JP4735926B2 - Highly efficient recovery method of nucleic acid - Google Patents
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Description
本発明は、目的とする核酸を回収する方法に関し、更に詳細には、ビオチン−アビジン複合体の形成を介して固相担体上に特異的に捕捉された核酸を、タンパク質変性剤とエチレンジアミン四酢酸の存在下において該ビオチン−アビジン複合体を解離させることにより回収する方法に関する。 The present invention relates to a method for recovering a target nucleic acid, and more specifically, a nucleic acid specifically captured on a solid phase carrier through formation of a biotin-avidin complex, a protein denaturant, and ethylenediaminetetraacetic acid. And recovering the biotin-avidin complex by dissociation in the presence of.
従来において、種々の核酸が混在する試料中から目的とする核酸（以下、「標的核酸」とも称する。）の回収方法として、種々の方法が報告されている。その一つとして、可磁性物質が一様に分布したコアを親水性ポリマーで被覆した磁性ビーズを用いた標的核酸の回収方法が報告されている（例えば、特許文献１、特許文献２，特許文献３を参照のこと。）。かかる方法は、ポリマーで覆われたビーズ表面をストレプトアビジン等で修飾することにより、ビオチン標識された核酸をビオチン−ストレプトアビジンの特異的結合対の形成を介してビーズ表面上に特異的に捕捉することで、標的核酸を特異的に回収する方法である。しかしながら、短鎖核酸を特異的に回収するのには効率的な方法であるが、長鎖核酸のビーズ表面上への特異的な結合には特殊試薬を有する等、その使用に制限があった。即ち、ビーズ上への核酸の結合力は核酸の長さに依存し、立体構造障害により核酸の結合力が低下することに起因する。 Conventionally, various methods have been reported as methods for recovering a target nucleic acid (hereinafter also referred to as “target nucleic acid”) from a sample containing various nucleic acids. As one of them, a method for recovering a target nucleic acid using magnetic beads in which a core in which a magnetic substance is uniformly distributed is coated with a hydrophilic polymer has been reported (for example, Patent Document 1, Patent Document 2, Patent Document) See 3). Such a method specifically captures a biotin-labeled nucleic acid on the bead surface through the formation of a biotin-streptavidin specific binding pair by modifying the polymer-coated bead surface with streptavidin or the like. Thus, the target nucleic acid is specifically recovered. However, although it is an efficient method for specifically recovering short-chain nucleic acids, there is a limit to the use such as having a special reagent for specific binding of long-chain nucleic acids onto the bead surface. . That is, the binding force of nucleic acid on the beads depends on the length of the nucleic acid, and is caused by the decrease in binding force of the nucleic acid due to a three-dimensional structural disorder.
また、ビオチン−アビジン複合体の解離定数を１億分の１まで低下させた特殊アビジンを使用して標的核酸を単離、精製する方法が報告されている（例えば、特許文献４、特許文献５を参照のこと。）。ここでは、水性ＤＭＳＯ、尿素、塩化リチウム、グアニジン塩酸塩等を作用させることにより、自然界においては同一サブユニットからなる４量体であるアビジンを、単量体に変換した特殊アビジンが開示されている。しかしながら、かかる方法は、ビオチン−アビジン相互間の特異性ならびに親和力を人為的に低下させた結果、標的核酸の回収率が低下するという問題点があり、また、標的核酸の回収の際にビオチン溶液を使用して溶出する方法が開示されているが、これに従うと再度精製を行なうためにはビオチンを除去する工程を要するという欠点があった。 In addition, methods for isolating and purifying a target nucleic acid using special avidin in which the dissociation constant of the biotin-avidin complex is reduced to 1 / 100,000 have been reported (for example, Patent Document 4 and Patent Document 5). checking.). Here, there is disclosed a special avidin obtained by converting avidin, which is a tetramer consisting of the same subunit in nature, into a monomer by acting aqueous DMSO, urea, lithium chloride, guanidine hydrochloride, etc. . However, this method has a problem in that the recovery rate of the target nucleic acid is reduced as a result of artificially reducing the specificity and affinity between biotin and avidin. According to this method, however, there is a drawback in that a step of removing biotin is required to perform purification again.
また、ストレプトアビジンをコートしたメンブレンとして、ビオチン捕捉メンブレン（Biotin Capture Membrane）が報告されている（特許文献６等を参照のこと。）。かかるメンブレンを使用することによりビオチン標識核酸を効率的にメンブレン上に捕捉できる。しかしながら、ストレプトアビジンとビオチン相互間の強固な結合に起因して、ｐＨ２〜１０、温度変化、有機溶媒、イオン性および非イオン性界面活性剤（ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ等）、変性剤（５Ｍグアニジン塩酸塩。２Ｍ尿素）等の過酷な条件下でも、両者の結合能力は保持される。そのため、メンブレンから核酸の回収は高濃度ビオチンを用いないと達成することができないか、もしくは、回収することは不可能であった。 In addition, as a membrane coated with streptavidin, a biotin capture membrane (Biotin Capture Membrane) has been reported (see Patent Document 6). By using such a membrane, biotin-labeled nucleic acid can be efficiently captured on the membrane. However, due to the strong binding between streptavidin and biotin, pH 2-10, temperature change, organic solvent, ionic and nonionic surfactants (SDS, CHAPS, etc.), denaturing agents (5M guanidine hydrochloride) Even in harsh conditions such as 2M urea, the binding ability of both is retained. Therefore, the recovery of nucleic acid from the membrane cannot be achieved unless high-concentration biotin is used, or cannot be recovered.
ここで、ビオチンとアビジンの結合は、アビジン１分子当り４分子のビオチンが結合する解離定数Ｋｄ＝10-1５Ｍの親和力を示す、生物学的に最も強固で安定な結合の一つとして知られている。この親和力は通常の抗原抗体反応の１００万倍以上も強く、実質上不可逆的な結合である。したがって、ビオチン−アビジン間の相互作用は核酸の特異的な回収に広範な潜在的利用価値を有するものである。一方で、核酸の回収においてビオチン−アビジン結合の解離を利用する際に、回収対象となる核酸を破壊してしまう様な過酷な条件を要する等、その解離に関して報告されている例は僅少であり、ビオチン−アビジン間の結合を解離する技術は現在においても開発途上の段階にある。したがって、ビオチン−アビジン間の強固かつ特異的な結合と、その解離を利用することにより、核酸を高効率で回収できる核酸の回収方法の更なる発展が期待されている。 Here, the binding between biotin and avidin is known as one of the most biologically strong and stable bindings with an affinity of dissociation constant Kd = 10 -15 M for binding 4 molecules of biotin per molecule of avidin. Yes. This affinity is more than 1 million times that of a normal antigen-antibody reaction, and is a substantially irreversible binding. Thus, the biotin-avidin interaction has broad potential utility for specific recovery of nucleic acids. On the other hand, when utilizing the dissociation of the biotin-avidin bond in the recovery of nucleic acids, there are very few examples that have been reported regarding the dissociation, such as requiring severe conditions that would destroy the nucleic acid to be recovered. The technique for dissociating the bond between biotin and avidin is still under development. Therefore, further development of a method for recovering nucleic acid that can recover nucleic acid with high efficiency by utilizing the strong and specific binding between biotin and avidin and the dissociation thereof is expected.
更に、核酸を含有する試料をイソチオシアン酸グアニジニウムおよびグアニジン塩酸塩等のカオトロピック物質の存在下でシリカ粒子等の担体と混合することにより、試料中に存在する核酸を遊離させて該シリカ粒子に結合させた後、該シリカ粒子に結合した核酸を溶出することにより、試料中から核酸を単離、精製する方法が報告されている（例えば、特許文献７を参照のこと。）。かかる方法は、非標識ＤＮＡを効率よく精製可能な一般的手段ではあるが、標識された核酸を特異的に単離、精製することができないという欠点があった。 Furthermore, by mixing a sample containing nucleic acid with a carrier such as silica particles in the presence of chaotropic substances such as guanidinium isothiocyanate and guanidine hydrochloride, the nucleic acid present in the sample is released and bound to the silica particles. Thereafter, a method for isolating and purifying nucleic acid from a sample by eluting the nucleic acid bound to the silica particles has been reported (see, for example, Patent Document 7). Such a method is a general means capable of efficiently purifying unlabeled DNA, but has a drawback in that it cannot specifically isolate and purify the labeled nucleic acid.
