JP4724380B2 - Nucleic acid probe used in nucleic acid measurement method and data analysis method - Google Patents

Nucleic acid probe used in nucleic acid measurement method and data analysis method Download PDF

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Description

本発明は、核酸の測定方法、それに用いる核酸プローブ及びその方法によって得られるデータを解析する方法に関する。詳しくは蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる各種核酸の各種測定方法に関し、蛍光色素で標識された核酸プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせたときに生ずる、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定するという原理に基づく各種核酸の各種新規測定方法、それに用いる核酸プローブ及びデバイス（ｄｅｖｉｃｅｓ）、それら測定方法の一つであるＰＣＲ方法によって得られるデータを解析する方法、解析装置、解析方法の各手段をプログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体に関する。   The present invention relates to a nucleic acid measurement method, a nucleic acid probe used therefor, and a method for analyzing data obtained by the method. Specifically, it relates to various methods for measuring various nucleic acids using nucleic acid probes labeled with fluorescent dyes, and decreases the emission of fluorescent dyes before and after hybridization, which occurs when a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye is hybridized to a target nucleic acid. Various new measurement methods for various nucleic acids based on the principle of measuring the amount, nucleic acid probes and devices used therefor, methods for analyzing data obtained by the PCR method which is one of these measurement methods, analysis devices, and analysis methods The present invention relates to a computer-readable recording medium in which each means is recorded as a program.

従来、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて核酸量を測定する各種方法が知られている。該方法には、以下のようなものがある。
（１）ドットブロッテング法
この方法は、標的核酸と当該核酸プローブをメンブラン上でハイブリダイゼーションさせた後、未反応の核酸プローブを洗い流し、標的核酸とハイブリダイゼーションした核酸プローブに標識された蛍光色素分子のみの蛍光強度を測定するものである。 Conventionally, various methods for measuring the amount of nucleic acid using a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye are known. The method includes the following.
(1) Dot blotting method In this method, the target nucleic acid and the nucleic acid probe are hybridized on the membrane, the unreacted nucleic acid probe is washed away, and the fluorescent dye molecule labeled on the nucleic acid probe hybridized with the target nucleic acid Only the fluorescence intensity is measured.

（２）インターカレーター方法（非特許文献１）：
この方法は、インターカレーターと称されるある種の蛍光色素が核酸の二重鎖内にはまりこんだときに、強く発光するのでその発光の増加量を測定する方法である。その蛍光色素として、例えば、エチジウムブロマイド（非特許文献２）、SYBR R グリーン(Green) I(非特許文献３）を挙げることができる。 (2) Intercalator method (Non-Patent Document 1):
This method is a method of measuring the amount of increase in light emission because a certain type of fluorescent dye called an intercalator emits strong light when it gets stuck in the double strand of a nucleic acid. Examples of the fluorescent dye include ethidium bromide (Non-Patent Document 2) and SYBR® Green I (Non-Patent Document 3).

（３）FRET(fluorescence energy transfer)を利用する方法（非特許文献４）： この方法は、標的核酸にハイブリダイズする二つの核酸プローブからなる。二つの核酸プローブは、各々異なった蛍光色素で標識されている。二つのプローブの内の一方は、ＦＲＥＴ現象を通して、エネルギーを他方のプローブの蛍光色素に送りこれを発光させることができる蛍光色素で標識されている。二つのプローブは、蛍光色素が向き合うように、かつ１〜９塩基離れてハイブリダイズするように設計されている。それで、二つの核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズすると蛍光色素の発光が起こり、発光の程度が標的核酸の複製量に比例する。 (3) Method using FRET (fluorescence energy transfer) (Non-patent Document 4): This method comprises two nucleic acid probes that hybridize to a target nucleic acid. The two nucleic acid probes are each labeled with a different fluorescent dye. One of the two probes is labeled with a fluorescent dye capable of transmitting energy to the fluorescent dye of the other probe through the FRET phenomenon and emitting it. The two probes are designed to hybridize so that the fluorescent dyes face each other and 1-9 bases apart. Thus, when the two nucleic acid probes are hybridized to the target nucleic acid, the fluorescent dye emits light, and the degree of light emission is proportional to the amount of replication of the target nucleic acid.

（４）分子ビーコン方法（非特許文献５）
この方法で使用する核酸プローブは、核酸プローブの一端にレポーター色素、他端にクエンチャー色素が標識さている。そしてその両端部は塩基配列において互いに相補性があるので、プローブ全体としてhairpin stemを形成するように塩基配列が設計されている。その構造のために液中に浮遊している状態では、Forster共鳴エネルギーのため、レポーター色素の発光は、クエンチャー色素により抑制されている。しかし、標的核酸にハイブリダイゼーションするとhairpin stem構造が壊れるために、レポーター色素とクエンチャー色素の距離が大きくなるので、Forster共鳴エネルギーの移動が起こらなくなる。そのために、レポーター色素の発光が起こるようになる。 (4) Molecular beacon method (Non-Patent Document 5)
The nucleic acid probe used in this method is labeled with a reporter dye at one end of the nucleic acid probe and a quencher dye at the other end. Since both ends thereof are complementary to each other in the base sequence, the base sequence is designed so as to form a hairpin stem as a whole probe. Due to Forster resonance energy, the light emission of the reporter dye is suppressed by the quencher dye in a state of floating in the liquid due to its structure. However, when hybridizing to the target nucleic acid, the hairpin stem structure is broken, and the distance between the reporter dye and the quencher dye increases, so that Forster resonance energy does not move. As a result, the reporter dye emits light.

（５）デービスの方法（非特許文献６）
デービスは、オリゴヌクレオチドの３’末端に蛍光色素を、炭素原子１８個を有するスペサーを介して結合したプローブを作成した。これをフローサイトメトリーに適用した。３’末端に蛍光色素を直接に結合した場合より、ハイブリダイゼーションした場合、１０倍の蛍光強度が得られることを報告した。
これらの方法は、核酸の各種測定方法、ＨＩＳＨ方法（fluorescent in situ hybridization assays)、ＰＣＲ方法、ＬＣＲ方法（ligase chain reaction)、SD方法( strand displacement assays)、競合的ハイブリダイゼーション方法(competitive hybridization)などに適用されてめざましい発展をとげている。 (5) Davis method (Non-Patent Document 6)
Davis created a probe in which a fluorescent dye was attached to the 3 ′ end of the oligonucleotide via a spacer having 18 carbon atoms. This was applied to flow cytometry. It has been reported that 10-fold fluorescence intensity can be obtained in the case of hybridization, compared with the case where a fluorescent dye is directly bonded to the 3 ′ end.
These methods include various nucleic acid measurement methods, HISH method (fluorescent in situ hybridization assays), PCR method, LCR method (ligase chain reaction), SD method (strand displacement assays), competitive hybridization method (competitive hybridization), etc. It is applied to and has made remarkable progress.

これらの方法は、現在一般的に使用されいるが、蛍光色素で標識した核酸プローブと標的核酸のハイブリダイゼーション反応を行った後、ハイブリダイゼーションしなかった当該核酸プローブを反応系から洗い流す必要があるという好ましくない手順を有している。このような手順を除くと測定時間の短縮、測定の簡便性、測定の正確性をもたらすことは明らかである。そこで、このような手順を有さない核酸測定方法の開発が望まれていた。   These methods are generally used at present, but after performing a hybridization reaction between a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye and a target nucleic acid, it is necessary to wash away the non-hybridized nucleic acid probe from the reaction system. Has an unfavorable procedure. It is clear that the removal of such procedures leads to a reduction in measurement time, ease of measurement, and accuracy of measurement. Therefore, development of a nucleic acid measurement method that does not have such a procedure has been desired.

Glazer et al., Nature 359:959,1992Glazer et al., Nature 359: 959,1992 実験医学、15巻、7号、46〜51ページ、1997年、羊土社Experimental Medicine, Vol. 15, No. 7, pp. 46-51, 1997, Yodosha LightCyclerTM System；1999年4月5日、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社発行のパンフレットLightCyclerTM System; pamphlet published on April 5, 1999 by Roche Diagnostics Co., Ltd. Mergney et al., Nucleic Acid Res., 22: 920-928,1994.Mergney et al., Nucleic Acid Res., 22: 920-928, 1994. Tyagi et al., Nature Biotech.,14:303-308,1996.Tyagi et al., Nature Biotech., 14: 303-308, 1996. Davis et al.、Nucleic acids Res.24: 702-706、1996Davis et al., Nucleic acids Res. 24: 702-706, 1996

本発明の課題は、前記の状況に鑑み、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる核酸測定方法において、より短時間に、より簡便、より正確に目的の核酸量を測定できる方法を提供することである。   In view of the above circumstances, an object of the present invention is to provide a method for measuring a target nucleic acid amount in a shorter time, more simply and more accurately in a nucleic acid measurement method using a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye. It is.

本発明者らは、前記課題を解決するにあたり、核酸プローブを用いた核酸測定方法について検討を重ねた。その結果、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素の発光が減少するという現象（蛍光消光現象）があり、特定の色素においてはその減少が顕著であり、かつその減少の程度は、蛍光色素が結合した部分の塩基の種類又は塩基配列に依存するということを発見した。本発明はかかる発見に基づいて完成されたものである。   In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have repeatedly studied a nucleic acid measurement method using a nucleic acid probe. As a result, when a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye hybridizes to a target nucleic acid, there is a phenomenon that the emission of the fluorescent dye decreases (fluorescence quenching phenomenon), and the decrease is remarkable in a specific dye, And it was discovered that the degree of the reduction depends on the kind or base sequence of the base to which the fluorescent dye is bound. The present invention has been completed based on such findings.

即ち、本発明は、
１）蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる核酸測定方法において、上記核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、上記核酸プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする核酸の測定方法、また、
２）蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、上記蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、かつ、当該プローブは、その末端部において蛍光色素で標識されており、当該核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、当該末端部において、当該プローブと標的核酸とがハイブリダイゼーションした末端塩基から１ないし３塩基離れて、標的核酸の塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１塩基以上存在するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることを特徴とする核酸測定用核酸プローブ、または、 蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、上記蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、かつ、当該プローブは、その末端部において蛍光色素で標識されており、当該核酸プローブが、標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、当該末端部分においてハイブリダイゼーションの塩基対がＧ（グアニン）とＣ（シトシン）のペアーを少なくも一対以上形成するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることを特徴とする核酸測定用核酸プローブ、また、それらのプローブを用いる核酸測定方法、また、 That is, the present invention
1) In a nucleic acid measurement method using a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye, when the nucleic acid probe is hybridized to a target nucleic acid, the fluorescent dye is a nucleic acid probe that reduces its luminescence, and the nucleic acid probe is used as a target nucleic acid. A method for measuring a nucleic acid, characterized by measuring the amount of decrease in the emission of a fluorescent dye before and after hybridization,
2) When a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye is hybridized to a target nucleic acid, the fluorescent dye is a nucleic acid probe that reduces its luminescence, and the probe is labeled with a fluorescent dye at its end. When the nucleic acid probe is hybridized to the target nucleic acid, at the terminal portion, the base sequence of the target nucleic acid is G (guanine) at a distance of 1 to 3 bases from the terminal base where the probe and the target nucleic acid are hybridized. When the nucleic acid probe for nucleic acid measurement, characterized in that the nucleotide sequence of the probe is designed so that at least one base exists, or a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye hybridizes to the target nucleic acid The fluorescent dye is a nucleic acid probe that reduces its emission, and The probe is labeled with a fluorescent dye at its terminal portion, and when the nucleic acid probe is hybridized to the target nucleic acid, the base pair for hybridization is G (guanine) and C (cytosine) at the terminal portion. Nucleic acid probes for nucleic acid measurement, wherein the base sequences of the probes are designed so as to form at least one pair or more, a nucleic acid measurement method using these probes, and

３）標的核酸若しくは遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mutation）を解析若しくは測定する方法において、前記２）に記載の核酸プローブを標的核酸若しくは遺伝子にハイブリダイゼーションさせ、蛍光強度の変化量を測定することを特徴とする標的核酸若しくは遺伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定する方法、また、
４）標的核酸若しくは遺伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定する測定キットにおいて、前記２）に記載の核酸プローブを含有することを特徴とする標的核酸若しくは遺伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定する測定キット、また、 3) In a method for analyzing or measuring polymorphism or / and mutation of a target nucleic acid or gene, the nucleic acid probe described in 2) above is hybridized to the target nucleic acid or gene, and the amount of change in fluorescence intensity A method of analyzing or measuring a polymorphism or / and mutation of a target nucleic acid or gene, characterized by measuring
4) In a measurement kit for analyzing or measuring a polymorphism or / and mutation of a target nucleic acid or gene, the polymorphism or / and mutation of the target nucleic acid or gene comprising the nucleic acid probe described in 2) above A measurement kit to analyze or measure, and

５）前記３）に記載の方法により得られるデータを解析する方法において、標的核酸若しくは遺伝子が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のハイブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正処理する過程を有することを特徴とする標的核酸若しくは遺伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定する方法のためのデータ解析方法、また、 5) In the method for analyzing the data obtained by the method described in 3) above, the fluorescence intensity value of the reaction system when the target nucleic acid or gene is hybridized with a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye is used as the above hybridization. A data analysis method for a method of analyzing or measuring a polymorphism or / and mutation of a target nucleic acid or gene, characterized by having a process of correcting by the fluorescence intensity value of the reaction system when not,

６）標的核酸若しくは遺伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定する測定装置において、前記５）に記載のデータ解析方法を実施するための手段を有することを特徴とする標的核酸若しくは遺伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定する測定装置、また、
７）前記５）に記載の補正処理過程をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体、また、 6) a target nucleic acid or gene polymorphism characterized by having a means for performing the data analysis method described in 5) above in a measuring apparatus for analyzing or measuring a polymorphism or / and mutation of a target nucleic acid or gene Measuring device for analyzing or measuring type or / and mutation, and
7) A computer-readable recording medium storing a program for causing a computer to execute the correction process described in 5) above;

８）前記１）、２）に記載の核酸プローブを固体表面に結合せしめたプローブを用いる核酸測定方法、及び該方法の核酸測定用デバイス、また、
９）前記１）、２）、８）に記載の核酸測定方法を用いるＨＩＳＨ（fluorescent in situ hybridization assays）方法、また、 8) A nucleic acid measurement method using a probe in which the nucleic acid probe according to 1) or 2) is bound to a solid surface, and a nucleic acid measurement device of the method,
9) HISH (fluorescent in situ hybridization assays) method using the nucleic acid measurement method according to 1), 2), 8) above,

１０）前記１）、２）、９）に記載の核酸測定方法によって得られるデータの解析方法、また、
１１）前記１）、２）に記載の核酸測定方法を用いるＰＣＲ方法、また、
１２）前記１１）に記載のＰＣＲ方法によって得られるデータ解析方法、また、
１３）前記１１）に記載のＰＣＲ方法を用いる核酸の融解曲線解析方法、また、
１４）前記１２）と１３）を融合させた解析方法、また、
１５）前記１１）、１２）、１３）又は１４）に記載の解析方法により解析する手段を有するＰＣＲの測定及び／又は解析装置、また、 10) A method for analyzing data obtained by the nucleic acid measurement method according to 1), 2), or 9),
11) A PCR method using the nucleic acid measurement method according to 1) or 2),
12) A data analysis method obtained by the PCR method according to 11) above,
13) A method for analyzing a melting curve of a nucleic acid using the PCR method according to 11),
14) An analysis method in which the above 12) and 13) are fused,
15) a PCR measurement and / or analysis apparatus having means for analyzing by the analysis method according to 11), 12), 13) or 14);

１６）前記１１）、１２）、１３）又は１４）に記載の解析方法により解析する手順をプログラムとして記録したコンピュータ読取可能な記録媒体、また、
１７）前記１２）、又は１４）に記載のデータ解析方法を利用することを特徴とする核酸の定量方法、また、
１８）前記１５）に記載のＰＣＲの測定及び／又は解析装置を用いる核酸の測定方法、また、
１９）前記１６）に記載の記録媒体を用いることを特徴とする核酸の測定方法、を提供する。 16) a computer-readable recording medium in which a procedure for analysis by the analysis method described in 11), 12), 13) or 14) is recorded as a program;
17) A nucleic acid quantification method using the data analysis method according to 12) or 14),
18) A method for measuring nucleic acid using the PCR measurement and / or analysis apparatus according to 15) above,
19) A method for measuring a nucleic acid, characterized by using the recording medium described in 16) above.

本発明は次のような効果を有する。
１）前記のように本発明の核酸測定方法、本発明のプローブ及びデバイスを用いると、測定系から未反応の核酸プローブを除く等の操作をすることがないので、標的核酸を短時間でかつ簡便に測定できる。また、複合微生物系又は共生微生物系に適用すると、当該系における特定菌株の存在量を特異的かつ短時間に測定できる。また、本発明は標的核酸若しくは遺伝子のＳＮＰなどの多型または変異などの解析若しくは測定する簡便な方法を提供している。
２）また、本発明の定量的ＰＣＲ方法は、次のような効果を有する。
ａ．ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる標的核酸の増幅に阻害的に作用する因子が添加されていないことから、従来公知の特異性のある通常のＰＣＲと同様の条件で定量的ＰＣＲを行うことができる。
ｂ．また、ＰＣＲの特異性を高く保つことができるので、プライマーダイマーの増幅が遅くなることから、従来公知の定量的ＰＣＲと比較すると定量限界が約１オーダー低くなる。
ｃ．複雑な核酸プローブを用意する必要がないので、それに要する時間と費用が節約できる。
ｄ．標的核酸の増幅効果も大きく、増幅過程をリアルタイムでモニタリングすることができる。
３）また、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデーターを解析する際、本発明のデーター解析方法を用いて、未知核酸コピー数の核酸試料について核酸のコピー数を求める検量直線を作成すると、検量線の相関係数は従来の方法により得られたものに較べて格段に高い。それで、本発明のデーター解析方法を用いると核酸の正確なコピー数を求めることができる。
４）また、本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法によって得られたデーターの解析方法に係るデーター解析用ソフトウエア、また、その解析方法の手順をプログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、また、それを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲの測定若しくは解析装置を用いると、相関係数の高い検量直線を自動的に作成することができる。
５）また、本発明の新規な核酸の融解曲線の分析方法を用いると、精度の高い、核酸のＴｍ値を求めることができる。更に、当該方法に係るデーター解析用ソフトウエア、また、その分析方法の手順をプログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、また、それを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲの測定若しくは解析装置を用いると、正確なＴｍ値を求めることができる。 The present invention has the following effects.
1) As described above, when the nucleic acid measurement method of the present invention, the probe and the device of the present invention are used, an operation such as removing an unreacted nucleic acid probe from the measurement system is not performed. It can be measured easily. Moreover, when applied to a complex microorganism system or a symbiotic microorganism system, the abundance of a specific strain in the system can be measured specifically and in a short time. The present invention also provides a simple method for analyzing or measuring polymorphisms or mutations such as target nucleic acids or gene SNPs.
2) Further, the quantitative PCR method of the present invention has the following effects.
a. Since no factor that inhibits the amplification of the target nucleic acid by Taq DNA polymerase is added, quantitative PCR can be carried out under the same conditions as conventional PCR with known specificity.
b. In addition, since the specificity of PCR can be kept high, amplification of primer dimers is delayed, and the limit of quantification is about one order lower than that of conventionally known quantitative PCR.
c. Since it is not necessary to prepare a complicated nucleic acid probe, the time and cost required for it can be saved.
d. The amplification effect of the target nucleic acid is also great, and the amplification process can be monitored in real time.
3) In addition, when analyzing data obtained by the real-time quantitative PCR method, using the data analysis method of the present invention, a calibration straight line for obtaining a nucleic acid copy number for a nucleic acid sample having an unknown nucleic acid copy number is prepared. The correlation coefficient of the line is much higher than that obtained by the conventional method. Therefore, when the data analysis method of the present invention is used, the exact copy number of the nucleic acid can be obtained.
4) Data analysis software according to a method for analyzing data obtained by the real-time quantitative PCR method of the present invention, a computer-readable recording medium in which the procedure of the analysis method is recorded as a program, and When a real-time quantitative PCR measurement or analysis apparatus using is used, a calibration line having a high correlation coefficient can be automatically created.
5) Further, by using the novel method for analyzing a melting curve of a nucleic acid of the present invention, a highly accurate Tm value of a nucleic acid can be obtained. Furthermore, using data analysis software according to the method, a computer-readable recording medium that records the procedure of the analysis method as a program, and a real-time quantitative PCR measurement or analysis device using the software, An accurate Tm value can be obtained.

次に好ましい実施の形態を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
本発明において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＸＴＰｓ、ｄＸＴＰｓ、ＮＴＰｓ、ｄＮＴＰｓ、核酸プローブ、ヘルパー核酸プローブ（又は核酸ヘルパープローブ、又は単にヘルパープローブ）、ハイブリダイズ、ハイブリダイゼーション、インターカレーター、プライマー、アニーリング、伸長反応、熱変性反応、核酸融解曲線、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−primed ＰＣＲ、Stretch ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、Ａｌｕ配列を利用したＰＣＲ、多重ＰＣＲ、混合プライマーを用いたＰＣＲ、ＰＮＡを用いたＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション方法（hybridization assays)、ＨＩＳＨ(fluorescent in situ hybridization assays)方法、ＰＣＲ方法(polymerase chain assays ）、ＬＣＲ方法（ligase chain reaction)、 ＳＤ方法(strand displacement assays)、競合的ハイブリダイゼーション方法( competitive hybridization)、ＤＮＡチップ、核酸検出用（遺伝子検出用）デバイス，ＳＮＰ（スニップ：一塩基置換多型）、複合微生物系等の用語は、現在、分子生物学、遺伝子工学、微生物工学等で一般的に使用されている用語と同じ意味である。
本発明の第一の特徴は、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる標的核酸の測定方法において、当該核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに生ずる、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することにある。 Next, the present invention will be described in more detail with reference to preferred embodiments.
In the present invention, DNA, RNA, cDNA, mRNA, rRNA, XTPs, dXTPs, NTPs, dNTPs, nucleic acid probe, helper nucleic acid probe (or nucleic acid helper probe, or simply helper probe), hybridization, hybridization, intercalator, primer , Annealing, extension reaction, heat denaturation reaction, nucleic acid melting curve, PCR, RT-PCR, RNA-primed PCR, Stretch PCR, reverse PCR, PCR using Alu sequence, multiplex PCR, PCR using mixed primers, PNA PCR method used, hybridization method (hybridization assays), HISH (fluorescent in situ hybridization assays) method, PCR method (polymerase chain assays), LCR method (ligase chain reaction), SD method (strand displacement assays), competitive hybridization Terminology of competitive hybridization, DNA chip, nucleic acid detection (gene detection) device, SNP (snip: single nucleotide substitution polymorphism), complex microbial system, etc. are currently molecular biology, genetic engineering, microorganisms It has the same meaning as a term generally used in engineering or the like.
The first feature of the present invention is that in the method for measuring a target nucleic acid using a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye, the emission of the fluorescent dye is reduced before and after hybridization, which occurs when the nucleic acid probe hybridizes to the target nucleic acid. Measure the amount.

本発明において標的核酸の測定とは、定量若しくは定量的検出、または単なる検出のことを云う。
蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる核酸測定方法とは、ハイブリダイゼーション方法(hybridization assays)、ＨＩＳＨ方法(fluorescent in situ hybridization assays)、ＰＣＲ方法(polymerase chain assays）、ＬＣＲ方法(ligase chain reaction)、SD方法(strand displacement assays)、 競合的ハイブリダイゼーション方法(competitive hybridization)などのことをいう。これらの方法では、蛍光色素で標識された核酸プローブを加えた後、標的核酸にハイブリダイゼーションしなかった未反応の当該核酸プローブの蛍光色素を測定系から洗浄等の方法で除去し、標的核酸にハイブリダイゼーションした当該核酸プローブに標識された蛍光色素を当該プローブから直接的に、又は当該プローブに間接的な手段を施して（例えば、酵素を作用させたりして）、発光させて、その発光量を測定する方法である。本発明はこのような複雑な操作をしないで目的核酸を測定することに特徴がある。 In the present invention, measurement of a target nucleic acid refers to quantitative or quantitative detection, or simple detection.
Nucleic acid measurement methods using nucleic acid probes labeled with fluorescent dyes include hybridization methods, HISH method (fluorescent in situ hybridization assays), PCR method (polymerase chain assays), LCR method (ligase chain reaction), SD method (strand displacement assays), competitive hybridization methods (competitive hybridization). In these methods, after adding a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye, the fluorescent dye of the unreacted nucleic acid probe that has not hybridized to the target nucleic acid is removed from the measurement system by a method such as washing, and the target nucleic acid is removed. The fluorescent dye labeled on the hybridized nucleic acid probe is directly emitted from the probe or indirectly applied to the probe (for example, by acting an enzyme) to emit light, and the amount of emitted light Is a method of measuring. The present invention is characterized in that the target nucleic acid is measured without such a complicated operation.

本発明において標的核酸とは、定量若しくは定量的検出、または単なる検出を目的とする核酸のことを云う。精製の有無を問わない。また、濃度の大小も問わない。各種の核酸が混在していてもよい。例えば、複合微生物系（複数微生物のＲＮＡ若しくは遺伝子ＤＮＡの混在系）又は共生微生物系（複数の動植物及び／又は複数の微生物のＲＮＡ若しくは遺伝子ＤＮＡの混在系）における定量若しくは定量的検出、または単なる検出を目的とする特定核酸である。尚、標的核酸の精製が必要な場合は従来公知の方法で行うことができる。例えば、市販されている精製キット等を使用して行うことができる。上記の核酸の具体例として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、２−Ｏ−メチル（Ｍｅ）ＲＮＡ、デオキシリボオリゴヌクレオチド（deoxyribo-oligonucleotides)、リボキシオリゴヌクレオチド(riboxy-origonucleotides）等を挙げることができる。   In the present invention, the target nucleic acid refers to a nucleic acid for the purpose of quantitative or quantitative detection or simple detection. Regardless of purification. Moreover, the magnitude | size of a density | concentration does not ask | require. Various nucleic acids may be mixed. For example, quantitative or quantitative detection in complex microorganism systems (mixed systems of RNA or gene DNA of multiple microorganisms) or symbiotic microorganism systems (mixed systems of RNA or gene DNA of multiple animals and plants and / or multiple microorganisms), or simple detection It is a specific nucleic acid for the purpose. When purification of the target nucleic acid is necessary, it can be performed by a conventionally known method. For example, it can be performed using a commercially available purification kit. Specific examples of the nucleic acid include DNA, RNA, PNA, 2-O-methyl (Me) RNA, deoxyribo-oligonucleotides, riboxy-origonucleotides and the like.

