JP4766297B2 - A vector comprising a non-virus-derived enhancer, cPPT, and CTS - Google Patents

A vector comprising a non-virus-derived enhancer, cPPT, and CTS Download PDF

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Description

本発明はエンハンサーに関し、詳しくはエンハンサーをベクターDNAに組み込み、ベクター中の遺伝子発現レベル、細胞への遺伝子導入効率を高めることを可能とするエンハンサーである。   The present invention relates to an enhancer. Specifically, the enhancer is incorporated into a vector DNA to enhance the gene expression level in the vector and the efficiency of gene transfer into cells.

遺伝子導入法には人体に直接遺伝子を導入する方法（in vivo法）と、一度体外に取り出した細胞に遺伝子を導入して、人体に戻す方法（ex vivo法）がある。   There are two methods of gene introduction: a method of introducing a gene directly into the human body (in vivo method) and a method of introducing a gene into a cell once taken out of the body and returning it to the human body (ex vivo method).

遺伝子導入法はいままで、物理的方法である微小注入法、電気穿孔法、遺伝子銃法、化学的方法であるリポソーム法、膜融合蛋白質―リポソーム法、リポフェクション法、カチオン性ペプチド法、リン酸カルシウム共沈法、DEAEデキストラン法、その他、エンドサイトーシス法、ウイルスを使う方法など数多く開発され、応用されている。   Until now, gene transfer methods have been physical injection methods such as microinjection, electroporation, gene gun, chemical methods such as liposome, membrane fusion protein-liposome, lipofection, cationic peptide, calcium phosphate coprecipitation Numerous methods, such as the DEAE dextran method, endocytosis method, and virus-based methods have been developed and applied.

これらの方法はそれぞれ長所と短所があり、目的により方法を選択する必要がある。物理的方法は、安全性が高く、プラスミドDNAのサイズの制限がない。また、in vivoの場合には、血液中の酵素の分解作用、および尿からの***により、Naked核酸が生体内に残る時間は短いため、Naked核酸を細胞に導入する効率が非常に低い。   Each of these methods has advantages and disadvantages, and it is necessary to select a method according to the purpose. The physical method is safe and has no restriction on the size of the plasmid DNA. In vivo, the efficiency of introducing a naked nucleic acid into a cell is very low because the time that the naked nucleic acid remains in the living body is short due to the degradation action of enzymes in blood and excretion from urine.

化学的方法ではウイルスを使う方法より安全性が高く、プラスミドDNAのサイズに制限がなく、物理的方法より導入遺伝子の発現効率が高いが、導入できる細胞は***細胞に限られ、また、遺伝子発現は一過性である。   The chemical method is safer than the virus method, the size of the plasmid DNA is not limited, and the transgene expression efficiency is higher than the physical method, but the cells that can be introduced are limited to dividing cells, and the gene expression Is transient.

ウイルスを使う方法は上記の方法に比べ安全性が劣るが、導入遺伝子の発現効率が最も高く非常に有用である。特に、レトロウイルス科のレンチウイルスベクターは***細胞にも非***細胞にも導入ができ、遺伝子発現の持続性を持っているため、最も遺伝子治療に応用されている。   Although the method using a virus is inferior to the above method in safety, it has the highest transgene expression efficiency and is very useful. In particular, lentiviral vectors of the retroviridae family can be introduced into dividing cells and non-dividing cells, and have the sustained gene expression, so that they are most applied to gene therapy.

遺伝子を細胞内に導入し、効率よく発現させるためには細胞質内への導入、核内移行、核内での遺伝子の維持および高効率の発現、こちら４つの段階を乗り越えなければならないため、遺伝子の核内運送システムの開発はますます重要になってくる。   In order to introduce a gene into a cell and to express it efficiently, introduction into the cytoplasm, translocation into the nucleus, maintenance of the gene in the nucleus and efficient expression must be overcome. The development of nuclear transport systems will become increasingly important.

例えば、核移行シグナル（nuclear localization signals）による核蛋白質の核内運送システムを利用した人工ウイルスベクターが開発された。DzauおよびカネダらはHVJ(hemagglutinating virus of Japan,Sendai virus)リポソームベクターを開発した。共導入する核蛋白質HMG-1 (high mobility group 1 protein)を用いている（特許文献１参照）。HMG-1は核内限定シグナルを持っておらず、DNAと結合し凝縮させ核移行を補助していると考えられる。しかし、HMG-1の精製はコストが高く、労力が必要となる。   For example, an artificial viral vector has been developed that utilizes a nuclear protein transport system based on nuclear localization signals. Dzau and Kaneda et al. Have developed HVJ (Sendai virus) liposome vectors. The co-introduced nuclear protein HMG-1 (high mobility group 1 protein) is used (see Patent Document 1). HMG-1 does not have an intranuclear signal, but is believed to bind and condense with DNA to assist nuclear translocation. However, purification of HMG-1 is costly and labor intensive.

MistryらはHMG-1の正電荷によって、DNAと結合する核内運送システムを開発したが、その導入効率は低い。核蛋白質HMG-1および-2はリポフェクション試薬に添加され、（株）ワコーバイオプロダクツ（Wako BioProducts）より市販されている。   Mistry et al. Developed a nuclear transport system that binds to DNA by the positive charge of HMG-1, but its introduction efficiency is low. Nucleoproteins HMG-1 and -2 are added to the lipofection reagent and are commercially available from Wako BioProducts.

Fritzらはcalf thymus histonesまたはSV40 NLSを含む組変え蛋白質、ヒトのヒストンＨ１（human histone H1）を利用し、DNAと結合するシステムを開発した。ただし、DNA―蛋白質の複合体が大きいため、核内への運送できず、細胞質内へしか運送することができない。   Fritz et al. Developed a system that binds DNA using a recombinant protein containing calf thymus histones or SV40 NLS, human histone H1. However, since the DNA-protein complex is large, it cannot be transported into the nucleus and can only be transported into the cytoplasm.

また、コストが低いという理由で核内限定シグナルを含む合成ペプチドも使われている。Hawley-Nelsonらは、SV40の核移行シグナル（NLS）を含む合成ペプチドをベクターDNAと混合させ、形成した複合体をリポフェクションに用いた（特許文献２）。しかし、NLSの認識配列がマスクされ、NLSによる導入効率の増加は認められなかった。   In addition, synthetic peptides containing nuclear restricted signals are also used because of their low cost. Hawley-Nelson et al. Mixed a synthetic peptide containing SV40 nuclear translocation signal (NLS) with vector DNA, and used the formed complex for lipofection (Patent Document 2). However, the recognition sequence of NLS was masked, and no increase in introduction efficiency due to NLS was observed.

HIVおよび他のレンチウイルスをウイルス蛋白質により非***細胞に感染させ、核内運送システムによって、DNAを核内に運送することができる。HIV pre-integration complexに存在するVprおよびmatrix proteinにはNLSが含まれており、非***細胞に感染させるために必要であるアデノウイルスDNAがmajor capsid protein、hexonにより核内運送されている。HSV(Herpes simplex virus)のcapsid proteinに特異的に変異(mutation)させると、ウイルスDNAの核内運送が阻害される(Batterson et al., 1983)。SV40(Simian virus 40)DNAがVp3(viral protein)により核内運送される。   HIV and other lentiviruses can infect non-dividing cells with viral proteins and the nuclear transport system can transport DNA into the nucleus. Vpr and matrix proteins present in the HIV pre-integration complex contain NLS, and adenoviral DNA necessary for infecting non-dividing cells is transported into the nucleus by major capsid protein, hexan. Mutation of HSV (Herpes simplex virus) capsid protein specifically inhibits viral DNA nuclear transport (Batterson et al., 1983). SV40 (Simian virus 40) DNA is transported into the nucleus by Vp3 (viral protein).

ウイルスベクターによる遺伝子治療は１９９０年に始められて以来、現在では世界で３０００名を超える患者に施行されている。ウイルスベクターによる遺伝子導入技術の有力な手段として、セントラルポリプリントラクト（ｃPPT）・CTS、ウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節因子（WPRE：woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)配列が広く応用されている。   Since the beginning of gene therapy with viral vectors in 1990, it is currently practiced in over 3000 patients worldwide. As an effective means for gene transfer technology using viral vectors, central polyprint lacto (cPPT) / CTS, woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE) sequences derived from woodchuck hepatitis virus have been widely applied.

WPREはウッドチャック肝炎ウイルスゲノムに含まれる転写後調制因子で、RNAを安定にし、発現を高める作用があり、レトロウイルスベクターでは２９３Ｔ細胞での遺伝子発現効率がコントロールと比較し５〜８倍となった（特許文献３参照）。WPREはレトロウイルスベクターだけではなく、AAV(adeno-associated virus) ベクター（非特許文献１参照）、アデノウイルスベクター（非特許文献２参照）にも高い遺伝子発現効率が確認された。   WPRE is a post-transcriptional regulator contained in the woodchuck hepatitis virus genome, which stabilizes RNA and enhances expression. With retroviral vectors, gene expression efficiency in 293T cells is 5 to 8 times that of controls. (See Patent Document 3). High gene expression efficiency was confirmed not only for retroviral vectors but also for AAV (adeno-associated virus) vectors (see Non-Patent Document 1) and adenoviral vectors (see Non-Patent Document 2).

ｃPPT・CTS、WPRE両者を搭載したレンチウイルスベクターはヒト幹細胞（非特許文献３参照）、ヒト造血幹細胞（非特許文献４参照）にも高い遺伝子導入、発現効率が報告された。逆に、Philippe-Emmanuel Mangeotが指摘したように、WPREがヒト神経樹状細胞（Dendritic Cell）に対し、不利な作用を及ぼした（非特許文献５参照）。Priscilla Y. Yamも指摘したように、WPREはヒトリンパ球T細胞に対し、導入効率を少し高め、GFPの発現効率を２〜３倍上昇させた（非特許文献６参照）。ｃPPT・CTS、WPRE両者を搭載した場合はWPRE単独より遺伝子導入発現効率を4〜１０倍上がる。ヒトリンパ球T細胞に対し、ｃPPT・CTSはWPREより高い遺伝子導入発現効率を持つことが証明された。
米国特許第５６３１２３７号明細書 米国特許第５７３６３９２号明細書 米国特許第６０１３５１６号明細書 HUMAN GENETHERAPY 1999,10:2295-2305 MOLECULARTHERAPY 2002,5,(5):509-516 MOLECULARTHERAPY 2003,7,(2):281-287 MOLECULARTHERAPY 2002,5,(4):479-484 MOLECULARTHERAPY 2002,5,(3):283-290 MOLECULARTHERAPY 2002,5,(4):479-484 Lentiviral vectors carrying both cPPT / CTS and WPRE have been reported to have high gene transfer and expression efficiency in human stem cells (see Non-Patent Document 3) and human hematopoietic stem cells (see Non-Patent Document 4). On the contrary, as Philippe-Emmanuel Mangeot pointed out, WPRE exerted an adverse effect on human neural dendritic cells (Dendritic Cell) (see Non-Patent Document 5). As Priscilla Y. Yam pointed out, WPRE slightly increased the introduction efficiency and increased the expression efficiency of GFP by 2-3 times compared to human lymphocyte T cells (see Non-Patent Document 6). When both cPPT / CTS and WPRE are installed, the gene transfer efficiency is 4 to 10 times higher than that of WPRE alone. For human lymphocyte T cells, cPPT / CTS was proved to have higher gene transfer expression efficiency than WPRE.
US Pat. No. 5,631,237 US Pat. No. 5,736,392 US Pat. No. 6,013,516 HUMAN GENETHERAPY 1999,10: 2295-2305 MOLECULARTHERAPY 2002,5, (5): 509-516 MOLECULARTHERAPY 2003,7, (2): 281-287 MOLECULARTHERAPY 2002,5, (4): 479-484 MOLECULARTHERAPY 2002,5, (3): 283-290 MOLECULARTHERAPY 2002,5, (4): 479-484

上記技術によりベクターにおける遺伝子導入効率および遺伝子発現レベルは向上したが、遺伝子治療等を行う上で、まだ十分なものではなく更なる向上が望まれる。そこで本発明の目的は、ベクター中の遺伝子発現レベルを高め、さらに、細胞への遺伝子導入効率を高めるエンハンサーを提供することにある。   Although the gene transfer efficiency and gene expression level in the vector have been improved by the above technique, it is not yet sufficient for gene therapy and the like, and further improvement is desired. Accordingly, an object of the present invention is to provide an enhancer that increases the gene expression level in a vector and further increases the efficiency of gene transfer into cells.

