JP4733936B2

JP4733936B2 - Ｒｎａ追跡方法

Info

Publication number: JP4733936B2
Application number: JP2004201836A
Authority: JP
Inventors: 泰郎大島; 祐介照井; 剛太河合; 恵美礼猪股; 祐介野村; 和雄原田
Original assignee: Taiyo Nippon Sanso Corp
Current assignee: Taiyo Nippon Sanso Corp
Priority date: 2004-07-08
Filing date: 2004-07-08
Publication date: 2011-07-27
Anticipated expiration: 2024-07-08
Also published as: JP2006020575A

Description

本発明は、ＲＮＡ安定化剤ならびにこのＲＮＡ安定化剤を用いたＲＮＡ安定化方法および複合体安定化方法に関するものである。

ＲＮＡとは、リボース、プリン塩基またはピリミジン塩基、リン酸基からなる核酸から構成された物質であり、ＤＮＡが保存している遺伝情報に基づいて、タンパク質を生合成する役割を担っている。近年、このＲＮＡを利用して、有用タンパク質や、酵素活性を有するＲＮＡ（リボザイム）からなる医薬品など、様々な工業製品を製造することが期待されている。

しかしながら、ＲＮＡは一般に不安定な物質であるため、室温よりも１０℃高い環境に置かれただけでも、その立体構造が容易に破壊され、かつ生理活性が失われてしまうという欠点があった。そこで、従来、ＲＮＡの安定性を高めるために、ＲＮＡにマグネシウムイオンなどの金属イオンを結合させる方法が提案されている（例えば、非特許文献１参照。）。
Ｒ．Ｈａｃｈ，「ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，１９７５，５５，ｐ．２７１−２８４

しかしながら、特許文献１にかかるＲＮＡ安定化方法にあっては、一般に、生体内において、金属イオンの量が常に一定に保たれているため、生体内におけるＲＮＡの安定化が困難であるという問題があった。

本発明は、上記従来技術の問題点に鑑み、
生体内外に関わらず、ＲＮＡの立体構造を安定化させるＲＮＡ安定化剤およびＲＮＡ安定化方法を提供することを目的とする。
また、生体内外に関わらず、ＲＮＡとＲＮＡとの結合能を有する分子とからなる複合体を安定化させる複合体安定化方法を提供することを目的とする。
さらに、ＲＮＡを生体内において追跡可能なＲＮＡトレーサーおよびＲＮＡ追跡方法を提供することを目的とする。

かかる課題を解決するため、
請求項１にかかる発明は、４級ポリアミンを構成する元素の一部が安定同位体元素により置換されているＲＮＡトレーサーをＲＮＡに結合させて、このＲＮＡトレーサーが結合したＲＮＡを生体細胞に導入し、この生体細胞を生体組織又は個体（但し、人間を除く）の中に導入し、このＲＮＡトレーサーを検出することにより、当該ＲＮＡが生体のどの部位に移動したかを追跡するＲＮＡ追跡方法である。

本発明のＲＮＡ安定化剤およびＲＮＡ安定化方法によれば、４級ポリアミンが生体に対して無害であるとともに、生体内において多量に保持されることが可能であるため、生体内外に関わらず、ＲＮＡの立体構造を安定化させることができる。

また、本発明の複合体安定化方法によれば、４級ポリアミンが生体に対して無害であるとともに、生体内において多量に保持されることが可能であるため、生体内外に関わらず、ＲＮＡを含む複合体の立体構造を安定化させることができる。

また、本発明のＲＮＡトレーサーおよびＲＮＡ追跡方法によれば、ＲＮＡトレーサーがＲＮＡと安定に結合し、かつ安定同位体が容易に検出可能であるため、生体内におけるＲＮＡの位置を正確に追跡することができる。