本発明において蛍光色素は、一般に核酸プローブに標識して、核酸の測定・検出に用いられるものが便利に使用できるが、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、プローブに標識した当該蛍光色素が、その発光を減少させるものが好適に用いられる。例えば、フルオレセイン（fluorescein）又はその誘導体類｛例えば、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate）（FITC）若しくはその誘導体等、Alexa 488、Alexa 532、cy3、cy5、EDANS（5-(2'-aminoethyl)amino-1-naphthalene sulfonic acid）｝、ローダミン（rhodamine）6G（R6G）又はその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン（teramethylrhodamine）（TMR）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（tetramethylrhodamine isothiocyanate)(TMRITC)、ｘ−ローダミン（x-rhodamine)、テキサスレッド(Texas red)、ボデピー(BODIPY)FL(商標名;モレキュラー・プローブ(Molecular Probes)社製、米国）、ボデピー(BODIPY)FL/C3（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes)社製、米国）、ボデピー(BODIPY)FL/C6（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー(BODIPY)5-FAM（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）TMR（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、又はその誘導体（例えば、ボデピー（BODIPY）TR（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、デピー（BODIPY）R6G（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）564（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、デピー（BODIPY）581（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）等を挙げることができる。これらの中でも、FITC、EDANS、6-joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、ボデピー（BODIPY） FL/C3（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY） FL/C6（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）等を好適なものとして、また、FITC、TMR、6-jeo、ボデピー（BODIPY） FL/C3（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY） FL/C6（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）をより好適なものとして挙げることができる。   In the present invention, a fluorescent dye generally labeled with a nucleic acid probe and used for nucleic acid measurement / detection can be conveniently used. However, when a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye is hybridized with a target nucleic acid, the probe is used. As the fluorescent dye labeled with, those that reduce the light emission are preferably used. For example, fluorescein or derivatives thereof (for example, fluorescein isothiocyanate (FITC) or derivatives thereof, such as Alexa 488, Alexa 532, cy3, cy5, EDANS (5- (2'-aminoethyl) amino- 1-naphthalene sulfonic acid)}, rhodamine 6G (R6G) or a derivative thereof (eg, tetramethylrhodamine isothiocyanate (TMRITC), x-rhodamine (x -rhodamine, Texas red, BODIPY FL (trade name; manufactured by Molecular Probes, USA), BODIPY FL / C3 (trade name; molecular probes) ), BODIPY FL / C6 (trade name; manufactured by Molecular Probes, USA), BODIPY ) 5-FAM (trade name; manufactured by Molecular Probes, USA), BODIPY TMR (trade name; manufactured by Molecular Probes, USA), or a derivative thereof (for example, bodepy) (BODIPY) TR (trade name; manufactured by Molecular Probes, USA), BODIPY R6G (trade name; manufactured by Molecular Probes, USA), BODIPY 564 (trademark) Name: Molecular Probes (US), BODIPY 581 (trade name; Molecular Probes, USA), etc. Among these, FITC, EDANS , 6-joe, TMR, Alexa 488, Alexa 532, BODIPY FL / C3 (trade name; manufactured by Molecular Probes, USA), BODIPY FL / C6 (trade name; (Molecular Probes, USA) and the like, and FITC, TMR, 6-jeo, BODIPY FL / C3 (trade name; manufactured by Molecular Probes), (US), BODIPY FL / C6 (trade name; manufactured by Molecular Probes, USA) can be mentioned as more preferable ones.

標的核酸にハイブリダイゼーションさせる核酸プローブは、オリゴデオキシリボヌクレオチドで構成されていてもよいし、オリゴリボヌクレオチドで構成されていてもよい。また、それらの双方が介在しているキメリックオリゴヌクレオチド（chemiric oligonucleodite）でもよい。また、２−ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド(2'-o-Methyl oligoribonucleotideｓ）（oligoribonucleotideの５’末端のヌククレオサイド(nucleoside）部がシチジンで、そのシチジンの２’位のＯＨ基がメチル（methyl)基で修飾されているもの）を使用してもよい。又はＲＮＡとの親和性を高めるために、当該２’−ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドをオリゴデオキシヌクレオチド（oligodeoxynuclueotide）の中に介在させていてもよい。   The nucleic acid probe to be hybridized to the target nucleic acid may be composed of oligodeoxyribonucleotides or oligoribonucleotides. Moreover, the chimeric oligonucleotide (chemiric oligonucleodite) which both intervenes may be sufficient. In addition, 2-o-methyl oligoribonucleotides (nucleoside portion at the 5 ′ end of oligoribonucleotide is cytidine, and the 2′-position OH group of the cytidine is methyl (methyl). ) Group) may be used. Alternatively, in order to increase affinity with RNA, the 2'-o-methyl oligoribonucleotide may be interposed in oligodeoxynuclueotide.

尚、２’−ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドのような修飾されたＲＮＡをオリゴデオキシヌクレオチドの中に介在させた核酸プローブは主にＲＮＡの測定に用いるものである。当該プローブを使用してＲＮＡを測定する場合、試料であるＲＮＡ溶液を、当該プローブとハイブリダイゼーションさせる前に、８０〜１００℃、好ましくは９０〜１００℃、最適には９３〜９７℃で、１〜１５分間、好ましくは２〜１０分間、最適には３〜７分間加熱処理してＲＮＡの高次構造を破壊することが好適である。また、当該核酸プローブの塩基鎖が３５塩基以下の場合、配列領域へのハイブリダイゼーション効率を上げるためにヘルパープローブ、例えば、(5')AGGCCGGCCCTTGACTTTCC T(3')なる塩基配列のオリヌクレオチドを反応溶液に添加することが好適である。この場合、ヘルパープローブはオリゴデオキシヌクレオチド体でも、また、２−ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド体でもよい。ただし、３５塩基鎖を超える核酸プローブを使用する場合は、標的のＲＮＡを熱変性するだけでよい。このような本発明の核酸プローブをＲＮＡにハイブリダイゼーションさせると、反応液中のＲＮＡの量に応じて蛍光強度が減少し、最終ＲＮＡ濃度が約１５０ｐＭまでＲＮＡを測定できる。   A nucleic acid probe in which modified RNA such as 2'-o-methyl oligoribonucleotide is interposed in oligodeoxynucleotide is mainly used for RNA measurement. When RNA is measured using the probe, the sample RNA solution is subjected to 80 to 100 ° C., preferably 90 to 100 ° C., optimally 93 to 97 ° C. before hybridization with the probe. It is suitable to destroy the higher-order structure of RNA by heat treatment for ˜15 minutes, preferably 2 to 10 minutes, optimally 3 to 7 minutes. When the nucleic acid probe has a base chain of 35 bases or less, a reaction solution containing a helper probe, for example, an oligonucleotide having a base sequence of (5 ′) AGGCCGGCCCTTGACTTTCC T (3 ′) is used to increase the efficiency of hybridization to the sequence region. It is preferable to add to. In this case, the helper probe may be an oligodeoxynucleotide body or a 2-o-methyl oligoribonucleotide body. However, in the case of using a nucleic acid probe having more than 35 base chains, it is only necessary to heat denature the target RNA. When such a nucleic acid probe of the present invention is hybridized to RNA, the fluorescence intensity decreases according to the amount of RNA in the reaction solution, and RNA can be measured up to a final RNA concentration of about 150 pM.

核酸プローブを用いる従来のハイブリダイゼーション方法によるＲＮＡの測定において、核酸プローブとしてオリゴデオキシヌクレオチド体又はオリゴリボヌクレオチド体が用いられてきた。ＲＮＡはそれ自体が強固な高次構造をとるため、プローブと標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーション効率が悪く、定量性に乏しかった。そのために、ＲＮＡを変性させた後、メンブランに固定してからハイブリダイゼーション反応を行うという繁雑性を従来方法は有していた。これに対して、前記の本発明方法は、ＲＮＡの特定構造部と高い親和性を有するリボース部修飾核酸プローブを用いているので、従来方法に較べて高い温度でハイブリダイゼーション反応を行うことができる。それで、ＲＮＡの高次構造の前記悪影響は、前処理としての加熱変性処理、ヘルパープローブの併用だけで克服可能である。これにより本発明方法においてハイブリダイゼーション効率は実質的に１００％になり、定量性が向上する。また、従来方法に較べて格段に簡便になる。   In RNA measurement by a conventional hybridization method using a nucleic acid probe, an oligodeoxynucleotide body or oligoribonucleotide body has been used as a nucleic acid probe. Since RNA has a strong high-order structure itself, the hybridization efficiency between the probe and the target RNA is poor, and the quantitativeness is poor. For this reason, the conventional method has the complexity of performing a hybridization reaction after denaturing RNA and then immobilizing it on the membrane. In contrast, the above-described method of the present invention uses a ribose moiety-modified nucleic acid probe having a high affinity for a specific structure portion of RNA, and thus can perform a hybridization reaction at a higher temperature than conventional methods. . Therefore, the above-described adverse effects of RNA higher-order structure can be overcome only by heat denaturation treatment as a pretreatment and the combined use of a helper probe. Thereby, in the method of the present invention, the hybridization efficiency is substantially 100%, and the quantitativeness is improved. Moreover, it becomes much simpler than the conventional method.

本発明のプローブの塩基数は５〜５０であり、好ましくは１０〜２５、特に好ましくは１５〜２０である。５０を超える場合は、ＨＩＳＨ方法に用いたとき細胞膜の透過性が悪くなり、本発明の適用範囲を狭めることになる。５未満の場合は、非特異的ハイブリダイゼーションが惹起し易くなり、測定誤差が大きくなる。   The number of bases of the probe of the present invention is 5 to 50, preferably 10 to 25, particularly preferably 15 to 20. When it exceeds 50, the permeability of the cell membrane is deteriorated when used in the HISH method, and the application range of the present invention is narrowed. If it is less than 5, non-specific hybridization is likely to occur, resulting in a large measurement error.

そのプローブの塩基配列は、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションするものであればよく、特に限定されない。好ましくは、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、
（１）当該プローブにハイブリダイゼーションした標的核酸の末端塩基部から１ないし３塩基離れて、標的核酸の塩基配列にＧ（グアニン）がすくなとも１塩基以上存在するように、当該プローブの塩基配列が設計されいる塩基配列、
（２）プローブの末端部分においてプローブ−核酸ハイブリッド複合体の塩基対がＧ（グアニン）とＣ（シトシン）のペアーを少なくとも一対以上形成するように、当該プローブの塩基配列が設計されている塩基配列、が好ましい。 The base sequence of the probe is not particularly limited as long as it specifically hybridizes to the target nucleic acid. Preferably, when a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye hybridizes to a target nucleic acid,
(1) The base sequence of the probe is 1 to 3 bases away from the terminal base portion of the target nucleic acid hybridized to the probe so that at least one G (guanine) is present in the base sequence of the target nucleic acid. Designed base sequence,
(2) A base sequence in which the base sequence of the probe is designed so that the base pair of the probe-nucleic acid hybrid complex forms at least one pair of G (guanine) and C (cytosine) at the terminal portion of the probe. Are preferred.

本発明における核酸プローブのオリゴヌクレオチドは、通常の一般的オリゴヌクレオチドの製造方法で製造できる。例えば、化学合成法、プラスミドベクター、ファージベクター等を使用する微生物法等で製造できる（Tetrahedron letters、 22巻、 1859〜1862頁、 1981年; Nucleic acids Research、 14巻、6227〜6245頁、1986年）。尚、現在、市販されている核酸合成機を使用するのが好適である（例えば、ABI394(Perkin Elmer社製、USA)）。   The oligonucleotide of the nucleic acid probe in the present invention can be produced by a general method for producing an oligonucleotide. For example, it can be produced by a chemical synthesis method, a microbial method using a plasmid vector, a phage vector or the like (Tetrahedron letters, 22, 1859-1862, 1981; Nucleic acids Research, 14, 6227-6245, 1986) ). In addition, it is preferable to use a commercially available nucleic acid synthesizer (for example, ABI394 (manufactured by Perkin Elmer, USA)).

オリゴヌクレオチドに蛍光色素を標識するには、従来公知の標識法のうちの所望のものを利用することができる（Nature Biotechnology、 14巻、 303〜308頁、 1996年; Applied and Environmental Microbiology、 63巻、 1143〜 1147頁、 1997年; Nucleic acids Research、 24巻、 4532〜4535頁、 1996年）。例えば、５´末端に蛍光色素分子を結合させる場合は、先ず、常法に従って５´末端のリン酸基にスペーサーとして、例えば、-(CH2)n-SHを導入する。これらの導入体は市販されているので市販品を購入してもよい（メドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー（Midland Certified Reagent Company））。この場合、ｎは３〜８、好ましくは６である。このスペーサーにＳＨ基反応性を有する蛍光色素又はその誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。このようにして合成された蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して本発明で使用する核酸プローブとすることができる。 In order to label the oligonucleotide with a fluorescent dye, any desired labeling method known in the art can be used (Nature Biotechnology, 14, 303-308, 1996; Applied and Environmental Microbiology, 63). 1143-1147, 1997; Nucleic acids Research, 24, 4532-4535, 1996). For example, when a fluorescent dye molecule is bound to the 5 ′ end, first, for example, — (CH 2 ) n —SH is introduced as a spacer into the phosphate group at the 5 ′ end according to a conventional method. These introducers are commercially available and may be purchased commercially (Midland Certified Reagent Company). In this case, n is 3-8, preferably 6. A labeled oligonucleotide can be synthesized by binding a fluorescent dye having SH group reactivity or a derivative thereof to this spacer. The oligonucleotide labeled with the fluorescent dye synthesized as described above can be purified by chromatography such as reverse phase to obtain a nucleic acid probe used in the present invention.

また、オリゴヌクレオチドの３’末端に蛍光色素を結合させることもできる。この場合は、リボース又はデオキシリボースの３’位ＣのＯＨ基にスペーサーとして、例えば、-(CH2)n-NH2を導入する。これらの導入体も前記と同様にして市販されているので市販品を購入してもよい（メドランド・サーテイファイフド・レージント・カンパニー（Midland Certified Reagent Company））。また、リン酸基を導入して、リン酸基のＯＨ基にスペサーとして、例えば、-(CH2)n-SHを導入する。これらの場合、ｎは３〜８、好ましくは４〜７である。このスペーサーにアミノ基、ＳＨ基に反応性を有する蛍光色素又はその誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。このようにして合成された蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して本発明で使用する核酸プローブとすることができる。このアミノ基を導入する場合、キット試薬（例えば、Uni-link aminomodifier（CLONTECH社製、米国）、フルオ・リポターキット（FluoReporter Kits) F-6082、 F-6083、 F-6084、 F-10220（いずれもモレクキュラー・プローベ（Molecular Probes）社製、米国））を用いるのが便利である。そして、常法に従って当該オリゴリボヌクレオチドに蛍光色素分子を結合させることができる。また、プローブ核酸の鎖内に蛍光色素分子を導入することも可能である（ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 225, 32-38頁（1998年））。
以上のようにして本発明の核酸プローブが調製できるが、好ましいプローブの形態は、３’又は５’末端が蛍光色素が標識されたものであり、その標識されている末端の塩基がＧ又はＣであるものである。５’末端が標識され、３’末端が標識されていない場合、３’末端のリボース又はデオキシリボースの３’位ＣのＯＨ基をリン酸基等、また３’末端のリボースの２’位ＣのＯＨ基をリン酸基等で修飾してもよく何ら制限されない。 In addition, a fluorescent dye can be bound to the 3 ′ end of the oligonucleotide. In this case, for example, — (CH 2 ) n —NH 2 is introduced as a spacer into the 3′-position C OH group of ribose or deoxyribose. Since these introductions are also commercially available in the same manner as described above, commercial products may be purchased (Midland Certified Reagent Company). Further, a phosphate group is introduced, and, for example, — (CH 2 ) n —SH is introduced as a spacer into the OH group of the phosphate group. In these cases, n is 3-8, preferably 4-7. A labeled oligonucleotide can be synthesized by binding a fluorescent dye having reactivity to an amino group or SH group or a derivative thereof to the spacer. The oligonucleotide labeled with the fluorescent dye synthesized as described above can be purified by chromatography such as reverse phase to obtain a nucleic acid probe used in the present invention. When introducing this amino group, kit reagents (for example, Uni-link aminomodifier (CLONTECH, USA), Fluo Reporter Kits F-6082, F-6083, F-6084, F-10220 ( In any case, it is convenient to use a molecular probe (Molecular Probes, USA). Then, a fluorescent dye molecule can be bound to the oligoribonucleotide according to a conventional method. It is also possible to introduce fluorescent dye molecules into the probe nucleic acid chain (ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 225, 32-38 (1998)).
Although the nucleic acid probe of the present invention can be prepared as described above, the preferred probe form is one in which the 3 ′ or 5 ′ end is labeled with a fluorescent dye, and the labeled end base is G or C. It is what is. When the 5 ′ end is labeled and the 3 ′ end is not labeled, the OH group at the 3 ′ position C of the ribose or deoxyribose at the 3 ′ end is a phosphate group or the like, and the 2 ′ position C of the ribose at the 3 ′ end The OH group may be modified with a phosphate group or the like without any limitation.

本発明の核酸プローブは、単に核酸測定だけでなく、標的核酸若しくは遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mutation）を解析若しくは測定する方法に好適に利用できる。特に下記に述べるＤＮＡチップと併用することによりより便利な方法を提供する。すなわち、本発明の核酸プローブと標的核酸若しくは遺伝子とのハイブリダイゼーションにおいて、ＧＣペアーを形成するかどうかにより、蛍光強度が変化する。それで、本発明の核酸プローブを標的核酸若しくは遺伝子にハイブリダイゼーションさせ、発光強度を測定することにより、標的核酸若しくは遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mutation）を解析若しくは測定することができる。具体的方法は、実施例に記した。この場合、標的核酸若しくは遺伝子は各種の核酸若しくは遺伝子の増幅方法のうちの一つの方法により増幅された増幅物でもよし、抽出されたものでもよい。また標的核酸はその種類を問わない。本発明を適用しうる標的核酸の例としてＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、人工修飾核酸などを挙げることができる。ただ、鎖中または末端にグアニン塩基が存在しておればよい。鎖中または末端にグアニン塩基が存在しないと蛍光強度が減少しない。よって、本発明方法により、Ｇ→Ａ、Ｇ←Ａ、 Ｃ→Ｔ、Ｃ←Ｔ、Ｇ→Ｃ、Ｇ←Ｃの変異、または置換、すなわち、１塩基多型（single nucleotide polymorphism (SNP)）などの多型（polymorphism analysis）等を解析若しくは測定することができる。なお、現在、多型分析は、マキサム・ギルバート（Maxam-Gilbert)法、ジデオキシ（dideoxy）法を用いて核酸若しくは遺伝子の塩基配列を決定することにより行われているのが現状である。   The nucleic acid probe of the present invention can be suitably used not only for nucleic acid measurement but also for a method for analyzing or measuring polymorphism or / and mutation of a target nucleic acid or gene. In particular, a more convenient method is provided by using together with the DNA chip described below. That is, in the hybridization between the nucleic acid probe of the present invention and the target nucleic acid or gene, the fluorescence intensity varies depending on whether a GC pair is formed. Therefore, the polymorphism or / and mutation of the target nucleic acid or gene can be analyzed or measured by hybridizing the nucleic acid probe of the present invention to the target nucleic acid or gene and measuring the luminescence intensity. . Specific methods are described in the examples. In this case, the target nucleic acid or gene may be an amplification product amplified by one of various nucleic acid or gene amplification methods, or may be extracted. Moreover, the target nucleic acid does not ask | require the kind. Examples of target nucleic acids to which the present invention can be applied include RNA, DNA, PNA, artificially modified nucleic acids and the like. However, the guanine base should just exist in a chain | strand or the terminal. If there is no guanine base in the chain or at the end, the fluorescence intensity does not decrease. Therefore, according to the method of the present invention, mutation or substitution of G → A, G ← A, C → T, C ← T, G → C, G ← C, that is, single nucleotide polymorphism (SNP) It is possible to analyze or measure polymorphism analysis. Currently, polymorphism analysis is currently performed by determining the nucleotide sequence of a nucleic acid or gene using the Maxam-Gilbert method or dideoxy method.

それで、本発明の核酸プローブを標的核酸または／および遺伝子の多型（polymorphism）及び変異（mutation）を解析若しくは測定する測定キットに含有させることにより、標的核酸若しくは遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mutation）を解析若しくは測定する測定キットとして好適に使用することができる。   Therefore, by including the nucleic acid probe of the present invention in a measurement kit for analyzing or measuring the target nucleic acid or / and gene polymorphism and mutation, the target nucleic acid or gene polymorphism or / And it can be suitably used as a measurement kit for analyzing or measuring mutation.

本発明の標的遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mutation）を解析若しくは測定する方法により得られるデータを解析する場合に、標的核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のものがハイブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正する処理過程を設けると、処理されたデータは信頼性の高いものになる。
それで本発明は、標的核酸若しくは遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mutation)を解析若しくは測定する方法のためのデータ解析方法を提供する。 When analyzing data obtained by the method for analyzing or measuring polymorphism or / and mutation of the target gene of the present invention, when the target nucleic acid is hybridized with a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye If a process for correcting the fluorescence intensity value of the reaction system with the fluorescence intensity value of the reaction system when the above is not hybridized is provided, the processed data becomes highly reliable.
Thus, the present invention provides a data analysis method for a method of analyzing or measuring polymorphism or / and mutation of a target nucleic acid or gene.

また、本発明の特徴は、標的核酸若しくは遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mutation）を解析若しくは測定する測定装置において、標的核酸若しくは遺伝子が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のものがハイブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正する処理手段を有することを特徴とする標的核酸若しくは遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mutation）を解析若しくは測定する測定装置である。   In addition, the present invention is characterized in that in a measuring apparatus for analyzing or measuring polymorphism or / and mutation of a target nucleic acid or gene, the target nucleic acid or gene is hybridized with a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye. Polymorphism of a target nucleic acid or gene, characterized in that it has a processing means for correcting the fluorescence intensity value of the reaction system with the fluorescence intensity value of the reaction system when the above is not hybridized Or / and a measuring device for analyzing or measuring mutation.

また、本発明の特徴は、標的核酸若しくは遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mutation）を解析若しくは測定する方法により得られるデータを解析する場合に、標的核酸若しくは遺伝子が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のものがハイブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正する処理過程をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体である。   In addition, the present invention is characterized in that a target nucleic acid or gene is labeled with a fluorescent dye when analyzing data obtained by a method of analyzing or measuring a polymorphism or / and mutation of the target nucleic acid or gene. Records a program that causes a computer to execute a process of correcting the fluorescence intensity value of the reaction system when hybridized with the prepared nucleic acid probe by the fluorescence intensity value of the reaction system when the above-mentioned nucleic acid probe is not hybridized The computer-readable recording medium.

本発明のプローブは固体（支持層）表面、例えばスライドガラスの表面に固定されていてもよい。この場合、蛍光色素で標識されていない端が固定されているのが好ましい。この形式は現在ＤＮＡチップと言われる。遺伝子発現（gene expression）のモニタリング、塩基配列（base sequence）の決定，変異解析（mutation analysis），１塩基多型（single nucleotide polymorphism (SNP)）などの多型解析（polymorphism analysis）等に使用できる。勿論、核酸測定用デバイス（チップ）として使用することができる。   The probe of the present invention may be fixed on the surface of a solid (support layer), for example, the surface of a slide glass. In this case, it is preferable that the end not labeled with the fluorescent dye is fixed. This format is now called a DNA chip. Can be used for gene expression monitoring, base sequence determination, mutation analysis, polymorphism analysis such as single nucleotide polymorphism (SNP) . Of course, it can be used as a nucleic acid measuring device (chip).

本発明のプローブを例えばスライドガラスの表面に結合させるには、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミンなどのポリ陽イオンをコートしたスライドガラス、アルデヒド基を導入したスライドガラス、アミノ基を導入したスライドガラスを先ず用意する。そして、i)ポリ陽イオンをコートしたスライドガラスには、プローブのリン酸基を反応させる、ii)アルデヒド基を導入したスライドガラスには、アミノ基を導入したプローブを反応させる、iii)アミノ基を導入したスライドガラスには、ＰＤＣ（pyridinium dichromate）導入、アミノ基又はアルデヒド基導入したプローブを反応させる、などにより達成できる(Fodor,P.A.,et al.,Science,251,767-773(1991); Schena,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,93,10614-10619(1996);McGal,G.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,93,13555-13560(1996);Blanchad,A.P.,et al.,Biosens.Bioelectron.,11,687-690(1996))。   In order to bind the probe of the present invention to the surface of a slide glass, for example, a slide glass coated with a polycation such as polylysine, polyethyleneimine, polyalkylamine, a slide glass introduced with an aldehyde group, a slide glass introduced with an amino group Prepare first. And i) a slide glass coated with a polycation is reacted with a phosphate group of the probe, ii) a slide glass introduced with an aldehyde group is reacted with a probe introduced with an amino group, iii) an amino group Can be achieved by introducing PDC (pyridinium dichromate), reacting with a probe introduced with an amino group or an aldehyde group, etc. (Fodor, PA, et al., Science, 251, 767-773 (1991); Schena , M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93, 10614-10619 (1996); McGal, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93, 13555-13560 (1996); Blanchad, AP, et al., Biosens. Bioelectron., 11, 687-690 (1996)).

核酸プローブを固体表面にアレー状に配列、結合させたデバイスは核酸測定用がより便利になる。
この場合、塩基配列の異なる多くの本発明のプローブを、個別に同一固体表面上に結合していデバイスをつくることにより、同時に多種遺伝子を検出定量できる。
このデバイスにおいては、プローブ毎に、前記固体のプローブを結合したと反対側の面に少なくとも一つの温度センサーとヒーターが設け、そのプローブを結合した前記固体の領域が最適温度条件になるように温度調節され得るように設計されているのが好適である。 A device in which nucleic acid probes are arrayed and bonded to a solid surface in an array becomes more convenient for nucleic acid measurement.
In this case, various genes can be simultaneously detected and quantified by making a device in which many probes of the present invention having different base sequences are individually bound on the same solid surface.
In this device, for each probe, at least one temperature sensor and a heater are provided on the surface opposite to the side where the solid probe is bonded, and the temperature of the solid region where the probe is bonded becomes an optimum temperature condition. It is preferably designed so that it can be adjusted.

このデバイスにおいては、本発明のプローブ以外のプローブ、例えば、一つの分子内に二つの異なった蛍光色素を有し、標的核酸にハイブリダイゼーションしていないときは、二つの蛍光色素の相互作用により、消光若しくは発光しているが、標的核酸にハイブリダイゼーションすると蛍光若しくは消光するように設計された構造をもつ核酸プローブ、即ち、前記の分子ビーコン(Tyagi et al., Nature Biotech.,14:303-308,1996)等を結合したものも好適に使用できる。それで、このようなデバイスも本発明の技術的範囲内に含まれる。   In this device, a probe other than the probe of the present invention, for example, two different fluorescent dyes in one molecule, and when not hybridized to the target nucleic acid, the interaction of the two fluorescent dyes, Nucleic acid probes having a structure that is quenched or luminescent but designed to fluoresce or quench when hybridized to the target nucleic acid, i.e. the molecular beacon (Tyagi et al., Nature Biotech., 14: 303-308 , 1996) can be suitably used. Therefore, such a device is also included in the technical scope of the present invention.

