JP4740700B2

JP4740700B2 - Biological material analysis chip, biological material analysis kit, and biological material analysis method using these

Info

Publication number: JP4740700B2
Application number: JP2005268092A
Authority: JP
Inventors: 和宣岡野; 賢二安田
Original assignee: On-chip Cellomics Consortium; Ulvac Inc
Current assignee: On-chip Cellomics Consortium; Ulvac Inc
Priority date: 2005-09-15
Filing date: 2005-09-15
Publication date: 2011-08-03
Anticipated expiration: 2025-09-15
Also published as: JP2007078553A

Description

本発明は細胞ないし細胞集合体である組織で発現している遺伝子産物であるｍＲＮＡないしタンパク質を定量的に計測するための生体物質解析チップ、生体物質解析キットおよび方生体物質解析法に関する。 The present invention relates to a biological material analysis chip, a biological material analysis kit, and a method for analyzing biological material for quantitatively measuring mRNA or protein which is a gene product expressed in a cell or a cell aggregate tissue.

ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有効である。遺伝子の発現状況を調べるには遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを調べる方法とｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質を調べる方法がある。ｍＲＮＡを調べる有力な方法として、固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に区分けして固定したＤＮＡプローブアレー、あるいはＤＮＡプローブチップ（実際には固定されているのはオリゴヌクレオチドの誘導体であるのでオリゴチップと呼ぶこともある）がある。ＤＮＡプローブアレーを用いるｍＲＮＡ検査では、予め十分多量な細胞検体からＲＮＡ成分を抽出し、リバーストランスクリプターゼによる逆転写反応でｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅やｃＲＮＡ合成により増幅を行う。また相補鎖合成時に標識ｄＮＴＰを取り込ませて多量の標識ＤＮＡ鎖を得る。最近ではアミノアリルｄＮＴＰを取り込ませて、その後にアミノ基に蛍光色素を反応させて蛍光標識ＤＮＡ鎖を得る方法が主流となっている。このようにして得られた蛍光標識ＤＮＡ鎖をいわゆるＤＮＡプローブアレーとハイブリダイズさせて各種発現遺伝子の解析を行う。ＤＮＡプローブアレー上には通常数十から１５０μｍφの微小スポット状に高密度にＤＮＡプローブを固定して標的ｃＤＮＡ捕捉速度を高め、高感度検出ができるようにしている。 Along with the progress of the genome project, the movement to understand living organisms at the DNA level, to diagnose diseases and to understand life phenomena has become active. It is effective to investigate the expression status of genes in order to understand life phenomena and investigate the functions of genes. There are two methods for examining the gene expression status: a method of examining mRNA which is a transcription product of a gene and a method of examining a protein translated from the mRNA. A promising method for examining mRNA is a DNA probe array in which a large number of DNA probes are divided and fixed on a solid surface, or a DNA probe chip (because it is actually a derivative of an oligonucleotide. Sometimes called an oligo chip). In an mRNA test using a DNA probe array, RNA components are extracted from a sufficiently large amount of cell specimens in advance, cDNA is synthesized by a reverse transcription reaction using reverse transcriptase, and amplified by PCR amplification or cRNA synthesis. In addition, a labeled dNTP is incorporated during complementary strand synthesis to obtain a large amount of labeled DNA strand. Recently, a method in which aminoallyl dNTP is incorporated and then a fluorescent dye is reacted with an amino group to obtain a fluorescently labeled DNA strand has become the mainstream. The fluorescently labeled DNA strand thus obtained is hybridized with a so-called DNA probe array to analyze various expressed genes. On the DNA probe array, DNA probes are usually fixed at a high density in the form of small spots of several tens to 150 μmφ so as to increase the target cDNA capture speed and enable high-sensitivity detection.

ＤＮＡチップを作るには光化学反応と半導体工業でよく用いられるリソグラフィーを用いて区画された多数のセルに設計された配列のオリゴマーを一塩基ずつ合成して行く方法（非特許文献１：Science 251, 767-773(1991)）、あるいはＤＮＡプローブやタンパク質プローブを各区画に一つ一つ植え込んでいく方法（非特許文献２：Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918 (1996)）などがある。 In order to make a DNA chip, a method of synthesizing oligomers of sequences designed in a large number of partitioned cells one by one using photochemical reaction and lithography often used in the semiconductor industry (Non-patent Document 1: Science 251, 767-773 (1991)), or a method of implanting DNA probes and protein probes one by one in each compartment (Non-patent Document 2: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918 (1996)) and so on.

これらチップは、いずれもスライドガラスなどの平面上に多数のプローブをアレイ状に整列させた構造をしている。どのプローブがどの位置にあるかは、プローブが固定されている物理的な位置のみでインデクシングされるのが一般的である。検出には、ＤＮＡチップの類では標識物に蛍光色素を用いるケースが圧倒的に多いが、電気化学発光を用いるケースやDedox（酸化還元）反応を用いて電気信号として検出する方法も実用化している。 Each of these chips has a structure in which a large number of probes are arranged in an array on a flat surface such as a slide glass. In general, which probe is located at which position is indexed only at a physical position where the probe is fixed. In the case of DNA chips, fluorescent dyes are predominantly used for labeling in the case of DNA chips. However, there are cases where electrochemiluminescence is used and a method for detecting an electrical signal using a Dedex (redox) reaction has been put into practical use. Yes.

ＤＮＡプローブのかわりに抗体や抗原を基板上にアレイ状に固定したプロテインチップの概念も実用化されている。基板上にアレルギーを起こす数十から数百の抗原（アレルゲン）を固定したデバイスに検体血清を反応させ、各抗原と抗原抗体反応を起こす血清中に存在するＩｇＭを特異的に捕捉し、ＩｇＭに結合する酵素標識２次抗体を反応させ、酵素活性を化学発光と組み合わせることで測定して、アレルゲンを検出するアレルゲン検査用のシステムが医療検査用に実用化されている。プロテインチップにおいても、高感度検出を行うために固体表面に抗体や抗原を高密度に固定することで測定対象物質の捕捉速度を高めている。 A protein chip concept in which antibodies and antigens are immobilized on a substrate in an array instead of a DNA probe has been put into practical use. The sample serum is reacted with a device in which several tens to several hundreds of antigens (allergens) that cause allergies are immobilized on the substrate, and IgM present in the serum that causes an antigen-antibody reaction with each antigen is specifically captured, and IgM An allergen test system that detects an allergen by reacting a bound enzyme-labeled secondary antibody and measuring enzyme activity in combination with chemiluminescence has been put to practical use for medical tests. Also in protein chips, in order to perform high-sensitivity detection, the capture speed of the measurement target substance is increased by immobilizing antibodies and antigens on the solid surface at a high density.

プロテインチップ上に捕捉した測定対象物質の検出には、酵素標識物を用いて化学発光ないし生物発光の系で検出するケースが多い。そのほか、蛍光標識検出や、電気化学発光検出、質量分析器による分析を行うケースと多様な方法が実用化されている。 In many cases, a substance to be measured captured on a protein chip is detected by a chemiluminescence or bioluminescence system using an enzyme label. In addition, various methods such as fluorescent label detection, electrochemiluminescence detection, and mass spectrometer analysis have been put into practical use.

電気化学発光法では、電極表面に抗原捕捉用の抗体が存在する。サンドイッチ用抗体の標識物にはルテニウム錯体を用いる（非特許文献３：Clin. Chem., 37, 1534-1539 (1991)）。電極表面ではルテニウムが酸化され、ＴＰＡのレドックス反応とカップルさせて還元するときに励起状態となったルテニウムの電子が基底状態に落ちる時に光を発する。 In the electrochemiluminescence method, an antigen capturing antibody is present on the electrode surface. A ruthenium complex is used as the label for the sandwich antibody (Non-patent Document 3: Clin. Chem., 37, 1534-1539 (1991)). Ruthenium is oxidized on the electrode surface, and emits light when the ruthenium electrons, which are excited when they are reduced by being coupled with the redox reaction of TPA, fall to the ground state.

