーゼであると思われるからである。この実験は、ＦＡＤＤ−／−及びＲＩＰｋ１−／−繊維芽細胞と同様に、ＴＢＫ−１／ＩＫＫ−δ欠如細胞は、ＩＦＮによる予備処理の後ですらウイルス複製及び細胞溶解に対して保護されないことを示した（図１８ａ）。   In Drosophila, anti-bacterial gene through activation of NF-κB homologue Relish (NF-κB homologue Relish) via I-κB kinase (IKK) complex consisting of IKK-β / IRD5 and IKK-γ / Kenny Imd and dFADD are required to stimulate the induction of expression. In mammalian cells, induction of IFN-β is also accompanied by activation of NF-κB and IRF-3. In FIG. 18a, wild type or IKK-α, IKK-β, IKK-γ and IKK-δ-deficient MEFs were infected with VSV (MOI 1/4 10) with or without IFNα / β (100 Um121) pretreatment. It was. The results show that pre-treatment with IFN could effectively protect MEFs lacking IKK-α, -β or -γ against viral infection (FIG. 18a). This study was supplemented by examining MEFs lacking Tank binding kinase 1 (TBK-1) / IKK-δ. This is because this molecule appears to be the primary IRF-3 kinase in MEFs. This experiment shows that, like FADD-/-and RIPk1-/-fibroblasts, TBK-1 / IKK-delta-deficient cells are not protected against viral replication and cell lysis even after pretreatment with IFN. (FIG. 18a).

ＦＡＤＤ−／−細胞と同様に、これらの結果は、ＴＢＫ−１／ＩＫＫ−δ欠如ＭＥＦｓにおけるＩ型ＩＦＮ誘発の欠如により説明されうる。ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ及びＥＬＩＳＡ分析は、ＴＢＫ−１／ＩＫＫ−δの不存在下では、Ｉ型ＩＦＮのｄｓＲＮＡ応答誘発及び他の抗ウイルス遺伝子もひどく害されることを確認した（図１８ｂ−ｄ）。これらの結果は、ＦＡＤＤが主としてＩＲＦ−３のＴＢＫ−１活性化を通してその効果を媒介することができることを示す。従って、ＴＢＫ−１／ＩＫＫ−δ及びＩＫＫ−１によるリン酸化の後に起こるＩＲＦ−３トランスロケーションは、トランスフェクションされたｄｓＲＮＡで処理した後のＦＡＤＤ−／−細胞において欠如していることが見出された（図１５ｅ及びｆ）。特に、Ｉｒｆ３−／−ＭＥＦｓは、Ｉ又はＩＩ型ＩＦＮへの暴露後のウイルス感染に対して完全には保護されなかった（図１８ｇ）。同様に、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ及びＲＮＡ干渉分析は、細胞内ｄｓＲＮＡの、ＩＲＦ３−／−ＭＥＦｓにおけるＩ型ＩＦＮ産生を誘発する能力の欠如を確認した（図１８ｈ〜ｊ）。   Similar to FADD − / − cells, these results can be explained by the lack of type I IFN induction in TBK-1 / IKK-δ deficient MEFs. DNA microarray, RT-PCR and ELISA analysis confirmed that in the absence of TBK-1 / IKK-δ, induction of dsRNA response of type I IFN and other antiviral genes were also severely compromised (FIGS. 18b-d). ). These results indicate that FADD can mediate its effect primarily through TBK-1 activation of IRF-3. Thus, IRF-3 translocation that occurs after phosphorylation by TBK-1 / IKK-δ and IKK-1 is found to be absent in FADD − / − cells after treatment with transfected dsRNA. (FIGS. 15e and f). In particular, Irf3-/-MEFs were not fully protected against viral infection after exposure to type I or type II IFN (Figure 18g). Similarly, DNA microarray, RT-PCR, ELISA and RNA interference analysis confirmed the lack of ability of intracellular dsRNA to induce type I IFN production in IRF3 − / − MEFs (FIGS. 18h-j).

これらの結果は、ウイルスｄｓＲＮＡｓは、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１を「インネイテオソーム("innateosome")」複合体に動員してＩＲＦ−３のＴＢＫ−１／ＩＫＫ−δ媒介活性化を調節することができる細胞内受容体分子により認識されることを示唆する。ＦＡＤＤ又はＲＩＰ１の損失は、ＩＦＮ−β産生の欠如及びその結果としてのＩＲＦ−７の産生の遅れ及び抗ウイルス状態３の強化に必要なＩＦＮ−αファミリーのメンバーの産生の遅れをもたらすことが示された。ＴＢＫ−１／ＩＫＫ−δ欠如ＭＥＦｓは、ＦＡＤＤ欠如ＭＥＦｓ又はＲＩＰ１欠如ＭＥＦｓ単独よりも、ｄｓＲＮＡ刺激に応答するＩ型ＩＦＮｓの誘発のより深い欠如(profound defect)を示すが、これは、細胞内ｄｓＲＮＡで活性化された複合体はＦＡＤＤの不存在下にいくらかの活性を保持していること、又は別のＦＡＤＤ非依存性細胞内シグナリングカスケードがＴＢＫ−１／ＩＫＫ−δに収斂することを示唆しているらしいことに注目すべきである。このＲＩＰ１／ＦＡＤＤ／ＴＢＫ−１（ＲＩＦＴ）経路は、ＴＬＲ３、ＰＫＲ、ＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ−１又はＴＲＡＦ６から殆ど独立しているようであり、そしてＤＥｘＤ／ＨヘリカーゼＲＩＧ−Ｉの如き別の細胞内のｄｓＲＮＡ活性化シグナルトランスデューサーの存在を示唆する他の発見と合致している。   These results indicate that viral dsRNAs can mobilize FADD and RIP1 to the “innateosome” complex to regulate TBK-1 / IKK-δ-mediated activation of IRF-3. This suggests that it is recognized by intracellular receptor molecules. It has been shown that loss of FADD or RIP1 results in a lack of IFN-β production and consequent delays in IRF-7 production and production of members of the IFN-α family that are required for antiviral status 3 enhancement. It was done. TBK-1 / IKK-δ-deficient MEFs show a profound defect in the induction of type I IFNs in response to dsRNA stimulation than FADD-deficient MEFs or RIP1-deficient MEFs alone, which indicates that intracellular dsRNA Suggests that the complex activated in 保持 retains some activity in the absence of FADD, or that another FADD-independent intracellular signaling cascade converges on TBK-1 / IKK-δ. It should be noted that it seems to be. This RIP1 / FADD / TBK-1 (RIFT) pathway appears to be almost independent of TLR3, PKR, TRIF / TICAM-1 or TRAF6, and within other cells such as DExD / H helicase RIG-I Consistent with other findings that suggest the presence of dsRNA-activated signal transducers.

実施例６：バクテリア感染に対する哺乳動物応答におけるＦＡＤＤの役割
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるｉｍｄ経路の役割が、グラム陽性菌感染に対する応答に関与することが報告され、そして抗ウイルス経路の存在はまだ決定されていない。哺乳動物細胞におけるＦＡＤＤ又はＲＩＰの損失により生じる細胞内バクテリア感染に対する自然応答がどうであるかを調べ、そして図１９に示す。簡単に言えば、ＦＡＤＤ＋／＋、ＦＡＤＤ−／−又はＲＩＰ−／−ＭＥＦｓを、ＩＦＮ−α／β又はＩＦＮ−γのあるなしで１８時間処理し、そして細胞内グラム陽性菌、Ｌｙｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの一夜培養物５μlで感染させ、そしてゲンタマイシン１０ig/mlを含有する培地中で更に２４時間インキュベーションし（図１９ａ及び１９ｂ）；あるいは、グラム陰性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの一夜培養物５０μlで感染させ、そしてゲンタマイシン１０ig/mlを含有する培地中で更に４８時間インキュベーションした（図１９ｃ）。有意義なことに、バクテリア感染への暴露の後ＦＡＤＤ及びＲＩＰ欠如繊維芽細胞において劇的な細胞死が起こることが観察された。この効果は、バクテリア複製の増加を伴っていた。このデータは、昆虫細胞と同様に、ＦＡＤＤ経路は、バクテリア感染に対する自然免疫において重要であることを示す。 Example 6: Role of FADD in Mammalian Response to Bacterial Infection The role of the imd pathway in Drosophila has been reported to be involved in the response to Gram-positive bacterial infection, and the presence of an antiviral pathway has not yet been determined. The natural response to intracellular bacterial infection caused by FADD or RIP loss in mammalian cells was examined and is shown in FIG. Briefly, FADD + / +, FADD − / − or RIP − / − MEFs were treated for 18 hours with or without IFN-α / β or IFN-γ and overnight in intracellular gram-positive bacteria, Lysteria monocytogenes Infect with 5 μl culture and incubate for a further 24 hours in medium containing 10 ig / ml gentamicin (FIGS. 19a and 19b); alternatively, infect with 50 μl overnight culture of Gram-negative Salmonella typhimurium and 10 g / ml gentamicin Incubation was continued for a further 48 hours in medium containing (FIG. 19c). Significantly, it was observed that dramatic cell death occurred in FADD and RIP-deficient fibroblasts after exposure to bacterial infection. This effect was accompanied by an increase in bacterial replication. This data indicates that, like insect cells, the FADD pathway is important in innate immunity against bacterial infection.

実施例７：大きな表面積を有するキトサン粒子の予備製造
マイクロスプレーエアーガン(Micro Spray Air Gun)又はエレクトロスプレー(Electrospray)法を、キトサンマイクロ粒子予備製造のために使用した。マイクロスプレーエアーガン法では、キトサン溶液を、ガンについて可能な最小の寸法に乱流で分散させた。粒子のサイズは主として表面張力により制御され、そして〜２０〜１００ミクロンの範囲にあった。 Example 7: Pre-production of chitosan particles with large surface area A Micro Spray Air Gun or Electrospray method was used for pre-production of chitosan micro particles. In the microspray air gun method, the chitosan solution was turbulently dispersed to the smallest possible size for the gun. The size of the particles was controlled primarily by surface tension and was in the range of ˜20-100 microns.

エレクトロスプレーは、液体の静電噴霧の方法である。静電界は、流体を毛細管電極から受け入れ対極に向けて強制的に噴出させる。クーロン反発による小滴の第２段階分割(splitting)及び微粉砕は、微細な微小滴のプルーム(plume)を生成させる。表面フィルム形成を防止するために、改変されたエレクトロスプレー法をセットアップした。   Electrospray is a method of electrostatic spraying of liquid. The electrostatic field forces fluid from the capillary electrode and ejects it toward the counter electrode. The second stage splitting and pulverization of the droplets by coulomb repulsion produces a fine microdrop plume. A modified electrospray method was set up to prevent surface film formation.

架橋溶液（トリポリホスフェート、ＴＰＰ）の静止した表面へのキトサンのエレクトロスプレーは、キトサン溶液の極めて微細な且つ均質な粉砕により、マイクロ粒子の代わりに安定化されたキトサンの薄い表面フィルムを形成した。この望ましくない効果を阻止するために、架橋溶液の乱流再循環を考案した（図２０）。循環マイクロポンプは、フィルムの破壊に必須の受け取り電極板におけるＴＰＰ溶液のオープンループ循環を与えた。改変されたエレクトロスプレー装置を使用して、水及び２５%エタノール中の１%、１．５%及び２%キトサン溶液を粉砕した。２５Ｇステンレス鋼毛細管（ＥＦＤ）は、粉砕電極として作用し、１０%ＴＰＰ溶液１００mlを含有する１０インチステンレス鋼板は受け取り対極として使用された。架橋ＴＰＰ溶液の乱流攪拌を伴うエレクトロスプレーは、マイクロスプレーガンプルーム様式を使用して得られたマイクロ粒子よりも小さい粒子を創生した：サイズは〜５〜５０ミクロンの分布で生じた（図２１）。   Electrospraying of chitosan onto a stationary surface of a cross-linking solution (tripolyphosphate, TPP) formed a stabilized thin surface film of chitosan instead of microparticles by very fine and homogeneous grinding of the chitosan solution. To prevent this undesirable effect, turbulent recirculation of the crosslinking solution was devised (FIG. 20). The circulating micropump provided an open loop circulation of the TPP solution at the receiving electrode plate that was essential for film breakage. A modified electrospray apparatus was used to grind 1%, 1.5% and 2% chitosan solutions in water and 25% ethanol. A 25G stainless steel capillary tube (EFD) served as the grinding electrode, and a 10 inch stainless steel plate containing 100 ml of 10% TPP solution was used as the receiving counter electrode. Electrospray with turbulent stirring of the cross-linked TPP solution created particles smaller than the microparticles obtained using the microspray gun plume mode: the size occurred in a distribution of ˜5-50 microns (FIG. 21).

改変されたエレクトロスプレー法により予備製造されたキトサン小滴は、およそミクロンサイズであり：エレクトロスプレープルームによる赤色レーザービームの有意な９０°散乱が観察され、これは光の波長に匹敵する小滴サイズを示している。乾燥粒子で観察されるより大きい見掛けのサイズは、その後の変換：ＴＰＰ溶液と接触すると、表面張力は、微小滴をＴＰＰの表面に極薄シートに広げる、により説明される。この格別の形状は顕微鏡で十分に見られた。凍結乾燥すると、マイクロシートは収縮してしわくちゃの紙に似た形状となり、そして再懸濁後に決して再び広がらない。マイクロ粒子を予備製造する上記した方法は、大きな表面積を有する広範囲のマイクロ粒子を生成する。より小さいサイズの粒子は、樹状細胞により飲み込まれうる。他方、これらの粒子の大きい表面積は、核酸及びタンパク質による外部飽和のための有意な利点を与える。   Chitosan droplets pre-manufactured by a modified electrospray method are approximately micron-sized: a significant 90 ° scattering of the red laser beam by the electrospray plume is observed, which is a droplet size comparable to the wavelength of light Is shown. The larger apparent size observed with dry particles is explained by the subsequent transformation: upon contact with the TPP solution, the surface tension spreads the microdroplets onto the surface of the TPP into an ultra-thin sheet. This extraordinary shape was well seen with a microscope. When lyophilized, the microsheet shrinks to resemble a crumpled paper and never spreads again after resuspension. The methods described above for pre-manufacturing microparticles produce a wide range of microparticles with a large surface area. Smaller sized particles can be swallowed by dendritic cells. On the other hand, the large surface area of these particles provides a significant advantage for external saturation with nucleic acids and proteins.

