JP4733644B2 - 膵臓腺癌の動物モデルおよびその使用 - Google Patents

膵臓腺癌の動物モデルおよびその使用 Download PDF

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Description

（関連出願）
本願は、２００３年１１月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／５２５，４６４号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／５２５，４６４号は、本明細書中に参考として援用される。
（政府の基金）
本発明はＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （ＮＩＨ）によって与えられた補助金番号 下で少なくとも部分的には政府の支援によりなされた。政府は本発明においてある種の権利を有する。
（発明の背景）
膵管腺癌は５％未満の６ヶ月および５年生存のメジアン生存を有し、それを最も致死的ヒト癌の１つとしている（非特許文献１）。この貧弱な予後は、診断の時点における均一に進行した病期、および現存の療法に対するそのかなりの抵抗性に関する。多数の鍵となるこの疾患の細胞起源をより明確に理解する必要性を含めた、患者予後における改善を可能とし、腫瘍細胞および間質成分の生物学的相互作用を解明し、特異的な遺伝的病巣の役割、腫瘍の開始および進行における特異的な遺伝的病巣およびそれらのシグナリング代理の役割を決定し、およびこれらの癌の強い治療的抵抗性についての基礎を明らかにするためには、多数の鍵となる挑戦に取り組まなければならない（非特許文献２）。
この悪性疾患は、この細胞型に対するその組織学的および免疫組織化学的関係に基づいて膵管から生起すると考えられる（非特許文献３）。管起源と合致し、より小さな膵管から生起すると考えられる膵臓上皮内新生物（ＰａｎＩＮｓ）として知られたプレ悪性病巣が、進行した悪性腫瘍と物理的に密接に近接して見出される（非特許文献４；非特許文献５）。ＰａｎＩＮｓは、ますます非典型的な組織学的段階に向けて進行し、クローン遺伝的変化の蓄積を呈するように見え、これはそれらが管腺癌の前駆体であることを示唆する（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。起源の細胞の問題は、細胞系統の間のトランス分化を可能とする膵臓の発生可塑性によって複雑となる（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。腺房細胞は、培養において、およびイン・ビボでの種々のストレス下の双方において、管−様細胞への化生変換を受けることが示されている（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。腺房においてＴＧＦ−αを発現するトランスジェニックマウスでの腺房管化生のプロセスに続く管特徴を伴う膵臓腫瘍の発生は、この悪性疾患における腺房細胞に対する先祖役割を示唆した（非特許文献１１；非特許文献１７）。他の実験研究は、島細胞または推定膵臓幹細胞集団もまた膵臓腺癌を生起させることを示唆している（非特許文献１８；非特許文献１９）。最後に、膵臓腺癌はこれらの分化した細胞型のいずれか１つから、または組織幹細胞から生じ、むしろ、特異的遺伝的病巣が生じている細胞区画にかかわらず腫瘍の表現型終点を指令する可能性が依然としてある。この範例は悪性神経膠腫において以前提唱されている（非特許文献２０；非特許文献２１）。
膵臓管腺癌を特徴付ける一連の遺伝子突然変異および経路が同定されているが、そのような突然変異または正確なモデルへの経路改変を適切に作成する手段は依然として理解しにくいままである。理想的な動物モデルはヒト疾患におけるのと同一の組織学的特徴（すなわち、ＰａｎＩＮｓとして知られた進行性異常管病巣に向けての正常な膵臓細胞からの暫時の出現、管細胞形態および免疫表現型の表示、侵入的成長および転移）を有するであろう（非特許文献２２；非特許文献２３）。そのようなモデルの創製は長い間求められてきた目的であった。
Ｗａｒｓｈａｗ，Ａ．Ｌ．およびＣ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−ｄｅｌ Ｃａｓｔｉｌｌｏ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（１９９２）３２６：４５５−６５ Ｋｅｒｎ，Ｓ．，ら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００１）６１：４９２３−３２ Ｓｏｌｃｉａ，Ｅ．，ら Ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ．（１９９５）Ａｒｍｅｄ Ｆｏｒｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ． Ｃｕｂｉｌｌａ，Ａ．Ｌ．およびＰ．Ｊ．Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９７６）３６：２６９０−８ Ｈｒｕｂａｎ，Ｒ．Ｈ．，ら Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ Ｐａｔｈｏｌ（２００１）２５：５７９−８６ Ｍｏｓｋａｌｕｋ，Ｃ．Ａ．，ら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９７）５７：２１４０−３ Ｙａｍａｎｏ，Ｍ．，ら Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ（２０００）１５６：２１２３−３３ Ｌｕｔｔｇｅｓ，Ｊ．，Ｈ．ら Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ（２００１）１５８：１６７７−８３ Ｋｌｅｉｎ，Ｗ．Ｍ．，ら Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ（２００２）１５：４４１−７ Ｓｈａｒｍａ，Ａ．，ら Ｄｉａｂｅｔｅｓ（１９９９）４８：５０７−１３ Ｍｅｓｚｏｅｌｙ，Ｉ．Ｍ．，ら Ｃａｎｃｅｒ Ｊ（２００１）７：２４２−５０ Ｂａｒｄｅｅｓｙ，Ｎ．およびＲ．Ａ．ＤｅＰｉｎｈｏ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ（２００２）２：８９７−９０９ Ｊｈａｐｐａｎ，Ｃ．，ら Ｃｅｌｌ（１９９０）６１：１１３７−４６ Ｓａｎｄｇｒｅｎ，Ｅ．Ｐ．，ら Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９１）８８：９３−７ Ｈａｌｌ，Ｐ．Ａ．およびＮ．Ｒ．Ｌｅｍｏｉｎｅ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ（１９９２）１６６：９７−１０３ Ｒｏｏｍａｎ，Ｉ．，ら Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（２０００）４３：９０７−１４ Ｗａｇｎｅｒ，Ｍ．，ら Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ（２００１）１５：２８６−９３ Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｔ．およびＤ．Ｈａｎａｈａｎ Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ（１９９４）１４５：６７１−８４ Ｐｏｕｒ，Ｐ．Ｍ．，ら Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ（２００３）２：１３ Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｅ．Ｃ．，ら Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ（１９９８）１２：３６７５−８５ Ｂａｃｈｏｏ，Ｒ．Ｍ．，ら Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ（２００２）１：２６９−７７ Ｓｏｌｃｉａ，ら Ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ，（１９９５）分冊第２０巻（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｒｍｅｄ Ｆｏｒｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ） Ｈｒｕｂａｎ， ｅｔ ａｌ．（２０００） Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５６：１８２１
しかしながら、多数の従前のモデリングの試みは、全てのレベルにおいてヒト疾患を発生反復するのに失敗している（Ｗｅｉ， ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｉｎｔ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ３３：４３；Ｋｅｒｎ， ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１：４９２３；Ｈｏｔｚ， ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｎｔ Ｊ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｄｉｓ １５：１３６；Ｂａｒｄｅｅｓｙ，ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２：８９７；Ｓｔａｎｄｏｐ，ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｄｉｇ Ｄｉｓ １９：２４）。
（発明の要旨）
本発明は、疾患の開始、維持、および進行を含めた、ヒト疾患の遺伝的および組織学的特徴を発生反復する膵管腺癌の非−ヒト動物モデルの発生に少なくとも部分的には基づく。本発明は癌、例えば、膵管腺癌の動物モデル、例えば、Ｋｒａｓの活性化突然変異が導入され、いずれかの１以上の既知または未知の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座、例えば、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ、Ｉｎｋ４ａ、Ａｒｆ、ｐ５３、Ｓｍａｄ４／Ｄｐｃ、Ｌｋｂ１、Ｂｒｃａ２、またはＭｌｈ１が誤発現され、例えば、腫瘍サプレッサー遺伝子をコードする１以上の遺伝子の全てまたは一部の欠失による減少した発現または発現の欠如を有する動物モデルを含む。
従って、１つの態様において、本発明は、ＫＲＡＳの活性化突然変異を含み、ここに、１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座が誤発現され、例えば、条件的に誤発現され、その結果、減少した発現または非−発現がもたらされることを特徴とする、膵臓腺癌の非−ヒト、例えば、げっ歯類、例えば、マウスの動物モデルを提供する。１つの実施形態において、誤発現される腫瘍サプレッサー遺伝子はＩｎｋ４ａ／ＡＲＦである。もう１つの実施形態において、誤発現される腫瘍サプレッサー遺伝子は組み合わされたＩｎｋ４ａ／ＡＲＦおよびｐ５３である。もう１つの実施形態において、誤発現される腫瘍サプレッサー遺伝子はＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ、Ｉｎｋ４ａ、Ａｒｆ、ｐ５３、Ｓｍａｄ４／Ｄｐｃ、Ｌｋｂ１、Ｂｒｃａ２、およびＭｌｋ１よりなる群から選択される。動物は１以上の破壊された遺伝子または遺伝子座につきホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。もう１つの実施形態において、１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座は、腫瘍サプレッサー蛋白質の全てまたは一部をコードするＤＮＡの除去によって破壊することができる。
１つの実施形態において、ＫＲＡＳの活性化突然変異はＫｒａｓＧ１２Ｄノックイン対立遺伝子（ＬＳＬ−Ｋｒａｓ）である。もう１つの実施形態において、ＫＲＡＳの活性化突然変異はＫｒａｓＧ１２Ｄノックイン対立遺伝子（ＬＳＬ−Ｋｒａｓ）であって、腫瘍サプレッサー遺伝子はＩＮＫ４ａ／Ａｒｆである。なおもう１つの実施形態において、非−ヒト動物はＰｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘを含む。
もう１つの実施形態において、非−ヒト動物モデルは、該１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座のトランスジェニック破壊を持つトランスジェニック動物である。１つの実施形態において、膵臓および十二指腸ホメオボックス遺伝子１（Ｐｄｘ１）−Ｃｒｅ導入遺伝子を用いて、膵臓における１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座を検出する。
もう１つの態様において、本発明は、対照野生型動物からの試料、例えば、血液、例えば、血清、尿、糞、胆汁、膵液、膵臓組織または膵臓細胞における遺伝子または蛋白質の発現または活性の存在、不存在またはレベルに対して、膵臓腺癌の動物モデルからの試料中の遺伝子または蛋白質の発現または活性の存在、不存在またはレベルを比較することを含み、例えば、該試料は組織、全血、血清、血漿、頬切屑、唾液、尿、糞、胆汁、膵臓細胞または膵臓組織を含有し、ここに、動物モデルはＫＲＡＳの活性化突然変異を含み、ここに、１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座が誤発現され、ここに、遺伝子または蛋白質の存在、不存在、または発現または活性レベルの差は、遺伝子または蛋白質が膵臓腺癌に関連するバイオマーカーであることを示すことを特徴とする、膵臓腺癌に関連するバイオマーカーを同定する方法を提供する。同定されたバイオマーカーは診断バイオマーカー、予後バイオマーカー、または薬理ゲノミクスバイオマーカーであり得る。
従って、１つの態様において、本発明は、対照野生型動物からの試料、例えば、血液、例えば、血清、尿、糞、胆汁、膵液、膵臓組織または膵臓細胞における遺伝子または蛋白質の発現または活性の存在、不存在、またはレベルに対して、膵臓腺癌の動物モデルからの試料、例えば、血液、例えば、血清、尿、糞、胆汁、膵液、膵臓組織または膵臓細胞における遺伝子または蛋白質の発現または活性の存在、不存在、またはレベルを比較することを含み、ここに、動物モデルはＫＲＡＳの活性化突然変異を含み、ここに、１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座が誤発現され、ここに、該動物モデルには療法が投与され；およびここに、遺伝子または蛋白質の存在、不存在、または発現または活性レベルの差は、該遺伝子または蛋白質が膵臓腺癌に関連する薬理ゲノミクスバイオマーカーであることを示すことを特徴とする、療法と組み合わせて発現される薬理ゲノミクスバイオマーカーを同定する方法を提供する。１つの実施形態において、動物モデルは転移性膵臓腫瘍を提示する。もう１つの実施形態において、動物モデルは膵臓腺癌に対して無症状である。１つの実施形態において、バイオマーカーは配列番号２３および２４よりなる群から選択される。
１つの実施形態において、本発明は、ａ）癌細胞のゲノムのプロファイリングを行い、ここに、該細胞は膵臓腺癌の動物モデルからのものであり、ここに、該動物モデルはＫＲＡＳの活性化突然変異を含み、およびここに、１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座が誤発現され；ｂ）工程ａ）で同定されたプロフィールのセグメント化分析を行い；ｃ）遺伝子座を同定し；ｄ）該同定された遺伝子座の優先順位をつけ；次いで、ｅ）同定された遺伝子座における遺伝子を問い合わせて、それにより、膵臓腺癌に関連するバイオマーカーを同定することを含む、膵臓腺癌に関連するバイオマーカーを同定する方法を提供する。１つの実施形態において、同定された遺伝子座における遺伝子の問い合わせは遺伝子発現データに基づく。もう１つの実施形態において、同定された遺伝子座における遺伝子の問い合わせはイン・ビトロスクリーニングアッセイに基づく。
もう１つの態様において、本発明は膵臓腺癌に関連する遺伝子座を同定する方法を提供し、該方法はａ）癌細胞のゲノムのプロファイリングを行い、ここに、該細胞は膵臓腺癌の動物モデルからのものであり、ここに、該動物モデルはＫＲＡＳの活性化突然変異を含み、およびここに、１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座が誤発現され；ｂ）工程ａ）で同定されたプロフィールのセグメント化分析を行い；ｃ）遺伝子座を同定し；次いで、ｄ）該同定された遺伝子座の優先順位をつけて、それにより、膵臓腺癌に関連する遺伝子座を同定する工程を含む。１つの実施形態において、バイオマーカーは該方法によって同定される。
１つの実施形態において、該プロファイリングは比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を用いて行われる。もう１つの実施形態において、癌細胞は膵臓腺癌細胞株または膵臓腺癌腫瘍に由来する。
本発明のなおもう１つの態様は、本明細書中に記載された方法によって同定されたバイオマーカー、例えば、核酸バイオマーカーまたは蛋白質バイオマーカーを提供する。
もう１つの態様において、本発明は、膵臓腺癌の動物モデルからの間質における遺伝子または蛋白質の発現または活性の存在、不存在、またはレベルに対して、膵臓腺癌の動物モデルからの腫瘍における遺伝子または蛋白質の発現または活性の存在、不存在、またはレベルを比較することを含み、ここに、該動物モデルはＫＲＡＳの活性化突然変異を含み、およびここに、１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座は誤発現され、およびここに、遺伝子または蛋白質の存在、不存在、または発現または活性レベルの差は、該遺伝子または蛋白質が間質−腫瘍連絡に関与することを示すことを特徴とする、間質−腫瘍連絡に関与する遺伝子または蛋白質を同定する方法を提供する。
なおもう１つの態様において、本発明は、被験体が膵臓腺癌に悩んでいるか否かを評価する方法を提供し、該方法は、被験体の試料、例えば、血液、例えば、血清、尿、糞、胆汁、膵液、膵臓組織または膵臓細胞試料における本明細書中に記載した方法によって同定されたバイオマーカーの発現または活性の存在、不存在、またはレベル、および対照試料、例えば、血液、例えば、血清、尿、糞、胆汁、膵液、膵臓組織または膵臓細胞試料におけるバイオマーカーの発現または活性の存在、不存在、またはレベルを比較することを含み、ここに、被験体試料および正常レベルにおけるバイオマーカーの発現または活性の存在、不存在、またはレベルの差は、被験体が膵臓腺癌に悩んでいることを示す。１つの実施形態において、試料は特許から得られた細胞を含む。
なおもう１つの態様において、本発明は被験体において膵臓腺癌の進行をモニタリングする方法を提供し、該方法はａ）本明細書中に記載された方法によって同定されたバイオマーカーの発現または活性の存在、不存在、またはレベルを第一の時点において被験体試料において検出し；ｂ）その後の時点において工程ａ）を反復し；次いで、ｃ）工程ａ）およびｂ）で検出された発現または活性の存在、不存在、またはレベルを比較し、それから、被験体における膵臓腺癌の進行をモニターすることを含む。１つの実施形態において、試料は特許から得られた細胞を含む。もう１つの実施形態において、第一の時点およびその後の時点の間で、被験体は腫瘍を除去する外科的処置を受けたことがある。
さらなる態様において、本発明は、被験体において膵臓腺癌を阻害するためのテスト化合物の効力を評価する方法を提供し、該方法は、被験体から得られ、かつテスト化合物に曝露された第一の試料中のバイオマーカーの発現または活性の存在、不存在、またはレベル、ここに、該バイオマーカーは本明細書中に記載された方法によって同定され、および被験体から得られた第二の試料中のバイオマーカーの発現または活性の存在、不存在、またはレベルを比較することを含み、ここに、該試料はテスト化合物に曝露されておらず、ここに、第二の試料に対する、第一の試料中のバイオマーカーの発現または活性の存在、不存在、またはレベルの有意な差は、テスト化合物が、被験体において膵臓腺癌を阻害するのに効力があることを示す。１つの実施形態において、第一および第二の試料は、被験体から得られた単一試料の一部である。
また、本発明は、療法の少なくとも一部を被験体に供するに先立って被験体から得られた第一の試料中のバイオマーカーの発現、ここに、該バイオマーカーは本明細書中に記載された方法によって同定され、および療法の一部の提供に続いて被験体から得られた第二の試料中のバイオマーカーの発現を比較することを含み、ここに、第一の試料に対する、第二の試料におけるバイオマーカーの発現の有意に低いレベルは、該療法が被験体において膵臓腺癌を阻害するのに効力があることを示すことを特徴とする、被験体において膵臓腺癌を阻害する療法の効力を評価する方法を提供する。
もう１つの態様において、本発明は被験体において膵臓腺癌を阻害するための組成物を選択する方法を提供し、該方法は、被験体からの癌細胞を含む試料を得；複数のテスト組成物の存在したで試料のアリコートを別々に曝露し；アリコートの各々におけるバイオマーカーの発現を比較し、ここに、該バイオマーカーは本明細書中に記載された方法によって同定され；次いで、他のテスト組成物に対する、そのテスト組成物を含有するアリコートにおけるバイオマーカーの発現のより低いレベルを誘導するテスト組成物の１つを選択することを含む。
さらにもう１つの態様において、本発明は被験体において膵臓腺癌を阻害する方法を提供し、該方法は被験体から癌細胞を含む試料を得；複数のテスト組成物の存在下で試料のアリコートを別々に維持し；アリコートの各々においてバイオマーカーの発現を比較し、ここに、該バイオマーカーは本明細書中で記載した方法によって同定され；次いで、他のテスト組成物に対する、そのテスト組成物を含有するアリコートにおいてバイオマーカーのより低いレベルの発現を誘導するテスト組成物の少なくとも１つを被験体に投与することを含む。
なおもう１つの実施形態において、本発明は、被験体が膵臓腺癌に悩んでいるか否かを評価するためのキットであって、該キットは本明細書中に記載された方法によって同定されたバイオマーカーの発現を評価するための試薬を含む。本発明のもう１つの態様は膵臓腺癌の存在を評価するためのキットを提供し、該キットは核酸プローブを含み、ここに、該プローブは本明細書中に記載された方法によって同定されたバイオマーカーに対応する転写されたポリヌクレオチドに特異的に結合する。
また、本発明は、被験体において膵臓腺癌を阻害するための複数の化合物の各々の適当性を評価するためのキットを提供し、該キットは複数の化合物；および本明細書中に記載された方法によって同定されたバイオマーカーの発現を評価するための試薬を含む。
もう１つの態様において、本発明は、ヒト膵臓腺癌細胞の存在を評価するためのキットを提供し、該キットは抗体を含み、ここに、該抗体は本明細書中に記載された方法によって同定されたバイオマーカーに対応する蛋白質に特異的に結合する。
本発明のもう１つの態様はテスト化合物の膵臓細胞発癌性能力を評価する方法を提供し、該方法は、テスト化合物の存在下および非存在下で膵臓細胞の別々のアリコートを維持し；次いで、アリコートの各々におけるバイオマーカーの発現を比較することを含み、ここに、該バイオマーカーは本明細書中に記載された方法によって同定され、ここに、テスト化合物の非存在下において維持されたアリコートに対する、テスト化合物の存在下において維持されたアリコートにおけるバイオマーカーの発現の有意に増強されたレベルは、テスト化合物がヒト膵臓細胞発癌性能力を保有することを示す。
さらなる態様において、本発明はテスト化合物の膵臓細胞発癌性能力を評価するためのキットを提供し、該キットは膵臓細胞、およびバイオマーカーの発現を評価するための試薬を含む。
さらにもう１つの態様において、本発明は、１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座が誤発現される、ＫＲＡＳの活性化突然変異を含む動物モデル、またはそれから単離された細胞にテスト化合物を投与し、次いで、該動物モデルにおいて膵臓腺癌の開始、維持、または進行に対するテスト化合物の効果を決定することを含む、膵臓腺癌の発生、進行、および／または維持を変調する化合物を同定する方法を提供する。
なおもう１つの態様において、本発明は、１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座が誤発現される、ＫＲＡＳの活性化突然変異を含む動物モデル、またはそれから単離された細胞にテスト化合物を投与し；次いで、該動物モデルにおいて膵臓腺癌の開始、維持、または進行に対するテスト化合物の効果を決定することを含み、膵臓腺癌の治療または予防用の潜在的治療剤を評価する方法を提供する。１つの実施形態において、該化合物は蛋白質、核酸分子、抗体、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、および有機または非−有機低分子よりなる群から選択される。
また、本発明は、本明細書中に記載された方法によって同定された化合物を投与することを含み、膵臓腺癌を有する、またはそれを発症する危険性がある被験体において膵臓腺癌を治療するまたは予防する方法を提供する。
なおもう１つの態様において、本発明は、１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座が誤発現される、ＫＲＡＳの活性化突然変異を含む膵臓腺癌の動物モデルからの単離された細胞、または細胞の精製された調製物を提供する。１つの実施形態において、該細胞は膵臓腺癌の該動物モデルからの膵臓組織から単離される。もう１つの実施形態において、該細胞は上皮、間質、腺房、または管細胞である。なおもう１つの実施形態において、細胞はトランスジェニック細胞、例えば、マウス細胞である。
１つの態様において、本発明は、被験体が膵臓腺癌に悩んでいる、または膵臓腺癌を発症する危険性があるか否かを評価する方法を提供し、該方法は、被験体試料中の最小共通領域（ＭＣＲ）のコピー数を、ＭＣＲの正常なコピー数と比較することを含み、ここに、該ＭＣＲは表２に列挙されたＭＣＲよりなる群から選択され、ここに、試料中のＭＣＲの改変されたコピー数は、被験体が膵臓腺癌に悩んでいるか、または膵臓腺癌を発症する危険性があることを示す。１つの実施形態において、コピー数は蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって評価される。もう１つの実施形態において、コピー数は定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって評価される。１つの実施形態において、正常なコピー数は対照試料から得られる。
もう１つの態様において、本発明は、被験体が膵臓腺癌に悩んでいるか、または膵臓腺癌を発症する危険性があるか否かを評価する方法を提供し、該方法はａ）試料中のバイオマーカーの量、構造および／または活性、ここに、該バイオマーカーは表２に列挙されたＭＣＲに存在するバイオマーカーであり；およびｂ）該バイオマーカーの正常な量、構造、および／または活性と比較することを含み、ここに、試料中のバイオマーカーの量、構造、および／または活性、および正常な量、構造、および／または活性の間の有意な差は、被験体が膵臓腺癌に悩んでいるか、または膵臓腺癌を発症する危険性があることを示す。１つの実施形態において、バイオマーカーの量を比較する。もう１つの実施形態において、バイオマーカーの構造を比較する。もう１つの実施形態において、バイオマーカーの活性を比較する。もう１つの実施形態において、バイオマーカーの量を、バイオマーカーの発現のレベルを測定することによって決定する。１つの実施形態において、バイオマーカーはバイオマーカーのコピー数を測定することによって決定される。なおもう１つの実施形態において、バイオマーカーの正常な量／構造および／または活性は対照試料から得られる。１つの実施形態において、試料は血液、尿、糞、胆汁、膵臓細胞または膵臓組織よりなる群から選択される。１つの実施形態において、コピー数は比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）によって評価される。さらなる実施形態において、ＣＧＨはアレイで行われる。１つの実施形態において、試料中のバイオマーカーの発現のレベルは、バイオマーカーに対応する蛋白質の試料中での存在を検出することによって評価される。もう１つの実施形態において、蛋白質の存在は、該蛋白質と特異的に結合する試薬を用いて検出される。１つの実施形態において、該試薬は抗体、抗体誘導体、および抗体フラグメントよりなる群から選択される。さらなる実施形態において、試料中のバイオマーカーの発現のレベルは、転写されたポリヌクレオチドの試料、またはその部分の存在を検出することによって評価され、ここに、転写されたポリヌクレオチドはバイオマーカーを含む。１つの実施形態において、転写されたポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。もう１つの実施形態において、転写されたポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。さらなる実施形態において、検出する工程は、さらに、転写されたポリヌクレオチドを増幅することを含む。１つの実施形態において、試料中のバイオマーカーの発現のレベルは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、バイオマーカーにアニールする、またはバイオマーカーを含むポリヌクレオチドの部分にアニールする転写されたポリヌクレオチドの試料中での存在を検出することによって評価される。
なおもう１つの態様において、本発明は、被験体において膵臓腺癌の進行をモニターする方法を提供し、該方法はａ）バイオマーカーの量および／または活性を第一の時点において被験体試料中で検出し、ここに、該マーカーは表２に列挙されたＭＣＲに存在するマーカーであり；ｂ）その後の時点において工程ａ）を反復し；次いで、ｃ）工程ａ）およびｂ）で検出された量および／または活性を比較し、次いで、それより、被験体における膵臓腺癌の進行をモニターすることを含む。１つの実施形態において、試料は血液、尿、糞、胆汁、膵臓細胞または膵臓組織よりなる群から選択される。１つの実施形態において、バイオマーカーの活性が測定される。もう１つの実施形態において、バイオマーカーの量が測定される。さらなる実施形態において、バイオマーカーの量は、バイオマーカーの発現のレベルを測定することによって決定される。さらなる実施形態において、試料中のバイオマーカーの発現のレベルは、バイオマーカーに対応する蛋白質の試料中での存在を検出することによって評価される。なおさらなる実施形態において、蛋白質の存在は、蛋白質に特異的に結合する試薬を用いて検出される。１つの実施形態において、試薬は抗体、抗体誘導体、および抗体フラグメントよりなる群から選択される。１つの実施形態において、試料中のバイオマーカーの発現のレベルは、転写されたポリヌクレオチドまたはその部分の試料中での存在を検出することによって評価され、ここに、転写されたポリヌクレオチドはバイオマーカーを含む。さらなる実施形態において、転写されたポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。もう１つの実施形態において、転写されたポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。なおもう１つの実施形態において、検出する工程は、さらに、転写されたポリヌクレオチドを増幅することを含む。もう１つの実施形態において、試料中のバイオマーカーの発現のレベルは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、バイオマーカーにアニールする、またはバイオマーカーを含むポリヌクレオチドの部分にアニールする転写されたポリヌクレオチドでの存在を検出することによって評価される。１つの実施形態において、試料は被験体から得られた細胞を含む。もう１つの実施形態において、第一の時点およびその後の時点の間で、被験体は膵臓腺癌に対する治療を受けており、膵臓腺癌に対する治療を完了しており、および／または緩解中である。
本発明の１つの態様は、被験体において膵臓腺癌を阻害するためのテスト化合物の効力を評価する方法を提供し、該方法はａ）被験体から得られ、テスト化合物の存在下で維持された第一の試料中のバイオマーカーの量および／または活性、ここに、該バイオマーカーは表２にリストしたＭＣＲに存在するバイオマーカーであり；およびｂ）被験体から得られ、かつテスト化合物の非存在下で維持された第二の試料中のバイオマーカーの量および／または活性を比較することを含み、ここに、第二の試料に対する、膵臓腺癌で欠失されるＭＣＲに存在する第一の試料中のバイオマーカーの有意に高い量および／または活性は、テスト化合物が膵臓腺癌を阻害するのに効力があることを示し、ここに、第二の試料に対する、膵臓腺癌で増幅されたＭＣＲに存在する第一の試料中のバイオマーカーの有意に低い量および／または活性は、テスト化合物が被験体において膵臓腺癌を阻害するのに効力があることを示す。１つの実施形態において、第一および第二の試料は被験体から得られた単一試料の部分である。もう１つの実施形態において、第一および第二の試料は被験体から得られたプールされた試料の部分である。
本発明のもう１つの態様は被験体において膵臓腺癌を阻害するための療法の効力を評価する方法を提供し、該方法は：ａ）被験体に療法の少なくとも一部を供するに先立って被験体から得られた第一の試料中のバイオマーカーの量および／または活性、ここに、該バイオマーカーは表２に列挙されたＭＣＲに存在するバイオマーカーであり、およびｂ）療法の一部の提供に続いて被験体から得られた第二の試料中のバイオマーカーの量および／または活性を比較することを含み、ここに、第二の試料に対する、膵臓腺癌において欠失されたＭＣＲに存在する第一の試料中のバイオマーカーの有意に高い量および／または活性は、テスト化合物が膵臓腺癌を阻害するのに効力があることを示し、ここに、第二の試料に対する、膵臓腺癌で増幅されるＭＣＲに存在する第一の試料中のバイオマーカーの有意に低い量および／または活性は、該療法が被験体において膵臓腺癌を阻害するのに効力があることを示す。
本発明のなおもう１つの態様は膵臓腺癌を変調することができる組成物を選択する方法を提供し、該方法はａ）膵臓腺癌細胞を含む試料を得；ｂ）該細胞をテスト化合物と接触させ；次いで、ｃ）バイオマーカーの量および／または活性を変調するテスト化合物の能力を測定し、ここに、該バイオマーカーは表２にテストされたＭＣＲに存在するバイオマーカーであり、それにより、膵臓腺癌のモジュレーターを同定することを含む。１つの実施形態において、細胞は膵臓腺癌の動物モデルから単離される。もう１つの実施形態において、細胞は膵臓腺癌細胞株からのものである。なおもう１つの実施形態において、細胞は膵臓腺癌に罹った被験体からのものである。さらなる実施形態において、細胞は膵臓腺癌腫瘍に由来する膵臓腺癌細胞株からのものである。
本発明の１つの態様は膵臓腺癌を変調することができる組成物を選択する方法を提供し、該方法はａ）表２に列挙されたＭＣＲに存在するバイオマーカーをテスト化合物と接触させ；次いで、ｂ）表２に列挙されたＭＣＲに存在するバイオマーカーの量および／または活性を変調するテスト化合物の能力を測定し、それにより、膵臓腺癌を変調することができる化合物を同定することを含む。１つの実施形態において、該方法は、さらに、膵臓腺癌の動物モデルにテスト化合物を投与することを含む。
本発明のもう１つの態様は膵臓腺癌を阻害する化合物の能力を評価するためのキットを提供し、該キットは表２に列挙されたＭＣＲに存在するバイオマーカーの量、構造、および／または活性を評価するための試薬を含む。
本発明の１つの態様は被験体が膵臓腺癌に悩んでいるか否かを評価するためのキットを提供し、該キットは、表２に列挙されたＭＣＲよりなる群から選択されるＭＣＲのコピー数を評価するための試薬を含む。
本発明のなおもう１つの態様は被験体が膵臓腺癌に悩んでいるか否かを評価するためのキットを提供し、該キットは表２に列挙されたＭＣＲに存在するバイオマーカーの量、構造、および／または活性を評価するための試薬を含む。
本発明の１つの態様はヒト膵臓腺癌細胞の存在を評価するためのキットを提供し、該キットは抗体またはそのフラグメントを含み、ここに、該抗体またはそのフラグメントは表２に列挙されたＭＣＲに存在するバイオマーカーに対応する蛋白質に特異的に結合する。
本発明のもう１つの態様は膵臓腺癌細胞の存在を評価するためのキットを提供し、該キットは核酸プローブを含み、ここに、該プローブは表２に列挙されたＭＣＲに存在するバイオマーカーに対応する転写されたポリヌクレオチドに特異的に結合する。１つの実施形態において、核酸プローブは分子ビーコンプローブである。
本発明の１つの態様は、表２に列挙されたＭＣＲに存在するバイオマーカーに対応する遺伝子または蛋白質の量および／または活性のモジュレーターを被験体に投与し、それにより、膵臓腺癌に悩む被験体を治療することを含む、膵臓腺癌に悩む被験体を治療する方法を提供する。
本発明のもう１つの態様は、膵臓腺癌で増幅される表２に列挙されたＭＣＲに存在するバイオマーカーに対応する遺伝子または蛋白質の量および／または活性を阻害する化合物を被験体に投与し、それにより、膵臓腺癌に悩む被験体を治療することを含み、膵臓腺癌に悩む被験体を治療する方法を提供する。１つの実施形態において、該化合物は薬学的に受容可能な処方にて投与される。１つの実施形態において、該化合物は、該マーカーに対応する蛋白質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。さらなる実施形態において、抗体はトキシンに結合体化される。なおもう１つの実施形態において、抗体は化学療法剤に結合体化される。１つの実施形態において、該化合物は、該マーカーに対応する遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ干渉因子である。さらなる実施形態において、ＲＮＡ干渉因子はｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。１つの実施形態において、該化合物は該バイオマーカーに対応する遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。もう１つの実施形態において、該化合物はペプチドまたはペプチドミメティックである。なおもう１つの実施形態において、該化合物は該バイオマーカーの活性を阻害する低分子である。１つの実施形態において、低分子はバイオマーカーおよび標的蛋白質の間の蛋白質−蛋白質相互作用を阻害する。１つの実施形態において、該化合物は該バイオマーカーの発現または活性を阻害するアプタマーである。
本発明のもう１つの態様は、膵臓腺癌において欠失した表２に列挙されたＭＣＲに存在するバイオマーカーに対応する遺伝子または蛋白質の発現または活性を増加させる化合物を被験体に投与し、それにより、膵臓腺癌に悩む被験体を治療することを含む、膵臓腺癌に悩む被験体を治療する方法を提供する。
本発明のなおもう１つの態様は、膵臓腺癌において欠失した表２に列挙されたＭＣＲに存在するバイオマーカーに対応する蛋白質を被験体に投与し、それにより、膵臓腺癌に悩む被験体を治療することを含む、膵臓腺癌に悩む被験体を治療する方法を提供する。１つの実施形態において、蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターによって、蛋白質は被験体の細胞に供される。もう１つの実施形態において、化合物は薬学的に受容可能な処方にて投与される。
本発明の１つの態様は、表２に列挙されたＭＣＲから選択されたＭＣＲ内に含まれる単離された核酸分子、またはそのフラグメントを提供し、ここに、該核酸分子は膵臓腺癌において改変された量、構造、および／または活性を有する。
本発明のもう１つの態様は核酸分子によってコードされた単離されたポリペプチドを提供する。
（発明の詳細な説明）
本発明は、当該疾患の開始、維持、および進行を含めた、ヒト膵臓腺癌の遺伝的および組織学的特徴を発生反復する膵臓腺癌の非−ヒト動物モデルの創製に少なくとも部分的には基づく。従って、本発明は、癌、例えば、膵臓腺癌の動物モデルを提供し、そこでは、Ｋｒａｓの活性化突然変異が導入されており、いずれかの１以上の既知または未知の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座、例えば、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ、Ｉｎｋ４ａ、Ａｒｆ、ｐ５３、Ｓｍａｄ４／Ｄｐｃ、Ｌｋｂ１、Ｂｒｃａ２、またはＭｌｈ１が誤発現され、例えば、誤発現されて、減少した発現または非−発現に導かれている。１つの実施形態において、１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座の誤発現は、Ｃｒｅレコンビナーゼの組織−特異的発現によって特異的細胞型において活性化し、または欠失することができる条件対立遺伝子によって達成される。１つの実施形態において、Ｉｎｋ４ａ／ＡｒｆはＫｒａｓの活性化と組み合わされて誤発現される。もう１つの実施形態において、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆおよびｐ５３はＫｒａｓの活性化と組み合わされて誤発現される。
特に、本発明者らは、１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座、例えば、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆの誤発現と組み合わされたＫｒａｓの活性化が膵臓腺癌を強力に誘導し、他方、いずれかの遺伝的病巣単独が進行した悪性病の生成に不十分であることを示した。動物モデルは、膵臓−特異的Ｃｒｅ−媒介突然変異体Ｋｒａｓ対立遺伝子（ＫｒａｓＧ１２Ｄ）（Ｊａｃｋｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：３２４３）および条件Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ対立遺伝子（Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ）の欠失双方を担うように作成された。Ｋｒａｓ対立遺伝子は「ノック−イン」であり、すなわち、それはその内因性プロモーターによって制御される。Ｋｒａｓ対立遺伝子、ＫｒａｓＧ１２Ｄは活性化突然変異（Ｇ１２Ｄ）を運び、その結果、Ｋｒａｓが構成的に発現される。従って、動物モデルにおいて、Ｋｒａｓはヒト膵臓腺癌における遺伝子の発現を模倣したレベルで発現される。Ｃｒｅレコンビナーゼ発現では、全ての腺房、島および管細胞においてＣｒｅ活性を生じ、全ての膵臓系列においてｌｏｘＰ含有対立遺伝子を欠失するＰｄｘ１−Ｃｒｅ導入遺伝子（Ｇｕ Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２９，２４４７−２４５７）を用いた：Ｋｒａｓは、従って、内因性レベルで活性化され、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆは膵臓の全ての細胞において特異的に欠失される。
これらの突然変異体対立遺伝子の組合せを担う動物は、高度に攻撃的で、侵入的かつ転移性の腫瘍まで迅速かつ確実に進行し、最後には、１１週齢までに動物の死滅をもたらす膵臓上皮内新形成（本明細書中で用いるＰａｎＩＮｓ）といわれる病巣プレ悪性管病変を発症する。
これらの腫瘍の進化は、貧弱に分化した状態まで進む傾向を持つ増殖性間質成分および管病変を保有する、ヒト疾患に対して驚くべき類似性を担う。該腫瘍はヒト癌に対して、同様な組織学的進行および同一の免疫組織化学的プロフィールでもって生起する。例えば、癌は、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ欠失と組み合わされて腺癌まで進行し、管マーカーを発現するが、内分泌または外分泌マーカーを発現しないＫｒａｓ活性化（ＰａｎＩＮｓ）に関連したプレ悪性管病変から生起する。腫瘍は極端に迅速に（全て７および１１週の間）かつ高度に再現可能な履歴でもって生起する。
腫瘍、例えば、膵臓腺癌が本発明の動物モデルにおいてその中で生起する迅速かつ狭いウィンドウは、本明細書中に記載された、膵臓腺癌に対するバイオマーカーおよび治療剤の同定、および化合物のプレ臨床的テストを大いに促進する。従って、本発明は、例えば、バイオマーカー発見およびスクリーニングアッセイのような、本明細書中に記載された癌、例えば、膵臓腺癌の動物モデルでの使用を提供する。バイオマーカーは疾患に対するバイオマーカー、例えば、初期疾患バイオマーカー、または腫瘍の維持および進行を含めた疾患の種々の段階を同定する疾患マーカーであり得る。
さらに、本発明の動物モデルによって表示された膵臓癌およびヒト疾患の間の高度な同様性に基づき、本発明は本明細書中に記載された動物モデルを用いる方法および、例えば、膵臓腺癌を有する、またはその危険性がある被験体において、膵臓腺癌の検出、または癌進行の段階の同定のための方法における本明細書中に記載されたこれらのバイオマーカーの使用も含む。
１つの実施形態において、バイオマーカーの同定は、対照動物と比較した本発明の動物モデルの血清プロテオミックス分析に基づく（例えば、実施例２参照）。もう１つの実施形態において、バイオマーカーの同定は、本発明の動物モデルからの腫瘍の比較ゲノミック分析に基づく（例えば、実施例３参照）。
従って、本発明は、ある種の染色体領域（遺伝子座）内に含まれ、癌に関連する再発コピー数変化の、（最小共通領域（ＭＣＲ）とここではいわれる）ゲノムの特異的領域を提供する。これらのＭＣＲは、膵臓癌ゲノム、例えば、膵臓腺癌ゲノムにおいてコピー数改変の高分解能特徴付けを可能とする新規なｃＤＮＡまたはオリゴマー−ベースのプラットフォームおよびバイオインフォーマティックスツールを用いて同定された。
ＭＣＲに到達するためには、アレイ比較ゲノミックハイブリダイゼーション（アレイ−ＣＧＨ）を利用して、膵臓腺癌細胞株および腫瘍検体中でコピー数異常（ＣＮＡ）（染色体領域の獲得および喪失）を規定した。
本明細書中で同定されたＭＣＲの増幅または欠失は、癌、例えば、膵臓癌および他の上皮癌の存在と相関する。さらに、各ＭＣＲ内に存在する遺伝子のコピー数および／または発現レベルの分析は、個々のバイオマーカーおよびバイオマーカーの組合せの同定、被験体における癌、例えば、膵臓癌、例えば、膵臓腺癌の存在および／または不存在と相関する増大したおよび減少した発現および／または増大したおよび減少したコピー数に導く。
従って、試料中の癌の存在、試料中の癌の不存在、およびバイオマーカーの量、構造および／または活性の改変を評価することによって、被験体における癌の予防、診断、特徴付け、および療法に関連する癌の他の特徴を検出するための方法がここに提供される。例えば、本明細書中で同定される、またはバイオマーカーの活性、またはＭＣＲ内のバイオマーカーのいずれかの１以上のメチル化状態に影響するコピー数、発現レベル、蛋白質レベル、蛋白質活性、突然変異の存在（例えば、置換、欠失、または付加突然変異）を評価することによる、ＭＣＲの存在、不存在またはコピー数の評価は本発明の範囲内のものである。
また、被験体において癌を阻害することができる化合物の同定のための、および本発明の遺伝子または蛋白質バイオマーカーのモジュレーター、例えば、アゴニストまたはアンタゴニストを用いる癌の治療、予防および／または阻害のための方法もまたここに提供される。
本明細書中に記載されたＭＣＲおよびバイオマーカーは膵臓癌試料で同定されたが、本発明の方法は膵臓癌の予防、診断、特徴付け、療法および予防での使用に断じて限定されず、例えば、本発明の方法は本明細書中に記載されたようにいずれの癌でも適用される。
また、本発明は、膵臓腺癌の治療および／または予防用の治療剤、例えば、腫瘍の悪性成長を予防または阻害する分子的に標的化された治療剤の同定のために、本明細書中に記載された動物モデル、またはこれらの動物モデルに由来する細胞または細胞形を用いるスクリーニング方法も提供する。
もう１つの態様において、本発明は、膵臓腺癌の治療および／または予防についての潜在的治療剤の評価のための、モデルシステム、例えば、プレ臨床モデルシステムとして本明細書中に記載された動物モデルを用いる方法を提供する。本発明の動物モデルにおける膵臓腺癌の進行、例えば、３週における非常に初期のプレ悪性病巣（ＰａｎＩＮ−１）の存在、４週におけるより進行したプレ悪性病巣（ＰａｎＩＮ−２）における存在、および５週までの小さな膵臓腺癌の存在に基づき、疾患の開始および進行に対する化学予防剤の、および化学治療剤および疾患の応答および治癒の臨床的インパクトの迅速測定が可能である。
なおもう１つの態様において、本発明は、例えば、ヘテロタイプ腫瘍−間質相互作用の研究、および腫瘍維持プログラムにおけるＫｒａｓの同定のための、膵臓腺癌の疾患生物学を研究するのに用いることができる細胞系の創製のための本発明の動物モデルの使用も提供する。
本発明の遺伝的に匹敵する初期継代マウス細胞系は、例えば、共培養、遺伝子発現プロファイリング、およびいずれかの細胞型における特異的遺伝子発現の操作を用いる腫瘍および間質の間のヘテロタイプ相互作用についての基礎の研究によって、疾患生物学を理解するのに有用である（Ｏｌｕｍｉ， Ａ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９，５００２−５０１１；Ｔｌｓｔｙ，Ｔ．Ｄ．，およびＨｅｉｎ，Ｐ．Ｗ．（２００１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ １１，５４−５９）。
また、本発明の細胞系は、例えば、腫瘍細胞を直接的に標的とするのみならず、腫瘍細胞とのミクロ環境の相互作用によって作り出された成長および生存シグナルを抑制することによって間接的な効果を発揮する化合物のような、腫瘍−間質共生を破壊する新しい薬物標的の発見で用いることもできる。
また、本発明の細胞系は、ＫＲＡＳ転写プログラムおよびシグナリング代理を同定するのにも用いることができる。これらの細胞系は、Ｋｒａｓ癌遺伝子プログラムおよびプロテオミックスプロフィールの同定でも有用である。腫瘍細胞の維持された増殖のためのＫＲＡＳの重要性は、ＲＮＡｉ技術を用いる発現ノック−ダウン、続いての、ＳＣＩＤマウスにおける直伸注射によって評価することができる。これは１）ＫＲＡＳまたはそのシグナリング代理が適当な薬物標的であるか否かの判断、２）潜在的新規な治療標的として働くであろう（無傷または破壊されたＫＲＡＳ発現での発現プロファイリング細胞による）特異的ＫＲＡＳシグナリング代理の同定、３）活性化されたＫＲＡＳのプロテオミックスシグニチャーの判断を可能とするであろう。シグニチャー発現プロフィールおよびプロテオミックスプロフィールの利用可能性は、ＫＲＡＳまたはそのシグナリング代理に向けられた薬物効力および特異性の評価において強力な源を提供する。
もう１つの実施形態において、本発明の動物モデルにおける癌の高度に再現可能であって迅速な進化もまたそれを、他の同系繁殖株と交雑させて、それらの癌に対する可能なモディファイヤーを同定するのに、および腫瘍形成に対する特定の蛋白質の寄与も遺伝的テストで適当であるようにする。また、開示された動物を研究ツールとして用いて、膵臓癌の遺伝的および生理学的特徴を決定することもできる。
本発明の種々の態様を以下のサブセクションにおいてさらに詳しく記載する。
（Ｉ．定義）
本明細書中で用いるように、以下の用語の各々はこのセクションにおいてそれに関連する意味を有する。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書中においては、冠詞の文法的目的の１または１を超える（すなわち、少なくとも１）をいうのに用いる。例えば、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ（ある要素）」は１つの要素または１を超える要素を意味する。
用語「腫瘍」または「癌」は、制御されない増殖、不滅、転移能力、迅速な成長および増殖速度、およびある種の特徴的形態学的特徴のような癌を引き起こす細胞に典型的な特徴を保有する細胞の存在をいう。癌細胞はしばしば腫瘍の形態であるが、そのような細胞は動物内で単独に存在することができるか、あるいは白血病細胞のような非−腫瘍形成性癌細胞であり得る。本明細書中で用いるように、用語「癌」はプレ悪性ならびに悪性癌を含む。癌は、限定されるものではないが、膵臓癌、例えば、膵臓腺癌、メラノーマ、乳癌、肺癌、気管支癌、結直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、頸癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、単環癌、小腸または中枢癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液学的組織の癌などを含む。
本明細書中で用いる用語「膵臓癌」はアデノーマ、腺癌、ガストリノーマ、ソマトスタチノーマ、インスリノーマおよびグルカゴノーマを含む。
本明細書中で用いるように、用語「腺癌」は、器官のライニングまたは内部表面に発症し、腺組織に由来し、または腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌腫である。
本明細書中において相互交換的に用いるように、「膵臓腺癌」または「膵管腺癌」は膵臓の腺癌である。１つの実施形態において、膵臓腺癌は膵臓管で起こる病変の進行から生起する（「ＰａｎＩＮ」とここではいう膵臓上皮内新形成）。
本明細書中で用いるように、「トランスジェニック動物」は、当該動物の細胞の１以上、好ましくは実質的に全てが導入遺伝子を含む動物、例えば、非−ヒト哺乳動物、例えば、霊長類、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、またはげっ歯類、例えば、マウスを含む。導入遺伝子は、例えば、マイクロインジェクション、トランスフェクションまたは感染によって、例えば、組み換えウイルスでの感染によって、細胞の前駆体への導入によって直接的または間接的に細胞に導入される。用語遺伝子操作は組換えＤＮＡ分子の導入を含む。この分子は染色体内に組み込まれ得るか、あるいはそれは染色体外で複製するＤＮＡであり得る。
本明細書中で用いるように、用語「げっ歯類」とは、系統分類目げっ歯目の全てのメンバーをいう。
本明細書中で用いるように、用語「誤発現」は遺伝子発現の非−野生型パターンを含む。発現は、本明細書中で用いるように、転写、転写後、例えば、ｍＲＮＡ安定性、翻訳、および翻訳後段階を含む。誤発現は：非−野生型レベルにおける、すなわち、発現を超えるまたは下回る発現；遺伝子が発現される時点または段階の点で野生型とは異なる発現のパターン、例えば、所定の発生期間または段階における（野生型と比較した）増大したまたは減少した発現；所定の細胞型または組織型、例えば、膵臓組織における（野生型と比較した）減少した発現の点で野生型と異なる発現のパターン；スプライシングサイズ、アミノ酸配列、トランジション後修飾、または発現されたポリペプチドの生物学的活性の点で野生型と異なる発現のパターン；遺伝子の発現に対する環境刺激または細胞外刺激の効果の点で野生型と異なる発現のパターン、例えば、刺激の長さの増大または減少の存在下で（野生型と比較して）増大したまたは減少した発現のパターンを含む。誤発現はトランスジェニック核酸からのいずれの発現も含む。誤発現は、例えば、遺伝子またはその制御配列の全てまたは一部の欠失によって誘導することができる遺伝子または導入遺伝子の欠如または非−発現を含む。
例えば、１以上の腫瘍サプレッサー蛋白質、例えば、該Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ蛋白質をコードする遺伝子の誤発現は、腫瘍サプレッサー遺伝子、例えば、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子の破壊によって引き起こされ得る。１つの実施形態において、腫瘍サプレッサー遺伝子、例えば、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子は該蛋白質の全てまたは一部をコードするＤＮＡの除去を介して破壊される。もう１つの実施形態において、動物は誤発現された腫瘍サプレッサー遺伝子、例えば、該Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子につきヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る、例えば、それは腫瘍サプレッサー遺伝子、例えば、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ導入遺伝子につきヘテロ接合性またはホモ接合性のトランスジェニック動物であり得る。もう１つの実施形態において、動物は腫瘍遺伝子、例えば、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子のトランスジェニック破壊、好ましくは、遺伝子産物を不活化する挿入または欠失を持つトランスジェニックマウスである。好ましい実施形態において、本発明の動物または細胞は１以上の腫瘍サプレッサー導入遺伝子、例えば、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ導入遺伝子、およびＫｒａｓ、例えば、ＫｒａｓＧ１２Ｄにおける導入遺伝子、またはＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ導入遺伝子、ｐ５３導入遺伝子、およびＫｒａｓ、例えば、ＫｒａｓＧ１２Ｄにおける導入遺伝子を運ぶ。もう１つの実施形態において、本発明の動物または細胞はＩｎｋ４ａ、Ａｒｆ、ｐ５３、Ｓｍａｄ４／Ｄｐｃ、Ｌｋｂ１、Ｂｒｃａ２、またはＭｌｈ１よりなる群から選択される腫瘍サプレッサー導入遺伝子を運ぶ。
本明細書中で用いるように、用語「ノックアウト」とは、導入遺伝子の挿入が当該動物またはそれからの細胞において内因性遺伝子を破壊する動物またはそれからの細胞をいう。この破壊は、例えば、動物または細胞においてＩｎｋ４ａ／Ａｒｆを実質的に排除することができる。
本明細書中で用いるように、用語「ノック−イン」とは、導入遺伝子の挿入が動物またはそれからの細胞において内因性遺伝子を破壊し、その結果、遺伝子機能、例えば、野生型発現レベルまたは発現パターンと異なる発現レベルまたは発現パターンをもたらし、その遺伝子の機能の喪失をもたらさない動物またはそれからの細胞をいう。
用語ノックアウトおよびノック−インは、遺伝子発現が条件付きで変調された（例えば、破壊されたまたは改変された）動物またはそれからの細胞、例えば、スクリーニングアッセイで用いられる細胞を創製するのに用いることもできる「条件ノック−アウト」および／または「条件ノック−イン」システムをいうことも意図される。例えば、（ここに引用して援用する）ＷＯ ９４／２９４４２および米国特許第５，６５０，２９８号に記載された遺伝子の条件改変についてのテトラサイクリン−調節システムを用いて、当該細胞と接触したテトラサイクリン濃度の変調を介して制御されるように改変された細胞、またはそれから細胞を単離することができる動物を創製することができる。もう１つの実施形態において、トランスジェニック非−ヒト動物を作出することができ、それは導入遺伝子の調節された発現を可能とする選択されたシステムを含む。そのようなシステムの１つの例はバクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼシステムの記載については、例えば、（ここに引用してその内容を明示的に一体化させる）Ｌａｋｓｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，９５９，３１７参照。レコンビナーゼシステムのもう１つの例はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰレコンビナーゼシステムである（ここに引用してその内容を明示的に一体化させるＯ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５）。もしｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼシステムを用いて導入遺伝子の発現を制御するならば、Ｃｒｅレコンビナーゼおよび選択された蛋白質を共にコードする導入遺伝子を含有する動物が要求される。そのような動物は「二重」トランスジェニック動物の構築を通じて、例えば、一方が選択された蛋白質をコードする導入遺伝子を含有し、他方がレコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する２つのトランスジェニック動物を接合させることによって供することができる。