本発明者は上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、特定の配列をエンハンサーとして挿入することにより、上記課題を達成し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。   As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventors have found that the above problems can be achieved by inserting a specific sequence as an enhancer, and have completed the present invention.

即ち、本発明のエンハンサーは、ベクターに挿入されたエンハンサーであって、動物ゲノムに存在するcis-acting elementのうち少なくとも一部を有することを特徴とするものである。動物ゲノムとしては、マウス、ヒトまたはラット等のゲノムを挙げることができる。例えば、cis-acting elementとして、マウスのゲノムのGenBank no:AE008683の214722bp〜216731bp、GenBank no:AF259074の50041bp〜2050bpである配列番号１、ヒトのゲノムのGenBank no:HUAE000658の209041bp〜211150bp、GenBank no:NG001332.1の209041bp〜211150bpである配列番号２またはラットのゲノムのGenBank no:NW_042967の2162172bp〜2164672bpである配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。   That is, the enhancer of the present invention is an enhancer inserted into a vector and has at least a part of cis-acting elements present in the animal genome. Examples of animal genomes include mouse, human or rat genomes. For example, as a cis-acting element, mouse genome GenBank no: AE008683 214722bp-216731bp, GenBank no: AF259074 50041bp-2050bp SEQ ID NO: 1, human genome GenBank no: HUAE000658 209041bp-211150bp, GenBank no DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 of 209041 bp to 211150 bp of NG001332.1, or SEQ ID NO: 3 of 2216272 bp to 2167472 bp of GenBank no: NW — 042967 of the rat genome.

また、本発明のエンハンサーは、遺伝子の転写を開始するプロモーターの前、または遺伝子の３’側に好適に挿入できる。また、ベクターとしては組換えウイルスベクターを好適に用いることができ、組換えウイルスベクターとしては、オンコウイルス由来のベクター（Oncovirus Vector）もしくはレンチウイルスベクター（Lentiviral Vector）等のレトロウイルスベクター（Retroviral Vector）、アデノウイルスベクター（Adenoviral Vector）、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV Vector：adeno-associated virus vector）またはバキュロウイルスベクター（Baculovirus Vector）等を用いることが可能である。なお、レンチウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベクターまたはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ベクターが好ましい。   In addition, the enhancer of the present invention can be suitably inserted in front of a promoter that initiates transcription of a gene or on the 3 'side of the gene. In addition, a recombinant virus vector can be preferably used as the vector. As the recombinant virus vector, a retroviral vector such as an oncovirus-derived vector (Oncovirus Vector) or a lentiviral vector (Lentiviral Vector). Adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors (AAV vectors), baculovirus vectors, and the like can be used. The lentiviral vector is preferably a human immunodeficiency virus (HIV) vector or a simian immunodeficiency virus (SIV) vector.

本発明のエンハンサーにより、遺伝子発現レベルを高まり、さらに、細胞への遺伝子導入効率を高めることが可能となった。これにより、新規の遺伝子治療用ベクターの開発および有用な遺伝子の発現、蛋白質の大量生産が可能となる。   With the enhancer of the present invention, it is possible to increase the gene expression level and further increase the efficiency of gene transfer into cells. This makes it possible to develop new gene therapy vectors, to express useful genes, and to mass produce proteins.

本発明の好適な実施形態について、詳細に説明する。本発明者は動物のゲノムに存在するcis-acting elementをエンハンサーとして選択した。エンハンサーというのは遺伝子の転写開始を促進し、転写開始点からかなり離れた上流または下流に位置して、逆向きでも働く塩基配列と定義される。本発明のエンハンサーはベクター中の遺伝子発現レベルを高めるための動物のゲノムに存在するcis-acting elementである。このエンハンサーは、例えば、マウスの嗅覚受容体遺伝子MOR28(mouse olfactory receptor 28)の上流領域７５kb、ヒトの嗅覚受容体遺伝子HOR28の上流領域３２kbに存在している。マウスの嗅覚受容体（OR）遺伝子は約１０００種類存在することが知られており、嗅神経細胞はこのうち１種類のみを発現する。YAC(yeast artificial chromosomes)にMOR28を含む数１００kb DNAを組み込み、マウスの受精卵前核へ微注射し、MOR28遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作成し、このトランスジェニックマウスを解析した結果、このエンハンサーはMOR28遺伝子の発現を活性化することが明らかになっている（Shou Serizawa et al. 2003 Science 2088-2094）。しかし、このエンハンサーをGFP遺伝子の転写を促進するCMVプロモーターの前に組み込んだプラスミドDNAをリポフェクション法により培養細胞HEK２９３に導入した場合、コトロールと比較しGFP遺伝子発現の増加は見られなかった。このエンハンサーの遺伝子発現を高めるメカニズムを解明するために、本発明者はHIV-1由来のレンチウイルスベクターシステムを用いて研究を行った。   A preferred embodiment of the present invention will be described in detail. The present inventor selected a cis-acting element present in the genome of the animal as an enhancer. An enhancer is defined as a base sequence that promotes the initiation of transcription of a gene and is located upstream or downstream from the transcription start point and works in the reverse direction. The enhancer of the present invention is a cis-acting element present in the genome of an animal for increasing the level of gene expression in the vector. This enhancer is present, for example, in the upstream region 75 kb of the mouse olfactory receptor gene MOR28 (mouse olfactory receptor 28) and in the upstream region 32 kb of the human olfactory receptor gene HOR28. About 1000 types of mouse olfactory receptor (OR) genes are known to exist, and olfactory neurons express only one of them. YAC (yeast artificial chromosomes) contains several hundred kb of DNA containing MOR28, microinjected into the pronucleus of the fertilized egg of a mouse, a transgenic mouse expressing the MOR28 gene was created, and the transgenic mouse was analyzed. Has been shown to activate the expression of the MOR28 gene (Shou Serizawa et al. 2003 Science 2088-2094). However, when the plasmid DNA in which this enhancer was incorporated before the CMV promoter that promotes transcription of the GFP gene was introduced into the cultured cell HEK293 by the lipofection method, no increase in GFP gene expression was observed compared to Kotrol. In order to elucidate the mechanism of enhancing the gene expression of this enhancer, the present inventor conducted research using a lentiviral vector system derived from HIV-1.

レンチウイルスベクターシステムの基本構造として、４つの独立した発現プラスミドを使用した。ベクター粒子形成に必須な蛋白質を供給するパッケージングベクター、ベクターにパッケージングされるmRNAを供給し、標的細胞に対して目的の遺伝子を運搬、導入するジーントランスファーベクター、シュードタイプベクター粒子を形成するための外殻蛋白質供給ベクターのVSV-G供給ベクターである。パッケージングベクターはgag, polを含むプラスミド、revを発現するプラスミド、この２つの発現プラスミドからなる。   Four independent expression plasmids were used as the basic structure of the lentiviral vector system. A packaging vector that supplies proteins essential for vector particle formation, an mRNA that is packaged in the vector, a gene transfer vector that transports and introduces the gene of interest to the target cell, and a pseudo-type vector particle This is a VSV-G supply vector of the outer shell protein supply vector. The packaging vector consists of a plasmid containing gag and pol, a plasmid expressing rev, and these two expression plasmids.

ジーントランスファーベクターは３’LTRの配列を部分的に削除している。これはSelf Inactivating Vector(SIN vector)と呼ばれ、標的細胞の染色体に侵入したレンチウイルスのプロウイルスは３’LTRの僅かに残っているU3部分を5’端に結合した形となる。それにより、標的細胞内では5’LTRのプロモーター活性が無くなるため、全長のRNAや宿主遺伝子の転写が起こらない。そして、内部プロモーターからの目的遺伝子の転写のみが行われることになり、安全性が向上する。   The gene transfer vector partially deletes the 3 'LTR sequence. This is called a Self Inactivating Vector (SIN vector). A lentiviral provirus that has entered the chromosome of the target cell has a form in which the slightly remaining U3 portion of the 3 'LTR is bound to the 5' end. As a result, the 5 'LTR promoter activity is lost in the target cell, so that transcription of full-length RNA and host genes does not occur. And only the transcription of the target gene from an internal promoter will be performed, and safety | security improves.

VSV-G供給ベクターは水庖性口内炎ウイルス (VSV：Vesicular stomatitis virus)の表面糖蛋白質であるVSV-Gを発現する。VSV-Gのレセプターであるりん脂質、ホスファチジルセリンがほとんどの動物細胞に存在するため、VSV-Gによって、作られたレンチウイルスベクターは感染指向性が広くなり、ほとんどの動物細胞に感染できる。   The VSV-G supply vector expresses VSV-G, a surface glycoprotein of varicella stomatitis virus (VSV). Since the phospholipid, phosphatidylserine, which is a receptor for VSV-G, is present in most animal cells, the lentiviral vector produced by VSV-G has a broader infection-directivity and can infect most animal cells.

パッケージングベクター、ジーントランスファーベクター、VSV-G供給ベクターを細胞にコトランスフェクションすると、ジーントランスファーベクターの5’LTRのプロモーター活性によりmRNAが転写、パッケージングベクターより供給されるウイルス蛋白によりパッケージングシグナル（Packaging Signal）配列が認識され、ベクター粒子内にRNAがパッケージングされる。次に、VSV-Gによって、シュードタイプ化され、ベクター粒子が完成する。ベクターが標的細胞に感染すると、パッケージングされていたRNAは逆転写酵素によりDNAとなり、両端のLTRとインテグラーゼの働きで宿主のゲノムにインテグレーションされる。そして、内部プロモーターの活性により目的遺伝子が発現する。   When a packaging vector, gene transfer vector, or VSV-G supply vector is co-transfected into a cell, mRNA is transcribed by the 5'LTR promoter activity of the gene transfer vector, and a packaging signal (by a viral protein supplied from the packaging vector ( Packaging Signal) sequences are recognized and RNA is packaged in vector particles. Next, it is pseudotyped by VSV-G to complete the vector particle. When the vector infects the target cell, the packaged RNA is converted to DNA by reverse transcriptase and integrated into the host genome by the action of LTR and integrase at both ends. The target gene is expressed by the activity of the internal promoter.

ジーントランスファーベクターは両端のLTRの間に、内在性プロモーターCMVと、それに次ぐGFP遺伝子を含み、それをコトロールとする。cPPT（cis-acting central polypurine tract）およびCTS（cis-acting termination region）により、HIVの逆転写過程でトリプレックスDNA構造を形成し、DNAの核内運送に関与している（米国特許第６６８２９０７号明細書)。本発明者はコトロールベクターのCMVプロモーター前にcPPTおよび CTS配列を組み込んだジーントランスファーベクターを構築した。さらに、そのcPPT及びCTS配列の前にマウス由来の２kbエンハンサーを組み込んだジーントランスファーベクター（以下、「エンハンサージーントランスファーベクター」ともいう）を構築した。   The gene transfer vector contains the endogenous promoter CMV and the GFP gene next to it between the LTRs at both ends, and uses it as a control. CPPT (cis-acting central polypurine tract) and CTS (cis-acting termination region) form a triplex DNA structure in the reverse transcription process of HIV and participate in nuclear transport of DNA (US Pat. No. 6,682,907) Specification). The present inventor constructed a gene transfer vector in which cPPT and CTS sequences were incorporated before the CMV promoter of the control vector. Furthermore, a gene transfer vector (hereinafter also referred to as “enhancement transfer vector”) in which a mouse-derived 2 kb enhancer was incorporated in front of the cPPT and CTS sequences was constructed.