実施例８：ポリイノシン酸−ポリシチジル酸をロードされたキトサン粒子
ポリイノシン酸−ポリシチジル酸、ポリ（ＩＣ）は、合成のミスマッチな二本鎖ＲＮＡからなるインターフェロン（ＩＦＮ）誘発物質である。このポリマーは、ポリイノシン酸及びポリシチジル酸の各一本鎖から作られる（図２２）。 Example 8 Chitosan Particles Loaded with Polyinosinic Acid-Polycytidylic Acid Polyinosinic acid-polycytidylic acid, poly (IC) is an interferon (IFN) inducer consisting of synthetic mismatched double-stranded RNA. This polymer is made from single chains of polyinosinic acid and polycytidylic acid (FIG. 22).

ポリアニオンであるので、ポリ（ＩＣ）は、ポリカチオンキトサンにより強く吸着される。ポリ（ＩＣ）をロードされたキトサン粒子の２つの製造方法を使用した：バルクキトサン溶液への混合及びポリ（ＩＣ）溶液中の空の粒子のインキュベーションによる予備製造されたキトサン粒子のポリ（ＩＣ）による外部飽和。   Since it is a polyanion, poly (IC) is strongly adsorbed by the polycation chitosan. Two methods of making poly (IC) loaded chitosan particles were used: poly (IC) of pre-made chitosan particles by mixing into bulk chitosan solution and incubation of empty particles in poly (IC) solution Due to external saturation.

１．ポリ（ＩＣ）による外部飽和
改変されたエレクトロスプレー法を使用して予備製造された粒子、普通は乾燥総計２０〜５０mgを、３．０mg/mlでＰＢＳ中に可溶化されたポリ（ＩＣ）(VWR International, Cat. #IC10270810)０．６ml中に入れた。室温で２時間の穏やかな振とうの後、粒子を、すべて１０００Ｇで２分間５回遠心し、各回上清を捨て、そして蒸留水１．５mlで置き換えた。洗浄された粒子の得られる懸濁液を一夜凍結乾燥した。 1. External saturation with poly (IC) Particles pre-manufactured using a modified electrospray method, usually 20-50 mg total dry, poly (IC) (solubilized in PBS at 3.0 mg / ml) VWR International, Cat. # IC10270810) in 0.6 ml. After 2 hours of gentle shaking at room temperature, the particles were all centrifuged 5 times for 2 minutes at 1000 G, the supernatant was discarded each time and replaced with 1.5 ml of distilled water. The resulting suspension of washed particles was lyophilized overnight.

２．エチジウムホモ二量体を使用する溶液中のポリ（ＩＣ）の測定
溶液中のポリ（ＩＣ）の濃度を決定するために、エチジウム誘導体のインターカレーションによる２０〜２５倍の蛍光増強の効果を使用した。 2. Measurement of poly (IC) in solution using ethidium homodimer To determine the concentration of poly (IC) in solution, the effect of fluorescence enhancement 20-25 times by intercalation of ethidium derivatives is used. did.

エチジウムホモ二量体(ETDH; Sigma-Aldrich, Cat. #46043)は、そのキレート構造により（図２３）、ＤＮＡ、ＲＮＡと及び遊離ヌクレオチドとさえ、特異的複合体を形成することが知られている。結果として、それはポリ（ＩＣ）を測定するための最も適当な蛍光インターカレーション剤と考えられた。Ｂｉｏ−ＴｅｋＫＣ−４多機能プレートリーダーを使用して、標準透明９６ウエルプレート中のエチジウムホモ二量体（ＥＴＤＨ）でインターカレーションされたポリ（ＩＣ）を測定した（図２４）。測定を行うための条件は表１に示される。   Ethidium homodimer (ETDH; Sigma-Aldrich, Cat. # 46043) is known to form specific complexes with its chelate structure (FIG. 23), even with DNA, RNA, and even free nucleotides. Yes. As a result, it was considered the most suitable fluorescent intercalation agent for measuring poly (IC). A Bio-TekKC-4 multifunction plate reader was used to measure poly (IC) intercalated with ethidium homodimer (ETDH) in standard clear 96-well plates (Figure 24). The conditions for performing the measurement are shown in Table 1.

粒子中のポリ（ＩＣ）の測定
ＫＣ−４リーダーを使用して固体キトサン粒子におけるポリ（ＩＣ）含有率の半定量的評価を行うことが可能であることが見出された。水溶液中のマイクロ粒子は、その小さなサイズのため、十分に透明であるとみなすことができ、そしてランダム散乱性物体とみなすことができる。ゆえに、ポリ（ＩＣ）の表面結合分子においてＥＴＤＨがインターカレーションし、そしてポリ（ＩＣ）の残りを含有する粒子の内側に更に拡散すると、ＥＴＤＨ蛍光の有意な部分がＫＣ−４リーダーにより集められることができる（図２５）。 Measurement of poly (IC) in particles It was found that a KC-4 reader can be used to make a semi-quantitative assessment of poly (IC) content in solid chitosan particles. Microparticles in aqueous solution can be considered sufficiently transparent due to their small size and can be considered as random scattering objects. Thus, when ETDH intercalates in poly (IC) surface-binding molecules and further diffuses inside the particles containing the rest of poly (IC), a significant portion of ETDH fluorescence is collected by the KC-4 reader (FIG. 25).

粒子を溶液中に浸漬することによる、粒子のポリ（ＩＣ）による外部飽和は、キトサン溶液中にポリ（ＩＣ）を直接混合することよりもはるかに優れていることが見出された。これを図２６に示す。ＥＴＤＨの存在下のポリ（ＩＣ）粒子の時間依存性蛍光は、２つの異なる相：蛍光の速い（数秒）増強を伴う容易にアクセス可能な表面ポリ（ＩＣ）分子の即時のインターカレーション及び粒子の深部へのＥＴＤＨのゆっくりした浸透による蛍光の安定した増加、を証明した。最大表面ローディングを有する、即ち、蛍光の高められた速い増強を示す、粒子を得ることが必要と考えられた。   It has been found that external saturation of particles by poly (IC) by immersing the particles in solution is much better than mixing poly (IC) directly into the chitosan solution. This is shown in FIG. The time-dependent fluorescence of poly (IC) particles in the presence of ETDH is two different phases: instant intercalation of easily accessible surface poly (IC) molecules with fast (several seconds) enhancement of fluorescence and particles Stable increase in fluorescence due to slow penetration of ETDH into the depth of It was considered necessary to obtain particles with maximum surface loading, i.e. exhibiting a fast enhanced enhancement of fluorescence.

キトサン／ポリ（ＩＣ）粒子の製造のプロトコールについて、効率の下記の試験的順序が見出された。
The following experimental sequence of efficiencies was found for the protocol for the production of chitosan / poly (IC) particles.

エレクトロスプレーを使用して製造された最善の粒子におけるポリ（ＩＣ）の容易にアクセス可能な表面分子は、粒子１mg当たりポリ（ＩＣ）４．７μgを含んでいたが、これは直接混合によりマイクロガンを使用して製造された粒子の場合より〜１２倍高かった（それぞれ、図２６におけるグラフ７及び２）。   The easily accessible surface molecule of poly (IC) in the best particles produced using electrospray contained 4.7 μg of poly (IC) per mg of particles, which was reduced to microgun by direct mixing. ˜12 times higher than for particles produced using (Graphs 7 and 2 in FIG. 26, respectively).

４．キトサン粒子からのポリ（ＩＣ）の低い放出
キトサン溶液へのポリ（ＩＣ）の直接混合により製造された粒子、１０mg乾燥重量をプラスチック試験管中のＰＢＳ１ml中に入れ、シールし、そしてシェーカー上で３７℃で９日間インキュベーションした。粒子を或る時点で１０００Ｇで５分間遠心し、上記したとおりのＥＴＤＨの存在下に蛍光アッセイのために、上清を採取し、そして新たなＰＢＳで置き換えた。観察された放出は、有意ではなく、２２７時間にわたり理論的最大値の０．５%未満で起こった（図２７）。キトサン粒子からのポリ（ＩＣ）の不十分な放出は、混合及び飽和製造法の両方で得られた粒子で見出された。粒子がファゴサイトーシスされるべき場合には、このことはあまり重要ではないことがある。 4). Low release of poly (IC) from chitosan particles Particles made by direct mixing of poly (IC) into chitosan solution, 10 mg dry weight is placed in 1 ml PBS in a plastic test tube, sealed, and 37 on a shaker Incubated for 9 days at ° C. The particles were centrifuged at 1000 G for 5 min at some point and the supernatant was collected and replaced with fresh PBS for fluorescence assay in the presence of ETDH as described above. The observed release was not significant and occurred at less than 0.5% of the theoretical maximum over 227 hours (FIG. 27). Insufficient release of poly (IC) from chitosan particles was found in particles obtained by both mixing and saturation manufacturing methods. This may not be very important if the particles are to be phagocytosed.

実施例９：ＯＶＡ及びポリ（ＩＣ）をロードされた多機能性キトサン粒子
オブアルブミン（ＯＶＡ）は、免疫学的実験でモデル抗原として使用することができる４５ｋＤａ糖タンパク質である。ＯＶＡ／ポリ（ＩＣ）をロードされたキトサン粒子の２つの製造方法を使用した：バルクキトサン溶液への混合及びＯＶＡ／ポリ（ＩＣ）によるマイクロ粒子の外部飽和。 Example 9: Multifunctional chitosan particle of albumin (OVA) loaded with OVA and poly (IC) is a 45 kDa glycoprotein that can be used as a model antigen in immunological experiments. Two methods of preparation of OVA / poly (IC) loaded chitosan particles were used: mixing into bulk chitosan solution and external saturation of microparticles with OVA / poly (IC).

１．ＯＶＡのみ又はＯＶＡとポリ（ＩＣ）との組み合わせによる外部飽和により製造されたキトサンマイクロ粒子。
エレクトロスプレーにより予備製造された粒子、全乾燥重量２０〜５０mgを、３０mg/mlＯＶＡ(Sigma-Aldrich, Cat. #A-5503)又は３０mg/mlＯＶＡ_２mg/mlポリ（ＩＣ）、１．５ml中に室温でロッカー上で２時間入れた。２時間の穏やかな振とうの後、粒子を各回１０００Ｇで５回遠心し、上清をすて、そして蒸留水１．５mlで置き換えた。かくして洗浄された粒子の得られる懸濁液を一晩凍結乾燥した。 1. Chitosan microparticles produced by external saturation with OVA alone or a combination of OVA and poly (IC).
Pre-manufactured particles by electrospray, 20-50 mg total dry weight, 30 mg / ml OVA (Sigma-Aldrich, Cat. # A-5503) or 30 mg / ml OVA — 2 mg / ml poly (IC), 1.5 ml at room temperature Put on the locker for 2 hours. After 2 hours of gentle shaking, the particles were centrifuged 5 times at 1000 G each time, the supernatant was rinsed and replaced with 1.5 ml of distilled water. The resulting suspension of washed particles was lyophilized overnight.

２．ＯＶＡのビシンコニン酸アッセイ
タンパク質のビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイは、２つの主要な工程に基づいている：
● 第１工程は、Ｃｕ＋２をＣｕ＋１に還元するビウレット反応である。
● 第２工程では、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）はビウレット錯体におけるペプチド基を置換して、Ｃｕ＋１ とのビスキレート錯体を形成し、これは紫色であり、そして５６２nmで検出できる（図２８）。 2. OVA Bicinchoninic Acid Assay The protein bicinchoninic acid (BCA) assay is based on two main steps:
● The first step is a biuret reaction that reduces Cu +2 to Cu +1 .
In the second step, bicinchoninic acid (BCA) displaces the peptide group in the biuret complex to form a bischelate complex with Cu +1 , which is purple and can be detected at 562 nm (FIG. 28).

商業的に入手可能なＢＣＡキット（例えば、Sigma-Aldrich, Cat. #BCA1）は、通常ＢＣＡ、酒石酸塩／重炭酸塩緩衝剤（ｐＨ１１．２５）及び４%硫酸銅溶液を含有する。アッセイの直前に、標準アルカリ性ＢＣＡ溶液５０部をアッセイ系として使用されるべき４%硫酸銅溶液１部と混合する。   Commercially available BCA kits (eg, Sigma-Aldrich, Cat. # BCA1) usually contain BCA, tartrate / bicarbonate buffer (pH 11.25) and 4% copper sulfate solution. Just prior to the assay, 50 parts of standard alkaline BCA solution is mixed with 1 part of 4% copper sulfate solution to be used as the assay system.

タンパク質は、溶液中及び不溶性物体中（緩衝剤中に懸濁させたマイクロ粒子；不溶性タンパク質含有フィルムのサンプル等）の両方においてＢＣＡアッセイで測定することができる。しかしながら、ヘテロ相システムは、ＢＣＡ溶液中のサンプルのより長い、そしてより高い温度での（溶液中のタンパク質での３７℃に対して６０℃）インキュベーションを必要とする。   Protein can be measured in a BCA assay both in solution and in insoluble matter (microparticles suspended in buffer; samples of insoluble protein-containing films, etc.). However, the heterophasic system requires a longer and higher temperature incubation of the sample in BCA solution (60 ° C. versus 37 ° C. with protein in solution).