１つの実施形態において、本発明のノック−アウト動物は腫瘍サプレッサー遺伝子、例えば、ｐ５３またはＩｎｋ４ａ／Ａｒｆの条件ノック−アウトを運ぶ。例えば、条件Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ対立遺伝子（Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ）は、エクソン２および３のＣｒｅ−媒介切り出しを維持し、それにより、組織特異的にｐ１６Ｉｎｋ４Ａおよびｐ１９Ａｒｆ蛋白質を共に排除するように作成した（実施例１参照）。もう１つの実施形態において、本発明のノック−イン動物は条件ＫｒａｓＧ１２Ｄノック−イン対立遺伝子（ＬＳＬ−Ｋｒａｓ）を運び、そこでは、ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ対立遺伝子は転写ストッパーエレメントのＣｒｅ−媒介切り出しに続いて内因性レベルで発現される（Ｊａｃｋｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：３２４３）。もう１つの実施形態において、ノック−イン導入遺伝子は遺伝子、例えば、ＫｒａｓＧ１２Ｄの活性化突然変異を保有する。本明細書中で用いるように、「活性化突然変異」は、その遺伝子の構成的発現をもたらす遺伝子配列の変化である。例えば、イン・ビボにて、腫瘍形成の結果、減少したＧＴＰａｓｅ活性およびＫｒａｓの構成的シグナリングに関連するＫｒａｓのコーディング配列において突然変異をもたらす。
もう１つの態様において、本発明は、動物または細胞に導入されると、該動物または細胞において１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座、例えば、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子またはｐ５３遺伝子の誤発現をもたらす核酸分子をその特徴とする。好ましい実施形態において、該核酸分子は腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座、ＩＮＫ４ａ／Ａｒｆ、ｐ５３、Ｉｎｋ４ａ、Ａｒｆ、ｐ５３、Ｓｍａｄ４／Ｄｐｃ、Ｌｋｂ１、Ｂｒｃａ２、またはＭｌｈ１、破壊、例えば、挿入または欠失、例えば、マーカー配列の挿入を含むヌクレオチド配列を含む。野生型ＩＮＫ４ａのヌクレオチド配列は当該分野で知られており、例えば、Ｇｅｎｅｂａｎｋ，ｇｉ：６７５３３８９（配列番号：１）に記載されており；野生型ｐ５３のヌクレオチド配列は当該分野で知られており、例えば、Ｇｅｎｅｂａｎｋ，ｇｉ：８４００７３７（配列番号：２０）に記載されており；野生型ＳＭＡＤ４のヌクレオチド配列は当該分野で知られており、例えば、Ｇｅｎｅｂａｎｋ，ｇｉ：３１５４３２２３（配列番号：２１）に記載されており；野生型Ｌｋｂ１のヌクレオチド配列は当該分野で知られており、例えば、Ｇｅｎｅｂａｎｋ，ｇｉ：７１０６４２４（配列番号：２２）に記載されており；野生型Ｍｌｈ１のヌクレオチド配列は当該分野で知られており、例えば、Ｇｅｎｅｂａｎｋ，ｇｉ：１９３８７８５１（配列番号：２５）に記載されており；野生型Ｂｒｃａ２のヌクレオチド配列は当該分野で知られており、例えば、Ｇｅｎｅｂａｎｋ，ｇｉ：６８５７７６４（配列番号：２６）に記載されており；野生型Ａｒｆ１のヌクレオチド配列は当該分野で知られており、例えば、Ｇｅｎｅｂａｎｋ，ｇｉ：３１５６０７３４（配列番号：２７）に記載されており；各々の内容をここに引用して援用する。
本明細書中で用いるように、「遺伝子の破壊」とは、遺伝子配列の変化、例えば、コーディング領域の変化をいう。破壊は：挿入、欠失、点突然変異、および再編成、例えば、インバージョンを含む。破壊は天然遺伝子または遺伝子座の領域、例えば、天然Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆまたはｐ５３ ＤＮＡ配列（例えば、１以上のエクソン）および／または遺伝子のプロモーター領域で起こって、遺伝子の野生型または天然に生じる配列と比較して細胞における遺伝子の発現を減少または防止することができる。「破壊」は古典的なランダム突然変異によって、または部位特異的方法によって誘導することができる。破壊はトランスジェニック的に導入することができる。全遺伝子の欠失は破壊である。１つの実施形態において、破壊は、ヘテロ接合においては、腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座の発現または活性レベル、例えば、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆまたはｐ５３の発現または活性レベルを、野生型の約５０％まで低下させ、あるいはホモ接合体においては、腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座、例えば、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆまたはｐ５３の発現または活性を実質的に排除する。
本明細書中で用いるように、用語「トランスジェニック細胞」とは、導入遺伝子を含有する細胞をいう。
本明細書中で用いるように、用語「マーカー配列」とは、（ａ）核酸構築体（例えば、標的化構築体）の一部として用いて、注目する遺伝子（例えば、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子）の発現を破壊し、および（ｂ）標的化構築体をそれらのゲノムに組み込んだ細胞を同定するのに用いられる核酸分子をいう。例えば、マーカー配列は、抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、または細胞で典型的には見出されないアッセイ可能な酵素、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼなどのような検出可能な特性を細胞に付与する蛋白質をコードする配列であり得る。
本明細書中で用いる「最小共通領域（ＭＣＲ）」とは、癌のゲノムにおける獲得および増幅（増大したコピー数）または喪失または欠失（減少したコピー数）いずれかを呈する連続的染色体領域をいう。ＭＣＲは、増大したまたは減少したコピー数を有し、かつ癌と関連する少なくとも１つの核酸配列を含む。本発明のＭＣＲは、限定されるものではないが、表２に記載されたものを含む。
「バイオマーカー」は改変することができる遺伝子または蛋白質であり、ここに、該改変は癌に関連したものである。該改変は正常なまたは健康な組織または細胞（例えば、対照）におけるその量、構造および／または活性と比較して、癌組織または癌細胞における量、構造および／または活性であり得、癌のような病期に関連する。例えば、癌と関連する本発明のバイオマーカーは、正常な、健康な組織または細胞と比較して、癌組織または癌細胞において、改変されたコピー数、発現レベル、蛋白質レベル、蛋白質活性、またはメチル化状態を有することができる。さらに、「バイオマーカー」は、癌のような病期に関連する組織または細胞に存在した場合、例えば、置換、欠失または付加によって、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルにおいてその構造が改変された、例えば、突然変異した（対立遺伝子変種を含有する）、例えば、野生型配列と異なる分子を含む。
バイオマーカーの用語「改変された量」またはバイオマーカーの「改変されたレベル」とは、対照試料におけるバイオマーカーの発現レベルまたはコピー数と比較した、バイオマーカーまたは染色体領域、例えば、ＭＣＲの増大したまたは減少したコピー数、および／または癌試料における特定のバイオマーカー遺伝子または複数遺伝子の増大したまたは減少した発現レベルをいう。バイオマーカーの用語「改変された量」は、正常、対照試料におけるバイオマーカーの蛋白質レベルと比較して、試料、例えば、癌試料におけるバイオマーカーの増大したまたは減少した蛋白質レベルも含む。さらに、バイオマーカーの改変された量は、バイオマーカーの発現または活性に影響し得る、本明細書中に記載した、バイオマーカーのメチル化状態を検出することによって測定することができる。
被験体におけるバイオマーカーの量、例えば、バイオマーカーまたはＭＣＲの発現またはコピー数、またはバイオマーカーの蛋白質レベルは、もしバイオマーカーの量を評価するのに使用するアッセイの標準誤差よりも大きな量、好ましくは、その量の少なくとも２、より好ましくは３、４、５、１０以上倍だけ正常レベルよりも、各々、より大きいかまたはより小さければ、バイオマーカーまたはＭＣＲの正常な量よりも「有意に」高いまたは低い。あるいは、被験体におけるバイオマーカーまたはＭＣＲの量は、もし該量がバイオマーカーまたはＭＣＲの正常な量よりも、各々、少なくとも約２、好ましくは少なくとも約３、４または５倍高いかまたは低ければ、正常な量よりも「有意に」高いまたは低いと考えることができる。
「遺伝子のコピー数」または「バイオマーカーのコピー数」とは、特定の遺伝子産物をコードする細胞中のＤＮＡ配列の数をいう。一般に、与えられた遺伝子に対して、哺乳動物は各遺伝子の２つのコピーを有する。しかしながら、コピー数は遺伝子増幅または複製によって増加し得るか、あるいは欠失によって減少し得る。
バイオマーカーのまたはＭＣＲの「正常な」コピー数、またはバイオマーカーの発現の「正常な」レベルは、被験体、例えば、癌に悩まされていないヒトからの生物学的試料、例えば、組織、全血、血清、血漿、頬切屑、唾液、尿、糞、胆汁、膵臓細胞または膵臓組織を含有する試料中の発現のレベル、バイオマーカーのコピー数、またはＭＣＲのコピー数である。
バイオマーカーまたはＭＣＲの用語「発現の改変されたレベル」とは、発現またはコピー数を評価するのに使用されるアッセイの標準誤差よりも大きいまたは小さい、テスト試料、例えば、癌に罹った対照に由来する試料中のバイオマーカーの発現レベルまたはコピー数をいい、好ましくは、対照試料（例えば、関連する疾患を有しない健康な被験体からの試料）中のバイオマーカーまたはＭＣＲの発現レベルまたはコピー数の、好ましくは、いくつかの対照試料中のバイオマーカーＭＣＲの平均発現レベルまたはコピー数の好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは３、４、５または１０以上倍である。発現の改変されたレベルは発現またはコピー数を評価するのに使用されるアッセイの標準誤差よりも大きいかまたは小さく、好ましくは、対照試料（例えば、関連する疾患を有しない健康な被験体からの試料）におけるバイオマーカーまたはＭＣＲの発現レベルまたはコピー数の、好ましくは、いくつかの対照試料中のバイオマーカーまたはＭＣＲの平均発現レベルまたはコピー数の好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは３、４、５または１０倍以上である。
バイオマーカーまたはＭＣＲの「過剰発現」または「発現またはコピー数の有意により高いレベル」とは、発現またはコピー数を評価するのに使用されるアッセイの標準誤差よりも大きいテスト試料中での発現レベルまたはコピー数をいい、対照試料（例えば、癌に悩んでいない健康な被験体からの試料）におけるバイオマーカーまたはＭＣＲの発現レベルまたはコピー数、好ましくは、いくつかの対照試料におけるバイオマーカーまたはＭＣＲの平均発現レベルまたはコピー数の好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは３、４、５または１０倍以上である。
バイオマーカーまたはＭＣＲの「過小発現」または「発現またはコピー数の有意により低いレベル」とは、発現またはコピー数を評価するのに使用されるアッセイの標準誤差よりも大きいテスト試料における発現またはコピー数をいうが、対照試料（例えば、癌に悩んでいない健康な被験体からの試料）におけるバイオマーカーまたはＭＣＲの発現レベルまたはコピー数、好ましくは、いくつかの対照試料におけるバイオマーカーまたはＭＣＲの平均発現レベルまたはコピー数の好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは３、４、５または１０倍以上少ない。
バイオマーカーの「メチル化状態」とは、メチル化パターン、例えば、バイオマーカーのプロモーターのメチル化、および／またはバイオマーカーのメチル化レベルをいう。ＤＮＡメチル化は遺伝可能であって、可逆的かつ後成の変化である。なお、ＤＮＡメチル化は発生および遺伝的結果を有する、遺伝子発現を改変する能力を有する。ＤＮＡメチル化は、例えば、その内容をここに引用して援用するＬａｉｒｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：１４８７−１４９５およびＬａｉｒｄ，Ｐ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ ３：２５３−２６６に記載されたように癌にリンクされている。例えば、腫瘍サプレッサー遺伝子のプロモーターにおけるＣｐＧオリゴヌクレオチドのメチル化はその不活化に至りかねない。加えて、正常なメチル化プロセスにおける改変はゲノム不安定性と関連付けられている（Ｌｅｎｇａｕｅｒ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：２５４５−２５５０，１９９７）。そのような異常な後成の変化は多くのタイプの癌で見出すことができ、従って、癌遺伝子トランスフォーメーションについての潜在的バイオマーカーとして供するができる。
メチル化を測定する方法は制限ランドマークゲノミックスキャニング（Ｋａｗａｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７４２１−７４２７，１９９４）、メチル化−感受性任意起点ＰＣＲ（Ｇｏｎｚａｌｇｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：５９４−５９９，１９９７）；メチル化−感受性制限酵素でのゲノミックＤＮＡの消化、引き続いての、注目する領域のサザン分析（消化−サザン方法）；ＰＣＲ増幅に先立ってのメチル化−感受性制限酵素でのゲノミックＤＮＡの消化を含むＰＣＲ−ベースのプロセス（Ｓｉｎｇｅｒ−Ｓａｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６８７， １９９０）；ビスルファイト処理を用いるゲノミック配列決定（Ｆｒｏｍｍｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８２７−１８３１，１９９２）；メチル化−特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）（Ｈｅｒｍａｎ， ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１−９８２６，１９９２）；およびビスルファイト−変換ＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の制限酵素消化（Ｓａｄｒｉ ａｎｄ Ｈｏｒｎｓｂｙ， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：５０５８−５０５９，１９９６；およびＸｉｏｎｇ ａｎｄ Ｌａｉｒｄ， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：２５３２−２５３４，１９９７）；遺伝子突然変異の検出のためのＰＣＲ技術（Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１１４３−１１４７，１９９１）および対立遺伝子−特異的発現の定量（Ｓｚａｂｏ ａｎｄ Ｍａｎｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．９：３０９７−３１０８、 １９９５；およびＳｉｎｇｅｒ−Ｓａｍ， ｅｔ ａｌ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．１：１６０−１６３， １９９２；および米国特許第６，２５１，５９４号に記載された方法を含み、それらの内容をここに引用して援用する。Ｚａｒｄｏ， ｅｔ ａｌ．，（２０００） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３２：４５３−４５８に記載された集積ゲノミックおよびエピゲノミック分析も用いることができる。
バイオマーカーの用語「改変された活性」とは、正常な対照試料中でのバイオマーカーの活性と比較して、例えば、癌試料における病期で増加したまたは減少したバイオマーカーの活性をいう。バイオマーカーの改変された活性は、例えば、バイオマーカーの改変された発現、バイオマーカーの改変された蛋白質レベル、バイオマーカーの改変された構造、または例えば、バイオマーカーと同一または異なる経路に関与する他の蛋白質との改変された相互作用、または転写アクチベーターまたはインヒビターとの改変された相互作用、または改変されたメチル化状態の結果であり得る。
バイオマーカーの用語「改変された構造」とは、正常なまたは野生型遺伝子または蛋白質と比較した、バイオマーカー遺伝子またはメーカー蛋白質内の突然変異または対立遺伝子変種、例えば、バイオマーカーの発現または活性に影響する突然変異の存在をいう。例えば、突然変異は、限定されるものではないが、置換、欠失、または付加突然変異を含む。突然変異はバイオマーカーのコーディングまたは非コーディング領域に存在することができる。
「バイオマーカー核酸」は、本発明のバイオマーカーによってコードされた、またはそれに対応する核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）である。バイオマーカー核酸分子は、核酸配列のいずれか、またはそのような配列の相補体の完全なまたは部分的配列をコードするＲＮＡも含む、ここに、全てのチミジン残基はウリジン残基で置き換えられえている、「バイオマーカー蛋白質」は、本発明のバイオマーカーによってコードされた、またはそれに対応する蛋白質である。バイオマーカー蛋白質は、配列のいずれかまたはそのフラグメントによってコードされた蛋白質の完全なまたは部分的配列を含む。用語「蛋白質」および「ポリペプチド」は本明細書中では相互交換可能に用いられる。
本明細書中で用いる「バイオマーカー」は、表３に記載されたＭＣＲに存在するいずれかの核酸配列、またはそのような配列によってコードされる蛋白質を含む。
本明細書中で同定されたバイオマーカーは診断および治療バイオマーカーを含む。単一のバイオマーカーは診断バイオマーカー、治療バイオマーカー、または診断および治療バイオマーカーの双方であり得る。
本明細書中で用いるように、用語「治療バイオマーカー」は、癌の発生（維持、進行、脈環形成、および／または転移を含む）に関与すると信じられているバイオマーカーを含む。治療バイオマーカーの癌−関連機能は、例えば、（１）例えば、ヒト癌の約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％以上を超えるにおいて、増大したまたは減少したコピー数（例えば、イン・サイチュハイブリダイゼーションにおける蛍光（ＦＩＳＨ）、およびＦＩＳＨ＋スペクトルハロタイプ（ＳＫＹ）、または定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による）、または突然変異（例えば、配列決定による）、過剰発現または過小発現（例えば、イン・サイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ノーザンブロット、またはｑＰＣＲによる）、増大したまたは減少した蛋白質レベル（例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）による）、または増大したまたは減少した蛋白質活性（例えば、バイオマーカーが関与する経路の変調によって決定）；（２）例えば、バイオマーカーのＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）による、例えば、軟寒天における癌細胞の増殖および成長の阻害；（３）癌遺伝子、例えば、ＭｙｃおよびＲＡＳによる、またはＲＡＳ単独による，マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の形質転換を増強するためのバイオマーカーの能力；（４）例えば、軟寒天における、腫瘍細胞系の成長を増強または減少させるバイオマーカーの能力；（５）ＳＣＩＤ外植体において一次マウス細胞を形質転換するバイオマーカーの能力；および／または；（６）バイオマーカーを阻害し、または活性化することによる、腫瘍、例えば、ヒト癌細胞系に由来する動物または腫瘍でデ・ノボ生起する腫瘍の維持または形成の予防によって確認することができる。
本明細書中で用いるように、用語「診断バイオマーカー」は、癌の診断で有用なバイオマーカー、例えば、療法の前、間または後における、腫瘍の過剰−または過小−活性出現、発現、成長、緩解、再発または抵抗性を含む。バイオマーカーの予言的機能は、例えば、（１）例えば、ヒト癌の約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％以上を超えるにおいて、増大したまたは減少したコピー数（例えば、ＦＩＳＨ、ＦＩＳＨ＋ＳＫＹ、またはｑＰＣＲによる）、過剰発現または過小発現（例えば、ＦＩＳＨ、ノーサンブロット、またはｑＰＣＲによる）、増大したまたは減少した蛋白質レベル（例えば、ＩＨＣによる）、増大したまたは減少した活性（例えば、バイオマーカーが関与する経路の変調によって測定）；（２）癌に悩む被験体、例えば、ヒトからの生物学的試料、例えば、組織、全血、血清、血漿、頬切屑、唾液、脳脊髄液、尿、糞、胆汁、膵臓細胞または膵臓組織を含有する試料におけるその存在または不存在；（３）癌をもつ被験体の臨床的サブセットにおけるその存在または不存在（例えば、特定の治療に応答するもの、または抵抗性を発生するもの）によって確認することができる。
診断バイオマーカーは、「代理バイオマーカー」、例えば、癌の進行の間接的バイオマーカーであるバイオマーカーも含む。
用語「プローブ」とは、特に意図した標的分子、例えば、本発明のバイオマーカーに選択的に結合することができるいずれかの分子をいう。プローブは当業者が合成することができるか、あるいは適当な生物学的調製物に由来することができる。標的分子の検出の目的では、プローブは、本明細書中に記載したように、標識されるように特別に設計することができる。プローブとして利用することができる分子の例は、限定されるものではないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、蛋白質、抗体、および有機モノマーを含む。
本明細書中で用いるように、用語「プロモーター／調節配列」は、プロモーター／調節配列に操作可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。いくつかの実施形態において、この配列はコアプロモーター配列であってよく、他の例においては、この配列は、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の調節エレメントも含むことができる。プロモーター／調節配列は、例えば、空間的にまたは時間的に制限された様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。
本明細書中で用いる「ＲＮＡ干渉因子」は、ＲＮＡで干渉（ＲＮＡｉ）によって、標的遺伝子例えば、本発明のバイオマーカーの発現に干渉し、またはそれを阻害するいずれかの剤と定義される。そのようなＲＮＡ干渉因子は、限定されるものではないが、標的遺伝子、例えば、本発明のバイオマーカー、またはそのフラグメントに相同なＲＮＡ分子、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的遺伝子の発現に干渉し、またはそれを阻害する低分子を含めた核酸分子を含む。
「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」は進化的に保存されたプロセスであり、それにより、標的遺伝子を同一または高度に類似する配列のＲＮＡの発現または導入の結果、その標的化遺伝子（Ｃｏｂｕｒｎ， Ｇ．ａｎｄ Ｃｕｌｌｅｎ， Ｂ．（２００２） Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６（１８）：９２２５）から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列特異的分解または特異的転写後遺伝子ライセンシング（ＰＴＧＳ）がもたらされ、それにより、標的遺伝子の発現が阻害される。１つの実施形態において、ＲＮＡは二本鎖、ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。このプロセスは植物、無脊髄動物、および哺乳動物細胞で記載されている。天然では、ＲＮＡｉは、長いｄｓＲＮＡの、ｓｉＲＮＡと呼ばれる二本鎖フラグメントへのプロセス的切断を促進するｄｓＲＮＡ−特異的エンドヌクレアーゼダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によって開始される。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを認識し、それを切断する蛋白質複合体に一体化される。ＲＮＡｉは、核酸分子、例えば、合成ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡ干渉因子を導入して、標的遺伝子の発現を阻害し、またはそれをサイレントとすることによって開始することもできる。本明細書中で用いるように、「標的遺伝子発現の阻害」または「バイオマーカー遺伝子発現の阻害」は、標的遺伝子（例えば、本発明のバイオマーカー遺伝子）または標的遺伝子によってコードされた蛋白質）例えば、本発明のバイオマーカー蛋白質の発現または蛋白質活性のいずれかの減少を含む。該減少は、標的遺伝ｉの発現、またはＲＮＡ干渉因子によって標的とされてこなかった標的遺伝子によってコードされる蛋白質の活性またはレベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上であり得る。
「小干渉ＲＮＡ」とも本明細書中ではいう「短い干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）は、例えば、ＲＮＡｉによって標的遺伝子の発現を阻害するように機能する剤と定義される。ｓｉＲＮＡは化学的に合成することができ、イン・ビトロ転写によって生産することにより、あるいは、宿主細胞内で生産することができる。１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡは長さが約１５ないし約４０ヌクレオチド、おそらくは約１５ないし約２８ヌクレオチド、より好ましくは長さが約１９ないし約２５ヌクレオチド、より好ましくは長さが約１９、２０、２１または２２ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であり、約０、１、２、３、４または５ヌクレオチドの長さを有する各ストランド上に３’および／または５’突出を含むことができる。該突出の長さは独立して２つのストランドの間であり、すなわち、１つのストランド上の突出の長さは第二のストランド上の突出の長さに依存しない。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解または特異的な転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を通じてＲＮＡ干渉を促進することができる。
もう１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡは（ステムループとも呼ばれる）小さなヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。１つの実施形態において、これらのｓｈＲＮＡは短い（例えば、１９ないし２５ヌクレオチド）アンチセンスストランド、続いての、５ないし９ヌクレオチドループ、および類似のセンスストランドから構成される。別法として、センスストランドはヌクレオチドループ構造に先行することができ、アンチセンスストランドは続くことができる。これらのｓｈＲＮＡはプラスミド、レトロウイルスおよびレンチウイルスに含ませることができ、例えば、ｐｏｌ ＩＩＩ Ｕ６プロモーター、またはもう１つのプロモーターから発現させることができる（例えば、ここに引用して援用するＳｔｅｗａｒｔ， ｅｔ ａｌ．，（２００３）ＲＮＡ Ａｐｒ；９（４）：４９３−５０１参照）。
ＲＮＡ干渉因子、例えば、ｓｉＲＮＡ分子は、癌を有する、または有する危険性がある被験体に投与して、本発明のバイオマーカー遺伝子、例えば、（表２にリストしたバイオマーカーのような）癌で過剰発現されるバイオマーカー遺伝子の発現を阻害し、それにより、被験体において癌を治療し、予防し、または阻害することもできる。
「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードする、または特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結した場合、細胞のほとんどまたは全ての生理学的条件下で遺伝子産物が生きたヒト細胞で生産されるようにするヌクレオチド配列である。
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードする、または特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結した場合に、実質的に、プロモーターに対応するインデューサーが細胞に存在する場合のみ遺伝子産物が生きたヒト細胞で生産されるようにするヌクレオチド配列である。
「組織−特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコードする、またはそれを特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結した場合、実質的に、細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合のみ、遺伝子産物が生きたヒト細胞で生産されるようにするヌクレオチド配列である。
「転写されたポリヌクレオチド」は、本発明のバイオマーカーの転写、およびもしあれば転写体の正常な転写後プロセッシング（例えば、スプライシング）、および転写体の逆転写によって作成された成熟ＲＮＡの全てまたは部分に相補的な、またはそれに相同なポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ、ｃＤＮＡの１つのアナログ）である。
「相補的な」とは、２つの核酸ストランドの領域の間、または同一核酸ストランドの２つの領域の間の配列相補性の広い概念をいう。第一の核酸領域のアデニン残基は、もし該残基がチミンまたはウラシルであれば、第一の領域に反平行である第二の核酸領域の残基とで特異的な水素結合（「塩基対合」を結合することが知られている。同様に、第一の核酸ストランドのシトシン残基は、もし該残基がグアニンであれば、第一のストランドに対して反平行である第二の核酸ストランドの残基とで塩基対合できることが知られている。核酸の第一の領域は、もし２つの領域が反平行に配列させる場合に、第一の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第二の領域の残基とで塩基対合できるならば、同一または異なる核酸の第二の領域に相補的である。好ましくは、第一の領域は第一の部分を含み、第二の領域は第二の部分を含み、それにより、第一および第二の部分が反平行に整列した場合、第一の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％は第二の部分におけるヌクレオチド残基とで塩基対合できる。より好ましくは、第一の部分の全てのヌクレオチド残基は第二の部分におけるヌクレオチド残基とで塩基対合できる。
本明細書中においては相互交換的に用いられる用語「相同性」または「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列の間、または２つのポリペプチド配列の間の配列同様性をいい、同一性はより厳格な比較である。フレーズ「％同一性または相同性）」および「％同一性または相同性」とは、２以上のポリヌクレオチド配列または２以上のポリペプチド配列の比較で見出された配列同様性のパーセンテージをいう。「配列同様性」とは、２以上のポリヌクレオチドの配列の間における（いずれかの適当な方法によって測定して）塩基対配列におけるパーセント同様性をいう。２以上の配列は０ないし１００％同様のいずれかの場所、またはそれらの間のいずれかの正数値であり得る。同一性または同様性は、比較の目的で成立することができる各配列の位置を比較することによって決定することができる。比較した配列中の位置が同一のヌクレオチド塩基またはアミノ酸によって占められれば、該分子はその位置において同一である。ポリヌクレオチド配列の間の同様性または同一性の程度は、ポリヌクレオチド配列によって共有される位置における同一またはマッチするヌクレオチドの数の関数である。ポリペプチド配列の同一性の程度は、ポリペプチド配列によって共有される位置における同一アミノ酸の数の関数である。ポリペプチド配列の相同性または同様性の程度はポリペプチド配列によって共有される位置におけるアミノ酸の数の関数である。本明細書中で用いる用語「実質的相同性」とは、少なくとも５０％、より好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上の相同性をいう。
バイオマーカーは、もしそれが、基質から解離するバイオマーカーの実質的割合なくして基質を流体（例えば、標準セーラインクエン酸、ｐＨ７．４）で漱ぐことができるように基質と共有結合により、または非−共有結合により会合すれば基質に固定）される。
本明細書中で用いるように「天然に生じる」核酸分子とは、天然で生じる（例えば、天然蛋白質をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子をいう。
癌は、もし癌の少なくとも１つの兆候が軽減され、終止され、遅れ、または妨げられるならば「阻害」される。本明細書中で用いるように、もし癌の再発または転移が低下し、遅れ、遅延し、または妨げられたならば、癌はやはり「阻害」される。
キットは少なくとも１つの剤、例えば、本発明のバイオマーカーを特異的に検出するためのプローブを含むいずれかの製造物（例えば、パッケージまたは容器）であり、該製造物は本発明の方法を実行するためのユニットとして促進され、分配され、または販売される。
（ＩＩ．本発明の使用）
本発明は、疾患の開始，維持、および進行を含めた、ヒト疾患の遺伝的および組織化学的特徴を発生反復する膵管腺癌の非−ヒト動物モデルの創製に少なくとも部分的に基づく。したがって、本発明は、本明細書中に記載された動物モデルを用いて膵臓腺癌を変調し、例えば、阻害し、治療し、または予防する化合物を同定するための方法を提供する。本発明は、膵臓癌の診断または予後で用いることができる膵臓癌特異的バイオマーカーを同定する方法も提供する。これらのバイオマーカーは、例えば、無兆候被験体において初期段階の疾患の検出のための、または被験体において膵臓癌の段階または進行を同定するための診断剤として働く。
本明細書中で記載するように、本発明の動物モデルにおける、Ｋｒａｓの誤発現、例えば、活性化、および１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子，例えば、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ、Ｉｎｋ４ａ、Ａｒｆ，ｐ５３、Ｓｍａｄ４／Ｄｐｃ、Ｌｋｂ１、Ｂｒｃａ２、またはＭｌｈ１の誤発現、例えば、減少した発現の結果、ヒトにおける疾患の開始、進行および／または維持を模倣する膵臓癌、例えば、膵臓腺癌の発生および進行をもたらす。かくして、本明細書中に記載した動物モデル、ならびに特異的細胞型、例えば、膵臓腺癌動物モデルに由来する膵臓、間質、腺房、管、精製された細胞、または本明細書中に記載された、これらの細胞型から発生し、膵臓腺癌動物モデルに由来する細胞系をスクリーニングアッセイで用いて、膵臓腺癌を変調し、治療し、予防し、または診断する剤を同定することができる。
（Ａ．バイオマーカーの発見）
本発明は、膵臓癌、例えば、膵臓腺癌の開始、進行および／または維持についての診断、予後および／または薬理ゲノミクスバイオマーカー、または予後バイオマーカーの同定方法を提供する。本発明の同系繁殖体の遺伝的に決定された動物モデルは制御された環境条件下で維持され、高度に再現性があり、かつ迅速な膵臓腺癌の発症を示し、これは、それらを、限定されるものではないが、初期段階、進行した段階、および後期段階の疾患のバイオマーカーを含めた疾患に対する段階−特異的バイオマーカーの同定用の理想的なツールとする。また、本発明の動物モデルは、限定されるものではないが、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ、Ｉｎｋ４ａ、Ａｒｆ，ｐ５３、Ｓｍａｄ４／Ｄｐｃ、Ｌｋｂ１、Ｂｒｃａ２、またはＭｌｈ１を含めた特異的遺伝子の機能の喪失を含めた、特定の遺伝的病変に特異的なバイオマーカーの同定を可能とする。
一般に、膵臓癌、例えば、膵臓腺癌に関連したバイオマーカーを同定する方法は、野生型動物、例えば、対照動物からの１以上の誤発現腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座に加え、本明細書中に記載された動物モデル、例えば、ＫＲＡＳの活性化突然変異を運ぶ動物モデルからの組織、全血、血清、血漿、頬切屑、唾液、尿、糞、胆汁、膵臓細胞または膵臓組織を含有する試料中のバイオマーカーの量および／または活性を比較することを含む。バイオマーカーの量および／または活性における動物の間の差は、バイオマーカーが膵臓腺癌に関連付けられることを示す。
１つの実施形態において、本発明の動物モデルからの試料、例えば、組織、全血、血清、血漿、頬切屑、唾液、尿、糞、胆汁、膵臓細胞または膵臓組織を含有する試料を、野生型動物、例えば、対照動物からの試料、例えば、組織、全血、血清、血漿、頬切屑、唾液、尿、糞、胆汁、膵臓細胞または膵臓組織を含有する試料と比較する。
本発明の動物モデルおよびそれから単離された細胞系もまた、蛍光イメージングプローブ用の適当な基質として働くこができるカテプシンのような特異的腫瘍関連プロテアーゼのような間質成分と反応する診断剤の発見で用いることもできる（Ｎｔｚｉａｃｈｉｒｓｔｏｓ， Ｖ．， ｅｔ ａｌ．，（２００３） Ｅｕｒ Ｒａｄｉｏｌ １３，１９５−２０８；Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ， Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ｎａｔ Ｍｅｄ ８，７５７−７６０；Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ， Ｒ．，ａｎｄ Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ， Ｖ．（２００３） Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，１２３−１２８）。膵臓腺癌における間質の特徴づけは、腫瘍サイズに対するその重要な寄与を仮定すれば、診断における活動性である。イン・ビトロでの培養技術は、腫瘍細胞および関連する間質総合の培養が、各腫瘍区画における（例えば、ファージ−表示技術を用いる（Ｓｐｅａｒ， Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８， ５０６−５１１）細胞表面マーカーの発現プロフィールを研究する潜在能力を可能とする。細胞系はＳＣＩＤマウスの皮下注射で用いられており、元の腫瘍細胞形態および遺伝学の頑強な成長および保持を示している。したがって、もう１つの実施形態において、間質からの組織を腫瘍の上皮区画からの組織と比較し、それを用いて、腫瘍の間質区画または上皮区画に特異的なバイオマーカーを同定する。更なる実施形態において、細胞系はその全体が膵臓腫瘍から生じさせ、それを利用して、前記したバイオマーカーを同定する。なおもう１つの実施形態において、細胞系はその全体が膵臓腫瘍の間質および／またはその上皮成分から発生し、それを利用して、前記したバイオマーカーを同定する。１つの実施形態において、腫瘍の間質区画からの細胞を腫瘍の上皮区画からの細胞と混合する。
１つの実施形態において、バイオマーカーは、当該分野で知られ、本明細書中に記載された免疫組織化学方法を用いて概観される、例えば、腫瘍の成長を調節することができる種々の分子の蓄積のパターンに基づいて同定される。病因に関与する特異的遺伝子または分子の群の発現を分析に指向されるスクリーニングを、動物モデルの一生の間継続することができる。発現は、免疫組織化学によって、ならびに蛋白質およびＲＮＡブロッティング技術によってモニターすることができる。転移性病巣は、一旦形成されたならば、そのような比較概観に付すこともできる。この分析は、異なる遺伝子発現に対する（本発明の動物モデルにおいて本明細書中に記載されたように同定された膵臓腺癌を変調するとして同定された化合物の使用を含めた）種々の治療範例の効果の評価を含めるように拡大することもできる。異なる遺伝子発現の外観に由来する情報は、最後には、動物モデルにおける疾患の開始と進行とを相関させることができる。
１つの実施形態において，バイオマーカーは蛋白質またはそのフラグメントである。例示的実施形態として、本発明のバイオマーカーの蛋白質および／またはフラグメントは、対照動物と比較した場合のその誤発現に基づいて、本発明の動物モデルの血液（全血、血清、および／または血漿）、頬切屑、唾液、尿、糞、胆汁、膵臓細胞または膵臓組織から同定される。血清検体は、膵臓腺癌の、例えば、開始、進行および／または維持についての診断、予後および／または薬理ゲノミクスである段階−特異的バイオマーカーの同定を可能とするために、例えば、マススペクトロメトリーによって特異的ペプチドの同定用の分析に容易に付すことができるフラクションへ検体を分解する当該分野で知られた蛋白質発見プラットフォームによって分析される（実施例２参照）。
１つの実施形態において，抗体、例えば、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体はこれらのバイオマーカーに対して生起される。抗体発生のためのエピトープは、ヒトにおけるオルソロガス蛋白質を認識する当業者によって選択することができる。これらの抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ−ベースのアッセイを用いてヒト診断、予後および／または薬理ゲノミクスバイオマーカーとしてのそれらの適用性につき評価して、その臨床的追跡が膵臓癌、例えば、膵臓腺癌の発生を明らかとする予測臨床試験において、ヒト膵臓腺癌被験体からの、およびコントロール被験体からの試料、例えば、血清をテストすることができる。
もう１つの実施形態において、蛋白質バイオマーカーは、（Ｚｙｏｍｙｘサイトカインチップのような）特異的蛋白質チップを利用して同定される。
もう１つの実施形態において、バイオマーカーは核酸またはそのフラグメントである。核酸バイオマーカーは、例えば、本発明の動物モデルの発現パターンを対照同腹子と比較する遺伝子発現パターンに基づいて同定することができる。例えば、１以上の遺伝子の発現パターンは、次いで、そのような評価で用いることができる「遺伝子発現プロフィール」または「転写プロフィール」に一部形成することができる。本明細書中で用いることができる「遺伝子発現プロフィール」または「転写プロフィール」は、与えられた条件の組の下で、与えられた組織または細胞型で得られたｍＲＮＡ発現のパターンを含む。そのような条件は、限定されるものではないが、細胞成長、増殖、分化、形質転換、腫瘍形成、転移、およびカルシノーゲン曝露を含むことができる。
遺伝子発現のプロフィールは、例えば、差分遺伝子発現手法、ノーザン分析および／またはＲＴ−ＰＣＲを利用することによって作り出すことができる。遺伝子発現プロフィールは、細胞−および／または動物−ベースのモデルシステム内で既知の状態につき特徴付けることができる。引き続いて、これらの既知の遺伝子発現プロフィールを比較して、そのような遺伝子発現プロフィールを修飾する、およびより望ましいプロフィールのそれにプロフィールをより密接に類似させる、テスト化合物が有する効果を確認することができる。
もう１つの実施形態において、非−侵入的イメージング技術、例えば、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を利用して、本発明のモデルシステムにおいて膵臓腫瘍の発生および成長をモニターして本明細書中に記載したようにして発見されたバイオマーカーと癌の進行の相関を可能とする。
本発明のもう１つの態様において、正常な（すなわち、非−癌性）細胞と比較して、癌細胞、例えば、本明細書中に記載された膵臓癌の動物モデルからの細胞の異なるコピー数に導く実質的に改変された染色体領域（ＭＣＲ）内でバイオマーカーが同定される。したがって、本発明は、正常な（すなわち、非−癌性）細胞と比較して、癌細胞の異なるコピー数に導く構造的に改変された染色体領域（ＭＣＲ）の同定に部分的に基づく。さらに、本発明は、正常な（すなわち、非−癌性）細胞と比較して、癌細胞における改変された量、構造および／または活性を有する、バイオマーカー、例えば、本発明のＭＣＲに存在するバイオマーカーの同定に部分的に基づく。本発明のバイオマーカーは、正常および癌性細胞の一方または双方で検出することができるＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよびポリペプチド分子に対応する。
また、試料中の本発明の１以上のＭＣＲの存在、不存在および／またはコピー数もまた組織の癌状態と相関する。本発明は、かくして、細胞（例えば、非−ヒト、培養された非−ヒト細胞、イン・ビボ細胞から得られた細胞）の癌状態を評価するための組成物、キット、および方法、ならびに本発明のバイオマーカーのモジュレーター、例えば、アゴニストまたはアンタゴニストを用いて癌を治療、予防および／または阻害する方法を提供する。
（Ｂ．スクリーニングアッセイ）
１つの態様において、本発明は、膵臓癌を変調し、治療し、または予防する、または膵臓癌、例えば、膵臓腺癌の開始、維持、および／または進行に関与する分子を変調するモジュレーター、すなわち、候補またはテスト化合物または剤（例えば、蛋白質、ペプチド、ペプチドミメティックス，低分子（有機または無機）または他の薬物）を同定するために（ここでは「スクリーニングアッセイ」ともいう）スクリーニング方法を提供する。
１つの実施形態において、本発明の動物モデルに由来する細胞、例えば、１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子を誤発現する、および活性化Ｋｒａｓ突然変異を有する細胞を、エクス・ビボにて、１以上のテスト化合物と接触させることができ、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ、ｐ５３、または１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または膵臓癌に関連する他の遺伝子に関係するシグナル変換経路における分子によって調節される生物学的応答をモニターすることができる。（例えば、未処理細胞または対照剤で処理した細胞のような適当な対照と比較して）細胞、または１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または膵臓癌に関連する他の遺伝子が関係するシグナル変換経路における分子での応答の変調は、膵臓癌、例えば、膵臓腺癌のモジュレーターとしてテスト化合物を同定する。
もう１つの実施形態において、１以上のテスト化合物をイン・ビボにて本発明の動物モデル（例えば、本明細書中に記載した膵臓癌の動物モデル）に直接投与して、１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子を誤発現し、活性化Ｋｒａｓ変調を有する細胞のイン・ビボ応答を変調するテスト化合物を同定し、または該動物における膵臓癌の開始、維持、および／または進行に対する、または疾患の兆候に対するテスト化合物の効果を評価する。曝露に対する動物の応答は、膵臓癌の逆行、またはそれに伴う兆候、例えば、処理の前および後における腫瘍負荷、腫瘍サイズ、および侵入的および／または転移能力の低下を評価することによってモニターすることができる。
テスト化合物は医薬組成物として動物モデルに投与することができる。そのような組成物は、典型的には、テスト化合物および薬学的に受容可能な担体を含む。本明細書中で用いるように、用語「薬学的に受容可能な担体」は、医薬投与に適合する、いずれかのおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌化合物、等張および吸収遅延化合物等を含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および化合物の使用は当該分野でよく知られている。いずれかの慣用的媒体または化合物が活性化合物に適合しないのを除き、組成物におけるその使用が考えられる。補助的活性化合物もまた組成物に配合することもできる。
エクス・ビボでのスクリーニング方法を実行するには、本発明の動物モデルに由来する細胞を標準的な方法によって動物または胚から単離し、テスト化合物と共にイン・ビトロにてインキュベート（すなわち、培養）することができる。細胞（例えば、膵臓細胞、例えば、膵臓上皮、間質、腺房、管）を標準的な技術によって本発明の動物から単離することができる。
１以上のテスト化合物と細胞との接触（エクス・ビボまたはイン・ビボいずれか）に続き、細胞の生物学的応答に対するテスト化合物の効果を、例えば、細胞の光学顕微鏡分析、細胞の組織化学分析、蛋白質の生産、ある種の遺伝子、例えば、腫瘍サプレッサー遺伝子の導入を含めた種々の適当な方法のいずれか１つによって測定することができる。
また、本発明は、（ａ）本発明のバイオマーカーに結合する、または（ｂ）本発明のバイオマーカーの活性に対する変調（例えば、刺激または阻害）効果を有し、さらに詳しくは、（ｃ）その天然基質（例えば、ペプチド、蛋白質、ホルモン、補因子、核酸）の１以上と本発明のバイオマーカーの相互作用に対する変調効果を有し、または（ｄ）本発明のバイオマーカーの発現に対する変調効果を有するモジュレーター、すなわち、候補またはテスト化合物または剤を同定する方法も提供する。そのようなアッセイは、典型的には、バイオマーカーおよび１以上のアッセイ成分の間の反応を含む。他の成分はテスト化合物それ自体、またはテスト化合物およびバイオマーカーの天然結合パートナーの組合せいずれかであり得る。本明細書中に記載されたもののようなアッセイを介して同定された化合物は、例えば、癌を変調し、例えば、阻害し、軽減し、治療し、または予防するのに有用であり得る。
本発明のテスト化合物は、天然および／または合成化合物の系統的ライブラリーを含めたいずれかの利用可能な源から入手することができる。また、テスト化合物は：生物学的ライブラリー；ペプトイドライブラリー、そうでなければ生体活性なままである酵素分解に対して耐性である新規な非−ペプチド骨格をもつ以外は、ペプチドの機能を有する分子のライブラリー；例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−８５参照）；空間的にアドレス可能な平衡固相または液相ライブラリー；脱回旋を必要とする合成ライブラリー方法；「１−ビーズ１−化合物」ライブラリー方法；アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー方法を含めた当該分野で公知のコンビナトーリアルライブラリー方法においていずれかの多数のアプローチによって得ることもできる。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定され、他方、他の４つのアプローチはペプチド、非−ペプチドオリゴマー、または化合物の低分子ライブラリーに適用できる（Ｌａｍ， １９９７， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、例えば、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３において当該分野で見出すことができる。化合物のライブラリーは溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， １９９２， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）ビーズ（Ｌａｍ， １９９１、 Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ， １９９３、 Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌および／または胞子（Ｌａｄｎｅｒ， ＵＳＰ ５，２２３，４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）上、またはファージ上（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８９−３９０：Ｄｅｖｌｉｎ １９９０、 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ， １９９１， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；Ｌａｄｎｅｒ， 前掲）に存在させることができる。
１つの実施形態において、本発明は、本発明のバイオマーカーまたはその生物学的に活性名部分の基質である候補またはテスト化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供することができる。もう１つの実施形態において、本発明は、本発明のバイオマーカーまたはその生物学的に活性な部分に結合する候補またはテスト化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。バイオマーカーに直接的に結合するテスト化合物能力の測定は、例えば、当該化合物のバイオマーカーへの結合が複合体中の標識されたバイオマーカー化合物を検出することによって測定できるように、該化合物を放射性同位体または酵素標識とカップリングさせることによって達成することができる。例えば、化合物（例えば、バイオマーカー基質）は直接的または間接的のいずれかで１２５Ｉ，３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで標識することができ、放射性同位体は放射性発光の直接的カウンティングによって、またはシンチレーションカウンティングによって検出することができる。別法として、アッセイ成分は、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識することができ、酵素標識は、適当な基質の生成物への返還の測定によって検出することができる。
もう１つの実施形態において、本発明は、本発明のバイオマーカーまたはその生物学的に活性な部分を活性を変調する候補またはテスト化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。全ての尤度において、バイオマーカーは、イン・ビボにて、限定されるものではないが、ペプチド、蛋白質、ホルモン、補因子、および核酸のような１以上の分子と相互作用することができる。この議論の目的では、そのような細胞および細胞外分子を本明細書中においては「結合パートナー」またはバイオマーカー「基質」という。
そのようなスクリーニングを容易にするための本発明の１つの必要な実施形態は、その天然のイン・ビボの結合パートナーを同定するためのバイオマーカーの使用である。当業者に知られたこれを達成するための多くの方法がある。１つの例は、バイオマーカー（結合パートナー）に結合し、またはそれと相互作用する、従って、バイオマーカーの天然の機能に恐らくは関与する他の蛋白質を同定するための、２−ハイブリッドアッセイまたは３−ハイブリッドアッセイにおける「エサ蛋白質」としてのバイオマーカー蛋白質の使用である（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６；Ｂｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００参照）。そのようなバイオマーカー結合パートナーは、バイオマーカー−媒介シグナリング経路のバイオマーカーまたは下流エレメントによるシグナルの増殖に関与するようでもある。別法として、そのようなバイオマーカー結合パートナーはまた、バイオマーカーの阻害剤としても用いられる。
２−ハイブリッドシステムは、別々のＤＮＡ−結合および活性化ドメインよりなるほとんどの転写因子のモジュール性質に基づく。簡単に述べれば、該アッセイは２つの異なるＤＮＡ構築体を利用する。１つの構築体において、バイオマーカー蛋白質をコードする遺伝子は、既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他の構築体において、同定されていない蛋白質（「プレイ（ｐｒｅｙ）」または「試料」）をコードする、ＤＮＡ配列のライブラリーからのＤＮＡ配列は、既知の転写因子の活性化ドメインにつきコードする遺伝子に融合される。もし「エサ」および「プレイ」蛋白質が相互作用し、イン・ビボにて、バイオマーカー−依存性複合体を形成できるならば、転写因子のＤＮＡ−結合および活性化ドメインは近接される。この近接は、転写因子に応答性の転写調節部位に操作可能に連結したレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能とする。レポーター遺伝子の発現は容易に検出でき、機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離し、これを用いて、バイオマーカー蛋白質と相互作用する蛋白質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
さらなる実施形態において、アッセイは、バイオマーカーおよびその基質および／または結合パートナーの間の相互作用を変調する（例えば、正にまたは負に影響する）化合物を同定する目的で本発明の使用を介して工夫することができる。そのような化合物は、限定されるものではないが、抗体、ペプチド、ホルモン、オリゴヌクレオチド、核酸、およびそのアナログのような分子を含むことができる。そのような化合物は、天然および／または合成化合物の系統的ライブラリーを含めたいずれかの利用可能な源から得ることもできる。この実施形態で用いられる好ましいアッセイ成分は本明細書中で同定される癌バイオマーカー、その既知の結合パートナーおよび／または基質、またはテスト化合物である。テスト化合物はいずれかの源から供給することができる。