本発明に関連するところでは、生体物質検出法の一つでプロテインチップと類似の技術であるサンドイッチイムノアッセイ法において、標識物に粒子を用いて測定対象物質を分子計数する方法が報告されている（非特許文献４：Analytical Biochemistry 202，120−125 (1992)）。 In the context of the present invention, a sandwich immunoassay method, which is one of the biological material detection methods and a technique similar to protein chips, has reported a method of molecularly counting a measurement target substance using particles as a label ( Non-patent document 4: Analytical Biochemistry 202, 120-125 (1992)).

Science 251, 767-773(1991)Science 251, 767-773 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918 (1996) Clin. Chem., 37, 1534-1539 (1991)Clin. Chem., 37, 1534-1539 (1991) Analytical Biochemistry 202，120−125 (1992）Analytical Biochemistry 202, 120-125 (1992)

上記従来技術では、ＤＮＡプローブチップあるいはプロテインチップを用いる遺伝子転写産物であるｍＲＮＡや翻訳産物であるタンパク質の識別や検出法に関してはよく検討されており、何らかの方法で溶液状の試料が準備できていればそれなりに測定ができる。また、出願人の一人により特許出願されている特願２００４−２２６３６１、特願２００４−２９７１９４あるいは特願２００４−３１８７７０に開示されているように、ｍＲＮＡやＤＮＡマイクロアレイの分野においてもナノ粒子を用いて解析する方法が提案されている。 In the above prior art, the identification and detection of mRNA, which is a gene transcription product using a DNA probe chip or protein chip, and the protein, which is a translation product, are well studied, and a solution sample can be prepared by any method. You can measure as it is. Further, as disclosed in Japanese Patent Application No. 2004-226361, Japanese Patent Application No. 2004-297194 or Japanese Patent Application No. 2004-318770 filed by one of the applicants, using nanoparticles in the field of mRNA and DNA microarray A method of analysis has been proposed.

しかしながら、生体物質を基板上に捕捉するための親和性プローブ（以下生体物質に結合して何らかの情報を得るために使われる物質の総称を親和性プローブと呼ぶことにする）はＤＮＡプローブや抗体などの生体有機物であるので、これらの固定にはガラスやシリコンの基板と生体有機物を固定する上で下記の問題がある。すなわち、
１）親和性プローブを基板上に固定するために物理的な吸着や共有結合形成を用いるが、吸着反応と共有結合反応のいずれも基板表面の状態に依存するために均一な固定が困難であるケースが多い。
２）親和性プローブの基板上への固定の立体方向の制御ができない。すなわち、溶液中の測定対象生体物質を捕捉するための親和性部位を測定対象生体物質と反応する方角に向けて固定することが難しい。このため、親和性プローブ自身の立体障害で測定対象の捕捉量が低下する。
３）親和性プローブの密度がコントロールできない。一般的に、固定時の親和性プローブ濃度や固定時間をコントロールすることで任意の密度の親和性プローブを固定した基板が得られると思われがちであるが、実際には制御が難しいことが多い。非特許文献４では、親和性プローブの固定時にこれとは異なる生体物質を共存させて実際の親和性プローブ固定密度をコントロールしている。親和性プローブを希薄状態で基板表面に固定しようとすると、島状に密度の高いところと周りの密度の薄いところができてしまう。
４）あるいは、上記１）から３）の問題に関連するが、親和性プローブの固定エリアが狭くなると各エリアで親和性プローブの固定量が異なるようになり、定量的な測定に害を及ぼす可能性がある。さらに、親和性プローブの固定エリアが狭くなると蛍光法のように親和性プローブエリア全体の蛍光強度を測定し、その蛍光強度を基に試料中の目的生体物質の量を定量解析することができなくなる。このために、上記非特許文献４あるいは特許出願発明のように基板上に捕捉した目的生体物質にナノ粒子を結合させてこれを計数する方法を取るわけであるが、親和性プローブが均一についていないと、部位ごとに結合するナノ粒子の数が異なることになり、計数による定量検出精度が当然低下することになる。 However, affinity probes for capturing biological substances on a substrate (hereinafter generic names of substances used to bind biological substances to obtain some information are called affinity probes) are DNA probes, antibodies, etc. Therefore, there are the following problems in fixing the glass and silicon substrates and the biological organic matter. That is,
1) Physical adsorption or covalent bond formation is used to immobilize the affinity probe on the substrate, but since both the adsorption reaction and the covalent bond reaction depend on the state of the substrate surface, uniform immobilization is difficult. There are many cases.
2) The stereo direction of the affinity probe immobilized on the substrate cannot be controlled. That is, it is difficult to fix the affinity site for capturing the measurement target biological material in the solution toward the direction of reaction with the measurement target biological material. For this reason, the capture amount of a measuring object falls by the steric hindrance of an affinity probe itself.
3) The density of the affinity probe cannot be controlled. In general, it tends to be thought that a substrate on which an affinity probe of an arbitrary density is fixed can be obtained by controlling the affinity probe concentration and fixing time at the time of fixation, but in practice it is often difficult to control. . In Non-Patent Document 4, the actual affinity probe immobilization density is controlled by coexisting a biological substance different from this when immobilizing the affinity probe. If the affinity probe is fixed to the substrate surface in a dilute state, an island-like portion having a high density and a surrounding portion having a low density are formed.
4) Or, related to the problems 1) to 3) above, if the affinity probe fixation area becomes narrow, the amount of affinity probe fixation varies in each area, which may harm quantitative measurement. There is sex. Furthermore, if the affinity probe fixing area becomes narrow, the fluorescence intensity of the entire affinity probe area can be measured as in the fluorescence method, and the amount of the target biological substance in the sample cannot be quantitatively analyzed based on the fluorescence intensity. . For this reason, as in the non-patent document 4 or the patent application invention, a method is used in which nanoparticles are bound to the target biological substance captured on the substrate and counted, but the affinity probe is not uniform. As a result, the number of nanoparticles that bind to each site differs, and the quantitative detection accuracy by counting naturally decreases.

基板に固定する親和性プローブ密度には最適条件が存在する。このために、親和性プローブ密度を任意にコントロールする必要性が出てくる。 There is an optimum condition for the density of the affinity probe immobilized on the substrate. For this reason, it becomes necessary to arbitrarily control the affinity probe density.

従来のプローブ固定法ではシランカップリング反応を用いて無機質であるガラスやシリコンウエハー表面に官能性残基を導入し、この官能性残基に親和性プローブを固定する方法が多用されている。しかしながらシランカップリング反応は、基板の表面状態に依存し、必ずしも均一に親和性プローブを固定する方法として最適なものではない。 In the conventional probe immobilization method, a method in which a functional residue is introduced onto the surface of an inorganic glass or silicon wafer by using a silane coupling reaction and an affinity probe is immobilized on the functional residue is often used. However, the silane coupling reaction depends on the surface state of the substrate and is not necessarily the optimum method for fixing the affinity probe uniformly.

本発明の目的は、親和性プローブを基板表面により均一な密度で固定することで微小な領域で、定量測定を行うことのできる生体物質解析チップとこれを用いる生体物質解析キットおよびこれらを用いる生体物質解析法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a biological material analysis chip capable of performing quantitative measurement in a minute region by fixing the affinity probe to the substrate surface at a uniform density, a biological material analysis kit using the same, and a biological material using these It is to provide a material analysis method.

本発明では、ガラスやシリコン基板表面のＳｉ−ＯＨないしＳｉ＝Ｏあるいは、金属表面のＭｅ−ＯＨやＭｅ＝Ｏ（Ｍｅ：金属原子）のような残基に直接反応するようなシランカップリングを用いることはしない。このような表面に存在する−ＯＨや＝Ｏ残基は表面状態により存在する量が異なるので、本質的に均一な活性基を導入することが困難と考えたからである。そこで、基板表面の状態に依存せずに親和性プローブを固定する残基を導入する必要がある。これには、基板表面状態にかかわらず、ポリマー層を基板表面に導入し、このポリマー層が一定間隔で親和性プローブを固定するための官能基を持つように設計すればよい。このとき重要なのは、いかにして親和性プローブを固定するための官能基の間隔をそろえるかである。 In the present invention, Si—OH or Si═O on the surface of glass or silicon substrate, or silane coupling that reacts directly with residues such as Me—OH or Me═O (Me: metal atom) on the metal surface. Do not use. This is because it is considered that it is difficult to introduce an essentially uniform active group because the amount of —OH or ═O residue present on the surface varies depending on the surface state. Therefore, it is necessary to introduce a residue that fixes the affinity probe without depending on the state of the substrate surface. For this purpose, a polymer layer may be introduced to the substrate surface regardless of the substrate surface state, and the polymer layer may be designed to have a functional group for fixing the affinity probe at regular intervals. What is important at this time is how to align the spacing of the functional groups for immobilizing the affinity probe.