３．溶液中の及び不溶性物体中のＯＶＡのアッセイ
アッセイ溶液ml当たり６０μgまでタンパク質をストレッチすることを行った線形応答の面積を決定するために、新鮮なＢＣＡアッセイ溶液をＯＶＡ標準により較正した（図２９）。 3. Assay of OVA in solution and in insoluble matter Fresh BCA assay solution was calibrated with OVA standards to determine the area of linear response performed by stretching protein to 60 μg per ml assay solution (FIG. 29). .

溶液中のＯＶＡを下記の如く測定した：
タンパク質溶液のアリコートを、必要な過剰のアッセイ溶液に加えて２以下の最終光学的吸光(final optical extinction)及びアッセイの線形応答を完全に保証した。分析物をロッカー中で３７℃で１時間インキュベーションした。すべての読みはタンパク質を含有しないブランクサンプルの読みに対して補正した。 The OVA in the solution was measured as follows:
An aliquot of the protein solution was added to the required excess assay solution to ensure a final optical extinction of 2 or less and the linear response of the assay completely. The analyte was incubated for 1 hour at 37 ° C. in a rocker. All readings were corrected for readings of blank samples containing no protein.

マイクロ粒子中のＯＶＡを下記のとおりに測定した：
乾燥マイクロ粒子のサンプル（各々約１mg）を、分析天秤(Mettler-Toledo XS105)で０．０１mgの正確度で重量を秤り、そして線形応答及び許容されうる光学密度（＜２ｏ．ｕ．）を与えるように予備計算された対応する過剰のＢＣＡアッセイ溶液中に懸濁させた。試験管中にシールされたサンプルをロッカー中で３７℃で４時間又は水浴中で時々タンプリングしながら６０℃で１時間インキュベーションした。両方の場合に、インキュベーション時間を、タンパク質の分子による二価の銅の一価の銅への完全な還元を与えるように実験的に決定した。管を、５００ｇで５分間遠心して、粒子を分離し、そして透明な（clear）着色した溶液を５６２nmで分光光度計により読み取った。すべての読みは、タンパク質を含有しないブランク粒子で得られたサンプルの読みに対して補正した。 The OVA in the microparticles was measured as follows:
Samples of dry microparticles (about 1 mg each) are weighed on an analytical balance (Mettler-Toledo XS105) with an accuracy of 0.01 mg and linear response and acceptable optical density (<2 ou). Suspended in corresponding excess BCA assay solution precalculated to give. Samples sealed in tubes were incubated at 37 ° C. for 4 hours in a rocker or 1 hour at 60 ° C. with occasional tamping in a water bath. In both cases, the incubation time was experimentally determined to give complete reduction of divalent copper to monovalent copper by the protein molecules. The tube was centrifuged at 500 g for 5 minutes to separate the particles and the clear colored solution was read by spectrophotometer at 562 nm. All readings were corrected for sample readings obtained with blank particles containing no protein.

実施例１０：適度のローディングタンパク質及び核酸を有する多官能性マイクロ粒子
１.マイクロ粒子中のＯＶＡ含有率の評価
タンパク質を直接混合により粒子に加えると、粒子調製の異なる方法は、ＯＶＡの最終含有率に対して有意な効果はないようであると見出された。しかしながら、タンパク質が予備製造された粒子の外部飽和（浸漬(soaking)）によりロードされると、結果は異なっていた。外部飽和は、３〜５倍高い最終ＯＶＡ濃度を有するマイクロ粒子を造り出した。 Example 10: Multifunctional microparticles with moderate loading proteins and nucleic acids 1. Evaluation of OVA content in microparticles When protein is added to the particles by direct mixing, the different methods of particle preparation are the final content of OVA Was found to have no significant effect. However, the results were different when the protein was loaded by external saturation (soaking) of the prefabricated particles. External saturation created microparticles with a final OVA concentration of 3-5 times higher.

改変されたエレクトロスプレー及びマイクロスプレーガンは、しわくちゃの紙の幾何学及び形状を示す非常に高い表面積を有する小さな粒子の予備製造を可能とする。粒子の小さなサイズ及び大きな表面積のマイクロ粒子は、放出速度よりもむしろ高い吸収容量に貢献した。   Modified electrospray and microspray guns allow the pre-production of small particles with very high surface areas that exhibit crumpled paper geometry and shape. The small size and large surface area of the particles contributed to a high absorption capacity rather than a release rate.

高い表面積は、溶液中のマイクロ粒子の外部飽和を介してＮＡ及びタンパク質が付着するための大きな外表面を与える。   The high surface area provides a large outer surface for NA and protein attachment through external saturation of microparticles in solution.

２．マイクロ粒子からのオブアルブミンの時間放出を測定すること
ロードされた粒子のサンプル、各々１０．０mgの乾燥重量を、プラスチック試験管中のＰＢＳ１．０ml中に入れ、パラフィンでシールし、そして３７℃で１８日までシェーカー上でインキュベーションした。管を、１０００Ｇで５分間ある時点で遠心し；上清を上記したとおりのＢＣＡアッセイのために採取した。 2. Measuring the time release of ovalbumin from microparticles Loaded particle samples, each 10.0 mg dry weight, are placed in 1.0 ml PBS in a plastic test tube, sealed with paraffin and at 37 ° C. Incubated on shaker until day 18. Tubes were centrifuged at 1000 G for 5 minutes at some point; supernatants were collected for BCA assay as described above.

タンパク質を混合することにより及びタンパク質溶液中に予備製造された粒子を浸漬することにより製造された粒子からのＯＶＡの放出プロフィルにおいて大きな差が見出された（図３０）。前者では、全体の放出は多日数で総ロードの２%を決して超えなかったが、後者では、放出は１５%〜３０%を達成し、そして最初の７〜１０時間で起こった。ＯＶＡの総含有率に対する効果と同様に、ＯＶＡ及びポリ（ＩＣ）を有する粒子の同時的飽和は、ＯＶＡの放出を見かけ上減少させた（図３０）。   A large difference was found in the release profile of OVA from particles produced by mixing the protein and by immersing the pre-made particles in the protein solution (FIG. 30). In the former, the overall release never exceeded 2% of the total load in many days, whereas in the latter, the release achieved 15-30% and occurred in the first 7-10 hours. Similar to the effect on the total OVA content, the simultaneous saturation of the particles with OVA and poly (IC) apparently reduced the release of OVA (FIG. 30).

実施例１１：ポリイノシン酸−ポリシチジル酸を高度にロードされたキトサン粒子
エレクトロスプレーを使用して製造された最善の粒子におけるポリ（ＩＣ）のアクセス可能な表面付着分子は、粒子１mg当たり４．７μgポリ（ＩＣ）を含有していた。粒子のサイズは〜５〜５０ミクロンに分布して生じており、そしてトリポリホスフェート（ＴＰＰ）を架橋剤として使用した。ゆえに、最も近い目標は粒子の収着容量(sorption capacity)を増加させるように設定された。 Example 11 Poly (IC) Accessible Surface Attachment Molecules in the Best Particles Produced Using a Polyinosinic Acid-Polycytidylic Acid Highly Loaded Chitosan Particle Electrospray was 4.7 μg poly / mg particle (IC) was contained. The particle size was distributed between -5 and 50 microns and tripolyphosphate (TPP) was used as a crosslinker. Therefore, the closest target was set to increase the sorption capacity of the particles.

粒子の収着容量を高めるために、キトサン架橋剤を変えることが望ましいことが見出された。より軟質の粒子を造りだし、そして同時に核酸のホスフェート基に結合することに対してはるかに弱い競合者である有望なゲル化架橋剤として、硫酸ナトリウムＮａ２ＳＯ４（特記しない限り、蒸留水中１０%）が選ばれた［Berthold, et al., J. Controlled Release, 39: 17-25(1996)］。 It has been found desirable to change the chitosan crosslinker to increase the sorption capacity of the particles. Sodium sulphate Na 2 SO 4 (10% in distilled water unless otherwise noted) as a promising gelling cross-linker that creates softer particles and at the same time is a much weaker competitor to binding to phosphate groups of nucleic acids. %) Was selected [Berthold, et al., J. Controlled Release, 39: 17-25 (1996)].

ポリ（ＩＣ）をロードされたミクロより大きい(supra micro)（即ち、大きい）−及びサブミクロン（小さい）プロタサン粒子(Protasan particles)を製造した。ミクロより大きい粒子（２０〜７００ミクロン）は、ケモカイン又は薬物担体として使用されると思われ、又は細胞外ＴＬＲ−３免疫経路を活性化すると思われ；それらは細胞により呑み込まれるのを回避するであろう。   Supra micro (ie, large)-and submicron (small) Protasan particles loaded with poly (IC) were prepared. Particles larger than micro (20-700 microns) may be used as chemokines or drug carriers, or may activate the extracellular TLR-3 immune pathway; they avoid being swallowed by cells I will.

他方、抗原提示細胞により呑み込まれ、そして一次自然免疫応答の活性化のための中心である内部ＦＡＤＤ／ＲＩＰ／ＴＲＡＦ−２経路を介してプロセッシングされうるより小さな粒子（０．５〜１０um）により核酸及び抗原が担持されると、免疫感作が有効であることが知られる。   On the other hand, smaller particles (0.5-10 um) that are swallowed by antigen-presenting cells and can be processed through the internal FADD / RIP / TRAF-2 pathway, which is central for activation of the primary innate immune response It is known that immunization is effective when the antigen is supported.

実施例１２：ポリイノシン酸−ポリシチジル酸を高度にロードされたミクロンより大きいプロタサン粒子
１００mlＮａ２ＳＯ４溶液ｐＨ５．５を含有する受け入れパンの上で層流モードにおいてマイクロエアーガンを使用する１%酢酸中のＰＲＯＴＡＳＡＮ ＵＰ ＣＬ ２１３(NovelMatrix, Norway, cat#420101)の２%溶液１０mlを噴霧して、より大きい粒子（１００〜２００ミクロンを得た。 Example 12: Polyinosinic acid-polycytidylic acid highly loaded micron protasan particles in 1% acetic acid using a micro air gun in laminar flow mode on a receiving pan containing 100 ml Na 2 SO 4 solution pH 5.5 10 ml of a 2% solution of PROTASAN UP CL 213 (NovelMatrix, Norway, cat # 420101) was sprayed to obtain larger particles (100-200 microns).

プロタサンを製造し、そして、ｃＧＭＰのＵＳ ＦＤＡガイドラインに従って証明した（２１ＣＦＲ２１０，２１１）。   Protasan was manufactured and certified according to cGMP US FDA guidelines (21 CFR 210, 211).

粒子を、繰り返し遠心／再懸濁手順を使用して蒸留水中で６回洗浄し、そして一夜凍結乾燥した。得られる粒子は、〜１０〜２００ミクロンの不規則でスポンジ状の断片を発生した（図３１Ａ）。   The particles were washed 6 times in distilled water using repeated centrifugation / resuspension procedures and lyophilized overnight. The resulting particles generated irregular, sponge-like fragments of -10-200 microns (FIG. 31A).

１.ポリ（ＩＣ）：可溶化及び測定
ポリ（ＩＣ）(Amersham, cat. #27-4729-01)５０mgを、製造者により推奨されたとおり、１%ＮａＣｌ３５ml中に一晩溶解した。最終溶液は、２６０nmにおける吸光度Ａ２６０〜１４．０を有していたが、これはml当たり純粋な二本鎖ポリ（ＩＣ）７００μgに相当した。故に、Ａｍｅｒｓｈａｍ製剤中のポリ（ＩＣ）の総含有率は約４９〜５０%であり、すべての他の成分は緩衝性塩であつた。 1. Poly (IC): Solubilization and Measurement 50 mg of poly (IC) (Amersham, cat. # 27-4729-01) was dissolved overnight in 35 ml of 1% NaCl as recommended by the manufacturer. The final solution had an absorbance A 260 -14.0 at 260 nm, corresponding to 700 μg of pure double-stranded poly (IC) per ml. Therefore, the total content of poly (IC) in the Amersham formulation was about 49-50% and all other ingredients were buffer salts.

粒子中のポリ（ＩＣ）の量は、システムに加えられたポリ（ＩＣ）と粒子沈殿後の水相に残っているポリ（ＩＣ）との差として計算された［Bivas-Benitz, et al., Int. J. Pharm, 266: 17-27(2003)］。溶液中のポリ（ＩＣ）の濃度を測定するために、ポリ（ＩＣ）ＵＶスペクトルの直接的読み取りを、製造に関与したポリ（ＩＣ）の非常に高い濃度により、蛍光法の代わりに使用した。   The amount of poly (IC) in the particles was calculated as the difference between the poly (IC) added to the system and the poly (IC) remaining in the aqueous phase after particle precipitation [Bivas-Benitz, et al. , Int. J. Pharm, 266: 17-27 (2003)]. In order to measure the concentration of poly (IC) in solution, a direct reading of the poly (IC) UV spectrum was used instead of the fluorescence method due to the very high concentration of poly (IC) involved in the production.

