JP4722534B2 - Anti-trivalent chromium monoclonal antibody and method of use thereof - Google Patents
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Description
本発明は、重金属を特異的に認識するモノクローナル抗体並びにその使用方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、３価クロム錯体を特異的に認識しうるモノクローナル抗体および該抗体を用い６価クロムを定性的または定量的に検出する方法に関する。 The present invention relates to a monoclonal antibody that specifically recognizes heavy metals and a method for using the same. More specifically, the present invention relates to a monoclonal antibody capable of specifically recognizing a trivalent chromium complex and a method for qualitatively or quantitatively detecting hexavalent chromium using the antibody.
近年、環境保全などの社会的な環境意識や健康に対する影響への関心の高まりから、産業や生活に伴う様々な場面における環境汚染物質の排出・蓄積の動向が注視されている。環境汚染物質の中でも環境汚染が問題となっている水銀、カドミウム、鉛、６価クロム、ヒ素等の重金属については公的機関により飲料水や地下水における水質基準、土壌における環境基準、環境への排出基準が設けられている。さらに、平成１５年２月に土壌汚染対策法が施行され、水質汚濁防止法と併せて、土壌に含まれることに起因して人の健康に係る被害を生ずるおそれがある他の重金属についても法的規準が設けられつつある。 In recent years, attention has been paid to the trend of discharge and accumulation of environmental pollutants in various scenes associated with industry and daily life due to the growing concern about social environmental awareness and health effects such as environmental conservation. Among environmental pollutants, mercury, cadmium, lead, hexavalent chromium, arsenic, and other heavy metals that are a problem for environmental pollution are officially released by water quality standards for drinking water and groundwater, environmental standards for soil, and discharge to the environment. Standards are in place. In addition, the Soil Contamination Countermeasures Law was enacted in February 2003. In addition to the Water Pollution Control Law, the law also applies to other heavy metals that may cause damage to human health due to inclusion in the soil. Standards are being established.
これら土壌や水等に対する重金属についての汚染調査の公定法分析には、従来、原子吸光度計や質量分析法などが用いられている。 Conventionally, atomic absorption spectrometers, mass spectrometry, and the like have been used for official analysis of pollution investigations on heavy metals such as soil and water.
一方、特定物質に対する簡易な測定法としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、免疫発光測定法、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）などの免疫反応を利用した方法が知られている。また、微量物質の測定法としては、間接蛍光抗体法、競合アッセイ法の他に蛍光センサーを利用する方法（非特許文献１）などがあり、その応用範囲は広い。 On the other hand, as a simple measurement method for a specific substance, a method using an immune reaction such as a radioimmunoassay (RIA), a fluorescent immunoassay (FIA), an immunoluminescence measurement method, an enzyme immunoassay (EIA or ELISA) is known. In addition to the indirect fluorescent antibody method and the competitive assay method, there are methods for measuring trace substances such as a method using a fluorescent sensor (Non-patent Document 1), and its application range is wide.
しかしながら、公定法分析には、多大な時間と費用を要する。一方で、汚染調査が必要とされる土壌などの大幅な増加が見込まれることから分析時間と費用の削減のためには、特定物質が環境基準値以上存在している高濃度エリアを絞り込んだ後に、該高濃度エリアのみを公定法分析することが望ましく、高濃度エリアを絞り込むための簡易分析法が望まれる。例えば、６価クロムに関しては、その水質基準および環境基準における規制値は５０ｐｐｂであり、５０ｐｐｂの６価クロムを検出可能な簡易測定法が求められる。 However, official analysis requires a great deal of time and money. On the other hand, since the increase in soils that require contamination surveys is expected, the analysis time and cost can be reduced after narrowing down high-concentration areas where specific substances exist above the environmental standards. It is desirable to analyze only the high concentration area by an official method, and a simple analysis method for narrowing down the high concentration area is desired. For example, regarding hexavalent chromium, the regulation value in the water quality standard and the environmental standard is 50 ppb, and a simple measurement method capable of detecting 50 ppb of hexavalent chromium is required.
また、免疫反応を利用した測定法において、測定すべき検出物質が金属元素やそのイオンの場合、一般的にはそれ自体が抗原性を持たないため、金属を検出しうる抗体を作製することは困難である。このため重金属測定用の抗体は一部の金属についてしか作製されていない（非特許文献２）ため、未だ作製されていない重金属測定用の抗体の作製が望まれている。 In addition, in the measurement method using immune reaction, when the detection substance to be measured is a metal element or its ion, it generally has no antigenicity, so that it is not possible to produce an antibody capable of detecting metal. Have difficulty. For this reason, since the antibody for heavy metal measurement is produced only about some metals (nonpatent literature 2), preparation of the antibody for heavy metal measurement which has not been produced yet is desired.
本発明は、かかる要望に応えるものであって、環境汚染物質としての重金属である６価クロムを簡易に検出・定量しうる方法およびその方法において使用されるモノクローナル抗体を提供するものである。 The present invention responds to such a demand, and provides a method capable of easily detecting and quantifying hexavalent chromium, which is a heavy metal as an environmental pollutant, and a monoclonal antibody used in the method.
そこで、本発明者等が鋭意研究を行ったところ、３価クロムのＥＤＴＡ錯体（以下、Ｃｒ（III）−ＥＤＴＡと標記）と結合性をもつモノクローナル抗体を作製しうることを見出した。６価クロムは還元することで３価クロムとすることが可能であるので、６価クロムを還元することで得られる３価クロムをＣｒ（III）−ＥＤＴＡとすることにより６価クロムを定性的または定量的に測定することが可能であることを知見した。 Thus, the present inventors conducted extensive research and found that a monoclonal antibody having a binding property with an EDTA complex of trivalent chromium (hereinafter referred to as Cr (III) -EDTA) can be produced. Since hexavalent chromium can be reduced to trivalent chromium, the trivalent chromium obtained by reducing hexavalent chromium is changed to Cr (III) -EDTA to qualitatively convert hexavalent chromium. It was also found that quantitative measurement is possible.