バイオマーカーおよびその結合パートナーの間の相互作用に干渉する化合物を同定するのに用いられるアッセイシステムの基本的原理は、２つの生成物が相互作用し、結合し、かくして、複合体を形成するのを可能とするのに十分な条件下で、かつ十分な時間にて、バイオマーカーおよびその結合パートナーを含有する反応混合物を調製することを含む。阻害活性につき剤をテストするには、反応混合物をテスト化合物の存在下および非存在下で調製する。テスト化合物は最初に反応混合物に含めることができるか、あるいはバイオマーカーおよびその結合パートナーの添加に引き続いた時点で加えることができる。対照反応混合物はテスト化合物なくして、あるいはプラセボと共にインキュベートされる。次いで、バイオマーカーおよびその結合パートナーの間のいずれかの複合体の形成を検出する。テスト化合物を含有する反応混合物におけるそのような形成は少ないかまたはほとんどないが、対照反応における複合体の形成は、化合物がバイオマーカーおよびその結合パートナーの相互作用に干渉することを示す。逆に、対照反応におけるよりも化合物の存在におけるより多くの複合体の形成は、化合物がバイオマーカーおよびその結合パートナーの相互作用を増強することができることを示す。
バイオマーカーとその結合パートナーとの相互作用に干渉する化合物についてのアッセイは、不均一または均一フォーマットで行うことができる。不均一アッセイは、バイオマーカーまたはその結合パートナーいずれかを固相に係留させ、反応の最後に固相に係留された複合体を検出することを含む。均一アッセイにおいて、全反応は液相で行われる。いずれかのアプローチにおいて、反応体の添加の順序を変更して、テストすべき化合物についての異なる情報を得ることができる。例えば、（例えば、競合によって）バイオマーカーおよび結合パートナーの間の相互作用に干渉するテスト化合物は、テスト物質の存在下で反応を行うことによって、すなわち、バイオマーカーおよびその相互作用性結合パートナーに先立って、または同時に反応混合物へテスト物質を加えることによって同定することができる。別法として、予め形成された複合体を破壊するテスト化合物、例えば、複合体からの成分の１つを置き換えるより高い結合定数を持つ化合物は、複合体が形成された後にテスト化合物を反応混合物に加えることによってテストすることができる。
種々のフォーマットを以下に簡単に述べる。
不均一アッセイシステムにおいては、バイオマーカーまたはその結合パートナーいずれかを固体表面またはマトリックスに係留させ、他方、他の対応する非−係留成分を直接的にまたは間接的にのいずれかで標識することができる。実行に際しては、マイクロタイタープレートをこのアプローチでしばしば利用する。係留された種は、典型的には、該技術を実行する者によく知られている非共有結合的または共有結合的多数の方法によって固定化することができる。非共有結合的付着は、しばしば、単に、固体表面をバイオマーカーまたはその結合パートナーの溶液で被覆し、次いで、乾燥することによって達成することができる。別法として、係留すべきアッセイ成分に対して特異的な固定化された抗体をこの目的で用いることができる。そのような表面は、しばしば、予め調製し、貯蔵することができる。
関連する実施形態において、アッセイ成分の一方または他方がマトリックスに係留されるのを可能とするドメインを加える融合蛋白質を供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／バイオマーカー融合蛋白質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／結合パートナーをグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させることができ、次いで、これをテスト化合物またはテスト化合物と非−吸着バイオマーカーまたはその結合パートナーいずれかと組み合わせ、混合物を、複合体形成に導く条件（例えば、生理学的条件）下でインキュベートする。インキュベーションに続き、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、いずれかの未結合アッセイ成分を除去し、固定化された複合体を、例えば、前記したように直接的にまたは間接的に評価する。別法として、複合体をマトリックスから解離させ、標準的な技術を用いてバイオマーカー結合または活性のレベルを決定することができる。
蛋白質をマトリックスに固定化するための他の技術もまた本発明のスクリーニングアッセイで用いることもできる。例えば、ビオチンおよびストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して、バイオマーカーまたはバイオマーカー結合パートナーいずれかを固定化することができる。ビオチニル化バイオマーカー蛋白質または標的分子は、当該分野で知られた技術（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジン−被覆９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定化することができる。ある実施形態において、蛋白質−固定化表面を予め調製し、貯蔵することができる。
アッセイを行うためには、固定化されたアッセイ成分の対応するパートナーをテスト化合物の有りまたは無しにて、被覆された表面に曝露する。反応が完了した後、未反応アッセイ成分を（例えば、洗浄によって）除去し、いずれかの形成された複合体は固体表面に固定化されたままであろう。固体表面に係留された複合体の検出は、多数の方法で達成することができる。非−固定化成分を予め標識する場合、表面に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。非−固定化成分が予め標識されない場合、間接的標識を用いて、例えば、最初に非−固定化種に特異的な標識された抗体を用いて表面に係留された複合体を検出することができる（抗体は、今度は、直接的に標識するか、または例えば、標識された抗−Ｉｇ抗体で間接的に標識することができる）。反応成分の添加の順序に応じて、複合体形成を変調する（阻害しまたは増強する）、または予め形成された複合体を破壊するテスト化合物を検出することができる。
本発明の別の実施形態において、均一アッセイを用いることができる。これは、典型的には、テスト化合物の存在下または非存在下で液相中で行われる前記したものに類似の反応である。次いで、形成された複合体を未反応成分から分離し、形成された複合体の量を測定する。不均一アッセイシステムで述べたように、反応体の液相への付加の順序は、いずれのテスト化合物が複合体形成を変調する（阻害しまたは増強する）のか、いずれが予め形成された複合体を破壊するのかについての情報を得ることができる。
そのような均一アッセイにおいては、反応生成物は、限定されるものではないが、分画遠心法、クロマトグラフィー、電気泳動および免疫沈澱を含めた多数の標準的技術のいずれかによって未反応アッセイ成分から分離することができる。分画遠心法においては、分子の複合体は、それらの異なるサイズおよび密度に基づく複合体の異なる沈積平衡により一連の遠心工程を通じて未複合体化分子から分離することができる（例えば、Ｒｉｖａｓ， Ｇ．， ａｎｄ Ｍｉｎｔｏｎ， Ａ．Ｐ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １９９３ Ａｕｇ；１８（８）：２８４−７参照）。また、標準的なクロマトグラフィー技術を利用して、未複合体化のものから複合体化分子を分離することもできる。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーはサイズに基づき、かつカラムフォーマットにて適当なゲル濾過樹脂の利用を通じて分子を分離し、例えば、比較的大きな複合体は比較的小さな未複合体化成分から分離することができる。同様に、未複合体化分子と比較した複合体の比較的異なる電荷特性を開発して、例えば、イオン−交換クロマトグラフィー樹脂の使用を介して残りの個々の反応体から複合体を異なって分離することができる。そのような樹脂およびクロマトグラフィー技術は当業者によく知られている（例えば、Ｈｅｅｇａａｒｄ， １９９８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１１：１４１−１４８；Ｈａｇｅ ａｎｄ Ｔｗｅｅｄ， １９９７， Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．，６９９：４９９−５２５参照）。また、ゲル電気泳動を使用して、未結合種から複合体化分子を分離することもできる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編）， Ｉｎ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９９９参照）。この技術においては、蛋白質または核酸複合体を、例えば、サイズまたは電荷に基づいて分離する。電気泳動プロセスの間に結合相互作用を維持するためには、還元剤の非存在下での非変性ゲルが典型的には好ましいが、特別な相互作用体に適当な条件は当業者によく知られているであろう。免疫沈澱は溶液から蛋白質−蛋白質複合体の単離のために利用されるもう１つの普通の技術である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編）， Ｉｎ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９９９参照）。この技術において、結合分子の１つに特異的な抗体に結合する全ての蛋白質は、遠心によって容易に収集することができるポリマービーズに抗体を結合体化することによって溶液から沈殿させる。結合したアッセイ成分は（特異的蛋白質分解事象、あるいは複合体における蛋白質−蛋白質相互作用を乱さないであろう当該分野でよく知られた他の技術を介して）ビーズから放出され、第二の免疫沈澱工程が行われ、このとき、対応して異なる相互作用アッセイ成分に特異的な抗体を利用する。このようにして、形成された複合体のみがビーズに結合したままであるはずである。テスト化合物の存在下および非存在下の双方における複合体形成の変動を比較することができ、かくして、バイオマーカーおよびその結合パートナーの間の相互作用を変調する化合物の能力についての情報を供することができる。
また、さらなる試料操作なくして、均一または不均一アッセイシステムにおける、バイオマーカーおよびその天然結合パートナーおよび／またはテスト化合物の間の相互作用の直接的検出のための方法は本発明の範囲内のものである。例えば、蛍光エネルギー移動の技術を利用することができる（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第４，８６８，１０３号参照）。一般には、この技術は、その発光された蛍光エネルギーが、今度は、吸収されたエネルギーにより蛍光を発することができる第二の「アクセプター」分子（例えば、バイオマーカーまたはテスト化合物）上の蛍光標識によって吸収されるような、第一の「ドナー」分子（例えば、バイオマーカーまたはテスト化合物）上へのフルオロフォア標識の付加を含む。別法として、「ドナー」蛋白質分子は、単に、トリプトファン残基の天然蛍光エネルギーを利用することができる。「アクセプター」分子標識が「ドナー」のそれと区別することができるように、異なる波長の光を発する標識が選択される。標識の間のエネルギー移動の効率は分子を分離する距離に関連するため、分子の間の空間的関係を評価することができる。結合が分子の間で起こる状況において、アッセイにおける「アクセプター」分子の蛍光発光は最大とすべきである。ＦＥＴ結合事象は、便宜には、（例えば、フルオリメーターを用いて）当該分野でよく知られた標準的フルオロメーター検出手段を介して測定することができる。予め形成された複合体中の種の１つの参画を増強し、または邪魔するテスト物質の結果、バックグラウンドのそれに対するシグナル変種の創製がもたらされる。このようにして、バイオマーカーおよびその結合パートナーの間の相互作用を変調するテスト物質を制御されたアッセイにおいて同定することができる。
もう１つの実施形態において、バイオマーカー発現のモジュレーターがある方法で同定され、そこでは、細胞を候補化合物と接触させ、細胞中のバイオマーカーに対応するｍＲＮＡまたは蛋白質の発現が測定される。候補化合物の存在下でのｍＲＮＡまたは蛋白質の発現のレベルを、候補化合物の非存在下におけるｍＲＮＡまたは蛋白質の発現のレベルと比較する。次いで、候補化合物を、この比較に基づいてバイオマーカー発現のモジュレーターとして同定することができる。例えば、バイオマーカーｍＲＮＡまたは蛋白質の発現がその不存在におけるよりも候補化合物の存在下で大きい（統計学的に有意に大きい）場合、候補化合物はバイオマーカーｍＲＮＡまたは蛋白質発現のスティミュレーターとして同定される。逆に、バイオマーカーｍＲＮＡまたは蛋白質の発現がその不存在におけるよりも候補化合物の存在下で小さい（統計学的に有意に小さい）場合、候補化合物はバイオマーカーｍＲＮＡまたは蛋白質発現の阻害剤として同定される。細胞におけるバイオマーカーｍＲＮＡまたは蛋白質発現のレベルは、バイオマーカーｍＲＮＡまたは蛋白質を検出するための本明細書中に記載された方法によって測定することができる。
もう１つの態様において、本発明は、本明細書中に記載されたアッセイの２以上の組合せに関する。例えば、変調剤は、細胞−ベースの、または無細胞アッセイを用いて同定することができ、バイオマーカー蛋白質の活性を変調する剤の能力は、さらに、例えば、本明細書中に記載したもののような、癌、細胞形質転換および／または腫瘍形成のための全動物モデルにおいて、イン・ビボにてさらに確認することができる。癌のさらなる動物ベースのモデルは当該分野でよく知られており（Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ， Ｈｉａｉ， Ｈ ａｎｄ Ｈｉｎｏ， Ｏ（編） １９９９，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ．３５；Ｃｌａｒｋｅ ＡＲ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（２０００） ２１：４３５−４１）、例えば、カルシノーゲン−誘導腫瘍（Ｒｉｔｈｉｄｅｃｈ， Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ （１９９９） ４２８：３３−３９；Ｍｉｌｌｅｒ， ＭＬ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｏｌ Ｍｕｔａｇｅｎ（２０００）３５：３１９−３２７）、腫瘍細胞の動物への注射および／または移植、ならびに成長調節遺伝子、例えば、癌遺伝子（例えば、ｒａｓ）（Ａｒｂｅｉｔ， ＪＭ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ （１９９３） １４２：１１８７−１１９７；Ｓｉｎｎ， Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（１９８７）４９：４６５−４７５；Ｔｈｏｒｇｅｉｒｓｓｏｎ， ＳＳ ｅｔ ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｌｅｔｔ （２０００）１１２−１１３：５５３−５５５）および腫瘍サプレッサー遺伝子（例えば、ｐ５３）（Ｖｏｏｉｊｓ， Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９９） １８：５２９３−５３０３；Ｃｌａｒｋ ＡＲ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔ Ｒｅｖ （１９９５） １４：１２５−１４８；Ｋｕｍａｒ， ＴＲ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ （１９９５） ２３８：２３３−２３８；Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ， ＬＡ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｎａｔｕｒｅ ３５６２１５−２２１）において突然変異を担う動物を含む。さらに、実験モデルシステムは、例えば、卵巣癌（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＴＣ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ（１９８４） １１：２８５−２９８；Ｒａｈｍａｎ， ＮＡ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９９８）１４５：１６７−１７４；Ｂｅａｍｅｒ， ＷＧ ｅｔ ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ（１９９８）２６：７０４−７１０）、胃癌（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ（２０００） ８６：８６３−８６９；Ｆｏｄｄｅ， Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ（１９９９） ８６：１０５−１１１）、乳癌（Ｌｉ， Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０００） １９：１０１０−１０１９；Ｇｒｅｅｎ， ＪＥ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０００） １９：１０２０−１０２７）、メラノーマ（Ｓａｔｙａｍｏｏｒｔｈｙ， Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔ Ｒｅｖ （１９９９） １８：４０１−４０５）、および前立腺癌（Ｓｈｉｒａｉ， Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ （２０００） ４６２：２１９−２２６；Ｂｏｓｔｗｉｃｋ， ＤＧ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ（２０００） ４３：２８６−２９４）の研究で利用できる。例えば、Ｃｈｉｎ Ｌ．ｅｔ ａｌ（１９９９） Ｎａｔｕｒｅ ４００（６７４３）：４６８−７２に記載された動物モデルを本発明の方法で用いることもできる。
本発明は、さらに、前記したスクリーニングアッセイによって同定される新規な剤に関する。従って、適当な動物モデルにおいて本明細書中で記載したように同定された剤をさらに用いることは本発明の範囲内のものである。例えば、本明細書中に記載したように同定された剤（例えば、バイオマーカー変調剤、低分子、アンチセンスバイオマーカー核酸分子、リボザイム、バイオマーカー−特異的抗体、そのフラグメント、バイオマーカー蛋白質、バイオマーカー核酸分子、ＲＮＡ干渉因子、例えば、本発明のバイオマーカーを標的化するｓｉＲＮＡ分子、またはバイオマーカー−結合パートナー）を動物モデルで用いて、そのような剤での処理の効率、毒性、または副作用を測定することができる。別法として、本明細書中に記載したように同定された剤を動物モデルで用いて、そのような剤の作用機序を決定することができる。さらに、本発明は、本明細書中で記載された処置のための前記スクリーニングアッセイによって同定された新規な剤の使用に関する。１つの実施形態において、本発明は、治療が起こるように、膵臓癌、例えば、膵臓腺癌のモジュレーターとして同定された化合物を被験体に投与することを含む膵臓癌を有する被験体を治療する方法をその要旨とする。
ＩＩＩ．使用の方法
本発明の組成物、キットおよび方法はとりわけ以下の使用を有する：
１）被験体が癌、膵臓腺癌に悩んでいるか否かの評価；
２）ヒト被験体における癌、例えば、膵臓腺癌の段階の評価；
３）被験体における癌、例えば、膵臓腺癌のグレードの評価；
４）被験体における癌、例えば、膵臓腺癌の良性または悪性の性質の評価；
５）被験体における癌、例えば、膵臓腺癌の転移性能力の評価；
６）被験体における癌、例えば、膵臓腺癌に関連する新生物の組織学的タイプの評価；
７）癌、例えば、膵臓腺癌を治療するのに有用な抗体、抗体フラグメント、または抗体誘導体の作成、および／または被験体が癌に悩んでいるか否かの評価；
８）癌、例えば、膵臓腺癌、細胞の存在の評価；
９）被験体における癌、例えば、膵臓腺癌を阻害するための１以上のテスト化合物の効率の評価；
１０）被験体における癌、例えば、膵臓腺癌を阻害するための療法の効率の評価；
１１）被験体における癌、例えば、膵臓腺癌の進行のモニタリング；
１２）被験体における癌、例えば、膵臓腺癌を阻害する組成物または療法の選択；
１３）癌、例えば、膵臓腺癌に悩む被験体の治療；
１４）被験体における癌、例えば、膵臓腺癌の阻害；
１５）テスト化合物の癌腫形成能力の評価；
１６）癌を発症する危険性がある被験体における癌、例えば、膵臓腺癌の開始の予防；
１７）膵臓腺癌における特異的突然変異の存在または特異的シグナリング経路の活性化の評価；および
１８）膵臓腺癌における特異的シグナリング経路に標的化された治療剤のインパクトの測定。
本発明は、正常な（すなわち、非−癌性）膵臓細胞におけるバイオマーカーのその量および／または活性と比較した、膵臓癌細胞において変調されるバイオマーカーを同定する方法を提供する。試料、例えば、血液、例えば、血清、尿、糞、胆汁、膵臓細胞または膵液を含有する試料中のこれらのバイオマーカーの１以上の変調された量および／または活性は、ここに、組織の癌性状態と相関する。本発明は、膵臓細胞（例えば、非−ヒト培養非−ヒト細胞、およびイン・ビボ細胞から得られた細胞）の癌性状態を評価し、ならびに膵臓腺癌に悩む被験体を治療するための組成物、キットおよび方法を提供する。
本発明は、かくして、被験体が癌に悩んでいるか、または癌を発症する危険性があるかを評価する方法を含む。この方法は、被験体試料中のバイオマーカーの、突然変異、例えば、バイオマーカーの活性に影響する突然変異（例えば、置換、欠失、または付加突然変異）の量、構造、および／または活性、例えば、突然変異の存在、不存在、コピー数、発現レベル、蛋白質レベル、蛋白質活性、存在、および／またはメチル化状態を正常なレベルで比較することを含む。被験体試料中のバイオマーカーの量、構造、または活性、および正常なレベルの間の有意な差は、患者が癌に悩んでいることを示す。本発明は、癌試料におけるＭＣＲ内のバイオマーカーの発現のレベル、またはＭＣＲのコピー数を、正常な対照試料におけるＭＣＲ内のバイオマーカーの発現のレベルまたはＭＣＲのコピー数と比較することによって、被験体が癌に悩んでいるか、または癌を発症する危険性があるかを評価する方法も提供する。被験体試料におけるＭＣＲ内のバイオマーカーの発現のレベルまたはＭＣＲのコピー数の間の有意な差は、被験体が癌に悩んでいる指標である。ＭＣＲは表２に列挙されたものよりなる群から選択される。
本明細書中に記載されたように同定されたいずれかのバイオマーカーまたはバイオマーカーの組合せ、または表２に列挙されたいずれかのＭＣＲまたはＭＣＲの組合せは、本発明の組成物、キットおよび方法で用いることができる。一般に、癌細胞におけるバイオマーカーまたはＭＣＲの量、例えば、発現のレベルまたはコピー数および／または活性と、正常な細胞における同一バイオマーカーの量、例えば、発現のレベルまたはコピー数、および／または活性との間の差ができる限り大きいバイオマーカーを用いるのが好ましい。この差はバイオマーカーの量および／または活性を評価するための方法の検出をできる限り小さく制限できるが、該差は評価方法の標準誤差よりも少なくとも大きく、好ましくは正常な組織における同一バイオマーカーの量、例えば、発現のレベルまたはコピー数、および／または活性よりも少なくとも２−、３−、４−、５−、６−、７−、８−、９−、１０−、１５−、２０−、２５−、１００−、５００−、１０００−倍以上の差であるのが好ましい。
本発明のバイオマーカーの１以上を用いてさらなる被験体試料をルーチン的にスクリーニングすることによって、ある種のバイオマーカーは、具体的膵臓癌、例えば、膵臓腺癌、ならびにその例が限定されるものではないが、メラノーマ、乳癌、気管支癌、結直腸癌、前立腺癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、頸癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、単管癌、小腸または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉種、軟骨肉腫、血液学的組織の癌などを含む他の癌を含めた種々のタイプの癌において変化した量、構造および／または活性を有するのが認識されることは理解される。
例えば、本発明のバイオマーカーのいくつかは、癌、例えば、膵臓腺癌のいくらか、すなわち、１０％、２０％、３０％、または４０％、またはほとんど（すなわち、５０％以上）、または事実的に全て（すなわち、８０％以上）において変化した量、構造および／または活性を有することが確認されるであろう。さらに、本発明のバイオマーカーのあるものは種々の組織学的サブタイプの癌に関連付けられることが確認されるであろう。
加えて、本発明のバイオマーカーの変化した量、構造および／または活性、またはＭＣＲの変化した発現またはコピー数につき非常に多数の対照試料が評価され、試料がそれから得られた個々の被験体の結果が相関するため、バイオマーカーは本発明のバイオマーカーのあるものの変化した量、構造および／または活性、またはＭＣＲの変化した発現またはコピー数が悪性癌と強く相関し、および本発明の他のバイオマーカーの変化した発現は両性腫瘍またはプレ悪性状態と強く相関することも確認されるであろう。かくして、本発明の組成物、キット、および方法は、被験体における癌の段階、グレード、組織学的タイプ、および良性／プレ悪性／悪性性質の１以上を特徴付けるのに有用である。
本発明の組成物、キットおよび方法を、被験体において癌の段階、グレード、組織学的タイプ、および良性／プレ悪性／悪性性質の１以上を特徴付けるのに用いる場合、本発明のバイオマーカーまたはＭＣＲ、またはバイオマーカーまたはＭＣＲのパネルは、陽性の結果が、対応する段階、グレード、組織学的タイプ、または良性／プレ悪性／悪性性質の、癌に悩む被験体の少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約４０％、６０％、または８０％、より好ましくは実質的全てにおいて得られるように選択されるのが好ましい。好ましくは、本発明のバイオマーカーまたはバイオマーカーのパネルは、約１０％よりも大きなＰＰＶ（陽性予測値）が（より好ましくは、９９．５％よりも大きなアッセイ特異性とカップリングされて）一般的集団で得られるように選択される。
本発明の複数のバイオマーカーまたはＭＣＲが本発明の組成物、キット、および方法で用いられる場合、各バイオマーカーの量、構造および／または活性、または発現のレベルまたはコピー数を、単一の反応混合物（すなわち、各バイオマーカーにつき異なる蛍光プローブのような試薬を用いる）またはバイオマーカーまたはＭＣＲの１以上に対応する個々の反応混合物のいずれかにおいて、同一タイプの非−癌性試料における複数のバイオマーカーの各々の正常な量、構造および／または活性、または発現のレベルまたはコピー数と比較することができる。
１つの実施形態において、対応する正常なレベルに対して、試料中の複数のバイオマーカーのうち１を超えたものの有意に変化した量、構造および／または活性、またはＭＣＲの１以上の有意に変化したコピー数は、被験体が癌に悩んでいることの指標である。例えば、対応する正常なレベルまたはコピー数に対する、複数のバイオマーカーまたはＭＣＲの各々の試料中の有意に低いコピー数は、被験体が癌に悩んでいることの指標である。さらにもう１つの実施形態において、対応する正常なレベルに対する試料中の１以上のバイオマーカーまたはＭＣＲの有意に増強されたコピー数、および１以上のバイオマーカーまたはＭＣＲの有意により低いレベルの発現またはコピー数は、被験体が癌に悩んでいることの指標である。また、例えば、対応する正常なコピー数に対する、複数のバイオマーカーまたはＭＣＲの各々の試料中での有意に増強されたコピー数は、被験体が癌に悩んでいる指標である。なおもう１つの実施形態において、対応する正常レベルに対する、試料中の１以上のバイオマーカーまたはＭＣＲの有意に増強されたコピー数、および１以上のバイオマーカーまたはＭＣＲの有意に低いコピー数は被験体が癌に悩んでいる指標である。
複数のバイオマーカーまたはＭＣＲを用いる場合、２、３、４、５、８、１０、１２、１５、２０、３０または５０以上の個々のバイオマーカーまたはＭＣＲを用い、または同定するのが好ましく、ここに、より少数のバイオマーカーまたはＭＣＲが好ましい。
少数のバイオマーカーのみが、例えば、膵臓腺癌と関連付けられることが知られている（例えば、ｐ１６ＩＮＫ４ＡおよびＴＰ５３腫瘍サプレッサーおよびＭＹＣ、ＫＲＡＳ２およびＡＫＴ２癌遺伝子）。これらのバイオマーカー、または癌の他のタイプと関連付けられることが知られている他のバイオマーカーを、例えば、バイオマーカーのパネルにおいて、本発明の１以上のバイオマーカーと一緒に用いることができる。加えて、頻繁な利得が膵臓癌において３ｑ、５ｐ、７ｐ、８ｑ、１１ｑ、１２ｐ、１７ｑおよび２０ｑにマッピングされており、喪失は３ｐ、４ｑ、６ｑ、８ｐ、９ｐ、１０ｑ、１２ｑ、１３ｑ、１７ｐ、１８ｑおよび２１ｑおよび２２ｑにマッピングされている。いくつかの場合において、これらの遺伝子内に存在する確証された癌遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子が同定されており、ＭＹＣ（８ｑ２４）、ｐ１６ＩＮＫ４Ａ（９ｐ２１）、ｐ５３（１７ｐ１３）、ＳＭＡＤ４（１８ｑ２１）およびＡＫＴ２（１９ｑ１３）を含む。癌遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子、成長因子−様遺伝子、プロテアーゼ−様遺伝子、および蛋白質キナーゼ−様遺伝子のようなあるタイプの遺伝子は、しばしば、種々のタイプの癌の発生に関係することはよく知られている。かくして、本発明のバイオマーカーの中で、公知の癌遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子によってコードされる公知の蛋白質に似た蛋白質に対応するもの、および成長因子、プロテアーゼ、および蛋白質キナーゼに似た蛋白質に対応するものの使用が好ましい。
本発明の組成物、キットおよび方法は、癌を発症する増大した危険性を有する被験体、およびそれらの医療アドバイザーに対して特に有用であろうことは認識される。癌を発症する増大した危険性を有すると認められた被験体は、例えば、癌の家族性履歴を有する被験体、突然変異体癌遺伝子（すなわち、少なくとも１つの対立遺伝子）を有すると同定された被験体、および進行する年齢の被験体を含む。
正常な（すなわち、非−癌性）ヒト組織におけるバイオマーカーの変化、例えば、コピー数、量、構造および／または活性は、種々の方法で評価することができる。１つの実施形態において、発現またはコピー数のレベルは、非−癌性であるように見える細胞の一部においてバイオマーカーまたはＭＣＲの発現のレベルおよび／またはコピー数を評価することによって、および癌性であることが疑われる細胞の一部において発現のレベルまたはコピー数とこの正常な発現のレベルまたはコピー数とを比較することによって評価される。例えば、腹腔鏡検査または他の医療手法が器官の一部で腫瘍の存在を明らかにする場合、バイオマーカーまたはＭＣＲの正常な発現レベルまたはコピー数は、器官の非−患部を用いて評価することができ、この正常な発現のレベルまたはコピー数は、器官の患部（すなわち、腫瘍）における同一バイオマーカーの発現のレベルまたはコピー数と比較することができる。別法として、かつ特に、さらなる情報が、本明細書中に記載された方法のルーチン的実行の結果として利用可能となるため、本発明のバイオマーカーまたはＭＣＲの「正常な」コピー数、量、構造および／または活性についての集団−平均値を用いることができる。他の実施形態において、バイオマーカーまたはＭＣＲの「正常な」コピー数、量、構造および／または活性は、非−癌−罹患被験体から得られた被験体試料において、被験体における癌の疑われる開始前の被験体から得られた被験体試料からの、編纂された被験体試料からの、バイオマーカーまたはＭＣＲのコピー数、量、構造および／または活性を評価することによって決定することができる。
本発明は、試料（例えば、編纂された組織試料、または被験体から得られた試料）において癌細胞の存在を評価するための組成物、キットおよび方法を含む。これらの組成物、キットおよび方法は、必要であれば、組成物、キットおよび方法をあるタイプの試料で用いるために適合させる以外は、前記したのと実質的に同一である。例えば、試料がパラフィン化された編纂されたヒト組織試料である場合、本発明の組成物において、本発明のキットにおいて、または用いる方法において、化合物の比率を調整する必要があろう。そのような方法は当該分野でよく知られており、当業者の技量内のものである。
本発明は、かくして、（例えば、被験体試料のような試料中の）癌細胞の存在を評価するためのキットを含む。該キットは、例えば、本発明のバイオマーカーまたはＭＣＲに対応する核酸またはポリペプチドと特異的に結合する本発明のバイオマーカーまたはＭＣＲを同定することができる１以上の試薬を含むことができる。本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドと結合するための適当な試薬は抗体、抗体誘導体、抗体フラグメントなどを含む。核酸（例えば、ゲノミックＤＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライシングされたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）と結合するための適当な試薬は相補性核酸を含む。例えば、核酸試薬は基材に固定された（標識されたまたは標識されていない）オリゴヌクレオチド、基材に結合していない標識されたオリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマーの対、分子ビーコンプローブなどを含むことができる。
本発明のキットは、所望により、本発明の方法を実行するのに有用なさらなる成分を含むことができる。その例として、キットは相補的核酸にアニールするのに、またはそれが特異的に結合する蛋白質で抗体に結合するのに適した流体（例えば、ＳＳＣ緩衝液）、１以上の試料区画、本発明の方法の実行を記載する指令資料、正常な細胞の試料、癌細胞の試料などを含むことができる。
本発明のキットは、バイオマーカーの蛋白質レベルまたは蛋白質活性を測定するのに有用な試薬を含むことができる。もう１つの実施形態において、本発明のキットはバイオマーカーのメチル化状態を測定するための試薬を含むことができるか、あるいはバイオマーカーの構造の変化、例えば、突然変異の存在を測定するための試薬を含むことができる。
また、本発明は、本発明の方法およびキットで有用な抗体を生産する単離されたハイブリドーマの製法も含む。本発明のバイオマーカーに対応する蛋白質は（例えば、その中でそれが発現する細胞からの精製によって、または公知の方法を用いるイン・ビボまたはイン・ビトロでの蛋白質をコードする核酸の転写および翻訳によって）単離することができ、脊椎動物、好ましくはマウス、ラット、ウサギまたはヒツジのような哺乳動物を単離された蛋白質を用いて免疫化する。脊椎動物は、該脊椎動物が蛋白質に対して頑強な免疫応答を呈するように、所望により（かつ好ましくは）単離された蛋白質で少なくともさらに１回免疫化することもできる。脾臓細胞は免疫化された脊椎動物から単離し、不滅化細胞系と融合させて、当該分野でよく知られた種々の方法のいずれかを用いてハイブリドーマを形成する。次いで、このようにして形成されたハイブリドーマを標準的な方法を用いてスクリーニングして、蛋白質に特異的に結合する抗体を生じる１以上のハイブリドーマを同定する。また、本発明はこの方法によって作成されたハイブリドーマおよびそのようなハイブリドーマを用いて作成された抗体も含む。
また、本発明は、癌細胞を阻害するテスト化合物の効率を評価する方法も含む。前記したように、本発明のバイオマーカーの量、構造および／または活性、または本発明のＭＣＲの発現のレベル、またはコピー数の差は、細胞の癌性状態と相関する。本発明のバイオマーカーのあるものの量、例えば、発現またはコピー数、構造および／または活性、あるいはＭＣＲの発現またはコピー数のレベルの変化は、細胞の癌性状態に由来する量であることは認識されるが、該量の変化は癌性状態を誘導し、維持し、および促進し得ることが同様に認識される。かくして、被験体において癌を阻害する化合物は変化、例えば、そのバイオマーカーについての正常なレベル（例えば、非−癌性細胞におけるバイオマーカーについての量、例えば、発現、および／または活性）により近いレベルに対する本発明のバイオマーカーの１以上の発現および／または活性の変化を引き起こし得る。
この方法は、かくして、第一の細胞試料における、テスト化合物の存在下で維持されたバイオマーカーの量、例えば、発現、および／または活性を、第二の細胞試料における、かつテスト化合物の不存在したにおいて維持されたバイオマーカーの量、例えば、発現、および／または活性と比較することを含む。バイオマーカー、例えば、癌において減少することが示されたバイオマーカーの量、例えば、発現、および／または活性の有意な増加、バイオマーカー、例えば、癌において増加することが示されたバイオマーカーの量、例えば、発現、および／または活性の有意な減少は、テスト化合物が癌を阻害する指標である。細胞試料は、例えば、被験体から得られた正常な細胞の単一試料のアリコート、被験体から得られた正常な細胞のプールされた試料、正常な細胞系の細胞、癌の単一試料のアリコート、被験体から得られた細胞、癌のプールされた試料、被験体から得られた細胞、癌細胞系の細胞、癌の動物モデルからの細胞などであり得る。１つの実施形態において、試料は被験体から得られた癌細胞であって、種々の癌を阻害するのに効果的であることが知られている複数の化合物をテストして、被験体において癌を最良に阻害するようである化合物を同定する。
この方法を同様に用いて、療法、例えば、化学療法、放射線療法、外科的処置、または被験体においた癌を阻害するようないずれかの他の治療的アプローチの効率を評価することができる。この方法においては、試料の対（１つは療法に付され、他方は療法に付されない）における本発明の１以上のバイオマーカーの量、例えば、発現、および／または活性を評価する。テスト化合物の効率を評価する方法に関しては、もし療法がバイオマーカー、例えば、癌において増加することが示されているバイオマーカーの量、例えば、発現、および／または活性の有意な減少を誘導し、バイオマーカー、例えば、癌において増加することが示されているバイオマーカーの誘導をブロックするならば、あるいはもし療法がバイオマーカー、例えば、癌で減少することが示されているバイオマーカーの量、例えば、発現、および／または活性の有意な増強を誘導するならば、該療法は癌を阻害するのに効果的である。前記したように、もし選択された被験体からの試料をこの方法で用いるならば、別の療法をイン・ビトロで評価して、被験体において癌を阻害するのに効果的であるように最も見える療法を選択することができる。
この方法を同様に用いて、被験体において癌の進行をモニターすることができ、ここに、もし被験体における試料がバイオマーカー、例えば、癌において増大することが示されているバイオマーカーの量、例えば、発現、および／または活性の有意な減少を有し、またはバイオマーカー、例えば、癌において増大することが示されているバイオマーカーの誘導、または癌の進行の間に、例えば、第一の時点においておよびその後の時点においてバイオマーカー、例えば、癌で減少することが示されているバイオマーカーの量、例えば、発現、および／または活性の有意な増強をブロックするならば、癌は改善されている。なおもう１つの実施形態において、第一の時点およびその後の時点の間に、被験体は治療、例えば、化学療法、放射線療法、外科的処置、癌を阻害するのに有用であるいずれかの他の治療的アプローチを受けており、完全な治療を完了しており、あるいは緩解している。
本明細書中に記載するように、被験体における癌は、癌において増大することが示されている１以上のバイオマーカーの量、例えば、発現、および／または活性の増加、および／または癌において減少することが示されている１以上のバイオマーカーの量、例えば、発現、および／または活性の減少に関連付けられる。前記したように、量、例えば、発現、および／または活性数のこれらの変化のいくつかが癌の発生に由来するが、これらの変化の他のものは癌細胞の癌性状態を誘導し、維持し、および促進する。かくして、１以上のバイオマーカー、例えば、癌で増加することが示されているバイオマーカーの量、例えば、発現、および／または活性の増加によって特徴付けられる癌は、それらのバイオマーカーの量、例えば、発現、および／または活性を阻害することによって阻害することができる。同様に、１以上のバイオマーカー、例えば、癌で減少することが示されているバイオマーカーの量、例えば、発現、および／または活性の減少によって特徴付けられる癌は、これらのバイオマーカーの量、例えば、発現、および／または活性を増強させることによって阻害することができる。
バイオマーカー、例えば、癌で増加することが示されているバイオマーカーの量および／または活性は当該分野で一般的に知られた多数の方法で阻害することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを癌細胞に供して、バイオマーカーの転写、翻訳、または双方を阻害することができる。バイオマーカー、例えば、癌で増加することが示されているバイオマーカーに標的化される、ＲＮＡ干渉因子、例えば、ｓｉＲＮＡ分子を癌細胞に供して、例えば、標的バイオマーカーのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解または特異的転写後遺伝子スプライシング（ＰＴＧＳ）を介して標的バイオマーカーの発現を阻害することができる。別法として、抗体、抗体誘導体、または抗体フラグメント、例えば、抗原に結合することができるフラグメントをコードし、かつ適当なプロモーターまたはレギュレーター領域に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを細胞に供して、バイオマーカーに対応する蛋白質の機能、量、および／または活性を阻害するであろう細胞内抗体を生じさせることができる。結合体化された抗体またはそのフラグメント、例えば、化学標識された抗体、放射性標識抗体、または本発明のバイオマーカーを標的とするイムノトキシンを投与して、癌を治療し、予防しまたは阻害することもできる。
また、低分子を用いて、バイオマーカー、例えば、癌で増大することが示されているバイオマーカーの発現および／または活性を変調し、例えば、阻害することもできる。１つの実施形態において、低分子は本発明のバイオマーカーおよび標的分子またはリガンドの間の蛋白質−蛋白質相互作用を破壊し、それにより、バイオマーカーの活性を変調し、例えば、増加させまたは減少させるように機能する。
本明細書中に記載された方法を用い、特に、細胞膜を横切ることができるのに十分に小さい分子を含めた種々の分子をスクリーニングして、バイオマーカーの量および／または活性を阻害する分子を同定することができる。そのように同定された化合物を被験体に供して、被験体の癌細胞におけるバイオマーカーの量および／または活性を阻害することができる。
バイオマーカー、例えば、癌で減少することが示されているバイオマーカーの量および／または活性は、当該分野で一般的に知られた多数の方法で増強させることができる。例えば、バイオマーカーをコードし、かつ適当なプロモーター／レギュレーター領域に操作可能に連結されたポリヌクレオチドを被験体の細胞に供して、その中のバイオマーカーに対応する蛋白質（およびｍＲＮＡ）の増強された発現および／または活性を誘導することができる。別法として、もし蛋白質が細胞膜を横切り、それ自体を細胞膜に挿入することができるか、または正常に分泌された蛋白質であるならば、蛋白質の量および／または活性は被験体における癌細胞に蛋白質を（例えば、直接的にまたは血流によって）供することによって増強することができる。また、低分子を用いて、バイオマーカー、例えば、癌で減少することが示されているバイオマーカーの発現または活性を変調、例えば、増加させることもできる。さらに、もう１つの実施形態において、本発明のバイオマーカーのモジュレーター、例えば、低分子を用いて、例えば、サイレントとされた遺伝子、例えば、腫瘍サプレッサーを再度発現させて、癌を治療または予防することができる。例えば、そのようなモジュレーターはＤＮＡ結合エレメントまたはメチルトランスフェラーゼと干渉することができる。
前記したように、ヒト細胞の癌性状態は本発明のバイオマーカーの量および／または活性の変化に相関する。かくして、癌で増加することが示されているバイオマーカーの１以上の増大した発現または活性、癌で減少することが示されているバイオマーカーの１以上の減少した量および／または活性を誘導する化合物は細胞癌形成を誘導することができる。また、本発明は、テスト化合物のヒト細胞癌形成能力を評価する方法も含む。この方法は、テスト化合物の存在下および非存在下でヒト細胞の別々のアリコートを維持することを含む。アリコートの各々における本発明のバイオマーカーの発現または活性を比較する。（テスト化合物の非存在下で維持されたアリコートに対する）テスト化合物の存在下で維持されたアリコートにおける、バイオマーカー、例えば、癌で増加することが示されているバイオマーカーの量および／または活性の有意な増加、またはバイオマーカー、例えば、癌で減少することが示されているバイオマーカーの量および／または活性の有意な減少は、テスト化合物がヒト細胞癌形成能力を保有する指標である。種々のテスト化合物の相対的癌形成能力は、関連バイオマーカーの量および／または活性の増強または阻害の程度を比較することによって、それに対して量および／または活性が増強され、または阻害されるバイオマーカーの数を比較することによって、あるいは双方を比較することによって評価することができる。
（ＩＶ．単離された核酸分子）
本発明の１つの態様は、本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチド、またはそのようなポリペプチドの部分をコードする核酸を含めた、本発明のバイオマーカーに対応する単離された核酸分子に関する。本発明の核酸分子は、ここに同定されたＭＣＲに存在する核酸分子を含む。本発明の単離された核酸分子は、本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸分子、およびそのような核酸分子のフラグメント、例えば、核酸分子の増幅または突然変異のためのＰＣＲプライマーとして用いられるのに適したものを含めた、本発明のバイオマーカーに対応する核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いるのに十分な核酸分子も含む。本明細書中で用いるように、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）およびヌクレオチドアナログを用いて生じさせたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含むことを意図する。核酸分子は一本鎖または二本鎖とすることができるが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
「単離された」核酸分子は、核酸分子の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。好ましくは、「単離された」核酸分子は、それから核酸分子が由来する生物のゲノミックＤＮＡにおいて核酸を天然で近接挟む（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置した配列）配列（好ましくは蛋白質−コーディング配列）を含まない。例えば、種々の実施形態において、単離された核酸分子は、それから核酸が由来する細胞のゲノミックＤＮＡにおいて核酸分子を天然で近接挟む約５ｋＢ、４ｋＢ、３ｋＢ、２ｋＢ、１ｋＢ、０．５ｋＢまたは０．１ｋＢ未満のヌクレオチド配列を含むことができる。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、組換え技術によって生産された場合に他の細胞物質または培養基を実質的に含まないようにでき、あるいは化学的に合成した場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まないようにできる。
本発明の核酸分子、例えば、表１または２に列挙されたバイオマーカーに対応する蛋白質をコードする核酸分子は、標準的な分子生物学技術、および本明細書中に記載されたデータベース記録中の配列情報を用いて単離することができる。そのような核酸配列の全てまたは一部を用い、本発明の核酸分子は、（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．編， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ，１９８９に記載されている）標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を用いて単離することができる。
本発明の核酸分子は、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノミックＤＮＡを鋳型として、および適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することができる。そのように増幅された核酸分子を適当なベクターにクローン化し、ＤＮＡ配列分析によって特徴付けることができる。さらに、本発明の核酸分子の全てまたは一部に対応するオリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成器を用いて標準的な合成技術によって調製することができる。
もう１つの好ましい実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、本発明のバイオマーカーに対応する核酸のヌクレオチド配列に、または本発明のバイオマーカーに対応する蛋白質をコードする核酸のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子を含む。与えられたヌクレオチド配列に対して相補的な核酸分子は、与えられたヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、それにより、安定なデュプレックスを形成することができる与えられたヌクレオチド配列に十分に相補的なものである。
さらに、本発明の核酸分子は核酸配列の一部のみを含むことができ、ここに、全長核酸配列は本発明のバイオマーカーを含み、あるいは本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドをコードする。そのような核酸分子は、例えば、プローブまたはプライマーとして用いることができる。該プローブ／プライマーは、典型的には、１以上の実質的に精製されたオリゴヌクレオチドとして用いられる。該オリゴヌクレオチドは、典型的には、ストリンジェントな条件下で、本発明の核酸の少なくとも約７、好ましくは約１５、より好ましくは約２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、または４００以上の連続ヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
本発明の核酸分子の配列に基づくプローブを用いて、本発明の１以上のバイオマーカーに対応する転写体またはゲノム配列を検出することができる。該プローブはそれに結合した標識基、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子を含む。そのようなプローブは、被験体からの細胞の試料中の蛋白質をコードする核酸分子のレベルを測定することによって、例えば、ｍＲＮＡレベルを検出し、または蛋白質をコードする遺伝子が突然変異されているか、または欠失されているかを決定することによるなどして、プローブを誤発現する細胞または組織を同定するための診断テストキットの一部として用いることができる。
本発明は、さらに、本発明のバイオマーカーに対応し、かくして、同一蛋白質をコードする、蛋白質をコードする核酸分子のヌクレオチド配列とは、遺伝子暗号の縮重のため、異なる核酸分子を含む。
アミノ酸配列の変化に導くＤＮＡ配列多形が集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることは当業者に認識されるであろう。そのような遺伝子多形は、天然対立遺伝子変動のため集団内の個体の間で存在することができる。対立遺伝子は、与えられた遺伝子座においてあるいは起こる遺伝子の群の１つである。加えて、（例えば、調節または分解に影響することによって）その遺伝子の総じての発現レベルに影響し得るＲＮＡ発現レベルに影響し得るＤＮＡ多形も存在し得ることは認識されよう。
本明細書中においては、「対立遺伝子変種」と相互交換的に用いられる用語「対立遺伝子」とは、遺伝子の別の形態またはその部分をいう。対立遺伝子は相同染色体上で同一の遺伝子座または位置を占める。被験体が遺伝子の２つの同一の対立遺伝子を有する場合、該被験体は遺伝子または対立遺伝子につきホモ接合性といわれる。被験体が遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を有する場合、被験体は遺伝子または対立遺伝子につきヘテロ接合性であるといわれる。特別な遺伝子の対立遺伝子は単一ヌクレオチド、またはいくつかのヌクレオチドにおいて相互に異なり得、ヌクレオチドの置換、欠失および挿入を含むことができる。また、遺伝子の対立遺伝子は１以上の突然変異を含む遺伝子の形態でもあり得る。
本明細書中で相互交換的に用いられる、用語「遺伝子の多形領域の対立遺伝子変種」または「対立遺伝子変種」とは、集団における遺伝子のその領域に見出される数個の可能なヌクレオチド配列のうちの１つを有する遺伝子の別の形態をいう。本明細書中で用いるように、対立遺伝子変種は、機能的対立遺伝子変種、非−機能的対立遺伝子変種、ＳＮＰ、突然変異および多形を含むことを意図する。
用語「単一ヌクレオチド多形」（ＳＮＰ）とは、対立遺伝子配列の間の変動の部位である単一ヌクレオチドによって占められる多形部位をいう。該部位には、通常、対立遺伝子の高度に保存された配列が先行し、およびそれに続く（例えば、集団の１／１００または１／１０００未満のメンバーで変化する配列）。ＳＮＰは、通常、多形部位におけるもう１つに代えての１つのヌクレオチドの置換のため生起する。また、ＳＮＰは、参照対立遺伝子に対して、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入から生起する。典型的には、多形部位は参照塩基以外の塩基によって占められる。例えば、参照対立遺伝子が多形部位に塩基「Ｔ」（チミジン）を含む場合、変化した対立遺伝子は多形部位に「Ｃ」（シジチン）、「Ｇ」（グアニン）、または「Ａ」（アデニン）を含むことができる。ＳＮＰは蛋白質−コーディングヌクレオチド配列で起こることができ、その場合、それは欠陥のあるまたはそうでなければ変種の蛋白質、または遺伝病を生起させ得る。そのようなＳＮＰは、遺伝子のコーディング配列を改変することができ、従って、もう１つのアミノ酸を特定することができ（「ミスセンス」ＳＮＰ）、あるいはＳＮＰは停止コドンを導入することができる（「ナンセンス」ＳＮＰ）。ＳＮＰが蛋白質のアミノ酸配列を変化させない場合、ＳＮＰは「サイレント」と呼ばれる。ＳＮＰはヌクレオチド配列の非コーディング領域にも起こり得る。この結果、例えば、別のスプライシングの結果として欠陥のある蛋白質発現が生じ、あるいはそれは蛋白質の機能に対して効果を有さなくてもよい。
本明細書中で用いるように、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」とは、本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子をいう。そのような天然対立遺伝子変動は、典型的には、与えられた遺伝子のヌクレオチド配列において１ないし５％偏差を生じ得る。別の対立遺伝子は、多数の異なる個体において注目する遺伝子を配列決定することによって同定することができる。これは、ハイブリダイゼーションプローブを用いて、種々の個体において同一遺伝子座を同定することによって容易に行うことができる。天然対立遺伝子変動の結果であり、機能的活性を変化させないいずれかのおよび全てのそのようなヌクレオチド変動および得られたアミノ酸多形または変動は本発明の範囲内にあることを意図する。
もう１つの実施形態において、本発明の単離された核酸分子は長さが少なくとも７、１５、２０、２５、３０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５５０、６５０、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３５００、４０００、４５００以上のヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下で、本発明のバイオマーカーに対応する核酸分子に、または本発明のバイオマーカーに対応する蛋白質をコードする核酸分子にハイブリダイズする。本明細書中で用いるように、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、ヌクレオチド配列の少なくとも６０％（６５％、７０％、７５％、８０％、好ましくは８５％）が相互に同一であり、典型的には、相互にハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての条件を記載することを意図する。そのようなストリンジェントな条件は当業者に知られており、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ．（１９８９）のセクション６．３．１ないし６．３．６に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的例は約４５℃における６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーション、引き続いての、５０ないし６５℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける１以上の洗浄である。
集団に存在できる本発明の核酸分子の天然に生じる対立遺伝子変種に加えて、当業者であれば、配列の変化を突然変異によって導入し、それによりコードされた蛋白質の生物学的活性を改変することなく、コードされた蛋白質のアミノ酸配列の変化に導くことができる認識するであろう。例えば、「非−必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換に導くヌクレオチド置換をなすことができる。「非−必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を改変することなく野生型配列から改変することができる残基であり、他方、「必須」アミノ酸残基は生物学的活性に必要なものである。例えば、種々の種のホモログの間で保存された、または半保存されたに過ぎないアミノ酸残基は活性につき非−必須であり得、かくして、改変に対するありそうな標的であろう。別法として、種々の種（例えば、ネズミおよびヒト）のホモログの間で保存されたアミノ酸残基は活性に対して必須であり得、かくして、改変に対して標的でありそうではない。