２．予備製造された粒子によるポリ（ＩＣ）の収着の測定
異なる実験におけるポリ（ＩＣ）５０〜７００ug/mlを含有する酢酸塩又はリン酸塩緩衝剤０．５〜５mlの容積中に、既知の重量の粒子を懸濁させた。懸濁液を強く５分間ボルテックスし、次いで中間レベルでボルテックスして保ち、次いで更に１５分間ロックした。その後、懸濁液を、７０００gで５分間遠心し、そして上清中のポリ（ＩＣ）の濃度を１cm石英セルを使用して分光光度計で測定した。２６０nm及び４００nmにおける吸光度の差を使用してポリ（ＩＣ）の濃度を決定し、ここで、どの１光学的単位も〜５０μg/mlポリ（ＩＣ）に相当していた(American Biosciences, specification for the Product#27-4732)。 2. Measurement of poly (IC) sorption by pre-fabricated particles In a volume of 0.5-5 ml acetate or phosphate buffer containing 50-700 ug / ml poly (IC) in different experiments, known The weight of particles was suspended. The suspension was vortexed vigorously for 5 minutes, then vortexed at an intermediate level and then locked for an additional 15 minutes. The suspension was then centrifuged at 7000 g for 5 minutes and the concentration of poly (IC) in the supernatant was measured with a spectrophotometer using a 1 cm quartz cell. The difference in absorbance at 260 nm and 400 nm was used to determine the concentration of poly (IC), where every single optical unit corresponded to ˜50 μg / ml poly (IC) (American Biosciences, specification for the Product # 27-4732).

３．ｐＨに依存するミクロンより大きいプロタサン粒子の収着容量
ポリ（ＩＣ）0.７mg/mlの溶液を、３つの異なる緩衝剤：１%酢酸塩緩衝剤ｐＨ４．５；１%酢酸塩緩衝剤ｐＨ５．５；ＰＢＳｐＨ７．４と１：１で混合した。各部分における乾燥プロタサン粒子、１．０＋−０．０４mgを、（ポリ（ＩＣ）：緩衝剤）混合溶液１．０ml容積中に懸濁させた。ボルテックス及び遠心後に、ポリ（ＩＣ）の吸着されなかった残りを上記のように測定した。すべての３つのサンプルは、乾燥空粒子mg当たりポリ（ＩＣ）０．７mgに等しいか又はそれを超える、プロタサン粒子の同様な収着容量を示した（図３２ａ）。けれどもサンプルの物理的状態は異なっていた。ｐＨ４．５のサンプルは、粒子の最もコンパクトな沈殿を示し、これに対してｐＨ５．５のサンプルは大きく且つ圧縮できないペレットを示し、そしてｐＨ７．４のサンプルは中間の圧縮を示した（図３２Ｂ）。粒子の最大収着容量は、後でｐＨ４．５で最も高いことが見出された（図３２Ｃ）。 3. pH-Dependent Sorption Capacity of Protasan Particles Larger than Micron A solution of 0.7 mg / ml poly (IC) was prepared in three different buffers: 1% acetate buffer pH 4.5; 1% acetate buffer pH 5. 5; Mixed with PBS pH 7.4 1: 1. 1.0 + -0.04 mg of dry protasan particles in each part was suspended in 1.0 ml volume of (poly (IC): buffer) mixed solution. After vortexing and centrifugation, the unadsorbed remainder of poly (IC) was measured as described above. All three samples showed a similar sorption capacity of protasan particles equal to or greater than 0.7 mg poly (IC) per mg dry empty particles (Figure 32a). But the physical state of the samples was different. The pH 4.5 sample showed the most compact precipitation of particles, whereas the pH 5.5 sample showed large and incompressible pellets, and the pH 7.4 sample showed intermediate compression (FIG. 32B). ). The maximum sorption capacity of the particles was later found to be highest at pH 4.5 (FIG. 32C).

上記発見の結果として、種々の粒子によるポリ（ＩＣ）の収着に関するすべてのその後の実験は、ｐＨ４．５で行われた。   As a result of the above discovery, all subsequent experiments on poly (IC) sorption by various particles were conducted at pH 4.5.

架橋剤として硫酸ナトリウムを使用して予備製造されたプロタサン粒子へのポリ（ＩＣ）の収着に関する実験は、ｐＨ４．５の最大収着容量は、空粒子１mg当たりポリ（ＩＣ）２mgを超えたことを証明した。この結果は、ＴＰＰ架橋剤による結果に対して〜４００倍の改良を示した。   Experiments on the sorption of poly (IC) onto pre-produced protasan particles using sodium sulfate as cross-linking agent showed that the maximum sorption capacity at pH 4.5 exceeded 2 mg poly (IC) per mg empty particles Prove that. This result showed a ~ 400-fold improvement over the result with the TPP crosslinker.

実施例１３：ポリ（ＩＣ）を高度にロードされたサブミクロンプロタサン粒子
希釈した溶液からのプロタサン／ポリ（ＩＣ）／架橋剤凝集物のゆっくりした沈殿を用いてサブミクロン粒子を製造した。 Example 13: Submicron Protasan Particles Highly Loaded with Poly (IC) Submicron particles were prepared using a slow precipitation of protasan / poly (IC) / crosslinker aggregates from a diluted solution.

０．１%酢酸塩緩衝剤ｐＨ４．５中の２００μg/mlのポリ（ＩＣ）溶液２００mlを、室温で絶えず攪拌しながら０．１%酢酸塩緩衝剤中の２００μg/mlプロタサン溶液２００mlに１５分以内に滴下により加えた。得られる溶液を３０℃で１時間攪拌し、その後硫酸ナトリウムの１０%溶液４００mlを、１５分以内に滴下により加えた。組み合わせた溶液の最終８００mlを、３０℃で２時間攪拌し、次いで５０００Gでの遠心により沈殿させた。ペレットを上記したとおり蒸留水中で２回洗浄し、水中に再懸濁させ、次いで４０umＢＤ Ｆａｌｃｏｎセルストレーナーを通してろ過し(BD Biosciences, cat.#352340)、次いで再び沈殿させ、そして最後に〜５mg/mlで水中に再懸濁させた。これらの粒子のサイズは１〜２０ミクロンの範囲に見出された（図３１Ｂ）。これらの粒子の収着容量は、１mg/mlであると思われた。   200 minutes of 200 μg / ml poly (IC) solution in 0.1% acetate buffer pH 4.5 to 200 ml of 200 μg / ml protasan solution in 0.1% acetate buffer with constant stirring at room temperature for 15 minutes Added dropwise. The resulting solution was stirred at 30 ° C. for 1 hour, after which 400 ml of a 10% solution of sodium sulfate was added dropwise within 15 minutes. The final 800 ml of the combined solution was stirred at 30 ° C. for 2 hours and then precipitated by centrifugation at 5000 G. The pellet is washed twice in distilled water as described above, resuspended in water, then filtered through a 40 um BD Falcon cell strainer (BD Biosciences, cat. # 352340), then precipitated again and finally ˜5 mg / ml And resuspended in water. The size of these particles was found in the range of 1-20 microns (FIG. 31B). The sorption capacity of these particles appeared to be 1 mg / ml.

実施例１４：疎水性カチオンＰＬＧＡ／ＰＥＩ／ＰＯＬＹ（ＩＣ）組み合わせ粒子
ＰＬＧＡ／ＰＥＩ／ポリ（ＩＣ）粒子を製造するために、Bivas-Benita et al.のプロトコールの種々の改変を用いた［Bivas-Benita et al., Eur. Jour. of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 58: 1-6(2004)］。実際に、ジクロロメタン中のＰＬＧＡの溶液及びアセトン中のＰＥＩの溶液を種々の割合で組み合わせ、超音波乳化、エアーガン及びエレクトロスプレー微粒化を使用してマイクロ粒子を得た。 Example 14: Hydrophobic Cation PLGA / PEI / POLY (IC) Combined Particles Various modifications of the protocol of Bivas-Benita et al. Were used to produce PLGA / PEI / poly (IC) particles [Bivas- Benita et al., Eur. Jour. Of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 58: 1-6 (2004)]. In practice, a solution of PLGA in dichloromethane and a solution of PEI in acetone were combined in various proportions to obtain microparticles using ultrasonic emulsification, air gun and electrospray atomization.

１．超音波乳化
ＰＬＧＡ５００mgをジクロロメタン５ml中に溶解し、そしてアセトン５mlに溶解したＰＥＩ１００mgと組み合わせた（５：１最終ＰＬＧＡ：ＰＥＩ比）。一緒にした溶液を室温でＢｒａｎｓｏｎ−１５１０超音波処理浴中で絶えず超音波処理下に保たれた１０%ＮａＣｌ水溶液５０ml中に滴下により注いだ。塩化ナトリウムを導入して、有機相を分散させること及び洗浄過程期間中再懸濁することを促進させた。混合物を高められた温度（５０℃）で更に４時間後に超音波処理して、揮発性溶媒を除去した。得られるＰＬＧＡ／ＰＥＩ粒子を前記したように４回洗浄／沈降させ、そして凍結乾燥した。なかなかなくならない界面活性剤の排除により、洗浄パスの数を減少させることが可能であることが見出された。 1. Ultrasonic emulsification 500 mg of PLGA was dissolved in 5 ml of dichloromethane and combined with 100 mg of PEI dissolved in 5 ml of acetone (5: 1 final PLGA: PEI ratio). The combined solution was poured dropwise at room temperature into 50 ml of 10% NaCl aqueous solution kept constantly sonicated in a Branson-1510 sonication bath. Sodium chloride was introduced to help disperse the organic phase and resuspend during the washing process. The mixture was sonicated after an additional 4 hours at elevated temperature (50 ° C.) to remove volatile solvents. The resulting PLGA / PEI particles were washed / settled four times as described above and lyophilized. It has been found that it is possible to reduce the number of cleaning passes by eliminating surfactants that do not go away.

２．ＮａＣｌ受け入れ水溶液に対するＰＬＧＡ／ＰＥＩ溶液のエアーガン及びエレクトロスプレー
ＣＨ２ＣＬ２／アセトン中の上記した５：１ＰＬＧＡ：ＰＥＩ溶液をマイクロエアーガンを使用して１０%ＮａＣｌに対して及びエレクトロスプレーを使用して乱流10%ＮａＣｌ溶液に対して噴霧した。集めたマイクロ粒子を４回洗浄／沈降させ、そして凍結乾燥した。 2. Air gun and electrospray of PLGA / PEI solution against NaCl receiving aqueous solution Disturb the above 5: 1 PLGA: PEI solution in CH 2 CL 2 / acetone to 10% NaCl using micro air gun and using electrospray. Sprayed against a flowing 10% NaCl solution. The collected microparticles were washed / settled four times and lyophilized.

界面活性剤なしで得られた粒子によるポリ（ＩＣ）の収着を、ポリ（ＩＣ）溶液〜７０μg/mlにおいて上記した如く試験した。一般的収着容量は、ほぼエマルジョン技術と匹敵するオーダーに改良されることが見出され；ｐＨ４．５の酢酸塩緩衝剤は収着のために最も適当であることが再び見出された（図３３ａ及びｂ）。   Sorption of poly (IC) by particles obtained without surfactant was tested as described above in poly (IC) solution to 70 μg / ml. The general sorption capacity was found to improve to an order that is roughly comparable to the emulsion technology; pH 4.5 acetate buffer was again found to be most suitable for sorption ( Figures 33a and b).

エアーマイクロガンを使用して得られた粒子の収着容量は、エレクトロスプレーからの粒子よりも幾分高いことが見受けられたが、全体としての形状及びサイズ分布は、エレクトロスプレーの場合により良好であった。エアーガンは、１０ミクロンより大きいサイズの不規則な凝集体を実際に生成し（示されていない）、そしてエレクトロスプレーからの粒子はサイズ範囲３〜１０ミクロンのスフェロイドであった（データは示されていない）。   Although the sorption capacity of particles obtained using an air microgun was found to be somewhat higher than particles from electrospray, the overall shape and size distribution was better with electrospray. there were. The air gun actually produced irregular aggregates of size greater than 10 microns (not shown), and the particles from the electrospray were spheroids in the size range 3-10 microns (data shown) Absent).

３．乾燥金属電極に対してエレクトロスプレーを使用して得られた粒子
乾燥金属電極（ステンレス鋼製パン）上に電気的に分散された粒子を受け取り、そしてその後それらを可溶化することが可能であることが見出された。粒子の収着容量を更に上昇させるために、ＰＬＧＡ：ＰＥＩ比を、２：１、即ち、前と同じく、同じ容積のＣＨ２Ｃｌ２及びアセトン中のＰＬＧＡ５００mg対ＰＥＩ２５０mgに増加させた。乾燥電極上に集められた粒子は、３〜７ミクロンのスフェロイドのように見えた（図３４ａ）。 3. Particles obtained using electrospray on a dry metal electrode It is possible to receive electrically dispersed particles on a dry metal electrode (stainless steel pan) and then solubilize them Was found. To further increase the sorption capacity of the particles, the PLGA: PEI ratio was increased to 2: 1, ie, 500 mg PLGA to 250 mg PEI in the same volume of CH 2 Cl 2 and acetone as before. The particles collected on the dry electrode looked like 3-7 micron spheroids (Figure 34a).

乾燥電極に対してエレクトロスプレーし、その後付着物を蒸留水中に可溶化して製造されたＰＬＧＡ／ＰＥＩ粒子は、種々のエマルジョン法又は水溶液に対する分散に対してはるかに優れているように見えることを結論しても差し支えない。   PLGA / PEI particles produced by electrospraying against a dry electrode and then solubilizing the deposit in distilled water appear to be much better for various emulsion methods or dispersion in aqueous solutions. You can conclude.