本発明のデバイスを用いる測定方法の基本的操作は、核酸プローブを結合した固体表面上にｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＲＮＡ等の標的核酸を含む溶液をのせ、ハイブリダイゼーションさせるだけである。これにより、標的核酸量に応じて蛍光量の変化がおこり、その蛍光変化量から標的核酸の検出定量が可能となる。また、一つの固体表面上に塩基配列の異なる核酸プローブを多数種結合させることにより、一度に多くの核酸を検出定量することができる。それで、ＤＮＡチップと全く同じ用途で使用できるので新規のＤＮＡチップである。最適の反応条件では標的核酸以外の核酸は蛍光の発光量を変化させないために、未反応な核酸を洗浄する操作は必要がない。更に、微小ヒーターにて核酸プローブの種類毎に温度コントロールすることにより、当該プローブ毎に最適反応条件にコントロールできるために正確な定量が可能となる。また、微小ヒーターにて温度を連続的に変化させ、その間、蛍光量を測定することにより、核酸プローブと標的核酸との解離曲線を解析することができる。その解離曲線の違いからハイブリダイゼーションした核酸の性質の判定や、ＳＮＰの検出ができる。   The basic operation of the measurement method using the device of the present invention is simply to place a solution containing a target nucleic acid such as mRNA, cDNA, rRNA, etc. on a solid surface to which a nucleic acid probe is bound, and to perform hybridization. As a result, the amount of fluorescence changes according to the amount of target nucleic acid, and the target nucleic acid can be detected and quantified from the amount of change in fluorescence. In addition, a large number of nucleic acids can be detected and quantified at a time by binding many kinds of nucleic acid probes having different base sequences on one solid surface. Therefore, since it can be used for exactly the same purpose as the DNA chip, it is a novel DNA chip. Under optimal reaction conditions, nucleic acids other than the target nucleic acid do not change the amount of fluorescence emitted, and therefore, there is no need to wash the unreacted nucleic acid. Furthermore, by controlling the temperature for each type of nucleic acid probe with a microheater, it is possible to control the optimal reaction conditions for each probe, so accurate quantification is possible. In addition, the dissociation curve between the nucleic acid probe and the target nucleic acid can be analyzed by continuously changing the temperature with a micro heater and measuring the amount of fluorescence during that time. From the difference in the dissociation curves, the properties of the hybridized nucleic acid can be determined and the SNP can be detected.

従来の標的核酸測定用デバイスは、蛍光色素で修飾されていない核酸プローブを固体表面に結合（固定：fix）し、それに蛍光色素で標識した標的核酸をハイブリダイゼーションさせた後、ハイブリダイゼーションしていない標的核酸を洗い流して、残存している蛍光色素の蛍光強度を測定していた。
蛍光色素で標的核酸を標識するには、例えば、特定ｍＲＮＡを標的とした場合、次のstepsを取る：（１）細胞から抽出されたｍＲＮＡ全部を抽出する。（２）それから、逆転写酵素（reverse transcriptase）を用いて、蛍光色素で修飾されヌクレオサイドをとり込ませながらｃＤＮＡを合成する。本発明ではこのような操作は必要がない。 The conventional device for measuring target nucleic acid binds (fixes) a nucleic acid probe not modified with a fluorescent dye to a solid surface, and hybridizes a target nucleic acid labeled with a fluorescent dye, and then does not hybridize. The target nucleic acid was washed away, and the fluorescence intensity of the remaining fluorescent dye was measured.
In order to label a target nucleic acid with a fluorescent dye, for example, when a specific mRNA is targeted, the following steps are taken: (1) All mRNA extracted from cells is extracted. (2) Then, a reverse transcriptase is used to synthesize cDNA while incorporating a nucleoside modified with a fluorescent dye. In the present invention, such an operation is not necessary.

当該デバイスには各種のプローブが多数スポットしてあるが、その各々のプローブにハイブリダイゼーションする核酸の最適ハイブリダイゼーション条件、例えば、温度等は各々異なる。よって本来であれば、プローブ毎（スポット毎）に、ハイブリダイゼーション反応、洗浄操作を最適な条件で行う必要がある。しかし、それは物理的に不可能であるので、すべてのプローブ毎に同一の温度でハイブリダイゼーションを行い、また、洗浄も同一温度で同一洗浄液で行われている。それで、ハイブリダイゼーションが期待されている核酸がハイブリダイゼーションしなかったり、ハイブリダイゼーションしてもハイブリダイゼーションが強固でないので容易に洗い流されてしまう等の欠点を有していた。そのような原因で核酸の定量性が低いものであった。本発明ではこの洗浄操作が必要がないのでこのような欠点を有しない。また、スポットの底に微小ヒータを設け、ハイブリダイゼーション温度をコントロールすることで、プローブ毎に最適温度でハイブリダイゼーション反応を行わせることができる。それで、本発明は定量性が格段に向上したものである。   A number of various probes are spotted on the device, but the optimum hybridization conditions for nucleic acids that hybridize to the probes, such as temperature, are different. Therefore, originally, it is necessary to perform the hybridization reaction and the washing operation under optimum conditions for each probe (each spot). However, since this is physically impossible, hybridization is performed at the same temperature for all the probes, and washing is performed at the same temperature with the same washing solution. As a result, the nucleic acid expected to be hybridized does not hybridize, or even if it is hybridized, the hybridization is not strong, so that it is easily washed away. For these reasons, the quantitativeness of nucleic acids was low. In the present invention, this washing operation is not necessary, and thus does not have such a drawback. Further, by providing a micro heater at the bottom of the spot and controlling the hybridization temperature, the hybridization reaction can be performed at the optimum temperature for each probe. Therefore, the present invention has a greatly improved quantitativeness.

本発明においては、前記した核酸プローブ又はデバイスを使用することで、標的核酸を短時間で、簡便かつ特異的に測定することができる。
以下に測定法を述べる。
本発明の測定方法において、先ず、測定系に前記の核酸プローブを添加し、標的核酸にハイブリダイゼーションさせる。その方法は、通常の既知方法で行なうことができる（Analytical Biochemistry、 183巻、 231〜244頁、 1989年; Nature Biotechnology、 14巻、 303〜308頁、 1996年; Applied and Environmental Microbiology、 63巻、 1143-1147頁、 1997年）。例えば、ハイブリダイゼーションの条件は、塩濃度が０〜２モル濃度、好ましくは０．１〜１．０モル濃度、ｐＨは６〜８、好ましくは６．５〜７．５である。 In the present invention, the target nucleic acid can be measured easily and specifically in a short time by using the above-described nucleic acid probe or device.
The measurement method is described below.
In the measurement method of the present invention, first, the above-described nucleic acid probe is added to the measurement system and hybridized with the target nucleic acid. The method can be carried out by conventional known methods (Analytical Biochemistry, 183, 231-244, 1989; Nature Biotechnology, 14, 303-308, 1996; Applied and Environmental Microbiology, 63, 1143-1147, 1997). For example, the hybridization conditions are a salt concentration of 0 to 2 molar, preferably 0.1 to 1.0 molar, and a pH of 6 to 8, preferably 6.5 to 7.5.

反応温度は、前記核酸プローブが標的核酸の特異的部位にハイブリダイゼーションして得られるハイブリド複合物のＴｍ値±１０℃の範囲内であるのが好ましい。このようにすることにより非特異的なハイブリダイゼーションを防止することができる。Ｔｍ−１０℃未満のときは、非特異的ハイブリダイゼーション起こり、Ｔｍ＋１０℃を越えるときは、ハイブリダイゼーションが起こらない。尚、Ｔｍ値は本発明で用いる核酸プローブを設計するのに必要な実験と同様にして求めることができる。すなわち、当該核酸プローブとハイブリダイゼーションする相補塩基配列のオリゴヌクレオチドを前記の核酸合成機等で化学合成し、当該核酸プローブとのハイブリダイゼーション物のＴｍ値を通常の方法で測定する。   The reaction temperature is preferably within a range of Tm value ± 10 ° C. of the hybrid complex obtained by hybridizing the nucleic acid probe to a specific site of the target nucleic acid. By doing so, non-specific hybridization can be prevented. Non-specific hybridization occurs when the temperature is lower than Tm-10 ° C, and no hybridization occurs when the temperature exceeds Tm + 10 ° C. The Tm value can be determined in the same manner as the experiment necessary for designing the nucleic acid probe used in the present invention. That is, an oligonucleotide having a complementary base sequence that hybridizes with the nucleic acid probe is chemically synthesized with the nucleic acid synthesizer or the like, and the Tm value of the hybridized product with the nucleic acid probe is measured by a usual method.

また、その反応時間は１秒間〜１８０分間、好ましくは５秒間〜９０分間である。１秒間未満のときは、ハイブリダイゼーションにおいて未反応の本発明の核酸プローブが多くなる。また、反応時間を余り長くしても特に意味がない。なお、反応時間は核酸種、すなわち、核酸の長さ、あるいは塩基配列によって大きく影響を受ける。
前記のようにして、本発明において核酸プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせる。そして、ハイブリダイゼーションの前後で、蛍光色素の発光量を蛍光光度計で測定し、発光の減少量を計算する。その減少量の大きさは標的核酸量と比例するので、標的核酸の量を求めることができる。 The reaction time is 1 second to 180 minutes, preferably 5 seconds to 90 minutes. When the time is less than 1 second, the number of unreacted nucleic acid probes of the present invention in hybridization increases. Also, there is no particular meaning if the reaction time is too long. The reaction time is greatly influenced by the nucleic acid species, that is, the length of the nucleic acid or the base sequence.
As described above, in the present invention, the nucleic acid probe is hybridized to the target nucleic acid. Then, before and after hybridization, the amount of emission of the fluorescent dye is measured with a fluorometer, and the amount of decrease in emission is calculated. Since the amount of the decrease is proportional to the amount of the target nucleic acid, the amount of the target nucleic acid can be obtained.

反応液中の標的核酸の濃度：０．１〜１０．０ｎＭであるのが好ましい。反応液中のプローブの濃度：１．０〜２５．０ｎＭであるが好ましい。検量線を作成する場合は、標的核酸に対して、プローブを１．０〜２．５の比率で用いるのが望ましい。   The concentration of the target nucleic acid in the reaction solution is preferably 0.1 to 10.0 nM. The concentration of the probe in the reaction solution is preferably 1.0 to 25.0 nM. When preparing a calibration curve, it is desirable to use the probe at a ratio of 1.0 to 2.5 with respect to the target nucleic acid.

実際、試料中の未知濃度の標的核酸を測定する場合、上記の条件で先ず、検量線を作成する。そして、複数の濃度のプローブを添加して、蛍光強度値の減少を測定する。そして、測定された蛍光強度の減少値を最大にするプローブ濃度を好ましいプローブ濃度とする。好ましい濃度のプローブで測定された蛍光強度の減少値もって、検量線から標的核酸の定量値を求めることになる。   In fact, when measuring an unknown concentration of target nucleic acid in a sample, a calibration curve is first created under the above conditions. Then, a plurality of probes having a plurality of concentrations are added, and a decrease in the fluorescence intensity value is measured. The probe concentration that maximizes the measured decrease in fluorescence intensity is set as a preferred probe concentration. The quantitative value of the target nucleic acid is obtained from the calibration curve with the decrease value of the fluorescence intensity measured with a probe having a preferred concentration.

本発明の核酸測定法の原理は、前記のごとくであるが、各種の核酸測定方法、例えば、ＦＩＳＨ方法、ＰＣＲ方法、ＬＣＲ方法、ＳＤ方法, 競合的ハイブリダイゼーション方法、ＴＡＳ方法、 などに適用できる。   Although the principle of the nucleic acid measurement method of the present invention is as described above, it can be applied to various nucleic acid measurement methods such as FISH method, PCR method, LCR method, SD method, competitive hybridization method, TAS method, etc. .

以下にその例を記す。
ａ）ＦＩＳＨ方法に適用した場合
即ち、本発明は色々の種類の微生物若しくは他の動物や植物が混在していて、相互に単離できない微生物系（複合微生物系、共生微生物系）の細胞内若しくは細胞のホモジネート等の核酸測定に好適に適用できる。ここでいう微生物とは一般的にいう微生物のことで、特に限定されるものではない。例えば、真核微生物、原核微生物、その他、マイコプラズマ、ウイルス、リッケチャ等を挙げることができる。そして、特定配列を有する核酸とは、これらの微生物系において、例えば、どのように活躍しているのか調べたい菌株の細胞に特異性を有する塩基配列をもつ核酸のことである。例えば、特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝子ＤＮＡの特定配列である。 An example is given below.
a) When applied to the FISH method In other words, the present invention is a mixture of various types of microorganisms or other animals and plants, and cannot be isolated from each other in cells of a microbial system (complex microbial system, symbiotic microbial system) or It can be suitably applied to nucleic acid measurement such as cell homogenate. The microorganism here is a general microorganism, and is not particularly limited. For example, eukaryotic microorganisms, prokaryotic microorganisms, mycoplasma, viruses, rickettsias and the like can be mentioned. A nucleic acid having a specific sequence is a nucleic acid having a base sequence having specificity for cells of a strain to be examined, for example, how it is active in these microbial systems. For example, a specific sequence of 5SrRNA, 16SrRNA or 23SrRNA of a specific strain or their gene DNA.

本発明において核酸プローブを複合微生物系又は共生微生物系に添加し、特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝子ＤＮＡの量を測定することにより、当該系における特定菌株の存在量を測定することできる。尚、複合微生物系又は共生微生物系のホモジネートに前記核酸プローブを添加して、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定して特定菌株の存在量を測定する方法も、本発明の技術的範囲内とする。   In the present invention, a nucleic acid probe is added to a complex microorganism system or a symbiotic microorganism system, and the abundance of the specific strain in the system is measured by measuring the amount of 5SrRNA, 16SrRNA or 23SrRNA of the specific strain or their gene DNA. it can. The method of measuring the abundance of a specific strain by adding the nucleic acid probe to a complex microbial or symbiotic microbial homogenate, and measuring the amount of decrease in fluorescence emission of the fluorescent dye before and after hybridization. Within the target range.

前記の測定方法は、例えば、以下の如くである。即ち、核酸プローブを添加する前に、複合微生物系又は共生微生物系の温度、塩濃度、ｐＨを前記の条件に調整する。複合微生物系又は共生微生物系における特定菌株は、細胞数として１０7〜１０12個／ｍｌ、好ましくは１０9〜１０10個／ｍｌに調整することが好適である。それは希釈、又は遠心分離等による濃縮等で行うことができる。細胞数が１０7個／ｍｌ未満のときは、蛍光強度が弱く、測定誤差が大きくなる。１０12個／ｍｌを超えるときは、複合微生物系又は共生微生物系の蛍光強度が強すぎるため、特定微生物の存在量を定量的に測定することができなくなる。 The measurement method is as follows, for example. That is, before adding the nucleic acid probe, the temperature, salt concentration, and pH of the complex microorganism system or symbiotic microorganism system are adjusted to the above-described conditions. The specific strain in the complex microorganism system or the symbiotic microorganism system is preferably adjusted to a cell number of 10 7 to 10 12 cells / ml, preferably 10 9 to 10 10 cells / ml. It can be performed by dilution or concentration by centrifugation or the like. When the number of cells is less than 10 7 cells / ml, the fluorescence intensity is weak and the measurement error increases. When it exceeds 10 12 cells / ml, the fluorescence intensity of the complex microorganism system or the symbiotic microorganism system is too strong, and the abundance of the specific microorganism cannot be measured quantitatively.

添加する核酸プローブの濃度は、複合微生物系又は共生微生物系における特定菌株の細胞数に依存する。細胞数１×１０8／ｍｌに対して０．１〜１０．０ｎＭ濃度、好ましくは０．５〜５ｎＭ濃度、より好ましくは１．０ｎＭ濃度である。０．１ｎＭ未満のときは、特定微生物の存在量を正確に反映したデータにならない。しかし、最適な核酸プローブの量は、細胞内の標的核酸量に依存するために一概にはいえない。 The concentration of the nucleic acid probe to be added depends on the number of cells of the specific strain in the complex microorganism system or the symbiotic microorganism system. The concentration is 0.1 to 10.0 nM, preferably 0.5 to 5 nM, more preferably 1.0 nM with respect to 1 × 10 8 cells / ml. When it is less than 0.1 nM, the data does not accurately reflect the abundance of the specific microorganism. However, the optimum amount of the nucleic acid probe cannot be generally determined because it depends on the amount of the target nucleic acid in the cell.

次に本発明において前記核酸プローブと特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子ＤＮＡにハイブリダイゼーションさせるときの反応温度は、前記した条件と同様である。また、その反応の時間も前記の条件と同様である。
前記のような条件で核酸プローブを特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれの遺伝子ＤＮＡにハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後の複合微生物系又は共生微生物系の蛍光色素の発光の減少量を測定する。 Next, in the present invention, the reaction temperature when hybridizing the nucleic acid probe to 5SrRNA, 16SrRNA or 23SrRNA of the specific strain or the gene DNA thereof is the same as described above. The reaction time is also the same as the above conditions.
Under the conditions as described above, the nucleic acid probe is hybridized to 5SrRNA, 16SrRNA or 23SrRNA of a specific strain or gene DNA thereof, and the amount of decrease in the emission of the fluorescent dye of the complex microorganism or symbiotic microorganism before and after hybridization is measured.

前記のようにして測定された蛍光色素の発光の減少量は、複合微生物系又は共生微生物系における特定菌株の存在量と比例する。それは５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝子ＤＮＡの量と特定菌株の存在量とが比例するからである。   The amount of decrease in the emission of the fluorescent dye measured as described above is proportional to the abundance of the specific strain in the complex microorganism system or the symbiotic microorganism system. This is because the amount of 5SrRNA, 16SrRNA or 23SrRNA or their gene DNA is proportional to the abundance of the specific strain.

尚、本発明において、複合微生物系又は共生微生物系における微生物以外の成分は、本発明の核酸プローブと特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝子ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを阻害しない限り、また、核酸プローブの蛍光色素の発光を阻害をしない限り、特に限定されない。例えば、KH2PO4、K2HPO4、NaH2PO4、Na2HPO4等のリン酸塩、硫安、硝安、尿素等の無機窒素類、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムイオン等の金属イオンの各種塩類、マンガン、亜鉛、鉄、コバルトイオン等の微量金属イオンの硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩等の各種塩類、更にビタミン類等が適当に含まれていてもよい。もし、上記の阻害が観察される場合は、遠心分離等の操作で複数の微生物が混在する菌体系から菌体を分離し、再び緩衝液系等に懸濁すればよい。 In the present invention, the components other than the microorganism in the complex microorganism system or the symbiotic microorganism system, unless the nucleic acid probe of the present invention and the 5S rRNA, 16S rRNA or 23S rRNA of the specific strain or their gene DNA are not inhibited. There is no particular limitation as long as the light emission of the fluorescent dye of the nucleic acid probe is not inhibited. For example, phosphates such as KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4 , NaH 2 PO 4 , Na 2 HPO 4 , inorganic nitrogen such as ammonium sulfate, ammonium nitrate, urea, metal ions such as magnesium, sodium, potassium, calcium ions And various salts such as sulfates, hydrochlorides, and carbonates of trace metal ions such as manganese, zinc, iron, and cobalt ions, and vitamins. If the above-mentioned inhibition is observed, the cells may be separated from the bacterial system in which a plurality of microorganisms are mixed by an operation such as centrifugation and then suspended again in a buffer system or the like.

上記の緩衝液としては、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、トリス・グリシン緩衝液、クエン酸緩衝液、グット緩衝液等の各種緩衝液をも用いることができる。緩衝液の濃度は、ハイブリダイゼーション、ＦＲＥＴ現象、蛍光色素の発光を阻害しない濃度である。その濃度は緩衝液の種類に依存する。緩衝液のｐＨは４〜１２、好ましくは５〜９である。   As the above buffer solution, various buffer solutions such as a phosphate buffer solution, a carbonate buffer solution, a Tris / hydrochloric acid buffer solution, a Tris / glycine buffer solution, a citrate buffer solution, and a Gut buffer solution can also be used. The concentration of the buffer solution is a concentration that does not inhibit the hybridization, the FRET phenomenon, and the luminescence of the fluorescent dye. Its concentration depends on the type of buffer. The pH of the buffer is 4-12, preferably 5-9.

ｂ）ＰＣＲ methodsに適用する場合
ＰＣＲ methodsであればどのような方法でも適用できるのであるが、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法に適用する場合を以下に記す。
即ち、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法において、本発明の特定の核酸プローブを用いてＰＣＲを行い、反応前後の蛍光色素の発光の減少をリアルタイムで測定するものである。
本発明のＰＣＲとは各種方法のＰＣＲを意味するものである。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−primed ＰＣＲ、Stretch ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、Ａｌｕ配列を利用したＰＣＲ、多重ＰＣＲ、混合プライマーを用いたＰＣＲ、ＰＮＡを用いたＰＣＲ法等をも含む。また、定量的とは、本来の定量測定の他に、検出程度の定量測定をも意味するものとする。 b) When applied to PCR methods Any method can be applied as long as it is a PCR method, but the case where it is applied to a real-time quantitative PCR method is described below.
That is, in the real-time quantitative PCR method, PCR is performed using the specific nucleic acid probe of the present invention, and the decrease in the emission of the fluorescent dye before and after the reaction is measured in real time.
The PCR of the present invention means various methods of PCR. For example, RT-PCR, RNA-primed PCR, Stretch PCR, reverse PCR, PCR using Alu sequence, multiplex PCR, PCR using mixed primers, PCR method using PNA, and the like are also included. Further, the term “quantitative” means not only the original quantitative measurement but also the quantitative measurement of the degree of detection.

前記のとおり、標的核酸とは、存在量を定量若しくは定量的検出するまたは単に検出する核酸のことを云う。精製の有無を問わない。また、濃度の大小も問わない。各種の核酸が混在していてもよい。例えば、複合微生物系（複数微生物のＲＮＡ若しくは遺伝子ＤＮＡの混在系）又は共生微生物系（複数の動植物及び／又は複数微生物のＲＮＡ若しくは遺伝子ＤＮＡの混在系）における増幅目的の特定核酸である。尚、標的核酸の精製が必要な場合は従来公知の方法で行うことができる。例えば、市販されている精製キット等を使用して行うことができる。   As described above, the target nucleic acid refers to a nucleic acid whose amount is quantitatively or quantitatively detected or simply detected. Regardless of purification. Moreover, the magnitude | size of a density | concentration does not ask | require. Various nucleic acids may be mixed. For example, a specific nucleic acid for amplification in a complex microorganism system (mixed system of RNA or gene DNA of a plurality of microorganisms) or a symbiotic microorganism system (mixed system of a plurality of animals and plants and / or RNA or gene DNA of a plurality of microorganisms). When purification of the target nucleic acid is necessary, it can be performed by a conventionally known method. For example, it can be performed using a commercially available purification kit.

従来公知の定量的ＰＣＲ方法はｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ若しくはｄＵＴＰ、標的核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、Ｔａｑポリメラーゼ、プライマー、並びに蛍光色素で標識した核酸プローブ若しくはインターカレーターを用いてＭｇイオンの存在下に、温度を低温、高温を繰り返しつつ標的核酸を増幅し、増幅過程の蛍光色素の発光の増加量をリアルタイムでモニタリングするものである（実験医学、１５巻、７号、４６〜５１ページ、１９９７年、羊土社）。   Conventionally known quantitative PCR methods include dATP, dGTP, dCTP, dTTP or dUTP, target nucleic acid (DNA or RNA), Taq polymerase, primer, and nucleic acid probe or intercalator labeled with a fluorescent dye in the presence of Mg ions. In addition, the target nucleic acid is amplified while repeating the temperature at low and high temperatures, and the increase in emission of the fluorescent dye in the amplification process is monitored in real time (Experimental Medicine, Vol. 15, No. 7, pp. 46-51, 1997). Year, Yodosha).

本発明の定量的ＰＣＲ方法は、本発明の核酸プローブを用いて標的核酸を増幅させ、増幅過程において、蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とするものである。本発明の定量的ＰＣＲにおいて、好ましい本発明のプローブとしては、その塩基数は５〜５０であり、好ましくは１０〜２５、特に好ましくは１５〜２０で、ＰＣＲサイクル中に標的核酸の増幅産物とハイブリダイゼーションするものであれば、どのようなものでもよい。また、フォワード（forward）型、リバース（reverse）型のどちらに設計してもよい。   The quantitative PCR method of the present invention is characterized in that the target nucleic acid is amplified using the nucleic acid probe of the present invention, and the amount of decrease in the emission of the fluorescent dye is measured in the amplification process. In the quantitative PCR of the present invention, the preferred probe of the present invention has 5 to 50 bases, preferably 10 to 25, particularly preferably 15 to 20, and the amplification product of the target nucleic acid during the PCR cycle. Anything that hybridizes may be used. In addition, either a forward type or a reverse type may be designed.

例えば、以下のものを挙げることができる。
（１）５’末端部、好ましくは５’末端が、本発明の実施に有用な蛍光色素で標識され、標的核酸に当該末端部においてハイブリダイゼーションしたとき、当該プローブと標的核酸とがハイブリダイゼーションした５’末端の塩基部分から１〜３塩基５’側に離れて、標的核酸の塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１塩基以上存在するように、塩基配列が設計されている。
（２）前記（１）のプローブの内、３’末端が蛍光色素で標識されているプローブ。 For example, the following can be mentioned.
(1) The 5 ′ end, preferably the 5 ′ end is labeled with a fluorescent dye useful in the practice of the present invention, and when the target nucleic acid is hybridized at the end, the probe and the target nucleic acid are hybridized. The base sequence is designed such that at least one base or more of G (guanine) is present in the base sequence of the target nucleic acid away from the base portion at the 5 ′ end to the 1 to 3 base 5 ′ side.
(2) A probe in which the 3 ′ end of the probe of (1) is labeled with a fluorescent dye.

（３）前記（１）のプローブの内、３’末端、例えば、３’末端のリボース若しくはデオキシリボースの３’位ＣのＯＨ基がリン酸基等で修飾されているもの、または、３’末端のリボースの２’位ＣのＯＨ基がリン酸基等で修飾されているもの。
（４）３’末端部、好ましくは３’末端が、本発明の蛍光色素で標識され、３’末端の塩基がＧ又はＣであるもの、または３’末端のリボースの２’位のＯＨ基がリン酸基等で修飾されいるもの。
（５）前記（１）のプローブのうち、５’末端部、好ましくは５’末端が、本発明の蛍光色素で標識されているもの。
（６）５’末端部、好ましくは５’末端が、本発明の実施に有用な蛍光色素で標識され、５’末端の塩基がＧ又はＣであるもの。 (3) Among the probes of the above (1), those in which the OH group at the 3 ′ position of the 3 ′ end, for example, the 3 ′ end ribose or deoxyribose is modified with a phosphate group or the like, or 3 ′ Those in which the OH group at the 2′-position C of the terminal ribose is modified with a phosphate group or the like.
(4) The 3 ′ end, preferably the 3 ′ end is labeled with the fluorescent dye of the present invention, and the 3 ′ end base is G or C, or the 3 ′ end ribose 2′-position OH group Is modified with a phosphate group or the like.
(5) The probe of (1) above, wherein the 5 ′ end, preferably the 5 ′ end is labeled with the fluorescent dye of the present invention.
(6) The 5 ′ end, preferably the 5 ′ end, is labeled with a fluorescent dye useful in the practice of the present invention, and the 5 ′ end base is G or C.