すなわち、２種類のモノマーを重合させて調製するポリマー層でできた重合生成薄膜を有するものを作成することとする。これは、前記ポリマー層が重合用の第１の官能基を２箇所に有する第１のモノマーと重合用の第２の官能基を２箇所に有する第２のモノマーを交互に配するように重合した構造で、前記第１のモノマーおよび前記第２のモノマーの片方に親和性プローブ結合残基を持つ構造をしている。具体的には、基板に第１のモノマーとしてジイソシアナート類と第２のモノマーとしてジアミン類を等モル比で反応させ重合させる。このケースでは、第１の官能基はイソシアナート基、第２の官能基はアミノ基ということになる。ジイソシアナートとしてはたとえばアルキルジイソシアナートやフェニレンジイソシアナート類を用いることができる。また、親和性プローブ結合用にはジイソシアナート類かジアミン類の側鎖に官能基を導入したモノマーを用いればよい。 That is, a film having a polymerized thin film made of a polymer layer prepared by polymerizing two kinds of monomers is prepared. The polymerization is performed so that the polymer layer alternately arranges a first monomer having two first functional groups for polymerization and a second monomer having two second functional groups for polymerization. In this structure, one of the first monomer and the second monomer has an affinity probe binding residue. Specifically, a diisocyanate as a first monomer and a diamine as a second monomer are reacted with each other at an equimolar ratio and polymerized on the substrate. In this case, the first functional group is an isocyanate group, and the second functional group is an amino group. As diisocyanates, for example, alkyl diisocyanates and phenylene diisocyanates can be used. For affinity probe binding, a monomer having a functional group introduced in the side chain of diisocyanate or diamine may be used.

例えば、ジアミン類の側鎖にカルボキシル基を導入したモノマーを用いる。これを基板表面で重合させると、ジイソシアナート類とジアミン類が交互に結合したポリマーが得られる。よってカルボキシル基はジイソシアナート類とジアミン類からなる周期のジアミン部分の側鎖に存在することになる。このため、ポリマー上に一定間隔で親和性プローブを固定することが可能となる。このときの重合生成薄膜はポリ尿素ということになる。重合上条件に関しては、既存の真空蒸着法を用いることができるジイソシアナート類とジアミン類の主鎖の長さを調製することで導入するカルボキシル基の間隔を調製できる。また、これにより、従来は表面に官能基を導入することが困難であった金や白金などの電極上にも自在に官能基を持つ薄膜を形成することができる。 For example, the monomer which introduce | transduced the carboxyl group into the side chain of diamines is used. When this is polymerized on the substrate surface, a polymer in which diisocyanates and diamines are alternately bonded is obtained. Therefore, a carboxyl group exists in the side chain of the diamine part of the period which consists of diisocyanates and diamines. For this reason, it becomes possible to fix the affinity probe on the polymer at regular intervals. The polymerized thin film at this time is polyurea. Regarding the polymerization conditions, the distance between the carboxyl groups to be introduced can be adjusted by adjusting the lengths of the main chains of diisocyanates and diamines, which can use the existing vacuum deposition method. In addition, this makes it possible to freely form a thin film having a functional group on an electrode such as gold or platinum, which has conventionally been difficult to introduce a functional group on the surface.

基板上に導入したカルボキシル基をカルボジイミド系の活性化剤を用いて生体物質捕捉用残基としてアミノ基を有するプローブを直接固定してもよい。あるいは、この側鎖カルボキシル基にジシクロヘキシルカルボジイミド系の活性化剤存在下でエチレンジアミンを反応させると、高収率で側鎖カルボキシル基に一級アミン残基を導入することができる。すなわち基板表面には一級アミンがほぼ一定間隔で並んだ状態となる。次にNucleic Acids Research,27,1970-1977(1999)およびCHEMBIOCHEM2, 686- 694(2001)記載の１，４−フェニレンヂイソチオシアナートで一級アミンを修飾し、表面にイソチオシアナート基を導入する。最後に５’末端にアミノ基を有するＤＮＡプローブ（スペーサー部：５’末端側１０塩基プラスターゲットのｃＤＮＡと反応する部分：平均３２塩基長）を反応させる。この反応条件は上記文献に詳しい。上記方法でＤＮＡプローブが約９ｎｍ間隔で固定された基板が得られる。 A probe having an amino group as a residue for capturing a biological substance may be directly immobilized using a carbodiimide-based activator for the carboxyl group introduced onto the substrate. Alternatively, when this side chain carboxyl group is reacted with ethylenediamine in the presence of a dicyclohexylcarbodiimide-based activator, a primary amine residue can be introduced into the side chain carboxyl group in high yield. That is, primary amines are arranged on the substrate surface at almost regular intervals. Next, the primary amine is modified with 1,4-phenylenediisothiocyanate described in Nucleic Acids Research, 27, 1970-1977 (1999) and CHEMBIOCHEM2, 686-694 (2001), and isothiocyanate groups are introduced on the surface. . Finally, a DNA probe having an amino group at the 5 'end (spacer part: 10 bases on the 5' end side plus a part that reacts with the target cDNA: average length of 32 bases) is reacted. The reaction conditions are detailed in the above literature. By the above method, a substrate on which DNA probes are fixed at intervals of about 9 nm can be obtained.

カルボキシル基をもつポリ尿素を基板上に形成する例のほか、側鎖にプローブとなるポリヌクレオチドやペプチドなどを固定できるような反応基を導入できる残基を周期的に持つポリマーであればいずれも利用することができる。たとえば、２種のモノマーの組み合わせが

や

（Ｒ_１〜Ｒ_３は任意の残基）の構造を有する酸無水物とＮＨ_２−Ｒ_５−ＮＨ_２（Ｒ_５は任意の残基）の構造を有するジアミンモノマーで、Ｒ_５にカルボキシル基を有するジアミノフェニル酢酸モノマーを用いることができる。酸無水物としては、４，４’−ヘキサフルオロイソプロピリデンビスフタル酸無水物のような構造のものを用いることができる。
In addition to the example of forming a polyurea having a carboxyl group on a substrate, any polymer that periodically has a residue capable of introducing a reactive group capable of immobilizing a polynucleotide or peptide as a probe on the side chain can be used. Can be used. For example, a combination of two monomers

And

An acid anhydride having a structure of (R _{1 to} R ₃ is an arbitrary residue) and a diamine monomer having a structure of NH ₂ —R ₅ —NH ₂ (R ₅ is an arbitrary residue), wherein R ₅ is a carboxyl group A diaminophenylacetic acid monomer having can be used. As the acid anhydride, one having a structure such as 4,4′-hexafluoroisopropylidenebisphthalic anhydride can be used.

このようなポリマーは、すなわちポリイミドである。ポリイミドは一般的にこのようなビス無水フタル酸とビスアミノ化合物を用いる。あるいは、たとえば長カルボキシル基を有するジアミノフェニル酢酸あるいは１，１０−ジアミノデカンのような脂肪族ジアミンの脂肪族位置にカルボン酸残基を有するモノマーとジ酸クロリドモノマーであるテレフタロイルジクロリドを蒸着重合により基板上に膜形成を行うポリアミドを利用することができる。プローブ固定用には長鎖脂肪族ジアミンに各種反応性残基を導入しておけばよい。蒸着重合としては既存の方法、たとえば、Jpn. Ｊ. Appl. Phys. 33, L1721-L1724（1994）やThin Solid Films, 215, 94-97 (1992)記載の方法に準じて、使用するモノマーの気化条件を考慮して行えばよい。 Such a polymer is polyimide. Polyimide generally uses such bisphthalic anhydride and a bisamino compound. Alternatively, vapor deposition polymerization of a monomer having a carboxylic acid residue at the aliphatic position of an aliphatic diamine such as diaminophenylacetic acid or 1,10-diaminodecane having a long carboxyl group and terephthaloyl dichloride as a diacid chloride monomer Thus, polyamide that forms a film on the substrate can be used. For the probe immobilization, various reactive residues may be introduced into the long-chain aliphatic diamine. Vapor deposition polymerization is carried out according to existing methods such as those described in Jpn. J. Appl. Phys. 33, L1721-L1724 (1994) and Thin Solid Films, 215, 94-97 (1992). What is necessary is just to consider vaporization conditions.