４．ファゴサイトーシスの観察のための蛍光ＰＬＧＡ／ＰＥＩ／ＦＩＴＣ粒子
ポリ（ＩＣ）を有する粒子のファゴサイトーシスに関する実験の開始を容易にするために、蛍光標識の簡単化されたバージョンを導入した。９５%エタノール１ml中のＦＩＴＣ(Sigma-Aldrich, cat. #F-7250)２mgを標準的な組み合わせのＰＬＧＡ：ＰＥＩ＝２：１溶液に加えて、乾燥電極に対するエレクトロスプレーの上記したプロトコールに従って粒子を合成した。 4). Fluorescent PLGA / PEI / FITC Particles for Observation of Phagocytosis To facilitate the start of experiments on phagocytosis of particles with poly (IC), a simplified version of a fluorescent label was introduced. Add 2 mg of FITC (Sigma-Aldrich, cat. # F-7250) in 1 ml of 95% ethanol to a standard combination of PLGA: PEI = 2: 1 solution and add the particles according to the protocol described above for electrospray on a dry electrode. Synthesized.

粒子を超音波処理により蒸留水中に再懸濁させ、そして遊離ＦＩＴＣから４回洗浄した。第４回目の洗浄は、遊離ＦＩＴＣの痕跡がゼロであることを示した。強い黄色の得られるペレットを、一晩凍結乾燥し、そして上記した標準プロトコールを使用してポリ（ＩＣ）をチャージした。収着容量は、先に得られたＦＩＴＣなしの粒子の場合よりも低いこと：１００〜２００μg/mlに対して〜７０μg/ml、が見出された。粒子は、明るい緑色蛍光を示す、０．５〜５μmサイズの不規則で幾分スポンジ状のスフェロイドであった（図３５）。   The particles were resuspended in distilled water by sonication and washed 4 times from free FITC. The fourth wash showed zero trace of free FITC. The resulting strong yellow pellet was lyophilized overnight and charged with poly (IC) using the standard protocol described above. The sorption capacity was found to be lower than that of previously obtained particles without FITC: ˜70 μg / ml versus 100-200 μg / ml. The particles were irregular and somewhat spongy spheroids of 0.5-5 μm size showing bright green fluorescence (FIG. 35).

５．ヒト樹状細胞におけるインターフェロンの誘発に関する予備的結果
約５０，０００の一次的なソーティングされたばかりの(primary freshly sorted)ＤＣ１又はＤＣ２サブセットヒト細胞を、ＰＬＧＡ−ＰＥＩ−ポリ（ＩＣ）粒子で処理し、そして培養上清を２４時間後に集め、そしてヒトＩＦＮ−α及びβについてＥＬＩＳＡに付した。β及びαインターフェロン両方の統計的に一貫したレベルが両サブセットについて見出された（図３６）。 5. Preliminary results on induction of interferon in human dendritic cells Approximately 50,000 primary freshly sorted DC1 or DC2 subset human cells were treated with PLGA-PEI-poly (IC) particles, Culture supernatants were then collected 24 hours later and subjected to ELISA for human IFN-α and β. Statistically consistent levels of both β and α interferon were found for both subsets (FIG. 36).

実施例１５：非ウイルス病原体に対する交差シグナリング防御経路
交差シグナリングストラテジーは、バクテリア及びウイルス関連疾患との戦いにおいて有用でありうる。これらの可能性を評価し、そしてＴＬＲ／ＦＡＤＤ経路の刺激因子を有するマイクロ粒子は抗原特異的Ｔ細胞の交差プライミングを含む強力なアジュバント特性を発揮することを確認するために、ニワトリオブアルブミン（ＯＶＡ）のためのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＯＴ−１トランスジェニックマウスをモデルとして使用する。これらの動物における大多数のＣＤ８Ｔ細胞は、Ｋｂ分子と会合しているオブアルブミンペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を認識する単一のＶα２＋Ｖβ５＋ＴＣＲを発現する。これらの粒子は、ＯＶＡ遺伝子を発現するように修飾されることができ、又はタンパク質を直接ロードされることができる。ＣＦＳＥで標識された精製されたＣＤ８＋Ｖα２細胞を動物に養子移行させる。３日後、ＯＶＡ含有粒子（遺伝子又はタンパク質）を動物に接種する（腹腔内）。この方法は、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞に対してｇｐ９６発現細胞からのＯＶＡの増加した交差提示を証明することが最近示された。このアプローチを使用することにより、自然免疫応答の刺激に関与するマイクロカプセル化ストラテジーは、適応的免疫応答の有効なモジュレーターであることが示されうる。 Example 15: Cross-signaling defense pathway against non-viral pathogens Cross-signaling strategies may be useful in the fight against bacterial and virus-related diseases. To evaluate these possibilities and confirm that microparticles with stimulators of the TLR / FADD pathway exert potent adjuvant properties including cross-priming of antigen-specific T cells, chicken of albumin (OVA) OT-1 transgenic mice expressing the T cell receptor (TCR) for use as a model. The majority of CD8 T cells in these animals express a single Vα2 + Vβ5 + TCR that recognizes the ovalbumin peptide (SIINFEKL) associated with the Kb molecule. These particles can be modified to express the OVA gene or can be directly loaded with proteins. Purified CD8 + Vα2 cells labeled with CFSE are adoptively transferred to animals. Three days later, animals are inoculated (intraperitoneally) with OVA-containing particles (gene or protein). This method has recently been shown to demonstrate increased cross-presentation of OVA from gp96-expressing cells versus OVA-specific T cells. By using this approach, microencapsulation strategies involved in stimulating the innate immune response can be shown to be effective modulators of the adaptive immune response.

実施例１６：ポリ（ＩＣ）をロードされたＰＬＧＡ／ＰＥＩ又はプロタサンマイクロ粒子は、細胞外ＴＬＲ３経路を活性化することにより２９３細胞におけるＩＦＮ−β産生を誘発することの証明。
ＴＬＲ３、外因性ｄｓＲＮＡのための受容体、を発現している又は発現していない２９３細胞を、ＩＦＮ−βプロモーターの制御下にルシフェラーゼ遺伝子でトランスフェクションし、そしてＰＬＧＡ／ＰＥＩ粒子（融合したｄｓＲＮＡを有する及び有していない）又はプロタサン粒子（融合したｄｓＲＮＡを有する及び有していない）に暴露した。粒子への暴露時間は３〜６時間であった。図３７ｂに示されたとおり、ｄｓＲＮＡを有する粒子のみが、ルシフェラーゼ遺伝子の細胞外ＴＬＲ３媒介活性化をトリガーすることができた。コントロールとして、ＴＬＲ３レポーターなしの２９３細胞を、ＩＦＮ−βプロモーターの制御下にルシフェラーゼ遺伝子でトランスフェクションし、そしてＰＬＧＡ／ＰＥＩ粒子（融合したｄｓＲＮＡを有する及び有していない）又はプロタサン粒子（融合したｄｓＲＮＡを有する及び有していない）に暴露した（図３７ａ）。有意なルシフェラーゼ活性は検出されなかったが、これはｄｓＲＮＡを有するマイクロ粒子のみがＴＬＲ３を介してＩＦＮ−β経路を活性化することができたことを示す。２９３細胞は、非常に弱い細胞内経路を有し、かくして、主としてＴＬＲ３経路を活性化する理由を有する（データは示されていない）。 Example 16: Demonstration that poly (IC) loaded PLGA / PEI or protasan microparticles induce IFN-β production in 293 cells by activating the extracellular TLR3 pathway.
293 cells expressing or not expressing TLR3, a receptor for exogenous dsRNA, were transfected with the luciferase gene under the control of the IFN-β promoter and PLGA / PEI particles (fused dsRNA With and without) or protasan particles (with and without fused dsRNA). The exposure time to the particles was 3-6 hours. As shown in FIG. 37b, only particles with dsRNA were able to trigger extracellular TLR3-mediated activation of the luciferase gene. As controls, 293 cells without a TLR3 reporter were transfected with the luciferase gene under the control of the IFN-β promoter and PLGA / PEI particles (with and without fused dsRNA) or protasan particles (fused dsRNA) With and without (FIG. 37a). No significant luciferase activity was detected, indicating that only microparticles with dsRNA were able to activate the IFN-β pathway via TLR3. 293 cells have a very weak intracellular pathway and thus have the main reason to activate the TLR3 pathway (data not shown).

コントロール：更なるコントロールとして、外因性ｄｓＲＮＡを、ＴＬＲ３を発現している又は発見していない２９３細胞に加えた。両タイプの細胞をＩＦＮ−βプロモーターの制御下にルシフェラーゼ遺伝子でトランスフェクションし、そして外因性ｄｓＲＮＡで処理した。ＴＬＲ３を発現する細胞のみがｄｓＲＮＡにより活性化されて、ＩＦＮ−βプロモーターを転写的に活性化することができた。   Control: As an additional control, exogenous dsRNA was added to 293 cells expressing or not discovering TLR3. Both types of cells were transfected with the luciferase gene under the control of the IFN-β promoter and treated with exogenous dsRNA. Only cells expressing TLR3 were activated by dsRNA and were able to transcriptionally activate the IFN-β promoter.

実施例１７：ポリ（ＩＣ）をロードされたＰＬＧＡ／ＰＥＩ又はプロタサンマイクロ粒子は、おそらく細胞外インネイテオソーム経路を活性化することによりＤＣ２サブセット細胞におけるＩＦＮα産生を誘発することの証明
末梢ヒト血液サンプルにおけるＤＣ２サブセットを、ＰＬＧＡ／ＰＥＩ又はプロタサン粒子（融合したｄｓＲＮＡを有する及び有していない）に暴露し、そして図３８に示されたとおり粒子への３〜６時間の暴露の後にインターフェロンα発現について監視した。ＤＣ２（プラズマサイトイドＤＣｓ(plasmacytoid DCs)はＴＬＲ３を欠き、それ故インターフェロンα誘発は別のｄｓＲＮＡシグナリング経路によりトリガーされる）は、おそらく「インネイテオソーム」を介する細胞内経路を利用する。 Example 17: Demonstration that poly (IC) loaded PLGA / PEI or protasan microparticles induce IFNα production in DC2 subset cells, possibly by activating the extracellular innateosome pathway DC2 subsets in human blood samples are exposed to PLGA / PEI or protasan particles (with and without fused dsRNA), and interferon after 3-6 hours exposure to particles as shown in FIG. α expression was monitored. DC2 (plasmacytoid DCs lack TLR3 and therefore interferon alpha induction is triggered by another dsRNA signaling pathway) probably utilizes an intracellular pathway through the “innateosome”.

本発明の化合物及び方法の好ましい態様は、説明することを意図しており、限定を意図するものではない。改変及び変更は上記教示に照らして当業者によりなされうる。本発明は、例えば、空気品質を監視するために、ガスサンプル中のアセトンレベルを測定する他の目的に使用することができることも、当業者により考えられうる。故に、特許請求の範囲により規定された範囲内にある変更が、開示された特別な態様においてなされうることは理解されるべきである。   Preferred embodiments of the compounds and methods of the present invention are intended to be illustrative and not limiting. Modifications and changes can be made by those skilled in the art in light of the above teachings. It can also be considered by those skilled in the art that the present invention can be used for other purposes of measuring the acetone level in a gas sample, for example to monitor air quality. Therefore, it is to be understood that changes that fall within the scope defined by the claims may be made in the particular aspects disclosed.