従って、本発明のもう１つの態様は、活性に対して必須でないアミノ酸残基の変化を含む本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に関する。そのようなポリペプチドは、本発明のバイオマーカーに対応する天然に生じる蛋白質からアミノ酸配列が異なるが、生物学的活性を保持する。１つの実施形態において、そのような蛋白質は、本発明のバイオマーカーに対応する蛋白質の１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％同一、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％同一であるアミノ酸配列を有する。
変種蛋白質をコードする単離されたアミノ酸分子は、１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を本発明の核酸のヌクレオチド配列に、１以上のアミノ酸残基の置換、付加または欠失がコードされた蛋白質に導入されるように導入することによって創製することができる。突然変異は、部位−特異的突然変異誘発およびＰＣＲ−媒介突然変異誘発のような標準的な技術によって導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は１以上の予測される非−必須アミノ酸残基においてなされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様な側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。同様な側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野において規定されてきた。これらのファミリーは塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、未荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非−極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸を含む。別法として、突然変異は、飽和突然変異誘発によるなどしてコーディング配列の全てまたは一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた突然変異体を生物学的活性につきスクリーニングして、活性を保有する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発に続き、コードされた蛋白質を組換えにより発現させることができ、蛋白質の活性を測定することができる。
本発明は、アンチセンス核酸分子、すなわち、本発明のセンス核酸に対して相補的な、例えば、本発明のバイオマーカーに対応する二本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディングストランドに対して相補的な、または本発明のバイオマーカーに対応するｍＲＮＡ配列に対して相補的な分子を含む。従って、本発明のアンチセンス核酸分子は本発明のセンス核酸に対して水素結合することができる（すなわち、それとアニールすることができる）。アンチセンス核酸は全コーディング配列に対して、またはその一部のみに対して、例えば、蛋白質コーディング配列（またはオープンリーディングフレーム）の全部または一部に対して相補的であり得る。アンチセンス核酸分子は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコーディングストランドの非−コーディング領域の全部または一部に対してアンチセンスでもあり得る。非−コーディング領域（「５’および３’非翻訳領域」）は、コーディング領域に近接しそれを挟み、アミノ酸に翻訳されない５’および３’配列である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０以上ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手法を用い、化学合成および酵素的連結反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に生じるヌクレオチド、あるいは分子の生物学的安定性を増加させるように、またはアンチセンスおよびセンス核酸の間で形成されるデュプレックスの物理的安定性を増加させるように設計された種々に修飾されたヌクレオチドを用いて化学合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸を創製するのに用いることができる修飾されたヌクレオチドの例は５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む。別法として、アンチセンス核酸は、アンチセンス向きに核酸がサブクローンされた発現ベクターを用いて生物学的に生産することができる（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下のサブセクションにさらに記載した、注目する標的核酸に対してアンチセンス向きのものであろう）。
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、被験体に投与されるか、あるいはそれが細胞ｍＲＮＡおよび／または本発明の選択されたバイオマーカーに対応するポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、またはそれに結合し、それにより、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによってバイオマーカーの発現を阻害するように、イン・サイチュで創製される。該ハイブリダイゼーションは、安定なデュプレックスを形成するような慣用的ヌクレオチド相補性によることができるか、あるいは例えば、ＤＮＡデュプレックスに結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重ラセンの主要溝における特異的相互作用を介することができる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与の経路の例は、組織部位における直接的注射、または膵臓−関連体液へのアンチセンス核酸の注入を含む。別法として、アンチセンス核酸分子は選択された細胞を標的とするように修飾し、次いで、全身投与することができる。例えば、全身投与では、アンチセンス分子は、例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによって、選択された細胞表面に発現された受容体または抗原に特異的に結合するように修飾することができる。また、アンチセンス核酸分子を、本明細書中に記載されたベクターを用いて細胞に送達することもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下に置かれるベクター構築体が好ましい。
本発明のアンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸分子であり得る。α−アノマー核酸分子は相補性ＲＮＡとで特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、そこでは、通常のα−ユニットとは対照的に、ストランドは相互に平行に走る（Ｇａｕｌｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。また、アンチセンス核酸分子は２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）を含むこともできる。
本発明はリボザイムも含む。リボザイムは、それがそれに対して相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を持つ触媒ＲＮＡ分子である。かくして、リボザイム（例えば、Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１に記載されたハンマーヘッドリボザイム）を用いて、触媒作用によりｍＲＮＡ転写体を切断して、それにより、ｍＲＮＡによってコードされた蛋白質の翻訳を阻害することができる。本発明のバイオマーカーに対応するポリヌクレオチドをコードする核酸分子に対する特異性を有するリボザイムは、バイオマーカーに対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば、テトラヒメナＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築することができ、そこでは、活性部位のヌクレオチド配列は切断されるべきヌクレオチド配列に対して相補的である（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第５，１１６，７４２号参照）。別法として、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択することができる（例えば、Ｂａｒｔｅｌ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８参照）。
また、本発明は、三重ラセン構造を形成する核酸分子を含む。例えば、本発明のポリペプチドの発現は、ポリペプチドをコードする遺伝子の調節領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化することによって阻害して、標的細胞において遺伝子の転写を妨げる三重ラセン構造を形成することができる。一般には、Ｈｅｌｅｎｅ（１９９１） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．６（６）：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ（１９９２） Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ（１９９２） Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）：８０７−１５参照。
種々の実施形態において、本発明の核酸分子は、塩基部位、糖部位またはリン酸骨格において修飾して、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解性を改良することができる。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸分子を創製することができる（Ｈｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４（１）：５−２３参照）。本明細書中で用いるように、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」とは、核酸ミミック、例えば、デオキシリボースリン酸骨格がプソイドペプチド骨格によって置き換えられ、４つの天然のヌクレオ塩基のみが保持されるＤＮＡミミックをいう。ＰＮＡの中性骨格は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能とすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ．（１９９６）， 前掲；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１４６７０−６７５に記載された標準固相ペプチド合成プロトコルを用いて行うことができる。
ＰＮＡは治療および診断適用で用いることができる。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写または翻訳阻止を誘導し、または複製を阻害することによって、遺伝子発現の配列−特異的変調のためのアンチセンスまたはアンチジーン剤として用いることができる。また、ＰＮＡは、例えば、ＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピングによって遺伝子中の単一塩基対突然変異の分析において；例えば、他の酵素と組み合わせて用いる場合に人工的制限酵素、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（Ｈｙｒｕｐ（１９９６）， 前掲として；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマー（Ｈｙｒｕｐ， １９９６， 前掲；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１４６７０−６７５）として用いることもできる。
もう１つの実施形態において、ＰＮＡを修飾して、例えば、親油性または他のヘルパー基をＰＮＡに付着させることによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソーム、あるいは当該分野で知られた薬物送達の他の技術の使用によって、それらの安定性または細胞摂取を増強させることができる。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組み合わせることができるＰＮＡ−ＤＮＡキメラを創製することができる。そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素、例えば、ＲＮＡＳＥ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ部分と相互作用するのを可能とし、他方、ＰＮＡ部分は高結合親和性および特異性を供するであろう。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、ヌクレオ塩基の間の結合の数、および向きの点で選択された適当な長さのリンカーを用いて連結することができる（Ｈｙｒｕｐ， １９９６， 前掲）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成はＨｙｒｕｐ（１９９６）、前掲、およびＦｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７−６３に記載されたように行うことができる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホルアミダイトカップリング化学および修飾されたヌクレオシドアナログを用いて固体支持体上で合成することができる。５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイトのような化合物は、ＰＮＡおよびＤＮＡの５’末端の間のリンクとして用いることができる（Ｍａｇ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：５９７３−８８）。次いで、ＰＮＡモノマーを段階的方法でカップリングさせて、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを持つキメラ分子を得る（Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７−６３）。別法として，５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを持つキメラ分子を合成することができる（Ｐｅｔｅｒｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９７５， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９−１１１２４）。
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、（例えば、イン・ビボで宿主細胞受容体を標的化する）ペプチド、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ８８／０９８１０）または血液−脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ８９／１０１３４参照）を横切る輸送を容易にする剤のような他の付属の基を含むこともできる。加えて、オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション−トリガード切断剤（例えば、Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６参照）またはインターカレーティング剤（例えば、Ｚｏｎ， １９８８， Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９参照）で修飾することができる。この目的では、オリゴヌクレオチドをもう１つの分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーショントリガード架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション−トリガード切断剤などに結合体化することができる。
また、本発明は、分子ビーコンが試料中の本発明の核酸分子の存在を定量するのに有用であるように、本発明の核酸分子に対して相補的な少なくとも１つの領域を有する分子ビーコン核酸分子も含む。「分子ビーコン」核酸は、相補的な領域の対を含み、かつフルオロフォアおよびそれに会合した蛍光クエンチャーを有する核酸分子である。フルオロフォアおよびクエンチャーは、相補的領域が相互にアニールした場合に、フルオロフォアの蛍光がクエンチャーによって消光される向きに、核酸の異なる部分と会合する。核酸分子の相補的領域が相互にアニールしない場合、フルオロフォアの蛍光は低い程度にしか消光されない。分子ビーコン核酸分子は、例えば、米国特許第５，８７６，９３０号に記載されている。
（Ｖ．単離された蛋白質および抗体）
本発明の１つの態様、本発明の個々のバイオマーカーに対応する単離された蛋白質、およびその生物学的に活性な部分、ならびに本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドに対して向けられた抗体を生起するための免疫原として用いるのに適したポリペプチドフラグメントに関する。１つの実施形態において、バイオマーカーに対応する天然ポリペプチドは、標準的な蛋白質精製技術を用いる適当な精製スキームによって細胞または組織源から単離することができる。もう１つの実施形態において、本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドは組換えＤＮＡ技術によって生産される。組換え発現の代替法として、本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドは標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成することができる。
「単離された」または「精製された」蛋白質またはその生物学的に活性な部分は、細胞物質または蛋白質が由来する細胞または組織源からの他の汚染蛋白質を実質的に含まず、または化学合成した場合には化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞物質を実施的に含まない」は、当該蛋白質がそれが単離されたまたはそれから組換えにより生産された細胞の細胞成分から分離された蛋白質の調製物を含む。かくして、細胞物質を実質的に含まない蛋白質は、（本明細書中では「汚染蛋白質」ともいう）異種蛋白質の約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量による）未満を有する蛋白質の調製物を含む。蛋白質またはその生物学的に活性な部分が組換えにより生産された場合、それは好ましくは培養基を実質的に含まず、すなわち、培養基は蛋白質調製物の約２０％、１０％、または５％の容量未満を表す。蛋白質が化学合成により生産される場合、それは好ましくは化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、すなわち、それは蛋白質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離されている。従って、蛋白質のそのような調製物は注目するポリペプチド以外の化学前駆体または化合物の約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量による）未満を有する。
本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドの生物学的に活性な部分は、全長蛋白質よりも少数のアミノ酸を含み、対応する全長蛋白質の少なくとも１つの活性を呈するバイオマーカーに対応する蛋白質のアミノ酸に十分に同一であるか、またはそれに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。典型的には、生物学的に活性な部分は、対応する蛋白質の少なくとも１つの活性を持つドメインまたはモチーフを含む。本発明の蛋白質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００以上のアミノ酸であるポリペプチドであり得る。さらに、蛋白質の他の領域が欠失された他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製し、本発明のポリペプチドの天然形態の機能的活性の１以上につき評価することができる。
好ましいポリペプチドは、本発明のバイオマーカーの核酸分子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を有する。他の有用な蛋白質はこれらの配列のうちの１つに対して実質的に同一（例えば、少なくとも約４０％、好ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％）であり、対応する天然に生じる蛋白質の蛋白質の機能的活性を保有するが、天然対立遺伝子変動または突然変異誘発のためアミノ酸配列は異なる。
２つのアミノ酸配列または２つの核酸のパーセント同一性を決定するためには、配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、第二のアミノ酸または核酸配列との最適な整列のために、ギャップを第一のアミノ酸または核酸配列の配列に導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列中の位置が第二の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、該分子はその位置において同一である。２つの配列の間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の全数（例えば、重複位置）×１００）。１つの実施形態において、２つの配列は同一の長さである。
２つの配列の間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較で利用する数学的アルゴリズムの好ましい非限定的例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７において修飾された、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに取り込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチはＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２で実行して、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴ蛋白質サーチをＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３で実行して、本発明の蛋白質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップを入れたアルゴリズムを得るためには、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されたように利用することができる。別法として、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子の間の距離の関係を検出する反復サーチを実行することができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．参照。配列の比較で利用される数学的アルゴリズムの非限定的例はＭｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ， （１９８８） Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ， ４：１１−７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に一体化される。アミノ酸配列を比較するためのＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを用いることができる。局所的配列同様性および整列の領域を同定するためのさらにもう１つの有用なアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８に記載されたＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較するためのＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いる場合、ＰＡＭ１２０重み付け残基表を、例えば、２のｋ−トゥプル（ｔｕｐｌｅ値）で用いることができる。
２つの配列の間のパーセント同一性は、ギャップを許容し、または許容することなく、前記したのと同様な技術を用いて決定することができる。パーセント同一性を計算するにおいて、正確なマッチのみをカウントする。
また、本発明は、本発明のバイオマーカーに対応するキメラまたは融合蛋白質を提供する。本明細書中で用いるように、「キメラ蛋白質」または「融合蛋白質」は、異種ポリペプチド（すなわち、バイオマーカーに対応するポリペプチド以外のポリペプチド）に操作可能に連結した本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドの全てまたは部分（好ましくは、生物学的に活性な部分）を含む。融合蛋白質内では、用語「操作可能に連結した」は、本発明のポリペプチドおよび異種ポリペプチドが相互に枠内で融合することを示すことを意図する。異種ポリペプチドは本発明のポリペプチドのアミノ−末端またはカルボキシル−末端に融合することができる。
１つの有用な蛋白質は、本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドがＧＳＴ配列のカルボキシル末端に融合したＧＳＴ融合蛋白質である。そのような融合蛋白質は、本発明の組み換えポリペプチドの精製を容易にすることができる。
もう１つの実施形態において、融合蛋白質はそのアミノ末端において異種シグナル配列を含む。例えば、本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドの天然シグナル配列を除去し、もう１つの蛋白質からのシグナル配列で置き換えることができる。例えば、バキュロウイルスエンベロープ蛋白質のｇｐ６７分泌配列を異種シグナル配列として用いることができる（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ，１９９２）。真核生物異種シグナル配列の他の例は、メリチンおよびヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼの分泌配列を含む（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。なおもう１つの例において、有用な原核生物異種シグナル配列はｐｈｏＡ分泌シグナル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， 前掲）およびプロテインＡ分泌シグナル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を含む。
なおもう１つの実施形態において、融合蛋白質は、本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドの全部または一部が免疫グロブリン蛋白質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合した免疫グロブリン融合蛋白質である。本発明の免疫グロブリン融合蛋白質は医薬組成物に取り込み、被験体に投与して、リガンド（可溶性または膜−結合）および細胞の表面の蛋白質（受容体）の間の相互作用を阻害し、それにより、イン・ビボにてシグナル変換を抑制することができる。免疫グロブリン融合蛋白質を用いて、本発明のポリペプチドの同属リガンドの生物学的利用性に影響させることができる。リガンド／受容体相互作用の阻害は、増殖性および分化障害を治療するのに、および細胞生存を変調（例えば、促進または阻害）するのにの双方において、治療的に有用であり得る。さらに、本発明の免疫グロブリン融合蛋白質を免疫原として用いて、被験体において本発明のポリペプチドに対して向けられた抗体を精製させ、リガンドを精製し、およびスクリーニングアッセイにおいて、受容体とリガンドとの相互作用を阻害する分子を同定することができる。
本発明のキメラおよび融合蛋白質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって生産することができる。もう１つの実施形態において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成器を含めた慣用的な技術によって合成することができる。別法として、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、引き続いてアニールし、再度増幅してキメラ遺伝子配列を生じさせることができる２つの連続遺伝子フラグメントの間に相補的突出を生起させるアンカープライマーを用いて行うことができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， 前掲参照）。さらに、融合部位（例えば、ＧＳＴポリペプチド）を既にコードする多くの発現ベクターが商業的に入手可能である。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、そのような発現ベクターに、融合部分が本発明のポリペプチドに枠内でリンクするようにクローン化することができる。
シグナル配列を用いて、分泌された蛋白質または注目する他の蛋白質の分泌および単離を容易にすることができる。シグナル配列は、一般には、１以上の切断事象における分泌の間に成熟蛋白質から切断される疎水性アミノ酸のコアによって典型的には特徴付けられる。そのようなシグナルペプチドは、それが分泌経路を通過するにつれて成熟蛋白質からシグナル配列の切断を可能とするプロセッシング部位を含む。かくして、本発明は、シグナル配列を有する記載されたポリペプチド、ならびにそれからシグナル配列が蛋白質分解によって切断されたポリペプチド（すなわち、切断産物）に関する。１つの実施形態において、シグナル配列をコードする核酸配列は、通常は分泌されず、またはそうでなければ単離するのが困難な蛋白質のような注目する蛋白質に対して、発現ベクター中で操作可能に連結することができる。シグナル配列は、発現ベクターがそれに形質転換される真核生物宿主からのような、蛋白質の分泌を指令し、シグナル配列は引き続いてまたは同時に切断される。次いで、蛋白質は当該分野で認められた方法によって細胞外培地から容易に精製することができる。別法として、シグナル配列は、ＧＳＴドメインのような、精製を容易にする配列を用いて注目する蛋白質に連結することができる。
また、本発明は、本発明の個々のバイオマーカーに対応するポリペプチドの変種に関する。そのような変種は、アゴニスト（ミメティックス）またはアンタゴニストとして機能することができる改変されたアミノ酸配列を有する。変種は、突然変異誘発、例えば、区別される点突然変異または切形によって生じさせることができる。アゴニストは、蛋白質の天然に生じる形態の生物学的活性と実質的に同一な活性、または該活性のサブセットを保有することができる。蛋白質のアンタゴニストは、例えば、注目する蛋白質を含む細胞シグナリングカスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合することによって、蛋白質の天然に生じる形態の１以上の活性を阻害することができる。かくして、限定された機能の変形での処理によって特別な生物学的効果を誘導することができる。蛋白質の天然に生じる形態の生物学的活性のサブセットを有する変種での被験体の処理は、蛋白質の天然に生じる形態での処理に対して被験体においてより少ない副作用を有することができる。
アゴニスト（ミメティックス）またはアンタゴニストいずれかとして機能する本発明の蛋白質の変種は、アゴニストまたはアンタゴニスト活性につき本発明の蛋白質の突然変異体、例えば、切形突然変異体のコンビナトーリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。１つの実施形態において、核酸レベルでのコンビナトーリアル突然変異誘発によって変種の変化に富んだライブラリーを創製し、これは変化に富んだ遺伝子ライブラリーによってコードされる。変種の変化に富んだライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列へ、潜在的蛋白質配列の縮重組が個々のポリペプチドとして、あるいは別法として（例えば、ファージディスプレのための）より大きな融合蛋白質の組として発現可能となるように酵素的に連結することによって生産することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から本発明のポリペプチドの潜在的変種のライブラリーを生じさせるのに用いることができる種々の方法がある。縮重オリゴヌクレオチドを合成させるための方法は当該分野で知られている（例えば、Ｎａｒａｎｇ， １９８３， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７参照）。
加えて、本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドのコーディング配列のフラグメントのライブラリーを用いて、変種のスクリーニングおよび引き続いての選択のためにポリペプチドの変化に富む集団を創製することができる。例えば、コーディング配列フラグメントのライブラリーは、注目するコーディング配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、ニッキングが分子当たり約１回のみ起こる条件下でヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性し、ＤＮＡを再生して、異なるニックド産物からのセンス／アンチセンス対を含むことができる二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理によってサイド形成されたデュプレックスから一本鎖部分を除去し、次いで、得られたフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することによって作り出すことができる。この方法によって、注目する蛋白質の種々のサイズのアミノ末端および内部フラグメントをコードする発現ベクターを誘導することができる。
点突然変異または切形によって作成されたコンビナトーリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングし、および選択された特性を有する遺伝子産物につきｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための数個の技術が当該分野で知られている。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、高スループット分析で使用することができる最も広く用いられる技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーの複製可能な発現ベクターへのクローニング、ベクターの得られたライブラリーでの適当な細胞の形質転換、および所望の活性の検出がその産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下でのコンビナトーリアル遺伝子の発現を含む。機能的アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）、ライブラリーにおける機能的突然変異体の頻度を増強するための技術をスクリーニングアッセイと組み合わせて用いて、本発明の蛋白質の変種を同定することができる（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ， １９９２， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７−３３１）。
本発明のバイオマーカーに対応する単離されたポリペプチド、またはそのフラグメントを免疫原として用いて、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準的技術を用いて抗体を作り出すことができる。全長ポリペプチドまたは蛋白質を用いることができるか、あるいは別法として、本発明は免疫原として用いられる抗原性ペプチドフラグメントを提供する。本発明の蛋白質の抗原性ペプチドは本発明のポリペプチドの１つのアミノ酸配列の少なくとも８つ（好ましくは、１０、１５、２０または３０以上）アミノ酸残基を含み、当該蛋白質が対応する本発明のバイオマーカーとで、ペプチドに対して生起された抗体が特異的免疫複合体を形成するように、蛋白質のエピトープを含む。抗原性ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、蛋白質の表面に位置する領域、例えば、親水性領域である。疎水性配列分析、親水性配列分析、または同様な分析を用いて、親水性領域を同定することができる。
免疫原は、典型的には、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物または脊椎動物のような適当な（すなわち、免疫コンピテント）被験体を免疫化することによって抗体を調製するのに用いられる。適当な免疫原性調製物は、例えば、組換えにより発現させた、または化学的に合成させたポリペプチドを含むことができる。該調製は、さらに、フロイントの完全または不完全アジュバント、または同様な免疫刺激剤のようなアジュバントを含むことができる。
従って、本発明のもう１つの態様は本発明のポリペプチドに対して向けられた抗体に関する。本明細書中において相互交換的に用いられる用語「抗体」および「抗体物質」とは、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、本発明のペプチドのような、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子をいう。本発明の与えられたポリペプチドに特異的に結合する分子は、該ポリペプチドに結合するが、ポリペプチドを天然で含有する試料、例えば、生物学的試料中の他の分子に実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例は、ペプシンのような酵素で抗体を処理することによって生じさせることができるＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む。本発明はポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書中で用いるように、用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、特定のエピトープと免疫反応できる抗原結合部位の１つの種のみを含有する抗体分子の集団をいう。
ポリクローナル抗体は、免疫原としての本発明のポリペプチドで適当な被験体を免疫化することによって前記したようにして調製することができる。免疫化された被験体における抗体力価は、免疫化されたポリペプチドを用い、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）でのような標準的技術によって経時的にモニターすることができる。所望により、抗体分子を被験体から（例えば、被験体の血液または血清から）収穫し、または単離し、プロテインＡクロマトグラフィーのようなよく知られた技術によって精製して、ＩｇＧ画分を得ることができる。免疫化後適当な時点で、例えば、特異的抗体力価が最高である場合、抗体−生産細胞を被験体から得ることができ、これを用いて、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７によって元来記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２参照）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， ｐｐ．７７−９６ Ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．，１９８５）またはトリオーマ技術のような標準的技術によってモノクローナル抗体を調製することができる。ハイブリドーマを生産するための技術はよく知られている（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．編， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４参照）。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、注目するポリペプチドに結合する抗体につきハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出される。
モノクローナル抗体−分泌ハイブリドーマを調製するための代替法として、注目するポリペプチドで組換えコンビナトーリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることによって、本発明のポリペプチドに向けられたモノクローナル抗体を同定し、単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを作成し、スクリーニングするためのキットは商業的に入手可能である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ， カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｋｉｔ， カタログ番号２４０６１２）。加えて、抗体ディスプレイライブラリーの作成およびスクリーニングで用いるのに特に適用できる方法および試薬の例は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９２／１８６１９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９１／１７２７１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９２／２０７９１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９２／１５６７９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９３／０１２８８；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９２／０１０４７；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９２／０９６９０；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３） ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４に見出すことができる。
加えて、標準組み換えＤＮＡ技術を用いて作成することができる、ヒトおよび非−ヒト部分を共に含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体の組換え抗体は本発明の範囲内のものである。そのようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ８７／０２６７１；欧州特許出願１８４，１８７；欧州特許出願１７１，４９６；欧州特許出願１７３，４９４；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記載された方法を用いて当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術によって生じさせることができる。
完全にヒトの抗体はヒト被験体の治療的処置で特に望ましい。そのような抗体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて生産することができる。トランスジェニックマウスは選択された抗原、例えば、本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドの全てまたは部分で通常に免疫化される。抗原に対して向けられたモノクローナル抗体は、慣用的なハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスによって保有されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子はＢ細胞分化の間に再編成され、引き続いて、クラススイッチング体細胞突然変異を受ける。かくして、そのような技術を用い、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体を生産することが可能である。ヒト抗体を生産するためのこの技術の概観については、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ（１９９５） Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのこの技術、およびそのような抗体を生産するためのプロトコルの詳細な議論については、例えば、米国特許第５，６２５，１２６号；米国特許第５，６３３，４２５号；米国特許第５，５６９，８２５号；米国特許第５，６６１，０１６号；および米国特許第５，５４５，８０６号参照。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ， Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ， ＣＡ）のような会社が、前記したのと同様な技術を用いて選択された抗原に対して向けられたヒト抗体を提供するのに従事することができる。
選択されたエピトープを認識する完全にヒトの抗体は、「ガイデッド選択」といわれる技術を用いて作成することができる。このアプローチにおいては、選択された非−ヒトモノクローナル抗体、例えば、ネズミ抗体を用いて、同一エピトープを認識する完全にヒト抗体の選択をガイドする（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３）。
癌で過剰発現される本発明のバイオマーカーに特異的に結合する、抗体、抗体誘導体、またはそのフラグメントを用いて、バイオマーカーの活性を阻害することができ、従って、被験体に投与して、該被験体における癌を治療し、阻害し、または予防することができる。さらに、結合体化抗体を用いて、被験体における癌を治療し、阻害し、または予防することもできる。結合体化抗体、好ましくはモノクローナル抗体、またはそのフラグメントは、薬物、トキシン、放射性原子に接合された抗体であり、これは、癌細胞に直接的にそれらの物質を送達するために送達ビークルとして用いられる。抗体、例えば、本発明のバイオマーカー（例えば、表２に列挙されたバイオマーカー）に特異的に結合する抗体を被験体に投与し、バイオマーカーに結合させ、それにより、毒性物質を癌細胞に送達し、身体の他の部分における正常な細胞への損傷を最小化する。
結合体化抗体は「タグド」、「標識された」または「負荷された」ともいわれる。化学療法剤が付着された抗体は、一般には、化学標識されたという。化学療法剤の例はタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミタラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロパノロロール、およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログを含む。治療剤は、限定されるものではないが、抗代謝産物（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロモスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ビスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗−有糸***剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）を含む。
放射性粒子が付着された抗体は放射性標識されたといい、このタイプのライブラリーは放射性免疫療法（ＲＩＴ）として知られている。癌を治療するのに用いられるかは別として、放射性標識抗体を用いて身体中の癌の拡大の領域を検出することもできる。トキシンに付着された抗体はイムノトキシンと呼ばれる。
イムノトキシンはトキシン（例えば、植物または細菌からの毒性物質）をモノクローナル抗体に付着させることによって作成される。イムノトキシンは、リボソーム−結合蛋白質（その開示をここに引用してその全体を援用するＢｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第６，１４６，６３１号参照）、アブリン、リシンＡ、シュードモナスエキソトキシン、またはジフテリアトキシンのような細菌トキシン；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲンアクチベータのような蛋白質；または例えば、リンホカイン、インターフェロン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）のような生物反応修飾物質、または他の成長因子、ジフテリアトキシン（ＤＴ）またはシュードモナスエキソトキシン（ＰＥ４０）に、またはリシンＡまたはサポリンのような植物トキシンに付着させることによって生じさせることができる。
本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドに対して向けられた抗体（例えば、モノクローナル抗体）を用いて、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈澱のような標準的な技術によってポリペプチドを単離することができる。さらに、そのような抗体を用いて、（例えば、細胞溶解物または細胞上清中で）バイオマーカーを検出して、バイオマーカーの発現のレベルおよびパターンを評価することができる。また、抗体を診断に用いて、臨床試験手法の一部として（例えば、胆汁のような膵臓−関連体液中で）組織または体液中の蛋白質レベルをモニターして、例えば、与えられた治療レジメンの効率を決定することもできる。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリングさせることによって促進することができる。検出可能な物質の例は種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、ルミネッセント物質、バイオルミネッセント物質、および放射性物質を含む。適当な酵素の例はホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み；適当な補欠分子族複合体の例はストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み；適当な蛍光物質の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンを含み；ルミネッセント物質の例はルミノールを含み；バイオルミネッセント物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびアクオリンを含み、および適当な放射性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを含む。
（ＶＩ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明のもう１つの態様は、本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチド（またはそのようなポリペプチドの部分）をコードする核酸分子を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書中で用いるように、用語「ベクター」は、それが連結していたもう１つの核酸を輸送することができる核酸分子をいう。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターのもう１つのタイプはウイルスベクターであり、そこでは、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。ある種のベクターは、それが導入される宿主細胞中で自律複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非−エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムに沿って複製される。さらに、ある種のベクター、すなわち発現ベクターは、それが操作可能に連結された遺伝子の発現を指令することができる。一般には、組換えＤＮＡ技術で利用される発現ベクターは、しばしば、プラスミド（ベクター）の形態である。しかしながら、本発明は、同等な機能を発揮する、ウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ−関連ウイルス）のような発現ベクターのそのような他の形態を含むことを意図する。
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に適した形態の本発明の核酸を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現すべき核酸配列に操作可能に連結された、発現で用いられるべき宿主細胞に基づいて選択された、１以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内では、「操作可能に連結された」は、（例えば、イン・ビトロ転写／翻訳システムにおいて、あるいはベクターが宿主細胞に導入された場合には宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能とするように注目するヌクレオチド配列が調節配列に連結していることを意味することを意図する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（１９９１）に記載されている。調節配列は、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの、およびある種の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例えば、組織−特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計は、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望の蛋白質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることは当業者に認識されるであろう。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入して、それにより、本明細書中に記載された核酸によってコードされる、融合蛋白質またはペプチドを含めた蛋白質またはペプチドを生産することができる。
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物細胞（例えば、｛バキュロウイルス発現ベクターを用いる｝昆虫細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞）における、本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドの発現のために設計することができる。適当な宿主細胞はＧｏｅｄｄｅｌ，前掲においてさらに議論されている。別法として、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、イン・ビトロにて転写し翻訳することができる。
原核生物における蛋白質の発現は、最もしばしば、融合または非−融合蛋白質いずれかの発現を指令する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターにてＥ．ｃｏｌｉで行われる。融合ベクターは、多数のアミノ酸をそこにコードされる蛋白質、通常は、組み換え蛋白質のアミノ末端に加える。そのような融合ベクターは、典型的には、３つの目的で働く：１）組換え蛋白質の発現を増加させるため；２）組換え蛋白質の溶解性を増加させるため；および３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換え蛋白質の精製を助けるため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、蛋白質分解切断部位を融合部位および組換え蛋白質の接合において導入して、融合蛋白質の精製に続いての組換え蛋白質の融合部位からの分離を可能とする。そのような酵素、およびその同族認識配列は、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、各々、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合蛋白質またはプロテインＡを標的組換え蛋白質に融合させるｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， １９８８， Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含む。
適当な誘導性非−融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例はｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ｐ．６０−８９， Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９１）を含む。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現はハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依拠する。ｐＥＴ １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現されたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ｇｎ１）によって媒介されるＴ７ ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依拠する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下でＴ７ ｇｎ１遺伝子を保有する定住性プロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組み換え蛋白質発現を最大とするための１つの戦略は、組換え蛋白質を蛋白質分解により切断する損なわれた能力を持つ宿主細菌において蛋白質を発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， ｐ．１１９−１２８， Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）。もう１つの戦略は、各アミノ酸についての個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉで優先的に利用されるように、発現ベクターに挿入されるべき核酸の核酸配列を改変することである（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のそのような改変は標準ＤＮＡ合成技術によって行うことができる。