本発明により、細胞内発現しているｍＲＮＡやタンパク質を分子レベルで検出できるようになる。 According to the present invention, mRNA and protein expressed in cells can be detected at the molecular level.

（実施例１）
図１は本発明を実行するに好適な生体物質解析チップの１例を示す図である。図１（Ａ）は実施例の生体物質解析チップを示す平面図、（Ｂ）は図１（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図である。 Example 1
FIG. 1 is a diagram showing an example of a biological material analysis chip suitable for carrying out the present invention. FIG. 1A is a plan view showing a biological material analysis chip of an example, and FIG. 1B is a cross-sectional view taken in the direction of the arrow at the position AA in FIG.

この生体物質解析チップ１００は、ガラス基板１の上面に親和性官能基を固定するためのポリマー薄膜層２１を作成する。ポリマー層２１の上にはテフロン（登録商標）層２２がプリントされている。したがって表面に出ているポリマー層２１は図の２３のような区画となっている。この区画は５０×５０μｍで細胞１個を収納できる。ポリマー薄膜層２１の上には親和性プローブとしてポリＴ（Ｔ３０）を固定し、ｍＲＮＡを網羅的に捕捉するようにすることができる。あるいは、上記「課題を解決するための手段」に記載したＤＮＡプローブ（スペーサー部：５’末端側１０塩基＋ターゲットのｍＲＮＡないしｃＤＮＡと反応する部分：平均３２塩基長）を固定することで特定のｍＲＮＡあるいはｃＤＮＡを捕捉するようなチップを得ることができる。もちろん通常のＤＮＡチップのように複数のＤＮＡプローブをスポットした構造とする。区画２１の集合の周りには溶液を保持するための仕切り５が存在する。 The biological material analysis chip 100 creates a polymer thin film layer 21 for fixing an affinity functional group on the upper surface of the glass substrate 1. A Teflon (registered trademark) layer 22 is printed on the polymer layer 21. Accordingly, the polymer layer 21 on the surface has a section as shown in FIG. This compartment is 50 × 50 μm and can hold one cell. Poly T (T30) can be immobilized as an affinity probe on the polymer thin film layer 21 so that mRNA can be captured comprehensively. Alternatively, the DNA probe (spacer part: 5 ′ terminal side 10 bases + part that reacts with target mRNA or cDNA: average of 32 bases in length) described in the above “Means for Solving the Problems” A chip that captures mRNA or cDNA can be obtained. Of course, the structure is such that a plurality of DNA probes are spotted like a normal DNA chip. There is a partition 5 around the set of compartments 21 for holding the solution.

まず、基板１の上面に形成する親和性官能基を固定するためのポリマー薄膜層について説明する。ポリマー薄膜層２１は第１のモノマーとしてアルキルジイソシアナートと第２のモノマーとしてジアミノフェニル酢酸を等モル比で反応させ重合させる。すなわちポリマー薄膜としては尿素樹脂薄膜ということになる。アルキルジイソシアナートとしては、例えば、ヘキサメチレンジイソシアナートを用いることができる。また、生体物質捕捉用残基は第２のモノマーであるジアミノフェニル酢酸のカルボキシル基ということになる。重合条件に関しては、既存の真空蒸着法を用いることができる。 First, the polymer thin film layer for fixing the affinity functional group formed on the upper surface of the substrate 1 will be described. The polymer thin film layer 21 is polymerized by reacting alkyl diisocyanate as the first monomer and diaminophenylacetic acid as the second monomer in an equimolar ratio. That is, the polymer thin film is a urea resin thin film. For example, hexamethylene diisocyanate can be used as the alkyl diisocyanate. Moreover, the biological substance-trapping residue is the carboxyl group of diaminophenylacetic acid, which is the second monomer. Regarding the polymerization conditions, existing vacuum deposition methods can be used.

このようにして基板上に形成したポリ尿素薄膜２１はアルキルジイソシアナートとジアミノフェニル酢酸モノマーが交互に反応して形成する構造のため、側鎖のカルボン酸基が比較的そろった間隔で存在することになる。アルキル基の長さを調製することで導入するカルボキシル基の間隔を調製できる。また、これにより、従来は表面に官能基を導入することが困難であった金や白金などの電極上にも官能基を持つ薄膜を形成することができる。基板上に導入したカルボキシル基をカルボジイミド系の活性化剤を用いて生体物質捕捉用残基としてアミノ基を有するプローブを直接固定してもよい。あるいは、この側鎖カルボキシル基にジシクロヘキシルカルボジイミド系の活性化剤存在下でエチレンジアミンを反応させると、高収率で側鎖カルボキシル基に一級アミン残基を導入することができる。すなわち基板表面には一級アミンがほぼ一定間隔で並んだ状態となる。 Since the polyurea thin film 21 thus formed on the substrate is formed by the reaction of alkyl diisocyanate and diaminophenylacetic acid monomer alternately, the side chain carboxylic acid groups are present at relatively uniform intervals. It will be. By adjusting the length of the alkyl group, the interval between the carboxyl groups to be introduced can be adjusted. In addition, this makes it possible to form a thin film having a functional group on an electrode such as gold or platinum, which has conventionally been difficult to introduce a functional group on the surface. A probe having an amino group as a residue for capturing a biological substance may be directly immobilized using a carbodiimide-based activator for the carboxyl group introduced onto the substrate. Alternatively, when this side chain carboxyl group is reacted with ethylenediamine in the presence of a dicyclohexylcarbodiimide-based activator, a primary amine residue can be introduced into the side chain carboxyl group in high yield. That is, primary amines are arranged on the substrate surface at almost regular intervals.

次にNucleic Acids Research,27,1970-1977(1999)およびCHEMBIOCHEM2, 686- 694(2001)記載の１，４−フェニレンヂイソチオシアナートで一級アミンを修飾し、表面にイソチオシアナート基を導入する。最後に５’末端にアミノ基を有するポリＴ（Ｔ３０）を反応させる。この反応条件は上記文献に詳しい。上記方法でポリＴが約９ｎｍ間隔で固定された基板が得られる。 Next, the primary amine is modified with 1,4-phenylenediisothiocyanate described in Nucleic Acids Research, 27, 1970-1977 (1999) and CHEMBIOCHEM2, 686-694 (2001), and isothiocyanate groups are introduced on the surface. . Finally, poly T (T30) having an amino group at the 5 'end is reacted. The reaction conditions are detailed in the above literature. By the above method, a substrate on which poly-T is fixed at intervals of about 9 nm is obtained.

実施例では、カルボキシル基をもつポリ尿素を基板１上に形成して用いたが、このほかにも、側鎖にプローブとなるポリヌクレオチドやペプチドなどを固定できるような反応基を導入できる残基を周期的に持つポリマーであれば利用することができる。たとえば、２種のモノマーの組み合わせが

の構造を有する酸無水物（Ｒ_１〜Ｒ_４は任意の残基）とＮＨ_２−Ｒ_５−ＮＨ_２の構造を有するジアミンモノマー（Ｒ_５は任意の残基）で、Ｒ_５にカルボキシル基を有するジアミノフェニル酢酸モノマーを用いることができる。酸無水物としては、４,４’−ヘキサフルオロイソプロピリデンビスフタル酸無水物のような構造のものを用いることができる。このようなポリマーは、すなわちポリイミドである。ポリイミドは一般的にこのようなビス無水フタル酸とビスアミノ化合物を用いる。あるいは、たとえばカルボキシル基を有するジアミノフェニル酢酸あるいは１，１０−ジアミノデカンのような脂肪族ジアミンの脂肪族位置にカルボン酸残基を有するモノマーとジ酸クロリドモノマーであるテレフタロイルジクロリドを蒸着重合により基板上に膜形成を行うポリアミドを利用することができる。プローブ固定用には長鎖脂肪族ジアミンに各種反応性残基を導入しておけばよい。蒸着重合としては既存の方法、たとえば、Jpn. Ｊ. Appl. Phys. 33, L1721-L1724（1994）やThin Solid Films, 215, 94-97 (1992) 記載の方法に準じて、使用するモノマーの気化条件を考慮して行えばよい。 In the examples, polyurea having a carboxyl group was formed on the substrate 1 and used, but in addition to this, a residue capable of introducing a reactive group capable of immobilizing a polynucleotide or peptide serving as a probe on the side chain. If it is a polymer which has periodically, it can utilize. For example, a combination of two monomers

