JP4734629B2 - 新規微生物、脂質改質剤及び2−アシルリゾリン脂質の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、シュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属し、ホスホリパーゼA1活性を有する酵素を産生する新規微生物、この新規微生物によって産生されたホスホリパーゼA1活性を有する酵素を有効量含有する脂質改質剤及びこの新規微生物によって産生されたホスホリパーゼA1活性を有する酵素を用いてリン脂質を加水分解し、2−アシルリゾリン脂質を得る2−アシルリゾリン脂質の製造方法に関する。
リゾリン脂質は通常のリン脂質より高い界面活性を有し、食品の乳化安定性、食感、弾力性をリン脂質以上に改善できるとともに、他の乳化剤の使用量を節約することができ、食品への利用に際して極めて効果的な脂質形態であることが知られている。また、食品用途の他に化粧品用乳化剤としても利用価値がある。
現在、リゾリン脂質の工業的な調製方法としてはホスホリパーゼA2による方法が知られている。ただ、このホスホリパーゼA2は豚膵臓を起源とする酵素だけであり、2−アシルリゾリン脂質によるエマルジョンに比べて、1−アシルリゾリン脂質によるエマルジョンは油層分離率が著しく低い点(第35回油化学討論会、講演番号P10)で問題がある。
ホスホリパーゼはトリグリセリドを加水分解しないので、基質中にトリグリセリドが存在していても、ジグリセリドやモノグリセリドが生成せず、リン脂質の加水分解生成物であるリゾリン脂質の精製を阻害しない。
特開平6−62850号公報、特開平7−31472号公報、特開平7−222592号公報等に開示されているように、糸状菌等の真菌に由来するホスホリパーゼA1の調製法が開発されているが、培養に長時間を要し菌体を含む培地からの酵素の抽出操作は煩雑である。
ホスホリパーゼA1は動物の膵臓や肝臓、微生物に存在し、ホスホリパーゼA2と共にリン脂質の代謝回転に寄与している。また、リン脂質の脂肪酸分子内分布の解析や脂質生化学研究において有用な酵素であるが、現在のところ精製品も含めて市販品はない。
特開平6−62850号公報
特開平7−31472号公報
特開平7−222592号公報
本発明の目的は、リン脂質の改質、脂質生化学研究などに有用なホスホリパーゼA1の新たな供給源を提供すると共に、DHA高含有リン脂質及びリゾリン脂質をより効率良く大量に調製しうる方法を提供することにある。
本発明者等は上述の課題を解決するために鋭意研究した結果、シュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属する微生物HFKI−0020株(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERMP−20545として寄託)の培養液中にホスホリパーゼA1活性を検出した。
すなわち本発明は、シュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属し、ホスホリパーゼA1活性を有する酵素を分泌する微生物HFKI−0020株(FERMP−20545)、この酵素を含む培養液を有効成分とする脂質改質剤及びこの脂質改質剤を用いてリン脂質を加水分解する2−アシルリゾリン脂質の製造方法を提供する。
本発明によれば、リン脂質の改質、脂質生化学研究などに有用なホスホリパーゼA1活性を有する酵素の新たな供給源を提供することができるという利点がある。
また、本発明の微生物によれば、ホスホリパーゼA1活性を有する酵素を菌体外の培養液中に分泌するので、酵素が菌体の内部に留まっている菌の場合と比べ、酵素を大量に生産することができるという利点がある。
また、本発明の微生物によれば、ホスホリパーゼA1活性を有する酵素を菌体外の培養液中に分泌するので、酵素を菌体内に産生する菌から酵素を回収する場合より分画が容易で、酵素を培養液から容易に回収することができるという利点がある。
また、本発明の脂質改質剤(培養液)によれば、10℃という低温状況下においても2−アシルリゾリン脂質を効率良く製造することができるという利点がある。また、2−アシル基がDHA(ドコサヘキサエン酸)であるものを用いると、DHA高含有リン脂質及びリゾリン脂質を製造しうる。
本発明において、培養液とは、Pseudomonas sp. HFKI−0020株(FERMP−20545)を培養して得られる培養産物をすべて包含するものであり、菌体を含んでいても、含んでいなくてもよい。本発明の培養液は、これらの菌株を、例えば常法に従ってペプトンと酵母エキスを含む培地で培養した後、慣用の方法で単離、精製することにより得られる。本発明の調製法及び製造法においては、遠心によって菌体を除去した培地(培養上清)を用いることが好ましい。基質としては大豆、菜種などの植物、イクラ、イカ、卵黄などの陸産及び海産動物、バクテリア、酵母などの微生物由来の天然に存在するリン脂質、及び化学的、酵素的に調製されたリン脂質など、sn-1位エステル結合を有するリン脂質であれば用いることができる。
微生物HFKI−0020株(FERMP−20545)の同定を実施した結果、シュードモナス(Pseudomonas sp.)属であると同定された。以下に、形態観察、生理・生化学性状試験及び16S rDNA (16S rRNA遺伝子)塩基配列解析の方法並びに微生物試験、解析結果を示す。
シュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属する微生物HFKI−0020株(FERMP−20545)の培養方法は、K28培地を用いる。表1にK28培地組成を示す。培養温度は10℃で好気条件にて5日間培養を行なった。