本発明者はこの３つのジーントランスファーベクターを、それぞれレンチウイルスベクターシステムを利用し、リポフェクション法により培養細胞HEK２９３に導入し、シュードタイプ化されたレンチウイルスを作製し、HIV-1p24 Antigen ELISA kit (ZepoMetrix
Corporation製)により、それぞれのウイルスのgag 蛋白質の量を測った。その結果、２kbエンハンサー、cPPTおよびCTSを含むウイルスは、コトロールウイルスより６倍以上、cPPTおよびCTSを含むウイルスよりも３倍以上高い。おそらく、この２kbエンハンサーは単独では、cPPTおよびCTSを含むウイルスより遺伝子を細胞内に２倍以上、コトロールより３倍以上導入し発現させると考えられる。 The present inventor introduced these three gene transfer vectors into cultured cells HEK293 by a lipofection method using a lentiviral vector system, respectively, to produce a pseudotyped lentivirus, and HIV-1p24 Antigen ELISA kit (ZepoMetrix
The amount of gag protein of each virus was measured. As a result, the virus containing the 2 kb enhancer, cPPT and CTS is more than 6 times higher than the Cotrol virus and more than 3 times higher than the virus containing cPPT and CTS. Probably, this 2 kb enhancer alone is considered to introduce and express a gene twice or more times in a cell and three times or more than kotorol than a virus containing cPPT and CTS.

前述したように、遺伝子を細胞内に導入し効率よく発現させるためには細胞質内への導入、核内移行、核内での遺伝子の維持及び高効率の発現、こちら４つの段階を乗り越えなければならない。この２kbエンハンサーの高導入効率、高効率の発現を説明するために、細胞核、核膜孔構造及びレンチウイルスDNA複合体の核内移行の複雑なメカニズムを分析する必要がある。   As mentioned above, in order to introduce a gene into a cell and to express it efficiently, introduction into the cytoplasm, translocation into the nucleus, maintenance of the gene in the nucleus and high-efficiency expression must be overcome. Don't be. In order to explain the high introduction efficiency and high-efficiency expression of this 2 kb enhancer, it is necessary to analyze the complex mechanism of nuclear translocation of the cell nucleus, nuclear pore structure and lentiviral DNA complex.

細胞核は最も大きい細胞小器官であり、細胞内の多くの情報が蛋白質や受容体結合ホルモンとして核に入り、遺伝子の発現を制御している。核に必要なリボソーム蛋白質、ヒストン、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼなども核膜孔から入る。一方、リボソーム前駆体、mRNA、tRNAをはじめとしてその遺伝情報と翻訳の要素が細胞質内に送り出される。そのために核には巨大分子を選択的に通す核膜孔がある。核膜孔は内径が８０nm、外径が１２０nmのリングとそれに８個のスポークがつき、中央に中心顆粒があるのでこの全体を指して、核膜孔複合体という。核膜の裏にはラミナという構造物が付着しており、ラミンA、B、Cという中間径フィラメントと相同性のある蛋白質を成分としている。１個の核当たり約３０００個の核膜孔がある。分子量６０kDaまでの分子は拡散によって核膜孔を非選択的に通過する。しかし、これよりも大きい分子は特定のシグナル配列を持ったものだけが通過することができる。   The cell nucleus is the largest organelle, and much information inside the cell enters the nucleus as proteins and receptor-binding hormones, and regulates gene expression. Ribosomal proteins, histones, DNA polymerase, RNA polymerase, etc. necessary for the nucleus also enter from the nuclear membrane pore. On the other hand, ribosome precursors, mRNA, tRNA and other genetic information and translation elements are sent into the cytoplasm. For this purpose, the nucleus has a nuclear pore that selectively allows macromolecules to pass through. The nuclear pore has an inner diameter of 80 nm, an outer diameter of 120 nm, and eight spokes, and a central granule in the center. The whole is referred to as a nuclear pore complex. A structure called lamina is attached to the back of the nuclear membrane, and lamin A, B, and C are proteins that are homologous to the intermediate filament. There are approximately 3000 nuclear pores per nucleus. Molecules up to a molecular weight of 60 kDa pass non-selectively through the nuclear pore by diffusion. However, larger molecules can only pass through with a specific signal sequence.

レンチウイルスDNA複合体の非***細胞核内移行システムの定説は以下のようになっている。逆転写された二本鎖DNAは非***細胞質内に、gag蛋白質に含まれるリン酸化されたp17(MA) 蛋白、Vpr蛋白及びインテグレース蛋白、逆転写酵素などとともにプレインテグレーション複合体（preintegration complex, PIC）を形成し核内に運ばれる。その中に、リン酸化されたp17(MA) 蛋白が強い核移行シグナルを持つことによって、核輸送蛋白Importinと結合し、PIC複合体が核膜孔を通ることを促進する。Vpr蛋白及びインテグレース蛋白も似たような作用を果たしている。   The established theory of the lentiviral DNA complex non-dividing cell nuclear translocation system is as follows. The reverse-transcribed double-stranded DNA is pre-integrated in the non-dividing cytoplasm along with the phosphorylated p17 (MA) protein, Vpr protein and integrase protein, reverse transcriptase, etc. contained in the gag protein. PIC) is formed and carried into the nucleus. Among them, the phosphorylated p17 (MA) protein has a strong nuclear translocation signal, thereby binding to the nuclear transport protein Importin and promoting the passage of the PIC complex through the nuclear membrane pore. Vpr protein and integrase protein perform similar actions.

前述したようにcPPT（cis-acting central polypurine tract）およびCTS （cis-acting termination region ）はトリプレックスDNA構造を形成し、レンチウイルスDNA複合体の細胞核内移行に機能している。一方、レンチウイルのRev蛋白はそのN端側に核移行シグナルを有し、核内に移行し、ウイルスRNA に存在する−RRE領域に結合し、ウイルスRNAのスプライシングを抑制する。そのRev蛋白C端側にNES(nuclear export signal)と呼ばれる核外輸送シグナルを持ち、輸出蛋白(exportin-1)、Ran-GTPと結合し、ウイルスRNAを核内から細胞質内へ運ばれる。細胞質内にRan-GTPase-activating protein(GAP)はRan-GTPを分解することによって、Rev蛋白はRev-RRE複合体から離れて、また繰り返し、核内に移行し、ウイルスRNAを核内から細胞質内へ運ぶ。   As described above, cPPT (cis-acting central polypurine tract) and CTS (cis-acting termination region) form a triplex DNA structure and function in the nuclear translocation of lentiviral DNA complexes. On the other hand, the Rev protein of lentivirus has a nuclear translocation signal on the N-terminal side, translocates into the nucleus, binds to the -RRE region present in the viral RNA, and suppresses splicing of the viral RNA. The Rev protein has a nuclear export signal called NES (nuclear export signal) on the C-terminal side, binds to export protein (exportin-1) and Ran-GTP, and carries viral RNA from the nucleus into the cytoplasm. Ran-GTPase-activating protein (GAP) decomposes Ran-GTP in the cytoplasm, and the Rev protein moves away from the Rev-RRE complex and repeatedly moves into the nucleus, and viral RNA is transferred from the nucleus to the cytoplasm. Carry in.

コトロールジーントランスファーベクターを、レンチウイルスベクターシステムを利用し、リポフェクション法により培養細胞HEK２９３に導入し、ジーントランスファーベクターの5’LTRのプロモーター活性によりGFPのmRNAが転写される。パッケージングベクターはgag, polを含むプラスミド、revを発現するプラスミド、VSV-G供給ベクターもそれぞれのプロモーター活性によりmRNAが転写される。***細胞HEK２９３の細胞質内に導入し２日目に、それらの蛋白質が合成される。合成されたRev蛋白が核内に移行し、ある程度の量になると、パッケージングベクターのRRE領域に結合し、スプライシングを抑制され、gag, polのmRNAが転写される。Rev蛋白がジーントランスファーベクターのRRE領域に結合すると、スプライシングが抑制され、RRE領域下流のGFP遺伝子の転写を阻害する。同時に、Rev蛋白それぞれgag, polのmRNA後のRRE領域に、すでにできたGFPmRNA前のRRE領域に結合し、核外輸送シグナルと輸出蛋白の結合により、RNAが核内から細胞質内へ運ばれる。細胞質内に、パッケージングベクターより供給されるウイルス蛋白によりPackaging Signal配列が認識され、ベクター粒子内にRNAがパッケージングされる。次に、VSV-Gによって、シュードタイプ化され、ベクター粒子が完成する。   The Cotrol gene transfer vector is introduced into cultured cells HEK293 by a lipofection method using a lentiviral vector system, and the GFP mRNA is transcribed by the promoter activity of the 5 'LTR of the gene transfer vector. The packaging vectors include gag and pol-containing plasmids, rev-expressing plasmids, and VSV-G supply vectors. The proteins are synthesized on the second day after introduction into the cytoplasm of the dividing cell HEK293. When the synthesized Rev protein moves into the nucleus and reaches a certain amount, it binds to the RRE region of the packaging vector, suppresses splicing, and transcribes gag and pol mRNAs. When the Rev protein binds to the RRE region of the gene transfer vector, splicing is suppressed and transcription of the GFP gene downstream of the RRE region is inhibited. At the same time, the Rev protein binds to the RRE region after the mRNAs of gag and pol, respectively, to the RRE region before the GFP mRNA, and the RNA is transported from the nucleus into the cytoplasm by the binding of the nuclear export signal and the export protein. In the cytoplasm, the packaging signal sequence is recognized by the viral protein supplied from the packaging vector, and RNA is packaged in the vector particle. Next, it is pseudotyped by VSV-G to complete the vector particle.

２kbエンハンサー、cPPTおよびCTSを含むベクター粒子はコトロールベクター粒子より、gag 蛋白質の量が６倍以上高いことの可能性としてはこのエンハンサーはRev蛋白のRNA核外輸送を促進が挙げられる。cPPTおよびCTSを含むベクター粒子はgag 蛋白質量がコントロールと比較して２倍となった。この結果は米国特許第６６８２９０７号明細書の主張と一致している。つまり、cPPT・CTSはトリプレックスDNA構造を形成し、レンチウイルスDNA複合体の細胞核内移行に機能している。また、もう一つの可能性として、このエンハンサーはcPPT・CTSが機能しているレンチウイルスDNA複合体（preintegration complex, PIC）の細胞核内移行に何らかの役割を果たしていることが考えられる。遺伝子を細胞内に導入し、効率よく発現させるためには***細胞HEK293に細胞周期の静止期でも、DNA複合体（PIC）の細胞核内移行システムが働いていると考えられる。   A vector particle containing a 2 kb enhancer, cPPT and CTS may have a 6-fold higher amount of gag protein than cotrol vector particles. This enhancer may promote RNA export of Rev protein. The vector particles containing cPPT and CTS doubled the amount of gag protein compared to the control. This result is consistent with the assertion of US Pat. No. 6,682,907. In other words, cPPT / CTS forms a triplex DNA structure and functions to move the lentiviral DNA complex into the cell nucleus. Another possibility is that this enhancer plays some role in the nuclear translocation of the lentiviral DNA complex (preintegration complex, PIC) in which cPPT / CTS functions. In order to introduce a gene into a cell and to express it efficiently, it is considered that the DNA complex (PIC) translocation system is working in the dividing cell HEK293 even in the stationary phase of the cell cycle.