前記（４）、（６）の場合、標的核酸の塩基配列から、どうしても５’末端がＧ又はＣに設計できない場合は、標的核酸の塩基配列から設計したプライマーであるオリゴヌクレオチドの５’末端に、５’−グアニル酸又は５’−シチジル酸を付加しても、本発明の目的は好適に達成できる。よって、本発明において、３’、又は５’末端の塩基がＧ又はＣになるように設計した核酸プローブとは、標的核酸の塩基配列から設計したプローブの他に、当該のプローブの３’又は５’末端に５’−グアニル酸又は５’−シチジル酸を付加してなるプローブを含むものと定義する。   In the case of (4) and (6) above, if the 5 ′ end cannot be designed as G or C from the base sequence of the target nucleic acid, it will be added to the 5 ′ end of the oligonucleotide that is the primer designed from the base sequence of the target nucleic acid. Even when 5′-guanylic acid or 5′-cytidylic acid is added, the object of the present invention can be preferably achieved. Therefore, in the present invention, the nucleic acid probe designed so that the 3 ′ or 5 ′ terminal base is G or C, in addition to the probe designed from the base sequence of the target nucleic acid, It is defined to include a probe formed by adding 5′-guanylic acid or 5′-cytidylic acid to the 5 ′ end.

特に上記の（１）、（２）、（３）又は（４）のプローブはプライマーとして利用されないように設計したものである。ＦＲＥＴ現象を用いるリアルタイム定量的ＰＣＲ方法において使用する（蛍光色素で標識した）二つのプローブの代わりに、本発明の一つのプローブを用いてＰＣＲを行うものである。ＰＣＲの反応系に当該プローブを添加し、ＰＣＲを行う。核酸伸長反応時、標的核酸若しくは増幅標的核酸にハイブリダイズしていた当該プローブがポリメラーゼにより分解され、ハイブリダイゼーション物から分解除去される。このときの反応系または核酸変性反応が完了した反応系の蛍光強度値を測定する。また、標的核酸若しくは増幅した増幅標的核酸が当該プローブとハイブリダイズしている反応系（アニーリング反応、若しくはポリメラーゼにより当該プローブがハイブリダイゼーション物から除かれるまでの核酸伸長反応時の反応系）の蛍光強度値を測定する。そして、前者からの蛍光強度値の減少率を算出することにより増幅された核酸を測定する。当該プローブが標的核酸若しくは増幅標的核酸から、核酸変性反応により完全に解離するか、または核酸伸長時にポリメラーゼにより当該プローブと標的核酸若しくは増幅標的核酸とのハイブリダイゼーション物から分解除去されたときは蛍光強度値は大きい。しかし、当該プローブが標的核酸若しくは増幅標的核酸に十分にハイブリダイズしているアニーリング反応が完了している反応系若しくは核酸伸長反応時にポリメラーゼにより当該プローブと標的核酸若しくは増幅標的核酸とのハイブリダイゼーション物から分解除去されるまでの反応系の蛍光強度値は前者より減少している。蛍光強度値の減少は増幅された核酸量に比例する。
この場合、当該プローブが標的核酸とハイブリダイゼーションしたときのそのハイブリダイゼーション物のＴｍが、プライマーのハイブリダイゼーション物のＴｍ値の±１５℃、好ましくは±５℃の範囲になるように、（２）、（３）、（４）のプローブの塩基配列が設計されることが望ましい。プローブのＴｍ値が、プライマーのＴｍ値−５℃、特に−１５℃未満であると、プローブがハイブリダイゼーションしないために、蛍光色素の発光の減少は起こらない。反対にプライマーのＴｍ値＋５℃、特に＋１５℃を超えると、プローブが目的としない標的核酸ともハイブリダイゼーションするので、プローブの特異性が失われる。 In particular, the probe of the above (1), (2), (3) or (4) is designed not to be used as a primer. Instead of the two probes (labeled with fluorescent dyes) used in the real-time quantitative PCR method using the FRET phenomenon, PCR is carried out using one probe of the present invention. The probe is added to the PCR reaction system and PCR is performed. During the nucleic acid extension reaction, the probe hybridized to the target nucleic acid or the amplified target nucleic acid is decomposed by the polymerase and decomposed and removed from the hybridized product. The fluorescence intensity value of the reaction system at this time or the reaction system in which the nucleic acid denaturation reaction has been completed is measured. In addition, the fluorescence intensity of the reaction system in which the target nucleic acid or amplified amplified target nucleic acid is hybridized with the probe (annealing reaction or reaction system during the nucleic acid extension reaction until the probe is removed from the hybridized product by polymerase) Measure the value. And the nucleic acid amplified by calculating the decreasing rate of the fluorescence intensity value from the former is measured. Fluorescence intensity when the probe is completely dissociated from the target nucleic acid or amplified target nucleic acid by a nucleic acid denaturation reaction, or decomposed and removed from the hybridized product of the probe with the target nucleic acid or amplified target nucleic acid by a polymerase during nucleic acid extension. The value is large. However, a reaction system in which the probe is sufficiently hybridized to the target nucleic acid or the amplified target nucleic acid or a hybridization product of the probe and the target nucleic acid or the amplified target nucleic acid by the polymerase during the nucleic acid extension reaction is completed. The fluorescence intensity value of the reaction system until it is decomposed and removed is lower than the former. The decrease in fluorescence intensity value is proportional to the amount of nucleic acid amplified.
In this case, the Tm of the hybridized product when the probe is hybridized with the target nucleic acid is within the range of ± 15 ° C., preferably ± 5 ° C. of the Tm value of the hybridized product of the primer (2) It is desirable that the base sequences of the probes (3) and (4) are designed. When the Tm value of the probe is -5 ° C., particularly less than −15 ° C. of the primer, the probe does not hybridize, and thus the emission of the fluorescent dye does not decrease. On the other hand, when the Tm value of the primer exceeds + 5 ° C., in particular, + 15 ° C., the probe also loses its specificity because it hybridizes with an undesired target nucleic acid.

上記の（５）、（６）のプローブは、プライマーとしてＰＣＲの反応系に添加するものである。蛍光色素で標識されたプライマーを用いるＰＣＲ方法は本発明以外未だ知られていない。ＰＣＲの反応が進むに従い、増幅された核酸は本発明の蛍光色素で標識される。それで、核酸変性反応が完了している反応系の蛍光強度値は大きいが、アニーリング反応完了しているか若しくは核酸伸長反応時の反応系においては、反応系の蛍光強度は前者の蛍光強度より減少する。   The probes (5) and (6) above are added to the PCR reaction system as primers. A PCR method using a primer labeled with a fluorescent dye is not yet known except the present invention. As the PCR reaction proceeds, the amplified nucleic acid is labeled with the fluorescent dye of the present invention. Therefore, although the fluorescence intensity value of the reaction system in which the nucleic acid denaturation reaction has been completed is large, in the reaction system in which the annealing reaction has been completed or during the nucleic acid extension reaction, the fluorescence intensity of the reaction system decreases from the former fluorescence intensity. .

ＰＣＲの反応は通常のＰＣＲ方法と同様の反応条件で行うことができる。それで、Ｍｇイオン濃度が低濃度（１〜２ｍＭ）である反応系で標的核酸の増幅を行うことができる。勿論、従来公知の定量的ＰＣＲにおいて使用されている高濃度（２〜４ｍＭ）のＭｇイオン存在下の反応系でも本発明は実施できる。   The PCR reaction can be performed under the same reaction conditions as in a normal PCR method. Thus, the target nucleic acid can be amplified in a reaction system with a low Mg ion concentration (1-2 mM). Of course, the present invention can also be carried out in a reaction system in the presence of a high concentration (2 to 4 mM) of Mg ions used in conventionally known quantitative PCR.

尚、本発明のＰＣＲ方法において、本発明のＰＣＲを行い、その増幅産物について核酸の融解曲線を分析を行ってＴｍ値を求めるできる。この方法は新規な核酸の融解曲線の分析方法である。本方法において本発明のＰＣＲ方法に用いた核酸プローブ又はプライマーとして用いた核酸プローブが好適に利用できる。
この場合、本発明のプローブの塩基配列を、ＳＮＰ（スニップ；一塩基置換多型）を含む領域と相補的な配列にすることで、ＰＣＲ終了後、その核酸の本発明のプローブから解離曲線を解析することにより、その解離曲線の違いからＳＮＰの検出ができる。本発明のプローブの配列としては、ＳＮＰを含む配列と相補的な塩基配列を使用すれば、プローブ配列とＳＮＰを含む配列との解離曲線より得られるＴｍ値は、ＳＮＰを含まない配列との解離曲線から得られるＴｍ値より高くなる。 In the PCR method of the present invention, the Tm value can be determined by performing the PCR of the present invention and analyzing the nucleic acid melting curve of the amplified product. This method is a novel method for analyzing melting curves of nucleic acids. In this method, the nucleic acid probe used in the PCR method of the present invention or the nucleic acid probe used as a primer can be suitably used.
In this case, by making the base sequence of the probe of the present invention complementary to the region containing SNP (snip; single nucleotide substitution polymorphism), the dissociation curve of the nucleic acid from the probe of the present invention is obtained after PCR is completed. By analyzing, SNP can be detected from the difference in the dissociation curves. As a probe sequence of the present invention, if a base sequence complementary to a sequence containing SNP is used, the Tm value obtained from the dissociation curve between the probe sequence and the sequence containing SNP is dissociated from the sequence not containing SNP. It becomes higher than the Tm value obtained from the curve.

本発明の第二の特徴は、前記のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法ので得られるデータを解析する方法の発明である。
リアルタイム定量的ＰＣＲ方法は、現在、ＰＣＲを行わせる反応装置、蛍光色素の発光を検出装置、ユーザーインターフェース、即ち、データー解析方法の各手順をプログラム化して、それを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体（別称：Sequence Detection Software System）、及びそれらを制御し、データー解析するコンピュータから構成される装置で、リアルタイムで測定されている。それで、本発明の測定もこのような装置で行われる。 The second feature of the present invention is an invention of a method for analyzing data obtained by the real-time quantitative PCR method.
The real-time quantitative PCR method is a computer-readable recording medium in which each procedure of a reaction apparatus for performing PCR, a detection device for detecting luminescence of a fluorescent dye, a user interface, that is, a data analysis method is programmed and recorded. (Alternative name: Sequence Detection Software System) and a device composed of a computer that controls and analyzes the data, and is measured in real time. Therefore, the measurement of the present invention is also performed with such an apparatus.

以下に、先ず、リアルタイム定量的ＰＣＲの解析装置から説明する。本発明において用いる装置は、ＰＣＲをリアルタイムでモニタリングできる装置であればどのような装置でもよいが、例えば、ABI PRISMTM 7700 塩基配列検出システム（Sequence Detection System SDS 7700)(パーキン・エルマー・アプライド・バイオシステム社(Perkin Elmer Applied Biosytems社、 USA))、ライトサイクラーTM システム（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、ドイツ）等を特に好適なものとして挙げることができる。 First, a real-time quantitative PCR analyzer will be described below. The apparatus used in the present invention may be any apparatus capable of monitoring PCR in real time. For example, ABI PRISM ™ 7700 nucleotide sequence detection system (Sequence Detection System SDS 7700) (Perkin Elmer Applied Biotechnology) Systems (Perkin Elmer Applied Biosytems, USA)), Light Cycler ™ system (Roche Diagnostics, Germany) and the like can be mentioned as particularly suitable ones.

尚、前記の反応装置は、標的核酸の熱変性反応、アニーリング反応、核酸の伸長反応を繰り返し行う装置（例えば、温度を９５℃、６０℃、７２℃に繰り返し行うことができる。）である。また、検出システムは、蛍光励起用アルゴンレーザー、スペクトログラフ並びにＣＣＤカメラからなっている。更に、データー解析方法の各手段をプログラム化して、それを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体は、コンピュータにインストールされており、コンピュータを介して上記のシステムを制御し、検出システムから出力されたデーターを解析処理するプログラムを記録したものである。   The above-described reaction apparatus is an apparatus that repeatedly performs a heat denaturation reaction, annealing reaction, and nucleic acid extension reaction of a target nucleic acid (for example, the temperature can be repeated at 95 ° C., 60 ° C., and 72 ° C.). The detection system includes an argon laser for fluorescence excitation, a spectrograph, and a CCD camera. Further, a computer-readable recording medium on which each means of the data analysis method is programmed and recorded is installed in the computer, and the data output from the detection system is controlled by controlling the above system via the computer. Is a program that records the analysis process.

コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されているデータ解析用プログラムは、サイクルごとの蛍光強度を測定する過程、測定された蛍光強度を、サイクルの関数として、ＰＣＲのamplifcation plotをコンピュータのデスプレー上に表示する過程、蛍光強度が検出され始めるＰＣＲサイクル数（threshold cycle number:Ct）を算出する過程、Ｃｔ値から試料核酸のコピー数を求める検量線を作成する過程、前記各過程のデーター、プロット値を印字する過程、からなっている。ＰＣＲが指数的に進行している場合、ＰＣＲ開始時の標的核酸のコピー数のＬｏｇ値と、Ｃｔとの間には直線関係が成り立つ。従って標的核酸の既知量のコピー数を用いて検量線を作成し、未知コピー数の標的核酸を含有するサンプルのＣｔを検出することにより、標的核酸のＰＣＲ開始時のコピー数を計算できる。   The data analysis program recorded on the computer-readable recording medium displays the PCR amplification plot on the computer display as a function of the cycle, measuring the fluorescence intensity for each cycle. The process of calculating the PCR cycle number (threshold cycle number: Ct) at which fluorescence intensity starts to be detected, the process of creating a calibration curve for obtaining the copy number of the sample nucleic acid from the Ct value, the data of each process, and the plot value The process consists of printing. When PCR progresses exponentially, a linear relationship is established between the Log value of the copy number of the target nucleic acid at the start of PCR and Ct. Therefore, a copy number at the start of PCR of the target nucleic acid can be calculated by preparing a calibration curve using a known number of copies of the target nucleic acid and detecting Ct of the sample containing the target nucleic acid with an unknown copy number.

本発明のＰＣＲ関連発明は、前記のようなリアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデーターを解析する方法である。以下に各特徴について記す。
第一の特徴は、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデーターを解析する方法において、各サイクルにおける増幅した核酸が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、各サイクルにおける前記の結合したもの、あるいは前記のハイブリダイズしたものが解離したときの反応系の蛍光強度値により補正する演算処理過程、即ち、補正演算処理過程である。 The PCR-related invention of the present invention is a method for analyzing data obtained by the above-described real-time quantitative PCR method. Each feature is described below.
The first feature is that in the method of analyzing data obtained by the real-time quantitative PCR method, when the amplified nucleic acid in each cycle is bound to the fluorescent dye, or the amplified nucleic acid is labeled with the fluorescent dye; Computation process in which the fluorescence intensity value of the reaction system when hybridized is corrected by the fluorescence intensity value of the reaction system when each of the above-mentioned combined or hybridized products dissociates in each cycle, ie, correction It is a calculation process.

「増幅した核酸が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系」とは、具体的に例示すると、ＰＣＲの各サイクルにおける４０〜８５℃、好ましくは５０〜８０℃の反応温度を有する核酸伸長反応あるいはアニーリングのときの反応系を挙げることができる。具体的温度は増幅した核酸の長さに依存する。
また、「前記の結合したもの、あるいは前記のハイブリダイズしたものが解離したときの反応系」とは、ＰＣＲの各サイクルにおける核酸の熱変性の反応系、具体的には、例えば、反応温度９０〜１００℃、好ましくは９４〜９６℃のときのものである。 The “reaction system when the amplified nucleic acid is bound to the fluorescent dye or when the amplified nucleic acid is hybridized with the nucleic acid probe labeled with the fluorescent dye” is specifically exemplified by 40 to 40 in each cycle of PCR. A reaction system for nucleic acid extension reaction or annealing having a reaction temperature of 85 ° C., preferably 50 to 80 ° C. can be mentioned. The specific temperature depends on the length of the amplified nucleic acid.
In addition, “the reaction system when the above-mentioned bound or hybridized substance is dissociated” means a reaction system for heat denaturation of nucleic acid in each cycle of PCR, specifically, for example, a reaction temperature of 90 It is a thing at -100 degreeC, Preferably it is 94-96 degreeC.

補正演算処理過程の補正演算処理としては本発明の目的に合致するものであればどのようなものでもよいのであるが、具体的には、次の〔数式１〕あるいは〔数式２〕による処理過程を含むものを例示することができる。
ｆn＝ｆhyb,n／ｆden,n 〔数式１〕
ｆn＝ｆden,n／ｆhyb,n 〔数式２〕
〔式中、
ｆn：〔数式１〕あるいは〔数式２〕により算出されたｎサイクルにおける補正演算処理値、
ｆhyb,n：ｎサイクルにおける、増幅した核酸が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値、
ｆden,n：ｎサイクルにおける、前記の結合したもの、あるいはハイブリダイズしたものが解離したときの反応系の蛍光強度値〕。
尚、本過程においては、本過程で得られた補正演算処理値若しくは当該値を各サイクル数に対してグラフ上にプロットし、コンピュータのデスプレー上に表示及び／又は印字する過程を含むものである。 The correction calculation process in the correction calculation process may be any process that meets the object of the present invention. Specifically, the process according to the following [Formula 1] or [Formula 2] Can be exemplified.
f n = f hyb, n / f den, n [Formula 1]
f n = f den, n / f hyb, n [Formula 2]
[Where,
f n : correction calculation processing value in n cycles calculated by [Equation 1] or [Equation 2],
f hyb, n : the fluorescence intensity value of the reaction system when the amplified nucleic acid is bound to the fluorescent dye or hybridized with the nucleic acid probe labeled with the fluorescent dye in n cycles,
f den, n : the fluorescence intensity value of the reaction system when the bound or hybridized product is dissociated in n cycles.
This process includes a process of plotting the correction calculation processing value obtained in this process or the value on a graph for each cycle number, and displaying and / or printing on a computer display.

第二の特徴は、各サイクルにおける〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値を次の〔数式３〕あるいは〔数式４〕に代入し、各サンプル間の蛍光変化割合あるいは蛍光変化率を算出し、それらを比較するデータ解析方法である。   The second feature is that the correction calculation processing value according to [Equation 1] or [Equation 2] in each cycle is substituted into the following [Equation 3] or [Equation 4], and the fluorescence change rate or the fluorescence change rate between the samples. Is a data analysis method for calculating and comparing them.

Ｆn＝ｆn／ｆa 〔数式３〕
Ｆn＝ｆa／ｆn 〔数式４〕
〔式中、
Ｆn：ｎサイクルにおける、〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化率、
ｆn：〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値
ｆa：〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値で、ｆnの変化が観察される以前の任意のサイクル数のものであるが、通常は、例えば、１０〜４０サイクルのもの、好適には１５〜３０サイクルのもの、より好適には２０〜３０サイクルのものが採用される。〕。
尚、本過程においては、本過程で得られた算出値、比較値若しくは当該値を各サイクル数に対してグラフ上にプロットし、コンピュータのデスプレー上に表示及び／又は印字する過程を含むものであるが、〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値については、それらの過程は含むものであっても、含まないものであってもよい。 F n = f n / f a [Formula 3]
F n = f a / f n [Formula 4]
[Where,
F n : Fluorescence change rate or fluorescence change rate calculated by [Equation 3] or [Equation 4] in n cycles,
f n : correction calculation processing value according to [Formula 1] or [Formula 2] f a : correction calculation processing value according to [Formula 1] or [Formula 2], an arbitrary number of cycles before a change in f n is observed Usually, for example, those having 10 to 40 cycles, preferably 15 to 30 cycles, and more preferably 20 to 30 cycles are employed. ].
This process includes a process of plotting the calculated value, comparison value or the value obtained in this process on the graph for each cycle number, and displaying and / or printing on the computer display. The correction calculation processing values according to [Equation 1] or [Equation 2] may or may not include those processes.

第三の特徴は、
３１）〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化率のデーターを用いて、〔数式５〕、〔数式６〕あるいは〔数式７〕による演算処理する過程、
ｌｏｇb（Ｆn）、ｌｎ（Ｆn） 〔数式５〕
ｌｏｇb｛（１−Ｆn）×Ａ｝、ｌｎ｛（１−Ｆn）×ｂ｝ 〔数式６〕
ｌｏｇb｛（Ｆn−１）×Ａ｝、ｌｎ｛（Ｆn−１）×Ａ｝ 〔数式７〕 The third feature is
31) Using the fluorescence change rate or the fluorescence change rate data calculated by [Equation 3] or [Equation 4], a process of performing arithmetic processing according to [Equation 5], [Equation 6] or [Equation 7],
log b (F n ), ln (F n ) [Formula 5]
log b {(1−F n ) × A}, ln {(1−F n ) × b} [Equation 6]
log b {(F n −1) × A}, ln {(F n −1) × A} [Equation 7]

〔式中、
Ａ、ｂ：任意の数値、好ましくは整数値、より好ましくは自然数である。そして、Ａ＝１００、ｂ＝１０のときは、｛（Ｆn−１）×Ａ｝は百分率（％）を表す。
Ｆn：〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出されたｎサイクルにおける蛍光変化割合あるいは蛍光変化率〕、
３２）前記３１）の演算処理値が一定値に達したサイクル数を求める演算処理過程、
３３）既知濃度の核酸試料におけるサイクル数と反応開始時の標的核酸のコピー数の関係式を計算する演算処理過程、
３４）未知試料におけるＰＣＲ開始時の標的核酸のコピー数を求める演算処理過程、
を有するデータ解析方法である。そして、３１）→３２）→３３）→３４）の順からなる過程が好適である。 [Where,
A, b: Any numerical value, preferably an integer value, more preferably a natural number. When A = 100 and b = 10, {(F n −1) × A} represents a percentage (%).
F n : Fluorescence change rate or fluorescence change rate in n cycles calculated by [Equation 3] or [Equation 4]
32) An arithmetic processing step for obtaining the number of cycles in which the arithmetic processing value of 31) has reached a certain value;
33) a calculation process for calculating a relational expression between the number of cycles in a nucleic acid sample of known concentration and the number of copies of the target nucleic acid at the start of the reaction;
34) A calculation process for obtaining the copy number of the target nucleic acid at the start of PCR in the unknown sample
Is a data analysis method. A process consisting of 31) → 32) → 33) → 34) is preferable.

前記３１）〜３３）の各過程においては、各過程で得られた演算処理値若しくは当該値を各サイクル数に対してグラフ上にプロットし、コンピュータのデスプレー上に表示及び／又は印字する過程を含むものであってもよい。前記３４）の過程の演算処理値は、前記と同様であるが、少なくとも印字される必要があるので、その過程を含むものである。
尚、〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値、〔数式３〕あるいは〔数式４〕による算出処理値は、各サイクル数に対してグラフ上にプロットし、コンピュータのデスプレー上に表示及び／又は印字されても、されなくてもよいので、それらの過程は必要に応じて追加すればよい。 In each of the steps 31) to 33), a calculation process value obtained in each step or the value is plotted on a graph with respect to each cycle number, and displayed and / or printed on a computer display. It may be included. The calculation processing value in the process of 34) is the same as described above, but includes at least the process because it needs to be printed.
It should be noted that the correction calculation processing value according to [Formula 1] or [Formula 2] and the calculation processing value according to [Formula 3] or [Formula 4] are plotted on a graph for each cycle number and displayed on the computer display. These processes may be added as necessary because they may or may not be printed.

前記データ解析方法は、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法が蛍光色素の発光の減少量を測定するものである場合に特に有効である。その具体例として、前記の本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法である。   The data analysis method is particularly effective when the real-time quantitative PCR method measures the amount of decrease in the emission of the fluorescent dye. A specific example is the above-described real-time quantitative PCR method of the present invention.

第４の特徴は、リアルタイム定量的ＰＣＲの解析装置において、前記本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法を実行する演算及び記憶手段を有するリアルタイム定量的ＰＣＲの測定及び／又は解析装置である。   A fourth feature of the real-time quantitative PCR analyzer is a real-time quantitative PCR measurement and / or analysis device having a calculation and storage means for executing the data analysis method for the real-time quantitative PCR method of the present invention. It is.

第５の特徴は、リアルタイム定量的ＰＣＲの解析装置を用いてＰＣＲを解析するデータ解析方法の各手段をプログラム化して、そのプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体において、前記本発明のデータ解析方法の各手段をコンピュータに実行させることができるようにしたプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体である。   A fifth feature of the present invention is that in the computer-readable recording medium in which each means of the data analysis method for analyzing PCR using a real-time quantitative PCR analyzer is programmed and the program is recorded, the data analysis of the present invention is performed. A computer-readable recording medium having recorded thereon a program that allows a computer to execute each means of the method.

第６の特徴は、核酸測定方法において、前記本発明のデータ解析方法、測定及び／又は解析装置、記録媒体を利用する新規な核酸の測定方法である。   A sixth feature is a novel nucleic acid measurement method using the data analysis method, measurement and / or analysis apparatus, and recording medium of the present invention in the nucleic acid measurement method.

また、第７の特徴は、前記の本発明の核酸の融解曲線の分析方法、即ち、本発明のＰＣＲ方法を行って核酸のＴｍ値を求める方法によって得られるデータを解析する方法である。
即ち、本発明のＰＣＲ法により増幅された核酸について、低い温度から核酸が完全に変性するまで、温度を徐々に上げる過程（例えば、５０℃から９５℃まで）、この過程において、短い時間間隔（例えば、０．２℃〜０．５℃間隔）で蛍光強度を測定する過程、測定結果を時間毎にデスプレー上に表示する過程、即ち、核酸の融解曲線を表示する過程、この融解曲線を一次微分する過程、その値（−ｄＦ／ｄＴ、Ｆ：蛍光強度、Ｔ：時間）を微分値としてデスプレー上に表示する過程、その微分値から変曲点を求める過程からなる、解析方法である。本発明においては、蛍光強度は温度が上がるごとに増加する。本発明においては、各サイクルにおける核酸伸長反応時、好ましくはＰＣＲ反応終了時の蛍光強度値を熱変性反応時の蛍光強度値を用いて割る演算処理する過程を上記の過程に追加することにより、より好ましい結果が得られる。 A seventh feature is a method for analyzing data obtained by the method for analyzing a melting curve of a nucleic acid of the present invention, that is, a method for obtaining a Tm value of a nucleic acid by performing the PCR method of the present invention.
That is, for a nucleic acid amplified by the PCR method of the present invention, the temperature is gradually increased from a low temperature until the nucleic acid is completely denatured (for example, from 50 ° C. to 95 ° C.). For example, the process of measuring the fluorescence intensity at intervals of 0.2 ° C. to 0.5 ° C., the process of displaying the measurement results on the display every time, that is, the process of displaying the melting curve of the nucleic acid, It is an analysis method comprising a process of differentiation, a process of displaying the value (−dF / dT, F: fluorescence intensity, T: time) on the display as a differential value, and a process of obtaining an inflection point from the differential value. In the present invention, the fluorescence intensity increases with increasing temperature. In the present invention, the process of dividing the fluorescence intensity value at the time of nucleic acid extension reaction in each cycle, preferably at the end of the PCR reaction, using the fluorescence intensity value at the heat denaturation reaction is added to the above process, More favorable results are obtained.