従って、本発明は、
[１]受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３７９として受託されたハイブリドーマにより産生され、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）と錯体を形成した３価クロムを特異的に認識するモノクローナル抗体；
[２]受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３７９として受託されたハイブリドーマ；
[３]試料中の３価クロムを定性的または定量的に測定する免疫学的手法において、３価クロムをＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）に配位させて[１]に記載のモノクローナル抗体を用いる方法；
[４][１]に記載のモノクローナル抗体を含む、試料中の３価クロムをＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）に配位させて定性的または定量的に測定するためのキット；
[５]前処理として、試料中の３価クロムをＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）に配位させる前に、試料中の６価クロムを３価クロムに還元するものである[３]に記載の方法；
[６]試料中の６価クロムを３価クロムに還元する前に、試料をキレート樹脂にて前処理する、[３]に記載の方法；
[７]検査対象試料を還元剤にて前処理した後にＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を加えた第１の試料と、前記前処理を行わずにＥＤＴＡを加えた第２の試料とを、[１]に記載のモノクローナル抗体を用いた免疫学的手法により測定し、前記第１の試料の測定結果と前記第２の試料の測定結果とを比較して、前記検査対象試料に含まれる３価クロムおよび６価クロムを定性的または定量的に分析する方法；
に関する。
Therefore, the present invention
[1] A monoclonal antibody that specifically recognizes trivalent chromium produced by a hybridoma deposited under accession number FERM P-20379 and complexed with EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) ;
[2] A hybridoma deposited under accession number FERM P-20379 ;
[3] A method of using the monoclonal antibody according to [1] by coordinating trivalent chromium to EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) in an immunological method for qualitatively or quantitatively measuring trivalent chromium in a sample ;
[4] A kit for qualitatively or quantitatively measuring trivalent chromium in a sample by coordinating with EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), comprising the monoclonal antibody according to [1] ;
[5] The method according to [3], wherein as the pretreatment, hexavalent chromium in the sample is reduced to trivalent chromium before the trivalent chromium in the sample is coordinated to EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid). ;
[6] The method according to [3], wherein the sample is pretreated with a chelate resin before reducing hexavalent chromium in the sample to trivalent chromium ;
[7] A first sample in which EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) is added after the sample to be inspected is pretreated with a reducing agent, and a second sample in which EDTA is added without performing the pretreatment, [1 The trivalent chromium contained in the sample to be examined is measured by an immunological technique using the monoclonal antibody according to claim 1, and the measurement result of the first sample is compared with the measurement result of the second sample. And qualitatively or quantitatively analyzing hexavalent chromium ;
About.
本発明においては、６価クロムを検出する際に、その法的規準（例えば環境基準、水質基準など）以下の検出限界を有することで環境基準濃度の測定が可能であることが好ましく、すなわち、本発明のモノクローナル抗体が３価クロムに対して５０ｐｐｂ以下の検出限界を有することで、それが実現される。 In the present invention, when detecting hexavalent chromium, it is preferable that the environmental standard concentration can be measured by having a detection limit equal to or lower than the legal standard (for example, environmental standard, water quality standard, etc.) This is realized by the fact that the monoclonal antibody of the present invention has a detection limit of 50 ppb or less with respect to trivalent chromium.
また、本発明のモノクローナル抗体は、マグネシウム、カドミウム、亜鉛、鉛などの３価クロム以外の金属のＥＤＴＡ錯体とはほとんどまたは全く交差反応を起こさず、その親和性は３．５％以下である。従って、正確に３価クロムのＥＤＴＡ錯体を定性的または定量的に測定することができる。 In addition, the monoclonal antibody of the present invention causes little or no cross reaction with EDTA complexes of metals other than trivalent chromium such as magnesium, cadmium, zinc and lead, and its affinity is 3.5% or less. Therefore, the EDTA complex of trivalent chromium can be measured qualitatively or quantitatively.
本発明の抗モノクローナル抗体としては、ＥＤＴＡと錯体を形成した３価クロムを特異的に認識するＧｂ３Ｇ１２が挙げられる。モノクローナル抗体Ｇｂ３Ｇ１２を産生するハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１７年１月２７日付けで受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３７９として受託されている。 Anti monoclonal antibodies of the invention include G B3G12 you specifically recognizing the trivalent chromium forming the EDTA complexes. The hybridoma producing the monoclonal antibody Gb3G12 has been entrusted to the Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as the accession number FERM P-20379 on January 27, 2005.