２kbエンハンサー、cPPTおよびCTSを含まれているベクター粒子はコトロールベクター粒子より、機能力価で約９倍になった。単位ベクターあたりの遺伝子発現能を高めたベクターは有効性の上昇だけでなく、投与量の減少による副作用の軽減も期待できることから、今後の応用が期待される。血液のリンパ球細胞に関わる遺伝子病はADA欠損症、白血病、悪性リンパ腫、HIV感染症などが知られている。リンパ球細胞への治療用遺伝子の導入は現実的になっている。   Vector particles containing the 2 kb enhancer, cPPT and CTS were about 9 times functional titer than the Cotrol vector particles. Vectors with enhanced gene expression ability per unit vector can be expected not only to increase the efficacy, but also to reduce side effects due to a decrease in dosage, and thus are expected to be applied in the future. Known genetic diseases related to blood lymphocytes include ADA deficiency, leukemia, malignant lymphoma, and HIV infection. Introduction of therapeutic genes into lymphocyte cells has become realistic.

cPPT・CTS／ジーントランスファーベクター、エンハンサージーントランスファーベクター由来の濃縮されたウイルスのリンパ球細胞への遺伝子導入効率を持つことを調べるために、ディプリーション（Depletion）法によるマウスSpleen mature B 、T細胞を調製した。cPPT・CTS／ジーントランスファーベクター、エンハンサージーントランスファーベクター由来の濃縮されたウイルスを用いて、調製したマウスSpleen mature B 細胞を感染させ、フローサイトメーターによる解析を行った結果、エンハンサージーントランスファーベクター由来の濃縮されたウイルスはcPPT・CTS/ジーントランスファーベクターウイルスより、マウスSpleen mature B 細胞への遺伝子導入効率を２倍増加した。   In order to examine the gene transfer efficiency of cPPT / CTS / gene transfer vector and enhancer transfer vector-derived concentrated virus into lymphocyte cells, mouse depletion (Spleen mature B, T cells) Was prepared. As a result of infecting the prepared mouse Spleen mature B cells with the concentrated virus derived from cPPT / CTS / gene transfer vector and enhancer transfer vector, and analyzing by flow cytometer, enrichment derived from enhancer transfer vector The resulting virus increased gene transfer efficiency into mouse Spleen mature B cells by a factor of 2 over cPPT / CTS / gene transfer vector virus.

cPPT・CTS／ジーントランスファーベクター、エンハンサージーントランスファーベクター由来の濃縮されたウイルスを用いて、調製したマウスSpleen mature T 細胞を感染させ、フローサイトメーターによる解析を行った。その結果、エンハンサージーントランスファーベクター由来の濃縮されたウイルスはcPPT・CTS/ジーントランスファーベクターウイルスより、マウスSpleen mature T細胞への遺伝子導入効率を若干増加した。これよりエンハンサーがcPPT・CTSよりSpleen mature B、T 細胞への高い遺伝子導入効率を持つことが確認された。   The prepared mouse Spleen mature T cells were infected with concentrated viruses derived from cPPT / CTS / gene transfer vector and enhancer transfer vector, and analyzed by a flow cytometer. As a result, the enriched virus derived from the enhancer transfer vector slightly increased the gene transfer efficiency into mouse Spleen mature T cells compared to the cPPT / CTS / gene transfer vector virus. This confirms that enhancers have higher gene transfer efficiency into Spleen mature B and T cells than cPPT and CTS.

また、上記実験の感染条件は感染３時間後、ウイルス液を排除し、２４時間培養であった。Spleen mature B、T 細胞がウイルスの感染により、傷害を受けて、感染時間の経過に伴い、死んでいくことを配慮し、感染時間を短くした。適当な感染時間を検討するために、本発明者は感染時間を３時間、２４時間と設定し、エンハンサージーントランスファーベクター由来の濃縮されたウイルスを用いて、調製したマウスSpleen mature B 細胞を感染させ、フローサイトメーターによる解析を行った。その結果、MOI(multiplicity of infection) 1、２４時間感染の場合は、遺伝子導入効率が42%に達成し、３時間感染の場合より４倍高くなった。エンハンサーとcPPT・CTSと組み合わせて、MOI(multiplicity of infection) 1のウイルス量で、高い遺伝子導入効率が得られており、高いMOIの感染はより高い遺伝子導入効率が得られることが予想され、本発明は遺伝子治療の応用に関し、高く評価されると考えられる。   Moreover, the infection conditions of the said experiment were the culture | cultivation for 24 hours, eliminating the virus liquid 3 hours after infection. Spleen mature B, T cells were damaged by virus infection, and the infection time was shortened considering that the cells would die as the infection time passed. In order to examine an appropriate infection time, the present inventors set the infection time as 3 hours and 24 hours, and infects the prepared mouse Spleen mature B cells with the concentrated virus derived from the enhancer transfer vector. The analysis was performed using a flow cytometer. As a result, in the case of MOI (multiplicity of infection) 1, 24 hours infection, the gene transfer efficiency was 42%, which was 4 times higher than that in the case of 3 hours infection. Combined with an enhancer and cPPT / CTS, high gene transfer efficiency is obtained with a viral load of MOI (multiplicity of infection) 1, and high MOI infection is expected to achieve higher gene transfer efficiency. The invention is considered highly appreciated for gene therapy applications.

本発明はエンハンサーである動物のゲノムに存在するcis-acting elementを含む組換えウイルスベクターを用いて、動物細胞を感染し、遺伝子発現レベル及び導入効率を高めるものである。ウイルスベクターに含まれるこのエンハンサーはそのウイルスベクターに組み込まれる単一の遺伝子の発現だけではなく、２つの遺伝子の同時的な発現にも作用し、遺伝子の発現レベルを高めることが考えられる。なお、ウイルスベクターに含まれるこのエンハンサーを遺伝子の転写を開始するプロモーターの前に置いても、遺伝子の３’側に置いても、遺伝子の発現レベルを高めることができる。   The present invention uses a recombinant viral vector containing a cis-acting element present in the genome of an animal, which is an enhancer, to infect animal cells and increase gene expression level and transfer efficiency. It is considered that this enhancer contained in a viral vector acts not only on the expression of a single gene incorporated into the viral vector but also on the simultaneous expression of two genes, thereby increasing the expression level of the gene. It should be noted that the gene expression level can be increased by placing the enhancer contained in the viral vector in front of the promoter that initiates gene transcription or on the 3 'side of the gene.

本発明のエンハンサーを挿入するベクターとして、人工ウイルスベクターおよび組換えウイルスベクターが挙げられる。人工ウイルスベクターとしては、核移行シグナル（NLS）を含む蛋白質または合成ペプチドが挙げられる。核移行シグナルは核蛋白質の核内運送を行う役割を果たしている。核移行シグナルを含む蛋白質型の人工ウイルスベクターとしては、核蛋白質HMG-1 (high mobility group 1 protein)が挙げられ、核移行シグナルを含む合成ペプチド型の人工ウイルスベクターとしては、SV40に含まれる核移行シグナル（NLS）を含む合成ペプチドが挙げられる。また、HIV pre-integration complex (Gallay et al., 1996)に存在するVpr、matrix protein、RevはNLSを含み、人工ウイルスベクターとして利用することができる。   Examples of the vector into which the enhancer of the present invention is inserted include artificial virus vectors and recombinant virus vectors. Artificial viral vectors include proteins or synthetic peptides that contain a nuclear localization signal (NLS). Nuclear translocation signals play a role in nuclear transport of nuclear proteins. An example of a protein-type artificial viral vector containing a nuclear translocation signal is the nuclear protein HMG-1 (high mobility group 1 protein), and a synthetic peptide-type artificial viral vector containing a nuclear translocation signal is the nucleus contained in SV40. Synthetic peptides containing a translocation signal (NLS) can be mentioned. Moreover, Vpr, matrix protein, and Rev present in the HIV pre-integration complex (Gallay et al., 1996) contain NLS and can be used as artificial virus vectors.

レトロウイルスベクターとはレトロウイルスのバックボーンを有することを指す。例えば、Oncovirus（オンコウイルス属）Vector、レンチイウルスベクター（Lentiviral Vector）でありレンチウイルスベクターとしてはHIV,SIVが好ましい。   A retroviral vector refers to having a retroviral backbone. For example, Oncovirus (Genus Oncovirus) Vector, Lentiviral Vector (Lentiviral Vector), and HIV and SIV are preferred as the lentiviral vector.

その感染される動物細胞としては、T細胞、B細胞、動物の胚性幹細胞（ES細胞）、動物の胚細胞、血球系または造血系幹細胞、人の組織の細胞、鼻腔または呼吸系統の気管支の粘膜上皮細胞等が挙げられる。B細胞においては抗体の産生に関与することが好ましい。例えば、抗体遺伝子を搭載するベクターにこのエンハンサーを組み込み、B細胞を感染させて、抗体の産生を高めることができると考えられる。   The animal cells to be infected include T cells, B cells, animal embryonic stem cells (ES cells), animal embryonic cells, hematopoietic or hematopoietic stem cells, human tissue cells, nasal cavity or respiratory bronchial bronchial cells Examples include mucosal epithelial cells. It is preferable to participate in antibody production in B cells. For example, it is considered that this enhancer can be incorporated into a vector carrying an antibody gene to infect B cells to increase antibody production.

また、T細胞においてはHIV感染によるCD4陽性T細胞の減少の治療が好ましい。例えば、治療遺伝子を搭載するベクターにこのエンハンサーを組み込み、ex vivoでCD4陽性T細胞を感染させ、再び、ヒトの身体に戻すことが考えられる。胚細胞、ES細胞においては目的遺伝子を搭載するベクターにこのエンハンサーを組み込み、胚細胞、ES細胞での高い遺伝子発現レベルを得られることが考えられる。   In addition, for T cells, treatment of a decrease in CD4 positive T cells due to HIV infection is preferable. For example, this enhancer may be incorporated into a vector carrying a therapeutic gene, infected with CD4 positive T cells ex vivo, and returned to the human body again. In embryonic cells and ES cells, it is conceivable that this enhancer can be incorporated into a vector carrying a target gene to obtain a high gene expression level in embryonic cells and ES cells.

人の組織の細胞、例えば、鼻腔または呼吸系統の気管支の粘膜上皮細胞、特に嚢胞性繊維症（cystic fibrosis, CF）を治療することが好ましい。嚢胞性繊維症とは、白人種に極めて高頻度にみられる常染色体劣性遺伝子病で、欧米では出生児２５００人当たり１人の発症頻度を示し、気道上皮では気道管腔内に粘稠な痰が多く溜まり、呼吸困難を起こす。このエンハンサー配列を含むパラミクソウイルスエンベロープシュードタイプレチウイルスベクターを作製し、鼻腔または呼吸系統の気管支の粘膜上皮細胞での高い遺伝子発現レベルを得られることが考えられる。   It is preferred to treat cells of human tissue, for example, nasal cavity or respiratory bronchial mucosal epithelial cells, especially cystic fibrosis (CF). Cystic fibrosis is an autosomal recessive genetic disease that is very common in Caucasians. In Europe and the United States, there is an incidence of 1 out of 2500 live births, and in the airway epithelium there is a viscous fold in the airway lumen. It accumulates a lot and causes dyspnea. It is conceivable that a paramyxovirus envelope pseudotype recivirus vector containing this enhancer sequence can be prepared to obtain a high gene expression level in nasal cavity or respiratory bronchial mucosal epithelial cells.