ＴＬＲｓを介する宿主細胞によるＰＡＭＰｓの検出を示す。FIG. 6 shows detection of PAMPs by host cells via TLRs. インターフェロンの抗ウイルス機構を示す。The antiviral mechanism of interferon is shown. ＴＮＦ−α経路の略図である。1 is a schematic representation of the TNF-α pathway. 抗原のプロセッシング及び主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子への送達の経路の略図である。1 is a schematic representation of the pathway of antigen processing and delivery to major histocompatibility complex (MHC) molecules. ポリ（ＩＣ）処理プロトコールの略図である。1 is a schematic diagram of a poly (IC) treatment protocol. ２つのウイルスシグナリング経路、外因性ＴＬＲ３依存性経路及び内因性ＦＡＤＤ依存性経路を活性化してＩＦＮを産生することにより自然免疫を高める提唱された方法の略図である。1 is a schematic representation of a proposed method of enhancing innate immunity by activating two viral signaling pathways, an exogenous TLR3-dependent pathway and an endogenous FADD-dependent pathway to produce IFN. キトサンの構造式である。This is the structural formula of chitosan. 単球由来のヒト樹状細胞によりファゴサイトーシスされたポリスチレンビーズを示す顕微鏡写真である。It is a microscope picture which shows the polystyrene bead phagocytosed by the monocyte-derived human dendritic cell. 分岐状ＰＥＩの構造式である。It is a structural formula of branched PEI. （１）酵母ｄｓＲＮＡ、（２）スペルミジン−ポリグルシン−グルタチオンコンジュゲート及び（３）ハイブリッドタンパク質ＴＢＩ−ＧＳＴからなる人工的ウイルス様粒子である。An artificial virus-like particle comprising (1) yeast dsRNA, (2) spermidine-polyglucin-glutathione conjugate, and (3) hybrid protein TBI-GST. 図１１ａ〜１１ｆは、ＩＦＮ予備処理後ですらＭＥＦｓにおけるＶＳＶ複製の阻止のためには、ＦＡＤＤが必要とされるがカスパーゼ−８は必要ではないことを示す実験データである。図１１ａは、ＦＡＤＤ欠如ＭＥＦｓは、ＩＦＮ予備処理にもかかわらずＶＳＶ誘発ＣＰＥ(VSV-induced CPE)に感受性であり、そして顕微鏡写真は感染の４８時間後に撮られたことを示す。図１１ｂは、ＦＡＤＤ欠如ＭＥＦｓがＩＦＮ予備処理によりＶＳＶでトリガーされた細胞死から保護されないことを示す。細胞生存度は、トリパンブルー排除分析により感染後の指示された時間に決定された。図１１ｃは、ＩＦＮ予備処理は、ＦＡＤＤ−／−ＥＦｓにおけるＶＳＶ複製を遅らせるが阻止はしないことを示す。図１１ｄは、カスパーゼ８欠如は、ＭＥＦｓにＶＳＶ誘発ＣＰＥに対する感受性を増加する素因を与えないことを示す。図１１ｅは、カスパーゼ−８＋／＋及び−／−ＭＥＦｓは、ＩＦＮ予備処理によりＶＳＶ誘発細胞死から等しく十分に保護されることを示す。図１１ｆは、ＩＦＮ予備処理が、カスパーゼ−８＋／＋及び−／−ＥＦｓの両方においてＶＳＶ複製を有効に阻害することを示す。FIGS. 11a-11f are experimental data showing that FADD is required but caspase-8 is not required to prevent VSV replication in MEFs even after IFN pretreatment. FIG. 11a shows that FADD-deficient MEFs are sensitive to VSV-induced CPE despite IFN pretreatment and micrographs were taken 48 hours after infection. FIG. 11b shows that FADD-deficient MEFs are not protected from VSV-triggered cell death by IFN pretreatment. Cell viability was determined at the indicated time after infection by trypan blue exclusion analysis. FIG. 11c shows that IFN preprocessing delays but does not prevent VSV replication in FADD − / − EFs. FIG. 11d shows that lack of caspase 8 does not predispose MEFs to increase susceptibility to VSV-induced CPE. FIG. 11e shows that caspase-8 + / + and − / − MEFs are equally well protected from VSV-induced cell death by IFN pretreatment. FIG. 11f shows that IFN pretreatment effectively inhibits VSV replication in both caspase-8 + / + and − / − EFs. 図１２ａ〜１２ｄは、ＦＡＤＤの不存在は、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）及びインフルエンザウイルス（ＦＬＵ）感染による感染に細胞を感作させることを示す実験データである。図１２ａは、ＥＭＣＶ誘発ＣＰＥに対して保護するのにＦＡＤＤが必要であることを示す。細胞は感染の２４時間後に写真に撮られた（倍率２００倍）。図１２ｂは、（ａ）における如く感染した細胞がトリパンブルー排除により細胞生存度について分析されたことを示す。図１２ｃは、ＥＭＣＶ誘発ＣＰＥに対して保護するのにＦＡＤＤが必要であることを示す。細胞は感染の２４時間後に写真に撮られた（倍率２００倍）。図１２ｄは、（ｃ）における如く感染した細胞がトリパンブルー排除により細胞生存度について分析されたことを示す。Figures 12a-12d are experimental data showing that the absence of FADD sensitizes cells to infection by encephalomyocarditis virus (EMCV) and influenza virus (FLU) infection. FIG. 12a shows that FADD is required to protect against EMCV-induced CPE. Cells were photographed 24 hours after infection (200x magnification). FIG. 12b shows that infected cells as in (a) were analyzed for cell viability by trypan blue exclusion. FIG. 12c shows that FADD is required to protect against EMCV-induced CPE. Cells were photographed 24 hours after infection (200x magnification). FIG. 12d shows that the infected cells as in (c) were analyzed for cell viability by trypan blue exclusion. 図１３ａ〜１３ｆは、ＩＦＮシグナリングがＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓにおいて破壊されないことを示す実験データである。図１３ａは、ＦＡＤＤの不存在下に正常なＳＴＡＴ１リン酸化を示す。図１３ｂは、ＩＦＮ処理の後のＳＴＡＴ１の核トランスロケーションがＦＡＤＤの不存在下に正常に起こることを示す。図１３ｃは、ＦＡＤＤは、ＩＦＮでトリガーされた遺伝子誘発のために必要ではないことを示す。図１３ｄは、ＩＦＮ応答プロモーターがＦＡＤＤ不存在下に正常に機能することを示す。図１３ｅは、外因性ＩＦＮ−βは、感染後に加えられると、ＶＳＶ誘発ＣＰＥからＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓを保護することができることを示す。細胞は感染の４８時間後に写真に撮られた。図１３ｆは、外因性ＩＦＮ−βは、感染後に加えられると、ＶＳＶ複製及びその結果としての細胞死からＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓを保護することができることを示す。Figures 13a-13f are experimental data showing that IFN signaling is not disrupted in FADD-/-MEFs. FIG. 13a shows normal STAT1 phosphorylation in the absence of FADD. FIG. 13b shows that nuclear translocation of STAT1 after IFN treatment occurs normally in the absence of FADD. FIG. 13c shows that FADD is not required for IFN-triggered gene induction. FIG. 13d shows that the IFN-responsive promoter functions normally in the absence of FADD. FIG. 13e shows that exogenous IFN-β can protect FADD − / − MEFs from VSV-induced CPE when added after infection. Cells were photographed 48 hours after infection. FIG. 13f shows that exogenous IFN-β can protect FADD − / − MEFs from VSV replication and consequent cell death when added after infection. 図１４ａ及び１４ｂは、ＩＦＮα／β予備処理にもかかわらず、ＶＳＶ感染の後野生型ＭＥＦｓの連続した保護を与えるのに、ＩＦＮ−βの新規な合成が必要であることを示す実験データである。図１４ａは、ＦＡＤＤ＋／−細胞は、ＩＦＮα／β予備処理にもかかわらず、中和性抗ＩＦＮ−β抗血清の存在下に、ＶＳＶに感受性であることを示す。写真は感染の４８時間後に撮られた（倍率、２００倍）。図１４ｂは、（ａ）における如く処理されたＦＡＤＤ＋／−細胞を、ＶＳＶ子孫収率又はトリパンブルー排除による細胞生存度について調べたことを示す。FIGS. 14a and 14b are experimental data showing that novel synthesis of IFN-β is required to confer continued protection of wild-type MEFs after VSV infection despite IFNα / β pretreatment. . FIG. 14a shows that FADD +/− cells are sensitive to VSV in the presence of neutralizing anti-IFN-β antiserum despite IFNα / β pretreatment. Pictures were taken 48 hours after infection (magnification, 200x). FIG. 14b shows that FADD +/− cells treated as in (a) were examined for VSV progeny yield or cell viability by trypan blue exclusion. 図１５ａ〜１５ｇは、ＦＡＤＤの不存在下に細胞内ｄｓＲＮＡによる不完全なＩＦＮ−β遺伝子誘発を示す実験データである。図１５ａは、ＩＦＮ−βプロモーターのトランスフェクションされたｄｓＲＮＡ媒介活性化はＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓにおいて不完全であることを示す。図１５ｂは、ＩＦＮ−αのｄｓＲＮＡ誘発産生はＦＡＤＤの不存在下では不完全であることを示す。図１５ｃは、マウス（Ｍ）ＦＡＤＤのＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓへの再構成は、ｄｓＲＮＡシグナリングを部分的に救済することができることを示す。図１５ｄは、カスパーゼ−８は、細胞内ｄｓＲＮＡシグナリングのために必要ではないことを示す。図１５ｅは、ＰＫＲは細胞内ｄｓＲＮＡシグナリングのために必要ではないことを示す。ＰＫＲ＋／＋及びＰＫＲ−／−ＭＥＦｓをＩＦＮ−β−Ｌｕｃでトランスフェクションした。 図１５ｆは、ＦＡＤＤのＲＮＡｉ媒介ノックダウンが細胞内ｄｓＲＮＡシグナリングを無効にするが、ＰＫＲ又はＴＬＲ３はそうではないことを示す。図１５ｇは、ＴＬＲ３の過剰発現は、細胞外ｄｓＲＮＡに対する応答を与えるが、細胞内ｄｓＲＮＡに対しては与えないことを示す。FIGS. 15a-15g are experimental data showing incomplete IFN-β gene induction by intracellular dsRNA in the absence of FADD. FIG. 15a shows that transfected dsRNA-mediated activation of the IFN-β promoter is incomplete in FADD − / − MEFs. FIG. 15b shows that dsRNA-induced production of IFN-α is incomplete in the absence of FADD. FIG. 15c shows that reconstitution of mouse (M) FADD into FADD − / − MEFs can partially rescue dsRNA signaling. FIG. 15d shows that caspase-8 is not required for intracellular dsRNA signaling. FIG. 15e shows that PKR is not required for intracellular dsRNA signaling. PKR + / + and PKR − / − MEFs were transfected with IFN-β-Luc. FIG. 15f shows that RNAi-mediated knockdown of FADD abolishes intracellular dsRNA signaling, but not PKR or TLR3. FIG. 15g shows that overexpression of TLR3 provides a response to extracellular dsRNA but not to intracellular dsRNA. 図１６ａ〜１６ｅは、ＴＬＲ３シグナリングはＦＡＤＤを必要としないことを示す実験データである。図１６ａは、ＴＬＲ３及び他のＴＬＲシグナリング成分は、ＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓにおいてＩＦＮ−βを正常に誘発することを示す。図１６ｂは、ＴＲＡＦ６欠如は、ＭＥＦｓをＩＦＮの存在下においてＶＳＶ感染を受けやすくしないことを示す。顕微鏡写真は、感染の４８時間後に撮られた。図１６ｃ及び１６ｄは、ＴＲＡＦ６−／−ＥＦｓがＩＦＮ予備処理によりＶＳＶでトリガーされる細胞死から保護されることを示す。細胞生存度は、感染の４８時間後にトリパンブルー排除分析により決定された。図１６ｅは、ＩＦＮ予備処理がＴＲＡＦ６−／−ＭＥＦｓをＶＳＶから保護することを示す。Figures 16a-16e are experimental data showing that TLR3 signaling does not require FADD. FIG. 16a shows that TLR3 and other TLR signaling components normally induce IFN-β in FADD − / − MEFs. FIG. 16b shows that lack of TRAF6 does not make MEFs susceptible to VSV infection in the presence of IFN. Micrographs were taken 48 hours after infection. Figures 16c and 16d show that TRAF6-/-EFs are protected from cell death triggered by VSV by IFN pretreatment. Cell viability was determined by trypan blue exclusion analysis 48 hours after infection. FIG. 16e shows that IFN preprocessing protects TRAF6-/-MEFs from VSV. 図１７ａ〜１７ｆは、ＲＩＰ欠失はＦＡＤＤ機能破壊(FADD ablation)によく似ることを示す実験データである。図１７ａは、ＲＩＰ欠如ＥＦｓは、ＩＦＮ予備処理にもかかわらずＶＳＶ誘発ＣＰＥに非常に感受性であることを示す。図１７ｂは、ＲＩＰ欠失ＥＦｓは、ＩＦＮ予備処理により、ＶＳＶでトリガーされた細胞死から保護されないことを示す。図１７ｃは、ＩＦＮ予備処理はＲＩＰの不存在下にウイルス複製を有効に阻害することができないことを示す。図１７ｄ及び１７ｅは、ＲＩＰの不存在下に不完全な(defective)細胞内ｄｓＲＮＡシグナリングを示す。図１７ｆは、ＴＬＲ３シグナリングのためにＲＩＰが必要ではないことを示す。Figures 17a-17f are experimental data showing that RIP deletion closely resembles FADD ablation. FIG. 17a shows that RIP-deficient EFs are very sensitive to VSV-induced CPE despite IFN pretreatment. FIG. 17b shows that RIP-deficient EFs are not protected from VSV-triggered cell death by IFN pretreatment. FIG. 17c shows that IFN pretreatment cannot effectively inhibit viral replication in the absence of RIP. Figures 17d and 17e show defective intracellular dsRNA signaling in the absence of RIP. FIG. 17f shows that RIP is not required for TLR3 signaling. 図１８ａ〜１８ｊは、ＴＢＫ−１／ＩＫＫ−δ及びＩＲＦ−３を介するＦＡＤＤシグナルを含む抗ウイルスシグナリングを示す実験データである。図１８ａは、ＩＦＮα／β（１００Uml２１）予備処理のあるなしで野生型又はＩＫＫ−α、ＩＫＫ−β、ＩＫＫ−γ及びＩＫＫ−δ欠如ＭＥＦｓのＶＳＶ（ＭＯＩ １／４ １０）による感染を示す。図１８ｂは、選ばれた組の抗ウイルス遺伝子のＤＮＡマイクロアレイ分析である。図１８ｃは、ポリ（ＩＣ）によるトランスフェクション後の又はポリ（ＩＣ）単独による処理の後のＩＦＮ−β産生を示す。図１８ｄは、指示された量のポリ（ＩＣ）によるトランスフェクション後の又はポリ（ＩＣ）単独による処理後のＩＦＮ−α産生を示す。図１８ｅは、ＦＡＤＤ＋／−及びＦＡＤＤ−／−細胞において１時間ポリ（ＩＣ）でトランスフェクションした後のＩＲＦ−３の局在化である。図１８ｆは、ＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓにおける不完全なＩＲＦ−３応答プロモーター活性化(defective IRF-3-responsive promoter activation)である。図１８ｇは、ＩＦＮα／β（１００Uml２１）又はＩＦＮ−γ（０．５ng ml２１）予備処理のあるなしでＩｒｆ３＋／＋及びＩｒｆ３−／−ＭＥＦｓのＶＳＶ（ＭＯＩ １／４ １０）による感染である。図１８ｈは、ポリ（ＩＣ）によるトランスフェクション後の又はポリ（ＩＣ）単独による処理後のＩＦＮ−β産生を示す。図１８ｉは、ポリ（ＩＣ）によるトランスフェクション後の又はポリ（ＩＣ）単独による処理後のＩＦＮ−αの産生を示す。図１８ｊは、選ばれた組の抗ウイルス遺伝子についてのＤＮＡマイクロアレイ分析である。誤差バーは平均±ｓ．ｄを示す。Figures 18a-18j are experimental data showing antiviral signaling including FADD signals via TBK-1 / IKK-δ and IRF-3. FIG. 18a shows infection by wild type or IKK-α, IKK-β, IKK-γ and IKK-δ-deficient MEFs with and without IFNα / β (100 Uml21) pretreatment by VSV (MOI 1/4 10). FIG. 18b is a DNA microarray analysis of a selected set of antiviral genes. FIG. 18c shows IFN-β production after transfection with poly (IC) or after treatment with poly (IC) alone. FIG. 18d shows IFN-α production after transfection with the indicated amount of poly (IC) or after treatment with poly (IC) alone. FIG. 18e is the localization of IRF-3 after 1 hour poly (IC) transfection in FADD +/− and FADD − / − cells. FIG. 18f is defective IRF-3-responsive promoter activation in FADD − / − MEFs. FIG. 18g is infection of Irf3 + / + and Irf3-/ − MEFs with VSV (MOI 1/4 10) with or without IFNα / β (100 Uml21) or IFN-γ (0.5 ng ml21) pretreatment. FIG. 18h shows IFN-β production after transfection with poly (IC) or after treatment with poly (IC) alone. FIG. 18i shows IFN-α production after transfection with poly (IC) or after treatment with poly (IC) alone. FIG. 18j is a DNA microarray analysis for a selected set of antiviral genes. Error bars are mean ± s. d. 図１９ａ〜１９ｃは、ＦＡＤＤ−／−細胞がグラム陽性及びグラム陰性細胞内バクテリアによる感染に対して感受性であることを示す実験データである。図１９ａは、ＦＡＤＤ−／−細胞が、細胞内Ｌｉｓｔｅｒｉａ感染により誘発されたＣＰＥに対して極めて感受性であることを示す。図１９ｂは、ＦＡＤＤ−／−細胞が、細胞内Ｌｉｓｔｅｒｉａ感染により誘発された細胞死に対して感受性であることを示す。図１９ｃは、ＦＡＤＤ−／−細胞が、細胞内Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染により誘発されたＣＰＥに対して極めて感受性であることを示す。Figures 19a-19c are experimental data showing that FADD-/-cells are susceptible to infection by gram positive and gram negative intracellular bacteria. FIG. 19a shows that FADD − / − cells are very sensitive to CPE induced by intracellular Listeria infection. FIG. 19b shows that FADD − / − cells are susceptible to cell death induced by intracellular Listeria infection. FIG. 19c shows that FADD − / − cells are very sensitive to CPE induced by intracellular Salmonella infection. 乱流受け取り器を有する改変されたエレクトロスプレー装置である。A modified electrospray device with a turbulent receiver. 乱流攪拌を有する改変されたエレクトロスプレーにより製造されたキトサンマイクロ粒子のＥＳＥＭ像である。2 is an ESEM image of chitosan microparticles produced by a modified electrospray with turbulent agitation. ポリイノシン酸−ポリシチジル酸、ポリ（ＩＣ）の構造式である。It is a structural formula of polyinosinic acid-polycytidylic acid, poly (IC). エチジウムホモ二量体の構造式である。It is a structural formula of ethidium homodimer. インターカレーションされたエチジウムホモ二量体の蛍光によりポリ（ＩＣ）を測定するための較正曲線を示す。Figure 2 shows a calibration curve for measuring poly (IC) by fluorescence of intercalated ethidium homodimer. エチジウムホモ二量体インターカレーターをインターカレーションさせることを使用して束縛されていない及び結合したポリ（ＩＣ）を測定する比較を示す。 （Ａ）溶液中の遊離ポリ（ＩＣ）を測定する； （Ｂ）マイクロ粒子中の結合したポリ（ＩＣ）を測定する。１−イルミネーター、２−検出器、３−フィルター、４−プレートウエル。Figure 6 shows a comparison of measuring unbound and bound poly (IC) using intercalating ethidium homodimeric intercalators. (A) Measure free poly (IC) in solution; (B) Measure bound poly (IC) in microparticles. 1-illuminator, 2-detector, 3-filter, 4-plate well. エチジウムホモ二量体と相互作用時のポリ（ＩＣ）をロードされたキトサン粒子の時間依存性蛍光を示す。Figure 3 shows the time-dependent fluorescence of chitosan particles loaded with poly (IC) upon interaction with ethidium homodimer. キトサンマイクロ粒子からのポリ（ＩＣ）の時間放出を示す。Figure 2 shows the time release of poly (IC) from chitosan microparticles. 図２８ａ及び図２８ｂは、一価銅のタンパク質及びビシンコニン酸との紫色の錯体を示す。 Ａはペプチド窒素とのビウレット錯体である。 Ｂはビシンコニン酸とのキレート錯体である。Figures 28a and 28b show a purple complex with monovalent copper protein and bicinchoninic acid. A is a biuret complex with peptide nitrogen. B is a chelate complex with bicinchoninic acid. オブアルブミンのビシンコニン酸アッセイのための較正曲全を示す。The complete calibration curve for the bicinchoninic acid assay of ovalbumin is shown. キトサンマイクロ粒子からのオブアルブミンの時間放出を表す。2 represents the time release of ovalbumin from chitosan microparticles. 図３１ａ及び図３１ｂは、凍結乾燥されたプロタサン／ポリ（ＩＣ）粒子のＳＥＭ像である。 Ａはミクロンより上のサイズ粒子、Ｘ１００である。バーは２００μmを示す。 Ｂはサブミクロンサイズの粒子、Ｘ５０００である。バーは５μmを示す。Figures 31a and 31b are SEM images of lyophilized protasan / poly (IC) particles. A is a size particle above micron, X100. The bar represents 200 μm. B is a submicron sized particle, X5000. Bar indicates 5 μm. 図３２ａ〜図３２ｃは、異なるｐＨにおけるミクロンより上のプロタサン粒子によるポリ（ＩＣ）の収着である。 Ａは収着の結果として減少するポリ（ＩＣ）の光学的スペクトルを示す。 Ｂは、ポリ（ＩＣ）の収着後の粒子のペレットを示す。 Ｃは異なるｐＨにおける粒子の収着容量を示す。Figures 32a-c are poly (IC) sorption by protasan particles above micron at different pH. A shows the optical spectrum of poly (IC) that decreases as a result of sorption. B shows particle pellets after poly (IC) sorption. C indicates the sorption capacity of the particles at different pH. 図３３ａ及び図３３ｂは、ＰＬＧＡ／ＰＥＩ粒子の収着特性である。 Ａは、異なる方法により得られた粒子のポリ（ＩＣ）の収着を示す。 Ｂは異なるｐＨにおけるポリ（ＩＣ）の収着を示す。Figures 33a and 33b are the sorption characteristics of PLGA / PEI particles. A shows the sorption of poly (IC) of particles obtained by different methods. B shows poly (IC) sorption at different pH. 図３４ａ及び図３４ｂは、後で可溶化を伴う乾燥ステンレス鋼電極に対するエレクトロスプレーにより得られたＰＬＧＡ／ＰＥＩ／ポリ（ＩＣ）粒子を示す。 Ａは、可溶化後のＳＥＭＸ５０００であり、そして Ｂは、収着容量を示す：高い又は低いイオン強度における可溶化により影響を受けた。Figures 34a and 34b show PLGA / PEI / poly (IC) particles obtained by electrospray on a dry stainless steel electrode with subsequent solubilization. A is SEMX5000 after solubilization and B shows sorption capacity: affected by solubilization at high or low ionic strength. 図３５ａ及び図３５ｂは、ＰＬＧＡ／ＰＥＩ／ポリ（ＩＣ）の粒子を示す。 ＡはＳＥＭ像Ｘ５０００であり、そして Ｂは希釈された水懸濁液の蛍光顕微鏡写真、Ｘ２００である。Figures 35a and 35b show PLGA / PEI / poly (IC) particles. A is a SEM image X5000, and B is a fluorescence micrograph of a diluted water suspension, X200. ポリ（ＩＣ）を有するＰＬＧＡ／ＰＥＩ粒子によるヒト樹状細胞のＤＣ１及びＤＣ２サブセットにおけるＩＦＮ−β及びＩＦＮ−αの誘発を示す。FIG. 5 shows induction of IFN-β and IFN-α in DC1 and DC2 subsets of human dendritic cells by PLGA / PEI particles with poly (IC). ポリ（ＩＣ）を有するＰＬＧＡ／ＰＥＩ粒子によるヒト樹状細胞のＤＣ１及びＤＣ２サブセットにおけるＩＦＮ−β及びＩＦＮ−αの誘発を示す。FIG. 5 shows induction of IFN-β and IFN-α in DC1 and DC2 subsets of human dendritic cells by PLGA / PEI particles with poly (IC). ポリ（ＩＣ）を有するマイクロ粒子を介する細胞外ＴＬＲ３誘発を示す。Figure 3 shows extracellular TLR3 induction via microparticles with poly (IC). ポリ（ＩＣ）を有するマイクロ粒子を介する細胞外ＴＬＲ３誘発を示す。Figure 3 shows extracellular TLR3 induction via microparticles with poly (IC). 末梢ヒト血液サンプル中のＤＣ２がＰＬＧＡ／ＰＥＩ又はプロタサン粒子（融合された(amalgamated)ｄｓＲＮＡを有するか又は有さない）に暴露され、そして粒子への暴露の３〜６時間後のＩＦＮ−α発現について監視されたことを示す。DC2 in peripheral human blood samples is exposed to PLGA / PEI or protasan particles (with or without amalgamated dsRNA) and IFN-α expression 3-6 hours after exposure to particles Indicates that monitoring has been performed.