本発明においては、前記の本発明の新規なＰＣＲ方法のデータ解析方法に、本発明の核酸の融解曲線の分析をする方法を追加してなる本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲの測定及び／又は解析装置も本発明の技術的範囲内である。   In the present invention, measurement and / or analysis of the real-time quantitative PCR of the present invention, which is obtained by adding a method for analyzing the melting curve of the nucleic acid of the present invention to the data analysis method of the novel PCR method of the present invention. Apparatus is also within the scope of the present invention.

更に、本発明の特徴の一つは、本発明の核酸の融解曲線の分析をする方法の各手段をコンピュータに実行させることができるようにしたプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体、また、前記本発明のＰＣＲ方法のデータ解析方法の各手段をコンピュータに実行させることができるようにしたプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体において、本発明の核酸の融解曲線の分析をする方法の各手段をコンピュータに実行させることができるようにしたプログラムを追加して記録したコンピュータ読取可能な記録媒体である。   Furthermore, one of the features of the present invention is a computer-readable recording medium storing a program that allows a computer to execute each means of the method for analyzing a melting curve of a nucleic acid of the present invention, Each of the methods for analyzing a melting curve of a nucleic acid of the present invention on a computer-readable recording medium recording a program that allows a computer to execute each means of the data analysis method of the PCR method of the present invention. A computer-readable recording medium additionally recorded with a program that allows a computer to execute the means.

本発明の前記のデータ解析方法、装置、及び記録媒体は、医学、法医学、人類学、古代生物学、生物学、遺伝子工学、分子生物学、農学、植物育種学等の各種の分野で利用できる。また、複合微生物系、共生微生物系と云われ、色々の種類の微生物若しくは他の動物、植物が混在していて相互に単離できない微生物系等に好適に利用できる。ここで云う微生物とは一般的に云う微生物のことで、特に限定されるものではない。例えば、真核微生物、原核微生物、その他マイコプラズマ、ウイルス、リッケチャ等を挙げることができる。   The data analysis method, apparatus, and recording medium of the present invention can be used in various fields such as medicine, forensic medicine, anthropology, ancient biology, biology, genetic engineering, molecular biology, agriculture, plant breeding, and the like. . Moreover, it can be suitably used for a microbial system that is referred to as a complex microbial system or a symbiotic microbial system and cannot be isolated from each other because various kinds of microorganisms or other animals and plants are mixed. The microorganism referred to herein is a microorganism generally referred to, and is not particularly limited. For example, eukaryotic microorganisms, prokaryotic microorganisms, other mycoplasmas, viruses, rickettsias and the like can be mentioned.

また、本発明の前記データ解析方法、装置及び記録媒体を用いて、複合微生物系又は共生微生物系における特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝子ＤＮＡのコピー数を定量することにより、当該系における特定菌株の存在量を測定することができる。それは、５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡの遺伝子ＤＮＡのコピー数は菌株よって一定であるからである。尚、本発明においては、複合微生物系又は共生微生物系のホモジネートを用いて、本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲを行い、特定菌株の存在量を測定する方法も、本発明の技術的範囲内とする。   Further, by quantifying the copy number of 5S rRNA, 16S rRNA or 23S rRNA of a specific strain in a complex microorganism system or a symbiotic microorganism system using the data analysis method, apparatus and recording medium of the present invention, the system The abundance of a specific strain in can be measured. This is because the gene DNA copy number of 5SrRNA, 16SrRNA or 23SrRNA is constant depending on the strain. In the present invention, the method for measuring the abundance of a specific strain by carrying out real-time quantitative PCR of the present invention using a complex microorganism or symbiotic microorganism homogenate is also within the technical scope of the present invention. .

次に実施例及び比較例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
実施例１
大腸菌（Escherichia coli）の１６ＳｒＲＮＡの核酸塩基配列にハイブリダイゼーションする、即ち、(3')CCGCTCACGCATC(5')の塩基配列を有する核酸プローブの調製を以下の通りに行った。 Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples and comparative examples.
Example 1
A nucleic acid probe that hybridizes to the nucleic acid base sequence of 16S rRNA of Escherichia coli, that is, having a base sequence of (3 ′) CCGCTCACGCATC (5 ′) was prepared as follows.

核酸プローブの調製：(3')CCGCTCACGCATC(5')の塩基配列をもつデオキシリボオリゴヌクレオチドの３’末端のデオキシリボースの３’位炭素のＯＨ基に、−（ＣＨ2）7−ＮＨ2を結合したものを、メドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社（Midland Certified Reagent Company、 米国）から購入した。更に、モレキュラープローブ（Molecular Probes）社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter Kits）F-6082（ボデピーＦＬのプロピオン酸サクシニミジルエステル（BODIPY FL propionic acid succinimidyl esters）の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合する試薬を含有するキット）を購入した。当該キットを前記購入のオリゴヌクレオチドに作用させて、本発明で使用するボデピーＦＬで標識した核酸プローブを合成した。 Preparation of nucleic acid probes: (3 ') to the position OH group of carbon 3' deoxyribose at the 3 'terminus of the deoxyribooligonucleotide with a nucleotide sequence of CCGCTCACGCATC (5'), - coupling the (CH 2) 7 -NH 2 The product was purchased from Medland Certified Reagent Company (USA). Furthermore, in addition to Fluo Reporter Kits F-6082 (BODIPY FL propionic acid succinimidyl esters) from Molecular Probes, the compounds can be used as oligonucleotide amines. A kit containing a reagent that binds to the derivative) was purchased. The kit was allowed to act on the purchased oligonucleotide to synthesize a nucleic acid probe labeled with bodepy FL used in the present invention.

合成物の精製：得られた合成物を乾固し乾固物を得た。それを０．５Ｍ ＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。当該溶解物をＮＡＰ−２５カラム（ファルマシア社製）でゲルろ過を行い、未反応物を除去した。更に逆相HPLC（B gradient：１５〜６５％、２５分間）を以下の条件で行った。そして、溶出するメインピークを分取した。分取した画分を凍結乾燥して、最初のオリゴヌクレオチド原料２ｍＭより２３％の収率で核酸プローブを得た。 Purification of synthesized product : The obtained synthesized product was dried to obtain a dried product. It was dissolved in 0.5M NaHCO 3 / Na 2 CO 3 buffer (pH 9.0). The lysate was subjected to gel filtration with a NAP-25 column (Pharmacia) to remove unreacted substances. Further, reverse phase HPLC (B gradient: 15 to 65%, 25 minutes) was performed under the following conditions. And the main peak which eluted was fractionated. The fraction thus collected was lyophilized to obtain a nucleic acid probe in a yield of 23% from 2 mM of the first oligonucleotide raw material.

尚、上記の逆相クトマトグラフィーの条件は次の通りである：
溶出ソルベントＡ：０．０５Ｎ TEAA ５％CH3CN
溶出ソルベントＢ（グラジエント(gradient)用）：０．０５Ｎ
TEAA ４０％CH3CN
カラム：CAPCEL PAK C18； ６×２５０ｍｍ
溶出速度：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
温度：４０℃
検出：２５４ｎｍ The conditions for the above reversed-phase chromatography are as follows:
Elution solvent A: 0.05N TEAA 5% CH 3 CN
Elution solvent B (for gradient): 0.05N
TEAA 40% CH 3 CN
Column: CAPCEL PAK C18; 6 x 250 mm
Elution rate: 1.0 ml / min
Temperature: 40 ° C
Detection: 254 nm

実施例２
殺菌したニュウトリエントブロス（ＮＢ）（Difco社製）液体培地５０ｍｌ（組成：ＮＢ、０．０８ｇ／１００ｍｌ）を含有する２００ｍｌ容の三角フラスコを用いて、大腸菌ＪＭ１０９株を３７℃で一晩振蘯培養した。次に、本培養液に９９．７％エタノールを当量添加した。このエタノール添加培養液２ｍｌを２．０ｍｌ容量のエッペンドルフ遠心チューブで遠心分離し、菌体を得た。３０ｍＭリン酸緩衝液（ソーダ塩）（ｐＨ：７．２）１００μｌで菌体を一回洗浄した。菌体を１３０ｍＭのＮａＣｌ含有の前記リン酸緩衝液１００μｌに懸濁した。当該懸濁液を氷冷中で４０分間超音波処理し（出力：３３ｗ、発振周波数：２０ｋＨｚ、発振法：０．５秒発振、０．５秒休止）、ホモジネートを作製した。 Example 2
Using a 200 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml of sterilized Nutrient Broth (NB) (Difco) liquid medium (composition: NB, 0.08 g / 100 ml), E. coli strain JM109 was shaken overnight at 37 ° C. Cultured. Next, an equivalent amount of 99.7% ethanol was added to the main culture solution. 2 ml of this ethanol-added culture was centrifuged with a 2.0 ml Eppendorf centrifuge tube to obtain bacterial cells. The cells were washed once with 100 μl of 30 mM phosphate buffer (soda salt) (pH: 7.2). The cells were suspended in 100 μl of the phosphate buffer containing 130 mM NaCl. The suspension was sonicated in ice-cooling for 40 minutes (output: 33 w, oscillation frequency: 20 kHz, oscillation method: oscillation for 0.5 seconds, pause for 0.5 seconds) to produce a homogenate.

前記ホモジネートを遠心分離した後、上澄液を採取し蛍光光度計のセルに移した。それを３６℃に温調した。それに３６℃に予め加温した前記核酸プローブの溶液を最終濃度で５ｎＭとなるように添加した。３６℃に温調しながら９０分間大腸菌１６ＳｒＲＮＡと核酸プローブとをハイブリダイゼーションさせた。そして蛍光光度計で蛍光色素の発光量を測定した。   After the homogenate was centrifuged, the supernatant was collected and transferred to a fluorometer cell. The temperature was adjusted to 36 ° C. The nucleic acid probe solution pre-warmed to 36 ° C. was added to a final concentration of 5 nM. The Escherichia coli 16S rRNA and the nucleic acid probe were hybridized for 90 minutes while controlling the temperature at 36 ° C. The amount of luminescence of the fluorescent dye was measured with a fluorometer.

ハイブリダイゼーション前の蛍光色素の発光量は、上記の上澄液の代りに、１３０ｍＭのＮａＣｌ含有の３０ｍＭのリン酸緩衝液（ソーダ塩）（ｐＨ：７．２）を用いて測定した値を採用した。核酸プローブの量と上澄液の量の比を変えて発光量を測定した（励起光５０３ｎｍ；測定蛍光色５１２ｎｍ）。その結果を図１に示した。図１から分かるように、上澄液の量比が増加することにより蛍光色素の発光が減少することが分かる。即ち、本発明においては、核酸プローブにハイブリダイゼーションする標的核酸量に比例して、蛍光色素の発光の減少量の大きさが大きくなることが分かる。   The light emission amount of the fluorescent dye before hybridization is a value measured using a 30 mM phosphate buffer (soda salt) (pH: 7.2) containing 130 mM NaCl instead of the above supernatant. did. The amount of luminescence was measured by changing the ratio between the amount of the nucleic acid probe and the amount of the supernatant (excitation light 503 nm; measurement fluorescence color 512 nm). The results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 1, the emission of the fluorescent dye decreases as the amount ratio of the supernatant increases. That is, in the present invention, it can be seen that the amount of decrease in the emission of the fluorescent dye increases in proportion to the amount of target nucleic acid that hybridizes to the nucleic acid probe.

実施例３
核酸プローブの調製：大腸菌ＪＭ１０９株の２３ＳｒＲＮＡにハイブリダイゼーションする(5')CCCACATCGTTTTGTCTGGG(3')の塩基配列をもつオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドの３’位炭素のＯＨ基に、−（ＣＨ2)7−ＮＨ2を結合したものを、実施例１と同様にメドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社（Midland Certified Reagent Company、米国）から購入した。更に、実施例１と同様にモレキュラープローブ（Molecular Probes）社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter Kit) F-6082 (ボデピーＦＬのプロピオン酸サクシニミジルエステル(BODIPY FL propionic acid succinimidyl ester）の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合する試薬を含有するキット）を購入した。当該キットを前記オリゴヌクレオチドに作用させて、ボデピーＦＬで標識した核酸プローブを合成した。得られた合成物を実施例１と同様に精製して、最初のオリゴヌクレオチド原料２ｍＭより２５％の収率でボデピーＦＬで標識した核酸プローブを得た。 Example 3
Nucleic acid probe preparation: Hybridizing to 23S rRNA of E. coli strain JM109 (5 ′) CCCACATCGTTTTGTCTGGG (3 ′) To the OH group at the 3 ′ carbon of the 5 ′ terminal nucleotide of the oligonucleotide, — (CH 2 ) 7- NH 2 -bonded product was purchased from Medland Certified Reagent Company (USA) in the same manner as in Example 1. Further, as in Example 1, in addition to FluoReporter Kit F-6082 (BODIPY FL propionic acid succinimidyl ester) from Molecular Probes, Kits containing reagents that bind compounds to amine derivatives of oligonucleotides were purchased. The kit was allowed to act on the oligonucleotide to synthesize a nucleic acid probe labeled with bodepy FL. The obtained synthesized product was purified in the same manner as in Example 1 to obtain a nucleic acid probe labeled with bodepy FL at a yield of 25% from 2 mM of the first oligonucleotide raw material.

実施例４
実施例２で得られた大腸菌ＪＭ１０９株の菌体に実施例２と同一の培地及び培養条件で調製したシュウドモナス・プウシモビルス ４２１Ｙ株（Pseudomonas paucimobilis）（現在名：スフィンゴモナス・プウシモビルス）（FERM P-5122）の菌体をＯＤ６６０値で大腸菌ＪＭ１０９株と同濃度混合し、複合微生物系を調製した。得られた混合液（大腸菌ＪＭ１０９株の菌体濃度は実施例２と同一）について実施例２と同じ方法によりホモジネートを調製した。実施例３で調製した核酸プローブを用いて、励起光を５４３ｎｍ、また、測定蛍光色を５６９ｎｍにする以外は、実施例２と同様な実験を行った結果、実施例２と同様な結果を得た。 Example 4
Pseudomonas paucimobilis (current name: Sphingomonas pusiomobils) (FERM P-5122) prepared in the same medium and culture conditions as in Example 2 on the cells of Escherichia coli JM109 obtained in Example 2 ) Was mixed at the same concentration with E. coli strain JM109 at an OD660 value to prepare a complex microorganism system. A homogenate was prepared by the same method as in Example 2 for the obtained mixed solution (the cell concentration of Escherichia coli JM109 strain was the same as in Example 2). Using the nucleic acid probe prepared in Example 3, an experiment similar to Example 2 was performed except that the excitation light was changed to 543 nm and the measurement fluorescence color was changed to 569 nm. As a result, the same result as in Example 2 was obtained. It was.

実施例５
蛍光消光現象における標的核酸の塩基選択性、即ち、本発明の塩基特異性を検討した。下記に示す標的合成デオキシリボオリゴヌクレオチド（３０mer）のpoly a〜jの１０種類をＤＮＡ合成機ＡＢＩ３９４（Perkin Elmer社製、米国)で調製した。 Example 5
The base selectivity of the target nucleic acid in the fluorescence quenching phenomenon, that is, the base specificity of the present invention was examined. Ten types of poly a to j of the target synthetic deoxyribooligonucleotide (30 mer) shown below were prepared with a DNA synthesizer ABI394 (Perkin Elmer, USA).

更に、上記の合成ＤＮＡに対応するデオキシリボオリゴヌクレオチドの５’末端にボデピーＦＬで標識した下記に示す本発明のプローブを調製した。
上記の合成ＤＮＡに対応するプライマーＤＮＡの５’末端のリン酸基に、−（ＣＨ2)6−ＮＨ2を結合したものをメドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社（Midland Certified Reagent Company、米国）から購入した。更に、モレキュラープローブ（Molecular Probes）社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter Kits）Ｆ−６０８２（ボデピーＦＬのプロピオン酸サクシニジルエステル（BODIPY FL propionic acid succinidyl esters)の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合させる試薬を含有するキット）を購入した。当該キットを前記購入のプライマーＤＮＡに作用させて下記のボデピーＦＬで標識した本発明のプローブｐｒｏｂｅ ａ〜ｄ、及びｆ〜ｈのを合成した。そして対応する合成デオキシリボオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素の発光がどの程度減少するかを下記の条件下に調べ、本発明のプローブの特異性を検討した。 Furthermore, the following probe of the present invention labeled with bodepy FL at the 5 ′ end of the deoxyribooligonucleotide corresponding to the above synthetic DNA was prepared.
A primer group corresponding to the above synthetic DNA having a phosphate group at the 5 ′ end bound to — (CH 2 ) 6 —NH 2 was obtained from Medland Certified Reagent Company, USA ) Purchased from. Furthermore, in addition to Fluo Reporter Kits F-6082 (BODIPY FL propionic acid succinidyl esters) from Molecular Probes, the compounds are converted to amine derivatives of oligonucleotides. Purchased a kit containing a reagent to be bound to. The probe probes a to d and f to h of the present invention labeled with the following bodepy FL were synthesized by allowing the kit to act on the purchased primer DNA. Then, the degree of emission of the fluorescent dye when hybridized with the corresponding synthetic deoxyribooligonucleotide was examined under the following conditions, and the specificity of the probe of the present invention was examined.

Figure 0004724380
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（１）ハイブリダイゼーション溶液のコンポーネント
合成ＤＮＡ ３２０ｎＭ（終濃度）
核酸プローブ ８０ｎＭ（終濃度）
ＮａＣｌ ５０ｍＭ（終濃度）
ＭｇＣｌ2 １ｍＭ（終濃度）
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．２） １００ｍＭ（終濃度）
ミリＱ純水 １．６９９２ｍｌ
終全量 ２．００００ｍｌ
（２）ハイブリダイゼーションの温度：５１℃
（３）測定条件：
励起光 ：５４３ｎｍ
測定蛍光色 ：５６９ｎｍ (1) Components of hybridization solution Synthetic DNA 320 nM (final concentration)
Nucleic acid probe 80nM (final concentration)
NaCl 50 mM (final concentration)
MgCl 2 1 mM (final concentration)
Tris-HCl buffer (pH = 7.2) 100 mM (final concentration)
Milli-Q pure water 1.6992ml
Final volume 2.000ml
(2) Hybridization temperature: 51 ° C
(3) Measurement conditions:
Excitation light: 543 nm
Measurement fluorescence color: 569 nm

Figure 0004724380
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その結果を表１に示した。表１から分かるように、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的ＤＮＡ（デオキシリボオリゴヌクレオチド）にハイブリダイゼーションしたときに、当該末端部において、当該プローブと標的ＤＮＡとがハイブリダイゼーションした末端塩基部から１〜３塩基離れて、標的ＤＮＡの塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１塩基以上存在するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることが好適であることを示している。また、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的ＤＮＡにハイブリダイゼーションしたときに、当該末端部においてハイブリダイゼーション物の塩基対がＧとＣのペアーを少なくとも一対以上形成するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることが好適であることが表１から分かる。   The results are shown in Table 1. As can be seen from Table 1, when a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye is hybridized to a target DNA (deoxyribooligonucleotide), 1 terminal from the terminal base part where the probe and target DNA hybridized is present at the terminal part. This indicates that it is preferable that the base sequence of the probe is designed so that there is at least one base of G (guanine) in the base sequence of the target DNA at a distance of -3 bases. In addition, when a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye is hybridized to the target DNA, the base sequence of the probe is such that the base pair of the hybridization product forms at least one pair of G and C at the terminal portion. It can be seen from Table 1 that it is preferable that is designed.

実施例６
下記のような塩基配列の標的核酸と本発明の核酸プローブを調製した。標的核酸内のＧ及び本発明の核酸プローブ内のＧの数の影響について、前記実施例と同様にして調べた。 Example 6
A target nucleic acid having the following base sequence and a nucleic acid probe of the present invention were prepared. The influence of the number of G in the target nucleic acid and the number of G in the nucleic acid probe of the present invention was examined in the same manner as in the above example.

Figure 0004724380
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表２から分かるように、標的核酸内のＧの数、本発明のプローブ内のＧの数はそれほど蛍光強度の減少に影響しないことが認識される。   As can be seen from Table 2, it is recognized that the number of G in the target nucleic acid and the number of G in the probe of the present invention do not significantly affect the decrease in fluorescence intensity.

実施例７
下記のような塩基配列の標的核酸と本発明の核酸プローブを調製した。標的核酸内の塩基種及び本発明の核酸プローブ内の塩基種の影響について、前記実施例と同様にして調べた。 Example 7
A target nucleic acid having the following base sequence and a nucleic acid probe of the present invention were prepared. The influence of the base species in the target nucleic acid and the base species in the nucleic acid probe of the present invention was examined in the same manner as in the above Example.

Figure 0004724380
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表３及び前記の実施例から分かるように、(i)蛍光色素で標識される本発明のプローブの末端がＣで構成され、標的核酸がハイブリダイゼーションしたとき、ＧＣ ペアーを形成するとき、(ii)蛍光色素で標識される本発明のプローブの末端がＣ以外の塩基で構成された場合、蛍光色素で標識されている個所の塩基と、標的核酸の塩基との塩基ペアーより、標的核酸の３’末端側にＧが少なくとも１個以上存在する場合に、蛍光強度の減少率が大きいことが分かる。   As can be seen from Table 3 and the above examples, (i) when the end of the probe of the present invention labeled with a fluorescent dye is composed of C and the target nucleic acid is hybridized to form a GC pair, (ii ) When the end of the probe of the present invention labeled with a fluorescent dye is composed of a base other than C, the target nucleic acid 3 is determined from the base pair of the base labeled with the fluorescent dye and the base of the target nucleic acid. It can be seen that when at least one G is present on the terminal side, the rate of decrease in fluorescence intensity is large.

実施例８
本発明の核酸プローブに標識する色素の種類について、前記実施例と同様にして調べた。なお、本発明のプローブは、前記実施例７のプローブｚを、また、標的核酸は前記実施例７のオリゴヌクレオチドｚを用いた。
その結果を、表４に示した。表から分かるように、本発明に用いる蛍光色素として好適なものは、FITC、 BODIPY FL、 BODIPY FL/C3、 6-joe、TMRなどを挙げることができる。 Example 8
The kind of the dye labeled on the nucleic acid probe of the present invention was examined in the same manner as in the above example. Note that the probe z of Example 7 was used as the probe of the present invention, and the oligonucleotide z of Example 7 was used as the target nucleic acid.
The results are shown in Table 4. As can be seen from the table, suitable fluorescent dyes for use in the present invention include FITC, BODIPY FL, BODIPY FL / C3, 6-joe, TMR and the like.

Figure 0004724380
Figure 0004724380

実施例９
核酸プローブの調製：大腸菌ＪＭ１０９株の１６ＳｒＲＮＡの１１５６塩基目から１１９０塩基の塩基配列に相当するＫＹＭ−７株の１６ＳｒＲＮＡ塩基配列に特異的にハイブリダイゼーションする(5')CAT CCC CAC CTT CCT CCC AGT TGA CCC CGG CAG TC(3')（３５塩基対）の塩基配列をもち、１〜１６及び２５〜３５塩基目がデオキシリボヌクレオチド、１７〜２４塩基目が２’位炭素のＯＨ基をアミノ基で修飾したリボオリゴヌクレオチドからなり、５’末端のリン酸基のＯＨ基を-(CH2)7-NN2で修飾しを結合したものを、実施例１と同様にメドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社（Midland Certified Reagent Company、米国）から購入した。更に実施例１と同様にモレキュラープローブ（Molecular Probes）社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter Kits) F-6082 （ボデピーＦＬ／Ｃ６のプロピオン酸サクシニミジルエステル（BODIPY FL/ C6 propionic acid succinimidyl ester）の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合する試薬を含有するキット）を購入した。当該キットを前記オリゴヌクレオチドに作用させて、ボデピーFL/C6で標識した核酸プローブを合成した。得られた合成物を実施例１と同様に精製して、最初のオリゴヌクレオチド原料２ｍＭより２３％の収率でボデピーFL/C6で標識した核酸プローブを得た。このプローブを３５塩基鎖2-O-Meプローブと名づけた。 Example 9
Nucleic acid probe preparation: specifically hybridizes to the 16S rRNA base sequence of the KYM-7 strain corresponding to the base sequence of 1190 to 1190 bases of 16S rRNA of Escherichia coli JM109 strain (5 ') CAT CCC CAC CTT CCT CCC AGT TGA CCC CGG CAG TC (3 ') (35 base pairs), 1 to 16 and 25 to 35 bases modified with deoxyribonucleotides, and 17 to 24 bases with 2' position OH group modified with amino group A ribooligonucleotide obtained by modifying the OH group of the phosphate group at the 5 ′ end with — (CH 2 ) 7 —NN 2 , and combining it with Medland Certified Resint as in Example 1. Purchased from Company (Midland Certified Reagent Company, USA). Furthermore, in the same manner as in Example 1, other than FluoReporter Kits F-6082 (BODIPY FL / C6 propionic acid succinimidyl ester) from Molecular Probes, Inc. In addition, a kit containing a reagent that binds the compound to an amine derivative of an oligonucleotide was purchased. The kit was allowed to act on the oligonucleotide to synthesize a nucleic acid probe labeled with bodepy FL / C6. The obtained synthesized product was purified in the same manner as in Example 1 to obtain a nucleic acid probe labeled with Bodepy FL / C6 at a yield of 23% from 2 mM of the first oligonucleotide raw material. This probe was named 35-base chain 2-O-Me probe.

（５’）AGG CCG GCC CTT GAC TTT CCT（３’）の塩基配列を有するリボキシオリゴヌクレオチドを前記同様にしてＤＮＡ合成機を用いて合成して、ホワード（ｆｏｒｗａｒｄ）型のヘルパープローブとした。一方、（５’）AUG GGA GUU CAG UAG UAC CCG CAA UGC UGG UCC(3')の塩基配列を有するリボキシオリゴヌクレオチドを前記同様にしてＤＮＡ合成機を用いて合成して、バックワード(back ward) 型のヘルパープローブとした。   (5 ') A riboxy oligonucleotide having the base sequence of AGG CCG GCC CTT GAC TTT CCT (3') was synthesized using a DNA synthesizer in the same manner as described above to obtain a forward type helper probe. On the other hand, a riboxy oligonucleotide having the base sequence of (5 ′) AUG GGA GUU CAG UAG UAC CCG CAA UGC UGG UCC (3 ′) was synthesized using a DNA synthesizer in the same manner as described above, and the backward (backward) ) Type helper probe.