An acid anhydride having a structure of (R _{1 to} R ₄ is an arbitrary residue) and a diamine monomer having a structure of NH ₂ —R ₅ —NH ₂ (R ₅ is an arbitrary residue), wherein R ₅ is a carboxyl group A diaminophenylacetic acid monomer having can be used. An acid anhydride having a structure such as 4,4′-hexafluoroisopropylidenebisphthalic anhydride can be used. Such a polymer is polyimide. Polyimide generally uses such bisphthalic anhydride and a bisamino compound. Alternatively, for example, a monomer having a carboxylic acid residue at the aliphatic position of an aliphatic diamine such as diaminophenylacetic acid or 1,10-diaminodecane having a carboxyl group and terephthaloyl dichloride, which is a diacid chloride monomer, are deposited by vapor deposition polymerization. Polyamide that forms a film on a substrate can be used. For the probe immobilization, various reactive residues may be introduced into the long-chain aliphatic diamine. Vapor deposition polymerization is carried out according to existing methods such as those described in Jpn. J. Appl. Phys. 33, L1721-L1724 (1994) and Thin Solid Films, 215, 94-97 (1992). What is necessary is just to consider vaporization conditions.

なお、図１において、５は樹脂製の壁であり、ポリ尿素薄膜２１の周辺に設け、試料溶液の周辺への流出を防止するためのものである。必ず必要と言うものではない。 In FIG. 1, reference numeral 5 denotes a resin wall, which is provided around the polyurea thin film 21 to prevent the sample solution from flowing out to the periphery. It is not always necessary.

図２（Ａ）は、基板１の上面に蒸着重合で形成された第１のモノマーとしてアルキルジイソシアナートと第２のモノマーとしてジアミノフェニル酢酸を等モル比で反応させ重合させたポリマー薄膜層２１の断面構造を示す模式図であり、図２（Ｂ）は、ポリマー薄膜層２１の平面構造を示す模式図である。 FIG. 2A shows a polymer thin film layer 21 obtained by reacting and polymerizing an alkyl diisocyanate as a first monomer and diaminophenylacetic acid as a second monomer at an equimolar ratio formed on the upper surface of the substrate 1 by vapor deposition polymerization. FIG. 2B is a schematic diagram showing a planar structure of the polymer thin film layer 21. As shown in FIG.

ポリマー薄膜層２１は、第１のモノマー部分２２と第２のモノマー部分２３が、第１のモノマー部分２２の第１の官能基２４と第２のモノマー部分２３の第２の官能基２５とがお互いに連結し、交互に重合した二つのモノマーの連鎖構造となっている。第２のモノマー部分２３には側鎖として第３の官能基２６が存在する。ポリマー層薄膜２１は基板表面との間での弱い結合２７と、基板１のガラス表面のシラノール基とポリマー側の官能基のパイ電子がごく一部分で共有結合した状態２８でアンカリングしていると推定される。図２（Ｂ）を参照して分かるように、第１のモノマー部分２２の第１の官能基２４と第２のモノマー部分２３の第２の官能基２５とがお互いに連結し、交互に重合した二つのモノマーの連鎖構造は、全てが、平行に整然と並ぶわけではないので、第三の官能基２６が、均等に、整然と配列されるわけではない。すなわち、図２（Ｂ）に示すように、反転したもの、傾いたものが混在する。しかし、第三の官能基２６を有する第２のモノマー部分２３は、第１のモノマー部分２２を介在させて配列されることになるので、第三の官能基２６が、むやみに集まったり、閑散と分布してしまったりすることは防止できる。 The polymer thin film layer 21 includes a first monomer portion 22 and a second monomer portion 23, and a first functional group 24 of the first monomer portion 22 and a second functional group 25 of the second monomer portion 23. It is a chain structure of two monomers linked to each other and polymerized alternately. The second monomer portion 23 has a third functional group 26 as a side chain. The polymer layer thin film 21 is anchored in a state 28 in which the weak bond 27 between the substrate surface and the silanol group on the glass surface of the substrate 1 and the pi electron of the functional group on the polymer side are covalently bonded in a very small part. Presumed. As can be seen with reference to FIG. 2 (B), the first functional group 24 of the first monomer portion 22 and the second functional group 25 of the second monomer portion 23 are connected to each other and polymerized alternately. The chain structures of the two monomers are not all arranged in order in parallel, so the third functional groups 26 are not arranged in an orderly manner. That is, as shown in FIG. 2 (B), inverted and tilted ones are mixed. However, since the second monomer portion 23 having the third functional group 26 is arranged with the first monomer portion 22 interposed therebetween, the third functional group 26 is gathered unnecessarily or loosely. It can be prevented from being distributed.

図３は、基板１の表面に形成されたポリマー薄膜層２１の第三の官能基２６とＤＮＡプローブ３１の５’末端部分３２の官能基３３とが結合する様子を模式的に示す図である。ここで、ポリマー薄膜層２１は、第１のモノマー２２と第２のモノマー２３が交互に重合しているので、分子レベルで見ると第２のモノマー２３の側鎖である第３の官能基２６の間隔はほぼ一定となり、したがって第３の官能基２６に結合するＤＮＡプローブ３１もほぼ一定間隔となる。もちろんポリマー鎖同士の２次元的な広がりも考える必要があるが、側鎖のカルボキシル基（図２（Ａ）では第３の官能基２６に相当）のマイナス荷電の反発力により、図２（B）に示すように、異なる鎖の間隔もほぼ一定となることが期待できる。 FIG. 3 is a diagram schematically showing a state in which the third functional group 26 of the polymer thin film layer 21 formed on the surface of the substrate 1 is bonded to the functional group 33 of the 5 ′ end portion 32 of the DNA probe 31. . Here, since the first monomer 22 and the second monomer 23 are alternately polymerized in the polymer thin film layer 21, the third functional group 26 that is a side chain of the second monomer 23 is seen at the molecular level. Is substantially constant, so that the DNA probes 31 bonded to the third functional group 26 are also substantially constant. Of course, it is also necessary to consider the two-dimensional expansion of the polymer chains, but due to the negatively charged repulsive force of the side chain carboxyl group (corresponding to the third functional group 26 in FIG. 2A), FIG. ), The distance between the different chains can be expected to be substantially constant.

図４は、図１−３に示す基板を用いて、ｍＲＮＡを検出する工程を示す図である。図４（Ａ）は基板１の上面のポリマー薄膜層２１の上面に、例えば、細胞を破砕して得られた試料溶液４１を配し、試料溶液４１中にはｍＲＮＡ４３やタンパク質４５が分散した様子を模視的に示す断面図である。溶液４１はいわゆるＰＢＳでＥＤＴＡは含まないものを使用する。基板１の上面のポリマー薄膜層２１の表面にプローブ３１が固定されている。ここではプローブ３１はポリＴからなるものを使用する。ｍＲＮＡが測定対象であるので液滴中に細胞浸透性のＲＮａｓｅインヒビターを予め入れておき、ｍＲＮＡの分解を極力防ぐ。 FIG. 4 is a diagram showing a process of detecting mRNA using the substrate shown in FIG. 1-3. 4A shows a state in which, for example, a sample solution 41 obtained by crushing cells is disposed on the upper surface of the polymer thin film layer 21 on the upper surface of the substrate 1, and mRNA 43 and protein 45 are dispersed in the sample solution 41. FIG. The solution 41 is a so-called PBS that does not contain EDTA. A probe 31 is fixed to the surface of the polymer thin film layer 21 on the upper surface of the substrate 1. Here, the probe 31 is made of poly-T. Since mRNA is an object to be measured, a cell-permeable RNase inhibitor is placed in the droplet in advance to prevent degradation of mRNA as much as possible.