実験例１
エンハンサー、ｃＰＰＴ・CTSによるシュードタイプレンチウイルスベクターの調製
プラスミドDNA（p EYFP-N1、Clontech社製）を制限酵素HindIII, BamHIで切断し、ブランティング（Bluntting）させ、セルフライゲーション（self-ligation）により環状のPlasmid DNAとした。その環状のPlasmid DNAのAseI siteに制限酵素HindIII, BamHIの認識配列を含むLinkerAseIを組み込んで、コトロールベクターを得た。 Experimental example 1
Preparation of pseudo-type lentiviral vector with enhancer and cPPT / CTS Plasmid DNA (pEYFP-N1, Clontech) was cleaved with restriction enzymes HindIII and BamHI, blunted, and self-ligated by self-ligation Circular plasmid DNA was used. LinkerAseI containing the recognition sequences of restriction enzymes HindIII and BamHI was incorporated into the Ase site of the circular plasmid DNA to obtain a control vector.

２kbエンハンサー断片はマウスのゲノムDNAであるGenBank no:AE008683の214722bpから216731bpまでの配列を元にして、primer EcoRV F （5’-GATATCcagaatagtacttcattatg）、primer EcoRV R（5’-GATATCTTGATCATCATTTCTATCTT）を用いたPCR 反応により２kbエンハンサー断片を増幅させた。増幅させた２kbエンハンサー断片をコトロールベクターに組み込み、発現ベクターを得た。   PCR reaction using primer EcoRV F (5'-GATATCcagaatagtacttcattatg) and primer EcoRV R (5'-GATATCTTGATCATCATTTCTATCTT) based on the sequence from 214722bp to 216731bp of GenBank no: AE008683, the genomic DNA of the mouse. Amplified a 2 kb enhancer fragment. The amplified 2 kb enhancer fragment was incorporated into a cotrol vector to obtain an expression vector.

プラスミドDNA （pBluescriptII SK(＋) 、Stratagene社製）のKpnI, ApaI部位の間に、AscI, BglII, AatIIの認識配列を、SacII, SacI部位の間に、NsiI, NheI, AscIの認識配列を組み込み、改変した。次に、コトロールベクター、増幅させた２kbエンハンサー断片を含む発現ベクターをそれぞれ、制限酵素HindIII, NotIで切断し、1.4kb、3.4kb断片を回収し、改変したPlasmid DNA（pBluescriptII SK(＋)）の制限酵素HindIII, NotIサイトに組み込み、pBluescriptII SK-CMV/EYFP、pBluescriptII SK-Enhancer/CMV/EYFとした。   Incorporate AscI, BglII and AatII recognition sequences between KpnI and ApaI sites of plasmid DNA (pBluescriptII SK (+), Stratagene), and NsiI, NheI and AscI recognition sequences between SacII and SacI sites. Modified. Next, the control vector and the expression vector containing the amplified 2 kb enhancer fragment were cleaved with restriction enzymes HindIII and NotI, respectively, and 1.4 kb and 3.4 kb fragments were recovered and modified plasmid DNA (pBluescriptII SK (+)). And incorporated into restriction enzyme HindIII and NotI sites of pBluescriptII SK-CMV / EYFP and pBluescriptII SK-Enhancer / CMV / EYF.

ジーントランスファーベクターpLenti6V5-DEST、パッケージングベクターpLP 1、pLP2、VSV-G供給ベクターpLPVSVG、レンチウイルス生産細胞293FTを含むpLenti6V5-DEST Gateway Vector Pack（Invitrogen社製）を使用し、以下の操作を行った。   Using the gene transfer vector pLenti6V5-DEST, packaging vectors pLP1, pLP2, VSV-G supply vector pLPVSVG, and pLenti6V5-DEST Gateway Vector Pack (manufactured by Invitrogen) containing lentivirus-producing cells 293FT, the following operations were performed. .

ます、ジーントランスファーベクターpLenti6V5-DESTを制限酵素ClaI, KpnIで切断し、5400bpの断片をゲルから回収した。回収された5400bpの断片に制限酵素ClaI, EcoRI, AscIなどの認識配列を含むLinker ClaI-KpnIを入れ込み、環状のプラスミドDNAを得た。   First, the gene transfer vector pLenti6V5-DEST was cleaved with restriction enzymes ClaI and KpnI, and a 5400 bp fragment was recovered from the gel. Linker ClaI-KpnI containing a recognition sequence such as restriction enzymes ClaI, EcoRI, AscI was inserted into the collected 5400 bp fragment to obtain a circular plasmid DNA.

pBluescriptII
SK-CMV/EYFPを制限酵素AscIで切断し、改変されたpLenti6V5-DEST環状のPlasmid DNAの制限酵素AscI部位に組み込んで、コトロールジーントランスファーベクターを得た。 pBluescriptII
SK-CMV / EYFP was cleaved with the restriction enzyme AscI, and incorporated into the restriction enzyme AscI site of the modified plasmid DNA of pLenti6V5-DEST to obtain a Cotrol gene transfer vector.

cPPT・CTS断片はpLP 1を鋳型（template）として、プライマーｃＰＰＴClaIF（5’-ATCGATTTTTAAAAGAAAAGGGGGG：配列番号４）、ｃＰＰＴEcoRIR（5’-GAATTCAAAATTTTGAATTTTTGTAATTTG：配列番号５）を用いて、PCR 反応を行い、ｃＰＰＴ・CTS断片を増幅させた。増幅させたcPPT・CTS断片をコトロールジーントランスファーベクターの制限酵素ClaI、EcoRI部位に組み込んで、ｃＰＰＴ・CTS/ジーントランスファーベクターとした。   The cPPT / CTS fragment was subjected to a PCR reaction using pLP 1 as a template, primers cPPTClaIF (5′-ATCGATTTTTAAAAGAAAAGGGGGG: SEQ ID NO: 4), cPPTEcoRIR (5′-GAATTCAAAATTTTGAATTTTTGTAATTTG: SEQ ID NO: 5), and cPPT / CTS. Fragments were amplified. The amplified cPPT / CTS fragment was incorporated into restriction enzyme ClaI and EcoRI sites of the Cotrol Gene Transfer Vector to obtain a cPPT / CTS / Gene Transfer Vector.

pBluescriptII SK-Enhancer/ CMV/EYFPを制限酵素AscIで切断し、cPPT・CTS/ジーントランスファーベクターDNAの制限酵素AscI部位に組み込んで、エンハンサージーントランスファーベクターとした。各ジーントランスファーベクターおよびパッケージングベクターの構造模式図を図１に示す。   pBluescriptII SK-Enhancer / CMV / EYFP was cleaved with the restriction enzyme AscI and incorporated into the restriction enzyme AscI site of the cPPT / CTS / gene transfer vector DNA to obtain an enhanced surgeon transfer vector. A schematic diagram of the structure of each gene transfer vector and packaging vector is shown in FIG.

レンチウイルス産生に用いたヒト胎児腎細胞由来細胞株293FT細胞（Invitrogen社製）を、10%非動化ウシ胎児血清、500μg/ml neomycine（Invitrogen社製）を含むD-MEM（Invitrogen社）で培養した。ベクターのトランスフェクションはLIPOFECTAMINE PLUS（Invitrogen社製）を用い、添付説明書に従い行った。   The human fetal kidney cell-derived cell line 293FT cell (manufactured by Invitrogen) used for lentivirus production was obtained from D-MEM (Invitrogen) containing 10% non-immobilized fetal calf serum and 500 μg / ml neomycine (Invitrogen). Cultured. Vector transfection was performed using LIPOFECTAMINE PLUS (Invitrogen) according to the attached instructions.

293FT細胞を直径15cm dish （コラーゲンタイプI コート製品、IWAKI社製）へ3×106個の細胞密度でまき、炭酸ガスインキュベーター中（37℃、5%炭酸ガス存在下）で48時間培養した。トランスフェクションの30分前に培養液を10mlのOptiMEM（Invitrogen社製）に培地交換し培養を続けた。トランスフェクションに使用するDNA量はそれぞれ20μgの３つのジーントランスファーベクターと、6μgのパッケージングベクターpLP 1、pLP2（Invitrogen社製）とを使用し、それらに加えて2μgのVSV-G供給ベクターpLPVSVGを使用した。DNAを3mlのOptiMEM（Invitrogen社製）に溶解させた後に400μlのPLUS reagent（Invitrogen社製）を加え、攪拌後15 分室温で静置した。DNAとPLUS reagent（Invitrogen社製）との混合液に、3mlのOptiMEMで希釈した100μl のLIPOFECTAMINEを添加し、攪拌後さらに15 分室温で静置した。以上の方法により調製したDNAとLIPOFECTAMINEとの複合体を含む溶液を直径15cm dishで培養している293FT細胞へ滴下して緩やかに攪拌した後に炭酸ガスインキュベーター中（37℃、5%炭酸ガス存在下）で3時間培養した。培養後30mlの10%非動化ウシ胎児血清を含むD-MEM（Invitrogen社製）を添加し、炭酸ガスインキュベーター中（37℃、5%炭酸ガス存在下）で48時間培養した後に培養上清を0.45μmのポアサイズのフィルター（DISMIC-25CSフィルター、ADVANTEC）で濾過してベクター溶液調製した。 293FT cells were seeded at a density of 3 × 10 6 cells in a 15 cm diameter dish (collagen type I coated product, manufactured by IWAKI) and cultured for 48 hours in a carbon dioxide incubator (37 ° C., in the presence of 5% carbon dioxide). Thirty minutes before transfection, the medium was replaced with 10 ml of OptiMEM (Invitrogen) and the culture was continued. The amount of DNA used for transfection is 20 μg each of three gene transfer vectors and 6 μg packaging vectors pLP 1 and pLP2 (Invitrogen), plus 2 μg VSV-G supply vector pLPVSVG. used. DNA was dissolved in 3 ml of OptiMEM (manufactured by Invitrogen), 400 μl of PLUS reagent (manufactured by Invitrogen) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes after stirring. 100 μl of LIPOFECTAMINE diluted with 3 ml of OptiMEM was added to a mixture of DNA and PLUS reagent (manufactured by Invitrogen). After stirring, the mixture was allowed to stand for 15 minutes at room temperature. A solution containing the complex of DNA and LIPOFECTAMINE prepared by the above method is added dropwise to 293FT cells cultured in a 15 cm dish and gently stirred, then in a carbon dioxide incubator (37 ° C, in the presence of 5% carbon dioxide) ) For 3 hours. After culture, add D-MEM (Invitrogen) containing 30 ml of 10% non-immobilized fetal bovine serum, and culture for 48 hours in a carbon dioxide incubator (37 ° C, in the presence of 5% carbon dioxide). Was filtered through a 0.45 μm pore size filter (DISMIC-25CS filter, ADVANTEC) to prepare a vector solution.

実験例２
ｐ２４蛋白質の発現量の測定
p24蛋白質の発現量の測定はHIV-1p24 Antigen ELISA kit (ZepoMetrix Corporation製)を用いて添付説明書に従い行った。まずは、HIV-1 P24 Antigen Standardを作り、次は225μlのコトロールジーントランスファーベクター、ｃＰＰＴ・CTS/ジーントランスファーベクター、エンハンサージーントランスファーベクター由来のウイルス液を５倍希釈し、順番に５回希釈系列を作って、添付説明書に従って反応を行った。最後に450nmのフィルターを持つマイクロプレートリーダー (BIO-RAD社製)を用いて測定し、解析ソフトMPMIIIにより解析を行った。その結果を図２に示す。これによりCPPT配列の後、レンチウイルスベクターのCMVプロモーターの前に、マウスのcis-acting element配列を挿入することによって、遺伝子発現レベルがCPPT配列なしのベクターと比較して６倍、CPPT配列ありのベクターと比較して３倍以上上昇することが確認された。 Experimental example 2
Measurement of expression level of p24 protein
The expression level of p24 protein was measured using HIV-1 p24 Antigen ELISA kit (ZepoMetrix Corporation) according to the attached instructions. First, make HIV-1 P24 Antigen Standard, and then dilute 225 μl of virus solution derived from Cotrol Gene Transfer Vector, cPPT / CTS / Gene Transfer Vector, and Enhanced Sage Transfer Vector 5 times, The reaction was carried out according to the attached instructions. Finally, measurement was performed using a microplate reader (manufactured by BIO-RAD) having a 450 nm filter, and analysis was performed using analysis software MPMIII. The result is shown in FIG. By inserting the mouse cis-acting element sequence after the CPPT sequence and before the CMV promoter of the lentiviral vector, the gene expression level is 6 times that of the vector without the CPPT sequence and the CPPT sequence is present. It was confirmed that it increased more than 3 times compared to the vector.