上記した従来法によれば、標的核酸を特異的、かつ、高収率に回収できないといった、問題点があった。そこで、本発明は、標的核酸、特には、標識された標的核酸を、特異的、かつ、高収率に回収可能な標的核酸の回収方法を提供することを目的とし、詳細には、ビオチン−アビジン複合体の形成と、新規な方法に基づく前記複合体の解離を利用した標的核酸の特異的、かつ、高収率な回収方法を提供することを目的とする。 According to the conventional method described above, there has been a problem that the target nucleic acid cannot be recovered in a specific and high yield. Therefore, an object of the present invention is to provide a method for recovering a target nucleic acid, in particular, a target nucleic acid that can recover a labeled target nucleic acid in a specific and high yield. It is an object of the present invention to provide a specific and high yield recovery method of a target nucleic acid utilizing the formation of an avidin complex and the dissociation of the complex based on a novel method.
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意研究した結果、タンパク質変性剤とエチレンジアミン四酢酸の作用によりビオチン−アビジン複合体を解離できるとの知見を得、かかる知見を標的核酸の回収に利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have obtained the knowledge that the biotin-avidin complex can be dissociated by the action of a protein denaturant and ethylenediaminetetraacetic acid, and can use such knowledge for the recovery of the target nucleic acid. As a result, the present invention has been completed.
即ち、上記目的を達成するため、本発明において、
ビオチン−アビジン複合体の形成を介して標的核酸が捕捉された固相担体に、タンパク質変性剤およびエチレンジアミン四酢酸を接触させることにより、前記ビオチン−アビジン複合体を解離させて標的核酸を回収する標的核酸の回収方法が提供される。
That is, in order to achieve the above object, in the present invention,
A target that recovers a target nucleic acid by dissociating the biotin-avidin complex by bringing a protein denaturant and ethylenediaminetetraacetic acid into contact with a solid phase carrier on which the target nucleic acid has been captured through the formation of a biotin-avidin complex. Nucleic acid recovery methods are provided.
好ましくは、前記タンパク質変性剤は、グアニジンチオシアン酸塩であり、更に、好ましくは、前記接触は、３５〜８０℃で行われる標的核酸の回収方法が提供される。 Preferably, the protein denaturing agent is guanidine thiocyanate, and more preferably, there is provided a method for recovering a target nucleic acid, wherein the contacting is performed at 35 to 80 ° C.
また、上記目的を達成するため、本発明において、
試料中に含まれる、ビオチン−アビジン複合体形成能を有する第１のメンバーで標識された標的核酸を、前記第１のメンバーとの間でビオチン−アビジン複合体形成能を有する第２メンバーの固相担体への結合、および、前記第１のメンバーと前記第２のメンバーの結合によるビオチン−アビジン複合体の形成を介して、標的核酸を固相担体に捕捉させる工程と、
前記固相担体に捕捉されなかった遊離核酸を除去する工程と、
前記固相担体にタンパク質変性剤およびエチレンジアミン四酢酸を接触させることにより、前記ビオチン−アビジン複合体を解離させて標的核酸を回収する工程とを有する標的核酸の回収方法が提供される。
In order to achieve the above object, in the present invention,
A target nucleic acid labeled with a first member having a biotin-avidin complex-forming ability contained in a sample is allowed to bind to a second member having a biotin-avidin complex-forming ability with the first member. Capturing a target nucleic acid on a solid phase carrier via binding to a phase carrier and formation of a biotin-avidin complex by binding of the first member and the second member;
Removing the free nucleic acid not captured by the solid phase carrier;
There is provided a method for recovering a target nucleic acid, comprising contacting the solid phase carrier with a protein denaturant and ethylenediaminetetraacetic acid to dissociate the biotin-avidin complex and recover the target nucleic acid.
好ましくは、前記タンパク質変性剤は、グアニジンチオシアン酸塩であり、更に、前記接触は、３５〜８０℃で行われる標的核酸の回収方法が提供される。 Preferably, the protein denaturant is guanidine thiocyanate, and further provided is a method for recovering a target nucleic acid, wherein the contacting is performed at 35 to 80 ° C.
そして、好ましくは、予め、試料中に含まれる標的核酸を、特異的にビオチン−アビジン複合体形成能を有する第１のメンバーで標識する工程を有する標的核酸の回収方法が提供される。 Preferably, a method for recovering a target nucleic acid is provided, which includes a step of labeling a target nucleic acid contained in a sample with a first member specifically having a biotin-avidin complex-forming ability in advance.
以下、具体的な本発明の実施の形態について説明するが、これはあくまでも本発明を例示するに留まり、本発明を限定するものではない。 Hereinafter, specific embodiments of the present invention will be described. However, these are merely examples of the present invention, and do not limit the present invention.
本発明は、ビオチン−アビジン複合体の形成と、該ビオチン−アビジン複合体の解離を利用することにより標的核酸の回収を行うものであり、ビオチン−アビジン複合体の解離をタンパク質変性剤およびエチレンジアミン四酢酸の存在下で行うことを特徴とするものである。 The present invention recovers a target nucleic acid by utilizing formation of a biotin-avidin complex and dissociation of the biotin-avidin complex. It is characterized in that it is carried out in the presence of acetic acid.
ここで、本明細書において「標的核酸」とは、回収対象である核酸を意味し、典型的には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡ、等のＤＮＡ、並びにｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、及び合成ＲＮＡ等のＲＮＡ、ペプチド核酸等であり、特に好ましくは、ＤＮＡ断片である。その起源および、長さ、塩基配列に対する制限なく、一本鎖、二本鎖、また、環状、直鎖状を問わず、いかなる核酸であってもよく、短鎖核酸のみならず７ｋｂ程度の長鎖核酸に対しても好ましく本発明を適用することができる。また、その構成成分はアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシルからなる単純ヌクレオチドのみならず、イノシン、メチルアデノシン等の修飾ヌクレオチドをも含み得る。 Here, the “target nucleic acid” in the present specification means a nucleic acid to be collected, typically, DNA such as cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA, and mRNA, total RNA, hnRNA, and RNA such as synthetic RNA, peptide nucleic acid and the like, particularly preferably a DNA fragment. There are no restrictions on its origin, length, and base sequence, and it may be any nucleic acid, whether single-stranded, double-stranded, circular, or linear. The present invention can also be preferably applied to strand nucleic acids. Moreover, the component may contain not only a simple nucleotide consisting of adenine, thymine, guanine, cytosine and uracil but also a modified nucleotide such as inosine and methyladenosine.
標的核酸の具体例としては、当該技術分野で常用されているＤＮＡ自動合成機等を使用して合成されたＤＮＡ断片、ｍＲＮＡを鋳型にして合成したｃＤＮＡ断片、ＰＣＲ等の増幅技術により増幅されたＤＮＡ断片等の人工的産物、ならびに原核生物および真核生物のあらゆる生物種に由来するＤＮＡ断片等を例示でき、いずれも標的核酸となり得る。 Specific examples of the target nucleic acid include DNA fragments synthesized using an automatic DNA synthesizer or the like commonly used in the technical field, cDNA fragments synthesized using mRNA as a template, and amplified by amplification techniques such as PCR. Artificial products such as DNA fragments, DNA fragments derived from all prokaryotic and eukaryotic species, and the like can be exemplified, and any of them can be a target nucleic acid.