本発明のモノクローナル抗体を用いて３価クロムを定性的または定量的に測定する免疫学的方法において、３価クロムはキレート剤（ＥＤＴＡ）に配位させ、形成された錯体を本発明のモノクローナル抗体により検出・測定する。故に、本発明は、（ｉ）検査対象試料にキレート剤（ＥＤＴＡ）を添加して錯体を形成させ、（ii）該錯体を特異的に認識する抗体を用いる免疫学的手法により３価クロムを定性的または定量的に測定する方法に関する。本発明のモノクローナル抗体は、前述のように３価クロムのＥＤＴＡ錯体に対して親和性が高く、且つ他の金属のＥＤＴＡ錯体との交差反応性が低いため、検査対象試料中の３価クロムをより正確に測定することができる。その中でも、本発明のモノクローナル抗体Ｇｂ３Ｇ１２は、３価クロムのＥＤＴＡ錯体に対して非常に高い親和性・特異性を有している。
また、本発明は、検査対象試料中の６価クロムを還元処理して３価クロムに還元し、次いで、検査対象試料にキレート剤（ＥＤＴＡ）を添加して錯体を形成させ、モノクローナル抗体Ｇｂ３Ｇ１２を用いて３価クロムのＥＤＴＡ錯体の濃度を測定することで、検査対象試料中の６価クロム濃度を知り得るものである。
さらに、本発明は、検査対象試料中に３価クロムが混入している場合、３価クロムを例えばキレート樹脂に吸着させる等の方法で除去し、次いで、６価クロムを還元処理することで検査対象試料中に存在する６価クロム由来の３価クロムを得ることができ、この検査対象試料にキレート剤（ＥＤＴＡ）を添加して錯体を形成させ、モノクローナル抗体Ｇｂ３Ｇ１２を用いて測定することで、検査対象試料中の６価クロムの濃度を知り得るものである。従って、本発明は、検査対象試料中に３価クロムが混入している場合、３価クロムを除去後に、６価クロムを還元処理により３価クロムに還元し、次いで、この検査対象試料にキレート剤（ＥＤＴＡ）を添加して錯体を形成させ、モノクローナル抗体Ｇｂ３Ｇ１２を用いて３価クロムのＥＤＴＡ錯体の濃度を測定し、その測定結果から検査対象試料中の６価クロム濃度を測定する方法に関する。
もしくは、検査対象試料中に３価クロムが混入している場合、検査対象試料を還元剤にて前処理した後にＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を加えた第１の試料と、前記前処理を行わずにＥＤＴＡを加えた第２の試料とを、モノクローナル抗体Ｇｂ３Ｇ１２を用いて免疫学的手法により測定し、前記第１の試料の測定結果と前記第２の試料の測定結果とを比較して、前記検査対象試料に含まれる３価クロムおよび６価クロムを定性的または定量的に分析する方法に関する。
In an immunological method for qualitatively or quantitatively measuring trivalent chromium using the monoclonal antibody of the present invention, trivalent chromium is coordinated to a chelating agent (EDTA) , and the complex formed is used as the monoclonal antibody of the present invention. Detect and measure with Therefore, in the present invention, (i) a chelating agent (EDTA) is added to a sample to be examined to form a complex, and (ii) trivalent chromium is obtained by an immunological technique using an antibody that specifically recognizes the complex. The present invention relates to a method for qualitative or quantitative measurement. As described above, the monoclonal antibody of the present invention has high affinity for the EDTA complex of trivalent chromium and low cross-reactivity with EDTA complexes of other metals. It can be measured more accurately. Among them, the monoclonal antibody Gb3G12 of the present invention has very high affinity and specificity for the trivalent chromium EDTA complex .
In the present invention, the hexavalent chromium in the test sample is reduced to trivalent chromium, then a chelating agent (EDTA) is added to the test sample to form a complex, and the monoclonal antibody Gb3G12 is added. By measuring the concentration of the EDTA complex of trivalent chromium, the hexavalent chromium concentration in the sample to be examined can be known.
Furthermore, in the present invention, when trivalent chromium is mixed in the sample to be inspected, the trivalent chromium is removed by a method such as adsorption to a chelate resin, and then the hexavalent chromium is subjected to reduction treatment. By obtaining trivalent chromium derived from hexavalent chromium present in the target sample , adding a chelating agent (EDTA) to this test target sample to form a complex, and measuring using the monoclonal antibody Gb3G12, It is possible to know the concentration of hexavalent chromium in the sample to be inspected. Therefore, in the present invention, when trivalent chromium is mixed in the sample to be inspected, after removing the trivalent chromium, the hexavalent chromium is reduced to trivalent chromium by reduction treatment, and then the sample to be inspected is chelated. The present invention relates to a method for forming a complex by adding an agent (EDTA), measuring the concentration of trivalent chromium EDTA complex using monoclonal antibody Gb3G12, and measuring the hexavalent chromium concentration in the sample to be examined from the measurement result.
Alternatively, when trivalent chromium is mixed in the sample to be inspected, the first sample in which EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) is added after the sample to be inspected is pretreated with a reducing agent, and the pretreatment is not performed. A second sample obtained by adding EDTA to the immunoassay using monoclonal antibody Gb3G12, and comparing the measurement result of the first sample with the measurement result of the second sample, The present invention relates to a method for qualitatively or quantitatively analyzing trivalent chromium and hexavalent chromium contained in a sample to be examined .
本発明において用いる免疫学的手法としては、本発明のモノクローナル抗体を用いればいずれでも良いが、例えば免疫クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、免疫発光測定法、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、ＣＬＥＩＡ（化学発光酵素免疫測定法）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ラテックス免疫比濁法（ＬＴＩＡ）、蛍光センサー法などの方法が挙げられる。 As the immunological technique used in the present invention, any of the monoclonal antibodies of the present invention may be used. For example, immunochromatography, radioimmunoassay (RIA), fluorescent immunoassay (FIA), immunoluminescence assay, enzyme immunoassay (EIA) Or ELISA), CLEIA (chemiluminescence enzyme immunoassay), immunoturbidimetry (TIA), latex immunoturbidimetry (LTIA), fluorescence sensor method, and the like.
本発明の試料中の３価クロムをＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）に配位させて３価クロムを定性的または定量的に測定するためのキットは、本発明のモノクローナル抗体のみから構成されていてもよいが、他の試薬例えばキレート剤、キレート剤−タンパク質複合体、ポジティブコントロール試料、ネガティブコントロール試料などを包含してもよい。また、モノクローナル抗体、キレート剤−タンパク質複合体のいずれか、または両方が標識されていてもよい。さらに、本発明のキットは、モノクローナル抗体を含め必要な試薬がフィルターなどに吸着されている免疫クロマトグラフィー装置（例えば、試験紙）の形態でもよい。 A kit for qualitatively or quantitatively measuring trivalent chromium by coordinating trivalent chromium in the sample of the present invention to EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) may be composed of only the monoclonal antibody of the present invention. However, other reagents such as chelating agents, chelating agent-protein complexes, positive control samples, negative control samples and the like may be included. In addition, either the monoclonal antibody, the chelating agent-protein complex, or both may be labeled. Furthermore, the kit of the present invention may be in the form of an immunochromatography apparatus (for example, a test paper) in which necessary reagents including a monoclonal antibody are adsorbed on a filter or the like.