図４（Ｂ）は、図４（Ａ）の状態から時間が経過した状態を模視的に示す図である。時間が経過するのに応じて、ｍＲＮＡ４３は基板上のポリＴプローブ３１にハイブリダイズする。ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションによる基板表面のポリＡプローブへの捕捉には４時間程度を要する。 FIG. 4B is a diagram schematically showing a state in which time has elapsed from the state of FIG. As time passes, mRNA 43 hybridizes to poly T probe 31 on the substrate. It takes about 4 hours to capture the substrate surface on the poly A probe by mRNA hybridization.

図４（Ｃ）は、基板１の上面のポリマー薄膜層２１の上面のポリＴプローブ３１に捕捉されたｍＲＮＡ群４３を識別する方法を説明する図である。まず、図４（Ｂ）に示すポリＴプローブ３１に捕捉されたｍＲＮＡ群を有する基板１を０．５％ＳＤＳと０．１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４で洗浄し、基板１上のポリＴプローブ３１にハイブリダイズしなかった物を除去する。次いで、ポリＴプローブ３１にハイブリダイズしたｍＲＮＡ群４３は、種々の異なったものがあるので、これを識別するための標識プローブの混合溶液５１を添加する。ここでは、標識プローブとしては異なる粒子径の金ナノ粒子に異なるＤＮＡ配列を持つＤＮＡプローブを結合させたものを用いる。図では模式的に５ｎｍの金ナノ粒子５３で標識したＤＮＡプローブ６３、１０ｎｍの金ナノ粒子５４で標識したＤＮＡプローブ６４、１５ｎｍの金ナノ粒子５５で標識したＤＮＡプローブ６５の３種を含む溶液５１を基板上に加えた状態を表す。金ナノ粒子標識ＤＮＡプローブの非特異的な吸着を防ぐために、溶液５１は０．５％ＳＤＳと０．１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４の組成としている。 FIG. 4C is a diagram for explaining a method of identifying the mRNA group 43 captured by the poly T probe 31 on the upper surface of the polymer thin film layer 21 on the upper surface of the substrate 1. First, the substrate 1 having the mRNA group captured by the poly-T probe 31 shown in FIG. 4B is washed with a 50 mM phosphate buffer pH 7.4 containing 0.5% SDS and 0.1 M NaCl. 1. Remove those that did not hybridize to poly T probe 31 on 1. Next, since there are various different mRNA groups 43 hybridized to the poly-T probe 31, a mixed solution 51 of labeled probes for identifying this is added. Here, as the labeled probe, one obtained by binding a DNA probe having a different DNA sequence to gold nanoparticles having different particle diameters is used. In the figure, a solution 51 containing three types of DNA probes 63 labeled with 5 nm gold nanoparticles 53, DNA probes 64 labeled with 10 nm gold nanoparticles 54, and DNA probes 65 labeled with 15 nm gold nanoparticles 55. Represents a state in which is added on the substrate. In order to prevent nonspecific adsorption of the gold nanoparticle-labeled DNA probe, the solution 51 has a composition of 50 mM phosphate buffer pH 7.4 containing 0.5% SDS and 0.1 M NaCl.

１時間４５℃でインキュベーションした後、同一の緩衝液で洗浄後、さらに１０ｍＭのＮａＣｌを含むクエン酸緩衝液ｐＨ７で洗浄する。この状態で基板上には、ポリＴプローブ３１にハイブリダイズしたｍＲＮＡ群とポリＴプローブ３１に捕捉された各ｍＲＮＡにハイブリダイズした標識プローブ６３，６４，６５が３体結合した状態になっている。標識プローブ６３，６４，６５には、走査型電子顕微鏡や操作型原子間力顕微鏡で容易に識別できる粒子径の異なる金ナノ粒子標識物５３、５４、５５が結合している。したがって、金ナノ粒子５３、５４、５５を、粒子径を区別しながらカウントすることで、基板１上のポリＴプローブ３１に捕捉されたｍＲＮＡの種類と量を測定することができる。 After incubation at 45 ° C. for 1 hour, the cells are washed with the same buffer, and further washed with citrate buffer pH 7 containing 10 mM NaCl. In this state, three labeled probes 63, 64, and 65 hybridized to each mRNA captured by the poly T probe 31 and three mRNA probes hybridized to the poly T probe 31 are bonded to the substrate. . Gold nanoparticle labels 53, 54, and 55 having different particle diameters that can be easily identified by a scanning electron microscope or an operational atomic force microscope are bound to the label probes 63, 64, and 65. Therefore, by counting the gold nanoparticles 53, 54, and 55 while distinguishing the particle diameters, the type and amount of mRNA captured by the poly T probe 31 on the substrate 1 can be measured.

区画２１は５×５μｍと微小なため、そこに固定できるプローブ数としては限られた数となってしまう。各区画ごとのプローブ固定量を一定に保とうとすると、基板表面の状態に固定量が依存するような方法は取ることができない。本方法を用いることで、基板表面のプローブ分子間隔をほぼ９ｎｍに保つことができる。このため５×５μｍ程度のスポットでのプローブ固定量のばらつきは従来法のＣＶ＝３０％程度から本発明によりＣＶ＝７％程度まで少なくすることができる。
（実施例２）
ここで、実施例による識別能力について評価すると以下のようである。 Since the section 21 is as small as 5 × 5 μm, the number of probes that can be fixed thereto is limited. If the fixed amount of probe for each section is kept constant, a method in which the fixed amount depends on the state of the substrate surface cannot be taken. By using this method, the probe molecule spacing on the substrate surface can be maintained at approximately 9 nm. For this reason, the variation of the probe fixing amount at a spot of about 5 × 5 μm can be reduced from about CV = 30% in the conventional method to about CV = 7% according to the present invention.
(Example 2)
Here, it is as follows when discriminating ability by an Example is evaluated.

基板１の上面のポリマー薄膜層２１の表面にプローブ３１が固定されるが、プローブ３１としてポリＴを用いることとし、通常のＤＮＡチップの様に複数の配列のＤＮＡプローブをポリマー薄膜層２１の表面にスポットして用いる例を考える。すなわち、上述したようにして調製したイソチオシアナート残基がほぼ一定間隔になるように配された表面にインクジェット装置を用いて各プローブをスポットする。スポットの大きさは１μｍφとし、各スポットが２μｍピッチで並んでいるとする。 The probe 31 is fixed to the surface of the polymer thin film layer 21 on the upper surface of the substrate 1. Poly T is used as the probe 31, and a plurality of DNA probes are arranged on the surface of the polymer thin film layer 21 like a normal DNA chip. Let's consider an example of spotting. That is, each probe is spotted using an ink jet apparatus on the surface where the isothiocyanate residues prepared as described above are arranged at almost regular intervals. It is assumed that the spot size is 1 μmφ and each spot is arranged at a pitch of 2 μm.

また、各スポットに３種類の捕捉用ＤＮＡプローブをミクスチャーとして固定し、各々捕捉用プローブに対応する検出用のＤＮＡプローブに上述のように３種類の異なる粒子径のナノ粒子を標識したものを用いるとする。 In addition, three types of capture DNA probes are fixed to each spot as a mixture, and the detection DNA probe corresponding to each capture probe is labeled with nanoparticles of three different particle sizes as described above. And

図５（Ａ）に本発明を用いる３種類のＤＮＡプローブを同一スポット位置に固定し、スポットごとに異なるＤＮＡプローブを固定したＤＮＡマイクロアレイの例を断面図で示す。基板１の上には蒸着重合で作成した反応性残基がほぼ等間隔で並んだ層２１の活性基を利用して３種のプローブ９２−１，９２−２，９２−３のグループと、これらとは異なる３種のプローブ９３−１，９３−２，９３−３がスポットエリア９２と９３に別個に固定されている。試料混合液９１を添加して２時間５０℃でインキュベーションする。試料混合液９１は１本鎖状態のｃＤＮＡ混合物で、たとえば白血球由来のｍＲＮＡ混合物を逆転写して得たものである。溶媒は０．５％ＳＤＳを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）である。反応終了後、０．５％ＳＤＳを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄する。 FIG. 5A shows a cross-sectional view of an example of a DNA microarray in which three types of DNA probes using the present invention are fixed at the same spot position and different DNA probes are fixed for each spot. On the substrate 1, a group of three types of probes 92-1, 92-2, 92-3 using the active groups of the layer 21 in which reactive residues prepared by vapor deposition polymerization are arranged at almost equal intervals, Three types of probes 93-1, 93-2, and 93-3 different from these are separately fixed to the spot areas 92 and 93, respectively. Add sample mixture 91 and incubate for 2 hours at 50 ° C. The sample mixture 91 is a single-stranded cDNA mixture, for example, obtained by reverse transcription of a leukocyte-derived mRNA mixture. The solvent is 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.5% SDS. After completion of the reaction, washing is performed with 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.5% SDS.