実験例３
ベクターの濃縮
実験例１にて回収された3種類のウイルス液をそれぞれ20000rpm (45 Ti rotor, Beckman)、4℃にて、２時間遠心し、ペレットをPBS (5% FCS, 2μg/ml polybrene)に溶解し、使用まで-80℃に保存した。 Experimental example 3
The three types of virus solutions collected in Example 1 of vector concentration were centrifuged at 20000 rpm (45 Ti rotor, Beckman) and 4 ° C. for 2 hours, respectively, and the pellet was PBS (5% FCS, 2 μg / ml polybrene). And stored at −80 ° C. until use.

実験例４
ベクターの力価測定
実験例２のHIV-1p24 Antigen ELISAの結果により、1000pgのｐ24蛋白質の量を持つ、コトロールジーントランスファーベクター由来のウイルス液140μl、cPPT・CTS／ジーントランスファーベクター由来のウイルス液70μl、エンハンサージーントランスファーベクター由来のウイルス液23μlを２９３FT細胞に感染させ、遺伝子導入される細胞の数によって、力価を計算した。２９３FT細胞を1×106／wellで６wellカルチャープレートにまき、４８時間培養した。光学顕微鏡で200倍の倍率で検鏡、視野内の遺伝子導入細胞数を測定し、３視野の平均を求め、視野の面積とプレートの面積よりもとめた係数854.865をかけることにより力価の算出を行った。その結果は図３に示す。図３（ａ）は１０００ｐｇあたりの力価（T. U.：Transducing Unit）を表し、コトロール、cPPT・CTS、エンハンサージーントランスファーベクターの力価は夫々、6×104T.U./1000pg、1.4×105T.U./1000pg、1.2×105T.U./1000pgであった。また、図３（ｂ）は、１ｍｌあたりの力価（T. U.／ml）に換算しものであり、エンハンサージーントランスファーベクターの力価は5.14×106T.U./mlとなり、コトロール（4.3×105T.U./ml）の約１１倍、ｃＰＰＴ・CTS（1.9×106T.U./ml）の約２．５倍となった。 Experimental Example 4
According to the results of the HIV-1p24 Antigen ELISA in Example 2 of titer measurement of the vector, 140 μl of the virus solution derived from the Cotrol Gene transfer vector and 70 μl of the virus solution derived from the cPPT · CTS / gene transfer vector having a p24 protein amount of 1000 pg. The 293FT cells were infected with 23 μl of the virus solution derived from the enhancer transfer vector, and the titer was calculated according to the number of cells into which the gene was introduced. 293FT cells were seeded on a 6- well culture plate at 1 × 10 6 / well and cultured for 48 hours. Measure the number of transgenic cells in the field of view with an optical microscope at 200 times magnification, calculate the average of the three fields, and calculate the titer by multiplying the area of the field and the area of the plate by a factor of 854.865. went. The result is shown in FIG. Fig. 3 (a) shows the titer per 1000 pg (TU: Transducing Unit), and the titers of Kotrol, cPPT / CTS, and enhancer transfer vectors are 6 x 10 4 TU / 1000 pg and 1.4 x 10 5 TU /, respectively. 1000 pg, 1.2 × 10 5 TU / 1000 pg. FIG. 3 (b) is converted to a titer per ml (TU / ml). The titer of the enhancer transfer vector is 5.14 × 10 6 TU / ml, indicating that the control is 4.3 × 10 5 TU. about 11 times as large as cPPT · CTS (1.9 × 10 6 TU / ml).

実験例５
ディプリーション（Depletion）法によるマウスSpleen mature B細胞の調製
３週齢のBALB/c系のマウスより脾臓を採取し、フロスト付きスライドガラスのフロスト部分で脾臓を挟み、5%FCSを含むRPMI1640中にスライドガラスを摩擦させることにより、脾臓細胞浮遊液を調製した。得られた細胞浮遊液をスピッツ遠心管（Falcon）に回収し、1500 rpm, 5分間遠心して、細胞のペレートを得た。次に、赤血球溶血用緩衝液（0.83% 塩化アンモニウムを含む）を細胞のペレートに添加してよく攪拌し、氷に１分間置き、10mlの2%FCSを含むHBSS溶液（Hanks, balanced salt solution, Sigma社製）を加えて２回遠心洗浄してから、5mlの最終濃度20μg/mlのanti-FcγRII/II（2.4G2;PharMingen,San Diego,CA）を加えて氷上に１５分間置いた。この操作により低親和性Fc受容体への抗体の非特異的結合を阻害する。細胞浮遊液を2×107個/mlに調整した。 Experimental Example 5
Preparation of mouse Spleen mature B cells by depletion method Spleen was collected from BALB / c mice aged 3 weeks, spleen was sandwiched between frosted glass slides with frost, and RPMI1640 containing 5% FCS. A spleen cell suspension was prepared by rubbing the slide glass. The obtained cell suspension was collected in a Spitz centrifuge tube (Falcon) and centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes to obtain cell pellets. Next, red blood cell lysis buffer (containing 0.83% ammonium chloride) is added to the cell pellet and stirred well, placed on ice for 1 minute, and HBSS solution containing 10 ml of 2% FCS (Hanks, balanced salt solution, (Sigma) was added and centrifuged twice, and then 5 ml of final concentration 20 μg / ml of anti-FcγRII / II (2.4G2; PharMingen, San Diego, Calif.) Was added and placed on ice for 15 minutes. This procedure inhibits nonspecific binding of the antibody to the low affinity Fc receptor. The cell suspension was adjusted to 2 × 10 7 cells / ml.

ビオチン標識抗体混合物（Miltenyi Biotec社製）に含まれるanti-CD90、anti-CD43、anti-CD5、anti-CD3、anti-CD11b(Mac-1)、anti-Gr-1、anti-Ter119を最適濃度に希釈し、調整された細胞浮遊液に添加し、氷上で３０分間反応させた。HBSS溶液で細胞浮遊液を遠心洗浄して余分な抗体を除き、メッシュを通す。100μlの標識ストレプトアビジンmicrobeads（Miltenyi Biotec社製、Gladbach、Germany）を細胞に添加し、氷上で１５分間反応させた。また、HBSS溶液で細胞浮遊液を遠心洗浄して500μl浮遊液とし、MACS clumn（Miltenyi Biotec社製）により分離し、15mlの細胞とした。   Opti-CD90, anti-CD43, anti-CD5, anti-CD3, anti-CD11b (Mac-1), anti-Gr-1, and anti-Ter119 contained in biotin-labeled antibody mixture (Miltenyi Biotec) The solution was added to the prepared cell suspension and allowed to react on ice for 30 minutes. Centrifuge cell suspension with HBSS solution to remove excess antibody, and pass through mesh. 100 μl of labeled streptavidin microbeads (Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany) was added to the cells and allowed to react on ice for 15 minutes. Further, the cell suspension was centrifuged and washed with an HBSS solution to give a 500 μl suspension, which was separated by MACS clumn (Miltenyi Biotec) to give 15 ml of cells.

得られた15 mlの細胞にマウスSpleen mature B細胞がどの割合で存在しているかを調べるために、フローサイタメーターFACS Calibur（Becton Dickinson, Mountain View, CA）を用い、以下の６つの細胞検体を使用した。１は細胞のみであり、抗体を添加しないネガテイブコトロールである。２、３、４の細胞は2.4G2抗体を添加したコトロールである。５の細胞はビオチン標識抗体混合物（Miltenyi Biotec社製）に含まれるanti-CD90、anti-CD43、anti-CD5、anti-CD3、anti-CD11b(Mac-1)、anti-Gr-1、anti-Ter119を添加し、MACS clumnを掛ける前のコトロールである。６の細胞はMACS clumnを掛けた後のサンプルである。   The flow cytometer FACS Calibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA) was used to examine the proportion of mouse Spleen mature B cells present in the obtained 15 ml cells. used. 1 is a negative cotrol which is only a cell and does not add an antibody. Cells 2, 3 and 4 are cotrols supplemented with 2.4G2 antibody. 5 cells are contained in a biotin-labeled antibody mixture (Miltenyi Biotec) anti-CD90, anti-CD43, anti-CD5, anti-CD3, anti-CD11b (Mac-1), anti-Gr-1, anti-Gr-1 This is the control before adding Ter119 and applying MACS clumn. 6 cells are samples after applying MACS clumn.

50μlずつ各６つの細胞（1×106個/ml）を96 wellプレートに載せて、HBSS溶液で細胞を遠心洗浄した。２、３、４の細胞にはそれぞれ100μlのanti-CD45R/B220-FITC標識（BD PharMingen）、anti-TCRβ-PE標識（BD PharMingen）、anti-CD45R/B220-APC標識（BD PharMingen）を添加した。５、６の細胞はanti-CD45R/B220-FITC標識（BD PharMingen）、anti-TCRβ-PE標識（BD PharMingen）、anti-CD45R/B220-APC-streptavidin標識（BD PharMingen）を含む抗体の混合物をそれぞれ100μl添加した。そのプレートを氷上で遮光し、３０分間反応させた。その後、150μlのHBSS溶液で細胞を２回遠心洗浄し、1mlのPI staining buffer（１×HBSS溶液、2% FCS, 1 ug/ml Propidiumiodide）に浮遊させ、メッシュを通し、FACSチューブに載せてフローサイタメーターFACS Calibur（Becton Dickinson）にて蛍光強度を測定した。６の細胞はマウスSpleen mature B 細胞の割合が97.4%を示して、良い結果になった。 Six cells (1 × 10 6 cells / ml) of 50 μl each were placed on a 96-well plate, and the cells were washed by centrifugation with an HBSS solution. 100 μl of anti-CD45R / B220-FITC label (BD PharMingen), anti-TCRβ-PE label (BD PharMingen) and anti-CD45R / B220-APC label (BD PharMingen) are added to cells 2, 3 and 4, respectively. did. Cells 5 and 6 contain a mixture of antibodies containing anti-CD45R / B220-FITC label (BD PharMingen), anti-TCRβ-PE label (BD PharMingen) and anti-CD45R / B220-APC-streptavidin label (BD PharMingen). 100 μl of each was added. The plate was protected from light on ice and allowed to react for 30 minutes. Then, the cells are washed twice by centrifugation with 150 μl of HBSS solution, suspended in 1 ml of PI staining buffer (1 × HBSS solution, 2% FCS, 1 ug / ml Propidiumiodide), passed through the mesh, placed on a FACS tube and flowed. The fluorescence intensity was measured with a cytometer FACS Calibur (Becton Dickinson). In 6 cells, the ratio of mouse Spleen mature B cells was 97.4%, which was a good result.