本発明によれば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）と錯体を形成した３価クロムを特異的に認識するモノクローナル抗体および該抗体を用いる免疫学的方法、該方法に用いるキット（装置）が提供される。本発明のモノクローナル抗体はＥＤＴＡと錯体を形成した３価クロムに対して高い親和性・特異性を有するため微量の３価クロムを検出することができる。また、６価クロムを３価クロムに還元してから該キットを用いることで６価クロムの定量が可能であることから、環境への排出基準のみならず、高い検出感度が要求される水質基準や環境基準に対する判定にも用いることができる。 According to the present invention, a monoclonal antibody that specifically recognizes trivalent chromium complexed with EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), an immunological method using the antibody, and a kit (apparatus) used for the method are provided. . Since the monoclonal antibody of the present invention has a high affinity and specificity for trivalent chromium complexed with EDTA , a trace amount of trivalent chromium can be detected. In addition, since hexavalent chromium can be quantified by reducing the hexavalent chromium to trivalent chromium and then using the kit, not only environmental emission standards but also water quality standards that require high detection sensitivity. It can also be used to determine environmental standards.
以下、本発明の構成を図面に示す一実施形態に基づいて詳細に説明する。
＜抗原＞
６価クロムおよび３価クロム単独では抗原性を持たない。そこで、本発明は、３価クロムをキレート剤に配位させ、形成された金属錯体を抗原として用いた。尚、６価クロムは通常、クロム酸塩や二クロム酸塩といった陰イオンとして存在しており、キレート剤に配位させることが困難であるため、用いなかった。キレート剤としては、３価クロムを配位しうるものであれば任意のキレート剤を用いることができるが、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメルおよびエデト酸トリエンチンを挙げることができるが、好ましくはＥＤＴＡである。
Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail based on an embodiment shown in the drawings.
<Antigen>
Hexavalent chromium and trivalent chromium alone have no antigenicity. Therefore, in the present invention, trivalent chromium is coordinated to a chelating agent, and the formed metal complex is used as an antigen. Hexavalent chromium is usually not present because it is present as an anion such as chromate or dichromate and is difficult to coordinate with the chelating agent. As the chelating agent, any chelating agent can be used as long as it can coordinate trivalent chromium. For example, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), tetraethylenetriamine (TET), Ethylenediamine (EDA), diethylenetriamine (DETA), citric acid, oxalic acid, crown ether, nitrilotetraacetic acid, disodium edetate, sodium edetate, trisodium edetate, penicillamine, trisodium pentetate calcium, pentetate, succil and Although edetate trientine can be mentioned, EDTA is preferred.
また、Ｃｒ（III）−ＥＤＴＡは免疫応答を誘導するには分子として小さすぎるため、キャリアとなる高分子量物質に結合させ、これを抗原または免疫源として用いる。キャリアとして用いることができる高分子量物質の例としては多糖類、タンパク質などが挙げられるが、タンパク質が好ましい。アルブミン、オバルブミン、ヘモシアニン、グロブリン、ゼラチン、コラーゲンなどが挙げられるが、これらに限定されない。 In addition, Cr (III) -EDTA is too small as a molecule to induce an immune response, so it is bound to a high molecular weight substance serving as a carrier and used as an antigen or an immunogen. Examples of the high molecular weight substance that can be used as the carrier include polysaccharides and proteins, and proteins are preferred. Examples include, but are not limited to albumin, ovalbumin, hemocyanin, globulin, gelatin, collagen and the like.
これら金属錯体とタンパク質の複合体を作製するには、タンパク質と結合しうる官能基を有するキレート剤または該官能基を導入したキレート剤を用いるか、あるいはリンカーを介してタンパク質とキレート剤を結合させることができる。そのようなキレート剤は市販されており、例えばイソチオシアノベンジル−ＥＤＴＡ（同仁化学）が挙げられる。複合体の形成は常法により行うことができる。 In order to produce a complex of these metal complexes and proteins, a chelating agent having a functional group capable of binding to the protein or a chelating agent having the functional group introduced therein is used, or the protein and the chelating agent are bound via a linker. be able to. Such chelating agents are commercially available, and examples include isothiocyanobenzyl-EDTA (Dojindo Laboratories). The formation of the complex can be performed by a conventional method.
＜抗金属モノクローナル抗体の作製＞
マウスの免疫、ハイブリドーマの作製およびその培養などモノクローナル抗体の作製は、常法に従って、例えばモノクローナル抗体作製マニュアル、多田ら著、学際企画発行、１９９５年（ISBN 4-906514-19-7）参照して適宜行うことができ、免疫するマウスの系統、脾臓細胞と融合させるミエローマなども特に限定されない。
<Preparation of anti-metal monoclonal antibody>
Monoclonal antibodies such as mouse immunization, hybridoma production and culture thereof can be prepared according to conventional methods, for example, see monoclonal antibody production manual, Tada et al., Interdisciplinary Planning, 1995 (ISBN 4-906514-19-7). The mouse strain to be immunized, myeloma to be fused with spleen cells, and the like are not particularly limited.