図５（Ｂ）に基板上の層２１の表面のプローブにｃＤＮＡが捕捉された状態を（示す。異なるｃＤＮＡ１０２−１，１０２−２，１０２−３がスポットエリア９２の対応するＤＮＡプローブにハイブリダイズ、ｃＤＮ１０３−２，１０３−３がスポットエリア９３の対応するプローブにハイブリダイズしている。スポット９３のプローブ９３−１に対応しているｃＤＮＡは試料中に存在しないケースで、このためいずれのスポットエリアにもハイブリダイズした痕跡は見られない。 FIG. 5B shows a state in which cDNA is captured by the probe on the surface of the layer 21 on the substrate (different cDNAs 102-1, 102-2, and 102-3 hybridize to corresponding DNA probes in the spot area 92. , CDN 103-2 and 103-3 are hybridized to the corresponding probes in the spot area 93. The cDNA corresponding to the probe 93-1 in the spot 93 is not present in the sample, and therefore any spot There are no traces of hybridization in the area.

図５（Ｃ）に、基板上の層２１の表面のプローブに捕捉されたｃＤＮＡが３種の異なる粒子径５、１０、１５μｍの金ナノ粒子を標識した第２のＤＮＡプローブ１１２−１，１１２−２，１１２−３、１１３−１、１１３−２、１１２−３と反応させるためにリン酸緩衝液９５を添加した状態を示す。第２のＤＮＡプローブはそれぞれ１本鎖ｃＤＮＡ１０２−１，１０２−２，１０２−３，１０３−１，１０３−２，１０３−３に相補な配列を有する（ｃＤＮＡ１０３−１は試料中に含まれないので図には描かれていない）。反応は０．５％ＳＤＳを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）９５中で、５５℃で３０分間行う。金ナノ粒子標識ＤＮＡプローブの混合液は予め９０℃５秒加熱し、５５℃に冷却して直ちに基板上に滴下する。０．５％ＳＤＳを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄する。 FIG. 5C shows the second DNA probes 112-1 and 112 in which the cDNA captured by the probe on the surface of the layer 21 on the substrate is labeled with three kinds of gold nanoparticles having different particle diameters of 5, 10, and 15 μm. The state in which a phosphate buffer 95 is added to react with -2, 112-3, 113-1, 113-2, 112-3 is shown. Each of the second DNA probes has a sequence complementary to the single-stranded cDNA 102-1, 102-2, 102-3, 103-1, 103-2, 103-3 (cDNA 103-1 is not included in the sample) So it is not drawn in the figure). The reaction is carried out in 55 mM phosphate buffer (pH 7.4) 95 containing 0.5% SDS at 55 ° C. for 30 minutes. The mixed solution of gold nanoparticle-labeled DNA probes is preliminarily heated at 90 ° C. for 5 seconds, cooled to 55 ° C., and immediately dropped onto the substrate. Wash with 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.5% SDS.

図５（Ｄ）に、基板上の各スポットエリアにｃＤＮＡ配列に従い金ナノ粒子１１２−１，１１２−２，１１２−３，１１３−２，１１３−３で標識したＤＮＡプローブがハイブリダイズした状態を示す。操作型電子顕微鏡か原子間力顕微鏡で基板表面をスキャンして、各スポットエリアに結合している金ナノ粒子を粒径別にカウントする。 FIG. 5D shows a state in which DNA spots labeled with gold nanoparticles 112-1, 112-2, 112-3, 113-2, and 113-3 are hybridized to each spot area on the substrate according to the cDNA sequence. Show. The surface of the substrate is scanned with an operation electron microscope or an atomic force microscope, and gold nanoparticles bonded to each spot area are counted by particle size.

区画２１は５×５μｍと微小なため、そこに固定できるプローブ数としては限られた数となってしまう。各区画ごとに３種類のプローブを固定しようとすると更に固定量のばらつき変動が大きくなる。本方法を用いることで、基板表面のプローブ分子間隔をほぼ９ｎｍに保つことができる。３種類のプローブを固定すると、５×５μｍ程度のスポットでのプローブ固定量のばらつきは従来法のＣＶ＝４０％程度から本発明によりＣＶ＝１０％程度まで少なくすることができる。 Since the section 21 is as small as 5 × 5 μm, the number of probes that can be fixed thereto is limited. If it is attempted to fix three types of probes for each section, the variation in the amount of fixation further increases. By using this method, the probe molecule spacing on the substrate surface can be maintained at approximately 9 nm. When three types of probes are fixed, the variation of the probe fixing amount at a spot of about 5 × 5 μm can be reduced from about CV = 40% of the conventional method to about CV = 10% according to the present invention.

本発明を実行するに好適な生体物質解析チップの１例を示す図であり、（Ａ）は実施例の生体物質解析チップを示す平面図、（Ｂ）は図１（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図である。It is a figure which shows one example of the biological material analysis chip | tip suitable for implementing this invention, (A) is a top view which shows the biological material analysis chip | tip of an Example, (B) is AA of FIG. 1 (A). It is sectional drawing seen in the arrow direction at the position. （Ａ）は、基板１の上面に蒸着重合で形成された第１のモノマーとしてアルキルジイソシアナートと第２のモノマーとしてジアミノフェニル酢酸を等モル比で反応させ重合させたポリマー薄膜層２１の断面構造を示す模式図であり、図２（Ｂ）は、ポリマー薄膜層２１の平面構造を示す模式図である。(A) is a cross section of a polymer thin film layer 21 obtained by reacting and polymerizing an alkyl diisocyanate as a first monomer and diaminophenylacetic acid as a second monomer in an equimolar ratio formed on the upper surface of the substrate 1 by vapor deposition polymerization. FIG. 2B is a schematic diagram showing a planar structure of the polymer thin film layer 21. FIG. 基板１の表面に形成されたポリマー薄膜層２１の第三の官能基２６とＤＮＡプローブ３１の５’末端部分３２の官能基３３とが結合する様子を模式的に示す図である。3 is a diagram schematically showing a state in which a third functional group 26 of a polymer thin film layer 21 formed on the surface of a substrate 1 is bonded to a functional group 33 of a 5 ′ end portion 32 of a DNA probe 31. FIG. （Ａ）−（Ｄ）は、図１−３に示す基板を用いて、ｍＲＮＡを検出する工程を示す図である。(A)-(D) is a figure which shows the process of detecting mRNA using the board | substrate shown to FIGS. 1-3. （Ａ）−（Ｄ）は、複数のＤＮＡプローブを同一スポット位置に固定し、各スポット位置でＤＮＡプローブを異なるものとしたＤＮＡマイクロアレイを用いて、ｍＲＮＡを検出する工程を示す図である。(A)-(D) is a figure which shows the process of detecting mRNA using the DNA microarray which fixed the some DNA probe to the same spot position, and made the DNA probe different in each spot position.