もう１つの実施形態において、発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現用のベクターの例はｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９８７， ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ， １９８２， Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびｐＰｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む。
別法として、発現ベクターはバキュロウイルス発現ベクターである。培養された昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）における蛋白質の発現で利用可能なバキュロウイルスベクターはｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ， １９８９， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）を含む。
なおもう１つの実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現の例は、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ， １９８７， Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７， ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）を含む。哺乳動物細胞で用いる場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調節エレメントによって供される。例えば、通常使用されるプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物および真核生物細胞の双方のための他の適当な発現ベクターについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，前掲の１６章および１７章を参照されたし。
もう１つの実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指令することができる（例えば、組織−特異的調節エレメントを用いて核酸を発現させる）。組織−特異的調節エレメントは当該分野で知られている。適当な組織−特異的プロモーターの非限定的例はアルブミンプロモーター（肝臓−特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系−特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ， １９８８， Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， １９８９， ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， １９８３， Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）、ニューロン−特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ， １９８９， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓−特異的プロモーターＥｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、および乳腺−特異的プロモーター（例えば、ミルクホエイプロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願第２６４，１６６号参照）を含む。また、発生的に関連したプロモーター、例えば、ネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｒ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ， １９８９， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）も考えられる。
本発明は、さらに、発現ベクターにアンチセンス向きにクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を可能とするように、調節配列に操作可能に連結される。アンチセンス向きにクローン化された核酸に操作可能に連結された調節配列を選択することができ、これは、種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指令し、例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的な組織−特異的または細胞−特異的発現を指令するウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサーまたは調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは組換えプラスミド、ファゲミド、または減弱ウイルスの形態とすることができ、そこでは、アンチセンス核酸は高効率調節領域の制御下で発現され、その活性はベクターが導入される細胞型によって決定することができる。アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の調節の議論については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｖｏｌ．１（１）を参照されたし。
本発明のもう１つの態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は本明細書中においては相互交換的に用いられる。そのような用語は特定の被験体細胞のみならず、そのような細胞の子孫または潜在的子孫もいうことは理解される。ある修飾が突然変異または環境の影響のいずれかにより後の世代で起こり得る故に、そのような子孫は事実親細胞と同一でないかもしれないが、依然として、本明細書中で用いる用語の範囲内に含まれる。
宿主細胞はいずれかの原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物細胞（例えば、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞）であり得る。
ベクターＤＮＡは、慣用的形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核生物または真核生物に導入することができる。本明細書中で用いるように、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、リン酸カルシウム、またはリン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含めた、外来性核酸を宿主細胞に導入するための種々の当該分野で認められた技術をいうことを意図する。宿主細胞を形質転換し、またはトランスフェクトする適当な方法はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（前掲）、および他の実験マニュアルで見出すことができる。
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションでは、用いる発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小さな割合のみが外来性ＤＮＡをそのゲノムに取り込むことができることは知られている。これらの取込体を同定し、選択するためには、（例えば、抗生物質に対する耐性のための）選択可能なバイオマーカーをコードする遺伝子を注目する遺伝子と共に宿主細胞に一般的には導入する。好ましい選択可能バイオマーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬物に対する耐性を付与するものを含む。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は薬物選択によって同定することができる（例えば、選択可能なバイオマーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他方、他の細胞は死滅する）。
培養中の原核生物または真核生物宿主細胞のような本発明の宿主細胞を用いて、本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドを生産することができる。従って、本発明は、さらに、本発明の宿主細胞を用いて本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドを生産する方法を提供する。１つの実施形態において、該方法は、バイオマーカーが生産するように、適当な培地中で（本発明のポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入された）本発明の宿主細胞を培養することを含む。もう１つの実施形態において、該方法は、さらに、培地または宿主細胞からバイオマーカーポリペプチドを単離することを含む。
本発明の宿主細胞を用いて、非−ヒトトランスジェニック動物を生産することもできる。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドをコードする配列が導入された受精卵母細胞または胚幹細胞である。次いで、そのような宿主細胞を用いて、本発明のバイオマーカー蛋白質をコードする外因性配列がそのゲノムに導入された非−ヒトトランスジェニック動物、または本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドをコードする内因性遺伝子が改変された相同組換え動物を作り出すことができる。そのような動物は、バイオマーカーに対応するポリペプチドの機能および／または活性を研究するのに、ポリペプチド活性のモジュレーターを同定しおよび／または評価するのに、ならびに治療または診断分子のプレ−臨床試験において、バイオマーカーの発見または評価、例えば、治療および診断バイオマーカーの発見または評価のために、または薬物の効率および特異性の代用物として有用である。
本明細書中で用いるように、「トランスジェニック動物」は非−ヒト動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、動物の１以上の細胞が導入遺伝子を含むラットまたはマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例は非−ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などを含む。導入遺伝子は細胞のゲノムに組み込まれた外来性ＤＮＡであり、該細胞からトランスジェニック動物が発生し、該細胞は染色動物のゲノム中に残り、それにより、トランスジェニック動物の１以上の細胞型または組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指令する。本明細書中で用いるように、「相同組換え動物」は非−ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスであり、そこでは、内因性遺伝子が、該内因性遺伝子、および動物の発生に先立って動物の細胞、例えば、動物の胚細胞に導入された外因性ＤＮＡ分子の間での相同組換えによって改変されている。トランスジェニック動物は、例えば、Ｃｈａｎ Ｉ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１１３（４）：５２８−３８およびＣｈｉｎ Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｎａｔｕｒｅ ４００（６７４３）：４６８−７２に記載されたもののような誘導性トランスジェニック動物も含む。
本発明のトランスジェニック動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸を受精卵母細胞の雄プロ核に導入することによって作成することができ、卵母細胞が偽妊娠雌養育動物中で発生させるのを可能とする。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルも導入遺伝子に含めて、導入遺伝子の発現の効率を増大させることもできる。組織−特異的調節配列は導入遺伝子に操作可能に連結して、本発明のポリペプチドの発現を特定の細胞に対して指令することができる。胚操作およびマイクロインジェクションを介してトランスジェニック動物、特に、マウスのような動物を作り出す方法は当該分野においては慣用的なものとなっており、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号、米国特許第４，８７３，１９１号、およびＨｏｇａｎ， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ．Ｙ．，１９８６に記載されている。同様な方法を他のトランスジェニック動物の生産で用いる。トランスジェニック創始動物は、そのゲノムにおける導入遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞における導入遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現に基づいて同定することができる。次いで、トランスジェニック創始動物を用いて，導入遺伝子を運ぶさらなる動物を育種することができる。さらに、導入遺伝子を運ぶトランスジェニック動物を、さらに、他の導入遺伝子を運ぶ他のトランスジェニック動物と交雑させることができる。
相同組換動物を作成するためには、その中へ欠失、付加、または置換が導入されて、それにより、遺伝子を改変する、例えば、機能的に破壊した本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも一部を含むベクターが調製される。好ましい実施形態において、ベクターは、相同組換えに際して、内因性遺伝子が機能的に破壊される（すなわち、もはや機能的蛋白質をコードしない；「ノックアウト」ベクターともいわれる）ように設計される。あるいは、ベクターは、相同組換えに際して、内因性遺伝子が突然変異され、またはそうでなければ改変されるが、依然として、機能的蛋白質をコードする（例えば、上流調節領域を改変して、それにより、内因性蛋白質の発現を改変する）ように設計することができる。相同組換えベクターにおいては、遺伝子の改変された部分は遺伝子のさらなる核酸によってその５’および３’末端において近接挟まれて、ベクターによって運ばれた外因性遺伝子および胚幹細胞における内因性遺伝子の間で相同組換えが起こるのを可能とする。さらなるフランキング核酸配列は、内因性遺伝子との成功した相同組換えに十分な長さのものである。典型的には、（５’および３’末端双方における）数キロ塩基のフランキングＤＮＡをベクターに含ませる（例えば、相同組換えベクターの記載についてはＴｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ， １９８７， Ｃｅｌｌ ５１：５０３参照）。ベクターは（例えば、エレクトロポレーションによって）胚幹細胞系に導入され、導入された遺伝子が内因性遺伝子と相同組換えされた細胞を選択する（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２， Ｃｅｌｌ ６９：９１５参照）。次いで、選択された細胞を動物（例えば、マウス）の未分化胚芽細胞に注入して、同種キメラを形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｒｃｈ， Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編， ＩＲＬ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９８７，ｐｐ．１１３−１５２参照）。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌養育動物に移植し、胚を出産予定日まで持って行く。その染色細胞において相同組換えＤＮＡを保有する子孫を用いて、動物の全ての細胞が導入遺伝子の生殖系伝達によって相同組換えＤＮＡを含有する動物を育種することができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法は、さらに、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２：８２３−８２９およびＰＣＴ公開番号ＷＯ ９０／１１３５４、ＷＯ ９１／０１１４０、ＷＯ ９２／０９６８、およびＷＯ ９３／０４１６９に記載されている。
もう１つの実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能とする選択されたシステムを含むトランスジェニック非−ヒト動物を生産することができる、そのようなシステムの１つの例はバクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼシステムの記載については、Ｌａｋｓｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６参照。レコンビナーゼシステムのもう１つの例はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰレコンビナーゼシステムである（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５）。もしｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼシステムを用いて導入遺伝子の発現を調節するならば、Ｃｒｅレコンビナーゼおよび選択される蛋白質の双方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要とされる。そのような動物は、例えば、１つは選択される蛋白質をコードする遺伝子を含み、他方はレコンビナーゼをコードする導入遺伝子をコードする２つのトランスジェニック動物を交配させることによって、「二重」トランスジェニック動物の構築を通じて供することができる。
本明細書中に記載された非−ヒトトランスジェニック動物のクローンの、Ｗｉｌｍｕｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３およびＰＣＴ公開番号ＷＯ ９７／０７６６８およびＷＯ ９７／０７６６９に記載された方法に従って生産することもできる。
（ＶＩＩ．治療の方法）
本発明は、癌、例えば、膵臓癌、例えば、膵臓腺癌を有する、またはその危険性がある（またはそれに対して感受性である）被験体、例えば、ヒトを処置する予防的治療的双方の方法を提供する。本明細書中で用いるように、被験体の「治療」は、疾患または疾病、疾患または疾病の兆候、または疾患または疾病の危険性（またはそれに対する感受性）を治癒し、阻害し、回復し、軽減し、緩和し、改変し、救済し、和らげ、改善し、または影響させる目的で、治療剤の、疾患または疾病を有し、疾患または疾病の兆候を有し、疾患または疾病の危険性がある（またはそれに対して感受性の）被験体への適用または投与、または治療剤の被験体からの細胞または組織への適用または投与を含む。本明細書中で用いるように、「治療剤」または「化合物」は、限定されるものではないが、低分子、ペプチド、ペプチドミメティックス、ポリペプチド、ＲＮＡ干渉因子、例えば、ｓｉＲＮＡ分子、抗体、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
本明細書中で用いるように、被験体における癌は、１以上のバイオマーカー、例えば、癌において増加することが示されているバイオマーカーの量および／または活性の変化、例えば、増加、または構造の変化、および／または１以上のバイオマーカー、例えば、癌において減少することが示されているバイオマーカーの量および／または活性の減少、または構造の変化に関連付けられる。前記で議論したように、量、構造、および／または活性のこれらの変化のいくつかは癌の発生に由来し、これらの変化の他のものは癌細胞の癌性状態を誘導し、維持し、および促進する。かくして、１以上のバイオマーカー、例えば、癌で増加することが示されているバイオマーカーの量および／または活性の増加、または構造の変化によって特徴付けられる癌は、それらのバイオマーカーの量、例えば、発現または蛋白質レベルおよび／または活性を阻害することによって阻害することができる。同様に、１以上のバイオマーカー、例えば、癌において減少することが示されているバイオマーカーの量および／または活性の減少、または構造の変化によって特徴付けられる癌は、それらのバイオマーカーの量、例えば、発現または蛋白質のレベル、および／または活性を増強させることによって阻害することができる。
したがって、本発明のもう１つの態様は癌に罹った被験体を治療する方法に関する。これらの方法は、本発明の１以上のバイオマーカーの量および／または活性を変調する化合物を被験体に投与することを含む。例えば、癌の治療または予防の方法は、１以上のバイオマーカー、例えば、癌において増加することが示されているバイオマーカーの量および／または活性を減少させる化合物を被験体に投与することを含む。バイオマーカー、例えば、癌において増大することが示されているバイオマーカーの量および／または活性を阻害するのに用いて、それにより、癌を治療または予防することができる化合物、例えば、アンタゴニストは抗体（例えば、結合体化抗体）、低分子、ＲＮＡ干渉因子、例えば、ｓｉＲＮＡ分子、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、治療で用いられる抗体はトキシン、化学療法剤、または放射性粒子に結合体化させる。
癌の治療または予防の方法は、バイオマーカー、例えば、癌において減少することが示されているバイオマーカーの量および／または活性を増加させる化合物を被験体に投与することも含む。バイオマーカー、例えば、癌において減少することが示されているバイオマーカーの発現または活性を増加させるのに用いて、それにより、癌を治療または予防する化合物、例えば、アゴニストは低分子、ペプチド、ペプトイド、ペプチドミメティックス、およびポリペプチドを含む。
本発明の方法で用いる低分子は、蛋白質−蛋白質相互作用を阻害し、それにより、バイオマーカーの量および／または活性を増加または減少させるものを含む。さらに、サイレントとされた遺伝子、例えば、腫瘍サプレッサーの再発現を引き起こすモジュレーター、例えば、低分子もここでは含まれる。例えば、そのような分子はＤＮＡ結合またはメチルトランスフェラーゼ活性に干渉する化合物を含む。
アプタマーを用いて本発明のバイオマーカーの発現または活性を変調し、例えば、増加させ、阻害し、それにより、癌を治療または予防し、阻害することもできる。アプタマーは、他の分子に結合するその能力に基づいてランダムなプールから選択されているＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。核酸または蛋白質に結合するアプタマーを選択することができる。
（ＶＩＩＩ．医薬組成物）
本発明のバイオマーカーに対応する（ここでは「活性化合物」または「化合物」ともいわれる）低分子、ペプチド、ペプトイド、ペプチドミメティックス、ポリペプチド、ＲＮＡ干渉因子、例えば、ｓｉＲＮＡ分子、抗体、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与に適した医薬組成物に取り込むことができる。そのような組成物は、典型的には、低分子、ペプチド、ペプトイド、ペプチドミメティックス、ポリペプチド、ＲＮＡ干渉因子、例えば、ｓｉＲＮＡ分子、抗体、リボザイム、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に受容可能な担体を含む。本明細書中で用いるように、用語「薬学的に受容可能な担体」は、医薬投与に適合する、いずれかのおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を含むことを意図する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および剤の使用は当該分野でよく知られている。いずれかの慣用的な媒体または剤が活性な化合物と適合しない限りを除き、組成物におけるその使用が考えられる。補助的な活性化合物の組成物に配合することもできる。
本発明は、本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の発現または活性を変調するための医薬組成物を調製する方法を含む。そのような方法は、薬学的に受容可能な担体を、本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の発現または活性を変調する剤と共に処方することを含む。そのような組成物は、さらに、追加の活性剤を含むことができる。かくして、本発明は、さらに、薬学的に受容可能な担体を、本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の発現または活性を変調する剤および１以上の追加の活性化合物と共に処方することによって医薬組成物を調製する方法を含む。
低分子剤および蛋白質またはポリペプチド剤の適当な用量は、通常の技量の医師、獣医または研究者の知識内の多数の因子に依存することは理解される。これらの剤の用量は、例えば、治療すべき被験体または試料の同一性、サイズ、および症状に依存して、さらに、組成物が投与されるべき経路、もし可能であれば、および実施者が化合物が本発明の核酸分子またはポリペプチドに対して有することを望む効果に依存して変化する。低分子は、限定されるものではないが、ペプチド、ペプチドミメティックス、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、モル当たり約１０，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機および有機金属化合物を含む）、モル当たり約５，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、モル当たり約１，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、モル当たり約５００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物およびそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に受容可能な形態を含む。
低分子の例示的な用量は、被験体または試料の重量１キログラム当たりミリグラムまたはマイクログラムの量を含む（例えば、キログラム当たり約１マイクログラムまたはキログラム当たり約５００マイクログラム、キログラム当たり約１００マイクログラムまたはキログラム当たり約５マイクログラム、またはキログラム当たり約１マイクログラムないしキログラムあたり約５０マイクログラム）。
本明細書中で定義するように、ＲＮＡ干渉因子、例えば、ｓｉＲＮＡの治療上有効量（すなわち、有効用量）は約０．００１ないし３，０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１ないし２５００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１ないし２０００、約０．１ないし１０００ｍｇ／ｋｇ体重、０．１ないし５００ｍｇ／ｋｇ体重、０．１ないし１００ｍｇ／ｋｇ体重、０．１ないし５０ｍｇ／ｋｇ体重、０．１ないし２５ｍｇ／ｋｇ体重、なおより好ましくは約１ないし１０ｍｇ／ｋｇ、２ないし９ｍｇ／ｋｇ、３ないし８ｍｇ／ｋｇ、４ないし７ｍｇ／ｋｇ、または５ないし６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。治療上有効量のＲＮＡ干渉因子での対照の治療は、単一治療を含むことができるか、あるいは好ましくは系列的治療を含むことができる。好ましい例においては、被験体は約０．１ないし２０ｍｇ／ｋｇ体重の間の範囲にて、ＲＮＡ干渉因子で、約１ないし１０週間の間に、好ましくは、２ないし８週間の間、より好ましくは約３ないし７週間の間、なおより好ましくは約４、５または６週間の間に１週間当たり１回処置する。
蛋白質またはポリペプチドの例示的用量は、被験体または試料重量１キログラム当たりグラム、ミリグラム、またはマイクログラムの量を含む（例えば、キログラム当たり約１マイクログラムないしキログラム当たり約５グラム、キログラム当たり約１００マイクログラムないしキログラム当たり約５００ミリグラム、またはキログラム当たり約１ミリグラムないしキログラム当たり約５０ミリグラム）。さらに、これらの剤の１つの適当な用量は、変調すべき発現または活性に関する剤の能力に依存することがさらに理解される。そのような適当な用量は本明細書中に記載されたアッセイを用いて決定することができる。１以上のこれらの剤を動物（例えば、ヒト）に投与して、本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を変調する場合、医師、獣医、または研究者は、例えば、まず比較的低い容量を処方し、引き続いて、適当な応答が得られるまで用量を増加させる。加えて、いずれかの特定の動物被験体についての具体的用量レベルは、使用する特定の剤の活性、被験体の年齢、体重、一般的健康、性別、および食習慣、投与の時間、投与の経路、排出速度、いずれかの薬物組合せ、および変調すべき発現または活性の程度を含めた種々の因子に依存するであろうことは理解される。
本発明の医薬組成物はその意図した投与経路に適合するよう処方される。投与の経路の例は非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与を含む。非経口、皮内または皮下適用で用いる溶液または懸濁液は以下の成分：注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルバラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または二亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン−四酢酸のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような等張性の調製用の剤を含む。ｐＨは塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整することができる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチックで作成されたアンプル、ディスポーザブルシリンジまたは多用量バイアルに入れることができる。
注射使用に適した医薬組成物は滅菌水性溶液（水溶性の場合）、または分散液および滅菌注射溶液または分散液の即席調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与では、適当な担体は生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、組成物は滅菌されていなければならず、容易な相乗効果が存在する程度まで流動性であるべきである。それは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびその適当な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール，フェノール、アスコルビン酸、チメロザール等によって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましいであろう。注射組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含ませることによって実現される。
滅菌注射溶液は、必要な量の活性化合物（例えば、ポリペプチドまたは抗体）を、必要であれば、前記リストの成分の１つまたは組合せと共に適当な溶媒に配合し、続いて、濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、基本的分散媒体を含む滅菌ビークルに活性化合物を配合し，次いで，前記リストからの必要な他の成分を配合することによって調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合には、調製の好ましい方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これは、有効成分＋その従前に滅菌濾過された溶液からのいずれかの追加の所望の成分の粉末を生じる。
経口組成物は、一般には、不活性な希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入することができるか、または圧縮して錠剤とすることができる。経口治療投与の目的では、活性な化合物を賦形剤と共に配合することができ、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で用いることができる。経口組成物は、マウスウォッシュとして用いるために流体担体を用いて調製することもでき、そこでは、流体担体中の化合物が経口により適用され、口内で転がし、吐き出し、または飲み込む。
薬学的に適合する結合剤および／または賦形剤物質は組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは以下の成分、または同様な性質の化合物のいずれかを含有することができる：マイクロクリスタリンセルロース、トララガントガムまたはゼラチンのような結合剤；澱粉またはラクトースのような賦形剤、アルギン酸、プリモゲル、またはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、またはステロート（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）のような滑沢剤；コロイド状に酸化ケイ素のようなグライダント；スクロースまたはサッカリンのような甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバーのようなフレーバー剤。
吸入による投与のためには、化合物を、適当なプロペラント，例えば、二酸化炭素のようなガス、ガスを含有する圧縮容器またはディスペンサー、あるいはネビュライザーからのエアロゾルスプレイの形態で送達される。
全身投与は経粘膜または経皮手段によることもできる。経粘膜または経皮投与では浸透させるべきバリアに対して適当な浸透剤を処方で用いる。そのような浸透剤は一般的に当該分野で知られており、例えば、経皮投与では、洗剤、胆汁塩、および流動性酸誘導体を含む。経粘膜投与は鼻スプレイまたは坐薬の使用を介して達成することができる。経皮投与では、活性化合物を当該分野で一般的に知られた軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに処方される。
化合物は（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドのような慣用的な坐薬基剤での）坐薬、または直腸送達用の保持浣腸の形態で調製することができる。
１つの実施形態において、有効化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含めた、制御放出処方のような、身体からの迅速な排出に対して化合物を保護する担体とで調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生分解性生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような処方の調製方法は当業者に明らかであろう。また、該物質はＡｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ およびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．から商業的に得ることもできる。（その中にまたはその上にモノクローナル抗体が一体化されたリポソームを含めた）リポソーム懸濁液は、薬学的に受容可能な担体として用いることもできる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されたように当業者に知られた方法によって調製することができる。
経口または非経口組成物を、投与の容易性および投与量の均一性のために投与単位形態で処方するのが特に有利である。本明細書中で用いる投与単位形態とは、治療すべき被験体についての単位投与量として適した物理的に区分される単位をいい；各単位は、必要な医薬担体と組み合わせて所望の治療効果を生じさせるように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の投与単位形態のための仕様は、活性化合物のユニークな特徴および達成すべき特定の治療効果、ならびに個体の治療用のそのような活性化合物を調合する分野に固有の制限に直接的に指示され、かつ直接的にそれに依存する。
抗体では、好ましい投与量は０．１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ体重（一般に、１０ｍｇ／ｋｇないし２０ｍｇ／ｋｇ）である。もし抗体が脳において作用すべきであれば、５０ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇの投与量が通常は適切である。一般には、部分的にヒトの抗体および十分にヒトの抗体は他の抗体よりもヒト身体内で長い半減期を有する。したがって、より低い投与量およびより低い頻度の投与がしばしば可能である。脂質化のような修飾を用いて、抗体を安定化し、（例えば、上皮への）摂取および組織浸透を増強させることができる。抗体の脂質化のための方法はＣｒｕｉｋｓｈａｎｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９７） Ｊ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ １４：１９３によって記載されている。
本発明のバイオマーカーに対応する核酸分子はベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（べ国特許第５，３２８，４７０号）によって、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７参照）によって被験体に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は適当な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことができる、あるいは遺伝子送達ビーグルが埋められた遅延放出マトリックスを含むことができる。別法として、完全な遺伝子送達ベクター、レトロウイルスベクターが組換え細胞から無傷で生じさせることができる場合、医薬製剤は遺伝子送達システムを生じさせる１以上の細胞を含むことができる。
本発明の方法で用いるＲＮＡ干渉因子、例えば、ｓｉＲＮＡをベクターに挿入することができる。これらの構築体は、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号）によって、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７参照）によって被験体に送達することができる。ベクターの医薬製剤はＲＮＡ干渉因子、例えば、ｓｉＲＮＡベクターを許容される希釈剤中に含むことができ、あるいは遺伝子送達ビークルが埋められた遅延放出マトリックスを含むことができる。別法として、完全な遺伝子送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターが組換え細胞から無傷で生産できる場合、医薬製剤は、遺伝子送達システムを生じる１以上の細胞を含むことができる。
医薬組成物は投与用の指示書と共に容器、パックまたはディスペンサーに含めることができる。
（ＩＸ．予測される医療）
また、本発明は、予測医療の分野にも関し、ここに、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクスス，およびモニタリング臨床試験が予後（予測）目的で用いられ、それにより、個体を予防的に処置する。したがって、本発明の１つの態様は、本発明の１以上のバイオマーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の量、構造および／または活性を測定して、個体が癌を発症する危険性があるか否かを判断するための診断アッセイに関する。そのようなアッセイは、予後または予測目的で用いて、それにより、癌の開始に先立って個体を予防的に処置することができる。
本発明のなおもう１つの態様は、臨床試験における本発明のバイオマーカーの量、構造および／または活性に対する剤（例えば、癌を阻害し、またはいずれかの他の疾病を治療または予防して｛すなわち、そのような処置が有するかも知れないいずれかの癌形成効果を理解する｝ために投与される薬物または他の化合物）の影響をモニターすることに関する。これらおよび他の剤を以下のセクションでさらに詳しく記載する。
Ａ．診断アッセイ
１．コピー数の検出のための方法
特定のバイオマーカーまたは染色体領域（例えば、ＭＣＲ）のコピー数を評価する方法は当業者によく知られている。染色体獲得または喪失の存在または不存在は、単に、個々に同定された領域またはバイオマーカーのコピー数の測定によって評価することができる。
試料中のコーディング核酸のコピー数を評価するための方法は、限定されるものではないが、ハイブリダイゼーション−ベースのアッセイを含む。例えば、試料中のコーディング核酸のコピー数を評価する１つの方法はサザンブロットを含む。サザンブロットにおいては、（典型的には、フラグメント化され、電気泳動ゲルで分離された）ゲノムＤＮＡを、標的領域に対して特異的なプローブにハイブリダイズさせる。標的領域についてのプローブからのハイブリダイゼーションシグナルの強度の、正常なゲノムＤＮＡ（例えば、同一または関連細胞、組織、器官等の非−増幅部分）の分析からの対照プローブシグナルとの比較により、標的核酸の相対的コピー数の見積もりが提供される。別法として、ノーザンブロットは，試料中のコーディング核酸のコピー数を評価するために利用することができる。ノーザンブロットにおいては、ｍＲＮＡを、標的領域に対して特異的なプローブにハイブリダイズさせる。標的領域プローブからのハイブリダイゼーションシグナルの強度と、正常なｍＲＮＡ（例えば、同一または関連細胞、組織、器官等の非−増幅部分）の分析からの対照プローブシグナルとの比較により、標的核酸の相対的コピー数の見積もりが提供される。
コピー数を決定するための代替手段はイン・サイチュハイブリダイゼーションである（例えば、Ａｎｇｅｒｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ １５２：６４９）。一般に、イン・サイチュハイブリダイゼーションは以下の工程：（１）分析すべき組織または生物学的構造の固定；（２）標的ＤＮＡの接近性を増加させ、および非特異的結合を低下させるための生物学的構造のプレハイブリダイゼーション処理；（３）核酸の混合物の生物学的構造または組織中の核酸へのハイブリダイゼーション；（４）ハイブリダイゼーションで結合しない核酸フラグメントを除去するためのハイブリダイゼーション後洗浄、および（５）ハイブリダイズした核酸フラグメントの検出を含む。これらの工程の各々で用いる試薬、および使用のための条件は特定の適用に依存して変化する。
好ましいハイブリダイゼーション−ベースのアッセイは、限定されるものではないが、サザンブロットまたはイン・サイチュハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨおよびＦＩＳＨ＋ＳＫＹ）のような伝統的な「直接的プローブ」方法、および比較ゲノミックハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、例えば、ｃＤＮＡ−ベースのまたはオリゴヌクレオチド配列ベースＣＧＨのような「比較プローブ」方法を含む。該方法は、限定されるものではないが、基材（例えば、膜またはガラス結合方法またはアレイ−ベースのアプローチを含めた広く種々の様式で用いることができる。
典型的なイン・サイチュハイブリダイゼーションアッセイにおいては、細胞は固体支持体、典型的には、ガラススライドに固定化される。もし核酸をプローブするならば、細胞は典型的には熱またはアルカリで変性する。次いで、細胞を、蛋白質をコードする核酸配列への特異的な標識されたプローブのアニリングを可能とする中程度の温度にてハイブリダイゼーション溶液と接触させる。次いで、標的（例えば、細胞）を、適当なシグナル／ノイズ比が得られるまで、所定のストリンジェンシーにて、または増大させるストリンジェンシーにて典型的には洗浄する。
プローブは、典型的には、例えば、放射性同位体または蛍光レポーターで標識される。好ましいプローブは、ストリンジェントな条件下で標的核酸と特異的にハイブリダイズするように十分に長い。好ましいサイズの範囲は約２００塩基ないし約１０００塩基である。
いくつかの適用においては、反復配列のハイブリダイゼーション能力をブロックする必要がある。かくして、いくつかの実施形態においてｔＲＮＡ、ヒトゲノムＤＮＡ、またはＣｏｔ−Ｉ ＤＮＡを用いて、非−特異的ハイブリダイゼーションをブロックする。
ＣＧＨ方法においては、（例えば、試料、例えば、可能な腫瘍からの）核酸の第一のコレクションを第一の標識で標識し、他方、核酸（例えば、健康な細胞／組織からの、例えば、対照）の第二のコレクションを第二の標識で標識する。核酸のハイブリダイゼーションの比率は、アレイにおける各繊維に結合する２つの（第一および第二）の標識によって決定される。染色体の欠失または多重化がある場合、２つの標識からのシグナルの比率の差を検出し、該比率はコピー数の尺度を供するであろう。また、アレイ−ベースのＣＧＨは、（２つの異なる色素で被験体および可能な腫瘍細胞を標識し、ハイブリダイゼーションに先立ってそれらを混合するのとは対照的に（これは、アレイ上のプローブの競合ハイブリダイゼーションによる比率を生じるであろう））単一−色標識で行うこともできる。単一色ＣＧＨにおいては、対照を標識し、１つのアレイにハイブリダイズさせ、絶対シグナルを読み、可能な腫瘍試料を標識し、（同一含有量にて）第二のアレイにハイブリダイズさせ、絶対シグナルを読む。コピー数の差は、２つのアレイからの絶対シグナルに基づいて計算される。
本発明の方法で用いるのに適したハイブリダイゼーションプロトコルは、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ（１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ．３：１２２７−１２３４；Ｐｉｎｋｅｌ（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：９１３８−９１４２；ＥＰＯ公開番号４３０，４０２；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．３３：Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｃｈｏｏ編， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， Ｎ．Ｊ．（１９９４）等に記載されている。１つの実施形態において、Ｐｉｎｋｅｌ， ｅｔ ａｌ，（１９９８） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０：２０７−２１１、またはＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ（１９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５３２１−５３２５（１９９２）のハイブリダイゼーションプロトコルを用いる。
本発明の方法は、アレイ−ベースのハイブリダイゼーションフォーマットによく適合している。アレイ−ベースのＣＧＨは、その内容をここに引用して援用する米国特許第６，４５５，２５８号に記載されている。
さらにもう１つの実施形態において、増幅−ベースのアッセイを用いて、コピー数を測定することができる。そのような増幅−ベースのアッセイにおいて、核酸配列は増幅反応（例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ））において鋳型として作用する。定量的な増幅において、増幅産物の量は基の試料に於ける鋳型の量に比例するであろう。適当な対照、例えば、健康な組織に対する比較により、コピー数の尺度が提供される。
「定量的」増幅の方法は当業者によく知られている。例えば、定量的なＰＣＲは、同一プライマーを用いて既知の量の対照配列を同時に増幅することを含む。これは、ＰＣＲ反応をキャリブレートするのに用いることができる内部標準である。定量ＰＣＲについての詳細なプロトコルはＩｎｎｉｓ， ｅｔ ａｌ．，（１９９０） ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．に供される。定量ＰＣＲ分析を用いるマイクロサテライト遺伝子座におけるＤＮＡコピー数の測定はＧｉｎｚｏｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ．，（２０００） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：５４０５−５４０９に記載されている。遺伝子についての既知の核酸配列は、当業者は、ルーチン的にプライマーを選択して、遺伝子のいずれかの部分を増幅するのを可能とするのに十分なのである。発蛍光性定量ＰＣＲを本発明の方法で用いることもできる。発蛍光性定量ＰＣＲにおいては、定量は蛍光シグナル、例えば、ＴａｑＭａｎおよびｓｙｂｒ緑色の量に基づく。
他の適当な増幅方法は、限定されるものではないが、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ（１９８９） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０、 Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ， ｅｔ ａｌ，．（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７、およびＢａｒｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９０） Ｇｅｎｅ ８９：１１７）、転写増幅（Ｋｗｏｈ， ｅｔ ａｌ，．（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３）、自己−維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ， ｅｔ ａｌ，，（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４）、ドットＰＣＲ、およびリンカーアダプターＰＣＲ等を含む。
ヘテロ接合性（ＬＯＨ）の喪失のマッピング（Ｗａｎｇ， Ｚ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（２００４） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４（１）：６４−７１；Ｓｅｙｍｏｕｒ， Ａ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ，．，（１９９４） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４、２７６１−４；Ｈａｈｎ，Ｓ．Ａ．， ｅｔ ａｌ，，（１９９５） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５、 ４６７０−５；Ｋｉｍｕｒａ， Ｍ．，ｅｔ ａｌ，．（１９９６） Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ １７， ８８−９３）を用いて、増幅または欠失の領域を同定することもできる。
２．遺伝子発現の検出方法
バイオマーカー発現レベルは、癌の、または癌を発症する危険性の診断方法として圧制することもできる。本発明のバイオマーカーの発現は、転写された分子または蛋白質の発現を検出するための広く種々のよく知られた方法のいずれかによって評価することができる。そのような方法の非限定的例は分泌された細胞−表面，細胞質、または核蛋白質の検出のための免疫学的方法、蛋白質精製方法、蛋白質機能または活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション方法、核酸逆転写方法，および核酸増幅方法を含む。
好ましい実施形態において、特定の遺伝子の活性は、遺伝子転写体（例えば、ｍＲＮＡ）の尺度によって、翻訳された蛋白質の量の尺度によって、または遺伝子産物活性の尺度によって特徴付けられる。バイオマーカー発現は、ｍＲＮＡレベル、蛋白質レベル、または蛋白質活性を検出することによるのを含めた種々の方法でモニターすることができ、そのいずれも標準技術を用いて測定することができる。検出は遺伝子発現のレベル（例えば、ゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、蛋白質、または酵素活性）の定量を含むことができるか、あるいは特に対照レベルと比較した、遺伝子発現のレベルの定量的評価であり得る。検出すべきレベルのタイプは文脈から明らかであろう。
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いる遺伝子転写体（ｍＲＮＡまたはそれから作成されたｃＤＮＡ）を検出し、および／または定量する方法は当業者に知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，前掲参照）。例えば、ｃＤＮＡの存在、不存在、または量を評価するための１つの方法は前記したサザン移動を含む。簡単に述べれば、該ｍＲＮＡを（例えば、酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム抽出方法を用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，前掲）単離し、逆転写して、ｃＤＮＡを得る。次いで、該ｃＤＮＡを所望により消化し、緩衝液中にてゲル上で泳動させ、膜に移動させる。次いで、標的ｃＤＮＡに対して特異的な核酸プローブを用いてハイブリダイゼーションを行う。
そのような診断および予後アッセイの一般的原理は、試料、またはバイオマーカーおよびプローブを含有することができる反応混合物を、適当な条件下で、バイオマーカーおよびプローブが相互反応し、結合し、かくして、除去でき、および／または反応混合物中で検出できる複合体を形成するのに十分な時間の間で、調製することを含む。これらのアッセイは種々の方法で行うことができる。
例えば、そのようなアッセイを行う１つの方法は、基材ともいわれる固相支持体上にバイオマーカーまたはプローブを係留させ、次いで、反応の最後に固相に係留された標的バイオマーカー／プローブ複合体を検出することを含むであろう。そのような方法の１つの実施形態において、バイオマーカーの存在および／または濃度につきアッセイすべき被験体からの試料を担体または固相支持体に係留させることができる。もう１つの実施形態において、逆の状況が可能であり、そこでは、プローブを固相に係留させることができ、被験体からの試料をアッセイの未係留成分として反応させることができる。
アッセイ成分を固相に係留するための多くの確立された方法がある。これらは、限定されるものではないが、ビオチンおよびストレプトアビジンのコンジュゲーションを通じて固定化されるバイオマーカーまたはプローブ分子を含む。そのようなビオチニル化アッセイ成分は当該分野で知られた技術（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を用いて、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製することができ、ストレプトアビジン−被覆９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルで固定化することができる。ある実施形態においては、固定化されたアッセイ成分を持つ表面は予め調製し、貯蔵することができる。
そのようなアッセイのための他の適当な担体または固相支持体は、バイオマーカーまたはプローブが属する分子のクラスに結合することができるいずれかの材料を含む。よく知られた支持体または担体は、限定されるものではないが、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩、およびマグネタイトを含む。
前記したアプローチにてアッセイを行うために、非−固定化成分を、それに対して第二の成分が係留された固相に加える。反応が完了した後、いずれかの複合体が固相に固定化されたままである条件下で、未複合体化成分を（例えば、洗浄によって）除去することができる。固相に係留されたバイオマーカー／プローブ複合体の検出は、本明細書中に概説された多数の方法で達成することができる。
好ましい実施形態において、プローブはそれが未係留アッセイ成分である場合、アッセイの本明細書中で議論し、かつ当業者によく知られた検出可能な標識での、直接的または間接的なアッセイの検出および呼出の目的で標識することができる。
また、例えば、蛍光エネルギー移動の技術を利用することによって、いずれかの成分（バイオマーカーまたはプローブ）のさらなる操作または標識なくして、バイオマーカー／プローブ複合体系性を直接的に検出することも可能である（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ， ｅｔ ａｌ，，米国特許第４，８６８，１０３号参照）。第一の「ドナー」分子上のフルオロフォアは、適当な波長の入射光での励起に際して、その発光された蛍光エネルギーが、吸収されたエネルギーにより今度は発光できる第二の「アクセプター」分子上の蛍光標識によって吸収されるように選択される。別法として、「ドナー」蛋白質分子は、単に、トリプトファン残基の天然蛍光エネルギーを利用することができる。「アクセプター」分子標識が「ドナー」のそれから区別できるように、異なる波長の光を発する標識を選択する。標識の間のエネルギー移動の効率は分子を分離する距離に関連するため、分子の間の空間的な関係を評価することができる。結合が該分子の間で起こる状況では、アッセイにおける「アクセプター」分子標識の蛍光発光は最大になるはずである。ＦＥＴ結合事象は、（例えば、フルオリメーターを用いて）当該分野でよく知られた標準フルオロメーター検出手段を通じて便宜には測定することができる。
