JP4745237B2 - パリエタリアジュダイカの主要アレルゲンの低アレルギー性変異体、その使用およびそれらを含む組成物 - Google Patents
パリエタリアジュダイカの主要アレルゲンの低アレルギー性変異体、その使用およびそれらを含む組成物 Download PDFInfo
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野生型Parj1およびParj2のクローニングおよび発現
Pjの主要アレルゲンParj1を生成するために、pQE30原核生物ベクター(Qiagen)を使用した。このベクターは、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)によって誘導的な方法で、短いヒスチジン尾部と融合した組換えタンパク質を発現することができる。ヒスチジン残基は、親和性クロマトグラフィーによる組換えタンパク質の精製を可能にする。処理型Parj1(EMBL受託番号X77414)を含むP5クローンに、条件:94℃で1分間、52℃で1分間、72℃で1分間、30サイクルの下でDNAポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の1サイクルを施した。使用した合成オリゴヌクレオチドは以下のものであった:
Parj1およびParj2の点突然変異体を、これらのアレルゲンの野生型バージョンをコードする前に記載したcDNAを、鋳型として使用してPCRによって作製した。特に、Pj1ループクローン用に、以下のオリゴヌクレオチドを使用して:
主要アレルゲンParj1およびParj2に関する遺伝情報を含むヘテロ二量体分子を構築するために、合成オリゴヌクレオチド:
Parj2三量体を構築するために、プラスミドベクターpQE31、Parj2組換えタンパク質をコードするDNA、および大腸菌のXLIblue細菌菌株を使用した。4つの制限エンドヌクレアーゼBamHI、SacI、SalIおよびHindIIIを使用した。
それぞれ100μ/mlおよび10μg/mlの最終濃度でアンピシリンおよびカナマイシンを含む400mlの2YTの培養培地に接種するために、10mlのo/n培養物を使用した。攪拌下で37℃において培養物を増殖させた。2時間後、IPTGを1mMの最終濃度で培養物に加え、攪拌下で37℃において4時間、培養物を増殖させた。このステップの最後に、細菌の培養物を5000rpmで15分間遠心分離にかける。ペレットは開始バッファー(10mMのリン酸ナトリウムpH7.4および6M尿素)に懸濁させ、細胞は超音波処理する。次いで溶解物を14.000rpmで30分間遠心分離にかけ、浄化した溶解物をCMセファロース(Pharmacia)カラムに充填した。タンパク質はNaClの不連続勾配を使用して希釈し、当該のタンパク質を含む分画を、10mMのリン酸ナトリウムpH7.4および1MのNaClを含むバッファーに対して2時間透析して、本来の三次元構造を形成させる。次いで組換えタンパク質を、製造者の教示書に従いHis Trapカラム(Amersham)を使用して最終的に精製した。希釈した分画は次いで16%ポリアクリルアミドゲル上で分析し、組換えタンパク質を含む分画は、ブラッドフォード法による染色後に分光測光法によって定量的に評価した。最後に、SephadexG-25カラム(Pharmacia)を使用してタンパク質を脱塩した。
ELISA試験をBonura他中に記載されたのと同様に実施した(13)。それぞれのウエルで使用した抗原の濃度は5μg/mlであった。患者(n=8)はパリエタリアジュダイカに対するアレルギーの明らかな病歴を有しており、市販の製品を使用する皮膚試験に対していずれも陽性反応が出た。
ヒスタミン放出アッセイを、アレルギー性被験体から抽出したヘパリン化血液を使用し、0.0001μg/ml〜10μg/mlのアレルゲンの濃度範囲を使用して行った。放出プロトコルは前に記載されたのと同様に実施した(13)。S-アデノシル-L-メチオニン-H3(Amersham、UK)は、オスラットの腎臓から調製したメチルトランスフェラーゼヒスタミン酵素の存在に関する放射能反応マーカーとして使用した。ヒスタミンの合計量は、1体積の0.05Mリン酸バッファーph7.9で希釈した100μg/mlの血液の放射能を、10分間サンプルを煮沸した後に測定することによって計算した。自発的放出は、希釈バッファーの存在下でサンプルをインキュベートすることによって計算した。放出されたヒスタミンの割合は、刺激なしでサンプルによって自発的に放出された割合を引いた後に、放出されたヒスタミンの割合として計算した。
