JP4746537B2 - グアニンヌクレオチド交換因子をコードする遺伝子およびその遺伝子産物 - Google Patents
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本明細書においては、単離された完全長DNAおよび/またはRNA;合成完全長DNAおよび/またはRNA;単離されたDNAオリゴヌクレオチド類および/またはRNAオリゴヌクレオチド類;あるいは合成DNAオリゴヌクレオチド類および/またはRNAオリゴヌクレオチド類を意味する総称的用語として「ポリヌクレオチド」という用語を使用し、ここでそのようなDNAおよび/またはRNAは最小サイズが2ヌクレオチドである。
本発明の一態様は新規ポリヌクレオチドに関する。本ポリヌクレオチドは、ヒト脳由来長鎖cDNAライブラリーから、Rho−GEFに特徴的なドメインであるDH/PHドメインをコードする領域を有する遺伝子として同定した。ヒト脳由来長鎖cDNAライブラリーは、市販のヒト脳、胎児脳および脳海馬由来のpolyA+RNAを出発原料として常法により構築したcDNAライブラリーについてdbEST(database of Expressed Sequence Tags)分析によりcDNA断片を単離して全塩基配列を決定したcDNAクローンからなるcDNAライブラリーである。
本発明の一態様は、本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換えベクターに関する。本組換えベクターは、本ポリヌクレオチドを適当なベクターDNAに挿入することにより取得できる。
本発明の一態様は、本発明に係る組換えベクターにより、宿主を形質転換して得られる形質転換体に関する。本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターを導入した形質転換体は、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の製造に有用である。本形質転換体には、本ポリヌクレオチド以外の所望の遺伝子を含有するベクターDNAの1種類または複数種類をさらに導入できる。本ポリヌクレオチド以外の所望の遺伝子を含有するベクターDNAとして、例えば、RhoA、Rac1またはCdc42等のRhoファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含有するベクターDNAが挙げられる。本ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターとRhoファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターとにより形質転換して得られる形質転換体は、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質によるRhoファミリー蛋白質の活性化促進を阻害する化合物の同定方法に使用できる。このような形質転換として好ましくは、本発明に係る組換えベクターとCdc42をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターとにより形質転換して得られる形質転換体が挙げられる。
本発明の一態様は、本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質に関する。
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質の製造方法に関する。本蛋白質は、例えば本蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法(非特許文献9、10、12および13等を参照)により取得可能である。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドの発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞から常法に従ってcDNAライブラリーをまず調製する。次いで、本蛋白質をコードする遺伝子に選択的にハイブリダイゼーションするプライマーを用いて、該cDNAライブラリーから本ポリヌクレオチドを増幅する。得られたポリヌクレオチドの発現誘導を公知の遺伝子工学的手法を利用して行うことにより、本蛋白質を取得できる。
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質を認識する抗体に関する。本抗体は、本蛋白質を抗原として用いて作製できる。抗原として、本蛋白質およびその断片のいずれを用いることもできる。断片を用いるときは、該断片は少なくとも8個、好ましくは少なくとも10個、より好ましくは少なくとも12個、さらに好ましくは15個以上のアミノ酸で構成される。本蛋白質に特異的な抗体を作成するためには、本蛋白質に固有なアミノ酸配列からなる領域を抗原として用いることが好ましい。この領域のアミノ酸配列は、必ずしも該蛋白質またはその断片のアミノ酸配列と同一である必要はなく、その立体構造上の外部への露出部位が好ましい。露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。本抗体は本蛋白質を特異的に認識する抗体であればいずれであってもよく、特に限定されない。本蛋白質を特異的に認識するとは、本蛋白質を認識する、例えば本蛋白質に結合するが、本蛋白質以外の蛋白質は認識しないか、弱く認識することを意味する。認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応により決定できる。
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質の機能を阻害する化合物、あるいは本発明に係るポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法に関する。本同定方法は、本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体または抗体のうち少なくともいずれか1種類を用いて、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施できる。本同定方法は、インビトロまたはインビボで実施されるいずれの方法も包含する。本同定方法により、本蛋白質の立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現の阻害剤の選別、または抗体を利用した抗体認識物質の選別等が実施できる。