もう１つの実施形態において、バイオマーカーを認識するプローブの能力の測定は、リアル−タイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）のような技術を利用することによって、いずれかのアッセイ成分（プローブまたはバイオマーカー）を標識することなく達成することができる（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ， Ｓ．ａｎｄ Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ， Ｃ．，１９９１， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５およびＳｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５参照）。本明細書中で用いるように、「ＢＩＡ」または「表面プラズモン共鳴」は、相互作用体（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）のいずれも標識することなく、リアルタイムにて生体特異的相互作用を調べるための技術である。（結合事象を示す）結合表面における質量の変化の結果、表面近くの光の屈折率の変化（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）がもたらされ、その結果、検出可能なシグナルが生じ、これは生物学的分子の間のリアル−タイム反応の尺度として用いることができる。
別法として、もう１つの実施形態において、類似の診断および予後アッセイを、液相中の溶質としてのバイオマーカーおよびプローブにて行うことができる。そのようなアッセイにおいて、複合体化バイオマーカーおよびプローブは、限定されるものではないが：分画遠心法、クロマトグラフィー、電気泳動および免疫沈澱を含めた多数の標準技術のいずれかによって未複合体化成分から分離する。分画遠心法においては、バイオマーカー／プローブ複合体は、それらの異なるサイズおよび密度に基づいて複合体の異なる沈積平衡により、一連の遠心工程について未複合体化アッセイ成分から分離することができる（例えば、Ｒｉｖａｓ， Ｇ．， ａｎｄ Ｍｉｎｔｏｎ， Ａ．Ｐ．， １９９３、 Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１８（８）：２８４−７参照）。また、標準クロマトグラフィー技術を利用して、複合体化分子を未複合体化分子から分離することもできる。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーは、サイズに基づき、かつカラムフォーマットにて適当なゲル濾過樹脂の利用を介して分子を分離し、例えば、比較的大きな複合体は比較的小さな未複合体化成分から分離することができる。同様に、未複合体化成分と比較してバイオマーカー／プローブ複合体の相対的に異なる電荷特性を利用して、例えば、イオン−交換クロマトグラフィー樹脂の利用を通じて、複合体を未複合体化成分から分けることができる。そのような樹脂およびクロマトグラフィー技術は当業者によく知られている（例えば、Ｈｅｅｇａａｒｄ， Ｎ，Ｈ．， １９９８， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．Ｗｉｎｔｅｒ １１（１−６：１４１−８；Ｈａｇｅ， Ｄ．Ｓ．， およびＴｗｅｅｄ， Ｓ．Ａ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ Ａｐｐｌ １９９７ Ｏｃｔ １０；６９９（１−２）；４９９−５２５参照）。ゲル電気泳動を使用して、複合体化アッセイ成分を未結合成分から分離することもできる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 １９８７−１９９９参照）。この技術においては、蛋白質または核酸複合体を、例えば、サイズまたは電荷に基づいて分離する。電気泳動プロセスの間の結合反応を維持するために、非−変性ゲルマトリックス物質および還元剤の非存在下における条件が典型的には好ましい。特定のアッセイおよびその成分に対する適当な条件は当業者によく知られている。
特別な実施形態において、バイオマーカーに対応するｍＲＮＡのレベルは、当該分野で知られた方法を用い、生物学的試料においてイン・サイチュ様式によって、およびイン・ビトロ様式によって測定することができる。用語「生物学的試料」は、被験体から単離された組織、細胞、生物学的流体およびその単離体、ならびに被験体内に存在する細胞および流体を含むことを意図する。多くの発現検出方法は単離されたＲＮＡを用いる。イン・ビトロ方法では、ｍＲＮＡの単離に対して選択しないいずれかのＲＮＡ単離技術を、細胞からのＲＮＡの精製で利用することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８７−１９９９参照）。加えて、多数の組織試料は、例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（１９８９， 米国特許第４，８４３，１５５号）の単一−工程ＲＮＡ単離プロセスのような当業者によく知られた技術を用いて容易に処理することができる。
単離された核酸は、限定されるものではないが、サザンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ鎖反応およびプローブアレイを含めたハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイで用いることができる。ｍＲＮＡレベルの検出のための１つの好ましい診断方法は、検出すべき遺伝子によってコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と単離されたｍＲＮＡとを接触させることを含む。核酸プローブは、例えば、全長ｃＤＮＡ、またはストリンジェントな条件下で本発明のバイオマーカーをコードするｍＲＮＡまたはゲノミックＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分な長さが少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドのようなその部分であり得る。本発明の診断アッセイで用いられる他の適当なプローブは本明細書中に記載される。ｍＲＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションは、問題とするバイオマーカーが発現されていることを示す。
１つの様式において、ｍＲＮＡは固体表面に固定化され、例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲルに流し、次いで、ニトロセルロースのような膜へゲルからのｍＲＮＡを移すことによってプローブと接触させる。別の様式において、プローブは固体表面に固定化され、ｍＲＮＡは、例えば、Ａｓｓｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイにおいてプローブと接触させる。当業者であれば、本発明のバイオマーカーによってコードされるｍＲＮＡのレベルを検出するのに用いられる公知のｍＲＮＡ検出方法を容易に適合させることができる。
プローブは蛋白質をコードする核酸配列の全長とすることができるか、または該全長未満とするころができる。より短いプローブは特異性につき経験的にテストされる。好ましくは、核酸プローブは長さが２０塩基またはそれよりも長い。（例えば、核酸ハイブリダイゼーションで用いられる核酸プローブ配列を選択する方法についてはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，参照）。ハイブリダイズされた部分の可視化は、ｃＤＮＡの存在または不存在の定量的測定を可能とする。
試料中の本発明のバイオマーカーに対応する転写体のレベルを測定するための別の方法は、例えば、ｒｔＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ， １９８７，米国特許第４，６８３，２０２号に記載された実験実施形態）、リガーゼ鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，１９９１， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８８：１８９−１９３）、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８９， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号）またはいずれかの他の核酸増幅方法による核酸増幅のプロセス、続いての、当業者によく知られた技術を用いる増幅された分子の検出を含む。発蛍光性ｒｔＰＣＲを本発明の方法で用いることもできる。発蛍光性ｒｔＰＣＲにおいて、定量は蛍光シグナル、例えば、ＴａｑＭａｎおよびＳｙｂｒ緑色の量に基づく。これらの検出スキームは、もしそのような分子が非常に少数で存在するならば、核酸分子の検出で特に有用である。本明細書中で用いるように、増幅プライマーは、遺伝子の５’または３’領域（各々、ストランドを加え、および除く、またはその逆）にアニールすることができ、双方の間で短い領域を含有することができる核酸分子の対と定義される。一般に、増幅プライマーは長さが約１０ないし３０ヌクレオチドであり、長さが約５０ないし２００ヌクレオチドの領域を近接挟む。適当な試薬にて、そのようなプライマーはプライマーによって近接挟まれるヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能とする。
イン・サイチュ方法では、ｍＲＮＡは検出に先立って細胞から単離される必要はない。そのような方法において、細胞または組織試料は、公知の組織学的方法を用いて調製／処理される。次いで、試料を支持体、典型的には、スライドガラスに固定化し、次いで、バイオマーカーをコードするｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるプローブと接触させる。
バイオマーカーの絶対的発現レベルに基づく測定をなすための代替法として、測定はバイオマーカーの正規化された発現レベルに基づくことができる。発現レベルは、その発現をバイオマーカーではない遺伝子、例えば、構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子の発現と比較することによって、バイオマーカーの絶対発現レベルを修正することにより正規化される。正規化のための適当な遺伝子は、アクチン遺伝子、または上皮細胞特異的遺伝子のようなハウスキーピング遺伝子を含む。この正規化は、もう１つの試料、例えば、非−癌性試料に対する１つの試料、例えば、被験体試料における発現レベルの比較、あるいは異なる源からの試料の間の比較を可能とする。
別法として、発現レベルは相対的発現レベルとして供することができる。バイオマーカーの相対的発現レベルを測定するために、バイオマーカーの発現のレベルを正常−対−癌細胞単離体の１０以上の試料、好ましくは５０以上の試料につき、問題の試料についての発言レベルの測定に先立って測定する。より多数の試料でアッセイした遺伝子の各々の平均発現レベルを測定し、これをバイオマーカーについてのベースライン発現レベルとして用いる。次いで、テスト試料で測定されたバイオマーカーの発現レベル（発現の絶対レベル）を、バイオマーカーで得られた平均発現値で除する。これにより、相対的発現レベルが供される。
好ましくは、ベースライン測定で用いた試料は同一組織型の癌細胞または正常細胞からのものであろう。細胞源の選択は、相対的発現レベルの使用に基づく。平均発現スコアとして正常な組織と見出された発現の使用は、アッセイされたバイオマーカーが細胞が由来する（ｖｓ 正常細胞）組織に特異的か否かを確証するのを助ける。加えて、より大きなデータが蓄積されると、平均発現値を改正することができ、蓄積されたデータに基づいて、改善された相対的発現値が供される。正常な細胞からの発現データは、癌状態の重傷度を等級分けするための手段を提供する。
もう１つの好ましい実施形態において、バイオマーカーの発現は、被験体試料中の細胞からゲノミックＤＮＡまたはｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（すなわち、転写されたポリヌクレオチド）を調製することによって、およびゲノミックＤＮＡまたはｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを、バイオマーカーを含むポリヌクレオチドの相補体である参照ポリヌクレオチド、およびそのフラグメントとハイブリダイズさせることによって評価される。ｃＤＮＡは、所望により、参照ポリヌクレオチドとのハイブリダイズに先立って、種々のポリメラーゼ鎖反応方法のいずれかを用いて増幅することができる。１以上のバイオマーカーの発現は、同様に、定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を用いて検出して、バイオマーカーの発現のレベルを評価することができる。別法として、本発明のバイオマーカーの突然変異または変種（例えば、単一ヌクレオチド多形、欠失等）を検出する多くの公知の方法のいずれかを用いて、被験体における突然変異したバイオマーカーの出現を検出することができる。
関連する実施形態において、試料から得られた転写されたポリヌクレオチドの混合物を、それに固定された本発明のバイオマーカーの少なくとも一部（例えば、少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、５００以上のヌクレオチド残基）に相補的な、または相同なポリペプチドを有する基材と接触させる。もし相補的または相同なポリヌクレオチドが基材上の異なって検出可能（例えば、異なるクロモフォアまたはフルオロフォアを用いて検出可能な、または異なる選択された位置に固定された）であれば、複数のバイオマーカーの発現のレベルを単一基材（例えば、選択された位置に固定されたポリヌクレオチドの「遺伝子」チップマイクロアレイ）を用いて同時に評価することができる。１つの核酸ともう１つの核酸とのハイブリダイゼーションを含むバイオマーカー発現を評価する方法を用いる場合、該ハイブリダイゼーションはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行うのが好ましい。
もう１つの実施形態において、バイオマーカーの発現を評価するための方法の組合せが利用される。
本発明の組成物、キットおよび方法は本発明の１以上のバイオマーカーの発現レベルまたはコピー数の差の検出に依拠するため、バイオマーカーの発現のレベルまたはコピー数は、正常な細胞および癌性細胞のうちの少なくとも１つにおける発現またはコピー数を評価するのに用いる方法の最小検出限界よりも有意に大きいのが好ましい。
３．発現された蛋白質の検出方法
バイオマーカー蛋白質の活性またはレベルは、発現されたポリペプチドを検出するまたは定量することによって検出および／または定量することもできる。ポリペプチドは、当業者によく知られた多数の手段のいずれかによって検出し、定量することができる。これらは電気泳動、毛細管電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散クロマトグラフィー等のような分析的生化学方法、または液体またはゲル沈殿反応、免疫拡散（一重または二重）、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素−結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫経口アッセイ、ウェスタンブロッティング等のような種々の免疫学的方法を含むことができる。当業者であれば、細胞は本発明のバイオマーカーを発現するか否かを決定するのに用いる公知の蛋白質−抗体検出方法を容易に適合させることができる。
本発明のポリペプチドを検出するための好ましい剤は、本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドに結合することができる抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体はポリクローナル、より好ましくはモノクローナルとすることができる。無傷の抗体、またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を用いることができる。プローブまたは抗体に関して、用語「標識された」は、検出可能な物質をプローブまたは抗体へカップリングさせる（すなわち、物理的に連結させる）ことによるプローブまたは抗体の直接的標識、ならびに直接的に標識されるもう１つの試薬での反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識を含むことを意図する。間接的標識の例は、蛍光標識された二次抗体、およびそれが蛍光標識されたストレプトアビジンで検出できるようなビオチンでのＤＮＡプローブの末端−標識を用いる一次抗体の検出を含む。
好ましい実施形態において、抗体は標識され、例えば、放射性−標識され、クロモフォア−標識され、フルオロフォア−標識され、または酵素−標識された抗体である。もう１つの実施形態において、バイオマーカーに対応するオープンリーディングフレームによってコードされる蛋白質、またはその正常な翻訳のち修飾の全てまたは一部を受けたそのような蛋白質のような、バイオマーカーに対応する蛋白質に特異的に結合する抗体誘導体（例えば、基質と、または蛋白質−リガンド対［例えば、ビオチン−ストレプトアビジン］の蛋白質またはリガンドと結合体化した抗体）、または抗体フラグメント（例えば、単一鎖抗体、単離された抗体超可変ドメイン等）が用いられる。
細胞からの蛋白質は当業者によく知られた技術を用いて単離することができる。使用される蛋白質単離方法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、 １９８８、 Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されたものとすることができる。
１つの様式において、抗体、または抗体フラグメントを、ウェスタンブロットまたは免疫蛍光技術のような方法を用いて、発現された蛋白質を検出することができる。そのような使用において、抗体または蛋白質いずれかを固体支持体に固定化するのが一般には好ましい。適当な固相支持体または担体は抗原または抗体に結合することができるいずれの支持体も含む。よく知られた支持体または担体は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩、マグネタイトを含む。
当業者であれば、抗体または抗原に結合するどれくらい多くの他の適当な担体を本発明で用いるそのような支持体に適合することができるかを知っている。例えば、細胞から単離された蛋白質をポリアクリルアミドゲル電気泳動に流すことができ、ニトロセルロースのような固相支持体の固定化することができる。次いで、支持体を適当な緩衝液で洗浄し、続いて、検出可能に標識された抗体で処理することができる。次いで、固相支持体を２回目として緩衝液で洗浄して、未結合抗体を除去することができる。次いで、固体支持体上の結合した標識の量は慣用的な手段によって検出することができる。電気泳動技術を用いる蛋白質を検出する手段は当業者によく知られている（一般に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ（１９８２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、 Ｍ．Ｙ．；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、 （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．参照）。
もう１つの好ましい実施形態において、ウェスタンブロット（イムノブロット）分析を用いて、試料中のポリペプチドの存在を検出し、定量する。この技術は、一般には、分子量に基づいてゲル電気泳動によって試料蛋白質を分離し、分離された蛋白質を（ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化されたナイロンフィルターのような）適当な固体支持体に移し、次いで、ポリペプチドに特異的に結合する抗体と共に試料をインキュベートすることを含む。抗−ポリペプチド抗体は固体支持体上のポリペプチドに特異的に結合する。これらの抗体は直接的に標識することができるか、あるいは別法として、抗−ポリペプチドに特異的に結合する標識された抗体（例えば、標識されたヒツジ抗−ヒト抗体）を用いて引き続いて検出することができる。
より好ましい実施形態において、ポリペプチドはイムノアッセイを用いて検出される。本明細書中で用いるように、イムノアッセイは、分析物に特異的に結合する抗体を利用するアッセイである。かくして、イムノアッセイは、分析物を単離し、標的化し、および定量するための他の物理的または化学的特性の使用とは反対に、ポリペプチドの抗−抗体への特異的結合の検出によって特徴づけられる。
ポリペプチドは多数のよく認められた免疫学的結合アッセイのうちいずれかを用いて検出され、および／または定量される（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号；第４、３７６、１１０号；第４、５１７、２８８号；および第４、８３７、１６８号参照）。一般的なイムノアッセイのレビューについては、Ａｓａｉ（１９９３） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ３７：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｓｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅｒｒ（１９９１） Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第７版も参照されたし。
免疫学的結合アッセイ（またはイムノアッセイ）は、典型的には、「捕獲剤」を利用して、分析物またはポリペプチドまたはサブ配列に特異的に結合させ、しばしばそれを固定化する。捕獲剤は、分析物に特異的に結合する部位である。好ましい実施形態において、捕獲剤はポリペプチドに特異的に結合する抗体である。抗体（抗−ペプチド）は、当業者によく知られた多数の手段のいずれかによって生産することができる。
また、イムノアッセイは、標識剤を利用して、捕獲剤および分析物によって形成された結合複合体に特異的に結合させ、それを標識する。標識剤は、それ自体、抗体−分析物複合体を含む部位の１つであり得る。かくして、標識剤は標識されたポロペプチドまたは標識された抗−抗体であり得る。別法として、標識剤は、抗体／ポリペプチド複合体に特異的に結合する、もう１つの抗体のような、第３の部位であり得る。
１つの好ましい実施形態において、標識剤は標識を担う第２のヒト抗体である。別法として、第２の抗体は標識を欠いてもよいが、今度は、第２の抗体が由来する種の抗体に特異的な標識された第３の抗体によって結合され得る。第２の抗体は、酵素−標識ストレプトアビジンのような、第３の標識された分子が特異的に結合することのできる検出可能な部位、例えば、ビオチンで修飾することができる。
プロテインＡまたはプロテインＧのような免疫グロブリン定常領域に特異的に結合することができる他の蛋白質を標識剤として用いることもできる。これらの蛋白質はストレプトコッカス細菌の細胞壁の通常の構成成分である。それらは、種々の種からの免疫グロブリン定常領域との強い非−免疫原性反応性を呈する（一般に、Ｋｒｏｎｖａｌ、 ｅｔ ａｌ．（１９７３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１１：１４０１−１４０６、 およびＡｋｅｒｓｔｒｏｍ（１９８５） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５：２５８９−２５４２参照）。
前記したように、ポリペプチドの検出および／または定量のためのイムノアッセイは、当業者によく知られた広く種々の様式を取ることができる。
ポリペプチドを検出するための好ましいイムノアッセイは競合的または非競合的である。非競合的イムノアッセイは、捕獲された分析物の量が直接的に測定されるアッセイである。１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいては、例えば、捕獲剤（抗−ペプチド抗体）を固体基材に直接的に結合させることができ、そこでそれらは固定化される。次いで、これらの固定化された抗体はテスト試料に存在するポリペプチドを捕獲する。かく固定化されたポリペプチドを、次いで、標識を担う第２のヒト抗体のような標識財によって結合させる。
競合アッセイにおいては、試料に存在する分析物（ポリペプチド）の量は、試料に存在する分析物によって捕獲剤（抗−ペプチド抗体）からの置き換えられた（または競合除去された）付加された（外因性）分析物（ポリペプチド）の量を測定することによって間接的に測定される。１つの競合アッセイにおいては、この場合はポリペプチドの既知の量を試料に加え、次いで、試料を捕獲剤と接触させる。抗体に結合したポリペプチドの量は、試料に存在するポリペプチドの濃度に逆比例する。
１つの特に好ましい実施形態において、抗体を固体基材に固定化させる。抗体に結合したポリペプチドの量は、ポリペプチド／抗体複合体に存在するポリペプチドの量を測定することによって、あるいは別法として、残存する未複合体化ポリペプチドの量を測定することによって決定することができる。ポリペプチドの量は標識されたポリペプチドを供することによって検出することができる。
本発明のアッセイは、当業者によく知られた標準的な方法に従い（ポリペプチドの正または負または量として）スコア取りされる。スコアリングの特定の方法は、アッセイ様式および標識の選択に依存するであろう。例えば、ウェスタンブロットアッセイは、酵素標識によって生じた着色産物を可視化することによってスコア取りすることができる。正しい分子量における明らかに目に見える着色バンドまたはスポットは正の結果としてスコア取りされ、他方、明らかに目に見えるスポットまたはバンドの不存在は負としてスコア取りされる。バンドまたはスポットの強度はポリペプチドの定量的尺度を供することができる。
本明細書中に記載された種々のイムノアッセイで用いる抗体は本明細書中に記載したように生産することができる。
もう１つの実施形態において、レベル（活性）は遺伝子産物の酵素活性を測定することによってアッセイされる。酵素の活性をアッセイする方法は当業者によく知られている。
バイオマーカー蛋白質の検出のためのイン・ビボ技術は、蛋白質に対して向けられた標識抗体を被験体に導入することを含む。例えば、抗体を、被験体におけるその存在および位置を標準的なイメージング技術によって検出することができる放射性バイオマーカーで標識することができる。
本発明の方法によって同定されるある種のバイオマーカーは分泌された蛋白質であり得る。いずれかの特定のバイオマーカー蛋白質は分泌された蛋白質であるか否かを決定するのは当業者にとって単純な事柄である。この決定をなすためには、バイオマーカー蛋白質は、例えば、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞系で発現させ、細胞外流体を収拾し（例えば、蛋白質と特異的に結合する標識抗体を用いて）細胞外流体中の蛋白質の存在または不存在を評価する。
以下に、蛋白質の分泌を検出するのに用いることができる方法の例を挙げる。約８×１０５２９３Ｔ細胞を、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２、９５％空気雰囲気下で、増殖培地（１０％胎児ウシ血清を補足したダルベッコの修飾イーグル培地［ＤＭＥＭ］）を含有するウェル中で３７℃にて約６０ないし７０％密集までインキュベートする。次いで、ウェル当たり蛋白質をコードする発現ベクターを含む２マイクログラムのＤＮＡ、および１０マイクロリットルのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬカタログ番号１８３４２−０１２）を含む標準トランスフェクション混合物を用いてトランスフェクトする。トランスフェクション混合物を約５時間維持し、次いで、新鮮な増殖培地で置き換え、空気雰囲気中で維持する。各ウェルを、メチオニンまたはシステインを含有しないＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−ＭＣ；ＩＣＮカタログ番号１６−４２４−５４）で２回温和にすすぐ。約１ミリリットルのＤＭＥＭ−ＭＣおよび約５０マイクロキュリーのトランス−３５ＳＴＭ試薬（ＩＣＮカタログ番号５１００６）を各ウェルに加える。ウェルを前記した５％ＣＯ２雰囲気下に維持し、選択された時間の間３７℃でインキュベートする。インキュベーションに続き、１５０マイクロリットルの条件培地を取り出し、遠心して、浮遊する細胞およびデブリスを除去する。上積み中の蛋白質の存在は、蛋白質が分泌されることを示す。
被験体試料、例えば、組織、全血、血清、血漿、頬切屑、唾液、脊髄液、尿、糞、胆汁、膵臓液または膵臓組織を含有する試料は、特に、当該細胞が癌性である場合、より特別には該癌が転移性である場合にはその中に細胞を含有し得、かくして、本発明の方法で用いることができることが認識されよう。細胞試料は、もちろん、試料中のバイオマーカーの発現のレベルの評価に先立って、種々のよく知られた収集後の分取および貯蔵技術（例えば、拡散および／または蛋白質抽出、固定、貯蔵、凍結、限外濾過、濃縮、蒸発、遠心等）に付すことができる。かくして、本発明の組成物、キットおよび方法を用いて、それを発現する細胞の表面に表示される少なくとも１つの部分を有する蛋白質に対応するバイオマーカーの発現を検出することができる。いずれかの特定のバイオマーカーに対応する蛋白質が細胞−表面蛋白質を含むか否かを決定するのは当業者にとって単純な事柄である。例えば、免疫学的方法を用いて、全細胞上のそのような蛋白質を検出することができるか、あるいはよく知られたコンピューター−ベースの配列分析方法（例えば、ＳＩＧＮＡＬＰプログラム；Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０：１−６）を用いて、（分泌された蛋白質および少なくとも１つの細胞−表面ドメインを有する蛋白質双方を含めた）少なくとも１つの細胞外ドメインの存在を予測することができる。それを発現する細胞の表面に表示された少なくとも１つの部分を有する蛋白質に対応するバイオマーカーの発現は、（例えば、蛋白質の細胞−表面ドメインに特異的に結合する標識された抗体を用いて）細胞を必ずしも溶解することなく検出することができる。
また、本発明は、生物学的試料、例えば、組織、全血、血清、血漿、頬切屑、唾液、尿、糞、胆汁、膵臓細胞または膵臓組織を含有する試料中の本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の存在を検出するためのキットも含む。そのようなキットを用いて、被験体が癌を罹患しているか、または癌を発症する増大した危険性があるかを判断することができる。例えば、該キットは、生物学的試料中の本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチド、またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することができる標識された化合物または剤、および試料中のポリペプチドまたはｍＲＮＡ（例えば、ポリペプチドに結合する抗体、またはポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに結合するオリゴヌクレオチドプローブ）の量を測定するための手段を含むことができる。キットは、キットを用いて得られた結果を解釈するための指示書を含むこともできる。
抗体−ベースのキットでは、キットが、例えば：（１）本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドに結合する（例えば、固体支持体に付着した）第１の抗体；および、所望により、（２）ポリペプチドまたは第１の抗体いずれかに結合し、結合可能な標識に結合体化された第２の異なる抗体を含むことができる。
オリゴヌクレオチド−ベースのキットでは、キットが、例えば：（１）本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド、または（２）本発明のバイオマーカーに対応する核酸分子を増幅するのに有用なプライマーの対を含むことができる。キットは、例えば、緩衝剤、保存剤、または蛋白質安定化剤を含むこともできる。キットは、さらに、検出可能な標識（例えば、酵素または基質）を検出するのに必要な成分を含むことができる。また、キットは、アッセイすることができ、テスト試料と比較することができる対照試料または一連の対照試料を含有することもできる。キットの各成分は、個々の容器内に封入することができ、種々の容器の全てが、該キットを用いて行われるアッセイの結果を解釈するための指示書と共に単一パッケージ内に入れることができる。
４．構造の改変を検出するための方法
本発明は、癌試料中のバイオマーカーの構造的改変、例えば、突然変異または対立遺伝子変種を、正常な、例えば、対照試料中のバイオマーカーの構造的改変、例えば、突然変異と比較することによって、被験体が癌を罹患しているか、または癌を発症する危険性があるかを評価する方法も提供する。癌試料中のバイオマーカーにおける構造的改変、例えば、突然変異または対立遺伝子変種の存在は、被験体が癌を罹患していることを示す。
好ましい検出方法は、多形部位と重複し、かつ多形領域の周りに約５、１０、２０、２５または３０ヌクレオチドを有するプローブを用いる対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションである。本発明の好ましい実施形態において、対立遺伝子変種に特異的にハイブリダイズできる数個のプローブを固相支持体、例えば、「チップ」に付着させる。オリゴヌクレオチドはリソグラフィーを含めた種々のプロセスによって固体支持体に結合させることができる。例えば、チップは２５０，０００までのオリゴヌクレオチドを保持することができる（ＧｅｎｅＣｈｉｐ、 ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＴＭ）。「ＤＮＡプローブアレイ」とも言われるオリゴヌクレオチドを含めるこれらのチップを用いる突然変異検出分析は、例えば、Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ７：２４４に記載されている。１つの実施形態において、チップは、遺伝子の少なくとも１つの多形領域の全ての対立遺伝子変種を含む。次いで、固相支持体をテスト核酸と接触させ、特異的プローブに対するハイブリダイゼーションを検出する。従って、１以上の遺伝子の多数の対立遺伝子変種の同一性は試料ハイブリダイゼーション実験で同定することができる。例えば、５’上流調節エレメントにおけるヌクレオチド多形の対立遺伝子変種の同一性は、単一ハイブリダイゼーション実験で測定することができる。
他の検出方法においては、対立遺伝子変種を同定するに先立ってバイオマーカーの少なくとも１つの部分をまず増幅する必要がある。増幅は、当該分野で公知の方法に従い、例えば、ＰＣＲおよび／またはＬＣＲ（Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ（１９８９） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０参照）によって行うことができる。１つの実施形態において、細胞のゲノミックにＤＮＡを、必要量の増幅されたＤＮＡを生じるのに十分な多数のサイクルの間、２つのＰＣＲプライマーおよび増幅に曝露する。好ましい実施形態においては、プライマーは１５０および３５０塩基対離して一致させる。
代替増幅方法は：自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ、 Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ、 Ｄ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ、 Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（１９８８） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）および自己−維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：１８７４）、および核酸ベースの配列増幅（ＮＡＢＳＡ）、またはいずれかの他の核酸増幅方法、引き続いての、当業者によく知られた技術を用いる増幅された分子の検出を含む。これらの検出スキームはもし核酸分子が非常に低い数で存在するならば、該分子の検出で特に有用である。
１つの実施形態において、当該分野で知られた種々の配列決定反応のいずれかを用いて、試料配列の配列を対応する参照（対照）配列と比較することによって、バイオマーカーの少なくとも一部を直接的に配列決定し、対立遺伝子変種、例えば、突然変異を検出することができる。例示的な配列決定反応はＭａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７７） ７４：５６０）またはＳａｎｇｅｒ（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ７４：５４６３）によって開発された技術に基づくものを含む。また、質量スペクトロメトリーによる配列決定を含めた、種々の配列決定手法のいずれかを、被験体アッセイ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９５） １９：４４８）を行う場合に利用することができる（例えば、Ｈ．ＫｏｓｔｅｒによるＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｏｒｙなる発明の名称の、米国特許第５，５４７，８３５号および国際特許出願公開番号ＷＯ ９４／１６１０１；Ｈ．ＫｏｓｔｅｒによるＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｏｒｙ Ｖｉａ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎなる発明の名称の、米国特許第５，５４７，８３５号および国際特許出願公開番号ＷＯ ９４／２１８２２、およびＨ．ＫｏｓｔｅｒによるＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｏｒｙなる発明の名称の、米国特許第５，６０５，７９８号および国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３６５１；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ａｄｖ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ ３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８：１４７−１５９参照）。ある実施形態については、核酸塩基の１、２または３のみの出現が、配列決定反応において決定される必要があることは当業者に明らかであろう。例えば、１つのみのヌクレオチドが検出されるＡ−トラック等を行うことができる。
なお他の配列決定方法は、例えば、「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ａ ｍｉｘｅｄ ＤＮＡ−ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｈａｉｎ ｐｒｏｂｅ」なる発明の名称の米国特許第５，５８０，７３２号、および「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」なる発明の名称の米国特許第５，５７１，６７６号に開示されている。
いくつかの場合においては、被験体からのＤＮＡにおけるバイオマーカーの特異的対立遺伝子の存在は、制限酵素分析によって示すことができる。例えば、特異的ヌクレオチド多形の結果、もう１つの対立遺伝子変種のヌクレオチド配列には存在しない制限部位を含むヌクレオチド配列を得ることができる。
さらなる実施形態において、（ヌクレアーゼ、ヒドロキシアミンまたはピペリジンと共に四酸化オスミウムのような）切断剤からの保護を用いて、ＲＮＡ／ＲＮＡ ＤＮＡ／ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロデュプレックスにおけるミスマッチした塩基を検出することができる（Ｍｙｅｒｓ、 ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２）。一般に、「ミスマッチ切断」の技術は、所望により標識されていてもよい対照核酸、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡをハイブリダイズさせることによって形成されたヘテロデュプレックスを供し、バイオマーカー対立遺伝子変種のヌクレオチド配列を、組織試料から得られた試料核酸、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡと比較することによって開始する。二本鎖デュプレックスは、対照および試料ストランドの間の塩基対ミスマッチに基づいて形成されたデュプレックスのようなデュプレックスの一本鎖領域を切断する剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスをＲＮａｓｅで処理することができ、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼで処理して、ミスマッチした領域を酵素的に消化することができる。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスをヒドロキシアミンまたは四酸化オスミウムで、およびピペリジンで処理して、ミスマッチした領域を消化することができる。ミスマッチした領域の消化の後に、次いで、得られた物質を変性トリアクリルアミドゲルでサイズによって分離して、対照および試料核酸が同一のヌクレオチド配列を有するか否か、あるいはいずれのヌクレオチドにおいてそれらが異なるかを決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５参照。好ましい実施形態において対照試料核酸を検出のために標識する。
もう１つの実施形態において、変性高速液体クロマトグラフェイー（ＤＨＰＬＣ）によって対立遺伝子変種を同定することができる（Ｏｅｆｎｅｒ ａｎｄ Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ、 （１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ．５７：Ｓｕｐｐｌ．Ａ２６６）。ＤＨＰＬＣは逆相イオン−対合クロマトグラフィーを用いて、ＰＣＲフラグメント内の特定のヌクレオチド遺伝子座においてヘテロ接合性である個体からの該フラグメントの増幅の間に生じるヘテロデュプレックスを検出する（Ｏｅｆｎｅｒ ａｎｄ Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ（１９９５） Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ．５７：Ｓｕｐｐｌ．Ａ２６６）。一般に、ＰＣＲ産物は注目するＤＮＡを近接挟むＰＣＲプライマーを用いて生じさせる。ＤＨＰＬＣ分析を行い、得られたクロマトグラムを分析して、特異的クロマトグラフェイープロフィールに基づいて塩基対の改変または欠失を同定する（Ｏ’Ｄｏｎｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５２：４４−４９参照）。
他の実施形態において、電気泳動移動度の改変を用いて、バイオマーカー対立遺伝子変種のタイプを同定する。例えば、単一ストランド立体配座多形（ＳＳＣＰ）を用いて、突然変異体および野生型核酸の間の電気泳動移動度の差を検出することができる（Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：２７６６、またＣｏｔｔｏｎ（１９９３） Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ２８５：１２５−１４４；およびＨａｙａｓｈｉ（１９９２） Ｇｅｎｅｔ Ａｎａｌ Ｔｅｃｈ Ａｐｐｌ ９：７３−７９参照）。試料および対照核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントを変性し、再生させる。一本鎖核酸の二次構造は配列に従って変化し、電気泳動移動度における得られた改変は単一塩基の変化さえの検出も可能とする。ＤＮＡフラグメントを標識するか、または標識されたプローブで検出することができる。アッセイの感度は（ＤＮＡよりはむしろ）ＲＮＡを用いることによって増強させることができ、ここに、二次構造は配列の変化により感受性である。もう１つの好ましい実施形態において、主題の方法はヘテロデュプレックス分析を利用して、電気泳動移動度の変化に基づいて二本鎖ヘテロデュプレックス分子を分離する（Ｋｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ７：５）。
なおもう１つの実施形態において、多形領域の対立遺伝子変種の同一性は、変性剤のグラジエントを含むポリアクリルアミドゲルにおける多形領域を含む核酸の移動を分析することによって得られ、変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いてアッセイされる（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５）。ＤＧＧＥを分析の方法として用いる場合、ＤＮＡを修飾して、例えば、ＰＣＲによって高融解ＧＣ−リッチのＤＮＡのほぼ４０ｂｐのＧＣクランプを加えることによって、それが完全に変性されていないことを確認する。さらなる実施形態において、変性剤グラジエントの代わりにオンドグラジエントを用いて、対照および試料ＤＮＡの移動度の差を同定する（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ ａｎｄ Ｒｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７） Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ ２６５：１２７５）。
２つの拡散の間の少なくとも１つのヌクレオチドの差を検出するための技術の例は、限定されるものではないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー延長などがあげられる。例えば、公知の多形ヌクレオチドが中央に入れられたオリゴヌクレオチドプローブ（対立遺伝子−特異的プローブ）を調製し、次いで、完全なマッチが見出される場合のみハイブリダイゼーションを可能とする条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズさせることができる（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３；Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６２３０；およびＷａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９７９） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．６：３５４３）。そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技術は、バイオマーカーの異なる多形領域における数個のヌクレオチド変化の同時検出で用いることができる。例えば、特異的対立遺伝子変種のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイズする膜に付着させ、次いで、この膜を標識された試料の核酸とハイブリダイズさせる。次いで、ハイブリダイゼーションシグナルの分析は、試料核酸のヌクレオチドの同一性を明らかにするであろう。
別法として、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術を、本発明と組み合わせて用いることができる。特異的増幅用のプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、（増幅が異なるハイブリダイゼーションに依存するように）（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２４３７−２４４８）分子の中央で、または適当な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ延長を妨げまたは低下させることができる（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３） Ｔｉｂｔｅｃｈ １１：２３８；Ｎｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２５０３）場合には１つのプライマーの極端な３’末端において注目する対立遺伝子変種を運ぶことができる。この技術はプローブオリゴ塩基延長では「ＰＲＯＢＥ」とも言われる。加えて、突然変異の領域中に新規な制限部位を導入して、切断ベースの欠失を作り出すのが望ましいであろう（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ６：１）。
もう１つの実施形態において、対立遺伝子変種の同定は、例えば、米国特許第４，９９８，６１７号およびＬａｎｄｅｇｒｅｎ、 Ｕ．ｅｔ ａｌ．、（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０に記載されたオリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）を用いて行う。該ＯＬＡプロトコルは、標的の単一ストランドの境を接する配列にハイブリダイズすることができるように設計された２つのオリゴヌクレオチドを用いる。該オリゴヌクレオチドの１つを分離バイオマーカーに連結し、例えば、ビオチニル化し、他方を検出可能に標識する。もし正確な相補的配列が標的分子で見出されたならば、該オリゴヌクレオチドはそれらの末端が境界を接し、連結基質を生じるようにハイブリダイズするであろう。次いで、連結はアビジンまたはもう１つのビオチンリガンドを用いて標識されたオリゴヌクレオチドが回収されるのを可能とする。Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ、 Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．は、ＰＣＲおよびＯＬＡの属性を組み合わせる核酸検出アッセイを記載している（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ、 Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８７：８９２３−８９２７）。この方法においては、ＰＣＲを用いて標的ＤＮＡの指数関数的増幅を達成し、次いでこれをＯＬＡを用いて検出する。
本発明は、さらに、バイオマーカーにおける単一ヌクレオチド多形を検出する方法を提供する。単一ヌクレオチド多形は不変配列の領域によって近接挟まれる変異の部位を構成するため、それらの分析は、変異の部位に存在する単一ヌクレオチドの同一性の決定を超えるものは必要とせず、各被験体についての完全な遺伝子配列を決定する必要はない。数個の方法が、そのような単一ヌクレオチド多形の分析を容易にするために開発されている。
１つの実施形態において、単一塩基多形は、例えば、Ｍｕｎｄｙ、 Ｃ．Ｒ．（米国特許第４，６５６，１２７号）に開示されているように、特殊化されたエキスヌクレアーゼ−抵抗性ヌクレオチドを用いることによって検出することができる。該方法に従って、多形部位からすぐに３’側の対立遺伝子配列に相補的なプライマーを、特定の動物またはヒトから得られた標的分子にハイブリダイズさせる。もし標的分子上の多形部位が、存在する特定のエキソヌクレアーゼ−抵抗性ヌクレオチド誘導体に相補的なヌクレオチドを含有すれば、その誘導体は、ハイブリダイズされたプライマーの末端に取り込まれるであろう。そのような取り込みがプライマーをエキソヌクレアーゼに対して抵抗性とし、それにより、その検出を可能とする。試料のエキソヌクレアーゼ−抵抗性誘導体の同一性は知られているため、プライマーがエキソヌクレアーゼに対して抵抗性となったという知見は、標的分子の多形部位に存在するヌクレオチドが反応で用いたヌクレオチド誘導体のそれに相補的であったことを明らかとする。この方法は、大量の外来性配列データの測定を必要としない利点を有する。
本発明のもう１つの実施形態において、多形部位のヌクレオチドの同一性を決定するために溶液−ベースの方法を用いる（Ｃｏｈｅｎ、 Ｄ．ｅｔ ａｌ．のフランス特許第２，６５０，８４０号；ＰＣＴ出願ＷＯ ９１／０２０８７）。米国特許第４，６５６，１２７号のＭｕｎｄｙの方法におけるように、多形部位の直３’側の対立遺伝子配列に相補的なプライマーを使用する。該方法は、もし多形部位のヌクレオチドに相補的であれば、プライマーの末端に取り込まれるようになるであろう標識されたジデオキシヌクレオチド誘導体を用いてその部位のヌクレオチドの同一性を決定する。
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（遺伝子ビット分析）またはＧＢＡＴＭとして知られた代替方法がＧｏｅｌｅｔ、 Ｐ．ｅｔ ａｌ．によって記載されている（ＰＣＴ出願番号９２／１５７１２）。Ｇｏｅｌｅｔ、 Ｐ．ｅｔ ａｌ．の方法は標識されたターミネーターの混合物、および多形部位の３’側の配列に相補的なプライマーを使用する。取り込まれた標識ターミネーターは、かくして、評価すべき標的分子の多形部位に存在するヌクレオチドによって決定され、それに相補的である。Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（フランス特許第２，６５０，８４０号、ＰＣＴ出願ＷＯ ９１／０２０８７）の方法とは対照的に、Ｇｏｅｌｅｔ、 Ｐ．ｅｔ ａｌ．の方法は、好ましくは、不均一相アッセイであり、そこでは、プライマーまたは標的分子が固相に固定化される。
ＤＮＡ中の多形部位をアッセイするための数個のプライマー−ガイデッドヌクレオチド取り込み手法は記載されている（Ｋｏｍｈｅｒ、 Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．、（１９８９） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７７７９−７７８４；Ｓｏｋｏｌｏｖ、Ｂ．Ｐ．、（１９９０） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３６７１；Ｓｙｖａｎｅｎ、 Ａ．−Ｃ，ｅｔ ａｌ．、（１９９０） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８：６８４−６９２；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ、 Ｍ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１４３−１１４７；Ｐｒｅｚａｎｔ、 Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１：１５９−１６４；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ、 Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９９２） ＧＡＴＡ ９：１０７−１１２；Ｎｙｒｅｎ、 Ｐ．（１９９３） ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１−１７５）。これらの方法は、それらが多形部位における塩基の間を区別するために標識されたデオキシヌクレオチドの取り込みに全てが依拠する点でＧＢＡＴＭとは異なる。そのような様式においては、シグナルは取り込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同一ヌクレオチドの実行において起こる多形の結果、実行の長さに比例するシグナルを得ることができる（Ｓｙｖａｎｅｎ、 Ａ．Ｃ．、 ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ａｍｅｒ． Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：４６−５９）。
バイオマーカーのコーディング領域に位置した多形領域の対立遺伝子変種の同一性を決定させるためには、前記したものよりもさらに他の方法を用いることができる。例えば、突然変異したバイオマーカーをコードする対立遺伝子変種の同定は、例えば、免疫組織化学または免疫沈澱において突然変異体蛋白質を特異的に認識する抗体を用いることによって行うことができる。野生型バイオマーカーまたはバイオマーカーの突然変異した形態に対する抗体は、当該分野で知られた方法に従って調製することができる。
別法として、バイオマーカーリガンドへの結合のようなバイオマーカーの活性を測定することもできる。結合アッセイは当該分野で知られており、例えば、被験体から細胞を得、次いで、標識されたリガンドでの結合実験を行って、蛋白質の突然変異した形態に対する結合が蛋白質の野生型に対する結合と異なるか否かを決定することを含む。
Ｂ．薬理ゲノミクスス
本発明のバイオマーカーの量および／または活性に対する刺激または阻害効果を有する剤またはモジュレーターを個体に投与して、被験体において癌を（予防的または治療的に）処置することができる。そのような処置の関連において、個体の薬理ゲノミクスス（すなわち、個体の遺伝子型および外来性化合物または薬物に対する個体の応答の間の関係の研究）を考えることができる。治療剤の代謝の差は、薬理学的に活性な薬物の用量および血中濃度の間の関係を改変することによって、ひどい毒性または治療的失敗に導きかねない。かくして、個体の薬理ゲノミクススは、個体の遺伝子型の考慮に基づいて予防的または治療的処置についての効果的な剤（例えば、薬物）の選択を可能とする。そのような薬理ゲノミクススをさらに用いて、適当な投与量および治療レジメンを決定することができる。従って、個体における本発明の量、構造および／または活性を測定して、それにより、個体の治療的予防的処置のための適当な剤を選択することができる。
薬理ゲノミクススは、侵された患者における改変された薬物処理および異常な作用による、薬物に対する応答の臨床的に有意な変動を取り扱う。例えば、Ｌｉｎｄｅｒ（１９９７） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４−２６６参照。一般には、ファルマコゲネティック条件の２つのタイプを区別することができる。薬物が身体に作用する方法を改変する単一因子として伝達される遺伝的条件は「改変された薬物作用」と言われる。進退が薬物に作用する方法を改変する単一因子として伝達された遺伝的条件は「改変された薬物代謝」と言われる。これらのファルマコゲネティック条件は稀な欠陥として、または多形としてのいずれかで起こり得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の欠乏は、主な臨床的合併症がオキシダント薬物（抗−マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛剤、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの消費後における溶血である通常の遺伝された酵素病である。