本明細書における「ビオチン−アビジン複合体」について説明する。ビオチン−アビジン複合体とは、ビオチン−アビジン間の特異的な分子間相互作用により形成された特異的結合対を指し、解離定数（１０−１５Ｍ）に近似する解離定数を有する安定した複合体を意味する概念として使用されるものである。したがって、ビオチンとは、ビオチンのみならず、アビジンと上記のような安定した複合体を形成する点でビオチンと実質的に同様の動態を示すビオチン誘導体、ビオチン類縁体等を含む概念として使用され、具体的には、ビオシチン、ビスノルビオチン、デスチオビオチン、オキシビオチン等をも好適に利用できる。一方、「アビジン」とは、ビオチンと上記のような安定した複合体を形成する点でアビジンと同様の動態を示すものであれば、特に制限はなく、卵白から単離したもの、Streptomyces avidiniから単離したストレプトアビジンをも含み、更に、アビジン、ストレプトアビジンの修飾体もしくは断片をも好適に利用できる。また、天然由来、組換え体の別を問わない。 The “biotin-avidin complex” in the present specification will be described. The biotin-avidin complex refers to a specific binding pair formed by a specific intermolecular interaction between biotin and avidin, and represents a stable complex having a dissociation constant approximate to the dissociation constant (10 −15 M ). It is used as a meaning concept. Therefore, biotin is used as a concept that includes not only biotin but also biotin derivatives and biotin analogs that exhibit substantially the same kinetics as biotin in that it forms a stable complex with avidin as described above. Specifically, biocytin, bisnorbiotin, desthiobiotin, oxybiotin and the like can be suitably used. On the other hand, “avidin” is not particularly limited as long as it exhibits the same kinetics as avidin in that it forms a stable complex with biotin as described above, and is isolated from egg white, from Streptomyces avidini. The isolated streptavidin is also included, and a modified form or fragment of avidin or streptavidin can also be suitably used. It does not matter whether it is naturally derived or recombinant.
以下、本発明の方法を詳細に説明する。
本発明の第一の実施形態において、ビオチン−アビジン複合体の形成を介して標的核酸が捕捉された固相担体に、タンパク質変性剤およびエチレンジアミン四酢酸を接触させることより、標的核酸を回収する方法を提供する。つまり、ビオチン−アビジン複合体の形成を介して固相担体上に非標的分子を排除して特異的に捕捉された標的核酸を、タンパク質変性剤およびエチレンジアミン四酢酸の作用によりビオチン−アビジン複合体を解離することにより特異的に回収するものである。
Hereinafter, the method of the present invention will be described in detail.
In the first embodiment of the present invention, a method for recovering a target nucleic acid by bringing a protein denaturant and ethylenediaminetetraacetic acid into contact with a solid phase carrier on which the target nucleic acid has been captured through the formation of a biotin-avidin complex. I will provide a. In other words, the target nucleic acid specifically captured by eliminating the non-target molecule on the solid phase carrier through the formation of the biotin-avidin complex is converted into the biotin-avidin complex by the action of the protein denaturant and ethylenediaminetetraacetic acid. It is specifically recovered by dissociation.
回収の対象となるのは、固相担体上にビオチン−アビジン複合体の形成を介して捕捉された核酸である。ここで、固相担体とは、ビオチン−アビジン複合体の形成を介して標的核酸を捕捉するために使用される不溶性担体である。標的核酸は、ビオチン−アビジン複合体を形成可能な第１のメンバーによって標識され、前記第１のメンバーが、前記第１のメンバーとの間でビオチン−アビジン複合体形成能を有する第２のメンバーと相互作用してビオチン−アビジン複合体を形成すると共に、前記第２のメンバーが固相担体に固定化されることにより、標的核酸が固相担体に捕捉されている。ここで、「ビオチン−アビジン複合体を形成可能な第１のメンバー」とは、ビオチンもしくはアビジンであり、「前記第１のメンバーとの間でビオチン−アビジン複合体形成能を有する第２のメンバー」とは、前記第１のメンバーがビオチンであれば、第２のメンバーはアビジンであり、前記第１のメンバーがアビジンであれば、第２のメンバーはビオチンである。本発明の適応に際しては前者が特に好ましい。したがって、好ましくは、“固相担体−アビジン−ビオチン−標的核酸”の形態で標的核酸が固相担体に捕捉される。 The target of recovery is the nucleic acid captured through the formation of a biotin-avidin complex on the solid support. Here, the solid phase carrier is an insoluble carrier used for capturing a target nucleic acid through formation of a biotin-avidin complex. The target nucleic acid is labeled with a first member capable of forming a biotin-avidin complex, and the first member has a biotin-avidin complex-forming ability with the first member. To form a biotin-avidin complex, and the second member is immobilized on the solid phase carrier, whereby the target nucleic acid is captured on the solid phase carrier. Here, the “first member capable of forming a biotin-avidin complex” is biotin or avidin, and “the second member having the ability to form a biotin-avidin complex with the first member”. “If the first member is biotin, the second member is avidin; if the first member is avidin, the second member is biotin. The former is particularly preferred for the application of the present invention. Therefore, the target nucleic acid is preferably captured on the solid phase carrier in the form of “solid phase carrier-avidin-biotin-target nucleic acid”.
したがって、本発明で使用される固相担体としては、ビオチン−アビジン間の相互作用に悪影響を及ぼさないものであれば、その形状、大きさ、材質は特に制限はない。例えば、粒子状、板状あるいは繊維状等いずれでもよく、メンブレン、マイクロタイタープレート、試験管、又はスティック等の形状の不溶性担体を使用できる。また、材質は、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ナイロン、ガラス、金属、ラッテクス、ニトロセルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、及びアガロースであることができる。例えば、標的核酸がビオチンで標識される場合には、ミリポア社から提供されるMicropureＥＺ等のタンパク吸着フィルターが好適な固相担体として使用できる。 Therefore, the solid phase carrier used in the present invention is not particularly limited in shape, size and material as long as it does not adversely affect the biotin-avidin interaction. For example, it may be in the form of particles, plates, fibers or the like, and an insoluble carrier in the form of a membrane, a microtiter plate, a test tube, or a stick can be used. The material can also be polystyrene, polypropylene, polyethylene, polycarbonate, nylon, glass, metal, latex, nitrocellulose, dextran, polyacrylamide, and agarose. For example, when the target nucleic acid is labeled with biotin, a protein adsorption filter such as Micropure EZ provided by Millipore can be used as a suitable solid phase carrier.
固相担体上に特異的に捕捉された標的核酸を、ビオチン−アビジン複合体の解離により回収する。つまり、ビオチン−アビジン複合体が解離することにより、固相担体上に捕捉されていた標的核酸が固相担体から離れて遊離し、これにより標的核酸が回収される。このとき、標的核酸は標識核酸として遊離される。ここで、ビオチン−アビジン複合体の解離とは、該複合体を構成する分子間結合を弱めて単一の各メンバー、つまり、アビジンとビオチンに分離することを意味するものである。 The target nucleic acid specifically captured on the solid support is recovered by dissociation of the biotin-avidin complex. That is, when the biotin-avidin complex is dissociated, the target nucleic acid captured on the solid support is released away from the solid support and the target nucleic acid is recovered. At this time, the target nucleic acid is released as a labeled nucleic acid. Here, the dissociation of the biotin-avidin complex means that the intermolecular bond constituting the complex is weakened and separated into single members, that is, avidin and biotin.
本発明において、ビオチン−アビジン複合体の解離は、タンパク質変性剤とエチレンジアミン四酢酸の存在下で達成され、特にエチレンジアミン四酢酸の存在が必須である。エチレンジアミン四酢酸の存在によりビオチン−アビジン複合体の解離が促進される。 In the present invention, dissociation of the biotin-avidin complex is achieved in the presence of a protein denaturant and ethylenediaminetetraacetic acid, and in particular, the presence of ethylenediaminetetraacetic acid is essential. The presence of ethylenediaminetetraacetic acid promotes dissociation of the biotin-avidin complex.