前記の１６ＳｒＲＮＡを９５℃で５分加熱処理した後、下記に示す反応条件においたプローブ溶液に添加した後、蛍光測定機器パーキンエルマー（Perkin Elmer) LS-50Bで蛍光強度を測定した。その結果を図２に示した。尚、上記の加熱処理しない１６ＳｒＲＮＡを用いたものをコントロールとした。加熱処理した実験区においては、蛍光強度の減少が大きいことが図２から分かる。この結果は、１６ＳｒＲＮＡを９５℃で加熱処理することで本発明のプローブとより強いハイブリダイゼーションをしていることを示している。
反応条件：
16SrRNA: 10.0 nM
プローブ: 25nM
緩衝液： 100mM コハク酸、125mM 水酸化リチウム、８．５％
リチウムドデシルサルファイト、pH 5.1
温度: 70℃ The 16S rRNA was heat-treated at 95 ° C. for 5 minutes, added to the probe solution under the reaction conditions shown below, and then measured for fluorescence intensity with a fluorescence measuring instrument Perkin Elmer LS-50B. The results are shown in FIG. A control using 16S rRNA not subjected to heat treatment was used as a control. It can be seen from FIG. 2 that the decrease in fluorescence intensity is large in the heat-treated experimental section. This result indicates that the 16S rRNA is heat-treated at 95 ° C. to thereby perform stronger hybridization with the probe of the present invention.
Reaction conditions:
16SrRNA: 10.0 nM
Probe: 25nM
Buffer: 100 mM succinic acid, 125 mM lithium hydroxide, 8.5%
Lithium dodecyl sulfite, pH 5.1
Temperature: 70 ℃

実施例１０（ヘルパープローブのハイブリダイゼーション効率への影響）
前記の１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイゼーションする下記の本発明のプローブ及びヘルパープローブを前記と同様にして調製した。そして下記の条件にて、本発明の2'-O-Meプローブの効果、当該プローブの塩基鎖の長さの影響、及びヘルパープローブの効果について検討した。その結果を図３のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄに示した。図から、本発明の2'-O-Meプローブがハイブリダイゼーション効率に寄与していることが分かる。また、2'-O-Meプローブの塩基鎖が短い場合にヘルパープローブがハイブリダイゼーション効率を高めるのに役立っている。 Example 10 (Effect of helper probe on hybridization efficiency)
The following probes and helper probes of the present invention that hybridize to the 16S rRNA were prepared as described above. Under the following conditions, the effect of the 2′-O-Me probe of the present invention, the influence of the length of the base chain of the probe, and the effect of the helper probe were examined. The results are shown in A, B, C, and D of FIG. From the figure, it can be seen that the 2′-O-Me probe of the present invention contributes to the hybridization efficiency. In addition, when the base chain of the 2′-O-Me probe is short, the helper probe is useful for increasing the hybridization efficiency.

１）前記と同じ３５塩基鎖2'-O-Meプローブ、
２）前記１）と同じ３５塩基鎖2'-O-Meプローブと同じ塩基配列であるが、オリゴヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドで構成されているプローブ（３５塩基鎖DNA プローブ）、
３）前記１）の３５塩基鎖2-O-Meプローブと同じ塩基配列であるが、５’末端から８塩基分、３’末端から１０塩基分のヌクレオチドを削除したプローブ（１７塩基鎖2-O-Me プローブ）、
４）前記２）の３３塩基鎖DNAプローブと同じ塩基配列であるが、３’末端から１６塩基分のヌクレオチドを削除したプローブ（１７塩基鎖DNAプローブ）、 1) The same 35-base 2′-O-Me probe as described above,
2) A probe (35 base chain DNA probe) that has the same base sequence as the 35 base chain 2′-O-Me probe as in 1) above, but whose oligonucleotide is composed of deoxyribonucleotides,
3) Probe having the same base sequence as the 35-base chain 2-O-Me probe of 1) above, except that nucleotides corresponding to 8 bases from the 5 'end and 10 bases from the 3' end are deleted (17 base chain 2- O-Me probe),
4) A probe having the same base sequence as the 33 base DNA probe of 2) above, except that 16 base nucleotides are deleted from the 3 ′ end (17 base DNA probe),

５）前記ホワード型ヘルパープローブの中央８塩基分のＯＨ基をメチル基で修飾したヘルパープローブ(ファード型 2-O-Meヘルパープローブ)
６）前記リバース型ヘルパープローブの中央８塩基分のＯＨ基をメチル基で修飾したヘルパープローブ(リバース型 2-O-Meヘルパープローブ）
７）前記フォワード型ヘルパープローブの塩基配列と同じ塩基配列であるが、オリゴヌクレオチドがデオキヌクレオチドで構成されているヘルパープローブ(ファワード型 DNA ヘルパープローブ）
８）前記リバース型ヘルパープローブの塩基配列と同じ塩基配列であるが、デオキリボヌクレオチドがで構成されているヘルパープローブ(リバース型 DNA ヘルパープローブ）
９）(5')GUGACGGUCACUAUUUGACCUCCUUCCACCCC(3')なる塩基配列を有するリボオリゴヌクレオチド（３５塩基リボオリゴヌクレオチド）、
１０）(5')GUGACGGUCACUAUUUG(3')なる塩基配列を有するリボオリゴヌクレオチド（１７塩基鎖リボオリゴヌクレオチド）、 5) A helper probe obtained by modifying the OH group of the central 8 bases of the forward-type helper probe with a methyl group (fard type 2-O-Me helper probe)
6) Helper probe (reverse type 2-O-Me helper probe) in which the OH group of the center 8 bases of the reverse type helper probe is modified with a methyl group
7) A helper probe having the same base sequence as that of the forward type helper probe, but having an oligonucleotide composed of deoxynucleotides (a forward type DNA helper probe)
8) A helper probe having the same base sequence as the reverse helper probe but comprising deoxyribonucleotides (reverse DNA helper probe)
9) Ribooligonucleotide having a base sequence of (5 ′) GUGACGGUCACUAUUUGACCUCCUUCCACCCC (3 ′) (35 base ribooligonucleotide),
10) a ribooligonucleotide having a base sequence of (5 ′) GUGACGGUCACUAUUUG (3 ′) (17-base ribooligonucleotide),

反応条件：
１６ＳｒＲＮＡ： 10nM
プローブ： 25nM
ヘルパープローブ： 1μM
緩衝液： 100mM コハク酸、125mM 水酸化リチウム、
８．５％ リチウムドデシルサルファイト、pH 5.1
温度：
・３５塩基鎖リボオリゴヌクレオチド2-O-Meプローブ使用の場合：
７０℃
・１７塩基鎖リボオリゴヌクレオチド２−Ｏ−Ｍｅプローブまたは
３３塩基鎖リボオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブ：６５℃
・１７塩基鎖リボオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブ：５０℃ Reaction conditions:
16S rRNA: 10 nM
Probe: 25nM
Helper probe: 1μM
Buffer: 100 mM succinic acid, 125 mM lithium hydroxide,
8.5% lithium dodecyl sulfite, pH 5.1
temperature:
・ When using a 35-base ribooligonucleotide 2-O-Me probe:
70 ° C
17 base chain ribooligonucleotide 2-O-Me probe or
33-base ribooligonucleotide DNA probe: 65 ° C
17-base ribooligonucleotide DNA probe: 50 ° C.

実施例１１（ｒＲＮＡ測定のための検量線の作成）
０．１〜１０ｎＭの範囲の前記ｒＲＮＡを９５℃で５分間加熱後、予め下記反応条件においた反応液に添加し、１０００秒後、蛍光強度の減少をパーキンエルマーLS-50Bを使用して測定した。その結果を図４に示した。図から検量線は０．１〜１０ｎＭにおいて直線性を示すことが分かる。
反応条件：
３３塩基鎖リボオリゴヌクレオチド2-O-Meプローブ： 1.0〜25nM
緩衝液： 100mM コハク酸、125mM 水酸化リチウム、
８．５％ リチウムドデシルサルファイト、
ｐＨ ５．１
温度： ７０℃ Example 11 (Preparation of calibration curve for rRNA measurement)
The rRNA in the range of 0.1 to 10 nM is heated at 95 ° C. for 5 minutes and then added to the reaction solution under the following reaction conditions in advance. After 1000 seconds, the decrease in fluorescence intensity is measured using a Perkin Elmer LS-50B. did. The results are shown in FIG. It can be seen from the figure that the calibration curve exhibits linearity at 0.1 to 10 nM.
Reaction conditions:
33-base ribooligonucleotide 2-O-Me probe: 1.0-25 nM
Buffer: 100 mM succinic acid, 125 mM lithium hydroxide,
8.5% lithium dodecyl sulfite,
pH 5.1
Temperature: 70 ° C

実施例１２(FISH方法)
セルロモナス（Cellulomonas）sp.KYM-7（FERM P-16806）及びアグロバクテリウム（Agrobacterium) sp. KYM-8(FERM P-11358)の各々のｒＲＮＡにハイブリダイゼーションする本発明のプローブ35〜36塩基鎖デオキシオリゴヌクレオチド 2-O-Meプローブを前記と同様にして調製した。各プローブの塩基配列は下記の通りである。 Example 12 (FISH method)
Probes 35 to 36 of the present invention that hybridize to the respective rRNAs of Cellulomonas sp. KYM-7 (FERM P-16806) and Agrobacterium sp. KYM-8 (FERM P-11358) Deoxyoligonucleotide 2-O-Me probe was prepared as described above. The base sequence of each probe is as follows.

セルロモナス sp.KYM-7のｒＲＮＡ測定のための３５塩基鎖デオキシオリゴヌクレオチド２−Ｏ−Ｍｅプローブ：
（5')CAT CCC CAC CTT CCT CCG AGT TGA CCC CGG CAG TC(3')（アンダーライン部分がメチル基で修飾されている。）。
アグロバクテリウム sp. KYM-8(FERM P-11358)のｒＲＮＡ測定のための３６塩基鎖デオキシオリゴヌクレオチド２−Ｏ−Ｍｅプローブ：
(5')CAT CCC CAC CTT CCT CTC GGC TTA TCA CCG GCA GTC(3')（アンダーライン部分がメチル基で修飾されている。）。 35-base deoxyoligonucleotide 2-O-Me probe for rRNA measurement of Cellulomonas sp. KYM-7:
(5 ') CAT CCC CAC CTT CCT C CG AGT TGA CCC CGG CAG TC (3') (Underline part is modified with a methyl group).
36-base chain deoxyoligonucleotide 2-O-Me probe for rRNA measurement of Agrobacterium sp. KYM-8 (FERM P-11358):
(5 ′) CAT CCC CAC CTT CCT C TC GGC TTA T CA CCG GCA GTC (3 ′) (underlined part is modified with a methyl group).

セルロモナス sp. KYM-7及びアグロバクテリウムsp. KYM-8を下記の培地組成で下記の培養条件で混合培養し、培養時間毎に培養物を採取した。それらから、ｒＲＮＡをRNeasy Maxikit（QIAGENE社）を用いて調製した。当該ｒＲＮＡを９５℃で５分加熱後、予め反応条件においた反応液に添加し、７０℃、１０００秒間反応させた後、蛍光強度をパーキンエルマーLS-50Bを使用して測定した。その結果を図５に示した。尚、全rＲＮＡはリボグリーン（RiboGreen) RNA Kit （会社名：モレキュラープローブ（molecular probes)、所在地名：Eugene,Oregon, USA）を用いて測定した。
図から分かるように、各菌株のｒＲＮＡの動態は全 rＲＮＡの動態と一致した。また、各菌株のｒＲＮＡの合計量は全ｒＲＮＡと一致した。このことは、本発明方法はFISH方法において有効な方法になることを示している。 Cellulomonas sp. KYM-7 and Agrobacterium sp. KYM-8 were mixed and cultured under the following culture conditions with the following medium composition, and cultures were collected at each incubation time. From them, rRNA was prepared using RNeasy Maxikit (QIAGENE). The rRNA was heated at 95 ° C. for 5 minutes, then added to the reaction solution in advance under reaction conditions, reacted at 70 ° C. for 1000 seconds, and then the fluorescence intensity was measured using Perkin Elmer LS-50B. The results are shown in FIG. The total rRNA was measured using RiboGreen RNA Kit (company name: molecular probes, location name: Eugene, Oregon, USA).
As can be seen from the figure, the kinetics of rRNA in each strain was consistent with the kinetics of total rRNA. Moreover, the total amount of rRNA of each strain was consistent with the total rRNA. This indicates that the method of the present invention is an effective method in the FISH method.

培地組成（g/l）：デンプン，10.0；アスパラギン酸，0.1； K2HPO4，5.0;
KH2PO4,2.0;MgSO4・7H2O ,0.2;NaCl，0.1; (NH4)2SO4;0.1.
培地１００ｍｌを５００ｍｌ容のコニカルフラスコに分注し、該フラスコを１２０℃で１０分間、オートクレーブ釜を用いて殺菌した。 Medium composition (g / l): starch, 10.0; aspartic acid, 0.1; K 2 HPO 4 , 5.0;
KH 2 PO 4 , 2.0; MgSO 4 7H 2 O, 0.2; NaCl, 0.1; (NH 4 ) 2 SO 4 ; 0.1.
100 ml of the medium was dispensed into a 500 ml conical flask, and the flask was sterilized at 120 ° C. for 10 minutes using an autoclave kettle.

培養条件：前記の菌株を斜面培地で予め培養した。該斜面培地より１白金耳の菌体をとり、前記の殺菌したコニカルフラスコに接種した。３０℃、１５０ｒｐｍで撹拌培養した。 Culture conditions: The aforementioned strain was previously cultured in a slant medium. One platinum loop of fungus was taken from the slant medium and inoculated into the sterilized conical flask. Stirring culture was performed at 30 ° C. and 150 rpm.

反応条件：
３３塩基鎖デオキシオリゴヌクレオチド２−Ｏ−Ｍｅプローブ: 1.0〜10nM
緩衝液: 100mM コハク酸、125mM 水酸化リチウム、
8.5% リチウムドデシルサルファイト、ｐＨ ５．１
温度： 70℃ Reaction conditions:
33-base deoxyoligonucleotide 2-O-Me probe: 1.0 to 10 nM
Buffer: 100 mM succinic acid, 125 mM lithium hydroxide,
8.5% lithium dodecyl sulfite, pH 5.1
Temperature: 70 ℃

以下実施例１３に、標的核酸若しくは遺伝子の多型及び変異を解析若しくは測定する方法を記す。
実施例１３
下記に示した塩基配列をもつ４種類のオリゴヌクレオチドを前記実施例５のＤＮＡ合成機を用いて合成した。また、前記実施例５と同様にして、下記の塩基配列の本発明の核酸プローブを合成した。該プローブと各々のオリゴヌクレオチドを溶液中でハイブリダイゼーションさせた後、蛍光強度の変化から１塩基置換の評価ができるかどうか検討した。本発明の核酸プローブの塩基配列は、標的オリゴヌクレオチドの３’末端にＧが存在する場合に、１００％マッチするように設計されている。ハイブリダイゼーション温度は、プローブと標的オリゴヌクレオチドの全塩基対（base-pairs）が１００％ハイブリダイゼーションできる４０℃に設定した。プローブ及び標的オリゴヌクレオチドの濃度、緩衝液の濃度，蛍光測定装置、蛍光測定条件、実験操作などは、前記実施例５と同様である。 Hereinafter, Example 13 describes a method for analyzing or measuring a target nucleic acid or gene polymorphism and mutation.
Example 13
Four types of oligonucleotides having the base sequences shown below were synthesized using the DNA synthesizer of Example 5. Further, in the same manner as in Example 5, the nucleic acid probe of the present invention having the following base sequence was synthesized. After the probe and each oligonucleotide were hybridized in solution, it was examined whether single base substitution could be evaluated from the change in fluorescence intensity. The base sequence of the nucleic acid probe of the present invention is designed to match 100% when G is present at the 3 ′ end of the target oligonucleotide. The hybridization temperature was set to 40 ° C. at which 100% hybridization of all base-pairs of the probe and the target oligonucleotide was possible. The concentration of the probe and target oligonucleotide, the concentration of the buffer, the fluorescence measuring device, the fluorescence measuring conditions, the experimental operation, etc. are the same as in Example 5.

Figure 0004724380
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その結果を表５に示した。表から、標的オリゴヌクレオチドＮｏ．１〜３においては、蛍光強度に変化は観察されなかったが、標的オリゴヌクレオチドＮｏ．４においては８４％の減少が観察された。   The results are shown in Table 5. From the table, the target oligonucleotide No. 1-3, no change was observed in the fluorescence intensity. In 4 a decrease of 84% was observed.

Figure 0004724380
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本発明において、標的核酸若しくは遺伝子（Ｎｏ．１〜４）の多型及び変異を解析若しくは測定若しくは測定する方法により得られるデータ（表５のカラムＡ及びＢのデータ）を解析する方法において、標的核酸若しくは遺伝子が蛍光色素で標識された核酸プローブ（上記の核酸プローブ）とハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のハイブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正するとは、表３の（Ａ−Ｂ）／Ｂの計算をいう。
以上の結果より、標的核酸が２本鎖の場合、Ｇ→Ａ、Ｇ←Ａ、Ｃ→Ｔ、Ｃ←Ｔ、Ｇ→Ｃ、Ｇ←Ｃの置換を検出できることが明らかになった。 In the present invention, a method for analyzing data (data in columns A and B in Table 5) obtained by a method for analyzing or measuring or measuring a polymorphism and mutation of a target nucleic acid or gene (No. 1 to 4) When the fluorescence intensity value of the reaction system when the nucleic acid or gene is hybridized with a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye (the above-mentioned nucleic acid probe) is corrected by the fluorescence intensity value of the reaction system when not hybridized Means the calculation of (AB) / B in Table 3.
From the above results, it was revealed that when the target nucleic acid is double-stranded, substitutions of G → A, G ← A, C → T, C ← T, G → C, and G ← C can be detected.

実施例１４
図６に本発明のＤＮＡチップのモデルを図示した。先ず、実施例１３で調製した本発明のプローブ、3'TTTTTTTTGGGGGGGGC5'BODIPY FL/C6の３’末端の３’位のＯＨにアミノ基を導入したもの、また、スライドガラスを反応基としてエポキシ基を有するシランカップリン剤でスライドガラスの表面を処理したものを用意する。上記の本発明のプローブを含む溶液をＤＮＡチップ作成装置GMSTM417ARRAYER(TAKARA)で該スライドガラス上にスポットする。そうすると、３’末端で発明のプローブがガラス面に結合する。該スライドガラスを密閉容器内に４時間位おき反応を完結させる。そして該スライドガラスを０．２％ＳＤＳ溶液、水に１分程度交互に２回づつ漬ける。更にホウ素溶液（水３００ｍｌにNaBH4１．０ｇを溶かしたもの。）に５分位つける。９５℃の水に２分つけてから、素早く０．２％ＳＤＳ溶液、水に１分程度交互に２回づつ漬けて試薬を洗い流す。室温で乾燥する。このようにして本発明のＤＮＡチップが調製される。
更に、各スポットのガラスの下面に図のような微小な温度センサーとヒータを設けることにより、高性能な本発明のＤＮＡチップを作成することができる。
このＤＮＡチップを用いて標的核酸若しくは遺伝子を測定する場合を説明する。該プローブに標的核酸若しくは遺伝子がハイブリダイゼーションしていないときは、又はハイブリダイゼーションしても本発明の蛍光色素標識末端でＧＣペアーを形成しないとき、若しくは当該プローブと標的核酸しくは遺伝子とがハイブリダイゼーションした末端塩基部分から１ないし３塩基離れて、標的核酸若しくは遺伝子の塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１ないし３塩基存在しないときは、蛍光強度に変化ない。しかし、ハイブリダイゼーションすると蛍光強度が減少する。この蛍光強度はＤＮＡチップ解析装置ＧＭＳTM４１８アレースキャナー（Array Scanner）（TAKARA）を使用して測定できる。 Example 14
FIG. 6 shows a model of the DNA chip of the present invention. First, the probe of the present invention prepared in Example 13, the 3′TTTTTTTTGGGGGGGGC5′BODIPY FL / C6, introduced with an amino group at the 3′-position OH of the 3 ′ end, and an epoxy group with a slide glass as a reactive group What prepared the thing which processed the surface of the slide glass with the silane coupling agent which has is prepared. The solution containing the probe of the present invention is spotted on the slide glass with a DNA chip production apparatus GMS ™ 417ARRAYER (TAKARA). The inventive probe then binds to the glass surface at the 3 'end. The slide glass is placed in a sealed container for about 4 hours to complete the reaction. Then, the glass slide is soaked twice in a 0.2% SDS solution and water for about 1 minute. Further, place it in a boron solution (1.0 ml of NaBH 4 dissolved in 300 ml of water) for about 5 minutes. After soaking in water at 95 ° C. for 2 minutes, quickly soak the reagent in a 0.2% SDS solution and water alternately for about 1 minute twice. Dry at room temperature. In this way, the DNA chip of the present invention is prepared.
Furthermore, a high-performance DNA chip of the present invention can be produced by providing a minute temperature sensor and heater as shown in the figure on the lower surface of the glass of each spot.
A case where a target nucleic acid or gene is measured using this DNA chip will be described. When the target nucleic acid or gene is not hybridized to the probe, or when a GC pair is not formed at the fluorescent dye-labeled end of the present invention even after hybridization, or the probe and the target nucleic acid or gene are hybridized When G (guanine) is not present in the base sequence of the target nucleic acid or gene at least 1 to 3 bases away from the terminal base portion, the fluorescence intensity does not change. However, the fluorescence intensity decreases upon hybridization. This fluorescence intensity can be measured using a DNA chip analyzer GMS ™ 418 Array Scanner (TAKARA).

以下、実施例１５〜１９に本発明のＰＣＲ方法を記す。
実施例１５
大腸菌のゲノムＤＮＡにおける１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を標的核酸として、当該核酸の増幅のための（BODIPY FL/C6で標識した）プライマーを調製した。 Hereinafter, Examples 15 to 19 describe the PCR method of the present invention.
Example 15
Primers (labeled with BODIPY FL / C6) for amplification of the nucleic acid were prepared using the 16S rRNA gene in the genomic DNA of E. coli as a target nucleic acid.

プライマー１（Eu800R：リバース型）の調製：(5')CATCGTTTACGGCGTGGAC(3')の塩基配列をもつデオキシリボオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機ABI394(Perkin Elmer社製、米国）を用いて合成し、更に当該オリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端のリン酸基をホスファターゼ処理してシトシンとし、そのシトシンの５’位の炭素OH基に、-(CH2)9-NH2を結合したものを、ミドランド・サーテイファイド・レージンド・カンパニー社（米国）から購入した。更に、モレキュラープローブ社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter Kits)F-6082（ボデピーFL/C6のプロピオン酸サクシニミジルエステル（BODIPY FL propionic acid succinimidyl ester）の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合させる試薬を含有するキット）を購入した。前記購入したオリゴヌクレオチドに当該キットを作用させて、本発明のボデピーFL/C6で標識したプライマー１を合成した。 Preparation of primer 1 (Eu800R: reverse type): A deoxyribooligonucleotide having the base sequence of (5 ′) CATCGTTTACGGCGTGGAC (3 ′) was synthesized using a DNA synthesizer ABI394 (manufactured by Perkin Elmer, USA). The phosphate group at the 5 'end of the oligodeoxyribonucleotide was treated with phosphatase to form cytosine, and-(CH 2 ) 9 -NH 2 was bound to the carbon OH group at the 5' position of the cytosine. Purchased from Fade Raisin Company (USA). Furthermore, in addition to FluoReporter Kits F-6082 (BODIPY FL propionic acid succinimidyl ester of Bodepy FL / C6) from Molecular Probes, the compound is converted into an amine derivative of oligonucleotide. A kit containing the reagent to be bound was purchased. The kit was allowed to act on the purchased oligonucleotide to synthesize Primer 1 labeled with Bodepy FL / C6 of the present invention.

合成物の精製：得られた合成物を乾固し乾固物を得た。それを0.5M Na2CO3/NaHCO3緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。当該溶解物をＮＡＰ−２５カラム（ファルマシア社製）でゲルろ過を行い、未反応物を除去した。更に逆相HPLC（B gradient：１５〜６５％、２５分間）を以下の条件で行った。そして、溶出するメインピークを分取した。分取した画分を凍結乾燥して本発明のプライマー１を、最初のオリゴヌクレオチド原料２ｍＭより５０％の収率で得た。 Purification of synthesized product: The obtained synthesized product was dried to obtain a dried product. It was dissolved in 0.5M Na 2 CO 3 / NaHCO 3 buffer (pH 9.0). The lysate was subjected to gel filtration with a NAP-25 column (Pharmacia) to remove unreacted substances. Further, reverse phase HPLC (B gradient: 15 to 65%, 25 minutes) was performed under the following conditions. And the main peak which eluted was fractionated. The fraction obtained was freeze-dried to obtain the primer 1 of the present invention in a yield of 50% from the initial oligonucleotide raw material of 2 mM.

尚、上記の逆相クロマトグラフィーの条件は次の通りである：
溶出ソルベントＡ：0.05N TEAA 5%CH3CN
溶出ソルベントＢ（グラジエント(gradient)用）：0.05N TEAA
40%CH3CN
カラム：CAPCEL PAK C18 ；6×250mm
溶出速度：１．０ml/min
温度：４０℃
検出：２５４ｎｍ The conditions for the above reverse phase chromatography are as follows:
Elution solvent A: 0.05N TEAA 5% CH 3 CN
Elution Solvent B (for gradient): 0.05N TEAA
40% CH 3 CN
Column: CAPCEL PAK C 18 ; 6 x 250mm
Elution rate: 1.0 ml / min
Temperature: 40 ° C
Detection: 254 nm

実施例１６
プライマー２（Eu500R/forward：フォワード型）の調製：(5')CCAGCAGCCGCGGTAATAC(3')の塩基配列をもつデオキシリボオリゴヌクレオチドの５’末端に蛍光色素（BODIPY FL/C6）で標識したプライマー２を実施例１３と同様にして収率５０％で調製した。 Example 16
Preparation of primer 2 (Eu500R / forward: forward type): (5 ′) Primer 2 labeled with a fluorescent dye (BODIPY FL / C6) at the 5 ′ end of a deoxyribooligonucleotide having the base sequence of CCAGCAGCCGCGGTAATAC (3 ′) Prepared in 50% yield as in Example 13.

実施例１７
殺菌したニュトリエントブロス(NB)（Difco社製）液体培地５ml（組成：NB、0.08g/100ml）を含有する試験管を用いて、大腸菌JM109株を３７℃で一晩振蘯培養した。培養液１．５mlを１．５ml容量の遠心チューブで遠心分離し、菌体を得た。この菌体から、DNeasy Tissue Kit（キアゲン社、ドイツ国）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。その方法は本キットのプロトコルに従った。その結果、17ng/μlのＤＮＡ溶液を得た。 Example 17
Using a test tube containing 5 ml of a sterilized nutritive broth (NB) (manufactured by Difco) liquid medium (composition: NB, 0.08 g / 100 ml), E. coli strain JM109 was shaken overnight at 37 ° C. 1.5 ml of the culture solution was centrifuged with a 1.5 ml capacity centrifuge tube to obtain bacterial cells. Genomic DNA was extracted from the cells using DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Germany). The method followed the protocol of this kit. As a result, a DNA solution of 17 ng / μl was obtained.