本発明にかかるＲＮＡ安定化剤の一実施形態を、以下に説明する。

本発明のＲＮＡ安定化剤は４級ポリアミンから構成されている。
この４級ポリアミンは、下記式（１）に示すように、一端にアミノ基を有する４つのアミノアルキル基が窒素原子に結合した化合物である。この４級ポリアミンにおいて、Ｒ_１〜Ｒ_４はアルキル鎖を示している。このアルキル鎖の炭素原子数は特に限定されない。また、Ｒ_１〜Ｒ_４の炭素原子数は同一であっても、異なっていてもよい。その中でも、アルキル鎖の炭素原子数が３〜５であるアミノアルキル基を４つ有する４級ポリアミンが、ＲＮＡ安定化剤として好ましい。

４級ポリアミンは、その４つのアミノ基が水溶液中においてカチオンとなるため、プラスに帯電している。一方、ＲＮＡは、そのリン酸基が水溶液中においてアニオンとなるため、マイナスに帯電している。従って、４級ポリアミンとＲＮＡとは、水溶液中において、イオン結合によって良好に結合することができる。

一方、４級ポリアミンを含むポリアミンは、元来、生体細胞内に多く存在しており、生体に対して無害な物質として知られている。特に、４級ポリアミンは好熱菌内に多く存在している物質である。従って、４級ポリアミンは、生体に対して無害であるとともに、生体内において多量に保持されることが可能である。

上記４級ポリアミンの製法の一例を、図１を用いて説明する。
図１において、４級ポリアミンの製法の合成経路が示されている。なお、４級ポリアミンの製法の合成経路は、図１の合成経路に限られることなく、他の合成経路であってもよい。

先ず、合成経路を概説する。
化合物（１）、（４）は、４級ポリアミン（７）の出発物質である。これら化合物（１）、（４）は市販されており、当業者が容易に入手することができるものである。なお、化合物（１）、（４）におけるＲ_１、Ｒ_２はアルキル鎖を示している。
化合物（１）からは、（ａ）工程を行うことにより、化合物（２）が得られる。得られた化合物（２）からは、（ｂ）工程を行うことにより、化合物（３）が得られる。
一方、化合物（４）からは、（ｃ）工程を行うことにより、化合物（５）が得られる。この化合物（５）と上記化合物（３）を用いて、（ｄ）工程を行うことにより、化合物（６）が得られる。最後に、得られた化合物（６）からは、（ｅ）工程を行うことにより、４級ポリアミンである化合物（７）が得られる。

次に、（ａ）〜（ｅ）工程を順に説明する。
（ａ）工程は、化合物（１）のアミド基をアミノ基に還元する工程である。具体的には、化合物（１）をリチウムアルミニウムヒドリドと反応させることにより、還元する。溶媒としては、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル，アセトニトリルなどが用いられるが、その中でもテトラヒドロフランが好ましい。また、反応温度は用いた溶媒が還流する温度であり，反応時間は２０〜２４時間である。なお、この反応は無水条件で行われる。

（ｂ）工程は、化合物（２）のアミノ基をイミド基にして保護する工程である。具体的には、化合物（２）を酢酸ナトリウムの存在下において無水フタル酸と反応させることにより、脱水縮合させる。反応温度は１５０〜２５０℃であり、反応時間は１．５〜２．５時間である。なお、この反応は無水条件で行われる。
反応後、粗生成物は、塩基性水溶液によりｐＨ８〜１０に調製されるとともに抽出された後、カラムクロマトグラフィーにより精製される。なお、展開溶媒としては、酢酸エチル、ヘキサン、石油エーテルなどの溶媒を単独または混合したものが用いられる。

（ｃ）工程は、化合物（４）の臭素をヨウ素に置換する工程である。具体的には、化合物（４）をヨウ化ナトリウムと反応させることにより、臭素をヨウ素に置換する。溶媒としては、アセトン、ジオキサン、エタノールなどが用いられるが、その中でもアセトンが好ましい。また、反応温度は用いた溶媒が還流する温度であり、反応時間は２〜３時間である。