実験例６
ディプリーション（Depletion）法によるマウスSpleen mature T細胞の調製
３週齢のBALB/c系のマウスより脾臓を採取し、フロスト付きスライドガラスのフロスト部分で脾臓を挟み、5%FCSを含むRPMI1640中にスライドガラスを摩擦させることにより、脾臓細胞浮遊液を調製した。得られた細胞浮遊液をスピッツ遠心管（Falcon）に回収し、1500 rpm、5分間遠心して、細胞のペレートを得た。次に、赤血球溶血用緩衝液（0.83%塩化アンモニウムを含む）を細胞のペレートに添加してよく攪拌し、氷に１分間置き、10mlの2%FCSを含むHBSS溶液（Hanks, balanced salt solution, Sigma社製）を加えて２回遠心洗浄してから、5mlの最終濃度20μg/mlのanti-FcγRII/II（2.4G2; PharMingen, San Diego, CA）を加えて氷上に１５分間置いた。この操作によって、低親和性Fc受容体への抗体の非特異的結合を阻害する。細胞浮遊液を2×107個/mlに調整した。 Experimental Example 6
Preparation of mouse Spleen mature T cells by depletion method Spleen was collected from BALB / c mice aged 3 weeks, spleen was sandwiched between frosted glass slides with frost, and RPMI1640 containing 5% FCS. A spleen cell suspension was prepared by rubbing the slide glass. The obtained cell suspension was collected in a Spitz centrifuge tube (Falcon) and centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes to obtain cell pellets. Next, erythrocyte hemolysis buffer (containing 0.83% ammonium chloride) is added to the cell pellet and stirred well, placed on ice for 1 minute, and HBSS solution containing 10 ml of 2% FCS (Hanks, balanced salt solution, Sigma) was added and centrifuged twice, and then 5 ml of final concentration 20 μg / ml anti-FcγRII / II (2.4G2; PharMingen, San Diego, Calif.) Was added and placed on ice for 15 minutes. This procedure inhibits nonspecific binding of the antibody to the low affinity Fc receptor. The cell suspension was adjusted to 2 × 10 7 cells / ml.

ビオチン標識抗体混合物（PharMingen）に含まれるanti-IgM、anti-IgD、anti-CD45R/B220、anti-CD11b(Mac-1)、anti-Gr-1、anti-Ter119を最適濃度に希釈し、調整された細胞浮遊液に添加し、氷上で３０分間反応させた。HBSS溶液で細胞浮遊液を遠心洗浄して余分な抗体を除き、メッシュを通した。100μlの標識ストレプトアビジンmicrobeads（Miltenyi Biotec社製、Gladbach、Germany）を細胞に添加し、氷上で１５分間反応させた。また、HBSS溶液で細胞浮遊液を遠心洗浄して500μl浮遊液とし、MACS clumn（Miltenyi Biotec）により分離し、10 mlの細胞とした。   Anti-IgM, anti-IgD, anti-CD45R / B220, anti-CD11b (Mac-1), anti-Gr-1, and anti-Ter119 contained in the biotin-labeled antibody mixture (PharMingen) are diluted to the optimum concentration and adjusted. The resultant was added to the cell suspension and allowed to react on ice for 30 minutes. The cell suspension was centrifuged and washed with HBSS solution to remove excess antibody, and passed through a mesh. 100 μl of labeled streptavidin microbeads (Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany) was added to the cells and allowed to react on ice for 15 minutes. Further, the cell suspension was centrifuged and washed with an HBSS solution to make a 500 μl suspension, which was separated by MACS clumn (Miltenyi Biotec) to give 10 ml of cells.

得られた10mlの細胞にマウスSpleen mature T細胞がどの割合で存在しているかを調べるために、フローサイタメーターFACS Calibur（Becton Dickinson, Mountain View, CA）を用い、以下の６つの細胞検体を使用した。１は細胞のみであり、抗体を添加しないネガテイブコトロールである。２、３、４の細胞は2.4G2抗体を添加したコトロールである。５の細胞はビオチン標識抗体混合物（Miltenyi Biotec社製）に含まれるanti-CD90、anti-CD43、anti-CD5、anti-CD3、anti-CD11b(Mac-1)、anti-Gr-1、anti-Ter119を添加し、MACS clumnに掛ける前のコトロールである。６の細胞はMACS clumnを掛けた後のサンプルである。   The flow cytometer FACS Calibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA) was used to examine the proportion of mouse Spleen mature T cells present in the obtained 10 ml cells, and the following 6 cell samples were used. did. 1 is a negative cotrol which is only a cell and does not add an antibody. Cells 2, 3 and 4 are cotrols supplemented with 2.4G2 antibody. 5 cells are contained in a biotin-labeled antibody mixture (Miltenyi Biotec) anti-CD90, anti-CD43, anti-CD5, anti-CD3, anti-CD11b (Mac-1), anti-Gr-1, anti-Gr-1 This is the control before adding Ter119 and applying to MACS clumn. 6 cells are samples after applying MACS clumn.

50μlずつ各６つの細胞（1×106個/ml）を96wellプレートに載せて、HBSS溶液で細胞を遠心洗浄した。２、３、４の細胞にはそれぞれ100μlのanti-CD3-FITC標識（BD PharMingen）、anti- CD45R/B220-PE標識（BD PharMingen）、anti-CD3-APC標識（BD PharMingen）を添加した。５、６の細胞はanti-CD3-FITC標識（BD PharMingen）、anti- CD45R/B220-PE標識（BD PharMingen）、anti-CD3-APC-streptavidin標識（BD PharMingen）を含む抗体の混合物をそれぞれ100μl添加した。そのプレートを氷上で遮光し、３０分間反応させた。その後、150μlのHBSS溶液で細胞を２回遠心洗浄し、1 mlのPI staining buffer（１×HBSS溶液、2% FCS、1μg/ml Propidiumiodide）に浮遊させ、メッシュを通し、FACSチューブに載せてフローサイタメーターFACS Calibur（Becton Dickinson）にて蛍光強度を測定した。６の細胞はマウスSpleen mature T 細胞の割合が91 %を示し、良い結果になった。 Six cells (1 × 10 6 cells / ml) of 50 μl each were placed on a 96-well plate, and the cells were washed by centrifugation with an HBSS solution. 100 μl of anti-CD3-FITC label (BD PharMingen), anti-CD45R / B220-PE label (BD PharMingen), and anti-CD3-APC label (BD PharMingen) were added to cells 2, 3, and 4, respectively. Cells 5 and 6 each contain 100 μl of an antibody mixture containing anti-CD3-FITC label (BD PharMingen), anti-CD45R / B220-PE label (BD PharMingen), and anti-CD3-APC-streptavidin label (BD PharMingen). Added. The plate was protected from light on ice and allowed to react for 30 minutes. The cells are then centrifuged twice with 150 μl of HBSS solution, suspended in 1 ml of PI staining buffer (1 × HBSS solution, 2% FCS, 1 μg / ml Propidiumiodide), passed through a mesh, placed on a FACS tube and flowed. The fluorescence intensity was measured with a cytometer FACS Calibur (Becton Dickinson). In 6 cells, the ratio of mouse Spleen mature T cells was 91%, which was a good result.

実験例７
マウスSpleen
mature B細胞への遺伝子導入及びフローサイトメーターによる解析
実験例５で調製されたマウスSpleen matureB細胞を10%FCS, 10-5M２−メルカプトエタノール（2-ME：2-mercaptoethanol）、25mＭ HEPESおよびペニシリン−ストレプトマイシン（penicillin-streptomycin）を含むRPMI1640培地で交換し2.5×105/wellで６wellカルチャープレートに撒いた。実験例３にて濃縮されたcPPT・CTS/ジーントランスファーベクター由来のウイルス液、エンハンサージーントランスファーベクター由来のウイルス液をそれぞれMOI(multiplicity of infection) 1, 0で調製した。つまり、MOIが1の場合は、2.5×105/wellの細胞に対して、2.5×105TU/mlにて調製した。調製されたウイルス液をそれぞれマウスSpleen mature B細胞に３時間感染させてから、10%FCS, 10-5M 2-ME、25mＭ HEPESおよびペニシリン−ストレプトマイシンを含むRPMI1640培地で交換し、２４時間培養し、PI staining buffer（１×HBSS溶液、2% FCS, 1 ug/ml Propidiumiodide）に浮遊させ、メッシュを通し、FACSチューブに載せてフローサイタメーターFACS Calibur（Becton Dickinson）にてYFP及びPEの２蛍光により蛍光強度を測定し、解析した。その結果を図４に示す。エンハンサージーントランスファーベクター（MOI＝1）の場合はSpleen mature B細胞でのEYFP陽性発現細胞割合は１２％で、cPPT・CTS（６％）の２倍になっている。これにより本発明のエンハンサーがcPPT・CTSよりSpleen mature B細胞への高い遺伝子導入効率を持つことが証明された。 Experimental Example 7
Mouse Spleen
mature transgenic and flow mice prepared in Analysis Experimental Example 5 by cytometer Spleen MatureB cells with 10% FCS to B cells, 10- 5 The M2-mercaptoethanol (2-ME: 2-mercaptoethanol ), 25mM HEPES and Penicillin -The medium was exchanged with RPMI1640 medium containing streptomycin (penicillin-streptomycin) and plated on a 6-well culture plate at 2.5 × 10 5 / well. The virus solution derived from cPPT / CTS / gene transfer vector and the virus solution derived from enhancer transfer vector concentrated in Experimental Example 3 were prepared at MOI (multiplicity of infection) 1, 0, respectively. That is, when the MOI was 1, it was prepared at 2.5 × 10 5 TU / ml for 2.5 × 10 5 / well cells. Prepared virus solution from each infected 3 hours Mice Spleen mature B cells, 10% FCS, 10- 5 M 2-ME, 25mM HEPES and penicillin - was replaced with RPMI1640 medium containing streptomycin, and cultured for 24 hours , Suspended in PI staining buffer (1 x HBSS solution, 2% FCS, 1 ug / ml Propidiumiodide), passed through mesh, placed on FACS tube, and flow fluorescence meter FACS Calibur (Becton Dickinson) 2 fluorescence of YFP and PE Was used to measure and analyze the fluorescence intensity. The result is shown in FIG. In the case of the enhancer transfer vector (MOI = 1), the ratio of EYFP-positive cells in Spleen mature B cells is 12%, which is twice that of cPPT / CTS (6%). This proves that the enhancer of the present invention has higher gene transfer efficiency into Spleen mature B cells than cPPT / CTS.

実験例８
マウスSpleen
mature T細胞への遺伝子導入及びフローサイトメーターによる解析
実験例６にて調製されたマウスSpleen mature T細胞を10%FCS、10-5M ２−メルカプトエタノール（2-ME：2-mercaptoethanol）, 25mＭ HEPESおよびペニシリン−ストレプトマイシン（penicillin-streptomycin）を含むRPMI1640培地で交換し2.5×105/wellで６well カルチャープレートに撒いた。実験例３で濃縮されたｃＰＰＴ・CTS/ジーントランスファーベクター由来のウイルス液、エンハンサージーントランスファーベクター由来のウイルス液をそれぞれMOI(multiplicity of infection) 1, 0で調製した。つまり、MOI(multiplicity of infection) 1の場合は、2.5×105/wellの細胞に対して、2.5×105TU/mlにて調製した。調製されたウイルス液をそれぞれマウスSpleen mature T細胞を３時間感染させてから、10%FCS、10-5M 2-ME, 25mＭ HEPESおよびペニシリン−ストレプトマイシンを含むRPMI1640培地で交換し、２４時間培養し、PI staining buffer（１×HBSS溶液、2% FCS, 1μg/ml Propidiumiodide）に浮遊させ、メッシュを通し、FACSチューブに載せてフローサイタメーターFACS Calibur（Becton Dickinson）にてYFP及びPEの２蛍光により蛍光強度を測定し、解析した。結果を図６に示す。エンハンサージーントランスファーベクター（MOI＝1）の場合はSpleen mature T 細胞でのEYFP陽性発現細胞割合は１２％で、cPPT・CTSの場合は9.7％であった。これにより本発明のエンハンサーがcPPT・CTSよりSpleen mature T細胞への高い遺伝子導入効率を持つことが証明された。 Experimental Example 8
Mouse Spleen
mature T gene transfer into cells and flow mice Spleen prepared by cytometer by analysis Experimental Example 6 mature T cells 10% FCS, 10- 5 M 2- mercaptoethanol (2-ME: 2-mercaptoethanol ), 25mM The medium was replaced with RPMI1640 medium containing HEPES and penicillin-streptomycin, and plated on a 6-well culture plate at 2.5 × 10 5 / well. The virus solution derived from cPPT · CTS / gene transfer vector and the virus solution derived from enhancer transfer vector concentrated in Experimental Example 3 were prepared at MOI (multiplicity of infection) 1, 0, respectively. That is, in the case of MOI (multiplicity of infection) 1, it was prepared at 2.5 × 10 5 TU / ml for 2.5 × 10 5 / well cells. Prepared virus solution from each infected 3 hours Mice Spleen mature T cells, 10% FCS, 10- 5 M 2-ME, 25mM HEPES and penicillin - was replaced with RPMI1640 medium containing streptomycin, and cultured for 24 hours , Suspended in PI staining buffer (1 x HBSS solution, 2% FCS, 1 µg / ml Propidiumiodide), passed through mesh, placed on FACS tube, and flow fluorescence meter FACS Calibur (Becton Dickinson) with 2 fluorescence of YFP and PE The fluorescence intensity was measured and analyzed. The results are shown in FIG. In the case of the enhancer transfer vector (MOI = 1), the ratio of EYFP positive expression cells in Spleen mature T cells was 12%, and in the case of cPPT / CTS, it was 9.7%. This proves that the enhancer of the present invention has higher gene transfer efficiency into Spleen mature T cells than cPPT / CTS.