実施例１８
上記の大腸菌のゲノムＤＮＡ、プライマー１及び／又はプライマー２を使用して、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社発売のライトサイクラーTMシステム（LightCyclerTM System）を用いて常法通りにＰＣＲ反応を行った。操作は当該システム機器の手順書に従った。
また、上記システムにおいてＰＣＲは、当該手順書に記されている核酸プローブ（FRET現象を利用する二個のプローブ）と通常のプライマー（蛍光色素で標識されていない通常のプライマー）の代りに本発明プライマー１及び／又は２を用いる以外は当該手順書通りに行った。 Example 18
Genomic DNA of the E. coli, using primers 1 and / or primer 2, PCR was carried out in a conventional manner by using the Roche Diagnostics Corporation launch of the LightCycler TM system (LightCycler TM System) . The operation followed the procedure manual for the system equipment.
In the above system, PCR is performed according to the present invention in place of the nucleic acid probes (two probes using the FRET phenomenon) and ordinary primers (ordinary primers not labeled with a fluorescent dye) described in the procedure. The procedure was followed except that primers 1 and / or 2 were used.

ＰＣＲは次のコンポーネントで行った。
大腸菌ゲノムＤＮＡ溶液 ３．５μｌ（終濃度０〜６ｎｇ／２０μｌ）
（終コピー数０〜２．４・１０6個）
プライマー溶液 ０．８μｌ（終濃度０．０８μＭ）
Ｔａｑ溶液 １０．０μｌ
ミリＱ純水 ５．７μｌ
全容量 ２０．０μｌ
尚、標的核酸である大腸菌１６ＳｒＤＮＡは、図７の説明欄に示される実験区の濃度で、また、プライマーは、同様に図７の注に示される実験区のプライマー１及び／又は２の組合せで実験を行った。 PCR was performed with the following components.
E. coli genomic DNA solution 3.5 μl (final concentration 0-6 ng / 20 μl)
(Final copy number 0-2.4 · 10 6 )
Primer solution 0.8 μl (final concentration 0.08 μM)
Taq solution 10.0 μl
Milli Q pure water 5.7μl
Total volume 20.0μl
The target nucleic acid E. coli 16SrDNA is the concentration in the experimental group shown in the explanatory column of FIG. 7, and the primer is also a combination of primer 1 and / or 2 in the experimental group shown in the note of FIG. The experiment was conducted.

また、上記のTaq溶液は次の試薬の混合液である。
Taq 溶液 ９６．０μｌ
ミリＱ純水 ６８．２μｌ
Taq DNA ポリメラーゼ溶液 ２４．０μｌ
Taq スタート(start) ３．８μｌ The above Taq solution is a mixture of the following reagents.
Taq solution 96.0 μl
Milli Q pure water 68.2μl
Taq DNA polymerase solution 24.0 μl
Taq start 3.8μl

尚、Taq 溶液、 Taq DNAポリメラーゼ溶液はロシュ・ダイアグノスティックス株式会社発売のＤＮＡマスターハイブリダイゼーションプローブ（DNA Master Hybridization Probes)キットのものである。特にTaq DNA ポリメラーゼ溶液は10×conc.（赤いキャップ）を１０倍に希釈して用いた。また、Taq スタートは、クローンテック社（ＵＳＡ）より販売されているTaq DNAポリメラーゼ用の抗体で、これを反応液に添加することで７０℃までTaq DNAポリメラーゼの活性を抑えることができる。即ち、ホット・スタート(hot start)を行うことができるものである。   The Taq solution and Taq DNA polymerase solution are those of the DNA Master Hybridization Probes kit sold by Roche Diagnostics Inc. In particular, the Taq DNA polymerase solution was used by diluting 10 × conc. (Red cap) 10 times. Taq start is an antibody for Taq DNA polymerase sold by Clontech (USA), and the activity of Taq DNA polymerase can be suppressed to 70 ° C. by adding it to the reaction solution. That is, a hot start can be performed.

反応条件は次の如くである。
変性（denaturation） 初期：９５℃、１２０秒
再：９５℃、 ０秒
アニーリング（annealing）条件 ５７℃、５秒
測定は、ライトサイクラーTMシステムを用いて行った。その際、該システムにあるＦ１〜３の検出器にうち、Ｆ１の検出器を用い、その検出器のゲインは１０、励起強度は７５に固定した。 The reaction conditions are as follows.
Denaturation Initial: 95 ° C, 120 seconds
Re: 95 ° C., 0 seconds Annealing conditions 57 ° C., 5 seconds Measurement was performed using a LightCycler ™ system. At that time, among the detectors F1 to F3 in the system, the detector of F1 was used, and the gain of the detector was fixed to 10 and the excitation intensity was fixed to 75.

その結果を図７及び８に示した。図７及び８から、蛍光色素の発光の減少が観察される時点のサイクル数と標的核酸の大腸菌１６ＳｒＤＮＡのコピー数が比例していることが分かる。尚、図においては、蛍光色素の発光の減少量を蛍光強度の減少値として表現した。
図９は、サイクル数を関数として、大腸菌１６ＳｒＤＮＡのコピー数を表現した大腸菌１６ＳｒＤＮＡの検量線である。相関係数は０．９９７３で、極めてよい相関を示した。
以上の結果から分かるように、本発明の定量的ＰＣＲ方法を用いると標的核酸の当初のコピー数を測定できるようになる。即ち、標的核酸の測定ができる。 The results are shown in FIGS. 7 and 8, it can be seen that the number of cycles at which the decrease in the emission of the fluorescent dye is observed is proportional to the number of copies of the target nucleic acid E. coli 16S rDNA. In the figure, the amount of decrease in emission of the fluorescent dye is expressed as a decrease in fluorescence intensity.
FIG. 9 is a calibration curve of E. coli 16SrDNA expressing the copy number of E. coli 16SrDNA as a function of the number of cycles. The correlation coefficient was 0.9973, indicating a very good correlation.
As can be seen from the above results, the initial copy number of the target nucleic acid can be measured by using the quantitative PCR method of the present invention. That is, the target nucleic acid can be measured.

実施例１９
実施例１８においては、本発明のプローブをプライマーとしてＰＣＲを行ったが、本実施例では従来法に用いるＦＲＥＴ現象を利用する二個のプローブの代わりに本発明のプローブを用いて下記の条件で本発明のＰＣＲを行った。
ａ）標的核酸:大腸菌の16S-rDNA
ｂ）使用プライマー：
・フォワードプライマー E8F: (3')AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(5')
・リバースプライマー E1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT(5')
ｃ）使用プローブ: BODIPY FL-(3')CCTTCCCACATCGTTT(5')
ｄ）使用PCR測定機器:ライトサイクラーTMシステム
ｅ）ＰＣＲの条件:
変性反応:95℃ for 0秒 (60秒間、95℃)
アニーリング反応: 50℃ for 5秒
核酸伸長反応: 72℃ for 70秒
全サイクル数: 70サイクル Example 19
In Example 18, PCR was performed using the probe of the present invention as a primer, but in this example, the probe of the present invention was used instead of the two probes using the FRET phenomenon used in the conventional method under the following conditions. The PCR of the present invention was performed.
a) Target nucleic acid: Escherichia coli 16S-rDNA
b) Primers used:
・ Forward primer E8F: (3 ') AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (5')
・ Reverse primer E1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT (5 ')
c) Probe used: BODIPY FL- (3 ') CCTTCCCACATCGTTT (5')
d) Equipment used for PCR measurement: Lightcycler TM system e) PCR conditions:
Denaturation reaction: 95 ° C for 0 seconds (60 seconds, 95 ° C)
Annealing reaction: 50 ℃ for 5 seconds Nucleic acid extension reaction: 72 ℃ for 70 seconds Total number of cycles: 70 cycles

ｆ）蛍光測定（アニーリング反応と変性反応後各サイクル後一回づつ測定された。
ｇ）反応液の組成:
反応液の全量:20 μl
DNA ポリメラーゼの量 (TaKaRa Ex taq): 0.5U
Taq スタート(抗体): 0.3μl
プライマーの濃度: 0.2μM (双方とも)
プローブの濃度: 0.05 μM
MgCl2 濃度: 2 mM
BSA(bovine serum albumin)濃度:0.25 mg/ml
dNTPs濃度: 2.5 mM (各ヌクレオチドについて). f) Fluorescence measurement (measured once after each cycle after annealing and denaturing reactions).
g) Composition of reaction solution:
Total reaction volume: 20 μl
Amount of DNA polymerase (TaKaRa Ex taq): 0.5U
Taq start (antibody): 0.3μl
Primer concentration: 0.2 μM (both)
Probe concentration: 0.05 μM
MgCl 2 concentration: 2 mM
BSA (bovine serum albumin) concentration: 0.25 mg / ml
dNTPs concentration: 2.5 mM (for each nucleotide).

その結果を図１０に示した。図から、蛍光色素の発光の減少が観察される時点のサイクル数と標的核酸の大腸菌１６ＳｒＤＮＡのコピー数が比例していることが分かる。
以上の結果から分かるように、本発明の定量的ＰＣＲ方法を用いると標的核酸の当初のコピー数を測定できるようになる。即ち、標的核酸の測定ができる。 The results are shown in FIG. From the figure, it can be seen that the number of cycles at which the decrease in the emission of the fluorescent dye is observed is proportional to the number of copies of the target nucleic acid E. coli 16S rDNA.
As can be seen from the above results, the initial copy number of the target nucleic acid can be measured by using the quantitative PCR method of the present invention. That is, the target nucleic acid can be measured.

次に以下の実施例に、上記の本発明の定量的ＰＣＲ方法を用いて得られるデータを解析する本発明のデータ解析方法について記す。
実施例２０
ヒトゲノムＤＮＡ（ヒトβ−グロビン（globin）（TaKaRaカタログ商品番号 ９０６０）（TaKaRa株式会社製）（以下、ヒトゲノムＤＮＡという。）を標的核酸として、当該核酸の増幅のためのボデピー FL/C6で標識したプライマーを調製した。 Next, the data analysis method of the present invention for analyzing data obtained by using the quantitative PCR method of the present invention will be described in the following examples.
Example 20
Human genomic DNA (human β-globin (TaKaRa catalog product number 9060) (manufactured by TaKaRa Inc.) (hereinafter referred to as human genomic DNA) was used as a target nucleic acid and labeled with Bodepy FL / C6 for amplification of the nucleic acid. Primers were prepared.

プライマーKM38+C（リバース型）の調製：（5')CTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG(3')の塩基配列をもつデオキシリボオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機ABI394(Perkin Elmer社製、米国）を用いて合成し、更に当該オリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端のリン酸基をホスファターゼ処理してシトシンとし、そのシトシンの５’位の炭素ＯＨ基に、-(CH2)9-NH2を結合したものを、ミドランド・サーテイファイド・レージンド・カンパニー社から購入した。更に、モレキュラープローブ社からリポーターキット（FluoReporter Kits)F-6082（ボデピーFL/C6のプロピオン酸サクシニミジルエステル(BODIPY FL propionic acid succinimidyl esters)の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合させる試薬を含有するキット）を購入した。前記購入したオリゴヌクレオチドに当該キットを作用させて、本発明のボデピーFL/C6で標識したプライマーKM38+Cを合成した。 Preparation of primer KM38 + C (reverse type): (5 ′) Deoxyribooligonucleotide having the base sequence of CTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG (3 ′) was synthesized using DNA synthesizer ABI394 (manufactured by Perkin Elmer, USA), and further The phosphate group at the 5 ′ end of the oligodeoxyribonucleotide was treated with phosphatase to form cytosine, and the 5′-position carbon OH group of the cytosine was bound with — (CH 2 ) 9 —NH 2. Purchased from Fade Resin Company. Furthermore, in addition to FluoReporter Kits F-6082 (BODIPY FL propionic acid succinimidyl esters of Bodepy FL / C6) from Molecular Probes, this compound is bound to an amine derivative of an oligonucleotide. A kit containing the reagent) was purchased. The kit was allowed to act on the purchased oligonucleotide to synthesize primer KM38 + C labeled with Bodepy FL / C6 of the present invention.

合成物の精製：得られた合成物を乾固し乾固物を得た。それを0.5M Na2CO3/NaH2CO3緩衝液(pH9.0)に溶解した。当該溶解物をNAP-25カラム（ファルマシア社製）でゲルろ過を行い、未反応物を除去した。更に逆相HPLC(B gradient:15〜65%、25分間）を以下の条件で行った。そして、溶出するメインピークを分取した。分取した画分を凍結乾燥して本発明のプライマーKM38+Cを、最初のオリゴヌクレオチド原料2mMより５０％の収率で得た。 Purification of synthesized product: The obtained synthesized product was dried to obtain a dried product. It was dissolved in 0.5M Na 2 CO 3 / NaH 2 CO 3 buffer (pH 9.0). The lysate was subjected to gel filtration with a NAP-25 column (Pharmacia) to remove unreacted substances. Further, reverse phase HPLC (B gradient: 15 to 65%, 25 minutes) was performed under the following conditions. And the main peak which eluted was fractionated. The collected fraction was freeze-dried to obtain the primer KM38 + C of the present invention in a yield of 50% from 2 mM of the first oligonucleotide raw material.

尚、上記の逆相クロマトグラフィーの条件は次の通りである：
溶出ソルベントＡ：0.05N TEAA 5%CH3CN
溶出ソルベントＢ（グラジエント（gradient）用）：0.05N
TEAA 40%CH3CN
カラム：CAPCEL PAK C18;6×250mm
溶出速度：1.0ml/min
温度：40℃
検出：254nm The conditions for the above reverse phase chromatography are as follows:
Elution solvent A: 0.05N TEAA 5% CH 3 CN
Elution solvent B (for gradient): 0.05N
TEAA 40% CH 3 CN
Column: CAPCEL PAK C18; 6 x 250mm
Elution rate: 1.0ml / min
Temperature: 40 ° C
Detection: 254nm

実施例２１
プライマーKM29（フォワード型）の調製：(5')GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG(3')の塩基配列をもつデオキシリボオリゴヌクレオチドを実施例１８と同様に合成した。 Example 21
Preparation of primer KM29 (forward type): Deoxyribooligonucleotide having the base sequence of (5 ′) GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG (3 ′) was synthesized in the same manner as in Example 18.

比較実験例１（本発明の、核酸伸長反応時の蛍光強度値を、熱変性反応時の蛍光強度値を用いて割る演算処理過程を有ないデーター解析用ソフトウエアを用いた実験例）。
上記のヒトゲノムＤＮＡ、プライマーKM38+C及びプライマーKM29を使用して、ライトサイクラー TMシステムを用いてＰＣＲ反応を行い、各サイクル毎の蛍光強度を測定した。
尚、本比較実施例のＰＣＲは、前記に説明した蛍光色素色素で標識したプライマーを用いるものであり、蛍光発光の増加でなく、減少を測定する新規なリアルタイム定量的ＰＣＲ方法である。データー解析用ソフトウエアは当該システムのものを用いて行った。上記システムにおいてＰＣＲは、当該手順書に記されている核酸プローブ（ＦＲＥＴ現象を利用する二個のプローブ）と通常のプライマー（蛍光色素で標識されていない通常のプライマー）の代りに本発明プライマーKM38+C及びKM29を用いる以外は当該装置の手順書通りに行った。 Comparative Experimental Example 1 (Experimental example using the data analysis software according to the present invention, which does not have a calculation process for dividing the fluorescence intensity value during the nucleic acid extension reaction by using the fluorescence intensity value during the heat denaturation reaction).
Using the above human genomic DNA, primer KM38 + C and primer KM29, PCR reaction was performed using the LightCycler ™ system, and the fluorescence intensity for each cycle was measured.
The PCR of this comparative example uses a primer labeled with the fluorescent dye described above, and is a novel real-time quantitative PCR method that measures a decrease rather than an increase in fluorescence. The software for data analysis was performed using the system. In the above system, PCR is carried out by using the primer KM38 of the present invention instead of the nucleic acid probe (two probes using the FRET phenomenon) described in the procedure and a normal primer (a normal primer not labeled with a fluorescent dye). Except for using + C and KM29, the procedure was performed according to the procedure of the apparatus.

ＰＣＲは次のコンポーネントで行った。
ヒトゲノムＤＮＡ 1.0μl（最終濃度1〜10000コピー）
プライマー溶液 4.0μl（最終濃度0.1μM）
Taq溶液 10.0μｌ
ミリＱ純水 5.0μl
全容量 20.0μl
尚、ヒトゲノムＤＮＡは、図１１の説明欄に示される実験区の濃度で実験を行った。MgCl2の最終濃度は2mMであった。 PCR was performed with the following components.
Human genomic DNA 1.0μl (final concentration 1-1000 copies)
Primer solution 4.0μl (final concentration 0.1μM)
Taq solution 10.0μl
Milli Q pure water 5.0μl
Total volume 20.0μl
The human genomic DNA was tested at the concentration in the experimental group shown in the explanatory column of FIG. The final concentration of MgCl 2 was 2 mM.

また、上記のTaq溶液は次に試薬の混合液である。
Taq 溶液 96.0μl
ミリＱ純水 68.2μl
Taq DNA ポリメラーゼ 24.0μl
Taq スタート 3.8μl Further, the above Taq solution is a mixed solution of reagents next.
Taq solution 96.0μl
Milli Q pure water 68.2μl
Taq DNA polymerase 24.0μl
Taq start 3.8μl

尚、Taq溶液、 Taq DNA ポリメラーゼ溶液はロシュ・ダイアグノスティックス株式会社発売のＤＮＡマスターハイブリダイゼーションプローブ（DNA Master Hybridization Probes）キットのものである。特にＴaq DNA ポリメラーゼ溶液は10×conc.（赤いキャップ）を１０倍に希釈して用いた。また、Ｔaqスタートは、クローンテック社（ＵＳＡ）より販売されているTaq DNA ポリメラーゼ用の抗体で、これを反応液に添加することで７０℃までTaq DNAポリメラーゼの活性を抑えることができる。即ち、ホット・スタートを行うことができるものである。   The Taq solution and Taq DNA polymerase solution are those of the DNA Master Hybridization Probes kit released by Roche Diagnostics Inc. In particular, Taq DNA polymerase solution was used by diluting 10 × conc. (Red cap) 10 times. Taq start is an antibody for Taq DNA polymerase sold by Clontech (USA), and the activity of Taq DNA polymerase can be suppressed to 70 ° C. by adding it to the reaction solution. That is, a hot start can be performed.

反応条件は次の如くである。
変性反応初期 ：95℃、60秒
再変性反応 ：95℃、10秒
アニーリング反応 ：60℃、5秒
ＤＮＡ伸長反応 ：72℃、17秒
測定は、ライトサイクラーTMシステムを用いて行った。その際、該システムにあるＦ１〜３の検出器にうち、Ｆ１の検出器を用い、その検出器のゲインは１０、励起強度は７５に固定した。 The reaction conditions are as follows.
Denaturation reaction initial stage: 95 ° C., 60 seconds Re-denaturation reaction: 95 ° C., 10 seconds Annealing reaction: 60 ° C., 5 seconds DNA extension reaction: 72 ° C., 17 seconds Measurement was performed using a LightCycler ™ system. At that time, among the detectors F1 to F3 in the system, the detector of F1 was used, and the gain of the detector was fixed to 10 and the excitation intensity was fixed to 75.

前記の如くにＰＣＲを行って、各サイクルの蛍光強度を実測した結果を図１１に示した。即ち、各コピー数のヒトゲノムＤＮＡについて、各サイクルの変性反応時及び核酸伸長反応時の蛍光強度を測定し、印字したものである。どのサイクルにおいても変性反応時には蛍光強度値は一定であるが、核酸伸長反応時には、２５サイクル目当たりから蛍光強度が減少しているのが観察される。そうして、減少はヒトゲノムＤＮＡのコピー数がおおい順に起こることが分かる。   FIG. 11 shows the result of actual measurement of the fluorescence intensity in each cycle by performing PCR as described above. That is, for the human genomic DNA of each copy number, the fluorescence intensity at the time of denaturation reaction and nucleic acid extension reaction of each cycle was measured and printed. In any cycle, the fluorescence intensity value is constant during the denaturation reaction, but during the nucleic acid extension reaction, it is observed that the fluorescence intensity decreases from around the 25th cycle. Thus, it can be seen that the decrease occurs in descending order of the copy number of human genomic DNA.

図１１においてヒトゲノムＤＮＡの各コピー数について初期のサイクル数の蛍光強度値が一様でない。それで、本実験例で使用するデーター解析方法に以下の過程を追加した。
（ｂ）１０サイクル目の蛍光強度値を１として各サイクルの蛍光強度値を換算する過程、即ち、下記の〔数式８〕による計算をする過程、
Ｃn＝Ｆn（７２）／Ｆ10（７２） 〔数式８〕
ただし、Ｃn＝各サイクル値の換算値、Ｆn（７２）＝各サイクルの７２℃の蛍光強度値、Ｆ10（７２）＝１０サイクル目の７２℃の蛍光強度値。
（ｃ）前記（ｂ）の過程で得られた換算値を、各サイクル数に対してプロットし、デスプレー上に表示及び／又は印字する過程、 In FIG. 11, the fluorescence intensity value at the initial cycle number is not uniform for each copy number of human genomic DNA. Therefore, the following process was added to the data analysis method used in this experimental example.
(B) The process of converting the fluorescence intensity value of each cycle by setting the fluorescence intensity value of the 10th cycle to 1, that is, the process of calculating by the following [Equation 8],
C n = F n (72) / F 10 (72) [Formula 8]
However, C n = converted value of each cycle value, F n (72) = intensity of fluorescence 72 ° C. of each cycle, F 10 (72) = 10 intensity of fluorescence cycle of 72 ° C..
(C) A process of plotting the converted value obtained in the process of (b) with respect to each cycle number, and displaying and / or printing on the display,

（ｄ）前記（ｂ）の過程で得られた各サイクルの換算値から下記の〔数式９〕による蛍光強度の変化率（減少率、消光率）を計算をする過程、
〔数式９〕
Ｆdn ＝ｌｏｇ10｛１００−Ｃn×１００）｝
Ｆdn ＝２ｌｏｇ10｛１−Ｃn｝
ただし、Ｆdn＝蛍光強度変化率（減少率、消光率）、Ｃn＝〔数式８〕で得られた値。
（ｅ）前記（ｄ）の過程で得られた換算値を、各サイクル数に対してプロットし、デスプレー上に表示及び／又は印字する過程、 (D) A process of calculating the change rate (decrease rate, quenching rate) of the fluorescence intensity according to the following [Equation 9] from the converted value of each cycle obtained in the process of (b).
[Formula 9]
F dn = log 10 {100−C n × 100)}
F dn = 2log 10 {1-C n }
Where F dn = fluorescence intensity change rate (decrease rate, quenching rate), C n = value obtained by [Formula 8].
(E) a process of plotting the converted value obtained in the process of (d) with respect to each cycle number, and displaying and / or printing on the display;

（ｆ）前記（ｄ）の過程で処理されたデーターの内、０．５をスレッシュホールド（ｔｈｒｅｓｈｈｏｌｄ）し、その値に達したサイクル数を計算する過程、
（ｇ）前記（ｆ）の過程で計算した値をＸ軸に、反応開始前のコピー数をＹ軸にプロットしたグラフを作成する過程、
（ｈ）前記（ｇ）の過程で作成したグラフをデスプレー上に表示及び／又は印字する過程、
（ｊ）前記（ｈ）の過程で描かれた直線の相関係数又は関係式を計算する過程、（ｉ）前記（ｊ）の過程で計算された計算値又は関係式をデスプレー上に表示及び／又は印字する過程。 (F) A process of thresholding 0.5 of the data processed in the process of (d) and calculating the number of cycles reaching the value.
(G) A process of creating a graph in which the value calculated in the process of (f) is plotted on the X axis and the copy number before starting the reaction is plotted on the Y axis,
(H) a process of displaying and / or printing the graph created in the process of (g) on the display;
(J) a process of calculating a correlation coefficient or a relational expression of the straight line drawn in the process of (h), (i) a calculation value or a relational expression calculated in the process of (j) is displayed on the display, and The process of printing.

上記のデーター解析用ソフトウエアを用いて、前記図１１で得られたデーターを前記に引き続いて以下のようにデーターを処理した。
図１２は、上記（ｂ）の過程で処理されたデーターを印字した（前記（ｃ）過程）したものである。即ち、１０サイクル目の蛍光強度値を１として換算
し、その換算値をサイクル数に対してプロットしたものである。
図１３は、前記（ｄ）の過程で処理したデーターを印字した（前記（ｅ）過程）ものである。即ち、図１２の各プロット値から蛍光強度の減少率（消光率）を計算して、各計算値を各サイクル数に対してプロットしたものである。 Using the above data analysis software, the data obtained in FIG. 11 was processed as follows, following the above.
FIG. 12 shows the data processed in the process (b) printed (process (c)). That is, the fluorescence intensity value at the 10th cycle is converted as 1, and the converted value is plotted against the number of cycles.
FIG. 13 shows the data processed in the process (d) printed (process (e)). That is, the decrease rate (quenching rate) of the fluorescence intensity is calculated from each plot value in FIG. 12, and each calculated value is plotted against each cycle number.

図１４は、前記（ｆ）の過程で処理したデーターについて、前記（ｇ）の過程で作成したグラフを印字した（前記（ｈ）の過程）ものである。即ち、蛍光強度減少率＝０．５をスレッシュホールド（threshhold）し、その値に達したサイクル数をＸ軸に、ヒトゲノムＤＮＡの反応開始前のコピー数をＹ軸にプロットしたグラフである。このグラフの直線の相関係数（Ｒ２）を前記（ｊ）の過程で計算し、印字した（前記（ｉ）の過程）もので、０．９５１４であった。このように、この相関係数では正確なコピー数を求めるは無理であった。   FIG. 14 shows a graph printed in the process (g) of the data processed in the process (f) (process (h)). That is, it is a graph in which the fluorescence intensity reduction rate = 0.5 is thresholded, the number of cycles that have reached that value is plotted on the X axis, and the number of copies of human genomic DNA before the reaction is plotted on the Y axis. The correlation coefficient (R2) of the straight line of this graph was calculated in the process (j) and printed (process (i)), which was 0.9514. Thus, it is impossible to obtain an exact copy number with this correlation coefficient.