＜抗体生産細胞のスクリーニング＞
抗体生産細胞のスクリーニングには一般的にはＥＬＩＳＡ法を用いるが、より少ない抗体量でスクリーニングが可能であるため、蛍光センサー法（特許文献１）を用いるのが好ましい。この方法は、一次スクリーニングおよび二次スクリーニングからなり、一次スクリーニングは担体に固定化した抗原（３価クロム錯体−タンパク質複合体）に抗体を含有するハイブリドーマ培養上清を添加し、固定化抗原に結合した抗体を蛍光標識した二次抗体（抗マウスＩｇＧ抗体）を用いて蛍光センサーで検出する。二次スクリーニングでは、培養上清に適当量（例えば10μM）の３価クロム錯体を添加して平衡化した後、錯体と結合しなかった抗体の固定化抗原との結合を一次スクリーニングと同様に測定する。一次スクリーニングと二次スクリーニングの差から３価クロム錯体と特異的に結合する抗体を特定する。
<Screening of antibody producing cells>
In general, ELISA is used for screening antibody-producing cells. However, since screening can be performed with a smaller amount of antibody, the fluorescence sensor method (Patent Document 1) is preferably used. This method consists of a primary screening and a secondary screening. In the primary screening, a hybridoma culture supernatant containing an antibody is added to an antigen (trivalent chromium complex-protein complex) immobilized on a carrier and binds to the immobilized antigen. The detected antibody is detected with a fluorescent sensor using a fluorescently labeled secondary antibody (anti-mouse IgG antibody). In the secondary screening, an appropriate amount (eg, 10 μM) of a trivalent chromium complex is added to the culture supernatant to equilibrate, and then the binding of the antibody that did not bind to the complex to the immobilized antigen is measured in the same manner as in the primary screening. To do. The antibody that specifically binds to the trivalent chromium complex is identified from the difference between the primary screening and the secondary screening.
＜モノクローナル抗体の産生および精製＞
特定したクローンを培養し、単離したコロニーは徐々に培地量を増やしながら継代する。得られた培地は、脱塩カラムを用いて培地自体に含まれる若干の重金属を除去するのが好ましい。さらに、培地中に他のタンパク質の影響を除くために、抗体を精製する方法、例えばプロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより抗体を精製するのが好ましい。
<Production and purification of monoclonal antibodies>
The identified clone is cultured, and the isolated colony is subcultured while gradually increasing the amount of the medium. It is preferable that the obtained medium removes some heavy metals contained in the medium itself using a desalting column. Furthermore, in order to remove the influence of other proteins in the medium, it is preferable to purify the antibody by a method of purifying the antibody, for example, protein A affinity column chromatography.
＜モノクローナル抗体の評価＞
得られたモノクローナル抗体は、３価クロム錯体および他の金属の錯体に対する親和性を比較することによりその抗体の抗原に対する親和性および特異性を評価する。親和性は、抗体の抗原との結合を５０％阻害する抗原濃度（ＩＣ５０）により評価する。そして、特異性は、３価クロムに対するＩＣ５０と他の金属に対するＩＣ５０を比較することにより評価する。ＩＣ５０はいずれの方法で算出してもよいが、測定結果をソフトウェア（例えばOrigin Version 6.0など）により解析して求めてもよい。例えば、蛍光センサー法などで得られた測定値は、抗原を加えなかったときの測定値を１００％として相対値に変換した後、抗体と抗原の結合曲線の近似式：
ｙ＝９９／（１＋（ｘ／Ｐ１）Ｐ２）＋０.５
［式中、ｘは抗体量であり、ｙは抗体と抗原の結合量（％）であり、Ｐ１およびＰ２は近似のパラメーターである］に導入する。また、Ｐ１およびＰ２はソフトフェアにより決定し、得られた結合曲線から、ｙ＝５０になるときのｘの値（＝Ｐ１）をＩＣ５０とする。また、抗体の特異性は３価クロムに対するＩＣ５０と他の金属に対するＩＣ５０との比を交差反応性として求める。
<Evaluation of monoclonal antibodies>
The resulting monoclonal antibodies are evaluated for their affinity and specificity for antigen by comparing their affinity for trivalent chromium complexes and other metal complexes. Affinity is evaluated by the antigen concentration (IC 50 ) that inhibits the binding of an antibody to an antigen by 50%. Specificity is evaluated by comparing the IC 50 for trivalent chromium with the IC 50 for other metals. The IC 50 may be calculated by any method, but the measurement result may be obtained by analyzing with software (for example, Origin Version 6.0). For example, the measurement value obtained by the fluorescence sensor method or the like is converted into a relative value with the measurement value when no antigen is added as 100%, and then an approximate expression of an antibody-antigen binding curve:
y = 99 / (1+ (x / P1) P2 ) +0.5
[Wherein x is the amount of antibody, y is the amount of antibody-antigen binding (%), and P1 and P2 are approximate parameters]. Further, P1 and P2 are determined by software, and the value of x (= P1) when y = 50 is determined as IC 50 from the obtained binding curve. The specificity of the antibody is determined as the cross-reactivity by the ratio of IC 50 for trivalent chromium and IC 50 for other metals.
＜免疫クロマトグラフィー＞
抗体を用いた免疫学的測定法の一例として免疫クロマトグラフィーを挙げる。この方法は、試料を試験紙上に滴下するだけで目的物質の有無を数分から数十分の間に判定できるため簡便性に優れ、かつ特別な機械装置を必要としないため非常に安価である。本発明において、免疫クロマトグラフィーは、キレート剤−タンパク質複合体を利用することにより、所望の金属を効果的に検出するものである。図３にその実施形態の一例を示す。プラスチックバッキングシート１の上に、メンブレン２と吸収パッド３を一部で重なるように配置し、メンブレン２の先端の試料滴下位置５に試料を滴下すると試料が吸収パッド３に向かってメンブレン２上を流動し、標識された抗金属ＥＤＴＡモノクロナール抗体あるいは標識されたＥＤＴＡ−タンパク質複合体が固定化された領域４を通過する際に、金属ＥＤＴＡ錯体が抗体に捕捉されあるいは抗金属ＥＤＴＡモノクロナール抗体がＥＤＴＡ−タンパク質複合体のＥＤＴＡと錯体を形成してその錯体に抗金属ＥＤＴＡが捕捉されて、固定化領域４が目視可能となることで検出対象物の有無を簡易に検出可能としている。なお、ＥＤＴＡなどのキレート剤を直接標識することは困難であるため、キレート剤にタンパク質を付加する前または後に、タンパク質に色素粒子を付加することで間接的にキレート剤を標識するのが好ましい。あるいは、モノクローナル抗体自体を標識することもできる。これらタンパク質の標識は通常行われている手法によって行うことができる。
<Immunochromatography>
As an example of immunoassay using antibodies, immunochromatography is exemplified. This method is excellent in convenience because the presence or absence of the target substance can be determined within a few minutes to several tens of minutes simply by dropping a sample on a test paper, and is very inexpensive because no special mechanical device is required. In the present invention, immunochromatography effectively detects a desired metal by using a chelating agent-protein complex. FIG. 3 shows an example of the embodiment. When the membrane 2 and the absorption pad 3 are arranged so as to partially overlap on the plastic backing sheet 1 and the sample is dropped onto the sample dropping position 5 at the tip of the membrane 2, the sample moves on the membrane 2 toward the absorption pad 3. When the labeled anti-metal EDTA monoclonal antibody or the labeled EDTA-protein complex passes through the immobilized region 4, the metal EDTA complex is captured by the antibody or the anti-metal EDTA monoclonal antibody is By forming a complex with EDTA of the EDTA-protein complex, the antimetal EDTA is captured by the complex, and the immobilization region 4 can be visually observed, so that the presence or absence of the detection target can be easily detected. Since it is difficult to directly label a chelating agent such as EDTA, it is preferable to indirectly label the chelating agent by adding dye particles to the protein before or after adding the protein to the chelating agent. Alternatively, the monoclonal antibody itself can be labeled. These proteins can be labeled by a commonly used technique.