実施例９
３時間及び２４時間感染の条件でマウスSpleen mature B細胞への遺伝子導入およびフローサイトメーターによる解析
実験例５で調製されたマウスSpleen mature B細胞を10%FCS、10-5M ２−メルカプトエタノール（2-ME：2-mercaptoethanol）、25mＭ HEPESおよびペニシリン−ストレプトマイシン（penicillin-streptomycin）を含むRPMI1640培地で交換し2.5×105/wellで６wellカルチャープレートに撒いた。実験例３で濃縮されたエンハンサージーントランスファーベクター由来のウイルス液をそれぞれMOI(multiplicity of infection) 1, 0.1, 0で調製した。つまり、MOI(multiplicity of infection) 1の場合は、2.5×105/wellの細胞に対して、2.5×105TU/mlにて調製した。調製されたウイルス液をそれぞれマウスSpleen mature B細胞を３時間、２４時間感染させてから、10% FCS, 10-5M 2-ME、25 mＭ HEPES及びペニシリン−ストレプトマイシンを含むRPMI1640培地で交換し、PI staining buffer（１×HBSS溶液、2% FCS, 1μg/ml Propidiumiodide）に浮遊させ、メッシュを通し、FACSチューブに載せてフローサイタメーターFACS Calibur（Becton Dickinson）にてYFP及びPEの２蛍光により蛍光強度を測定し、解析した。その結果を図６に示す。エンハンサージーントランスファーベクター（感染３時間）の場合はSpleen mature B 細胞でのEYFP陽性発現細胞割合は10.4% （MOI＝1）、1.1% （MOI＝0.1）となった。エンハンサージーントランスファーベクター（感染２４時間）の場合はSpleen mature B 細胞でのEYFP陽性発現細胞割合は42.2% （MOI＝1）、11.7% （MOI＝0.1）になった。感染時間が３時間から２４時間変わると、エンハンサージーントランスファーベクターはSpleen mature B 細胞でのEYFP陽性発現細胞割合は４倍（MOI＝1）、１０倍（MOI＝0.1）増加した。これにより、エンハンサーによるSpleen mature B細胞での高発現レベルが感染時間延長により促進されていることが分かる。 Example 9
3 hours and 24 hours mice Spleen mature transgenic and mouse flows were prepared according cytometer analysis Experimental Example 5 to B cells Spleen mature B cells with 10% FCS under the condition of infection, 10- 5 M 2-mercaptoethanol ( 2-ME: 2-mercaptoethanol), 25 mM HEPES, and an RPMI1640 medium containing penicillin-streptomycin were exchanged and plated on a 6-well culture plate at 2.5 × 10 5 / well. Virus solutions derived from the enhanced surgeon transfer vector concentrated in Experimental Example 3 were prepared at MOI (multiplicity of infection) 1, 0.1, 0, respectively. That is, in the case of MOI (multiplicity of infection) 1, it was prepared at 2.5 × 10 5 TU / ml for 2.5 × 10 5 / well cells. It was replaced with RPMI1640 medium containing streptomycin, - prepared virus solution for 3 hours Mice Spleen mature B cells, respectively, from the infected 24 hours, 10% FCS, 10- 5 M 2-ME, 25 mM HEPES and penicillin Float in PI staining buffer (1 x HBSS solution, 2% FCS, 1 µg / ml Propidiumiodide), pass through a mesh, place on a FACS tube, and fluoresce with two fluorescences of YFP and PE in a flow cytometer FACS Calibur (Becton Dickinson) Intensity was measured and analyzed. The result is shown in FIG. In the case of the enhancer transfer vector (3 hours of infection), the ratio of EYFP-positive cells in Spleen mature B cells was 10.4% (MOI = 1) and 1.1% (MOI = 0.1). In the case of the enhancer transfer vector (24 hours of infection), the ratio of EYFP positive expressing cells in Spleen mature B cells was 42.2% (MOI = 1) and 11.7% (MOI = 0.1). When the infection time changed from 3 hours to 24 hours, the ratio of EYFP positive expressing cells in Spleen mature B cells increased 4 times (MOI = 1) and 10 times (MOI = 0.1). This shows that the high expression level in Spleen mature B cells by the enhancer is promoted by prolonging the infection time.

本発明者はこのエンハンサーとWPREとの比較的な実験を行っていないが、厚生労働科学研究費補助金（エイズ対策研究事業）総合研究報告書にて、SIVベクターの開発と血友病A遺伝子治療への応用に関し、株式会社ディナベック研究所により以下の報告がなされている。ベクター自身の性能を高めるためにレンチウイルスベクターの骨格配列に細胞への導入効率を上昇させる目的でSIVゲノムに含まれるcPPT配列、および導入遺伝子の発現効率を高めるWPRE配列を挿入し、緑色蛍光蛋白質（GFP）遺伝子をマーカーに用い、293T細胞に遺伝子導入実験を行った結果、cPPT配列の搭載により遺伝子導入効率が、WPRE配列の搭載により遺伝子発現効率が上昇したことが明らかになった。さらに両者を同時搭載することにより従来のSIVベクターに比べて機能力価で約10倍ベクターの生産性を上昇させた。   Although the present inventor has not conducted a comparative experiment between this enhancer and WPRE, the SIV vector development and hemophilia A gene have been reported in the Comprehensive Research Report of the Health and Labor Sciences Grant-in-Aid for Research on AIDS The following reports have been made by Dynabec Laboratories, Inc. regarding treatment applications. In order to increase the efficiency of the vector itself, the cPPT sequence contained in the SIV genome and the WPRE sequence that increases the expression efficiency of the transgene are inserted into the skeleton sequence of the lentiviral vector in order to increase the efficiency of introduction into the cell. As a result of the gene transfer experiment into 293T cells using the (GFP) gene as a marker, it was revealed that the gene transfer efficiency was increased by loading the cPPT sequence, and the gene expression efficiency was increased by loading the WPRE sequence. Furthermore, the simultaneous loading of both increased the productivity of the vector by about 10 times in functional titer compared to the conventional SIV vector.

本発明の実験例４によると、エンハンサー、cPPT・CTSを含むベクター粒子はコトロールベクター粒子より、機能力価で約９倍になっている。即ち、293T細胞の場合はこのエンハンサーとWPREとは相当なレベルになっている。ヒトリンパ球T細胞の場合はこのエンハンサーはcPPT・CTS、WPREより高い遺伝子導入効率を持つ進歩性で、遺伝子治療における応用がかなり期待される。   According to Experimental Example 4 of the present invention, the vector particle containing the enhancer and cPPT / CTS has a functional titer of about 9 times that of the Cotrol vector particle. That is, in the case of 293T cells, this enhancer and WPRE are at a considerable level. In the case of human lymphocyte T cells, this enhancer is an inventive step with higher gene transfer efficiency than cPPT, CTS and WPRE, and is expected to be applied in gene therapy.

ジーントランスファーベクター、パッケージングベクターおよびVSV-G供給ベクターの構造模式図である。FIG. 3 is a structural schematic diagram of a gene transfer vector, a packaging vector, and a VSV-G supply vector. 各ジーントランスファーベクターの（ａ）ウイルス液７０μＬのｐ24蛋白質の発現量（ｂ）ウイルス液１mLあたりに換算した際のｐ24蛋白質の発現量の平均を示すグラフである。It is a graph which shows the average of the expression level of (a) 70 microliters p24 protein expression level of each gene transfer vector, and (b) p24 protein expression level when converted per 1 mL of virus liquid. 各ジーントランスファーベクターの（ａ）１０００ｐｇあたりの力価、（ｂ）１ｍｌあたりに換算した力価を示すグラフである。It is a graph which shows (a) titer per 1000pg of each gene transfer vector, and (b) titer converted per ml. マウスSpleen matureB細胞への遺伝子導入及びフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。It is a graph which shows the analysis result by the gene transfer to a mouse | mouth Spleen mature B cell, and a flow cytometer. マウスSpleen mature Ｔ細胞への遺伝子導入及びフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。It is a graph which shows the analysis result by the gene transfer to a mouse | mouth Spleen mature T cell, and a flow cytometer. ３時間および２４時間感染の条件におけるマウスSpleen mature B細胞への遺伝子導入及びフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。It is a graph which shows the analysis result by the gene transfer to the mouse | mouth Spleen mature B cell in the conditions of 3 hours and 24 hours infection, and a flow cytometer.

Claims (7)

配列番号１、配列番号２または配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡからなるエンハンサーと、ｃＰＰＴと、ＣＴＳとを含む組み替えウィルスベクターであって、レトロウィルスベクターであることを特徴とするベクター。A recombinant virus vector comprising an enhancer comprising a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, cPPT, and CTS, wherein the vector is a retrovirus vector. 導入遺伝子のためのプロモーターとして、ＣＭＶプロモーターを含む請求項１または２記載のベクター。The vector according to claim 1 or 2, comprising a CMV promoter as a promoter for the transgene. 遺伝子の転写を開始するプロモーターの前、または遺伝子の３’側に前記エンハンサーを挿入した請求項１または２記載のベクター。 The vector according to claim 1 or 2, wherein the enhancer is inserted in front of a promoter that initiates gene transcription or 3 'to the gene. レンチウィルスベクターである請求項１〜３のいずれか一項記載のベクター The vector according to any one of claims 1 to 3, which is a lentiviral vector. ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）ベクターである請求項１〜４のいずれか一項記載のベクター。 The vector according to any one of claims 1 to 4, which is a human immunodeficiency virus (HIV) vector . サル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）ベクターである請求項１〜４のいずれか一項記載のベクター。 The vector according to any one of claims 1 to 4, which is a simian immunodeficiency virus (SIV) vector . gag、polを含むプラスミド、revを発現するプラスミド、VSV-Gを供給するためのプラスミド、および、配列番号１、配列番号２または配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡからなるエンハンサーと、ｃＰＰＴと、ＣＴＳとを含むプラスミドから構成されるレンチウィルスベクターシステム。an enhancer comprising a plasmid containing gag, pol, a plasmid expressing rev, a plasmid for supplying VSV-G, and a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, and cPPT And a Lentiviral vector system comprising a plasmid containing CTS.
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