（ｄ）工程は、化合物（３）を４級アミンにする工程である。具体的には、化合物（３）を化合物（５）と反応させることにより、４級アミンを合成する。溶媒としては、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアルデヒドなどが用いられるが、その中でもジオキサンが好ましい。また，反応温度は１８０〜２３０℃であり、反応時間は２〜４時間である。なお、この反応は窒素またはアルゴン雰囲気下、無水条件で行われる。

（ｅ）工程は、化合物（６）のアミノ基を保護している無水フタル酸由来の保護基を脱離させる工程である。具体的には、化合物（６）をヒドラジンと反応させることにより、保護基を脱離させる。溶媒としては、エタノール、メタノール、ジオキサンなどが用いられるが、その中でもエタノールが好ましい。また、反応温度は用いた溶媒が還流する温度であり、反応時間は１．５〜２．５時間である。
反応後、粗生成物は、エタノール、メタノール、ジオキサンなどにより濾過、洗浄された後、カラムクロマトグラフィーにより精製される。なお、展開溶媒としては、４〜６Ｎの塩酸が用いられる。
以上の製法により、４級ポリアミンが製造される。

本発明のＲＮＡ安定化方法は、上記ＲＮＡ安定化剤を用いたものである。以下、ＲＮＡ安定化方法について説明する。

本発明のＲＮＡ安定化方法においては、対象となるＲＮＡは特に限定されず、例えば、ウイルス、ファージ、細菌などの原核細胞または真核細胞などから、公知の方法により採取されたものであってもよい。また、化学合成されたＲＮＡであってもよい。
このようなＲＮＡを用いてＲＮＡ水溶液を調製する。溶媒としては、純水、またはトリス塩酸緩衝溶液やトリス酢酸緩衝溶液などの緩衝溶液が挙げられる。このＲＮＡ水溶液におけるＲＮＡの濃度は任意であり、ＲＮＡが溶解する限りにおいて自由に設定できる。なお、ＲＮＡ水溶液のｐＨは６〜８であり、好ましくは６．８〜７．５である。

このＲＮＡ水溶液に、ＲＮＡ安定化剤を添加する。添加方法としては、ＲＮＡ安定化剤を直接添加する方法、または、ＲＮＡ水溶液と同様の溶媒を用いてＲＮＡ安定化剤の水溶液を調整した上で、このＲＮＡ安定化剤水溶液を滴下する方法などが用いられる。ＲＮＡ安定化剤を構成する４級ポリアミンは水に対して易溶であるため、どの方法であっても、ＲＮＡ水溶液に良好に溶解することができる。なお、ＲＮＡ安定化剤を溶解する際には、シェーカーなどを用いてもよい。

添加するＲＮＡ安定化剤の量は、ＲＮＡに対して０．１〜２０当量である。ＲＮＡ安定化剤の量がこの範囲内であるとき、ＲＮＡ安定化剤は全てのＲＮＡと十分に結合することができる。ＲＮＡ安定化剤と結合したＲＮＡにあっては、変性温度が上昇する。すなわち、ＲＮＡの安定性が向上する。

以下、ＲＮＡ安定化の作用機構について説明する。
一般に、ＲＮＡおよびそのリン酸基は、水溶液中において複雑な立体構造を形成している。一方、本発明のＲＮＡ安定化剤を構成する４級ポリアミンにあっては、柔軟なアルキル鎖により、４つのアミノ基が空間的に異なる位置にあり、また、異なる方向を向くことが可能である。従って、このような４級ポリアミンは、複雑な立体構造を形成しているＲＮＡのリン酸基に巧みに結合して、リン酸基の電荷を中和することができる。電荷が中和されたＲＮＡはリン酸基同士のクーロン反発がなくなるため、その立体構造の安定性が向上する。

このように、４級ポリアミンから構成されるＲＮＡ安定化剤を用いることにより、ＲＮＡの立体構造を安定化させることができる。また、４級ポリアミンが生体に対して無害であるとともに、生体内において多量に保持されることが可能であるため、生体内外に関わらず、ＲＮＡの立体構造を安定化させることができる。