（１）試験法１
本発明のモノクローナル抗体を試験紙の一部分に試料の流れを横切るように帯状に固定化する。次いで、検査対象試料中にキレート剤−タンパク質−色素粒子（キレート剤−標識タンパク質）複合体を添加して、３価クロムと結合させたのち試験紙に滴下させる（図４（Ａ），（Ｂ）参照）。目的の金属イオンが存在する場合には、金属−キレート剤錯体が形成され、金属錯体と標識タンパク質複合体が試験紙上に帯状に固定化したモノクローナル抗体によって補足され、その結果として色素粒子が帯状に密集して試料中の金属イオンが可視化する（図４（Ｃ），（Ｄ）参照）。試料中に金属イオンが存在しない場合は、キレート剤−タンパク質−色素粒子複合体は試験紙上に固定化されたモノクローナル抗体に補足されないため、色素粒子により可視化されない。
(1) Test method 1
The monoclonal antibody of the present invention is immobilized on a part of the test paper in a strip shape so as to cross the sample flow. Next, a chelating agent-protein-dye particle (chelating agent-labeled protein) complex is added to the sample to be examined, combined with trivalent chromium, and then dropped onto the test paper (FIGS. 4A and 4B). )reference). When the desired metal ion is present, a metal-chelator complex is formed, and the metal complex and the labeled protein complex are captured by the monoclonal antibody immobilized on the test strip in the form of a strip, resulting in the strip of pigment particles. The metal ions in the sample are visualized densely (see FIGS. 4C and 4D). In the absence of metal ions in the sample, the chelator-protein-dye particle complex is not captured by the dye particles because it is not captured by the monoclonal antibody immobilized on the test paper.
（２）試験法２
キレート剤−タンパク質複合体を利用して金属イオンを検出する免疫クロマトグラフィーとして次の方法がある。まず、試験法１における抗体の代わりにキレート剤−タンパク質を試験紙上に帯状に固定化する（図５（Ｂ）参照）。色素粒子はモノクローナル抗体に付加する。この標識抗体と検査対象試料をともに試験紙に滴下させると（図５（Ａ），（Ｂ）参照）、金属イオンが試験紙上のキレート剤−タンパク質複合体に補足され、金属−キレート剤錯体が形成され、結果として標識されたモノクローナル抗体が金属−キレート剤錯体を介して試験紙上に補足され、帯状に密集した色素粒子により試料中の金属イオンが可視化される（図５（Ｃ），（Ｄ）参照）。
これら２つの試験法の利点は、タンパク質を介することでキレート剤を帯状に試験紙に固定することが容易になること、およびタンパク質１分子当たりに複数のキレート剤を付加するすることができ、単純に試験紙上にキレート剤を固定した場合に比べて表面積を大きく取ることが可能になり、結果として検出感度を上げることができることである。
(2) Test method 2
There are the following methods as immunochromatography for detecting metal ions using a chelator-protein complex. First, instead of the antibody in Test Method 1, a chelating agent-protein is immobilized in a strip shape on a test paper (see FIG. 5B). Dye particles are added to the monoclonal antibody. When both the labeled antibody and the sample to be examined are dropped on the test paper (see FIGS. 5A and 5B), the metal ions are captured by the chelating agent-protein complex on the test paper, and the metal-chelating agent complex is formed. The formed monoclonal antibody as a result is captured on the test paper via the metal-chelator complex, and the metal ions in the sample are visualized by the densely packed pigment particles (FIGS. 5C and 5D). )reference).
The advantage of these two test methods is that it is easy to fix the chelating agent in strips through the protein, and multiple chelating agents can be added per protein molecule. In addition, it is possible to increase the surface area as compared with the case where the chelating agent is fixed on the test paper, and as a result, the detection sensitivity can be increased.
本発明を下記の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本実施例では抗原として３価クロムとＥＤＴＡの錯体（Ｃｒ（III）−ＥＤＴＡ）、キャリアタンパク質としてヘモシアニンもしくはオバルブミンを用いて、３価クロムとしてＣｒ（III）−ＥＤＴＡを特異的に認識する抗体を作製した。 The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited thereto. In this example, trivalent chromium and EDTA complex (Cr (III) -EDTA) is used as an antigen, hemocyanin or ovalbumin is used as a carrier protein, and Cr (III) -EDTA is specifically recognized as trivalent chromium. Antibodies were made.