実施例２２（本発明のデーター解析方法を用いてデーター処理がなされた実験例）
ＰＣＲは比較実験例１と同様に行った。
データー処理は、比較実験例１の（ｂ）の過程の前に下記の（ａ）の過程をおき、（ｂ）、（ｄ）の過程を以下のように変更する以外は比較実験例１と同様な過程で行った。
（ａ）各サイクルにおける増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プライマーとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値（即ち、核酸伸長反応時（７２℃）の蛍光強度値）を、増幅した核酸が核酸プライマーとハイブリダイズしたものが解離したときの反応系の蛍光強度値（即ち、核酸熱変性反応時（９５℃）の蛍光強度値）で割る補正演算処理過程、即ち、実測の蛍光強度値を〔数式１〕で補正した。
ｆn＝ｆhyb,n／ｆden,n 〔数式１〕
［式中、ｆn＝サイクルの蛍光強度の補正値、ｆhyb,n＝各サイクルの７２℃の蛍光強度値、ｆden,n＝各サイクルの９５℃の蛍光強度値］
得られた値を各サイクル数にプロットしたのが図１５である。 Example 22 (Experimental example in which data processing was performed using the data analysis method of the present invention)
PCR was performed in the same manner as in Comparative Experimental Example 1.
The data processing is the same as Comparative Experiment Example 1 except that the following process (a) is performed before the process (b) of Comparative Experiment Example 1 and the processes (b) and (d) are changed as follows. The same process was performed.
(A) The fluorescence intensity value of the reaction system when the amplified nucleic acid in each cycle was hybridized with a nucleic acid primer labeled with a fluorescent dye (that is, the fluorescence intensity value at the time of nucleic acid extension reaction (72 ° C.)) was amplified. Correction calculation process divided by the fluorescence intensity value of the reaction system when the nucleic acid hybridized with the nucleic acid primer dissociates (that is, the fluorescence intensity value at the time of nucleic acid heat denaturation reaction (95 ° C.)), that is, the measured fluorescence intensity The value was corrected by [Equation 1].
f n = f hyb, n / f den, n [Formula 1]
[ Where f n = correction value of fluorescence intensity of cycle, f hyb, n = fluorescence intensity value at 72 ° C. of each cycle, f den, n = fluorescence intensity value of 95 ° C. of each cycle]
FIG. 15 is a plot of the obtained values for each cycle number.

（ｂ）各サイクルにおける〔数式１〕における補正演算処理値を〔数式３〕に代入し、各サイクルにおける各サンプル間の蛍光変化率（減少率又は消光率）を算出する演算処理過程、即ち、下記の〔数式１０〕で演算処理する過程、
Ｆn＝ｆn／ｆ25 〔数式１０〕
［式中、Ｆn＝各サイクルの演算処理値、ｆn＝〔数式１〕で得られた各サイクルの値、ｆ25＝〔数式１〕で得られた値で、サイクル数が２５回目のもの］。
〔数式１０〕は〔数式３〕において、ａ＝２５とした場合におけるものである。 (B) Substituting the correction calculation processing value in [Formula 1] in each cycle into [Formula 3], and calculating the fluorescence change rate (decrease rate or quenching rate) between the samples in each cycle, The process of calculating with the following [Equation 10],
F n = f n / f 25 [Formula 10]
[Where F n = calculation value of each cycle, f n = value of each cycle obtained by [Formula 1], f 25 = value obtained by [Formula 1], and the number of cycles is 25th thing].
[Equation 10] is the case where a = 25 in [Equation 3].

（ｄ）前記（ｂ）の過程で得られた各サイクルの演算処理値を〔数式６〕による蛍光強度の変化率（減少率又は消光率）の対数値を演算処理をする過程、即ち、下記の〔数式１１〕で演算処理する過程、
ｌｏｇ10｛（１−Ｆn）×１００｝ 〔数式１１〕
［式中、Ｆn＝［数式１０］で得られた値］。
〔数式１１〕は〔数式６〕において、ｂ＝１０、Ａ＝１００とした場合におけるものである。 (D) The process of calculating the logarithmic value of the change rate (decrease rate or quenching rate) of the fluorescence intensity according to [Equation 6] using the calculation process value of each cycle obtained in the process of (b), that is, The process of calculating with [Formula 11] of
log 10 {(1-F n ) × 100} [Formula 11]
[Wherein, F n = value obtained by [Formula 10]].
[Formula 11] is obtained when b = 10 and A = 100 in [Formula 6].

上記の結果を図１６及び１７に示した。
図１６は、前記（ａ）及び（ｂ）の過程で処理された値をサイクル数に対してプロットし、印字したものである。
図１７は、図１６で得られた値について前記（ｄ）の過程で計算された値を、サイクル数に対してプロットし、印字したものである。 The above results are shown in FIGS.
FIG. 16 is a plot of the values processed in steps (a) and (b) plotted against the number of cycles.
FIG. 17 is a plot of the values obtained in FIG. 16 calculated in the process (d) plotted against the number of cycles.

次に、図１７のグラフを基に、前記（ｆ）、（ｇ）、及び（ｈ）の過程で処理した。即ち、図１７のグラフを基に比較実験例１と同様に、ｌｏｇ10（蛍光強度変化率）のスレッシュホールド値として、０．１、０．３、０．５、０．７、０．９、１．２を選び、その値に達したサイクル数をＸ軸に、ヒトゲノムＤＮＡの反応開始前のコピー数をＹ軸にプロットし、検量線を描かせた。その結果を図１８に示した。これらの検量線について前記（ｊ）及び（ｉ）の過程で処理して求めた相関係数（Ｒ2）は、前記各スレッシュホールド値に対して、各々０．９９８、０．９９９、０．９９９３、０．９９８５、０．９９８９、０．９９８８であった。これらの相関係数から、スレッシュホールド値として０．５（相関係数０．９９９３）を採用することが望ましいことが認識できた。この相関係数をもつ検量線であれば、未知コピー数の核酸試料について反応開始前のコピー数を精度よく求めることができることが分かる。 Next, it processed in the process of said (f), (g), and (h) based on the graph of FIG. That is, the threshold value of log 10 (fluorescence intensity change rate) is set to 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 0.9 based on the graph of FIG. 1.2 was plotted, and the number of cycles that reached that value was plotted on the X-axis, and the number of copies of human genomic DNA before the start of the reaction was plotted on the Y-axis to draw a calibration curve. The results are shown in FIG. Correlation coefficients (R 2 ) obtained by processing these calibration curves in the processes (j) and (i) are 0.998, 0.999, 0. 9993, 0.9985, 0.9989, and 0.9988. From these correlation coefficients, it was recognized that it was desirable to adopt 0.5 (correlation coefficient 0.9993) as the threshold value. It can be seen that a calibration curve having this correlation coefficient can accurately determine the copy number before starting the reaction for a nucleic acid sample having an unknown copy number.

実施例２３（核酸の融解曲線分析及びＴｍ値分析の例）
本発明の新規なＰＣＲ法により増幅された核酸について、５１）低い温度から核酸が完全に変性するまで、温度を徐々に上げるあるいは下げる過程（例えば、５０℃から９５℃まで）、５２）前記５１）過程において、短い時間間隔（例えば、０．２℃〜０．５℃間隔）で蛍光強度を測定する過程、５３）前記５２）過程の測定結果を時間毎にデスプレー上に表示する過程、即ち、核酸の融解曲線を表示する過程、５４）前記５３）過程の融解曲線を一次微分する過程、５５）前記５４）過程の微分値（−ｄＦ／ｄＴ、Ｆ：蛍光強度、Ｔ：時間）をデスプレー上に表示する過程、５６）前記５５）から得られる微分値から変曲点を求める過程からなるソフトウエアを作成し、前記本発明のデーター解析用ソフトウエアに合体した。当該データー解析用ソフトウエアを記録したコンピューター読み取り可能な記録媒体をインストールした前記ライトサイクラーTMシステムを用いて本発明の新規リアルタイム定量的ＰＣＲ反応を行い、核酸融解曲線の分析を行った。本発明においては、蛍光強度は温度が上がるごとに増加する。 Example 23 (Example of melting curve analysis and Tm value analysis of nucleic acid)
For the nucleic acid amplified by the novel PCR method of the present invention, 51) gradually increasing or decreasing the temperature from the low temperature until the nucleic acid is completely denatured (for example, from 50 ° C. to 95 ° C.), 52) 51 ) In the process, the fluorescence intensity is measured at a short time interval (for example, 0.2 ° C. to 0.5 ° C.), 53) The measurement result of the step 52) is displayed on the display every time, ie, 54) the process of displaying the melting curve of the nucleic acid, 54) the process of primary differentiation of the melting curve of the 53) process, 55) the differential value of the 54) process (−dF / dT, F: fluorescence intensity, T: time) 56) Software consisting of a process of displaying on the display, 56) a process of obtaining an inflection point from the differential value obtained from the above 55) was created and incorporated into the data analysis software of the present invention. A novel real-time quantitative PCR reaction of the present invention was performed using the LightCycler ™ system in which the computer-readable recording medium on which the data analysis software was recorded was installed, and the nucleic acid melting curve was analyzed. In the present invention, the fluorescence intensity increases with increasing temperature.

実施例２２と同じヒトゲノムＤＮＡの１コピーと１０コピーについて、実施例２０と同様のＰＣＲを行い、前記５１）、５２）、５３）、５４）及び５５）の過程で処理されたデーターを印字したものが図１９である。１コピーと１０コピーの７５回目の増幅産物について、本実施例の５１）、５２）及び５３）の過程で処理した核酸融解曲線の図が図２０である。５４）の過程でこの曲線を微分し、５５）及び５６）の過程で変曲点（Ｔｍ値）を求めたものが図２１である。図２１から、１コピーと１０コピーの増幅産物のＴｍ値が異なる故に、各増幅産物は異なる産物であることが判明した。   The same PCR as in Example 20 was performed on 1 copy and 10 copies of the same human genomic DNA as in Example 22, and the data processed in the process of 51), 52), 53), 54) and 55) was printed. The thing is FIG. FIG. 20 is a diagram of nucleic acid melting curves obtained by treating the 1st and 10th copies of the 75th amplification product in the process of 51), 52) and 53) of this example. This curve is differentiated in the process of 54), and the inflection point (Tm value) is obtained in the processes of 55) and 56) is shown in FIG. From FIG. 21, it was found that each amplification product was a different product because the Tm values of the 1-copy and 10-copy amplification products were different.

本発明は次のような効果を有する。
１）前記のように本発明の核酸測定方法、本発明のプローブ及びデバイスを用いると、測定系から未反応の核酸プローブを除く等の操作をすることがないので、標的核酸を短時間でかつ簡便に測定できる。また、複合微生物系又は共生微生物系に適用すると、当該系における特定菌株の存在量を特異的かつ短時間に測定できる。また、本発明は標的核酸若しくは遺伝子のＳＮＰなどの多型または変異などの解析若しくは測定する簡便な方法を提供している。
２）また、本発明の定量的ＰＣＲ方法は、次のような効果を有する。
ａ．ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる標的核酸の増幅に阻害的に作用する因子が添加されていないことから、従来公知の特異性のある通常のＰＣＲと同様の条件で定量的ＰＣＲを行うことができる。
ｂ．また、ＰＣＲの特異性を高く保つことができるので、プライマーダイマーの増幅が遅くなることから、従来公知の定量的ＰＣＲと比較すると定量限界が約１オーダー低くなる。
ｃ．複雑な核酸プローブを用意する必要がないので、それに要する時間と費用が節約できる。
ｄ．標的核酸の増幅効果も大きく、増幅過程をリアルタイムでモニタリングすることができる。
３）また、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデーターを解析する際、本発明のデーター解析方法を用いて、未知核酸コピー数の核酸試料について核酸のコピー数を求める検量直線を作成すると、検量線の相関係数は従来の方法により得られたものに較べて格段に高い。それで、本発明のデーター解析方法を用いると核酸の正確なコピー数を求めることができる。
４）また、本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法によって得られたデーターの解析方法に係るデーター解析用ソフトウエア、また、その解析方法の手順をプログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、また、それを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲの測定若しくは解析装置を用いると、相関係数の高い検量直線を自動的に作成することができる。
５）また、本発明の新規な核酸の融解曲線の分析方法を用いると、精度の高い、核酸のＴｍ値を求めることができる。更に、当該方法に係るデーター解析用ソフトウエア、また、その分析方法の手順をプログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、また、それを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲの測定若しくは解析装置を用いると、正確なＴｍ値を求めることができる。 The present invention has the following effects.
1) As described above, when the nucleic acid measurement method of the present invention, the probe and the device of the present invention are used, an operation such as removing an unreacted nucleic acid probe from the measurement system is not performed. It can be measured easily. Moreover, when applied to a complex microorganism system or a symbiotic microorganism system, the abundance of a specific strain in the system can be measured specifically and in a short time. The present invention also provides a simple method for analyzing or measuring polymorphisms or mutations such as target nucleic acids or gene SNPs.
2) Further, the quantitative PCR method of the present invention has the following effects.
a. Since no factor that inhibits the amplification of the target nucleic acid by Taq DNA polymerase is added, quantitative PCR can be carried out under the same conditions as conventional PCR with known specificity.
b. In addition, since the specificity of PCR can be kept high, amplification of primer dimers is delayed, and the limit of quantification is about one order lower than that of conventionally known quantitative PCR.
c. Since it is not necessary to prepare a complicated nucleic acid probe, the time and cost required for it can be saved.
d. The amplification effect of the target nucleic acid is also great, and the amplification process can be monitored in real time.
3) In addition, when analyzing data obtained by the real-time quantitative PCR method, using the data analysis method of the present invention, a calibration straight line for obtaining a nucleic acid copy number for a nucleic acid sample having an unknown nucleic acid copy number is prepared. The correlation coefficient of the line is much higher than that obtained by the conventional method. Therefore, when the data analysis method of the present invention is used, the exact copy number of the nucleic acid can be obtained.
4) Data analysis software according to a method for analyzing data obtained by the real-time quantitative PCR method of the present invention, a computer-readable recording medium in which the procedure of the analysis method is recorded as a program, and When a real-time quantitative PCR measurement or analysis apparatus using is used, a calibration line having a high correlation coefficient can be automatically created.
5) Further, by using the novel method for analyzing a melting curve of a nucleic acid of the present invention, a highly accurate Tm value of a nucleic acid can be obtained. Furthermore, using data analysis software according to the method, a computer-readable recording medium that records the procedure of the analysis method as a program, and a real-time quantitative PCR measurement or analysis device using the software, An accurate Tm value can be obtained.

実施例１で得た核酸プローブを用いて大腸菌の１６ＳｒＲＮＡの５´末端から数えて３３５から３５８番目の核酸塩基配列を測定した場合の蛍光強度測定データを示す図。The figure which shows the fluorescence intensity measurement data at the time of measuring the 335th-358th nucleobase sequence counted from the 5 'end of 16S rRNA of E. coli using the nucleic acid probe obtained in Example 1. ３５塩基鎖2-o-Meプローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションに対する熱処理の効果を示す図。The figure which shows the effect of the heat processing with respect to the hybridization to the target nucleic acid of 35 base chain 2-o-Me probe. プローブと標的核酸１６ＳｒＲＮＡのハイブリダイゼーションに対するプローブの塩基鎖の塩基数、ヘルパープローブ及びプローブの５’末端のリボースの２’位ＯＨ基のメチル基修飾の効果を示す図。The figure which shows the effect of the methyl group modification of the 2'-position OH group of the ribose of the 5 'terminal of a helper probe and a probe's 5' terminal with respect to hybridization of a probe and target nucleic acid 16SrRNA. 本発明方法によるｒＲＮＡ測定のための検量線。Calibration curve for rRNA measurement by the method of the present invention. ＫＹＭ７株及びＫＹＭ８株の複合培養系のｒＲＮＡ量の時間経過についての本発明のＦＩＳＨ方法による分析。The analysis by the FISH method of this invention about the time course of the rRNA amount of the composite culture system of KYM7 strain and KYM8 strain. 本発明のＤＮＡチップを説明する図。The figure explaining the DNA chip of this invention. ボデピーＦＬで標識したプライマー１及び２を用いた定量的ＰＣＲ方法：サイクル数と蛍光色素の発光の減少量の関係を示す図。Quantitative PCR method using primers 1 and 2 labeled with bodepy FL: A graph showing the relationship between the number of cycles and the amount of decrease in the emission of the fluorescent dye. ボデピーＦＬで標識したプライマー１及び２を用いた定量的ＰＣＲ方法：サイクル数と蛍光色素の発光の減少量の対数値の関係を示す図。Quantitative PCR method using primers 1 and 2 labeled with bodepy FL: A graph showing the relationship between the number of cycles and the logarithmic value of the amount of decrease in the emission of the fluorescent dye. 本発明の定量的ＰＣＲ方法を用いて作成した大腸菌１６ＳｒＤＮＡの検量線を示す図。ｎ：１０n The figure which shows the analytical curve of colon_bacillus | E._coli 16SrDNA produced using the quantitative PCR method of this invention. n: 10 n 上図は、ＦＲＥＴ現象を用いるリアルタイム定量的ＰＣＲ方法において使用する蛍光色素で標識した二つのプローブの代わりに、本発明の一つのプローブを用いてリアルタイム定量的ＰＣＲを行った場合の蛍光強度の現象率の変化を示す図である。下図は蛍光強度の現象が有為に観察され始めるサイクル数（threshold number：Ct値）を算出し、検量線を作成した図である。The above figure shows the phenomenon of fluorescence intensity when real-time quantitative PCR is carried out using one probe of the present invention instead of two probes labeled with a fluorescent dye used in the real-time quantitative PCR method using the FRET phenomenon. It is a figure which shows the change of a rate. The figure below shows the calibration curve created by calculating the number of cycles (threshold number: Ct value) at which the fluorescence intensity phenomenon begins to be observed. 本発明の補正演算処理しない場合の、本発明のボデピーＦＬで標識したプライマーを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲによって得られた蛍光減少曲線を示す図。The figure which shows the fluorescence reduction curve obtained by real-time quantitative PCR using the primer labeled with the bodepy FL of this invention when not carrying out the correction | amendment calculation process of this invention. 各曲線の１０サイクル目の値を１として補正する以外は、図１１の曲線の場合と同様にして得られたリアルタイム定量的ＰＣＲの蛍光減少曲線を示す図。The figure which shows the fluorescence decreasing curve of real-time quantitative PCR obtained like the case of the curve of FIG. 11 except correcting the value of the 10th cycle of each curve as 1. FIG. 図１２の各曲線の各プロット値について、［数式９］の蛍光強度減少率（変化率）を計算し、計算値をプロットした曲線を示す図。The figure which shows the curve which calculated the fluorescence intensity decreasing rate (change rate) of [Formula 9] about each plot value of each curve of FIG. 12, and plotted the calculated value. 図１３のデーターから求めたヒトゲノムＤＮＡの検量直線を示す図。The figure which shows the calibration straight line of the human genomic DNA calculated | required from the data of FIG. 図１１の各サイクルの測定値を〔数式１〕で補正演算処理した値を各サイクル 数に対してプロットした曲線を示す図。The figure which shows the curve which plotted the value which carried out the correction calculation process of the measured value of each cycle of FIG. 11 with [Formula 1] with respect to each cycle number. 図１５の各サイクルの演算処理値を〔数式３〕で演算処理した値をサイクル数に対してプロットした曲線を示す図。The figure which shows the curve which plotted the value which calculated the arithmetic processing value of each cycle of FIG. 15 with [Formula 3] with respect to the cycle number. 図１６の各サイクルの演算処理値を〔数式６〕の式で演算処理した値をサイクル数に対してプロットした曲線を示す図。The figure which shows the curve which plotted the value which calculated the arithmetic processing value of each cycle of FIG. 16 by the formula of [Formula 6] with respect to the cycle number. 図１６の各log（蛍光変化率）値からＣｔ値の候補として、０．１、０．３、０．５、０．７、０．９、１．２を適当に選んで、それに対応する検量直線を描かせた場合の図。尚、各検量線における相関係数を下記に示した。Appropriately select 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 0.9, 1.2 as Ct value candidates from each log (fluorescence change rate) value in FIG. The figure when drawing a calibration straight line. In addition, the correlation coefficient in each calibration curve is shown below. １コピー及び１０コピーのヒトゲノムＤＮＡについて、本発明のボデピーＦＬで標識したプライマーを用いてリアルタイム定量的ＰＣＲを行った場合の蛍光減少曲線を示す図。ただし、〔数式１〕の補正演算処理を施した。The figure which shows the fluorescence reduction curve at the time of performing real-time quantitative PCR about 1 copy and 10 copies of human genomic DNA using the primer labeled with the bodepy FL of this invention. However, the correction calculation processing of [Formula 1] was performed. 図１９に示されるＰＣＲの増幅産物についての核酸の融解曲線分析を行った場合の核酸の融解曲線を示す図。The figure which shows the melting curve of a nucleic acid at the time of performing the melting curve analysis of the nucleic acid about the amplification product of PCR shown in FIG. 図２０の曲線を微分して得られた、Ｔｍ値を示す曲線を示す図（谷がＴｍ値）。The figure which shows the curve which shows Tm value obtained by differentiating the curve of FIG. 20 (a trough is Tm value).

Claims (6)

標的核酸と、蛍光色素で標識された核酸プローブとを含む反応系に対するリアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する方法において、各サイクルにおける増幅した核酸が上記核酸プローブとハイブリダイズしたときの上記反応系の蛍光強度値を、そのサイクルにおける前記のハイブリダイズしたものが解離したときの上記反応系の蛍光強度値により補正する演算処理過程（以下、補正演算処理過程という。）を有することを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法。 In a method for analyzing data obtained by a real-time quantitative PCR method for a reaction system including a target nucleic acid and a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye, the amplified nucleic acid in each cycle is hybridized with the nucleic acid probe. the fluorescence intensity value of the reaction system, the processing process in which those mentioned above hybridized in that cycle is corrected by the intensity of fluorescence of the reaction system when dissociated to have a (hereinafter, referred to. correction calculation process) Data analysis method for featured real-time quantitative PCR method. 請求項１に記載の補正演算処理過程が、次の〔数式１〕あるいは〔数式２〕によるものである請求項１に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法。
ｆn＝ｆhyb,n／ｆden,n 〔数式１〕
ｆn＝ｆden,n／ｆhyb,n 〔数式２〕
〔式中、
ｆn：〔数式１〕あるいは〔数式２〕により算出されたｎサイクルにおける補正演算処理値、
ｆhyb,n：ｎサイクルにおける、増幅した核酸が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値、
ｆden,n：ｎサイクルにおける、前記の結合したもの、あるいはハイブリダイズしたものが解離したときの反応系の蛍光強度値〕。 The data analysis method for the real-time quantitative PCR method according to claim 1, wherein the correction calculation process according to claim 1 is performed by the following [Formula 1] or [Formula 2].
f n = f hyb, n / f den, n [Formula 1]
f n = f den, n / f hyb, n [Formula 2]
[Where,
f n : correction calculation processing value in n cycles calculated by [Equation 1] or [Equation 2],
f hyb, n : the fluorescence intensity value of the reaction system when the amplified nucleic acid is bound to the fluorescent dye or hybridized with the nucleic acid probe labeled with the fluorescent dye in n cycles,
f den, n : the fluorescence intensity value of the reaction system when the bound or hybridized product is dissociated in n cycles. 標的核酸と、蛍光色素で標識された核酸プローブとを含む反応系に対するリアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する方法において、各サイクルにおける増幅した核酸が上記核酸プローブとハイブリダイズしたアニーリング反応時の上記反応系の蛍光強度値を、そのサイクルにおける前記のハイブリダイズしたものが解離した熱変性反応時の上記反応系の蛍光強度値により補正する演算処理過程（以下、補正演算処理過程という。）を有することを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法。 In a method for analyzing data obtained by a real-time quantitative PCR method for a reaction system including a target nucleic acid and a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye, an annealing reaction in which the amplified nucleic acid in each cycle is hybridized with the nucleic acid probe. An arithmetic processing step (hereinafter referred to as a correction arithmetic processing step) in which the fluorescence intensity value of the reaction system at the time is corrected by the fluorescence intensity value of the reaction system at the time of the heat denaturation reaction in which the hybrid is dissociated in the cycle. data analysis method for real-time quantitative PCR method characterized by have a). 請求項３に記載の補正演算処理過程が、次の〔数式１〕あるいは〔数式２〕によるものである請求項３に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法。4. The data analysis method for the real-time quantitative PCR method according to claim 3, wherein the correction calculation process according to claim 3 is performed by the following [Formula 1] or [Formula 2].
ｆ  f nn ＝ｆ= F hyb,nhyb, n ／ｆ/ F den,nden, n 〔数式１〕          [Formula 1]
ｆ  f nn ＝ｆ= F den,nden, n ／ｆ/ F hyb,nhyb, n 〔数式２〕          [Formula 2]
〔式中、[Where,
ｆf nn ：〔数式１〕あるいは〔数式２〕により算出されたｎサイクルにおける補正演算処理値、: Correction calculation processing value in n cycles calculated by [Equation 1] or [Equation 2]
ｆf hyb,nhyb, n ：ｎサイクルにおける、増幅した核酸が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値、: The fluorescence intensity value of the reaction system when the amplified nucleic acid binds to the fluorescent dye in n cycles or when the amplified nucleic acid hybridizes with a nucleic acid probe labeled with the fluorescent dye,
ｆf den,nden, n ：ｎサイクルにおける、前記の結合したもの、あるいはハイブリダイズしたものが解離したときの反応系の蛍光強度値〕。: The fluorescence intensity value of the reaction system when the bound or hybridized product dissociates in n cycles]. 標的核酸と、蛍光色素で標識された核酸プローブとを含む反応系に対するリアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する方法において、各サイクルにおける増幅した核酸が上記核酸プローブとハイブリダイズした核酸伸長反応時の上記反応系の蛍光強度値を、各サイクルにおける前記のハイブリダイズしたものが解離した熱変性反応時の上記反応系の蛍光強度値により補正する演算処理過程（以下、補正演算処理過程という。）を有することを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法。 In a method for analyzing data obtained by a real-time quantitative PCR method for a reaction system including a target nucleic acid and a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye, nucleic acid extension in which amplified nucleic acid in each cycle is hybridized with the nucleic acid probe. An arithmetic processing process for correcting the fluorescence intensity value of the reaction system at the time of reaction by the fluorescence intensity value of the reaction system at the time of the heat denaturation reaction in which the hybridized product is dissociated in each cycle (hereinafter referred to as a correction arithmetic processing process). A data analysis method for a real-time quantitative PCR method, characterized by comprising : 請求項５に記載の補正演算処理過程が、次の〔数式１〕あるいは〔数式２〕によるものである請求項５に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法。
ｆ n ＝ｆ hyb,n ／ｆ den,n 〔数式１〕
ｆ n ＝ｆ den,n ／ｆ hyb,n 〔数式２〕
〔式中、
ｆ n ：〔数式１〕あるいは〔数式２〕により算出されたｎサイクルにおける補正演算処理値、
ｆ hyb,n ：ｎサイクルにおける、増幅した核酸が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値、
ｆ den,n ：ｎサイクルにおける、前記の結合したもの、あるいはハイブリダイズしたものが解離したときの反応系の蛍光強度値〕。 6. The data analysis method for the real-time quantitative PCR method according to claim 5, wherein the correction calculation process according to claim 5 is performed by the following [Equation 1] or [Equation 2].
f n = f hyb, n / f den, n [Formula 1]
f n = f den, n / f hyb, n [Formula 2]
[Where,
f n : correction calculation processing value in n cycles calculated by [Equation 1] or [Equation 2],
f hyb, n : the fluorescence intensity value of the reaction system when the amplified nucleic acid is bound to the fluorescent dye or hybridized with the nucleic acid probe labeled with the fluorescent dye in n cycles,
f den, n : the fluorescence intensity value of the reaction system when the bound or hybridized product is dissociated in n cycles.
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