例示的実施形態において、薬物代謝酵素の活性は薬物作用の強度および持続双方の主な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびチトクロームＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多形の発見は、なぜ幾人かの被験体が予測される薬物効果を得ないのか、または標準かつ安全用量の薬物を摂取した後において過剰な薬物応答および深刻な毒性を示すのかに関する説明を提供した。これらの多形は集団において２つの表現型、広範なメタボライザー（ＥＭ）および貧弱なメタボライザー（ＰＭ）で発現される。ＰＭの優勢は異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子はコードに多形であって、数個の突然変異がＰＭで同定されており、その全ては機能的ＣＹＰ２Ｄ６の不存在に導く。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の貧弱なメタボライザーは、それらが標準用量を受け取る場合に、かなり頻繁に過剰な薬物応答および副作用を経験する。もし代謝産物が活性な治療的部位であれば、ＰＭは、そのＣＹＰ２Ｄ６−形成代謝産物モルフィンによって媒介されるコデインの鎮痛効果について示されているように治療的応答を示さないであろう。他の極端は、標準用量に応答しないいわゆる超速メタボライザーである。最近、超速代謝の分子的基礎はＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅によるものと同定されている。
したがって、個体における本発明のバイオマーカーの量、構造および／または活性を測定し、それにより、個体の治療的または予防的処置のための適切な剤を選択することができる。加えて、ファルマコゲネティック研究を用いて、薬物−代謝酵素をコードする多形対立遺伝子の遺伝子型分けを、個体の薬物応答性表現型の同定に適用することができる。この知識が、投与または薬物選択に適用する場合、有害反応または治療的失敗を回避することができ、かくして、して、本発明のバイオマーカーの量、構造および／または活性のモジュレーターで被験体を処置する場合に治療的または予防的効率を増強させることができる。
Ｃ．モニタリング臨床試験
本発明のバイオマーカーの量、構造および／または活性についての剤（例えば、薬物化合物）の影響のモニタリングは、基本的な薬物スクリーニングにおいてのみならず、臨床試験においても適用することができる。例えば、バイオマーカーの量、構造および／または活性に影響する剤の有効性は、癌の治療を受けている被験体の臨床試験においてモニターすることができる。好ましい実施形態において、本発明は、（ｉ）剤の投与に先立って被験体からプレ−投与試料を得：（ｉｉ）プレ−投与試料において本発明の１以上の選択されたバイオマーカーの量、構造および／または活性を検出し；（ｉｉｉ）被験体から１以上の投与後試料を得；（ｉｖ）投与後試料においてバイオマーカーの量、構造および／または活性を検出し；（ｖ）プレ−投与試料におけるバイオマーカーの量、構造および／または活性を投与後試料または複数試料におけるバイオマーカーの量、構造および／または活性と比較し；次いで、（ｖｉ）剤の被験体への投与をそれに従って改変する工程を含む、被験体の剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、蛋白質、ペプチド、抗体、核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、低分子、ＲＮＡ緩衝剤、または他の薬物候補）での処置の有効性をモニターする方法を提供する。例えば、剤の増大した投与は、検出されるよりも高いレベルまでバイオマーカーの量および／または活性を増加させ、すなわち、剤の有効性を増加させるのが望ましくあり得る。別法として、剤の減少した投与は、検出されるよりも低いレベルまでバイオマーカーの量および／または活性を減少させ、すなわち、剤の有効性を減少させるのが望ましくあり得る。
Ｄ．代理マーカー
本発明のバイオマーカーは、病期、特に、膵臓癌、例えば、膵臓腺癌に導く、１以上の疾病または病期に対する、または疾患に対する代理マーカーとして働くことができる。本明細書中で用いるように、「代理バイオマーカー」は、疾患または疾病の不存在または存在に、または疾患または疾病の進行に（例えば、腫瘍の存在または不存在に）相関する目的生化学バイオマーカーである。そのようなマーカーの存在または量は疾患とは独立している。従って、これらのマーカーは、処置の特定のコースが病期または疾病を小さくするのに効果的であるか否かを示すよう働くことができる。代理マーカーは、病期または疾病の存在または程度が標準的な方法（例えば、初期段階腫瘍）を通じて評価するのが困難である場合、または潜在的に危険な臨床的終点に到達する前に疾患進行の評価が望まれる場合に特に用いられる（例えば、心血管病の評価は、代理バイオマーカーとしてのコレステロールレベルを用いてなすことができ、ＨＩＶ感染の分析は、心筋梗塞または充分に発症したＡＩＤＳの望ましくない臨床的結果に充分に先立って、代理バイオマーカーとしてのＨＩＶ ＲＮＡレベルを用いてなすことができる）。当該分野における代理マーカーの使用の例は：Ｋｏｏｍｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｊ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．３５：２５８−２６４；およびＪａｍｅｓ（１９９４） ＡＩＤＳ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｎｅｗｓ Ａｒｃｈｉｖｅ ２０９を含む。
本発明のバイオマーカーはファルマコダイナミックマーカーとしても有用である。本明細書中で用いるように、「ファルマコダイナミックバイオマーカー」は、薬物効果に特異的に相関する目的的生化学バイオマーカーである。ファルマコダイナミックバイオマーカーの存在または量は、薬物がそれに対して投与される病期または疾病に関せず；従って、バイオマーカーの存在または量は被験体における薬物の存在または活性を示す。例えば、ファルマコダイナミックバイオマーカーは、薬物のレベルに関連するその組織において該バイオマーカーが発現されるかまたは転写され、あるいは発現または転写されない点で、生物学的組織における薬物の濃度の批評であり得る。このように、薬物の分布または摂取はファルマコダイナミックバイオマーカーによってモニターすることができる。同様に、ファルマコダイナミックバイオマーカーの存在または量は薬物の代謝産物の存在または量に関連し得、従って、バイオマーカーの存在または量はイン・ビボにおいて薬物の相対的分解速度の指標である。ファルマコダイナミックマーカーは、特に、薬物が低用量で投与される場合に、薬物効果の検出の感度を増加させるのに特に用いられる。少量の薬物でさえ複数ラウンドのバイオマーカー転写または発現を活性化するのに充分であり得るため、増幅されたバイオマーカーは薬物それ自体よりも容易に検出可能な量におけるものであり得る。また、バイオマーカーはバイオマーカーそれ自体の検出のためより容易に検出することができ；例えば、本明細書中で記載された方法を用い、抗体を蛋白質バイオマーカーについての免疫−ベースの検出システムで使用することができ、あるいはバイオマーカー−特異的放射性標識プローブを用い、ｍＲＮＡバイオマーカーを検出することができる。さらに、ファルマコダイナミックバイオマーカーの使用は、可能な直接的観察の範囲を超える薬物処置のための危険なメカニズムベースの予測を提供することができる。当該分野におけるファルマコダイナミックマーカーの使用の例はＭａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．米国特許第６，０３３，８６２号；Ｈａｔｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｅｎｖ．Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．９０：２２９−２３８；Ｓｃｈｅｎｔａｇ （１９９９） Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５６ Ｓｕｐｐｌ．３：Ｓ２１−Ｓ２４；およびＮｉｃｏｌａｕ （１９９９） Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５６ Ｓｕｐｐｌ．３：Ｓ１６−Ｓ２０。
実施例
限定的なものと解釈されるべきでない以下の実施例によって本発明をさらに説明する。本出願を引用して出願されたすべての文献、図面、配列表、特許および公開された特許出願の内容はここに引用して援用する。
実施例１：膵臓腺癌のマウスモデルの創製
Ａ．材料および方法
条件Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆマウス株の作成
ジフテリアトキシン（ＤＴ）に対する陰性選択マーカー、ネオマイシンアセチルトランスフェラーゼ（Ｎｅｏ）、Ｆｒｔ部位およびｌｏｘＰ部位を運ぶｐＫＯＩＩ標的化ベクターにＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子座をサブクローン化した（図７）。胚幹（ＥＳ）細胞をエレクトロポレーションし、標準的な技術によって選択した。ＰｓｔＩ制限酵素および標的化構築体に対して外部である３’フラグメントを用い、クローンをサザン分析によってスクリーニングした（図７）。未分化胚芽細胞注射を標的化クローンで行い、伝達キメラマウスをＣＡＧＧ−Ｆｌｐｅおよびトランスジェニックマウスまで育種して、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ ｌｏｘ対立遺伝子を得た。これらのマウスをＦＶＢ／ｎバックグラウンドで育種した（戻し交配４世代）。マウスをサザン分析および多重ＰＣＲ（プライマーおよび条件が要求に応じて入手可能である）によって遺伝子型分けした。対立遺伝子の機能的テストでは、これらのマウスをＥＩＩＡ−Ｃｒｅの一般的デリーター株（Ｌａｋｓｏ、 Ｍ．、 Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：５８６０−５）に交配し、その結果、サザンブロットによって評価されるようにエクソン２および３が効果的に欠失された。ＭＥＦ単離および培養、Ｃｒｅ−媒介欠失および３Ｔ３アッセイを含めた、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）においてＩｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ対立遺伝子の機能性をテストする方法は記載されているように行った（Ｂａｒｄｅｅｓｙ、 Ｎ．、 ｅｔ ａｌ．（２００２ｂ） Ｎａｔｕｒｅ ４１９：１６２−７）。
マウスコロニー精製
ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄノック−イン株（Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｅ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １５：３２４３−８）およびＰｄｘ１−Ｃｒｅトランスジェニック株（Ｇｕ、Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２９：２４４７−５７）をＩｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウスまで育種して、遺伝子型Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／＋およびＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘを得た。これらの株を交配して、実験コホートを得た。マウスをスロットブロットおよびＰＣＲによって表現型分けした。
組織学および免疫組織化学
組織を１０％ホルマリン中で一晩固定し、パラフィンに包埋した。免疫組織化学では、スライドをキシレンに脱パラフィン化し、エタノール中で順次再水和した。抗原検索を必要とする抗体では、製造業者の支持に従って、Ａｎｔｉｇｅｎ Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（抗原マスク解除溶液）（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いた。スライドを過酸化水素（０．３ないし３％）中でクエンチして、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックし、次いで、自動化緩衝液（Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｂｉｏｍｅｄａ）中で洗浄した。スライドを５％正常血清中で室温にて１時間ブロックした。スライドをブロッキング緩衝液中に希釈された一次抗体と共に４℃にて一晩インキュベートした。アビジン−ビオチンペロキシダーゼ複合体方法（Ｖｅｃｔｏｒ）を用い、スライドをヘマトキシリンで逆染色した。スライドをエタノール中で順次脱水し、キシレンで清浄し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ）で設置した。抗体および希釈はアミラーゼ、１：５００（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、インスリン１：１００（Ｄａｋｏ）、ＴＲＯＭＡ３（サイトケラチン１９） １：１０、およびＥＧＦＲ、１：５０（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）であったＥＧＦＲおよびサイトケラチン染色は抗原マスク解除を必要とした。ビオチニル化ＤＢＡレクチン（Ｖｅｃｔｏｒ）は１：１００で用いた。
一次膵臓腺癌細胞株の樹立および培養
新たに単離された腫瘍検体を滅菌したカミソリの刃でミンチし、ディスパーゼＩＩ／コラゲナーゼ（各々４ｍｇ／ｍＬ）で３７℃にて１時間消化し、次いで、ＲＰＭＩ＋２０％胎児ウシ血清に再度懸濁し、ビトロゲン／フィブロネクチン被覆プレート上に摂取した。細胞をトリプシン処理によって継体した。全ての実験は７世代未満の培養した細胞で行った。
分子分析
各々製造業者に従い、ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ）によって単離し、ＲＱ１ ＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理し、次いで、ＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。ＲＮＡはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて逆転写した。ＰＣＲプライマーは、一連の重複する４００ないし５００ｂｐフラグメントとして全Ｓｍａｄ４およびｐ５３コーディング領域を増幅した。
Ｓｍａｄ４では、プライマー対は以下のものであった：
Figure 0004733644
 （１）（配列番号２）
ｐ５３では、プライマー対は以下のものであった：
Figure 0004733644
 ＰＣＲ産物を、ＰＣＲで用いたプライマーの１つにて直接的配列決定に付した。野生型ＫｒａｓおよびＫｒａｓＧ１２Ｄ突然変異体転写体を区別するためのＲＴ−ＰＣＲ／ＲＦＬＰ分析はプライマー：
Figure 0004733644
 を用いて、野生型および突然変異体転写体双方からの２４３ｂｐ産物を増幅した。野生型対立遺伝子はそうではないが、ＫｒａｓＧ１２Ｄ対立遺伝子はエクソン１中に作成されたＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む。かくして、２４３ｂｐのＰＣＲ産物のＨｉｎｄＩＩＩでの消化により、突然変異体産物のみから２１３ｂｐおよび３０ｂｐバンドが得られる。ウェスタンブロット分析では、プトテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）およびホスファターゼ阻害剤カクテル（キットＩおよびＩＩ， Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の存在下で、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ
１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で組織または細胞ペレットを音波処理した。５０μｇの溶解物を４ないし１２％ビス−トリスＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で解像し、ＰＶＤＦ膜に移した。膜をｐ１６ Ｉｎｋ４ａ（Ｍ−１５６， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｐ５３（Ａｂ−７， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｓｍａｄ４（Ｂ−８， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｐ２１（Ｃ−１９， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｐ１９ Ａｒｆ（Ａｂ−８０， Ａｂｃａｍ）、およびチューブリン（ＤＭ−１Ａ， Ｓｉｇｍａ）につきブロットした。ｐ５３誘導では、１０Ｇｙにおいてセシウム源（カナダ国の原子エネルギー委員会（Ａｔｏｍｉｃ Ｅｎｅｒｇｙ Ｃｏｍｉｓｓｉｏｎ））を用いて細胞を照射し、４時間後に収穫した。活性化されたＲａｓレベルの測定では、製造業者の指示に従ってＲａｓ活性化アッセイキット（Ｕｐｓａｔｅ）を用いた。
定量的リアル−タイムＰＣＲ
ＰＣＲプライマーは、エクソン１を含むＫｒａｓゲノミックＤＮＡの１５４ｂｐ産物を増幅するように設計した。
Figure 0004733644
 定量ＰＣＲは、ＡＢＩ ７７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、ＳＹＢＲ緑色色素（Ｑｉａｇｅｎ）の蛍光の増加をリアル−タイムでモニターすることにとよって行った。データは、比較Ｃｔ方法およびＧＡＰＤＨに対する正規化を用いる相対的定量によって分析した。
Ｂ．結果
膵臓−特異的ＫｒａｓＧ１２Ｄ発現およびＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ欠失を持つマウス株の創製
ヒト膵臓腺癌で遭遇する２つのシグニチャー遺伝病変のユニークかつ協同的な相互作用をモデル化するために、潜在的ＫｒａｓＧ１２Ｄノック−イン対立遺伝子（ＬＳＬ−Ｋｒａｓ）（Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｅ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １５：３２４３−８）および／または条件Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆノックアウト対立遺伝子を生殖系に保有するマウス株を特徴付けた。従前に記載されているように（Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｅ．Ｌ．ｅｔ ａｌ，．，（２００１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １５：３２４３−８）、転写ストッパーエレメントのＣｒｅ−媒介切除に続いて、ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ対立遺伝子を内因性レベルで発現させ、これは、与えられた癌のタイプにつき適当な細胞起源におけるＫｒａｓＧ１２Ｄの指向性発現を助けることができる。条件Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ対立遺伝子（Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ）はエクソン２および３のＣｒｅ−媒介切除を保持するように作成し、それにより、ｐ１６ＩＮＫ４Ａおよびｐ１９ＡＲＦ蛋白質を共に排除した（図７）。この対立遺伝子の性能を遺伝子的に、かつ機能的に評価した：１）Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウスのＥＩＩＡ−Ｃｒｅ構成的デリーター株への交配は予期された欠失産物を持つ子孫を生じ、２）ＩＮＫ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウス胚線維芽細胞は正常なレベルのｐ１６ＩＮＫ４Ａおよびｐ１９ＡＲＦを示し、野生型細胞に対する同様なキネティックスの継体−誘導老化を受け、他方、Ｃｒｅレコンビナーゼをコードするレトロウイルスでのこれらの細胞の感染はｐ１６ＩＮＫ４Ａおよびｐ１９ＡＲＦの発現をなくし、不滅細胞の増殖をもたらし、３）Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウスは野生型マウスに対して同様な腫瘍発生および生命スパンを示した（図７）。これらのデータは、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ対立遺伝子が野生型機能を保持し、Ｉｎｋ４ａおよびＡｒｆ双方をＣｒｅレコンビナーゼ活性によってなるとすることができることを示す。ＫｒａｓＧ１２Ｄ対立遺伝子を発現し、膵臓における条件Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ対立遺伝子の双方のコピーを特異的に欠失するために、全ての膵臓系列（内分泌、外分泌および管細胞）（Ｇｕ， Ｇ．，ｅｔ ａｌ，（２００２） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２９：２４４７−５７）において効果的にｌｏｘＰ−含有対立遺伝子を欠失することが依然示されたＰｄｘ１−Ｃｒｅ導入遺伝子を利用した。
ＫｒａｓＧ１２Ｄはプレ悪性管病巣を刺激する。
ヒト検体の組織病理学的および遺伝的分析は、プレ悪性および悪性膵管病巣についての段階進行モデル、およびそれらの対応する突然変異プロフィールを生じた（図１ａ）。膵臓新形成の開始および進行についてのＫｒａｓＧ１２Ｄの役割を調べるために、Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄマウスのコホールトを作成し、膵臓病理学につき評価した。化合物Ｐｄｘ１−ＣｒｅおよびＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ株は予期されたメンデル比率で生まれ、臨床的弱点の証拠はなかった。３０週の年齢まで（ｎ＝１５）、Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄマウスは疾患健康の外方兆候は示さなかった。それに対応して、これらのマウス（ｎ＝５）における血清グルコース、アミラーゼ、リパーゼ、アルブミンおよび全ビリルビン測定は正常な限界内であり、これは、正常な膵臓の構造および病理学を示す。さらに、組織学的に正常な島、腺房および管は、分析した全ての段階のこれらのマウスの膵臓において明瞭に明らかであった（図１ｂ）。しかしながら、系列的な組織学的概観（９、１２、１８および２６週）は、ヒトＰａｎＩＮｓの強く暗示する膵管病巣を明らかにした。より若いマウスにおいては、細長いムチン状管細胞よりなる小さなＰａｎＩＮ−１病巣のみが検出された（図１ｃ）。１２週までには、より大きなおよびより増殖性の管が認められ（図１ｄ）、これらの変化は年齢と共により顕著となった。２６週においては、膵臓実質の広範な領域が、顕著な繊維状間質によって囲まれたＰａｎＩＮｓによって置き換えられていた（図１ｅ）。ＰａｎＩＮは年齢と共に数およびサイズが増加したが、分析した１５匹のマウスのいずれにおいても侵入的腫瘍は３０週齢まで観察されなかった。腺房細胞区画には新形成の証拠はないが、病巣反応性化成変化が観察され−ＰａｎＩＮによる領域的管閉塞に関連するようである。同様に、いくつかの膵臓島は中程度に拡大したように見えたが、新形成の証拠は示さなかった。これらの区画に対するＫｒａｓＧ１２Ｄ発現の中程度のインパクトは前記した正常な体重獲得および血清化学と合致している。ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２ＤまたはＰｄｘ１−Ｃｒｅ対立遺伝子単独のいずれかを保有するマウスは膵臓の異常性を示さなかった。これらの結果は、ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄおよび異なるＰｄｘ１−Ｃｒｅ対立遺伝子またはｐ４８−Ｃｒｅ対立遺伝子いずれかを保有するマウスの広範な独立した研究に沿うものである（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ， Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３２：１２８−３４）。この研究においては、双方の化合物株は、管組織学を伴う進行性プレ悪性病巣、膵臓腺癌における活性化されたＫＲＡＳに対する開始役割と合致する観察を呈した。
Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆの喪失は膵臓において悪性進行を引き起こす。
Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子座は活性化されたＲａｓ遺伝子の癌潜在能力を拘束すると提唱されており、これは、ヒト癌におけるこれらの遺伝子の合致した突然変異の高い程度、およびイン・ビトロおよびイン・ビボにおける活性化されたＨｒａｓの癌原性を容易とするにおいてＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ喪失の役割に沿った概念である（Ｓｅｒｒａｎｏ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．，（１９９６） Ｃｅｌｌ ８５：２７−３７；Ｃｈｉｎ， Ｌ．，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １１：２８２２−３４；Ｋａｍｉｊｏ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｃｅｌｌ ９１：６４９−５９；Ｒｏｚｅｎｂｌｕｍ， Ｅ．， Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５７：１７３１−４；Ｓｅｒｒａｎｏ， Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｃｅｌｌ ８８：５９３−６０２；Ｒｕａｓ， Ｍ．およびＧ．Ｐｅｔｅｒｓ（１９９８） Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １３７８：Ｆ１１５−７７）。Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２ＤにおけるＰａｎＩｎ病巣の進行の欠如は、膵臓におけるＫｒａｓＧ１２Ｄ発現およびＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ欠失の組合せインパクトの評価を促進した。Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／＋マウスからの全膵臓ＤＮＡのサザンブロットは，Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ対立遺伝子の効果的な欠失を明らかとした（図２ａ）。７週齢まで、各遺伝子型のマウスは臨床的に正常であったが、７および１１週齢の間の全てのＰｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘ動物（ｎ＝２６）は病態となり（図２ｂ，生存曲線）、体重喪失、腹水、黄疸（図２ｃ）、および触知可能腹部塊が共通して示される（表１）。オートプシーは、４ないし２０ｍｍの直径の範囲の固体膵臓腫瘍の存在を明らかとした（図２ｃ，表１）。肉眼的には、これらの腫瘍は不規則なかつはっきりとしない境界を持ち固く、しばしば、隣接する器官および腹膜後腔に接着していた。いくつかの場合において、１を超える区別される腫瘍小節が明らかであり、これは、これらの新生物が性質が多病巣的であり得ることを示す。腫瘍は高度に侵入的であり、しばしば、十二指腸および／または脾臓に関連し、場合によっては、共通胆管を閉塞した（表１）。肝臓および肺転移は肉眼的には明らかでなかった。２１週齢までは、Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／＋およびＰｄｘ１−Ｃｒｅ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘ動物を含めた被験体コホートで腫瘍は観察されなかった。ＫｒａｓＧ１２Ｄの進行の促進においてこの病巣の強力なシネルジーと共に、膵臓におけるＩｎｋ４ａ／Ａｒｆを欠くマウスにおける膵臓癌の不存在は、ＰａｎＩＮｓを誘導し、腫瘍形成の開始相を調節するよりはむしろ、初期段階管新生物の悪性進行を拘束するにおいてＩｎｋ４ａ／Ａｒｆの役割を指摘する。
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 表１：臨床的に危うくされたＰｄｘ１−Ｃｒｅ ＬＳＬ−ＫＲＡＳ ｃＩｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘ動物からのデータ。複数の病巣が存在する場合、腫瘍のサイズは最大の区別される腫瘍節の近似的直径として与える。腫瘍はしばしば大きくかつ侵入的であり、サイズの近似を困難としている。位置はヒト解剖を参照して用いられる頭部、身体および尾については、隣接する器官に対する膵臓腫瘍の相対的関連を示す。「下方膵臓」とは、それについて類似のヒト膵臓組織がない腸に付属するマウス膵臓組織の位置をいう。体重喪失は物理的廃棄および同腹子と比較した減少した体重の兆候によって判断した。黄疸および血液の混じった腹水液はオートプシーを成した臨床的観察であった。侵入／転移は以下のように位置によって示す：十二指腸（Ｄ）、胃（Ｓ）、結腸（Ｃ）、膵臓周囲リンパ節（ＰＮ）、腎臓リンパ節（ＲＮ）、副腎（Ａ）、肝臓（Ｌ）、脾臓（ＳＰ）、腹膜後腔（ＲＰ）、横隔膜（ＤＰ）、静脈（Ｖ）、食道（Ｅ）、特定されていないリンパ節（ＬＮ）、膀胱（ＧＢ）。転移は示した位置に続いて（ｍ）によって示される。
ｐ５３は膵臓において悪性進行を加速する。
Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａｌｏｘ／＋；ｐ５３ｌｏｘ／＋を運ぶマウスは、Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘを運ぶ動物（図２ｂ参照）よりも迅速に病態となり（図９，生存曲線参照）、体喪失、腹水液、黄疸、および触知可能腹部塊が共通して示された。
ネズミ膵臓腫瘍はヒト膵臓腺癌の病理学的特徴を発生反復する。
腫瘍の顕微鏡検査は、よく分化しおよび中程度に分化したヒト膵管腺癌に対して類似性を有するよく形成された腺形態を明らかにした（図２ｄ）。ヒト膵臓腺癌は圧倒的に管マーカーを発現し、内分泌および外分泌マーカーの発現を欠如する（Ｓｏｌｃｉａ， Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ．Ａｒｍｅｄ Ｆｏｒｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｏｎ， Ｄ．Ｃ．）。管表現型に合致して、ネズミ腫瘍の腺成分はサイトケラチン（Ｃｋ）−１９免疫組織化学に対して陽性であり（図２ｇおよびｈ）、ＤＢＡレクチンと反応し（データは示さず）、周期的酸シッフ＋ジアスターゼ（ＰＡＳ＋Ｄ）（図２ｊ）およびアルシャンブルー染色によるムチン含有量を示した。さらに、腫瘍は、陽性三色染色によって示されるように間質コラーゲン沈積を示した（図２ｋ）。各々、腺房およびβ−細胞分化に対するマーカーであるアミラーゼおよびインスリンに対する反応性を示した腫瘍はなかった（図８）。これらの実験腫瘍の組織学的および免疫組織化学プロフィールは、ヒト膵管線癌に対する顕著な類似性を有する。
よく、および中程度に分化した管線癌に加えて、未分化／退形成（肉腫様）腫瘍（図２ｅおよびｆ）の領域はほとんどの場合に観察された。これらの退形成領域は、抗−Ｃｋ−１９抗体およびＤＢＡレクチンとの弱いまたは斑な反応性を示す（図２ｈ，２ｉ）。これらの腫瘍は高有糸***活性、ひどい核異型性および広範な細胞多形態性を呈した。いくつかの腫瘍においては、よく分化した、ないし退形成願主の範囲の数個のブレードの分化が認められた。これらの退形成領域の上皮性質は膜間接合および微小絨毛の存在を明らかとした電子顕微鏡によって確認された。
ネズミ膵臓腺癌の侵入および転移
局所的侵入および転移拡大は、進行したヒト膵臓腺癌の病理学的ホールマークである。Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘ動物に生起する膵臓腫瘍は、十二指腸、胃、肝臓および秘蔵を含めた隣接器官の広範な侵入を示した（表１，図３，ｃ，ｅ）。腹膜後腔および横隔膜の腫瘍侵入も観察された。さらに、リンパ系および血管系の侵入はしばしば検出され、これらの新生物の転移可能性を示唆する観察であった。顕著には腫瘍の腺および退形成成分は共に観察され、侵入腫瘍細胞はＣｋ−１９に 対して陽性に染色されることが示された（図３ｆ）。
これらの病巣の侵入的性質を仮定すれば、サブセットの場合における距離の離れた器官の全身組織学的概観を行った。この概観は、リンパ節（図３ｂ）への転移を明らかとし、場合によっては、肝臓（図３ｄ）への転移を明らかとしたが、肺転移は観察されなかった。転移はしばしば性質が多病巣的であったが、サイズは小さかった。これらのマウスで検出された血管系およびリンパ節の広範な侵入は、それを、組織学的概観がこれらの腫瘍の真の転移性を過小評価するようにする。総じて、転移の分布パターンは、肝臓および局所的リンパ節へ最も普通には拡大するヒト疾患で観察されたものと同様である（Ｓｏｌｃｉａ， Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９５） Ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ．Ａｒｍｅｄ Ｆｏｒｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．）。
Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−Ｋｒａｓ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘ膵臓における加速された悪性トランスフォーメーション
ＫＲＡＳ活性化およびホモ接合性Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ欠乏によって生じたより早い段階の腫瘍発生を良好に理解するために、３、４、５および６週齢において、外方に正常なＰｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−Ｋｒａｓ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘおよびＰｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−Ｋｒａｓ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／＋同腹子についてオートプシーシリーズを行った。全ての年齢において、Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／＋動物は稀なおよび単離されたＰａｎＩＮ−１ａ病巣に関して正常な肉眼的膵臓組織学を呈した。３週において、Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−Ｋｒａｓ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘ動物は一義的に正常な膵臓組織学を有し；しかしながら、この時点においては低グレードの管病巣も全てのマウスで観察された（図４ｂ，ｎ＝６マウス）。低グレードのＰａｎＩＮ病巣に加えて、これらのマウスのうち２匹は悪性管細胞の偶然の病巣をやはり示した。４週までは、これらのマウス（ｎ＝４）は同腹子に対して増大した総数およびより高いグレードの膵臓管病巣を有した（図４ｃ）。さらに、この年齢において初期段階腺癌が検出され、重要なことには、これらの腫瘍はそれらの最も初期の発端から管および退形成形態を共に示した（図４ｄ）。５週において、ほとんどのマウスは小さな多病巣膵臓腺癌を呈したが、限定的なシリーズのセクショニングは、いくつかの動物が進行したＰａｎＩＮを有するに過ぎず、率直な悪性疾患まで未だ進行していないことを明らかとした（図４ｅ）。注目すべきは、数個の場合において、進行したＰａｎＩＮ病巣が侵入的管および退形成腫瘍細胞で囲まれて見出された（図４ｆ）、これは、そのようなＰａｎＩＮ病巣の進行から生起するこれらの腫瘍と合致する観察である。６週齢までは、分析した全てのＰｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；ＩＮｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウスは小さな膵臓腺癌を有し（ｎ＝５）、成体マウスで生起する侵入的腫瘍に似た組織学であった。かくして、一旦開始すれば，Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウスにおける膵臓管病巣は侵入的膵臓腺癌への迅速な組織学的および進行を受けるようである。これらの特徴は、ヒト管腺癌が、ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ機能の喪失に際して悪性疾患に向かって進行する活性化ＫＲＡＳ突然変異を持つＰａｎＩＮ病巣に由来するモデルを支持する。
膵臓腺癌の分子分析
腫瘍の分子分析を行って、ヒト膵臓腺癌において普通に改変された経路の状態を決定した。Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄマウスからの全膵臓溶解物が、年齢にマッチした野生型対照（図５ａ）と比較してＲａｓ−ＧＴＰの中程度の上昇を示し、これは、突然変異体の構成的に活性なＫｒａｓＧ１２Ｄ対立遺伝子の発現に合致する。さらに、Ｒａｓ−ＧＴＰのレベルはＰｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘ腫瘍溶解物において有意に上昇し（図５ａ）、これは、活性化されたＫＲＡＳシグナリング経路が働いたままである、進行した段階の腫瘍においてさえさらに増強され得るが、この増加は、腫瘍−対−正常膵臓において細胞型の改変されたバランスをあるいは反映することができようことを示す。
腫瘍試料のさらなる分子研究は、ネズミ膵臓腺癌に由来する初期継体細胞系を利用して（材料および方法）、汚染正常細胞の存在を回避した。予測されるように、腫瘍細胞系は、ＰＣＲ分析によって測定されるようにＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子座のホモ接合性欠失を示し（図５ｂ）、ｐ１６Ｉｎｋ４ａまたはｐ１９Ａｒｆを発現しなかった（図５ｃ）。次に、Ｓｍａｄ４およびｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子の状態を評価した；進行したヒト膵臓腺癌は、しばしば、ホモ接合性欠失またはＳｍａｄ４の切形突然変異を維持し、その結果、発現が喪失され、ならびにｐ５３ミスセンス突然変異を維持し、その結果、突然変異体蛋白質が安定化する。調べた全ての場合において（ｎ＝１５）、ウェスタンブロットは全長ＳＭＡＤ４蛋白質の頑強な発現を示し（図５ｃ）、ＲＴ−ＰＣＲで生じたオープンリーディングフレームの配列分析は野生型Ｓｍａｄ４配列を明らかとした（材料および方法参照）。加えて、ウェスタンブロット分析は中程度のレベルのｐ５３を明らかとし（図５ｄ）、電離放射線に応答して増大したｐ５３およびｐ２１ＣＩＰ１レベルの誘導を示し（図５ｅ）、これは野生型ｐ５３の機能に合致する。したがって、ＲＴ−ＰＣＲで生じたｐ５３オープンリーディングフレームの配列分析は、全ての検体が野生型ｐ５３状態を有することを確認した。ＫＲＡＳ遺伝子座における遺伝子コピー数の改変は、活性化ＫＲＡＳ突然変異を保有するいくつかの腫瘍の進行に寄与すると考えられる。具体的には、ＫＲＡＳ遺伝子増幅は、ヒト膵臓腺癌を含めたある種のヒト悪性疾患において、およびマウスにおいては数個の腫瘍タイプにおいて起こる（Ｙａｍａｄａ， Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７７：３７０−５；Ｍａｈｌａｍａｋｉ， Ｅ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２０：３８３−９１；Ｌｉｕ， Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９８） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７：２４０３−１１；Ｓｃｈｌｅｇｅｒ， Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（２０００） Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９１：２７−３２；Ｈｅｉｄｅｎｂｌａｄ， Ｍ．，ｅｔ ａｌ，．（２００２） Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ３４：２１１−２３；Ｏ’Ｈａｇａｎ， Ｒ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２：１４９―５５）。加えて、野生型ＲＡＳ対立遺伝子の喪失は、活性化されたＲＡＳによる細胞形質転換を促進することも示されている（Ｂｒｅｍｎｅｒ， Ｒ．ａｎｄ Ａ．Ｂａｌｍａｉｎ（１９９０） Ｃｅｌｌ ６１：４０７−１７；Ｆｉｎｎｅｙ， Ｒ．Ｅ．ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｂｉｓｈｏｐ（１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１５２４−７；Ｚｈａｎｇ， Ｚ．，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２９：２５−３３）。定量的リアル−タイムＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を１５の膵臓癌細胞系に由来するゲノミックＤＮＡで行って、相対的Ｋｒａｓ遺伝子コピー数を評価した（材料および方法参照）。これらの分析は２つの検体における高レベルの増幅を明らかとし、（図５ｆ、上方パネル、レーン１０および１４、各々、６倍および４５倍）；これらの変化は対応する一次腫瘍においても明らかであった（各々、３倍および５．５倍）。加えて、ほぼ２倍の利得が３つの他の検体（図５ｆ、上方パネル、レーン５、６および９）、および対応する一次腫瘍で検出された。いくつかの一次腫瘍検体における増幅の低下した相対的大きさは、汚染間質組織の存在によるものであろう。イムノブロット分析は、高レベルの遺伝子増幅を有した細胞系からの溶解物において顕著なＫｒａｓ発現増加、およびより低いレベルの利得を持つ系からの溶解物において中程度の増加を明らかとした（図５ｆ、下方パネル）。次に、ＲＴ−ＰＣＲ／ＲＦＬＰ分析を使用して、突然変異体または野生型対立遺伝子がこれらの腫瘍で増幅するか否かを評価した。これらの分析は、Ｋｒａｓ増幅を持つ試料における突然変異体ＫｒａｓＧ１２Ｄ転写体に対応するバンドの増大した強度を明らかとし（図５ｇ、レーン２および４）、これは、突然変異体対立遺伝子は特異的に増幅されることを示す。最後に、これらのデータは、野生型Ｋｒａｓ対立遺伝子の発現はやはり全ての主要で保持されることを示し、野生型および突然変異体Ｋｒａｓ対立遺伝子の双方が存在したことを示す（図５ｇおよびデータは示さず）ゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析によって確証された結果である。よって、野生型対立遺伝子の喪失ではなく、活性化されたＫｒａｓの遺伝子増幅は、膵臓における悪性進行に寄与するように見える。
最後に、これらの腫瘍におけるアクセサリーシグナリング経路の状態に取り組んだ。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２／ＮＥＵの活性化および消滅は進化するヒト疾患の特徴である。具体的には、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２／ＮＥＵはＰａｎＩＮ進行において初期に誘導され、管腺癌においては上昇したままであり、他方、ＨＥＲ２／ＮＥＵ発現はより進行した未分化腫瘍においては消滅するようになる（Ｋｏｒｃ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ，（１９９２） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９０：１３５２−６０； Ｄａｙ， Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６） Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ ２７：１１９−２４；Ｆｒｉｅｓｓ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７４：３５−４２）。同様に、マウスモデルにおいては、未分化肉腫様領域（図６ｃおよび６ｄ）においてではなく、腫瘍の腺成分におけるＥＧＦＲ（図６ａ）およびＨＥＲ２／ＮＥＵ（図６ｂ）双方の発現が観察された。このモデルにおいては、増殖シグナリング分子の活性化と共に、Ｓｍａｄ４およびｐ５３突然変異の欠如は、この疾患の生物学においてこれらの経路のさらなる分析の機会を提供する。
Ｋｒａｓ活性化は、マウスにおけるＰａｎＩＮ発生での開始工程であるように見える。Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄマウスにおける普遍的なＫｒａｓＧ１２Ｄ発現に拘わらず肉眼的に正常な膵臓人工物は、さらなる−恐らくは後成−事象がＰａｎＩＮの出現を可能とするよう要求されることを示唆する。同等に、ＫＲＡＳ突然変異が組織学的に正常なヒト膵臓検体で観察されている（Ｌｕｔｔｇｅｓ， Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９９） Ｃａｎｃｅｒ ８５：１７０３−１０）。無傷Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子座の存在下においては、ネズミＰａｎＩＮは、それらの高い多重性にも拘らず、３０週齢まではＰａｎＩＮ−２段階を超えて進行せず、これは、効果的かつ優れたｐ１６ＩＮＫ４Ａおよび／またはｐ１９ＡＲＦ−媒介チェックポイントメカニズムが、活性化された病巣において悪性進行を拘束することを示す。Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子座は、ＰａｎＩＮの進行、および進入性膵臓腺癌の発生の双方を調節するにおいて臨界的である。
６週までの膵臓腺癌の開始、進行した段階までのＰａｎＩＮの先行する迅速な進行、および他の区画における新形成変化の不存在は、Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウスにおけるＰａｎＩＮないし腺癌配列に対する証拠を提供する。同様に、ＰａｎＩＮが異なる管細胞、定住性多能先祖細胞から、あるいは腺房または他の細胞型のトランス分化を介して生起するかを決定することはできない。事実、従前のデータは、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ喪失が成熟神経膠星状細胞のイン・ビボにおける神経膠種細胞への脱分化を可能とし（Ｂａｃｈｏｏ， Ｒ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １：２６９−７７）、したがって、ｐ１６ＩＮＫ４ａ／および／またはｐ１９ＡＲＦがこのモデルにおける進行をブロックするにおいて同様な役割を演じることができることを示した。Ｐｄｘ１プロモーターを介する膵臓発生初期におけるＣｒｅの発現は、全ての膵臓区画におけるＫｒａｓの効果的な活性化を可能とするが、管腫瘍のみが発症することに注意するのは興味深い。Ｋｒａｓ活性化および膵管腫瘍形成のこのユニークな関連は、膵臓のヒト癌に適応できるように見える。というのは、ＫＲＡＳ突然変異は管腺癌において、およびもう１つのタイプの膵臓管悪性腫瘍、管内乳頭ムチン新生物（Ｚ’Ｇｒａｇｇｅｎ， Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７） Ａｎｎ Ｓｕｒｇ ２２６：４９１−８；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ４９８−５００）において検出されるが、腺房細胞腫においては検出されない（Ｔｅｒｈｕｎｅ， Ｐ．Ｇ．， ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ｍｏｌ Ｃａｒｃｉｎｏｇ １０：１１０−４）ためである。したがって、バイアスされないＰｄｘ１−Ｃｒｅシステムは、生理学的レベルにおいては、活性化されたＫｒａｓが管表現型に向けて種々の系列の先祖細胞または分化した細胞を駆動し、あるいはこの癌蛋白質が管区画においてその形質転換効果を単独で発揮できることを示す。これらの問題の正式な解決は、厳しく規定された細胞培養−ベースの系、ならびにより分化した膵臓系列に特異的に標的化されたＣｒｅレコンビナーゼ株への交配を必要とするであろう。
Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウスにおけるＰａｎＩＮの病巣の不存在は、ｐ１６ＩＮＫ４Ａおよびｐ１９ＡＲＦがこれらの最も初期の新形成段階の開始を調節しないことを示唆する。むしろ、Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウスにおけるＰａｎＩＮ病巣の迅速な進行および腺癌の発生は、これらの開始された病巣の悪性トランスフォーメーションを拘束するのにＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子座を必要とすることを示す。開始よりはむしろ進行におけるそのような役割は、ヒトにおけるＰａｎＩＮ−２段階でのＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ喪失の記載されている出現、および生殖系ＩＮＫ４Ａ突然変異を持つファミリーのサブセットで観察された膵臓腺癌の匹敵する開始年齢、および散在性腫瘍で観察されたそれによくフィットする（Ｍｏｓｋａｌｕｋ， Ｃ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．，（１９９７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５７：２１４０−３；Ｗｉｌｅｎｔｚ， Ｒ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８：４７４０−４；Ｌｙｎｃｈ， Ｈ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｃａｎｃｅｒ９４：８４−９６）。活性化されたＫＲＡＳおよびＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ欠乏のイン・共働的相互作用に対するメカニズムの基礎は重要な論点のままである。最近まで、支配的なモデルは、それにより、活性化されたＲＡＳがＭＡＰＫキナーゼの誘導を媒介し，Ｉｎｋ４ａおよびＡｒｆの誘導および引き続いての成長阻止に直接的に導くフィードバックループの存在を提唱していた（Ｓｅｒｒａｎｏ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｃｅｌｌ ８５：２７−３７）。しかしながら、最近の研究は、そのような直接的ループは、活性化されたＲＡＳの内因性−過剰発現とは反対−レベルに応答して作動しないことを示している（Ｇｕｅｒｒａ， Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ４：１１１−２０）。この遺伝子座の生理学的発現は、恐らくは、インテグリン−細胞外マトリックス相互作用（Ｐｌａｔｈ， Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５０： １４６７−７８；Ｎａｔａｒａｊａｎ， Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００３） Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６３：４７７−９１）および***刺激体（Ａｌａｎｉ， Ｒ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：７８１２−６； Ｏｈｔａｎｉ， Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｎａｔｕｒｅ ４０９：１０６７−７０）のような因子によって媒介された陽性および陰性双方のレギュレーターによって綿密に制御されているように見える。理論に拘束されるつもりはないが、これらの知見は、これらのシグナルのバランスの改変がＰａｎＩＮ病巣で起こるが、正常な膵臓（Ｒａｓ活性化の有りまたは無し）では起こらず、その結果，Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子座が活性化されることを示す。
ヒト膵臓腺癌におけるもう１つの重要な論点は、ＩＮＫ４Ａ−対−ＡＲＦ喪失の相対的な病理学的役割である。ヒトにおいては、ＩＮＫ４Ａ突然変異は疾患素因を決定するようである。というのは、ＩＮＫ４Ａを特異的に標的化するが、ＡＲＦは無しで済ませる散在性および生殖系突然変異の双方があるためである（Ｒｏｚｅｎｂｌｕｍ， Ｅ．，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５７：１７３１−４；Ｌｉｕ， Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２１：１２８−３２；Ｌａｌ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２７：３５８−６１；Ｌｙｎｃｈ， Ｈ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｃａｎｃｅｒ ９４：８４−９６）。他方、該遺伝子座のホモ接合性欠失を介する−ＡＲＦの喪失は腫瘍の約５０％で起こる（Ｒｏｚｅｎｂｌｕｍ， Ｅ．，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５７：１７３１−４）。注目すべきは、これらのＡＲＦ−欠乏腫瘍のかなりの割合がまたｐ５３突然変異を保有し（Ｒｏｚｅｎｂｌｕｍ， Ｅ．，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５７：１７３１−４）、潜在的に、ｐ５３調節における以外のＡＲＦ喪失の癌遺伝子役割、および／またはＤＮＡ損傷応答（後記参照）に対するｐ５３喪失の特異的役割を反映する。Ｉｎｋ４ａによって、およびＡｒｆによって寄与される特異的腫瘍サプレッサー活性はＰｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄマウスの、この遺伝子座のいずれかの遺伝子が欠乏した遺伝的バックグラウンドへの交配によって解決されるべきである。ｐ５３突然変異がマウス腫瘍モデルにおいて存在しないことは注目に値する。これは、マウスにおいてではなくヒト癌におけるｐ５３の機能を検知するｐ１９ＡＲＦ−独立性ＤＮＡ損傷を不活性化する必要性を反映するであろう。かくして、Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウスにおいては、異常な細胞周期エントリーおよび活性化された癌遺伝子発現のような他のストレスによるｐ５３誘導を中和する−Ａｒｆ欠失は、腫瘍進行においてｐ５３喪失に対して効果的に置き換えることができる。この多様性に対する１つの基礎は、テロメアダイナミックスの交差種差（Ｍａｓｅｒ， Ｒ．Ｓ．ａｎｄ Ｒ．Ａ．ＤｅＰｉｎｈｏ（２００２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：５６５−９）、進化する腫瘍のテロメアチェックポイント応答における（ＡＲＦではなく）ｐ５３の顕著な役割（Ｃｈｉｎ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．，（１９９９） Ｃｅｌｌ ９７：５２７−３８）、およびヒト膵臓腺癌の進行におけるテロメア機能不全の証拠（ｖａｎ Ｈｅｅｋ， Ｎ． Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２００２） Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６１：１５４１−７）であろう。
最後に、データは、一般的には悪性疾患および特殊には膵臓癌の古典的特徴の多くは、ＫＲＡＳ活性化の設定におけるＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ喪失によって発生反復することができるのを示す。ＫＲＡＳ活性化またはＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ喪失単独は局所的侵入および進行した局所的成長を引き起こさないが、組合せは引き起こす。
前記した、癌遺伝子Ｋｒａｓによって指令されたマウスモデルの分析、およびＩｎｋ４／Ａｒｆ腫瘍サプレッサー遺伝子の欠失は、Ｋｒａｓ活性化が膵臓腺癌についての開始する病巣を構成するが、悪性進行については不十分であることを示した。Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子座は開始に寄与しないが、この遺伝子座の一体性は、Ｋｒａｓ誘導病巣の悪性進行を拘束するにおいて臨界的である。これらの研究は、マウスが生じた、Ｋｒａｓ活性化の背景に対するｐ５３、（無傷Ａｒｆと共に）Ｉｎｋ４ａ、Ｓｍａｄ４、およびＬｋｂ１腫瘍サプレッサー、例えば、Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａｌｏｘ／ｌｏｘ；Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；ｐ５３ｌｏｘ／ｌｏｘ；Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；ＳＭＡＤ４ｌｏｘ／ｌｏｘ；Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｌｋｂ１ｌｏｘ／ｌｏｘを分析することによって膵臓腺癌病因において遺伝子相互作用を調べるのに拡大されてきた。データは、１）ｐ５３欠失は、膵臓腺癌の促進においてＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ喪失の必要性を効果的に置き換えることができ、２）Ｉｎｋ４ａ欠失はＫｒａｓ−駆動腫瘍形成を促進するのに不十分であり、３）Ｓｍａｄ４欠失は促進された進入性および転移性腫瘍の成長を促進し、および４）Ｌｋｂ１欠失はＫｒａｓ活性化と共に効果的に協働することを示す。これらの遺伝子モデルシステムは、これらの突然変異体対立遺伝子によって従事される癌遺伝子機構を解剖するのに、およびそれらの活性の代理バイオマーカーを同定するためのプラットフォームを提供する。具体的には、同調腫瘍形成を受けている多数の遺伝子的に同一の動物の利用可能性は、腫瘍形成プロセスの進行段階における検体の単離、ヒト疾患との関連において利用できない機会を可能とする。