実施例１：抗３価クロムモノクローナル抗体の作製
（１）抗原の作製
１ｍｇのイソチオシアノベンジル−ＥＤＴＡ（同人化学）を１０ｍｇのスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）と３ｍｌの５０ｍＭシュウ酸緩衝液（ｐＨ９.５）中で３７℃、４時間反応させた。次いで、脱塩カラム（バイオラッド製、１０ＤＧパックドカラム）を用いて５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５に置換した。この溶液に５ｍＭになるように硫酸亜鉛を添加して、亜鉛錯体を形成させてＣｒ（III）−ＥＤＴＡ−ヘモシアニン複合体を抗原として精製した。また、ヘモシアニンの代わりにニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）を用いて同様な操作を行ってＣｒ（III）−ＥＤＴＡ−オバルブミン複合体を作製し、これをスクリーニング用抗原とした。
Example 1 Production of Anti-Trivalent Chromium Monoclonal Antibody (1) Production of Antigen 1 mg of isothiocyanobenzyl-EDTA (doujinshi) was added to 10 mg of mussel hemocyanin (KLH) and 3 ml of 50 mM oxalate buffer (pH 9. 5) The mixture was reacted at 37 ° C for 4 hours. Subsequently, it was replaced with 50 mM MES buffer pH 6.5 using a desalting column (Biorad, 10DG packed column). Zinc sulfate was added to this solution to 5 mM to form a zinc complex, and the Cr (III) -EDTA-hemocyanin complex was purified as an antigen. Further, a similar operation was performed using chicken ovalbumin (OVA) instead of hemocyanin to prepare a Cr (III) -EDTA-ovalbumin complex, which was used as a screening antigen.
（２）モノクローナル抗体の作製
ａ）マウスの免疫
６匹のＢＡＬＢ／Ｃ近交系のマウス（雌、５週齢、日本クレア）を１週間程度飼育環境に慣らしたのち、１回目の免疫を行った。免疫は、実施例１の免疫用抗原と等量のアジュバントを十分に混合してエマルジョンとした。１回の免疫につき、タンパク質量にして約０.３ｍｇの抗原を用いて１回につき２カ所、１００μｌずつ皮下注射した。２回目以降の免疫は２週間程度おきに３回または４回行った。３回目の免疫後、４〜７日間にマウスの尾部より数滴の血液を採取し、スクリーニング用抗原を用いて抗体価を測定し、抗体の産生を確認した。
(2) Production of monoclonal antibody a) Immunization of mice Six BALB / C inbred mice (female, 5 weeks old, Japan Claire) were acclimatized for about one week, and then the first immunization was performed. It was. For immunization, an immunizing antigen of Example 1 and an equal amount of an adjuvant were mixed thoroughly to prepare an emulsion. For each immunization, 100 μl of each protein was injected subcutaneously at two locations at a time using about 0.3 mg of antigen in terms of protein amount. The second and subsequent immunizations were performed 3 or 4 times every 2 weeks. After the third immunization, 4 to 7 days, several drops of blood were collected from the tail of the mouse, and the antibody titer was measured using a screening antigen to confirm the production of the antibody.
ｂ）ハイブリドーマの作製
最後の免疫から４〜５日経過したマウスから、脾臓を摘出し、脾臓細胞とミエローマ細胞（ＮＳ０株、理化学研究所）と融合させた。細胞を融合する際は、重合度１５００のポリエチレングリコールで脾臓細胞とミエローマを処理した。細胞融合に関する一連の操作は３７℃にて行った。得られたハイブリドーマは９６穴プレートに分注し、ＨＡＴ培地中で３７℃，５％ＣＯ２の条件下で培養した。ハイブリドーマは、融合後約２週間培養し、その間は３〜４日に１回培地を交換した。なお、１０日目前後まではＨＡＴ培地を用い、その後はＨＴ培地を用いた。
b) Preparation of hybridoma Spleens were removed from mice that had passed 4 to 5 days after the last immunization, and fused with spleen cells and myeloma cells (NS0 strain, RIKEN). When cells were fused, spleen cells and myeloma were treated with polyethylene glycol having a polymerization degree of 1500. A series of operations relating to cell fusion was performed at 37 ° C. The obtained hybridoma was dispensed into a 96-well plate and cultured in a HAT medium under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . The hybridoma was cultured for about 2 weeks after the fusion, during which the medium was changed once every 3 to 4 days. The HAT medium was used until around day 10, and the HT medium was used thereafter.
ｃ）スクリーニング
スクリーニングは、フロー式蛍光センサー（キネクサ３０００）を用いて蛍光センサー法にて行った。また、抗原を固定化する担体としてアガロースビーズ（ＮＨＳ修飾済み，ファルマシア）を用いた。１ｍｌのアガロースビーズ懸濁液に対して、実施例２で得たスクリーニング用抗原０．１ｍｇを添加して抗原をビーズに固定化した。
９６穴プレートの培養液の上清約１０μｌずつ取り、１本の試験管にまとめた（約１ｍｌ）。一次スクリーニングでは、この試験管に固定化抗原を添加し、固定化抗原に結合した抗体は蛍光物質Ｃｙ５にて標識された二次抗体（抗マウスＩｇＧヤギ抗体）を用いて間接的に蛍光標識し、上清中の抗体と固定化抗原との結合を蛍光センサーにより検出した。二次スクリーニングでは、培養上清にＣｒ（III）−ＥＤＴＡを１μＭとなるように加え、平衡化したのち、錯体と結合しなかった抗体のビーズへの結合を同様に測定した。二次スクリーニングによって、Ｃｒ（III）−ＥＤＴＡと特異的に結合する抗体を含むと判定されたプレートについては，１本の試験管にまとめる培養上清を１２穴分〜１穴分と段階的に絞り込みながら、一次スクリーニング同様、上清中の抗体のビーズへの結合を測定し、目的の抗体を産生するハイブリドーマとして、Ｇｂ３Ｇ１２株を特定した。スクリーニングによって陽性と判断されたこの抗体生産細胞は、メチルセルロース培地を用いて単一の細胞に由来するコロニーを形成させた後、コロニーを液体培地に移し培養を続けた。
c) Screening Screening was performed by a fluorescence sensor method using a flow-type fluorescence sensor (Kinexa 3000). Further, agarose beads (NHS modified, Pharmacia) were used as a carrier for immobilizing the antigen. To 1 ml of the agarose bead suspension, 0.1 mg of the screening antigen obtained in Example 2 was added to immobilize the antigen on the beads.