菌学的性状試験として、光学顕微鏡BX50F4 (オリンパス,日本)により、細胞形態、グラム染色性、胞子の有無、鞭毛による運動性の有無を観察した。また、K28培地平板上でのコロニー形態を観察した。また、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸/ガス産生、ブドウ糖の酸化/発酵(O/F)について試験を行なった。菌学的性状試験の結果は表2に示す通りであった。
また、生理・生化学性状試験を行なったところ、結果は表3に示す通りであった。
また、追加試験として、King’s B寒天培地上で蛍光色素産生試験を行なったところ、結果は表4に示す通りであった。
16S rDNA塩基配列解析として、ゲノムDNAの抽出にはInstaGene Matrix (BIO RAD, CA, U.S.A.)を使用し、操作はBIO RAD社のプロトコールに従った。抽出したゲノムDNAを鋳型として、PCRにより16S ribosomal RNA遺伝子(16S rDNA)の全塩基配列1500〜1600 bpの領域を増幅した。その後、増幅された16S rDNAをシーケンシングし、検体の16S rDNA塩基配列を得た。PCRにはReady-To-Go PCR Beads(Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA), とプライマー9F及び1510Rを使用した。サイクルシークエンスにはABI Prism BigDye Terminator v3.1 Kit (Applied Biosystems, CA, USA)とシークエンスプライマー8種を使用した。サーマルサイクラーにはGeneAmp PCR System 9600(Applied Biosystems, CA, USA)、DNAシーケンサーにはABI PRISM 3100 DNA Sequencer(Applied Biosystems, CA, USA)を使用し、得られた塩基配列断片の結合にはAutoAssembler2.1(Applied Biosystems, CA, USA)を使用した。なお、PCRからサイクルシークエンスまでの基本的操作は各キットのプロトコールに従った。
シュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属する微生物HFKI−0020株(FERMP−20545)の16S rDNA塩基配列を、配列表の配列番号1に示す。
上記の塩基配列を、2種類の塩基配列データベースに対し相同性検索を実施した。
まず、解析ソフトウェアとしてMicroSeq Microbial Identification System Software V.1.4.1(Applied Biosystems, CA, USA)を使用し塩基配列を解析した。相同性検索を行なう際の対象データベースにはMicroSeq Bacterial Full Gene Library v.0001(Applied Biosystems, CA, USA)を使用した。具体的には、BLAST を用いて上記データベースに対し相同性検索を実施し、相同率が上位10位までの配列を取得した。相同性検索結果を表5に示す。
次に、より多くの情報を得るため国際塩基配列データベース(Genbank/DDBJ/EMBL)に対し相同性検索を実施しました。具体的には、米国NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih, gov/)が提供するオンラインサービスより、BLASTをもちいて国際塩基配列データベースに対して相同性検索を行い、得られた16S rDNA塩基配列からシュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属する微生物HFKI−0020株(FERMP−20545)と近縁と考えられる種の相同検索を実施した。相同性検索結果を表6に示す。
形態および生理学的性状学的試験の結果、シュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属する微生物HFKI−0020株(FERMP−20545)はグラム染色陰性、桿菌、運動性、カタラーゼ反応陽性、オキシダーゼ反応陽性、蛍光色素産生能などの性状を示し、これらのことから蛍光色素産生Pseudomonasであることが示唆された。また、16S rDNA塩基配列解析でもP. fluorescens biotype GやP. agariciなど蛍光色素を産生するPseudomonasの16S rDNAに対し高い相同性を示した。これらのことから蛍光色素産生Pseudomonasであると考えられる。
種については、P. fluorescens biotype Gは本種基準株ではなく、P. fluorescensの基準株であるATCC 13525株はMicroSeqによる相同性検索6位に検索され、このP. fluorescens基準株に対しては高い相度率を示さない。ATCC 17518株に代表される本種 biotype GなどP. fluorescensには16S rDNAに基づく解析で系統的に異なる幾つかのbiotypeが存在することが知られ、これらのbiotypeは分類学的には依然P. fluorescensとして扱われる。P. fluorescensについては分類学的に未整理な部分である。従って、現時点では本願微生物HFKI−0020株(FERMP−20545)はシュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属する新規微生物.とすることが妥当と考えられる。