実施例２：膵臓腺癌の動物モデルを利用するバイオマーカーの発見
本発明の動物モデルの組織学的および臨床的確証を確立したので、膵臓癌特異的血清バイオマーカーの同定のためのこれらのモデルの適用可能性に取り組んだ。加えて、膵臓腺癌についての段階−特異的バイオマーカーの総括的な同定に対し、Ｓｍａｄ４、ｐ５３、Ｉｎｋ４ａ、Ａｒｆ、およびＬｋｂ１の機能の喪失を含めた、特定の遺伝的病巣に対して特異的なバイオマーカーを開発した。例えば、Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａｌｏｘ／ｌｏｘ；Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；ｐ５３ｌｏｘ／ｌｏｘ；Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；ＳＭＡＤ４ｌｏｘ／ｌｏｘ；Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｌｋｂ１ｌｏｘ／ｌｏｘ。これらのバイオマーカーは、臨床的に無兆候被験体における初期段階の疾患の検出のための、ならびに膵臓癌の種々の段階のための診断のための高度に感受性であり、迅速かつコスト的に有利なスクリーニング方法の開発を可能とするように働く。非−侵入的テスト関連血清分析は、ルーチン的臨床試験の意味で危険性があり得る被験体の迅速な評価を可能とする。
バイオマーカー発見の重要な構成要素は、本発明のモデルシステムにおける膵臓腫瘍の発生および成長をモニターして、系列的血清分析および癌進行との相関を可能とする感受性で、非−侵入的イメージング技術を開発する必要性である。この目的で、進化するネズミ膵臓癌の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）検出に対する最適化されたプロトコルが開発されてきた。さらに、バイオマーカー発見の努力におけるそれらの適当性についての現存のプロテオミックスアプローチを評価する必要性があった。この目的で、中程度の腫瘍負荷を持つマウスからの、および対照同腹子マウスからの血清を単離した。血清検体は、Ｅｐｒｏｇｅｎ ＰｒｏｔｅｏＳｅｐプラットフォーム、新規な蛋白質発見化学、および高分解能蛋白質分析のための自動分析技術を使用するソフトウエアプラットフォームによって分析した。ＰｒｏｔｅｏＳｅｐは、液体クロマトグラフィー技術を用いて複合体蛋白質系の高分解の２Ｄマップを生じさせるゲル−フリーの全てが液相の蛋白質マッピング技術である。それらのｐＩおよび第二の次元の疎水性分離に基づく蛋白質の第一の次元の分離は、各々、ユニークな高速クロマトフォーカシング（ＣＦ）および高分解能逆相ＮＰＳ蛋白質分離カラムを用いて発生される。次いで、試料についての完全な蛋白質プロフィールを提示するＥｐｒｏｇｅｎ’ｓ ＰｒｏｔｅｏＳｅｐ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅを用いて２Ｄ蛋白質マップを作成する。該分析は、各々、腫瘍担持マウスおよび対照マウスからの血清検体の明瞭なクラスタリングを示し、多数の特異的癌−関連蛋白質ピークの存在を明らかにしたマッププロフィールを示した。これらのデータは、バイオマーカー発見プラットフォームとしてのＥｐｒｏｇｅｎ ＰｒｏｔｅｏＳｅｐシステムと組み合わせたネズミ腫瘍モデルの有用性についての明確な原理の証拠として働く。重要なことには、Ｅｐｒｏｇｅｎシステムは、血清検体を９×９６の液体画分に分解し、それは、一旦２Ｄプロットが同定された潜在的バイオマーカーを有すれば、特異的ペプチドの同定用のマススペクトロメトリー分析に容易に従うことができる。当業者であれば、他のクロマトグラフィーアプローチ（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｒｅｓｔ ＰｒｏｔｅｏｍｅＣｈｉｐTM）および（Ｚｙｏｍｙｘサイトカインチップのような）特異的蛋白質チップを使用するもののような、他のプロテオミックスプラットフォームを用いて、同一の結果を達成できることを認識するであろう。
バイオマーカー発見および確証のための具体的なアプローチは以下の通りである：腫瘍−傾向および対照マウスを系列的（毎週の）血清単離およびＭＲＩによるモニタリングに付し；Ｅｐｒｏｇｅｎシステムまたはもう１つのプロテオミックスプラットフォーム、続いて、マススペクトロメトリーによって血清検体をプロファイルして、段階−特異的マーカーの同定を可能とした。抗体はこれらのマーカーに対して生起させる。ヒトにおいてオルトロガス蛋白質をやはり認識する、抗体発生のためのエピトープを選択する。ＥＬＩＳＡ−ベースのアッセイを用い、これらの抗体をヒト診断マーカーとしてのそれらの適用につき評価して、ヒト膵臓癌被験体からの、およびその臨床的追跡が腎臓腺癌の発生を明らかとする展望的研究における被験体からの血清をテストする。
これらの努力は，Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウスにおいて中程度に進行した疾患（確立された悪性腫瘍であるが、隣接する器官の侵入または転移はない）の特異的バイオマーカーを同定した（図１０）。図１１は、Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘモデルにおいて腫瘍進行のタイムラインを示し、検体がこの分析のために収集された時点を示す。
これらの分析に続き、ＬＣ−ＭＳを、直接的に、または血漿検体のトリプシン消化物に対して、またはプレ分画（Ｅｐｒｏｇｅｎまたはレクチン結合）に続いて使用した。インフォーマティックス方法を用い、図１３ＡおよびＢに示すもののように、疾患プロフィール−対−プロフィールノクラスタリンを行い、病期に対する高相関を持つ特異的ペプチドが同定されており、限定されるものではないが、ＨＬＧＳＶＴＡＬＨＶＬ（配列番号：２３）およびＱＥＱＥＲＫＥＫ（配列番号：２４）を含む（図１３Ｂ）。図１３Ａは、共に身分画血漿で同定された、テロメラーゼ−関連蛋白質および蛋白質ＡＮＫＴの癌−特異的発現を示す。核小体紡錘−関連蛋白質（ＮｕＳＡＰ）としても知られたＡＮＫＴは、紡錘微小管組織化において非常に重要であり、増殖しつつある細胞において選択的に発現される。
実施例３：膵臓腺癌の動物モデルを利用するバイオマーカー発見
ヒト固体腫瘍は、しばしば、広範な染色体再編成を受け、正常な染色体物質およびトランスローケーションの獲得または喪失、または２つの異なる染色体の間の異常な融合に導く、新規なキメラ蛋白質の生産に導く、増幅および欠失を含めた顕著な細胞発生異常を呈する。「ゲノミック不安定性」のこのプロセスは、細胞の染色体物質の一体性を支配する分子メカニズムの破壊を通じて起こり、得られた細胞形成異常は、悪性新生物の病因に寄与すると考えられる。
ゲノミック不安定性は膵臓腺癌のホールマーク特徴であって、ヒト腫瘍検体の多数の細胞形成実験は、膵臓癌ゲノム内のかなりの数の再発増幅および欠失を示している。これらの遺伝的病巣はこの疾患における多くの潜在的に新規な癌遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子を指摘するが、ヒト膵臓癌における極端なゲノム複雑性のレベルもまた、この新生物の病因に対して最も臨海的である病巣の同定を複雑化する。膵臓癌の信頼性のあるマウスモデルで起こる細胞系異常の研究は、一次的診断および病因重要性を持つヒト腫瘍で起こる事象を同定するのを助けるように価値あるフィルターとして働くことができる。さらに、マウスにおいて対立遺伝子を遺伝子的に操作する能力は、腫瘍形成の間にゲノム不安定性を生じるにおける癌形成病巣のメカニズム的役割に真剣に取り組むのを可能とする。
本発明のＭＣＲを同定するために、新規なｃＤＮＡまたはオリゴマー−ベースのプラットフォームおよびバイオインフォーマティックスツールを利用した。これらの方法は、膵臓癌ゲノム、例えば、膵臓腺癌ゲノムにおけるコピー数改変の高分解能特徴付けを可能とした。
ＭＣＲに到達するには、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイ−ＣＧＨ）を利用して、膵臓腺癌細胞株および腫瘍検体においてコピー数異常（ＣＮＡ）（染色体領域の獲得および喪失）を規定した（例えば、表２）。
（Ｏｌｓｈｅｎ ａｎｄ Ｖｅｎｋａｔｒａｍａｎ， Ｏｌｓｈｅｎ， Ａ．Ｂ．， ａｎｄ Ｖｅｎｋａｔｒａｍａｎ， Ｅ．Ｓ．（２００２） ＡＳＡ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇｓ ２５３０−２５３５； Ｇｉｎｚｉｎｇｅｒ， Ｄ．Ｇ．（２００２） Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ３０，５０３−１２；Ｇｏｌｕｂ， Ｔ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６、 ５３１−７；Ｈｙｍａｎ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２， ６２４０−５；Ｌｕｃｉｔｏ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １３、２２９１−３０５によって記載されたように）データセットからのフィルターノイズに対する生プロフィールのセグメント化分析を行い、これを用いて、データにおける統計学的に有意な変化点を同定した。
ＭＣＲ内の遺伝子座の同定は、以下のように、数個の基本的基準を利用した自動コンピュータアルゴリズムに基づいた：１）ある１００分位数を超えるまたは下回るセグメントを改変されたと同定した；２）もし２以上の改変されたセグメントが５００ＫＢ未満によって分離された単一プロフィールにおいて隣接すれば、セグメントにわたる全領域を改変されたスパンと考えた；３）２０ＭＢより短い高度に改変されたセグメントまたはスパンを、区別される遺伝子座境界を規定するための「情報的スパン」として保持した。より長い領域は捨てなかったが、遺伝子座境界を規定するのに含めなかった；４）情報的スパンを試料を横切って比較して、正の値または負の値のセグメントの重複する群を同定した；各群は遺伝子座を規定する；および５）ＭＣＲが高度に改変されたセグメントの出現をカウントすることによって計算されたピーク再発の少なくとも７５％を有する連続スパンと定義された。もし２つのＭＣＲが唯１つのプローブ位置のギャップによって分離されているならば、それらは合わせた。もし遺伝子座において３を超えるＭＣＲがあれば、全領域は単一の複合体ＭＣＲとして報告した。
サイズに基づく情報的ＣＮＡ、および変化の振れに対する高有意性閾値の達成を規定する遺伝子座−同定アルゴリズムを用いた。次いで、多重プロフィールからの重複するＣＮＡを自動様式に合わせて、その境界がこれらの重複するＣＮＡまでの合わせた物理的拡大を表す、領域的コピー数の変化の区別される「遺伝子座」を規定した。各遺伝子座は、その幅および振幅が最も支配的な増幅の輪郭またはその遺伝子座についての欠失を反映するピークプロフィールによって特徴付けた。さらに、各遺伝子座内で、複数の腫瘍試料を横切って１以上のＭＣＲを同定し、各ＭＣＲは、潜在的に、試料組を横切ってのコピー数改変に標的化された区別される癌−関連遺伝子を保有する。
遺伝子座−同定アルゴリズムは、細胞系および一次腫瘍双方における再発、変化の振幅および表示の点で注釈されたデータセット内で区別されるＭＣＲを規定した。これらの区別されるＭＣＲは、一次腫瘍および細胞系双方における再発高−閾値変化を強調する４つの基準に基づいて並べた。この並べるスキームの実行により、４つの基準のうち少なくとも３つを満足する本発明のＭＣＲを得た（表２参照）。
これらの並べられた遺伝子座に帰せらせる信頼性−レベルは、アレイ−ＣＧＨによって規定されたＸ選択ＭＣＲにて１００％一致を示したリアル−タイム定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）によってさらに確証される。
表２において、遺伝子座およびＭＣＲは「利得および増幅」または「喪失および欠失」いずれかを有するものとして示され、これは、各遺伝子座およびＭＣＲが、癌において、（１）増大したコピー数および／または発現または（２）減少したコピー数および／または発現、または欠失いずれかを有することを示す。さらに、（ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｋｒａｓ２、ＳＭＡＤ４、ＬＫＢ１、およびテロメラーゼのような）膵臓癌の病因において重要な役割を演じることが知られている遺伝子が遺伝子座内に存在し、これは表２にも記載される。
本発明のＭＣＲ内に存在する遺伝子の有意な割合の相補性発現プロフィール分析は、遺伝子量およびｍＲＮＡ発現の間の統計学的に有意な関連を持つバイオマーカーのサブセットを提供する。まだ注釈されていないＭＣＲ内のさらなるバイオマーカーは、本明細書中に記載された癌についてのバイオマーカーとして用いることもでき、本発明に含まれる。
本明細書中に記載されたような、改変されたコピー数の染色体領域を同定する新規な方法は、限定されるものではないが、癌を含めた種々の疾患についての種々のデータ組に適用することができる。限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド−ベースのマイクロアレイ（Ｂｒｅｎｎａｎ， ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ； Ｌｕｃｉｔｏ， ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３：２２９１−２３０５；Ｂｉｇｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１４：２８７−２９５；Ｚｈａｏ， ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６４（９）：３０６０−７１）、および、例えば、（例えば、ＦＩＳＨおよびＦＩＳＨ＋スペクトル核型（ＳＫＹ）のような）ハイブリダイゼーション方法を含めた本明細書中に記載されたた他の方法を含めた他の方法を用いて、コピー数の異常を測定することができる。
Ａ．材料および方法
細胞系および一次腫瘍
全ての一次腫瘍は、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆまたはｐ５３条件腫瘍サプレッサー対立遺伝子いずれかを保有するＰｄｘ−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄマウスから獲得した。マウスに膵臓腺癌を発生させ、低継体細胞系はこれらの腫瘍に由来した。他の条件腫瘍サプレッサー対立遺伝子、例えば、Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａｌｏｘ／ｌｏｘ；Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；ｐ５３ｌｏｘ／ｌｏｘ；Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；ＳＭＡＤ４ｌｏｘ／ｌｏｘ；Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｌｋｂ１ｌｏｘ／ｌｏｘ；を保有するマウスもまた腫瘍を発生させ、これは後に記載するように分析で用いる。
ｃＤＮＡマイクロアレイについてのアレイ−ＣＧＨプロファイリング
製造業者の指示に従って（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌｉｅ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）、細胞系および一次腫瘍からのゲノミックＤＮＡを抽出した。修飾を施した（詳細については、Ａｇｕｉｒｒｅ， Ａ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１， ９０６７−７２参照）公表されたプロトコル（Ｐｏｌｌａｃｋ， Ｊ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．（１９９９ａ） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２３， ４１−４６）に従って、ゲノミックＤＮＡをフラグメント化し、ランダム−プライム標識した．標識されたＤＮＡをヒトｃＤＮＡマイクロアレイまたはオリゴマイクロアレイいずれかにハイブリダイズさせた。該ｃＤＮＡマイクロアレイは、それに対してほぼ１１，２１１のユニークなマップ位置が規定された（ＮＣＢＩ， Ｂｕｉｌｄ ３４）、１３，２８１のマッピング可能なクローンと共に１４，１６０のｃＤＮＡクローン（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｈｕｍａｎ １クローンセット）を含む。マッピングされたエレメントの間のメジアン間隔は７２．７キロ塩基であり；間隔の９４．１％は１Ｍｂ未満であり、９８．９％は３Ｍｂ未満である。該オリゴアレイは２２Ｋのオリゴヌクレオチド（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む。全てのプローブは、ヒト／マウスゲノム配列の最も遅いドラフト（ＮＣＢＩ， Ｂｕｉｌｄ ３４）にてＢＬＡＳＴ整列に付した。ＢＬＡＳＴ結果に基づき、マッピングできないプローブを排除し、これは５５ｂｐ未満のベストヒットの整列長と任意に定義され；およびベストヒットの整列長につき９５％異常の第二のベストヒットスコアを有することによって同定された未−情報的プローブと定義された。これらの基準はヒトアレイについて１６０２２の情報的プローブを選択した。マッピングされたエレメントの間のメジアン間隔は５４．７キロ塩基であり、間隔の９６．７％は１Ｍｂ未満であり、および９９．５％は３Ｍｂ未満である。
アレイのスキャンされたイメージの蛍光比率を計算し、生のアレイ−ＣＧＨプロフィールを処理して、順列を用いて、生のデータにおける変化の点の有意性を決定するセグメント化アルゴリズムを用いてコピー数における統計学的に有意な転移を同定した（Ｏｌｓｈｅｎ， Ａ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ５（４）：５５７−７２）。各セグメントは、含まれるプローブのメジアンであるＬｏｇ２比率が割り当てられた。データは、セグメント化値の分布において最も高いモードが中心であった。モード−センタリングの後、利得および喪失は＋０．１１または−０．１１よりも大またはそれと等しいＬｏｇ２比率と定義され（データの中央５０％変位値の＋／−４標準偏差）、増幅および欠失は、各々、０．４よりも大きな、または−０．４よりも小さな比率と定義された。扁平および腺癌の間の比較は以下のように行った：カスタム−メイドのアルゴリズムを設計して、１つの腫瘍サブタイプにおける試料の少なくとも２５％で０．５のＬｏｇ２比率を超えるが、他のデータセットに存在しないセグメント化データにつき全てのプローブを同定した。欠失については、アルゴリズムは、１つの腫瘍サブタイプにおける試料の少なくとも２５％で０．５のＬｏｇ２比率未満であって、他のデータセットに存在しないセグメント化データについて全てのプローブをサーチした。
自動化遺伝子座定義
遺伝子座は、以下の規則に基づいてセグメント化データに適用された自動化アルゴリズムによって定義される：
１．０．４を超える、または−０．４未満のセグメントを改変されたと同定した。
２．もし２以上の改変されたセグメントは単一プロフィールにおいて隣接するか、あるいは５００ＫＢ未満だけ分離されていれば、セグメントにわたる全領域は改変されたスパンであると考えられた。
３．２０ＭＢよりも短い行動に改変されたセグメントまたはスパンは、区別される遺伝子座境界を定義するために「情報的スパン」として保持された。より長い領域は捨てなかったが、遺伝子座の境界を規定するにおいては含めなかった。
４．情報的スパンを試料を横切って比較して、正−値または負−値セグメントの重複する群を同定し：各群は遺伝子座を規定する。
５．再発率は全群についてのピーク再発についての２５％未満であれば常に重複群を別々の群に分けた。再発率が全群についてのピーク再発の２５％未満であれば常に重複群を別々の群に分けた。再発は、高い閾値における改変を持つ試料の数をカウントすることによって計算した（０．４， −０．４）
６．ＭＣＲは、高度に改変されたセグメントの出現をカウントすることによって計算されたピーク再発の少なくとも７５％を有する連続スパンと定義された。もし２つのＭＣＲが１つのみの位置のギャップによって分離されれば、それらは合わせた。もし遺伝子座において３を超えるＭＣＲがあれば、全領域は単一複合体ＭＣＲとして報告された。
ＭＣＲ特徴付け
各ＭＣＲについては、ピークセグメント値を同定した。利得または喪失の再発は、従前に定義されたより低い閾値に基づいて全ての試料を横切って計算した（〜＋／−０．１１）。セグメント値または長さについての閾値とは独立した再発のさらなる尺度として、増幅された領域については０を超える、欠失された領域については０未満の全てのセグメント価のメジアンを取ることによって、メジアン異常（ＭＡ）を各プローブ位置について計算した。値のこの対を、各試料プロフィールにおいてプローブ標識を独立して順序を入れ替えた後に得られた値の分布に対して比較した。ＭＡの大きさが順序を入れ替えた平均の９５％を超えた場合、該領域は有意に利得されまたは喪失されたと記され、これを優先順位のための投票システムで用いた。公知の遺伝子の数は、ＮＣＢＩにおける２００３年７月ヒトアセンブリーに基づいてカウントする（ビルド３４）。
定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）証明
ＰＣＲプライマーは、標的および対照配列内の１００ないし１５０ｂｐの産物を増幅するように設計される。各細胞系における対照配列についてのプライマーは、アレイ−ＣＧＨ分析によって示されたように正倍数体コピー数の領域内に設計される。定量ＰＣＲは、ＡＢＩ７７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で、ＳＹＢＲ緑色色素（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）の蛍光の増加をリアル−タイムでモニターすることによって行う。相対的遺伝子コピー数は標準曲線方法（Ｇｉｎｚｉｎｅｒ， Ｄ．Ｇ．（２００２） Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ３０，５０３−５１２）によって計算される。遺伝子量の見積もりは、試料内の最も普通のコピー数に対してなされる。ＰＣＲ確証のために、豊富なラインエレメントを、それに対してコピー数に改変を比較すべき参照として用いる。他のデータベースでの以前の経験に基づき（Ａｇｕｉｒｒｅ， Ａ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１， ９０６７−９０７２； Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｃ，ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４，４７４４−４７４８）、（相対的遺伝子量としての）２の閾値を改変のカットオフとして用いる。発現の確証のためには、ＲＮＡ−特異的ＰＣＲプライマーを設計して、エクソンを横切って１００ないし１５０ｂｐの産物を増幅する。
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐについての発現プロファイリング
ビオチニル化標的ｃＲＮＡは、標準的なプロトコル（Ｇｏｌｕｂ， Ｔ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６、 ５３１−５３７）に従って、全試料ＲＮＡから作成し、ヒトオリゴヌクレオチドプローブアレイ（Ｕ１３３Ｐｌｕｓ ２．０， Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）にハイブリダイズさせる。発現値はｄＣｈｉｐ（Ｌｉ， Ｃ．， ａｎｄ Ｗｏｎｇ， Ｗ．Ｈ．（２００１） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８，３１−３６）において正規化し、次いで、各群につき、コホートのメジアンに対してＬｏｇ２比率により標準化する。
積分されたコピー数および発現分析
アレイ−ＣＧＨデータは、各発現値をその対応するコピー数値にマッピングできるように内挿する。各遺伝子位置については、アレイ−ＣＧＨが改変されたコピー数を示すか否かに基づき、あるいは内挿されたＣＧＨ値に基づかないで試料をグループ分けする。発現に対する遺伝子量の効果は、改変されたおよび未改変試料群における発現値の平均の差を、改変されたおよび未改変試料群における発現値の標準偏差の合計で割ったものとして定義される遺伝子重み付けを計算することによって測定される（Ａｇｕｉｒｒｅ， Ａ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１、 ９０６７−９０７２；Ｈｙｍａｎ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２，６２４０−６２４５）。各遺伝子についての重み付けの有意性は、試料標識を１０，０００回並べ直し、０．０５のアルファ閾値を適用することによって見積もられる。
蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
メタ相拡大スライドは標準的なプロトコルに従って調製される（Ｐｒｏｔｏｐｏｐｏｖ， Ａ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ ４，４４３−４４７）。凍結された組織セクション（４μｍ）を製造業者のプロトコルに従って予備処理する（ＦＩＳＨについての凍結組織調製、Ｖｙｓｉｓ， Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ， ＩＬ）。ＦＩＳＨ分析用のプローブは、ビオチン−１４−ｄＡＴＰまたはジコキシゲニン−１１−ｓＵＴＰで、製造業者の指示（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）に従ってニックトランスレーションを用いて標識する。ビオチニル化プローブは、Ｃｙ３−結合体化アビジン（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｗｅｓｔｂｕｒｙ， ＮＹ）を用いて検出する。ジゴケシゲニン−標識プローブについては、抗ジゴキシゲニン−ＦＩＴＣ Ｆａｂフラグメント（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ， ＮＹ）を用いる。スライドを５μｇ／ｍＬの４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（Ｍｅｒｃｋ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）で逆染色し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄアンチフェード培地（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｒｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）に設置する。ＦＩＳＨシグナル獲得およびスペクトル分析は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ（Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）によって開発されたフィルターセットおよびソフトウエアを用いて行う。
膵臓腺癌ゲノムにおける公知および新規ＣＮＡの同定
膵臓腺癌のＫｒａｓＧ１２Ｄ−駆動マウスモデルで起こるゲノム異常を同定するために、アレイ−比較ゲノミックハイブリダイゼーションを利用して、染色体コピー数における異常を包括的に評価した。Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆまたはｐ５３腫瘍サプレッサー対立遺伝子を利用する膵臓腺癌のモデルは本明細書中に記載されたように作成し、アレイ−ＣＧＨによって３５の腫瘍が集合的に分析されている、これらのプロフィールは膵臓腫瘍の生物学および遺伝学に関する価値ある情報の広範なデータベースを含む。まず、ゲノミック不安定性に対するＩｎｋ４ａ／Ａｒｆまたはｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子の不活化の異なるインパクトは、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−突然変異体腫瘍のゲノム複雑性をｐ５３−突然変異体腫瘍のそれと比較した場合に明らかとなった（図１２）。ｐ５３腫瘍サプレッサーにおける突然変異を含む腫瘍は、増大したゲノム不安定性およびより頻繁な細胞形成異常を有する（図１２）。これらの分析は、現在、ＳＭＡＤ４、ＬＫＢ１およびテロメラーゼを含めた他の公知の膵臓癌遺伝子を評価するのに拡大されている。
慣用的バイオインフォーマティックアプローチを利用し、これらのマウス腫瘍のゲノムで起こるコピー数異常の包括的リストが作成された（表２）。表２における欄は以下の記号を有する：Ｃｈｒ， 「染色体」；ＭＣＲ．Ｓｔ．，与えられた改変についての塩基対開始位置；ＭＣＲ．Ｅｎｄ．，同一改変についての塩基対末端位置；ＭＣＲ．Ｗｉｄｔｈ（Ｍｂ）、Ｍｂにおける増幅または欠失のサイズ；Ｐｅａｋ．Ｖａｌ．，ＣＮＡに対してのピークＡＣＧＨ値；Ｒｅｃ．Ａｌｌ，データセットを横切る増幅または欠失の再発；ＭＣＲ．ｇｅｎｅｓ， 増幅または欠失内の遺伝子の数；Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ，増幅または欠失内の既知の候補癌遺伝子または腫瘍サプレッサー遺伝子。
表２におけるＭＣＲのリストは、これらのマウス腫瘍における利得または喪失の全ての領域の列挙を表し、膵臓癌についての病理学的および／または診断および治療的重要性を有し得る遺伝子を含む染色体の位置を概説する。例えば、これらの腫瘍ゲノムにおける利得／増幅の領域内に位置した遺伝子はＲＮＡおよび蛋白質レベルで過剰発現され、かくして、診断バイオマーカーまたは新規な治療標的に対する有効な候補である。
同等物
当業者であれば、高々ルーチン的実験を用いて，本明細書中に記載された発明の特別な実施形態に対する多くの同等物を認識し、または確認することができよう、そのような同等物は以下の請求の範囲に含まれることを意図する。
図１Ａないし１ＥはＰｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄマウスにおいて生起するプレ侵入的管病巣を示す。（Ａ）ヒト膵臓腺癌の遺伝的進行モデル。管新形成病巣の増大するブレードの細胞表現型が示される。以前の研究は、時間的系列で示された、特異的病期における遺伝的改変の存在のカタログを作成した。線の厚みは病巣の頻度に対応する。機能喪失事象は赤色で示し、他方、機能獲得の病巣は緑色で示す。（Ｂ）上方パネル：１２週Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄマウスにおける正常な腺房組織（星印）のバックグラウンドにおける正常な島（矢印）および管（矢の根）を示すＨ＆Ｅ株。隣接する血管（ＢＶ）も示される。下方パネル：単一層立方体様管上皮のより高いパワー図。（Ｃ）９週齢Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄマウス（Ｈ＆Ｅ染色）で検出されるＰａｎＩＮ−１病巣。ムチン様柱状上皮（矢印）および乳頭人工物（ダッシュ線のボックス）を持つＰａｎＩＮ病巣に注意されたし。（Ｄ）１２週齢Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄマウス（Ｈ＆Ｅ染色）における顕著な間質応答（星印）を持つ管増殖（ダッシュ線ボックス）の病巣。（Ｅ）２６週齢（Ｈ＆Ｅ染色）におけるＰｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄマウスの膵臓における親密に会合した線維間質（星印）の古典的なピクチャーを持つ広範なＰａｎＩＮ病巣。 図２Ａないし２Ｋは、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ欠乏は、侵入的膵臓腺癌への進行を促進することを示す。（Ａ）Ｐｄｘ１−Ｃｒｅでの膵臓におけるＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子座の完全な切除。Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ導入遺伝子を保有する、またはそれを欠くＩｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／＋マウスからの膵臓（Ｐ）または脾臓（Ｓ）ＤＮＡについてのＰｓｔＩサザンブロット。野生型またはｌｏｘ対立遺伝子は９．０ｋｂにおいて移動し、組み換えられたＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ−ナル対立遺伝子は４．６ｋｂのバンドに対応する。（Ｂ）Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウス（「Ｉｎｋ／Ａｒｆ Ｌ／Ｌ」で示す：ｎ＝２６マウス）および対照コホート（「ｃｔｒｌ」で示す：Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ、ＬＳＬ−ＫＲＡＳおよびＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ対立遺伝子の全ての組合せ、ｎ＝１８６マウス）についてのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ膵臓無腫瘍生存曲線。臨床的には、瀕死状態で提示されたマウスはオートプシーのために安楽死させた。（Ｃ）共通の胆汁管を閉塞し、膀胱の膨張（＊）を引き起こす膵臓腺癌のグロス写真。黄疸は腹部皮膚（Ｊ）で容易に明らかである。Ｔ＝腫瘍；Ｄ＝十二指腸；Ｌ＝肝臓。棒線＝０．６ｃｍ。ダッシュ線の丸は腫瘍を示す。（Ｄ）７．９週齢のＰｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘ動物で観察されたよく分化した管腺癌。腺腫瘍細胞（矢の根）は豊富な間質によって囲われている（＊）。（Ｅ）パネル（Ｄ）からのそれと同一のマウスにおいて生起した貧弱に分化した腺癌。不規則な悪く形成された腺（矢の根）は高度に有糸***する非典型的な腫瘍細胞の混合物と共に存在する。（Ｆ）（Ｄ）および（Ｅ）と同一のマウスからの肉腫様特徴を持つ腫瘍の領域。（Ｇ）ないし（Ｉ）管マーカー、サイトケラチン−１９につき染色されたよく分化した（Ｇ）、貧弱に分化した（Ｈ）および肉腫様（Ｉ）腫瘍の領域。（Ｊ）よく分化した腫瘍細胞における先端ムチンに対するＰＡＳ＋Ｄ染色。（Ｋ）コラーゲンに対する三色染色は腫瘍間質の線維性質を明らかにする。 図３Ａないし３Ｆは、ネズミ膵臓腫瘍が侵入し、転移するのを示す。（Ａ）膵管腺癌による十二指腸侵入。腫瘍（Ｔ）、筋肉壁（Ｍ、矢の根）および腸上皮（ＩＥ）が示される。（Ｂ）リンパ節転移の高倍率顕微鏡写真（Ｔ、矢の根）。ＬＮは正常なリンパ節人工物を示す。（Ｃ）胃壁（Ｍ、矢の根）に侵入する腫瘍細胞（Ｔ）。隣接する胃上皮が示される（ＧＥ）。（Ｄ）肝臓中の門管内の転移性腫瘍細胞（矢の根）の高パワー顕微鏡写真。肝細胞（Ｈ）、門静脈（ＰＶ）および反応性胆汁管（Ｂ）が示される。（Ｅ）脾臓に侵入する膵臓腫瘍細胞（Ｔ）。脾臓の白い髄が示される（ＷＰ）。（Ｆ）脾臓に侵入するパネルＥにおける腫瘍細胞に対するサイトケラチン−１９についての免疫組織化学染色。インセット：ｃｋ−１９＋侵入腫瘍細胞の高パワーイメージ。 図４Ａないし４ＦはＰｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−Ｋｒａｓ；Ｉｎｋ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘ動物における初期段階膵臓病巣を示す。（Ａ）５週Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／＋動物で見られる低−グレードのＰａｎＩＮ病巣（矢の根）の高倍率図。（Ｂ）３週齢Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウスにおける低−グレードのプレ侵入管病巣。（Ｃ）４週におけるＰｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウスにおける高グレードプレ侵入的管病巣。（Ｄ）４週齢Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウスにおける膵臓腺癌の初期病巣。この初期癌の管および退形成成分双方に注意されたし。（Ｅ）５週Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウスにおける高グレードＰａｎＩＮ病巣。１０μｍ間隔での全膵臓を通じての系列的セクショニングは、この動物において腺癌のいずれの病巣も発見できなかった。（Ｆ）５週Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウスにおける退形成腫瘍細胞によって囲われた高グレードＰａｎＩＮ病巣（星印）。 図５Ａないし５Ｇはネズミ膵臓腺癌の分子分析を示す。（Ａ）Ｒａｓ活性化アッセイ。Ｒａｆ ＲＢＤアガロース（Ｕｐｓｔａｔｅ）で沈殿し、次いで、抗−Ｒａｓ抗体でのイムノブロット分析に付された、野生型膵臓（レーン１および２）、Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ膵臓（レーン３および４）からの、およびネズミ膵臓腺癌（レーン５および６）アフィニティーからの溶解物。（Ｂ）ネズミ膵臓腺癌細胞株におけるＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子座のＰＣＲ分析。Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ＋（下方バンド）、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ（中央バンド）、およびＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ−（上方バンド）対立遺伝子を増幅するプライマーにて、多重ＰＣＲを膵臓癌細胞系からのＤＮＡに対して行った（レーン３ないし１６）。Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ＋／＋（＋／＋、レーン１および１８）およびＩｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘ（Ｌ／Ｌ、レーン２および１７）マウスからのＤＮＡを対照として供した。全ての細胞系はＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ−対立遺伝子のみを示す。（Ｃ）腫瘍溶解物の免疫ブロット分析。膜をｐ１６Ｉｎｋ４ａ、Ｐ１９Ａｒｆ、Ｓｍａｄ４、および（負荷対照としての）β−チューブリンに対して免疫ブロットした。一次マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ、レーン１）からの溶解物を陽性対照として供した。（Ｄ）ｐ５３発現のイムノブロット分析。一次ＭＥＦ（レーン１）およびｐ５３−／−ＭＥＦ（レーン２）は、各々、陽性および陰性対照であった。（Ｅ）イオン化照射による膵臓腺癌細胞におけるｐ５３およびｐ２１の誘導。マウス膵臓癌細胞系は未処理（−）またはガンマ照射（＋）のいずれかであった（レーン１ないし８）。溶解物をｐ５３、ｐ２１およびβ−チューブリンにつきイムノブロットした。突然変異体ｐ５３対立遺伝子（ｐ５３＊）を持つＭＥＦはｐ５３過剰発現についての対照であった。腫瘍は突然変異体安定化ｐ５３を持つ細胞と比較したｐ５３の中程度の発現を示し、その電離放射線はこれらの腫瘍細胞においてｐ５３およびｐ２１を効果的に誘導することができる。（Ｆ）Ｋｒａｓ遺伝子の増幅、および膵臓腺癌のサブセットにおける上昇したＫｒａｓ蛋白質の発現。上方パネルは、定量的リアル−タイムＰＣＲによって測定された相対的Ｋｒａｓ遺伝子コピー数を示す。野生型検体は１．０の比率を有する；（−）行わず。中央および下方パネルは、各々、対応するＫｒａｓレベルおよびチューブリン（ｔｕｂ）負荷対照のウェスタンブロット分析を示す。レーン１は対照ＭＥＦ検体である。レーン２ないし１５は腫瘍細胞系検体である。レーン１０および１４は高レベルＫｒａｓ遺伝子増幅および蛋白質過剰発現を共に示す。（Ｇ）突然変異体Ｋｒａｓ対立遺伝子は、増大したＫｒａｓ遺伝子コピー数を示す腫瘍において増幅される。ＲＴ−ＰＣＲ／ＲＦＬＰ分析を膵臓腺癌細胞株ＲＮＡで行って、野生型およびＫｒａｓＧ１２Ｄ対立遺伝子がＫｒａｓＧ１２Ｄ−特異的ＨｉｎｄＩＩＩ部位に基づいて発現されるか否かを評価した。ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡは未処理（−）であるか、あるいはＨｉｎｄＩＩＩ（＋）で消化した。レーン１ないし１２は腫瘍細胞系である。レーン１３および１４は対照精巣ｃＤＮＡである。全ての腫瘍は双方の対立遺伝子を発現する。図（５Ｆ）中のレーン１０および１４に対応する腫瘍５８および６５（レーン２および４）は、より低いＫｒａｓＧ１２Ｄ対立遺伝子の増大した相対的比率を示し、これは、この突然変異体対立遺伝子の増幅および過剰発現に合致する。 図６Ａないし６Ｄは膵臓腺癌におけるＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の発現を示す。（Ａ、Ｂ）抗−ＥＧＦＲ（Ａ）または抗−ＨＥＲ２（Ｂ）抗体での免疫組織化学は、腫瘍の腺領域におけるこれらの蛋白質の頑強な発現を示す。（Ｃ、Ｄ）ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２に対する免疫組織化学は、これらの腫瘍の貧弱に分化された領域における非常に弱いまたは存在しない発現を明らかにする。（Ｃ）および（Ｄ）は、（Ａ）および（Ｂ）で示されたスライドの隣接領域から写真を撮ったことに注意されたし。 図７Ａないし７Ｄは、Ｉｎｋ４／Ａｒｆ遺伝子座のエクソン２および３の条件標的化を示す。（Ａ）各々、ＡｒｆおよびＩｎｋ４ａのエクソン１βおよび１αは、通常のエクソン２および３のように示される。ｌｏｘＰ部位がエクソン１αおよびエクソン２の間のＥｃｏＲＶの部位に挿入され、Ｆｒｔ部位および単一ｌｏｘＰ部位が近接するネオマイシンカセット（Ｎｅｏ）がエクソン３の３’側ＳｔｕＩ部位に挿入されたＫＯ構築体を用いてＥＳ細胞を標的化した。ジフテリアトキシン遺伝子（ＤＴ）を陰性選択マーカーとして供した。キメラマウスをＣＡＧＧ：Ｆｌｐｅ株に交雑させて、Ｎｅｏをイン・ビボで切り出し、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ対立遺伝子を得た。Ｃｒｅ−媒介切り出しはエクソン２および３のＩｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘを欠失させ、この遺伝子座の双方の産物を破壊する。制限部位はＳｔｕＩ（Ｓ）、ＳｐｅＩ（Ｓｐ）、ＥｃｏＲＶ（Ｅ）およびＰｓｔＩ（Ｐ）である。３’フラグメント（プローブＡ）をＰｓｔＩ制限消化に続いて用いて、組換え体ＥＳ細胞クローンにつきスクリーニングし、Ｃｒｅ−媒介欠失を評価した。（Ｂ）Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウスとＥＩＩａ−Ｃｒｅの一般的欠失株との交雑に続く４．６ｋｂ Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆヌル（−）対立遺伝子の生産を示す、プローブＡとハイブリダイズしたＰｓｔＩ消化ＤＮＡのサザンブロット。野生型対立遺伝子は９ｋｂである。（Ｃ）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）におけるｐ１６Ｉｎｋ４ａおよびｐ１９Ａｒｆ発現のウェスタンブロット。ＭＥＦは２つのＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ＋／＋および２つのＩｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘ胚から調製し、引き続いて、Ｃｒｅを発現するレトロウイルスで感染させる（ＳｉｌｖｅｒおよびＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎ ２００１）（＋、レーン６ないし９）か、または処理しなかった（−、レーン２ないし５）。Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−ＭＥＦ（Ｓｅｒｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．１９９６）を免疫反応性に対する陰性対照として用いた。非−特異的（ｎ．ｓ．）バンドは同等な負荷を示すよう供した。未処理Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘＭＥＦは野生型ＭＥＦに対して匹敵するレベルのｐ１６Ｉｎｋ４ａおよびｐ１９Ａｒｆ発現を示し、他方、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘＭＥＦとしては、Ｃｒｅに曝露されたＭＥＦはいずれの蛋白質も発現しない。（Ｄ）Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘ（ＬＬ）およびＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ＋／＋（＋＋）ＭＥＦはＣｒｅレトロウイルスで感染させ（＋Ｃｒｅ）、または未処理であって、３Ｔ３プロトコルによって系列的継代に付した。Ｃｒｅ−処理Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘ培養は不滅増殖を示し、他方、全ての他の培養は継代−誘導老化を受けた。 図８Ａないし８Ｄは、腺房または島細胞分化のマーカーに対して陰性であるＰｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘ腫瘍株を示す。（ＡおよびＣ）Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウスにおいて生起する同一膵臓腫瘍についての、よく分化した管腺癌（Ａ）および退形成変化の病巣（Ｃ）の領域における腺房マーカーアミラーゼについての免疫組織化学。（Ａ）におけるインセット：腫瘍に隣接する保持された腺房組織における強い抗−アミラーゼ反応性。（ＢおよびＤ）よく分化した管腺癌（Ｂ）および退形成腫瘍細胞（Ｄ）双方における内分泌マーカーインスリンについての免疫組織化学。（Ｂ）におけるインセット：隣接する島における強い抗−インスリン反応性。並んだ管の陰性染色に注意されたし。 図９は、Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａｌｏｘ／＋；ｐ５３ｌｏｘ／＋マウス（四角）および対照コホート（菱形）についてのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ膵臓無腫瘍生存曲線を示す。臨床的には、瀕死状態で提示されたマウスはオートプシーのために安楽死させた。 図１０は、正常−対−膵臓腫瘍担持マウス（ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘマウス）の血清蛋白質プロフィールを示すＥｐｒｏｇｅｎ ＰｒｏｔｅｏＳｅｐシステムからのデータを示す。左側パネルは対照−対−癌担持マウスにおける蛋白質豊富度の差を比較するＰＩ／疎水性プロットを示す。同等な豊富度は白色に見え、腫瘍−関連増大は明るい灰色に見え、正常な動物からのものは暗い灰色である。右側パネルは、対照および腫瘍担持動物における与えられたＰＩおよび異なる疎水性の蛋白質の追跡を示す。高度に発現された蛋白質は膵臓癌に対するバイオマーカーである（矢印）ことに注意されたし。 図１１はＰｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘモデルにおける腫瘍進行のタイムラインを示し、検体がこの分析のために収集された時点を示す。 図１２は、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−対−ｐ５３マウス膵臓腺癌のゲノム複雑性を示す。Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆまたはｐ５３条件腫瘍サプレッサー遺伝子いずれかを保有するＰｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄマウスに膵臓腺癌を発生させ、低継代細胞系はこれらの腫瘍に由来した。これらの細胞系からのゲノムＤＮＡを標準的なプロトコルに従ってアレイ−ＣＧＨによって分析した。Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆまたはｐ５３腫瘍サプレッサー突然変異を保有する腫瘍のゲノム複雑性を密度関数としてプロットし、Ｘ軸はアレイ−ＣＧＨ値に対応する（腫瘍および正常ＤＮＡの間の蛍光比率のＬｏｇ２）。「０」を超えるアレイ−ＣＧＨ値は腫瘍ゲノムの増幅されたまたは獲得されたセグメントに対応し、「０」未満のものは腫瘍ゲノムの失われたまたは欠失されたセグメントに対応する。非常に多数の失われたまたは獲得されたセグメントがｐ５３突然変異を持つ腫瘍で見られる。 図１３Ａおよび１３Ｂは、膵臓腺癌のＰｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘモデルからの血清のプロテオミックスプロファイリングによって同定された、テロメラーゼ−関連蛋白質の、および蛋白質ＡＮＫＴの癌−特異的発現（１３Ａ）、およびこれらの分析で同定された病期と高い相関を持つ特異的ペプチドの配列（１３Ｂ）を示す。 表２である。

Claims (37)

  1. 膵臓特異的プロモーターの制御下で発現されるリコンビナーゼと、該リコンビナーゼの制御下での転写ストッパーエレメントの切り出しにより発現されるＫＲＡＳの活性化突然変異と、該リコンビナーゼの制御下で誤発現される１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座とを含む、膵臓腺癌の非−ヒト動物モデル。
  2. 前記１以上の前記腫瘍サプレッサー遺伝子が条件付で誤発現される、請求項１に記載の非−動物モデル。
  3. ＫＲＡＳの前記活性化突然変異が、ＫｒａｓＧ１２Ｄノック−イン対立遺伝子（ＬＳＬ−Ｋｒａｓ）である、請求項１に記載の非−ヒト動物モデル。
  4. ＫＲＡＳの活性化突然変異が、ＫｒａｓＧ１２Ｄノック−イン対立遺伝子（ＬＳＬ−Ｋｒａｓ）であって、前記腫瘍サプレッサー遺伝子がＩＮＫ４ａ／Ａｒｆである、請求項１に記載の非−ヒト動物モデル。
  5. 前記動物がＰｄｘ１−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘを含む、請求項１に記載の非−ヒト動物モデル。
  6. 前記誤発現が、１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座の減少した発現をもたらす、請求項１に記載の非−ヒト動物モデル。
  7. 前記腫瘍サプレッサー遺伝子が、Ｉｎｋ４ａ／ＡＲＦである、請求項１に記載の非−ヒト動物モデル。
  8. 前記腫瘍サプレッサー遺伝子が、Ｉｎｋ４ａ／ＡＲＦ、Ｉｎｋ４ａ、Ａｒｆ、ｐ５３、Ｓｍａｄ４／Ｄｐｃ、Ｌｋｂ１、Ｂｒｃａ２、およびＭｌｈ１よりなる群から選択される、請求項１に記載の非−ヒト動物モデル。
  9. 前記腫瘍サプレッサー遺伝子が、Ｉｎｋ４ａ／ＡＲＦおよびｐ５３である、請求項１に記載の非−ヒト動物モデル。
  10. 前記１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座が、該腫瘍サプレッサー蛋白質の全てまたは一部をコードするＤＮＡの除去によって破壊される、請求項１に記載の非−ヒト動物モデル。
  11. 前記動物が、１以上の破壊された遺伝子または遺伝子座についてホモ接合性である、請求項１０に記載の非−ヒト動物モデル。
  12. 前記動物が、１以上の破壊された遺伝子または遺伝子座についてヘテロ接合性である、請求項１０に記載の非−ヒト動物モデル。
  13. 前記動物が、前記１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子または遺伝子座のトランスジェニック破壊を有するトランスジェニック動物である、請求項１に記載の非−ヒト動物モデル。
  14. 膵臓および十二指腸ホメオボックス遺伝子１（Ｐｄｘ１）−Ｃｒｅが、前記リコンビナーゼを発現するために使用される、請求項１に記載の非−ヒト動物モデル。
  15. 前記動物がげっ歯類である、請求項１に記載の非−ヒト動物モデル。
  16. 前記げっ歯類がマウスである、請求項１５に記載の非−ヒト動物モデル。
  17. 膵臓腺癌に関連するマーカーについて同定するための方法であって、該方法は、
    対照非ヒト野生型動物からの試料中の遺伝子または蛋白質の発現または活性の存在、非存在またはレベルに対して、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の膵臓腺癌の動物モデルからの試料における遺伝子または蛋白質の量、構造、および／または活性を比較する工程を包含し、
    ここで、該遺伝子または蛋白質の量、構造、および／または活性の差は、該遺伝子または蛋白質が、膵臓腺癌に関連するバイオマーカーであることを示す、方法。
  18. 同定された前記バイオマーカーが診断バイオマーカーである請求項１７記載の方法。
  19. 同定された前記バイオマーカーが予後バイオマーカーである請求項１７記載の方法。
  20. 治療レジメンと組み合わせて発現される薬理ゲノミクスバイオマーカーを同定する方法であって、該方法は、以下：
    対照非ヒト野生型動物由来の試料における遺伝子または蛋白質の発現または活性の存在、非存在、またはレベルに対して、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の膵臓腺癌の動物モデル由来の試料における遺伝子または蛋白質の量、構造、および／または活性を比較する工程を包含し、該動物モデルは治療レジメンを施されており；
    ここで、該動物モデルの試料と該対照試料との間の遺伝子または蛋白質の量、構造、および／または活性の差が、該遺伝子または蛋白質が膵臓腺癌に関連する薬理ゲノミクスバイオマーカーであることを示す、方法。
  21. 前記試料は血液、尿、糞、胆汁、膵臓細胞または膵臓組織を含有する請求項１７または２０記載の方法。
  22. 前記動物モデルが転移性膵臓腫瘍を表示する請求項１７または２０記載の方法。
  23. 前記動物モデルが膵臓腺癌に対して無兆候である請求項１７または２０記載の方法。
  24. 膵臓腺癌に関連するバイオマーカーを同定するための方法であって、該方法は、以下：
    ａ）癌細胞のゲノムのプロファイリングを行う工程であって、該細胞は請求項１〜１６のいずれか１項に記載の膵臓腺癌の動物モデル由来のものである、工程；
    ｂ）工程ａ）で同定されたプロファイルのセグメント化分析を行う工程；
    ｃ）遺伝子座を同定する工程；
    ｄ）該同定された遺伝子座を順位付けする工程；および、
    ｅ）該同定された遺伝子座における遺伝子を問い合わせる工程、
    を包含し、これらにより、膵臓腺癌に関連するバイオマーカーを同定する、方法。
  25. 膵臓腺癌に関連する遺伝子座を同定するための方法であって、該方法は、以下：
    ａ）癌細胞のゲノムのプロファイリングを行う工程であって、該細胞は請求項１〜１６のいずれか１項に記載の膵臓腺癌の動物モデル由来のものである、工程；
    ｂ）工程ａ）で同定されたプロファイルのセグメント化分析を行う工程；
    ｃ）遺伝子座を同定する工程；および、
    ｄ）該同定された遺伝子座を順位付けする工程、
    を包含し、これらにより、膵臓腺癌に関連する遺伝子座を同定する、方法。
  26. 同定された遺伝子座における遺伝子の前記問い合わせ工程が、遺伝子発現データに基づく、請求項２４に記載の方法。
  27. 同定された遺伝子座における遺伝子の前記問い合わせが、インビトロでのスクリーニングアッセイに基づく、請求項２４に記載の方法。
  28. 前記プロファイリングが比較ゲノミックハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を用いて行われる、請求項２４または２５に記載の方法。
  29. 前記癌細胞が、膵臓腺癌細胞株または膵臓腺癌腫瘍に由来する、請求項２４または２５に記載の方法。
  30. 腫瘍−間質共生を変調する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）請求項１〜１６のいずれか１項に記載の膵臓腺癌の動物モデルにテスト化合物を投与する工程；および、
    （ｂ）該動物モデルにおける膵臓腺癌の開始、維持、または進行に対するテスト化合物の効果を測定し、それにより、腫瘍−間質共生を変調する化合物を同定する工程、
    を包含する、方法。
  31. 膵臓腺癌の発生、進行、および／または維持を変調する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）請求項１〜１６のいずれか１項に記載の膵臓腺癌の動物モデルにテスト化合物を投与する工程、ならびに、
    （ｂ）該動物モデルにおける膵臓腺癌の開始、維持、または進行に対するテスト化合物の効果を決定して、それにより、膵臓腺癌の発生、進行、および／または維持を変調する化合物を同定する、方法。
  32. 膵臓腺癌の治療または予防のための潜在的治療剤を評価する方法であって、該方法は、以下：
    ａ）請求項１〜１６のいずれか１項に記載の膵臓腺癌の動物モデルにテスト化合物を投与する工程、ならびに、
    ｂ）該動物モデルにおける膵臓腺癌の開始、維持、または進行に対するテスト化合物の効果を測定し、それにより、膵臓腺癌の治療または予防のための潜在的治療剤を評価する、方法。
  33. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載の膵臓腺癌の動物モデル由来の単離された細胞、または該膵臓腺癌の動物モデル由来の細胞の精製された調製物。
  34. 前記細胞が前記膵臓腺癌の動物モデル由来の膵臓組織から単離されたものである、請求項３３に記載の単離された細胞。
  35. 前記細胞が、上皮、間質、腺房、または管細胞である、請求項３４に記載の単離された細胞。
  36. 前記細胞がトランスジェニック細胞である、請求項３３に記載の細胞。
  37. 前記トランスジェニック細胞がマウス細胞である、請求項３６に記載の細胞。
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