Claims (21)

ポリカチオンポリマーを含む、２０〜７００ミクロンメートルの範囲の直径を有するマイクロ粒子；
ポリ（ＩＣ）であるＦＡＤＤ依存性経路のモジュレーター；及び
ポリ（ＩＣ）であるＴＬＲ経路のモジュレーターを含み、
該ＦＡＤＤ依存性経路のモジュレーター及び該ＴＬＲ経路のモジュレーターは、該マイクロ粒子と会合している、
哺乳動物における自然免疫系をモジュレーションするための組成物。 Microparticles having a diameter in the range of 20 to 700 microns comprising a polycationic polymer;
A modulator of a FADD-dependent pathway that is poly (IC) ; and
A modulator of the TLR pathway that is poly (IC) ,
The modulator of the FADD-dependent pathway and the modulator of the TLR pathway are associated with the microparticle;
A composition for modulating the innate immune system in a mammal. 該マイクロ粒子が、抗原提示細胞に特異的に結合するターゲティング分子で更にコーティングされる、請求項１に記載の組成物。  2. The composition of claim 1, wherein the microparticle is further coated with a targeting molecule that specifically binds to antigen presenting cells. 該ターゲティング分子が抗体である、請求項２に記載の組成物。The composition of claim 2 , wherein the targeting molecule is an antibody. 該ターゲティング分子が熱ショックタンパク質ｇｐ９６である、請求項３に記載の組成物。4. The composition of claim 3 , wherein the targeting molecule is heat shock protein gp96. サイトカイン又は抗原を含有するポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）マトリックスを更に含み、該マイクロ粒子が該マトリックス中にカプセル化されている、請求項１に記載の組成物。  The composition of claim 1, further comprising a poly (lactide-co-glycolide) (PLGA) matrix containing a cytokine or antigen, wherein the microparticles are encapsulated in the matrix. 該マイクロ粒子中にカプセル化されたサイトカインを更に含む、請求項１に記載の組成物。  2. The composition of claim 1, further comprising a cytokine encapsulated in the microparticle. 該サイトカインが、ＩＬ−１２、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１６、ＴＮＦα及びＭＩＦよりなる群から選ばれる、請求項６に記載の組成物。The cytokine is IL-12, IL-1α, IL-1β, IL-15, IL-18, IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-4, IL-10, IL-6, IL-17, IL-16, The composition according to claim 6, which is selected from the group consisting of TNFα and MIF. 該マイクロ粒子は、サイトカインの所望の放出速度が達成されるように、１種以上の疎水性ポリマーを更に含む、請求項７に記載の組成物。8. The composition of claim 7 , wherein the microparticle further comprises one or more hydrophobic polymers so that a desired release rate of cytokines is achieved. 該１種以上の疎水性ポリマーがＰＬＧＡ、ポリ（カプロラクトン）又はポリ（オキシブチレート）を含む、請求項８に記載の組成物.The composition of claim 8 , wherein the one or more hydrophobic polymers comprise PLGA, poly (caprolactone) or poly (oxybutyrate). 該マイクロ粒子が両親媒性ポリマーを更に含む、請求項７に記載の組成物.The composition of claim 7 , wherein the microparticle further comprises an amphiphilic polymer. 該両親媒性ポリマーがポリ（エチレン）イミン（ＰＥＩ）である、請求項１０に記載の組成物.The composition of claim 10 , wherein the amphiphilic polymer is poly (ethylene) imine (PEI). 該組成物が、腫瘍抗原又は腫瘍抗原をコードするＤＮＡを更に含み、該腫瘍抗原又は腫瘍抗原をコードするＤＮＡが該マイクロ粒子と会合している、請求項1に記載の組成物。  2. The composition according to claim 1, wherein the composition further comprises a tumor antigen or a DNA encoding a tumor antigen, and the DNA encoding the tumor antigen or the tumor antigen is associated with the microparticle. 該ポリカチオンポリマーがキトサンである、請求項１に記載の組成物。  The composition of claim 1, wherein the polycationic polymer is chitosan. 薬学的に許容されうる担体を更に含む、請求項１に記載の組成物。  The composition of claim 1 further comprising a pharmaceutically acceptable carrier. ポリカチオンポリマーを含む、２０〜７００ミクロンメートルの範囲の直径を有するマイクロ粒子、
自然免疫応答ブースターとしてのポリ（ＩＣ）、及び
抗原を含み、
該ポリ（ＩＣ）及び該抗原は該マイクロ粒子と会合している、哺乳動物における免疫応答をモジュレーションするための組成物。 Microparticles having a diameter in the range of 20 to 700 microns comprising a polycationic polymer;
Po Li as innate immune response booster (IC), and comprises an antigen,
該Po Li (IC) and the antigen are associated with the microparticle, compositions for modulating the immune response in a mammal. サイトカインを更に含み、該サイトカインは該マイクロ粒子と会合している、請求項１５に記載の組成物。 16. The composition of claim 15 , further comprising a cytokine, wherein the cytokine is associated with the microparticle. 該サイトカインが、ＩＬ−１２、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１６、ＴＮＦα及びＭＩＦよりなる群から選ばれる、請求項１６に記載の組成物。The cytokine is IL-12, IL-1α, IL-1β, IL-15, IL-18, IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-4, IL-10, IL-6, IL-17, IL-16, The composition according to claim 16, which is selected from the group consisting of TNFα and MIF. 熱ショックタンパク質を更に含み、該熱ショックタンパク質は該マイクロ粒子と会合している、請求項１５に記載の組成物。 16. The composition of claim 15 , further comprising a heat shock protein, wherein the heat shock protein is associated with the microparticle. 該ポリ（ＩＣ）及び該抗原が、表面付着、カプセル化又は表面付着とカプセル化との組み合わせにより該マイクロ粒子と会合している、請求項１５に記載の組成物。 該Po Li (IC) and said antigen, surface adhesion, is associated with the microparticles by a combination of encapsulation or surface attachment and encapsulation composition of claim 15. 該免疫応答が自然免疫応答である、請求項１５に記載の組成物。 16. The composition of claim 15 , wherein the immune response is an innate immune response. 該免疫応答が適応的免疫応答である、請求項１５に記載の組成物。 16. The composition of claim 15 , wherein the immune response is an adaptive immune response.
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EP (1) EP1697511A4 (en)
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AU (1) AU2004314706A1 (en)
CA (1) CA2548992A1 (en)
WO (1) WO2005072088A2 (en)