エチレンジアミン四酢酸は、２価の金属イオンと錯塩を形成する二官能性のキレート剤である。 Ethylenediaminetetraacetic acid is a bifunctional chelating agent that forms a complex salt with a divalent metal ion.
ここで使用可能なタンパク質変性剤としては、タンパク質の高次の立体構造を変形させ、そのポリペプチド側鎖間の水素結合、疎水結合、イオン結合の多くを解離させ、タンパク質の有する機能を喪失もしくは改変させる能力を有するものであれば、特に制限されず、公知のタンパク質変性剤のいずれをも使用することができる。具体的には、グアニジンチオシアン酸塩等を好ましく例示することができるが、これに限定されるものではない。 As a protein denaturant that can be used here, the higher-order three-dimensional structure of the protein is deformed, and many of hydrogen bonds, hydrophobic bonds, and ionic bonds between the polypeptide side chains are dissociated, and the function of the protein is lost or lost. Any known protein denaturant can be used as long as it has an ability to be modified. Specifically, guanidine thiocyanate and the like can be preferably exemplified, but are not limited thereto.
タンパク質変性剤、エチレンジアミン四酢酸による標的核酸の回収に際しては、加温処理を行うことがビオチン−アビジン複合体の解離作用の促進の点から好ましい。即ち、加温によりビオチン−アビジン複合体の解離が促進され、フィルターに特異的に捕捉された標識核酸が効率よく遊離される。該加温処理は、３５℃以上で行うことにより上記効果が増大する。回収される標的核酸の安定性をも考慮すると、３５〜８０℃で行うことが好ましく、特には、３５〜６５℃で行うことが好ましい。 When recovering the target nucleic acid with the protein denaturant, ethylenediaminetetraacetic acid, it is preferable to perform a heating treatment from the viewpoint of promoting the dissociation action of the biotin-avidin complex. That is, dissociation of the biotin-avidin complex is promoted by heating, and the labeled nucleic acid specifically captured by the filter is efficiently released. The effect is increased by performing the heating treatment at 35 ° C. or higher. Considering also the stability of the target nucleic acid to be recovered, it is preferably performed at 35 to 80 ° C, particularly preferably at 35 to 65 ° C.
また、標的核酸の回収における、タンパク質変性剤とエチレンジアミン四酢酸の添加のタイミングは、加温処理時においてタンパク質変性剤が存在する形態が好ましく例示されるが、両者の添加タイミングは特に制限されるものではない。したがって、タンパク質変性剤の添加後に、エチレンジアミン四酢酸を添加することにより固相担体に接触させる形態も好ましく実施可能であり、当業者が適宜設定することができる。 In addition, the timing of the addition of the protein denaturant and ethylenediaminetetraacetic acid in the recovery of the target nucleic acid is preferably exemplified by the form in which the protein denaturant is present during the heating treatment, but the timing of addition of both is particularly limited is not. Therefore, a mode in which ethylenediaminetetraacetic acid is added and then brought into contact with the solid phase carrier after addition of the protein denaturant can be preferably implemented and can be appropriately set by those skilled in the art.
本発明の第二の実施形態は、本発明の第一の実施形態で示した方法を利用した、試料中に含まれる標的核酸を特異的に回収する方法を提供する。 The second embodiment of the present invention provides a method for specifically recovering a target nucleic acid contained in a sample using the method shown in the first embodiment of the present invention.
以下、図１を参照して詳細に説明する。具体的には、以下の工程を有する。
１．試料中に存在する標的核酸を、ビオチン−アビジン複合体の形成により特異的に固相担体に捕捉させる工程（以下、「標的核酸の捕捉工程」と略する。）
２．固相担体に捕捉されなかった遊離核酸を除去する工程（以下、「非標的核酸の除去工程」と称する。）
３．ビオチン−アビジン複合体を解離させることにより、標的核酸を固相担体から遊離させて回収する工程（以下、「解離工程」と称する。）
Hereinafter, this will be described in detail with reference to FIG. Specifically, it has the following processes.
1. A step of specifically capturing a target nucleic acid present in a sample on a solid phase carrier by forming a biotin-avidin complex (hereinafter abbreviated as “target nucleic acid capturing step”).
2. A step of removing free nucleic acid not captured by the solid phase carrier (hereinafter referred to as “non-target nucleic acid removal step”).
3. A step of releasing and recovering the target nucleic acid from the solid phase carrier by dissociating the biotin-avidin complex (hereinafter referred to as “dissociation step”).
ここで、試料とは、標的核酸を含み得る試料であれば特に制限はなく、例えば、全血、血漿、血清、尿、唾液、糞便、細胞培養物、培養上清等の、核酸を含み得る生物体由来の生物試料、また、必要に応じて生物試料に適当な処理を行った試料をも含み得る。例えば、生体試料に適当な細胞溶解液を添加して核酸を抽出した試料、制限酵素等で酵素処理した試料等が含まれる。また、生体試料から抽出された核酸をＰＣＲ等の増幅技術を用いて取得された増幅産物等も好ましく例示される。 Here, the sample is not particularly limited as long as it can contain the target nucleic acid, and can contain nucleic acids such as whole blood, plasma, serum, urine, saliva, stool, cell culture, and culture supernatant. Biological samples derived from living organisms, and samples obtained by appropriately treating biological samples as necessary may also be included. For example, a sample obtained by adding a suitable cell lysate to a biological sample and extracting a nucleic acid, a sample treated with a restriction enzyme, and the like are included. Moreover, the amplification product etc. which acquired the nucleic acid extracted from the biological sample using amplification techniques, such as PCR, are illustrated preferably.
１.標的核酸の捕捉工程
標的核酸の捕捉工程においては、ビオチン−アビジン複合体の形成を介して標的核酸を固相担体上に捕捉する。標的核酸の捕捉は、ビオチン−アビジン複合体形成能を有する第１のメンバーで標識された標的核酸を、前記第１のメンバーとの間でビオチン−アビジン複合体形成能を有する第２のメンバーの固相担体への固定化、および、前記第１のメンバーと前記２のメンバーの相互作用によるビオチン−アビジン複合体の形成を介して、固相担体上に捕捉される。例えば、標的核酸がビオチンにより標識化され、該標的核酸を標識するビオチンがアビジンと複合体を形成し、アビジンが固相担体に固定化されることにより達成され、その逆も可能である。このとき、該第１のメンバーとの間でビオチン−アビジン複合体形成能を有する第２のメンバーの固相担体への固定化、および、前記第１のメンバーと第２のメンバーの相互作用によるビオチン−アビジン複合体の形成は、いずれが先に行われても、また同時でもよい。
1. Target Nucleic Acid Capture Step In the target nucleic acid capture step, the target nucleic acid is captured on a solid phase carrier through the formation of a biotin-avidin complex. The target nucleic acid is captured by the target nucleic acid labeled with the first member having biotin-avidin complex-forming ability and the second member having biotin-avidin complex-forming ability with the first member. It is captured on the solid phase carrier through immobilization on the solid phase carrier and formation of a biotin-avidin complex by the interaction between the first member and the second member. For example, the target nucleic acid is labeled with biotin, biotin that labels the target nucleic acid forms a complex with avidin, and avidin is immobilized on a solid support, and vice versa. At this time, by immobilization of the second member having the biotin-avidin complex forming ability with the first member on the solid phase carrier and the interaction between the first member and the second member Either the biotin-avidin complex may be formed first or at the same time.