一般に、ＲＮＡは複数のＲＮＡ同士で結合して複合体（多量体）を形成することができる。また、ＲＮＡは特定のタンパク質と結合して、リボソームなどの複合体を形成することができる。このようなＲＮＡを含む複合体に関しても、本発明のＲＮＡ安定化剤を用いることにより、安定化を行うことができる。
以下、ＲＮＡ安定化剤を用いた複合体安定化方法について説明する。

複合体は、ＲＮＡとＲＮＡとの結合能を有する分子とから構成されている。
ＲＮＡとしては、特に限定されず、あらゆる種類のＲＮＡであってもよい。ＲＮＡとの結合能を有する分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質などが挙げられる。複合体のの結合様式は、水素結合が一般的であるが、これに限らず、疎水結合、ジスルフィド結合などであってもよい。

上記複合体を用いて複合体水溶液を調製する。溶媒としては、純水、またはトリス塩酸緩衝溶液やトリス酢酸緩衝溶液などの緩衝溶液が挙げられる。この複合体水溶液における複合体の濃度は任意であり、複合体が溶解する限りにおいて自由に設定できる。なお、複合体水溶液のｐＨは６〜８であり，好ましくは６．８〜７．５である。

この複合体水溶液に、ＲＮＡ安定化剤を添加する。添加方法は上述したＲＮＡ安定化方法のものと同様であるので、その説明を省略する。
添加するＲＮＡ安定化剤の量は、複合体に対して０．１〜２０当量である。ＲＮＡ安定化剤の量がこの範囲内であるとき、ＲＮＡ安定化剤は全ての複合体と十分に結合することができる。ＲＮＡ安定化剤と結合した複合体にあっては、変性温度が上昇する。すなわち、ＲＮＡの安定性が向上する。

以下、複合体安定化の作用機構について説明する。
複合体安定化の作用機構としては、上述したＲＮＡ安定化と同様のものが挙げられる。すなわち、４級ポリアミンがＲＮＡのリン酸基の電荷を中和することにより、クーロン反発を低減させる作用機構である。これにより、複合体は、ＲＮＡ単量体の変性による立体構造の崩壊を防止することができる。
また、他の作用機構として、４級ポリアミンによる複合体の結合の補強が挙げられる。すなわち、４級ポリアミンのそれぞれのアミノ基が、複合体の結合部位において、複数の分子にまたがって結合することにより、“つなぎ”分子としての作用を及ぼす作用機構である。これにより、複合体は、それぞれのユニット同士の結合を強化することができるため、その立体構造の安定性が向上する。

このように、４級ポリアミンからなるＲＮＡ安定化剤を用いることにより、複合体の立体構造を安定化することができる。また、４級ポリアミンが生体に対して無害であるとともに、生体内において多量に保持されることが可能であるため、生体内外に関わらず、複合体の立体構造を安定化させることができる。

本発明のＲＮＡトレーサーは上記ＲＮＡ安定化剤を用いたものである。以下、ＲＮＡトレーサーについて説明する。

ＲＮＡトレーサーは、ＲＮＡ安定化剤を構成する４級ポリアミンを、安定同位体元素により標識することにより得られる。安定同位体元素としては、^１３Ｃ，^１５Ｎなどが用いられる。これら安定同位体元素を、４級ポリアミンを構成する^１２Ｃ，^１４Ｎなどと置換することにより、標識が行われる。
ＲＮＡトレーサーの検出方法としては、質量分析法、赤外分析法、核磁気共鳴法などが挙げられる。その中でも、生体内において検出が可能である核磁気共鳴法が好適である。安定同位体元素は、上記検出方法によって特異なスペクトルデータを示すことが知られており、これにより、容易に検出される。