パリエタリアジュダイカ花粉に対するアレルギーは、地中海領域におけるアレルギーの最も一般的な形の1つである。特にParj1およびParj2は、アレルギー反応における2つの主要な役割を担う物質であり、したがってPjアレルギーを治療するための特異的免疫療法において使用するための産物を探索する際の2つの主要な標的となる。この2つの別個のアレルゲンは、それらがns-LTPファミリーに属する点で類似の特性を示す。植物タンパク質のこのファミリーは、構造レベルで特徴付けられてきている。すべてのその要素は、4-52、14-29、30-75、50-91の順で(これらの数字は図1、パネルAに示す成熟Parj1の主要配列を指す)4個のイオウ架橋を形成する8個のシステイン残基によってもたらされる4個のアルファヘリックスを含む非常にコンパクトな構造を有する(図2参照)。以下に記載するすべての戦略は、元の相当物と類似した三次元構造を保ちながら、低いアレルギー誘発能力を有する分子を作製することを目的とする。特に、明確な領域ループ1中に含まれる(図1、図2、図3参照)Parj1およびParj2のアミノ酸Lys23、G1u24、Lys27の部位特定突然変異誘発によって、それらはヒトIgEとの結合能力に大きく影響を与えることができることが示された。図5では、ELISA分析が、Pj1ループおよびPj2ループ突然変異体に関するIgE結合が著しく減少し、非アレルギー性患者の血清のレベルに匹敵する活性レベルに達することを実証する。図6は、Pjアレルギー患者(n=5)の全血を多量のPj1ループまたは野生型突然変異体と共にインキュベートするときの、ヒスタミン放出概略を示す。これらの患者の40%は、放出の割合は野生型分子によって放出された割合より低かった(図6、パネルCおよびE)。残りの患者は、野生型分子のそれに匹敵する概略を有する、ある程度不均一な応答を示した。この型の突然変異誘発は、タンパク質の一般的構造に干渉しないようである。図7は、Pj1野生型分子を用いた免疫処置によって得られたポリクローナルウサギ抗体と結合するそれらの能力に関して、野生型PjとPj1ループを比較したELISA試験を示す。この分析はPj1ループ分子に関する高い割合の結合も示し、本来の分子のドメインに匹敵する多数のタンパク質構造ドメインの持続性を実証する。
Claims (8)
- 第1のアミノ酸配列、第2のアミノ酸配列、および、もし存在するならば、第3のアミノ酸配列を含む多量体タンパク質分子であって、
第1のアミノ酸配列、第2のアミノ酸配列、および第3のアミノ酸配列が、相互に独立に、パリエタリアジュダイカの主要アレルゲンParj1、パリエタリアジュダイカの主要アレルゲンParj2、Parj1のループ1のアミノ酸領域中に突然変異を含むParj1変異体、およびParj2のループ1のアミノ酸領域中に突然変異を含むParj2変異体からなる群より選択される配列からなり、
もし第3のアミノ酸配列が存在する場合、第1のアミノ酸配列、第2のアミノ酸配列、および第3のアミノ酸配列は同時に同一の配列ではなく、
もし第3のアミノ酸配列が存在しない場合、第1のアミノ酸配列、および第2のアミノ酸配列は同時に同一の配列ではなく、
主要アレルゲンParj1の配列が配列番号1の配列であり、主要アレルゲンParj2の配列が配列番号3の配列であり、かつ
Parj1変異体の配列が配列番号2の配列であり、Parj2変異体の配列が配列番号4の配列である、多量体タンパク質分子。 - 第1のアミノ酸配列、第2のアミノ酸配列、および第3のアミノ酸配列のうち少なくとも一つが、Parj1変異体、またはParj2変異体の配列である、請求項1に記載の多量体タンパク質分子。
- 請求項1または2に記載の多量体タンパク質分子をコードする核酸。
- 適切な転写プロモーター系の制御下において請求項3に記載の核酸を含む、原核細胞中での発現用の組換えベクター。
- 適切な転写プロモーター系の制御下において請求項3に記載の核酸を含む、真核細胞中での発現用の組換えベクター。
- 医療に使用するための、請求項1または2に記載の多量体タンパク質分子。
- 低アレルギー性物質として医療に使用するための、請求項1または2に記載の多量体タンパク質分子。
- 有効かつ許容可能な量の請求項1または2に記載の多量体タンパク質分子ならびに適切なアジュバントおよび/または希釈剤を含む医薬組成物。
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