つまり、標的核酸を固相担体に捕捉させるための具体的な方法としては、アビジンで予め被覆処理した固相担体にビオチン標識された標的核酸を接触させる方法、ビオチン標識された標的核酸をアビジンと反応させた後、アビジンを固相担体に吸着させる方法等、種々の形態を例示でき、いずれをも使用することができる。この結果、標的核酸は固相担体上に選択的かつ特異的に捕捉される、一方で、標的核酸以外の非標的核酸は固相担体上に捕捉されず試料中に遊離状態で残存する。標的核酸の固相担体への捕捉に際しては、ビオチン−アビジン間の特異的な親和性結合の達成が必要な程度進行するため、十分な物理化学的条件下で、十分な時間インキュベーションが行われるものとする。また、アビジン、もしくは、ビオチンの固相担体への固定化は、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法を採用することができる。 That is, as a specific method for capturing a target nucleic acid on a solid phase carrier, a method of contacting a target nucleic acid labeled with biotin with a solid phase carrier previously coated with avidin, a target nucleic acid labeled with biotin and avidin After the reaction, various forms such as a method of adsorbing avidin on a solid phase carrier can be exemplified, and any of them can be used. As a result, the target nucleic acid is selectively and specifically captured on the solid phase carrier, while non-target nucleic acids other than the target nucleic acid are not captured on the solid phase carrier and remain in the sample in a free state. When capturing the target nucleic acid on the solid phase carrier, it will proceed to the extent necessary to achieve specific affinity binding between biotin and avidin, so that it will be incubated for a sufficient amount of time under sufficient physicochemical conditions. And For immobilization of avidin or biotin on a solid phase carrier, a known method such as a physical adsorption method, a chemical binding method, or a combination thereof can be employed.
本発明の方法においては、標的核酸はビオチン−アビジン複合体からなる特異的結合対を構成する第１のメンバーで標識されており、つまり、ビオチンもしくはアビジンで標識され、好ましくは、ビオチンで標識される。標的核酸が試料中に標識化状態で存在する場合を除いては、試料中に含まれる標的核酸のみを特異的に標識する条件下、つまり、回収対象の核酸以外の非標的核酸の標識化が生じず、標的核酸のみが標識化される条件下で、標的核酸の標識化を行うことが必要となる。好ましくは、配列特異的に標識化することにより標的核酸の特異的な標識化を行うことができる。例えば、試料をビオチンで標識された標的核酸を特異的に認識できるプローブと接触させることにより達成できる。 In the method of the present invention, the target nucleic acid is labeled with a first member constituting a specific binding pair consisting of a biotin-avidin complex, that is, labeled with biotin or avidin, preferably labeled with biotin. The Unless the target nucleic acid is present in a labeled state in the sample, the labeling of non-target nucleic acid other than the nucleic acid to be recovered is performed under conditions that specifically label only the target nucleic acid contained in the sample. It is necessary to label the target nucleic acid under conditions that do not occur and only the target nucleic acid is labeled. Preferably, the target nucleic acid can be specifically labeled by labeling in a sequence-specific manner. For example, it can be achieved by contacting the sample with a probe capable of specifically recognizing a target nucleic acid labeled with biotin.
プローブは、既知の方法によって調製され、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法、既に標的となる核酸が取得されている場合にはその制限酵素断片等が利用可能である。化学合成法に基づきプローブを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいて設計される。プローブは合成後、ＨＰＬＣ等の手段により精製される。また、化学合成を行う場合には市販の自動合成装置を利用することも可能である。 The probe is prepared by a known method, and a chemical synthesis method based on the phosphoramidite method or the like, or a restriction enzyme fragment or the like when a target nucleic acid has already been obtained can be used. When a probe is prepared based on a chemical synthesis method, it is designed based on the sequence information of the target nucleic acid prior to synthesis. After the synthesis, the probe is purified by means such as HPLC. Moreover, when performing chemical synthesis, it is also possible to use a commercially available automatic synthesizer.
プローブのビオチン標識化は既知の方法に基づいて行うことが可能である。例えば、予めビオチンが導入されているプローブを取得するためには、ＤＮＡ合成の際に、アマシャム社から市販されているBiotin phosphoramidite等のビオチンホスホアミダイドを用いて５´末端にビオチンを導入する方法、ビオチン化試薬、例えば、ライフ テクノロジー社から市販されているphotobiotin Labeling System等によりビオチン標識を行う方法等が使用可能である。 The biotin labeling of the probe can be performed based on a known method. For example, in order to obtain a probe in which biotin has been introduced in advance, a method of introducing biotin at the 5 ′ end using biotin phosphoramidite such as Biotin phosphoramidite commercially available from Amersham during DNA synthesis. A biotinylated reagent, for example, a method of labeling biotin with a photobiotin labeling system commercially available from Life Technology, etc. can be used.
標的核酸の標識化に用いられるプローブは、回収対象となる標的核酸の所定の領域、好ましくは、標的核酸の末端領域、の配列に相補的になるように選択された配列を有するものであり、標的核酸を配列選択的に捕捉するように構成される。ここで、相補的とは、プローブと標的核酸が塩基対合則に従って特異的に結合し安定な二重鎖構造を形成できることを意味し、完全な相補性のみならず、プローブと標的核酸が互いに安定な二重鎖構造を形成し得るのに十分である限り、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合則に沿って適合する部分的な相補性であっても許容される。具体的には、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ断片等からなるものが例示され、一本鎖、二本鎖核酸であり得るが、好ましくは一本鎖オリゴヌクレオチドである。その塩基数は、標的核酸を特異的に認識するために十分に長くなければならないが、長すぎると逆に非特異的反応を誘発するので好ましくない。したがって、適当な長さはＧＣ含量等の標的核酸の配列情報、並びに、反応温度、反応液中の塩濃度等のハイブリダイゼーション反応条件など多くの因子に依存して決定されるが、好ましくは、少なくとも１６塩基、更に好ましくは２０〜５０塩基である。 The probe used for labeling the target nucleic acid has a sequence selected so as to be complementary to the sequence of a predetermined region of the target nucleic acid to be recovered, preferably the terminal region of the target nucleic acid, It is configured to capture target nucleic acids in a sequence selective manner. Here, the term “complementary” means that the probe and the target nucleic acid can be specifically bound according to the base pairing rule to form a stable double-stranded structure. As long as it is sufficient to be able to form a stable duplex structure, only some nucleobases are allowed to have partial complementarity that fits along the base-pairing rules. Specific examples include oligonucleotides, RNA, DNA fragments and the like, which may be single-stranded or double-stranded nucleic acids, but are preferably single-stranded oligonucleotides. The number of bases must be long enough to specifically recognize the target nucleic acid, but if it is too long, a non-specific reaction is induced, which is not preferable. Accordingly, an appropriate length is determined depending on many factors such as target nucleic acid sequence information such as GC content, and hybridization reaction conditions such as reaction temperature and salt concentration in the reaction solution. At least 16 bases, more preferably 20 to 50 bases.
２．非標的核酸の除去工程
非標的核酸の除去工程においては、固相担体に捕捉されずに遊離状態で存在する非標的核酸が固相担体上から除去される。固相担体に捕捉されずに遊離状態で存在する非標的核酸を除去することにより、試料中からの標的核酸の選択的かつ特異的な分離が達成される。非標的核酸を除去する方法としては、ビオチン−アビジン相互間の特異的結合に影響を与えない限り制限はなく、例えば、標的核酸を捕捉した固相担体の洗浄、ろ過、遠心分離、ふるい、等の公知の手段よって達成される。また、固相担体として、常磁性担体、もしくは磁性担体を使用する場合には、磁石等の磁気的分離方法も好適に利用できる。
2. Non-target Nucleic Acid Removal Step In the non-target nucleic acid removal step, non-target nucleic acids that are present in a free state without being captured by the solid phase carrier are removed from the solid phase carrier. By removing the non-target nucleic acid that is present in the free state without being captured by the solid phase carrier, selective and specific separation of the target nucleic acid from the sample is achieved. The method for removing the non-target nucleic acid is not limited as long as it does not affect the specific binding between biotin and avidin. For example, washing, filtration, centrifugation, sieving, etc. This is achieved by known means. In addition, when a paramagnetic carrier or a magnetic carrier is used as the solid phase carrier, a magnetic separation method such as a magnet can be suitably used.