以下、ＲＮＡトレーサーを用いたＲＮＡ追跡方法について説明する。
本発明のＲＮＡ追跡方法において、対象となるＲＮＡは特に限定されず、生体内における機能や役割を調査したいＲＮＡが用いられる。このようなＲＮＡを用いてＲＮＡ水溶液を調製する。溶媒としては、純水、またはトリス塩酸緩衝溶液やトリス酢酸緩衝溶液などの緩衝溶液が挙げられる。このＲＮＡ水溶液に置けるＲＮＡの濃度は任意であり、ＲＮＡが溶解する限りにおいて自由に設定できる。なお、ＲＮＡ水溶液のｐＨは６〜８であり，好ましくは６．８〜７．５である。

この複合体水溶液に、ＲＮＡトレーサーを添加する。添加方法は上述したＲＮＡ安定化方法のものと同様であるので、ここでは省略する。ついで、このＲＮＡトレーサーが結合したＲＮＡを、生体細胞中に導入する。導入方法としては、電気パルスを用いたエレクトロポレーション法、ガラス針で直接注入するマイクロインジェクション法、リポソームに包含させて導入する方法などが挙げられる。これらの方法を用いて、ＲＮＡトレーサーが結合したＲＮＡを生体細胞内に導入する。
また、上記生体細胞を生体組織、個体の中に導入してもよい。ただし、個体には人間は含まれない。導入方法としては、皮下注射、腹腔内投与などが挙げられる。

次に、生体細胞内に導入されたＲＮＡトレーサーを、上記検出方法により検出する。これにより、ＲＮＡトレーサーが結合したＲＮＡが細胞内に存在しているかどうかを追跡することができる。また、ＲＮＡトレーサーを生体組織や個体内に導入した場合には、ＲＮＡが生体のどの部位に移動したかを追跡することが可能となる。
これらの知見は、ＲＮＡの機能や役割を明らかにする上で、重要な基礎データとなる。

このように、本発明のＲＮＡトレーサーおよびＲＮＡ追跡方法を用いると、ＲＮＡトレーサーがＲＮＡと安定に結合し、かつ安定同位体が容易に検出可能であるため、生体内におけるＲＮＡの位置を正確に追跡することができる。

以下、実施例により、本発明をさらに詳しく説明する。本発明は、下記実施例に何ら制限されるものではない。

［実施例１］
実施例１では、本発明のＲＮＡ安定化剤を用いてＲＮＡの安定化を試みた。以下に、実施手順を説明する。

先ず、ＲＮＡ安定化剤を構成する４級ポリアミンを製造した。合成経路としては化２に示したものを用いた。出発物質である化合物（１）としては、Ｒ_１の炭素数が２である３，３，３−ニトリロトリスイソプロピオンアミド（東京化成工業株式会社）を用いた。また、出発物質である化合物（４）としては、Ｒ_２の炭素数が３であるＮ−（３−ブロモプロピル）フタルイミド（シグマアルドリッチジャパン株式会社）を用いた。
以下、（ａ）〜（ｅ）工程における操作を説明する。

（ａ）工程においては、化合物（１）をリチウムアルミニウムヒドリドと反応させることにより、アミド基をアミノ基に還元した。溶媒としては、テトラヒドロフランを用いた。また、反応温度は１００℃、反応時間は２４時間であった。なお、この反応は無水条件で行われた。

（ｂ）工程においては、化合物（２）を酢酸ナトリウムの存在下において、無水フタル酸と反応させることにより、脱水縮合させた。また、反応温度は２００℃、反応時間は２時間であった。なお、この反応は無水条件で行われた。
反応後、粗生成物を、塩基性水溶液によりｐＨ８に調製するとともに抽出した後、カラムクロマトグラフィーにより精製した。なお、展開溶媒としては、酢酸エチルとヘキサンを等量ずつ混合した混合溶媒を用いた。

（ｃ）工程においては、化合物（４）をヨウ化ナトリウムと反応させることにより、臭素をヨウ素に置換した。溶媒としては、アセトンを用いた。また、反応温度は用いた溶媒が還流する温度であり、反応時間は２時間であった。