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6875584B1 (en) * 1999-03-02 2005-04-05 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prophylactic and therapeutic immunization against protozoan infection and disease
AUPR011700A0 (en) * 2000-09-14 2000-10-05 Austin Research Institute, The Composition comprising immunogenic virus sized particles (VSP)
EP1749212A2 (en) * 2004-04-23 2007-02-07 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Diagnostic assay for trypanosoma cruzi infection
US8329411B2 (en) * 2004-04-23 2012-12-11 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Diagnostic assay for Trypanosoma cruzi infection
US7785806B2 (en) 2004-04-28 2010-08-31 Vaxdesign Corporation Method for determining the immunogenicity of an antigen
US8071373B2 (en) 2004-04-28 2011-12-06 Sanofi Pasteur Vaxdesign Corp. Co-culture lymphoid tissue equivalent (LTE) for an artificial immune system (AIS)
US8298824B2 (en) 2004-04-28 2012-10-30 Sanofi Pasteur Vaxdesign Corporation Methods of evaluating a test agent in a diseased cell model
US7771999B2 (en) 2004-04-28 2010-08-10 Vaxdesign Corp. Disease model incorporation into an artificial immune system (AIS)
US8030070B2 (en) 2004-04-28 2011-10-04 Sanofi Pasteur Vaxdesign Corp. Artificial lymphoid tissue equivalent
US7709256B2 (en) 2004-04-28 2010-05-04 Vaxdesign Corp. Disease model incorporation into an artificial immune system (AIS)
US7785883B2 (en) 2004-04-28 2010-08-31 Vax Design Corp. Automatable artificial immune system (AIS)
US7855074B2 (en) 2004-04-28 2010-12-21 Vaxdesign Corp. Artificial immune system: methods for making and use
US7780969B2 (en) * 2005-07-15 2010-08-24 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Trypanosoma cruzi proteome compositions and methods
JP2007099631A (en) * 2005-09-30 2007-04-19 Hosokawa Funtai Gijutsu Kenkyusho:Kk Method for producing anionic medicine-encapsulated nanoparticle and pharmaceutical formulation using the same
EP1954252B1 (en) * 2005-12-02 2016-02-03 GlaxoSmithKline Biologicals SA Nanoparticles for use in immunogenic compositions
ES2804472T3 (en) 2005-12-13 2021-02-08 Harvard College Structures for cell transplantation
EP1969366B1 (en) 2005-12-21 2015-10-21 Sanofi Pasteur VaxDesign Corporation In vitro germinal centers
EP1991204A2 (en) * 2006-02-24 2008-11-19 Novartis AG Microparticles containing biodegradable polymer and cationic polysaccharide for use in immunogenic compositions
US20100150960A1 (en) * 2006-09-22 2010-06-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Servi Compositions and methods for chitosan enhanced immune response
WO2008065752A1 (en) * 2006-11-30 2008-06-05 National University Corporation Hokkaido University Immunotherapeutic agent containing dirna as active ingredient
WO2008068762A2 (en) * 2006-12-07 2008-06-12 Noah Ben-Shalom Chitosan formulation for cholesterol reduction in humans
CN103120653B (en) 2007-04-04 2015-09-30 希格默伊德药业有限公司 A kind of combination of oral medication
EP2061587A1 (en) 2007-04-26 2009-05-27 Sigmoid Pharma Limited Manufacture of multiple minicapsules
WO2009002401A2 (en) 2007-06-21 2008-12-31 President And Fellows Of Harvard College Scaffolds for cell collection or elimination
US8647837B2 (en) 2007-07-16 2014-02-11 Sanofi Pasteur Vaxdesign Corp. Artificial tissue constructs comprising alveolar cells and methods for using the same
WO2009093250A2 (en) * 2008-01-25 2009-07-30 Gavish-Galilee Bio Applications Ltd Targeting of innate immune response to tumor site
US9370558B2 (en) 2008-02-13 2016-06-21 President And Fellows Of Harvard College Controlled delivery of TLR agonists in structural polymeric devices
EP2254602B1 (en) 2008-02-13 2018-11-21 President and Fellows of Harvard College Continuous cell programming devices
JP2011519828A (en) 2008-04-18 2011-07-14 バクシネート コーポレーション Flagellin deletion mutants and methods of use
WO2009146456A1 (en) 2008-05-30 2009-12-03 President And Fellows Of Harvard College Controlled release of growth factors and signaling molecules for promoting angiogenesis
US20100086613A1 (en) * 2008-10-03 2010-04-08 Chang-Jer Wu Chitosan vehicle and method for making same
CN102209530B (en) * 2008-10-10 2013-05-15 普罗贝尔特医药公司 Orally administrable immunostimulant product for aquaculture
IE20090793A1 (en) * 2008-10-13 2010-06-23 Sigmoid Pharma Ltd A delivery system
CA2737352C (en) 2008-10-16 2017-06-27 University Of Saskatchewan Combination adjuvant formulation
MX2011010050A (en) 2009-03-25 2011-12-14 Univ Texas Compositions for stimulation of mammalian innate immune resistance to pathogens.
US9297005B2 (en) 2009-04-13 2016-03-29 President And Fellows Of Harvard College Harnessing cell dynamics to engineer materials
ES2530049T3 (en) 2009-05-18 2015-02-26 Sigmoid Pharma Limited Composition comprising drops of oil
ES2368963B1 (en) * 2009-07-04 2012-10-10 Fundación Centro Nacional De Investigaciones Oncológicas Carlos Iii PROCEDURE FOR IDENTIFICATION OF THERAPEUTIC AGENTS AGAINST MELANOMA AND USE OF IDENTIFIED AGENT.
US8728456B2 (en) 2009-07-31 2014-05-20 President And Fellows Of Harvard College Programming of cells for tolerogenic therapies
US9878036B2 (en) 2009-08-12 2018-01-30 Sigmoid Pharma Limited Immunomodulatory compositions comprising a polymer matrix and an oil phase
ES2644286T3 (en) 2009-10-22 2017-11-28 Gilead Sciences, Inc. Purine or deazapurine derivatives useful for the treatment of (among others) viral infections
WO2011109834A2 (en) 2010-03-05 2011-09-09 President And Fellows Of Harvard College Enhancement of skeletal muscle stem cell engrafment by dual delivery of vegf and igf-1
WO2011163669A2 (en) 2010-06-25 2011-12-29 President And Fellows Of Harvard College Co-delivery of stimulatory and inhibitory factors to create temporally stable and spatially restricted zones
PL2594140T3 (en) 2010-07-16 2019-09-30 Universidad De Navarra Nanoparticles for encapsulation of compounds, the production and uses thereof
US11202759B2 (en) 2010-10-06 2021-12-21 President And Fellows Of Harvard College Injectable, pore-forming hydrogels for materials-based cell therapies
US9603894B2 (en) 2010-11-08 2017-03-28 President And Fellows Of Harvard College Materials presenting notch signaling molecules to control cell behavior
GB201020032D0 (en) 2010-11-25 2011-01-12 Sigmoid Pharma Ltd Composition
EP2701753B1 (en) 2011-04-27 2018-12-26 President and Fellows of Harvard College Cell-friendly inverse opal hydrogels for cell encapsulation, drug and protein delivery, and functional nanoparticle encapsulation
US9675561B2 (en) 2011-04-28 2017-06-13 President And Fellows Of Harvard College Injectable cryogel vaccine devices and methods of use thereof
EP2701745B1 (en) 2011-04-28 2018-07-11 President and Fellows of Harvard College Injectable preformed macroscopic 3-dimensional scaffolds for minimally invasive administration
JP6062426B2 (en) 2011-06-03 2017-01-18 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ In situ antigen-producing cancer vaccine
EP2734237A4 (en) * 2011-07-22 2015-03-25 Pawel Kalinski Tumor selective chemokine modulation
US10758487B2 (en) 2011-12-09 2020-09-01 The Johns Hopkins University Artificial antigen presenting cells having a defined and dynamic shape
CA2861107A1 (en) * 2012-01-13 2013-07-18 President And Fellows Of Harvard College Controlled delivery of tlr agonists in structural polymeric devices
ES2773895T3 (en) 2012-04-16 2020-07-15 Harvard College Mesoporous Silica Compositions to Modulate Immune Responses
NZ630040A (en) 2012-05-03 2016-10-28 Janssen Sciences Ireland Uc Polyinosinic-polycytidylic acid (poly (i:c)) formulations for the treatment of upper respiratory tract infections
GB201212010D0 (en) 2012-07-05 2012-08-22 Sigmoid Pharma Ltd Formulations
WO2014067976A1 (en) * 2012-10-30 2014-05-08 Nestec S.A. Compositions comprising microparticles and probiotics to deliver a synergistic immune effect
GB201319791D0 (en) 2013-11-08 2013-12-25 Sigmoid Pharma Ltd Formulations
CA2932878C (en) 2013-11-26 2020-11-03 Zoetis Services Llc Compositions for induction of immune response
JP7348708B2 (en) 2014-04-30 2023-09-21 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ Combination vaccine device and method for killing cancer cells
WO2016044839A2 (en) 2014-09-19 2016-03-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for treating viral infections through stimulated innate immunity in combination with antiviral compounds
JP6716582B2 (en) 2014-11-07 2020-07-01 サブリミティ・セラピューティクス・リミテッドＳｕｂｌｉｍｉｔｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ Composition containing cyclosporine
US11786457B2 (en) 2015-01-30 2023-10-17 President And Fellows Of Harvard College Peritumoral and intratumoral materials for cancer therapy
JP7094533B2 (en) 2015-04-10 2022-07-04 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ Immune cell capture device and its manufacture and use
CN115531609A (en) 2016-02-06 2022-12-30 哈佛学院校长同事会 Remodeling hematopoietic niches to reconstitute immunity
AU2017295704B2 (en) 2016-07-13 2023-07-13 President And Fellows Of Harvard College Antigen-presenting cell-mimetic scaffolds and methods for making and using the same
US11559578B2 (en) 2020-06-30 2023-01-24 International Business Machines Corporation Biodegradable cationic polycarbonates as adjuvants for vaccines

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002034287A2 (en) * 2000-10-27 2002-05-02 Pharmexa A/S Therapeutic vaccine formulations containing chitosan

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3280400D1 (en) * 1981-10-23 1992-06-04 Molecular Biosystems Inc OLIGONUCLEOTIDES MEDICINE AND THEIR PRODUCTION METHOD.
US20030077317A1 (en) * 1996-06-25 2003-04-24 Brown University Research Foundation Methods and compositions for enhancing the bioadhesive properties of polymers using organic excipients
ATE241965T1 (en) * 1999-01-13 2003-06-15 Univ Johns Hopkins Med GENETIC IMMUNIZATION WITH SIMULTANEOUS ADMINISTRATION OF NUCLEIC ACIDS AND CYTOKINES
US6015712A (en) * 1999-07-19 2000-01-18 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of FADD expression
AR045702A1 (en) * 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp COMPOSITIONS OF ASSISTANTS.
US20050191358A1 (en) * 2003-01-14 2005-09-01 Derek O' Hagan Microparticles with adsorbed polynucleotide-containing species
US7727969B2 (en) * 2003-06-06 2010-06-01 Massachusetts Institute Of Technology Controlled release nanoparticle having bound oligonucleotide for targeted delivery

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002034287A2 (en) * 2000-10-27 2002-05-02 Pharmexa A/S Therapeutic vaccine formulations containing chitosan

Also Published As

Publication number Publication date
US20050244505A1 (en) 2005-11-03
US20100285132A1 (en) 2010-11-11
JP2011173909A (en) 2011-09-08
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CA2548992A1 (en) 2005-08-11
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EP1697511A4 (en) 2007-11-21

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