本発明に係る同定方法により得られた化合物は、本発明に係る蛋白質の機能、例えばRhoファミリー蛋白質の活性化を促進する機能の阻害剤や拮抗剤等の候補化合物として利用できる。また、本発明に係るポリヌクレオチドの発現阻害剤の候補化合物として利用できる。これら候補化合物は、その有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより医薬として調製でき、ゆえに本蛋白質の機能の異常および/または本ポリヌクレオチドの発現の異常に起因する各種病的症状の防止効果および/または治療効果を期待できる。また、本発明に係る化合物は、本同定方法以外の方法により得られた化合物であって、本蛋白質の機能を阻害するおよび/または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物も含まれる。
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質、ポリペプチド、組換えベクター、形質転換体、抗体、または化合物を有効成分として含み、本蛋白質の機能および/または本ポリペプチドの発現を阻害するまたは拮抗することに基づく医薬または医薬組成物に関する。
本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、抗体または化合物は、それ自体を、診断マーカーや診断試薬等の疾患診断手段として使用できる。
ヒトの脳、胎児脳および脳海馬由来のpolyA+RNA(Clontech社製:カタログNo.6516−1、6525−1および6578−1)を出発原料として常法によりcDNAライブラリーを構築し、dbEST分析によりcDNA断片を単離してcDNAクローンの塩基配列を決定した。具体的には、小原らの方法(非特許文献19)に従って調製した上記ヒト脳由来のcDNAライブラリーから、約50,000個の組換え体をランダムに選択し、このうち約30,000個のクローンのcDNAについて、その5′末端および3′末端の塩基配列を決定した。さらに約1,100個のクローンを主にインビトロの転写翻訳実験により選択し、それらcDNAの塩基配列を小原らの方法に従って決定した。
実施例1で同定したクローンhj03796を用いて、該クローンがコードする蛋白質をFLAG−tag融合蛋白質として293EBNA細胞(Invitrogen社製)で発現させた。また、クローンhj03796がコードする蛋白質の部分配列からなりDH/PHドメインを含む蛋白質を293EBNA細胞を用いて発現させた。発現の確認はウエスタンブロット法により行った。
実施例2で構築したhj03796DH/PH(C末端FLAG−tag融合蛋白質)発現ベクターを用いて、hj03796DH/PHとRhoファミリー蛋白質との結合について、プルダウン法により検討した。
Cdc42、RhoAまたはRac1の発現ベクターはゲートウェイTMクローニングテクノロジー(Invitrogen社製)を用いて作製した。まず、Multiple Tissue cDNA Panels(Clontech社製)のスプリーンファーストストランドDNA(spleen first strand DNA)をテンプレートとして、pfu turboを用いて各Rhoファミリー蛋白質(Cdc42、RhoAおよびRac1)をコードする遺伝子を増幅した。増幅産物を、TOPO cloning systemを用いた反応にてpENTR/Dに挿入してエントリーベクターを作製した。増幅反応にはプライマーとして、Cdc42遺伝子に対してはCdc42−s1(配列番号13)およびCdc42−as1(配列番号14)、RhoA遺伝子に対してはRhoA−s1(配列番号15)およびRhoA−as1(配列番号16)、Rac1遺伝子に対してはRac1−s1(配列番号17)およびRac1−as1(配列番号18)を使用した。次に、構築したエントリーベクターについて、N末端GST−tag融合蛋白質発現ベクターであるpDEST27を用いてLRクロナーゼによる組換え反応よりGST融合Rhoファミリー蛋白質発現プラスミドを作製した。各遺伝子のコード領域の塩基配列が正しく挿入されていることをシーケンスを行って確認した。シーケンス反応はDYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit(Amersham Biosciences社製)を、泳動および解析はABI PRISM 377を用いて行なった。
hj03796DH/PHのRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を、実施例2で構築したhj03796DH/PH(C末端FLAG−tag融合蛋白質)発現ベクターを用いて、エフェクタープルダウン法により検討した。Rhoファミリー蛋白質として、Cdc42、RhoAおよびRac1を用いた。これらRhoファミリー蛋白質はいずれもN末端3×FLAG−tag融合蛋白質として発現させた。
配列番号1:(602):(1126)Dbl相同ドメインをコードする領域。
配列番号1:(1202):(1495)プレックストリン相同ドメインをコードする領域。
配列番号3:配列番号1の第581番目から第1675番目までのヌクレオチドからなる部分配列であって、Dbl相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメインをコードする領域を含むポリヌクレオチドであり、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号4に記載のアミノ酸配列をコードする。
配列番号5:5´末端にコザックコンセンサス配列とメチオニンに対応するコドンとを有し、それに続いて、配列番号1の第581番目から第1675番目までのヌクレオチドからなる部分配列であってDbl相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメインをコードする領域を含む配列を有するポリヌクレオチドであり、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号6に記載のアミノ酸配列をコードする。
配列番号5:(1):(4)コザックコンセンサス配列。
配列番号5:(5):(7)メチオニンに対応するコドン。