３．解離工程
解離工程においては、ビオチン−アビジン複合体の解離により固相担体上に特異的に捕捉された標的核酸が回収される。つまり、ビオチン−アビジン複合体が解離することにより、固相担体上に捕捉されていた標的核酸が固相担体から遊離し、これにより標的核酸が試料中から特異的かつ選択的に回収される。このとき、標的核酸は標識核酸として遊離される。ここで、ビオチン−アビジン複合体の解離とは、該複合体を構成する分子間結合を弱めて単一の各メンバー、つまり、アビジンとビオチンに分離することを意味するものである。
3. Dissociation step In the dissociation step, the target nucleic acid specifically captured on the solid support by the dissociation of the biotin-avidin complex is recovered. That is, when the biotin-avidin complex is dissociated, the target nucleic acid captured on the solid phase carrier is released from the solid phase carrier, whereby the target nucleic acid is specifically and selectively recovered from the sample. At this time, the target nucleic acid is released as a labeled nucleic acid. Here, the dissociation of the biotin-avidin complex means that the intermolecular bond constituting the complex is weakened and separated into single members, that is, avidin and biotin.
本発明において、ビオチン−アビジン複合体の解離は、タンパク質変性剤とエチレンジアミン四酢酸の存在下で達成され、特にエチレンジアミン四酢酸の存在が必須である。エチレンジアミン四酢酸の存在によりビオチン−アビジン複合体の解離が促進される。 In the present invention, dissociation of the biotin-avidin complex is achieved in the presence of a protein denaturant and ethylenediaminetetraacetic acid, and in particular, the presence of ethylenediaminetetraacetic acid is essential. The presence of ethylenediaminetetraacetic acid promotes dissociation of the biotin-avidin complex.
また、タンパク質変性剤、エチレンジアミン四酢酸による標的核酸の回収に際しては、加温処理を行うことがビオチン−アビジン複合体の解離作用の促進の点から好ましい。即ち、加温によりビオチン−アビジンの特異的結合の解離が促進され、フィルターに特異的に捕捉された標的ＤＮＡが効率よく遊離される。該加温処理は、３５℃以上で行うことにより上記効果が増大する。回収される標的核酸の安定性をも考慮すると、３５〜８０℃で行うことが好ましく、特には、３５〜６５℃で行うことが好ましい。 In addition, when recovering the target nucleic acid using a protein denaturant or ethylenediaminetetraacetic acid, it is preferable to perform a heating treatment in terms of promoting the dissociation action of the biotin-avidin complex. That is, dissociation of the specific binding of biotin-avidin is promoted by heating, and the target DNA specifically captured by the filter is efficiently released. The effect is increased by performing the heating treatment at 35 ° C. or higher. Considering also the stability of the target nucleic acid to be recovered, it is preferably performed at 35 to 80 ° C, particularly preferably at 35 to 65 ° C.
以上のように構成することにより、核酸の混合物等の試料から所望の核酸の回収が可能となる。本発明は、非常に強固な特異的結合対を形成するビオチン−アビジンの相互作用を利用するものであることから、試料中に含まれる標的核酸の濃度が低い場合であって、良好に所望の標的核酸を選択的かつ特異的に回収できる。 By configuring as described above, desired nucleic acid can be recovered from a sample such as a mixture of nucleic acids. Since the present invention utilizes the biotin-avidin interaction that forms a very strong specific binding pair, the target nucleic acid contained in the sample is low in concentration, The target nucleic acid can be selectively and specifically recovered.
以下に、具体例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の趣旨を逸脱しない限り、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with specific examples. However, the present invention is not limited to these examples without departing from the gist of the present invention.
実施例１：タンパク質変性剤とエチレンジアミン四酢酸の作用による標識ＤＮＡの回収
タンパク質変性剤とエチレンジアミン四酢酸の作用によりビオチン−アビジン複合体の解離を促進可能であり、これを利用することにより標的ＤＮＡを高い回収率で回収することが可能であることを示すため、以下に掲げる実験を行った。
Example 1: Recovery of labeled DNA by the action of a protein denaturing agent and ethylenediaminetetraacetic acid The dissociation of the biotin-avidin complex can be promoted by the action of a protein denaturing agent and ethylenediaminetetraacetic acid. In order to show that it is possible to recover at a high recovery rate, the following experiment was conducted.
標的核酸として、６００ｂｐのビオチン標識ＤＮＡを使用した。６００ｂｐのビオチン標識ＤＮＡ ５０ｎｇとストレプトアビジン（ロシュ・ダイアゴノスティック社製）１μｇを、５０μｌの終濃度３０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム溶液中で混合し、３７℃にて３０分間インキュベートしてビオチン−ストレプトアビジン複合体を形成させた。インキュベート後の混合溶液をMicropureＥＺカラム（ミリポア社製）に入れ、ストレプトアビジンのフィルターへの吸着を介して標識ＤＮＡをフィルターに捕捉させた後、遠心分離により濾過を行った。続いて、５０μｌの３０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム溶液で２度洗浄を行った。洗浄後、５０μｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５Ｍグアニジンチオシアン酸塩溶液を用いてフィルター上の捕捉標識ＤＮＡを溶出し、３７℃にて１５分間インキュベーションした後、１／１０容量の５００ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ｐＨ８．０）溶液と、２倍量の２―プロパノールを添加して遠心分離を行うことにより、ＤＮＡを沈殿させて回収した。回収後、電気泳動を行いゲル染色により可視化した。結果を図２、レーン５に示す。 A 600 bp biotin-labeled DNA was used as the target nucleic acid. 50 ng of 600 bp biotin-labeled DNA and 1 μg of streptavidin (Roche Diagnostics) were mixed in 50 μl of a final concentration of 30 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 10 mM magnesium chloride solution, and the mixture was mixed at 37 ° C. for 30 minutes. Incubated for minutes to form a biotin-streptavidin complex. The mixed solution after incubation was placed in a Micropure EZ column (manufactured by Millipore), and the labeled DNA was captured on the filter through adsorption of streptavidin to the filter, followed by filtration by centrifugation. Subsequently, washing was performed twice with 50 μl of 30 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 10 mM magnesium chloride solution. After washing, the capture labeled DNA on the filter was eluted with 50 μl of 50 mM sodium acetate (pH 6.0), 5M guanidine thiocyanate solution, incubated at 37 ° C. for 15 minutes, and then 1/10 volume of 500 mM ethylenediamine. By adding a tetraacetic acid (pH 8.0) solution and 2-fold amount of 2-propanol and performing centrifugation, the DNA was precipitated and recovered. After collection, electrophoresis was performed and visualization was performed by gel staining. The results are shown in FIG.
図２中、レーン１は分子量マーカーとしての１００ｂｐのラダー、レーン２は６００ｂｐのビオチン標識ＤＮＡ、レーン３は６００ｂｐのビオチン標識ＤＮＡとストレプトアビジンの混合溶液を、上記と同様にしてMicropureＥＺカラムに適用した素通り画分である。レーン４は回収に際してエチレンジアミン四酢酸を添加しないで反応を行った以外はレーン５と同様の手順に従ったものである。 In FIG. 2, lane 1 is a 100 bp ladder as a molecular weight marker, lane 2 is a 600 bp biotin labeled DNA, lane 3 is a 600 bp biotin labeled DNA and streptavidin mixed solution applied to a Micropure EZ column in the same manner as described above. It is a pass-through fraction. Lane 4 follows the same procedure as Lane 5 except that the reaction was carried out without adding ethylenediaminetetraacetic acid.
図２の結果、回収に際してエチレンジアミン四酢酸を添加することにより、ＤＮＡの回収率が上昇することが認められた（レーン４、レーン５の比較）。以上のことより、エチレンジアミン四酢酸の存在がビオチン−ストレプトアビジンの特異的結合の解離を促進し、フィルターに特異的に捕捉された標識ＤＮＡを効率よく遊離させることができることが判明した。 As a result of FIG. 2, it was confirmed that the recovery rate of DNA was increased by adding ethylenediaminetetraacetic acid during the recovery (comparison of lanes 4 and 5). From the above, it has been found that the presence of ethylenediaminetetraacetic acid promotes dissociation of the specific binding of biotin-streptavidin, and can efficiently release the labeled DNA specifically captured by the filter.