（ｄ）工程においては、化合物（３）を化合物（５）と反応させることにより、４級アミンを合成した。溶媒としては、ジオキサンを用いた。また、反応温度は２００℃であり、反応時間は３時間であった。なお、この反応は窒素またはアルゴン雰囲気下、無水条件で行われた。

（ｅ）工程においては、化合物（６）をヒドラジンと反応させることにより、無水フタル酸由来の保護基を脱離させた。溶媒としては、エタノールを用いた。また、反応温度は用いた溶媒が還流する温度であり、反応時間は２時間であった。
反応後、粗生成物は、エタノールと水の混合溶媒により濾過、洗浄された後、カラムクロマトグラフィーにより精製された。なお、展開溶媒は６Ｎの塩酸であった。
以上
の製法により、４級ポリアミンを得た。なお、４級ポリアミンの同定は、核磁気共鳴法、質量分析法により行われた。

次に、４級ポリアミンからなるＲＮＡ安定化剤を用いて、ＲＮＡの安定化を行った。
ＲＮＡとしては、酵母フェニルアラニン転移ＲＮＡ（シグマアルドリッチジャパン株式会社、配列番号１参照）を用いた。また、このＲＮＡの変性温度は４７．８℃である。
上記ＲＮＡを５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させて、ＲＮＡ水溶液を調製した。このＲＮＡ水溶液の濃度は６０μＭであった。
一方、本実施で合成した４級ポリアミンからなるＲＮＡ安定化剤を上記緩衝溶液に溶解させて、ＲＮＡ安定化剤水溶液を調製した。このＲＮＡ安定化剤水溶液の濃度は１ｍＭであった。
ついで、上記ＲＮＡ水溶液に、上記ＲＮＡ安定化剤水溶液を滴定して、混合水溶液を調製した。この混合水溶液における最終的なＲＮＡ安定化剤の濃度は０．３ｍＭであった。

得られた混合水溶液の吸光度を、温度変化に対して測定した。その結果、温度が７６．７℃になった時、吸光度が急激に増加することが明らかとなった。この吸光度の増加は、ＲＮＡが変性したことを示している。従って、ＲＮＡ安定化剤を添加することによって、ＲＮＡの変性温度が上昇することが明らかとなった。

［実施例２］
実施例２では、本発明のＲＮＡ安定化剤を用いて複合体の安定化を試みた。以下に、実施手順を説明する。

ＲＮＡ安定化剤としては、実施例１で作製した４級ポリアミンを用いた。複合体としては、２量体を形成するＲＮＡ３５（配列番号２参照）を用いた。このＲＮＡ３５は３５塩基の核酸塩基からなっており、その塩基配列は後述する通りである。このＲＮＡ３５により形成される２量体の解離温度は，０．８μＭの濃度において３７℃である。ＲＮＡ安定化剤と複合体の混合水溶液の調製方法は、実施例１と同様であったので、その説明を省略する。

得られた混合水溶液の吸光度を、温度変化に対して測定した。その結果、温度が６５℃を超えた時、吸光度が増加を始めることが明らかとなった。この吸光度の増加は、２量体が解離したことを示している。従って、ＲＮＡ安定化剤を添加することによって、複合体の解離温度が上昇することが明らかとなった。

本発明のＲＮＡ安定化剤は、ＲＮＡおよび複合体を安定化する有効成分として有用であるほか、これ以外のＲＮＡウィルス阻害剤やＲＮＡ医薬品の効果増強剤として使用できる。

本発明の実施形態にかかる４級ポリアミンの製法における合成経路の一例を示す流れ図である。

Claims

４級ポリアミンを構成する元素の一部が安定同位体元素により置換されているＲＮＡトレーサーをＲＮＡに結合させて、このＲＮＡトレーサーが結合したＲＮＡを生体細胞に導入し、この生体細胞を生体組織又は個体（但し、人間を除く）の中に導入し、このＲＮＡトレーサーを検出することにより、当該ＲＮＡが生体のどの部位に移動したかを追跡するＲＮＡ追跡方法。