配列番号7:プライマー用に配列番号1の配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号8:プライマー用に配列番号1の配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号9:プライマー用に配列番号1の配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号10:プライマー用に配列番号1の配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号11:プライマー用にproto−Dblの配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号12:プライマー用にproto−Dblの配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号13:プライマー用にCdc42の配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号14:プライマー用にCdc42の配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号15:プライマー用にRhoAの配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号16:プライマー用にRhoAの配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号17:プライマー用にRac1の配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号18:プライマー用にRac1の配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号19:コザックコンセンサス配列とそれに続くメチオニンに対応するコドンを含む設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号20:Cdc42遺伝子。
配列番号21:Cdc42
配列番号22:RhoA遺伝子
配列番号23:RhoA
配列番号24:Rac1遺伝子
配列番号25:Rac1
配列番号26:proto−Dbl(配列番号27)をコードする遺伝子。
Claims (17)
- 配列表の配列番号1に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド。
- 配列表の配列番号3若しくは5に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号4若しくは6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド。
- 配列表の配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、または配列表の配列番号4に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドであって、Cdc42の活性化を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
- 配列表の配列番号1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドにおいて1乃至数個のヌクレオチドの変異または誘発変異を有するポリヌクレオチドであって、Cdc42の活性化を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
- 配列表の配列番号1に記載の塩基配列に相補的な塩基配列で表わされるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドであって、Cdc42の活性化を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1から5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
- 請求項6に記載の組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体。
- 請求項6に記載の組換えベクターおよびCdc42をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体。
- 配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質。
- 配列表の配列番号4または6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質。
- 請求項3から5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質。
- 請求項7または8に記載の形質転換体を培養し、次いで得られた培養物から請求項9から11のいずれか1項に記載の蛋白質を回収する工程を含む、請求項9から11のいず
れか1項に記載の蛋白質の製造方法。 - 請求項9から11のいずれか1項に記載の蛋白質の機能および/または請求項1から5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物と該蛋白質および/または該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該蛋白質の機能および/または該ポリヌクレオチドの発現の存在、不存在または変化を検出することにより、該化合物が該蛋白質の機能および/または該ポリヌクレオチドの発現を阻害するか否かを判定すること、並びに該タンパク質の機能がCdc42の活性化を促進する機能であることを特徴とする同定方法。
- 請求項13に記載の同定方法であって、請求項9から11のいずれか1項に記載の蛋白質、請求項1から5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項6に記載の組換えベクター、請求項7または8に記載の形質転換体、および前記蛋白質を特異的に認識する抗体のうち少なくともいずれか1つを用いることを特徴とする同定方法。
- 被検組織がヒト胃腫瘍由来組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における請求項1から5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする方法。
- 被検組織における請求項1から5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの発現量が、対照であるヒト正常胃由来組織における該ポリヌクレオチドの発現量の4.5倍以上である場合に、被検組織がヒト胃腫瘍由来組織であると判定することを特徴とする、請求項15に記載の方法。
- 請求項9から11のいずれか1項に記載の蛋白質、請求項1から5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項6に記載の組換えベクター、および請求項7または8に記載の形質転換体のうち少なくともいずれか1つを含んでなる試薬キット。
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