実施例２：加温条件下でのタンパク質変性剤とエチレンジアミン四酢酸の作用による標識ＤＮＡの回収
加温により、タンパク質変性剤とエチレンジアミン四酢酸の作用によるビオチン−アビジン複合体の解離を更に促進可能であり、これを利用することにより標的ＤＮＡを高い回収率で回収することが可能であることを示すため、種々の温度条件を設定して以下に掲げる実験を行った。
Example 2: Recovery of labeled DNA by the action of a protein denaturant and ethylenediaminetetraacetic acid under heating conditions By heating, the dissociation of the biotin-avidin complex by the action of a protein denaturant and ethylenediaminetetraacetic acid can be further promoted. In order to show that it is possible to recover the target DNA at a high recovery rate by using this, various temperature conditions were set and the following experiments were conducted.
標的核酸としては、実施例１と同様に６００ｂｐのビオチン標識ＤＮＡを使用した。６００ｂｐのビオチン標識ＤＮＡ ５０ｎｇとストレプトアビジン（ロシュ・ダイアゴノスティック社製）１μｇを、５０μｌの終濃度３０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム溶液中で混合し、３７℃にて３０分間インキュベートし、ビオチン−ストレプトアビジン複合体を形成させた。インキュベート後の混合溶液をMicropureＥＺカラム（ミリポア社製）に入れ、フィルターにストレプトアビジンを介して標的ＤＮＡ断片を捕捉させた後、遠心分離を行うことにより濾過を行った。続いて、５０μｌの３０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム溶液で２度洗浄を行った。洗浄後、５０μｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５Ｍグアニジンチオシアン酸塩溶液を用いてフィルター上の捕捉標識ＤＮＡを溶出し、２５℃、３５℃、４５℃、５５℃もしくは６５℃にて１５分間インキュベーションした後、１／１０容量の５００ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ｐＨ８．０）溶液と、２倍量の２−プロパノールを添加して遠心分離を行うことにより、ＤＮＡを沈殿させて回収した。回収後、電気泳動を行い、ゲル染色により可視化した。結果を図３に示し、レーン３、レーン４、レーン５、レーン６、レーン７は、夫々、２５℃、３５℃、４５℃、５５℃もしくは６５℃にて溶出を行った結果を示す。 As the target nucleic acid, 600 bp of biotin-labeled DNA was used as in Example 1. 50 ng of 600 bp biotin-labeled DNA and 1 μg of streptavidin (Roche Diagnostics) were mixed in 50 μl of a final concentration of 30 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 10 mM magnesium chloride solution, and the mixture was mixed at 37 ° C. for 30 minutes. Incubated for minutes to form a biotin-streptavidin complex. The mixed solution after the incubation was put into a Micropure EZ column (Millipore), and the target DNA fragment was captured by the filter via streptavidin, followed by filtration by centrifugation. Subsequently, washing was performed twice with 50 μl of 30 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 10 mM magnesium chloride solution. After washing, the capture-labeled DNA on the filter was eluted with 50 μl of 50 mM sodium acetate (pH 6.0), 5M guanidine thiocyanate solution, and 15 ° C. at 25, 35, 45, 55 or 65 ° C. After incubation for 1 minute, 1/10 volume of a 500 mM ethylenediaminetetraacetic acid (pH 8.0) solution and 2 volumes of 2-propanol were added and centrifuged to precipitate and collect DNA. After recovery, electrophoresis was performed and visualization was performed by gel staining. The results are shown in FIG. 3, and lane 3, lane 4, lane 5, lane 6 and lane 7 show the results of elution at 25 ° C., 35 ° C., 45 ° C., 55 ° C. or 65 ° C., respectively.
また、図３中、レーン１、レーン８は分子量マーカーとしての１００ｂｐのラダー、レーン２は６００ｂｐのビオチン標識ＤＮＡである。 In FIG. 3, lanes 1 and 8 are 100 bp ladders as molecular weight markers, and lane 2 is 600 bp biotin-labeled DNA.
図３の結果より、回収に際して加温することにより、標的ＤＮＡ断片の回収率が上昇することが認められた（レーン３、レーン４、レーン５、レーン６およびレーン７の比較）。以上のことから、加温によりビオチン−アビジンの特異的結合の解離を促進し、フィルターに特異的に捕捉された標識ＤＮＡを効率よく遊離させることができることが判明した。 From the results shown in FIG. 3, it was confirmed that the recovery rate of the target DNA fragment was increased by heating during the recovery (comparison of lane 3, lane 4, lane 5, lane 6 and lane 7). From the above, it was proved that dissociation of the specific binding of biotin-avidin is promoted by heating, and the labeled DNA specifically captured by the filter can be efficiently released.
実施例３：標識ＤＮＡの塩基長による回収率の変化−１
本発明の方法が、回収対象となる標的ＤＮＡ、並びに、試料中に混在する非標的ＤＮＡの塩基長に影響されることなく、高収率で標的ＤＮＡを回収できることが可能であることを示すため、以下に掲げる実験を行った。
Example 3: Change in recovery rate due to base length of labeled DNA-1
In order to show that the method of the present invention can recover target DNA in high yield without being affected by the target DNA to be recovered and the base length of non-target DNA mixed in the sample. The following experiments were conducted.
１ｋｂプラスＤＮＡラダー（インビトロジェン社製）１００ｎｇおよび６００ｂｐのビオチン標識ＤＮＡ ５０ｎｇとストレプトアビジン（ロシュ・ダイアゴノスティック社製）１μｇとを、５０μｌの終濃度３０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム溶液中で混合し、３７℃にて３０分間インキュベートし、ビオチン−ストレプトアビジン複合体を形成させた。インキュベート後の混合溶液をMicropureＥＺカラム（ミリポア社製）に入れ、ストレプトアビジンのフィルターへの吸着を介して標識ＤＮＡをフィルターに捕捉させた後、遠心分離を行うことにより濾過を行った。続いて、５０μｌの３０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム溶液で２度洗浄を行った。洗浄後、５０μｌのWizard SV Membrane binding Solution(プロメガ社製)を用いてフィルター上の捕捉標識ＤＮＡを溶出し、３７℃にて１５分間インキュベーションした後、１／１０容量の５００ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ｐＨ８．０）溶液と、２倍量の２―プロパノールを添加して遠心分離を行うことにより、ＤＮＡを沈殿させて回収した。回収後、電気泳動を行い、ゲル染色により可視化した。結果を図４、レーン６に示す。 100 ng of 1 kb plus DNA ladder (manufactured by Invitrogen) and 50 ng of biotin-labeled DNA of 600 bp and 1 μg of streptavidin (manufactured by Roche Diagnostics), 50 μl final concentration of 30 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM chloride Mixed in magnesium solution and incubated at 37 ° C. for 30 minutes to form biotin-streptavidin complex. The mixed solution after the incubation was placed in a Micropure EZ column (manufactured by Millipore), and the labeled DNA was captured by the filter through adsorption of streptavidin to the filter, followed by filtration by centrifugation. Subsequently, washing was performed twice with 50 μl of 30 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 10 mM magnesium chloride solution. After washing, the capture labeled DNA on the filter was eluted using 50 μl of Wizard SV Membrane binding Solution (Promega), incubated at 37 ° C. for 15 minutes, and then 1/10 volume of 500 mM ethylenediaminetetraacetic acid (pH 8. 0) DNA was precipitated and recovered by adding the solution and 2 volumes of 2-propanol and centrifuging. After recovery, electrophoresis was performed and visualization was performed by gel staining. The results are shown in FIG.