符号の説明Explanation of symbols

１００…生体物質解析チップ、１…ガラス基板、５…樹脂製の壁、２１…ポリマー薄膜層、２２…第１のモノマー部分、２３…第２のモノマー部分、２４…第１のモノマー部分の第１の官能基、２５…第２のモノマー部分の第２の官能基、２６…第２のモノマー部分の側鎖としての第３の官能基、２７…ポリマー層薄膜と基板表面との間の弱い結合、２８…基板のガラス表面のシラノール基とポリマー側の官能基のパイ電子の共有結合した状態、３１，９２，９３…ＤＮＡプローブ、３２…ＤＮＡプローブの５’末端部分、３３…ＤＮＡプローブの５’末端部分の官能基、４１…細胞を破砕して得られた試料溶液、４３…ｍＲＮＡ、４５…タンパク質、５３，５４，５５，１１２，１１３…金ナノ粒子、６３，６４，６５…金ナノ粒子で標識したＤＮＡプローブ、１０２，１０３…ｃＤＮＡ。
DESCRIPTION OF SYMBOLS 100 ... Biological material analysis chip, 1 ... Glass substrate, 5 ... Resin wall, 21 ... Polymer thin film layer, 22 ... 1st monomer part, 23 ... 2nd monomer part, 24 ... 1st monomer part 1 functional group, 25 ... second functional group of the second monomer part, 26 ... third functional group as a side chain of the second monomer part, 27 ... weak between the polymer layer thin film and the substrate surface Bond, 28 ... Covalent bonding of silanol groups on the glass surface of the substrate and pi electrons of the functional group on the polymer side, 31, 92, 93 ... DNA probe, 32 ... 5 'end portion of the DNA probe, 33 ... DNA probe 5 'terminal functional group, 41 ... sample solution obtained by disrupting cells, 43 ... mRNA, 45 ... protein, 53,54,55,112,113 ... gold nanoparticles, 63,64,65 ... gold Labeled with nanoparticles DNA probe, 102,103 ... cDNA.

Claims

基板と、該基板の一つの表面に所定の生体物質の捕捉用残基を有する固体チップであり、前記基板の一つの表面に２種類のモノマーを重合させて調製するポリマー層を有し、前記ポリマー層の内、第１の官能基を２箇所に有する第１のモノマーと重合用の第２の官能基を２箇所に有する第２のモノマーを実質的に交互に配するように重合した構造で、前記第１のモノマーおよび前記第２のモノマーの片方に生体物質捕捉用残基を持つ構造であることを特徴とする生体物質解析チップ。 A solid chip having a substrate and a residue for capturing a predetermined biological substance on one surface of the substrate, and a polymer layer prepared by polymerizing two types of monomers on one surface of the substrate, The structure which polymerized so that the 1st monomer which has the 1st functional group in two places in the polymer layer, and the 2nd monomer which has the 2nd functional group for superposition | polymerization in two places may be arranged substantially alternately. A biological material analysis chip having a structure having a biological material-trapping residue on one of the first monomer and the second monomer.

前記第１のモノマーと第２のモノマーの組み合わせがＮＣＳ−Ｒ_１−ＮＣＳ（Ｒ_１は任意の残基）の構造を有するジイソチオシアナートモノマーとＮＨ_２−Ｒ_２−ＮＨ_２（Ｒ_２は任意の残基）の構造を有するジアミンモノマーで、ポリマー層がポリ尿素である請求項１記載の生体物質解析チップ。 The combination of the first monomer and the second monomer is a diisothiocyanate monomer having a structure of NCS-R ₁ -NCS (R ₁ is an arbitrary residue) and NH ₂ -R ₂ -NH ₂ (R ₂ is 2. The biological material analysis chip according to claim 1, wherein the polymer layer is a polyurea with a diamine monomer having a structure of any residue.

前記第１のモノマーと第２のモノマーの組み合わせが

あるいは

（Ｒ_１〜Ｒ_３は任意の残基）の構造を有する酸無水物とＮＨ_２−Ｒ_５−ＮＨ_２（Ｒ_５は任意の残基）の構造を有するジアミンモノマーで、ポリマー層がポリアミドないしポリイミドである請求項１記載の生体物質解析チップ。 The combination of the first monomer and the second monomer is

Or

An acid anhydride having a structure of (R _{1 to} R ₃ is an arbitrary residue) and a diamine monomer having a structure of NH ₂ —R ₅ —NH ₂ (R ₅ is an arbitrary residue), and the polymer layer is polyamide or claim 1 Symbol placement biological substance analysis chip is polyimide.

前記生体物質捕捉用残基がカルボキシル基である請求項１ないし請求項３のいずれか1項に記載の生体物質解析チップ。 4. The biological material analysis chip according to claim 1, wherein the biological material capturing residue is a carboxyl group.

前記カルボキシル基にイソチオシアン酸が導入された構造である請求項４記載の生体物質解析チップ。 The biological material analysis chip according to claim 4, which has a structure in which isothiocyanic acid is introduced into the carboxyl group.

前記カルボキシル基にジアミン類を反応させて固体チップ表面にアミンを導入し、前記固体表面に導入したアミンにジイソチオシアナート類を反応させて固体チップ表面にイソチオシアナート残基を導入した構造の請求項４記載の生体物質解析チップ。 By reacting diamines with the carboxyl group to introduce amine to a solid chip surface, of the amine introduced into the solid surface is reacted with di-isothiocyanates were introduced isothiocyanate residue on a solid chip surface structure 4. Symbol placement of a biological substance analysis chip.

所定の生体物質の捕捉用残基を有する固体チップが、前記固体チップ表面に２種類のモノマーを重合させて調製するポリマー層を有し、少なくても前記ポリマー層が重合用の前記２つのモノマーの内第１の官能基を２箇所に有する第１のモノマーと重合用の第２の官能基を２箇所に有する第２のモノマーを実質的に交互に配するように重合した構造で、前記２つのモノマーの内少なくとも１種のモノマーに生体物質捕捉用残基を持つ構造で、前記生体物質捕捉用残基に所定の生体物質を捕捉するための分子が共有結合で固定した細胞構成物質解析チップと、前記生体物質捕捉用残基に固定した分子に捕捉された所定の生体物質に結合し該所定の生体物質を特定するための標識物を含む生体物質とを有することを特徴とする生体物質解析キット。 A solid chip having a residue for capturing a predetermined biological material has a polymer layer prepared by polymerizing two types of monomers on the surface of the solid chip, and at least the two polymer layers are used for polymerization. Wherein the first monomer having two first functional groups and the second monomer having two second functional groups for polymerization are polymerized so as to be alternately arranged, Cell structure substance analysis in which at least one of the two monomers has a residue for capturing a biological substance, and a molecule for capturing the predetermined biological substance is covalently fixed to the residue for capturing a biological substance. A living body comprising a chip and a biological material that binds to a predetermined biological material captured by a molecule immobilized on the biological material capturing residue and contains a label for identifying the predetermined biological material Substance analysis kit

前記標識物が５から３００ｎｍのナノ粒子からなる請求項７記載の生体物質解析キット。 The biological material analysis kit according to claim 7, wherein the label is made of nanoparticles of 5 to 300 nm.

所定の生体物質の捕捉用残基を有する固体チップが、前記固体チップ表面に２種類のモノマーを重合させて調製するポリマー層を有し、少なくても前記ポリマー層が重合用の前記２つのモノマーの内第１の官能基を２箇所に有する第１のモノマーと重合用の第２の官能基を２箇所に有する第２のモノマーを実質的に交互に配するように重合した構造で、前記２つのモノマーの内少なくとも１種のモノマーに生体物質捕捉用残基を持つ構造で、前記生体物質捕捉用残基に所定の生体物質を捕捉するための分子が共有結合で固定した細胞構成物質解析チップの表面上の空間に生体物質を含む緩衝液を添加する工程、前記細胞構成物質解析チップ表面に存在し共有結合で固定された生体物質を捕捉するための分子で所定の生体物質を捕捉する工程、該所定の生体物質と結合し該所定の生体物質を特定するためのナノ粒子で標識された生体物質を結合する工程、細胞構成物質解析チップの表面に固定されるナノ粒子を計数する工程、からなることを特徴とする生体物質解析法。 A solid chip having a residue for capturing a predetermined biological material has a polymer layer prepared by polymerizing two types of monomers on the surface of the solid chip, and at least the two polymer layers are used for polymerization. Wherein the first monomer having two first functional groups and the second monomer having two second functional groups for polymerization are polymerized so as to be alternately arranged, Cell structure substance analysis in which at least one of the two monomers has a residue for capturing a biological substance, and a molecule for capturing the predetermined biological substance is covalently fixed to the residue for capturing a biological substance. A step of adding a buffer solution containing a biological material to a space on the surface of the chip, and capturing a predetermined biological material with a molecule for capturing the biological material which is present on the surface of the cell component analysis chip and is fixed by covalent bonding Process, A step of binding a biological material labeled with a nanoparticle for binding to a predetermined biological material and identifying the predetermined biological material, and a step of counting the nanoparticles fixed on the surface of the cell component analysis chip Biomaterial analysis method characterized by this.