以下、参考例と実施例により本発明を詳細に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
シュードモナス(Pseudomonas sp.) HFKI−0020株(FERMP−20545)HFKIをK28培地(ペプトン 0.5%、酵母エキス0.1%、人工海水 50%)に植菌して10℃で約72時間振盪培養した。遠心で菌体を除去して培養上清を得た。基質として1-パルミトイル-2-オレオイルホスファチジルコリン(16:0/18:1(n-9)-PC)、又は1-オレオイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン(18:1(n-9)/16:0-PC) 5mg、培養上清1mlにジエチルエーテル1mlを加え、全量を2mlにした。10℃で24時間撹拌した後、フォルチ法で脂質を抽出した後、シリカゲルTLC(薄層クロマトグラフィー)でリゾホスファチジルコリン(LPC)を分画した。塩酸メタノール法でLPCの構成脂肪酸を塩酸メタノール法でメチルエステルとして得た後、ガスクロマトグラフィで定量分析した。原料とLPCの脂肪酸組成を表7に示す。
表7はシュードモナス(Pseudomonas sp.)HFKI−0020株(FERMP−20545)の培養上清を用いた合成PCの加水分解反応で生成したLPCの脂肪酸組成(mol%)を示す。両基質ともLPCにはsn−1位とsn−2位の脂肪酸が検出されたが、sn−2位の脂肪酸が多く残っており、sn−1位のアシル基が選択的に加水分解された。即ち、酵素溶液として用いた培養上清中には、主要な加水分解活性としてホスホリパーゼA1活性が存在することが確認された。
シュードモナス(Pseudomonas sp.)HFKI−0020株(FERMP−20545)をK28培地(ペプトン 0.5%、酵母エキス0.1%、人工海水 50%)に植菌して10℃で約72時間振盪培養した。遠心で菌体を除去して培養上清を得た。基質としての大豆油10μgに培養上清0.5mlにジエチルエーテル0.5mlを加え、10℃で24時間撹拌した。反応溶液をシリカゲルTLCに展開した結果、遊離酸の生成は検出されず、加水分解は確認されなかった。従って、この培養上清はリパーゼ活性を有しないことが判明した。
培養液中に含まれるホスホリパーゼA1活性を有する酵素を分離・精製することにより食品や化粧品を工業的に大量に乳化する用途に利用できる。
Claims (7)
- シュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属し、ホスホリパーゼA1活性を有する酵素を産生する、受託番号FERM P−20545として寄託された新規微生物。
- 下記菌学的性質及び下記生理・生化学的性質を有することを特徴とする請求項1に記載の新規微生物。
A.菌学的性質
(1)細胞形態:幅0.8〜1.0μm、長さ2.0〜3.0μmの桿菌
(2)グラム染色性:陰性
(3)胞子の有無:陰性
(4)運動性:陽性
(5)コロニー形態(48時間培養)
(イ)直径:2.0〜3.0mm
(ロ)色調:淡黄色
(ハ)形:円形
(ニ)***状態:レンズ状
(ホ)周縁:全縁
(ヘ)表面の形状など:スムーズ
(ト)透明度:不透明
(チ)粘稠度:バター様
(6)生育温度試験(℃)
(イ)37℃:陽性
(ロ)45℃:反応弱い
(7)カタラーゼ反応:陽性
(8)オキシダーゼ反応:陽性
(9)グルコースからの酸/ガス産生(酸産生/ガス産生):陰性/陰性
(10)O/Fテスト(酸化/発酵):陰性/陰性
B.生理・生化学的性質
(1)硝酸塩還元:陰性
(2)インドール産生:陰性
(3)ブドウ糖酸性化:陰性
(4)アルギニンジヒドロラーゼ:陽性
(5)ウレアーゼ:陰性
(6)エスクリン加水分解:陰性
(7)ゼラチン加水分解:陽性
(8)β−ガラクトシダーゼ:陰性
(9)ブドウ糖資化性:陽性
(10)L−アラビノース資化性:陽性
(11)D−マンノース資化性:陽性
(12)D−マンニトール資化性:陽性
(13)N−アセチル−D−グルコサミン資化性:陽性
(14)マルトース資化性:陰性
(15)グルコン酸カリウム資化性:陽性
(16)n−カプリン酸資化性:陽性
(17)アジピン酸資化性:陰性
(18)dI−リンゴ酸資化性:陽性
(19)クエン酸ナトリウム資化性:陽性
(20)酢酸フェニル資化性:陰性
(21)チトクロームオキシダーゼ:陽性
(22)King's B寒天培地上での蛍光色素産生:陽性 - 16SrRNA遺伝子の塩基配列が配列表の配列番号1に記載の配列であることを特徴とする請求項1又は2に記載の新規微生物。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の新規微生物によって産生されたホスホリパーゼA 1 活性を有する酵素を有効量含有することを特徴とする脂質改質剤。
- 前記酵素が菌体及び/又は培養液に含まれている形で使用されていることを特徴とする請求項4に記載の脂質改質剤。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の新規微生物によって産生されたホスホリパーゼA 1 活性を有する酵素を用いてリン脂質を加水分解し、2−アシルリゾリン脂質を得ることを特徴とする2−アシルリゾリン脂質の製造方法。
- 前記酵素が菌体及び/又は培養液に含まれている形で使用されていることを特徴とする請求項6に記載の2−アシルリゾリン脂質の製造方法。
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