また、図４中、レーン１およびレーン７は分子量マーカーとしての１００ｂｐのラダー、レーン２は６００ｂｐのビオチン標識ＤＮＡ、レーン３は１ｋｂのラダー、レーン４は１ｋｂのラダーおよび６００ｂｐのビオチン標識ＤＮＡ、レーン５は、レーン６と同じ試料を、上記と同様にしてカラムに適用した際のカラムからの素通り画分である。 4, Lane 1 and Lane 7 are 100 bp ladders as molecular weight markers, Lane 2 is 600 bp biotin-labeled DNA, Lane 3 is 1 kb ladder, Lane 4 is 1 kb ladder and 600 bp biotin-labeled DNA, Lane 5 is a flow-through fraction from the column when the same sample as in lane 6 is applied to the column in the same manner as described above.
図４の結果より、６００ｂｐの短鎖の標識ＤＮＡ断片を回収率９０％以上で回収できることが認められると共に（レーン６、回収率はレーン２との比較。）、試料中に長鎖ＤＮＡが混在している場合においても、効率よく標的ＤＮＡ断片を回収できることが判明した。 From the result of FIG. 4, it is recognized that a 600 bp short-chain labeled DNA fragment can be recovered at a recovery rate of 90% or more (lane 6, recovery rate is compared with lane 2), and long-chain DNA is mixed in the sample. It has been found that the target DNA fragment can be efficiently recovered even in the case where the target DNA fragment is used.
実施例４：標識ＤＮＡの塩基長による回収率の変化−２
１００ｂｐＤＮＡラダー（インビトロジェン社製）１００ｎｇおよび７ｋｂのビオチン標識ＤＮＡ ５０ｎｇとストレプトアビジン（ロシュ・ダイアゴノスティック社製）１μｇとを、５０μｌの終濃度３０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム溶液中で混合し、３７℃にて３０分間インキュベートし、ビオチン−ストレプトアビジン複合体を形成させた。インキュベート後の混合溶液をMicropureＥＺカラム（ミリポア社製）に入れ、ストレプトアビジンへのフィルターの吸着を介して標識ＤＮＡをフィルターに捕捉させた後、遠心分離を行うことにより濾過を行った。続いて、５０μｌの３０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム溶液で２度洗浄を行った。洗浄後、５０μｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５Ｍグアニジンチオシアン酸塩溶液を用いてフィルター上の捕捉標識ＤＮＡを溶出し、３７℃にて１５分間インキュベーションした後、１／１０容量の５００ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ｐＨ８．０）溶液と、２倍量の２―プロパノールを添加して遠心分離を行うことにより、ＤＮＡを沈殿させて回収した。回収後、電気泳動を行い、ゲル染色により可視化した。結果を図５、レーン６に示す。
Example 4: Change in recovery rate due to base length of labeled DNA-2
100 ng of 100 bp DNA ladder (manufactured by Invitrogen) and 50 ng of biotin-labeled DNA of 7 kb and 1 μg of streptavidin (manufactured by Roche Diagnostics), 50 μl final concentration of 30 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride solution Mixed in and incubated at 37 ° C. for 30 minutes to form a biotin-streptavidin complex. The mixed solution after the incubation was placed in a Micropure EZ column (manufactured by Millipore), and the labeled DNA was captured by the filter through adsorption of the filter to streptavidin, followed by filtration by centrifugation. Subsequently, washing was performed twice with 50 μl of 30 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 10 mM magnesium chloride solution. After washing, the capture labeled DNA on the filter was eluted with 50 μl of 50 mM sodium acetate (pH 6.0), 5M guanidine thiocyanate solution, incubated at 37 ° C. for 15 minutes, and then 1/10 volume of 500 mM ethylenediamine. By adding a tetraacetic acid (pH 8.0) solution and 2-fold amount of 2-propanol and performing centrifugation, the DNA was precipitated and recovered. After recovery, electrophoresis was performed and visualization was performed by gel staining. The results are shown in FIG.
また、図５中、レーン１およびレーン７は分子量マーカーとしての１００ｂｐのラダー、レーン２は７ｋｂのビオチン標識ＤＮＡ、レーン３は２５０ｂｐのラダー、レーン４は２５０ｂｐのラダーおよび７ｋｂのビオチン標識ＤＮＡ、レーン５は、レーン６と同じ試料を、同様にカラムに適用した際のカラムからの素通り画分である。 In FIG. 5, lane 1 and lane 7 are 100 bp ladders as molecular weight markers, lane 2 is 7 kb biotin labeled DNA, lane 3 is 250 bp ladder, lane 4 is 250 bp ladder and 7 kb biotin labeled DNA, lane 5 is a flow-through fraction from the column when the same sample as in lane 6 is applied to the column in the same manner.
図５の結果より、７ｋｂの長鎖の標識ＤＮＡ断片を回収率９０％以上で回収できることが認められた（レーン６、回収率はレーン２との比較。）。実施例３の結果とも併せて、本願の方法により回収の対象となる標的ＤＮＡの塩基長に制限されることなく効率的に標的ＤＮＡを回収できることが判明した。また、本発明の方法は、試料中に混入するＤＮＡの塩基長にその効果を制限されることないことも同時に判明した。 From the results of FIG. 5, it was confirmed that the 7 kb long labeled DNA fragment could be recovered at a recovery rate of 90% or more (lane 6, recovery rate compared to lane 2). Together with the results of Example 3, it was found that the target DNA can be efficiently recovered by the method of the present application without being limited by the base length of the target DNA to be recovered. It was also found that the effect of the method of the present invention is not limited by the DNA base length mixed in the sample.
（効果）
本発明の方法を用いれば、核酸が混在する試料から所望の核酸以外の核酸を除外して、特異的に所望の核酸のみを高い回収率で回収することができる。また、核酸の塩基長による回収率の変動はなく効率的に回収できることから、広範な利用価値を有する。
(effect)
By using the method of the present invention, nucleic acids other than the desired nucleic acid can be excluded from the sample in which the nucleic acid is mixed, and only the desired nucleic acid can be specifically recovered with a high recovery rate. In addition, there is no fluctuation in the recovery rate due to the base length of the nucleic acid, and it can be recovered efficiently, so it has a wide utility value.
Claims (7)
ビオチン−アビジン複合体の形成を介してビオチン化された標的核酸が捕捉された固相担体に、タンパク質変性剤を接触させて前記ビオチン化標的核酸−アビジン複合体を溶出し、当該溶出物にエチレンジアミン四酢酸を添加することにより、前記ビオチン−アビジン複合体を解離させて標的核酸を回収する標的核酸の回収方法。 A method for recovering a biotinylated target nucleic acid,
The biotinylated target nucleic acid-avidin complex is eluted by bringing the protein denaturant into contact with a solid phase carrier on which the biotinylated target nucleic acid has been captured through the formation of the biotin- avidin complex , and ethylenediamine is added to the eluate. A method for recovering a target nucleic acid, comprising adding tetraacetic acid to dissociate the biotin-avidin complex and recovering the target nucleic acid.
試料中に含まれる、ビオチン化された標的核酸を、アビジン化された固相担体へ、ビオチン−アビジン複合体の形成を介して標的核酸を固相担体に捕捉させる工程と、
前記固相担体に捕捉されなかった遊離核酸を除去する工程と、
前記固相担体に、タンパク質変性剤を接触させて前記ビオチン化標的核酸−アビジン複合体を溶出し、当該溶出物にエチレンジアミン四酢酸を添加することにより、前記ビオチン−アビジン複合体を解離させて標的核酸を回収する工程とを有する標的核酸の回収方法。 A method for recovering a biotinylated target nucleic acid,
Capturing the biotinylated target nucleic acid contained in the sample onto an avidinized solid phase carrier and capturing the target nucleic acid on the solid phase carrier through formation of a biotin-avidin complex;
Removing the free nucleic acid not captured by the solid phase carrier;
A protein denaturant is brought into contact with the solid phase carrier to elute the biotinylated target nucleic acid-avidin complex , and ethylenediaminetetraacetic acid is added to the eluate to dissociate the biotin-avidin complex to target A method for recovering a target nucleic acid, comprising the step of recovering the nucleic acid.
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