About 10 μl of the supernatant of the culture medium in a 96-well plate was taken and collected in one test tube (about 1 ml). In the primary screening, an immobilized antigen is added to the test tube, and the antibody bound to the immobilized antigen is indirectly fluorescently labeled using a secondary antibody (anti-mouse IgG goat antibody) labeled with the fluorescent substance Cy5. The binding between the antibody in the supernatant and the immobilized antigen was detected by a fluorescence sensor. In the secondary screening, Cr (III) -EDTA was added to the culture supernatant to 1 μM, and after equilibration, the binding of the antibody that did not bind to the complex to the beads was measured in the same manner. For the plate determined to contain an antibody that specifically binds to Cr (III) -EDTA by the secondary screening, the culture supernatant to be collected in one test tube is gradually divided into 12 to 1 well. While narrowing down, the binding of the antibody in the supernatant to the beads was measured in the same manner as in the primary screening, and the Gb3G12 strain was identified as a hybridoma producing the target antibody. The antibody-producing cells judged positive by screening formed colonies derived from a single cell using a methylcellulose medium, and then transferred the colonies to a liquid medium and continued the culture.
ｄ）モノクローナル抗体の生産
単離されたコロニーを９６穴プレート、２４穴プレート、２５ｃｍ２フラスコの順に培地量を増やしながら継代した。継代の後３〜５日の間に培養上清中の抗体量を蛍光センサーにて測定し、抗体量の多いものを次の培地に移した。なお、９６穴プレートの培地量は２００μｌ、２４穴プレートの培地量は１０００μｌ、２５ｃｍ２フラスコの培地量は１０ｍｌである。また、培養後の培地は脱塩カラムを用いて培地に含まれる若干の重金属を除去し、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７.０）に置換した。さらに、プロテインＡアフィニティーカラムに供して、得られたモノクローナル抗体を精製した。
d) Production of monoclonal antibody The isolated colonies were subcultured in the order of 96-well plate, 24-well plate, and 25 cm 2 flask while increasing the amount of medium. Between 3 and 5 days after the passage, the amount of antibody in the culture supernatant was measured with a fluorescence sensor, and the one with a large amount of antibody was transferred to the next medium. The medium volume of the 96-well plate is 200 μl, the medium volume of the 24-well plate is 1000 μl, and the medium volume of the 25 cm 2 flask is 10 ml. In addition, the medium after the culture was replaced with 25 mM HEPES buffer (pH 7.0) after removing some heavy metals contained in the medium using a desalting column. Further, the resulting monoclonal antibody was purified by subjecting it to a protein A affinity column.
実施例２：抗３価クロムモノクローナル抗体の評価
（１）重金属−ＥＤＴＡ錯体との結合性
Ｃｒ（III）−ＥＤＴＡおよび他の金属とＥＤＴＡの錯体に対する親和性を測定・比較することで、得られた抗３価クロム抗体を評価した（図１）。なお、３価クロム以外の金属として、マグネシウム（Ｍｇ−ＥＤＴＡ）、カドミウム（Ｃｄ−ＥＤＴＡ）、亜鉛（Ｚｎ−ＥＤＴＡ）、および鉛（Ｐｂ−ＥＤＴＡ）を用い、フリーのＥＤＴＡをコントロールとした。なお、ＩＣ５０値に対して抗体濃度が十分に小さい（１０分の１以下の）場合にＩＣ５０値と結合解離定数がほぼ一致することが知られているため、本実施例では評価として結合解離定数を用いた。
その結果、モノクローナル抗体Ｇｂ３Ｇ１２は、Ｃｒ（III）−ＥＤＴＡ以外の錯体に対する交差反応性は３．５％以下であり、Ｇｂ３Ｇ１２抗体がＣｒ（III）−ＥＤＴＡに対して強い特異性を有することが確認された。これらの結果を下記の表１に示す。尚、交差反応性は、下式で表される。
交差反応性＝（Ｃｒ（III)−ＥＤＴＡの解離定数／金属−ＥＤＴＡの解離定数）ｘ 100
Example 2: Evaluation of anti-trivalent chromium monoclonal antibody (1) Binding to heavy metal-EDTA complex Obtained by measuring and comparing the affinity of Cr (III) -EDTA and other metals with EDTA complexes Anti-trivalent chromium antibodies were evaluated (FIG. 1). Note that magnesium (Mg-EDTA), cadmium (Cd-EDTA), zinc (Zn-EDTA), and lead (Pb-EDTA) were used as metals other than trivalent chromium, and free EDTA was used as a control. Since the antibody concentration is known to bond dissociation constant as an IC 50 value coincides substantially if sufficiently small (less than one tenth) relative to an IC 50 value, binding as evaluated in this example The dissociation constant was used.
As a result, the monoclonal antibody Gb3G12 has a cross-reactivity with a complex other than Cr (III) -EDTA of 3.5% or less, and it is confirmed that the Gb3G12 antibody has a strong specificity for Cr (III) -EDTA. It was done. These results are shown in Table 1 below. The cross-reactivity is expressed by the following formula.
Cross reactivity = (dissociation constant of Cr (III) -EDTA / dissociation constant of metal-EDTA) × 100
（２）Ｇｂ３Ｇ１２抗体の検出限界
図１のグラフからＧｂ３Ｇ１２抗体のＣｒ（III)−ＥＤＴＡに対する検出限界を決定した。錯体濃度と蛍光強度の間に直線的な関係のある範囲の下限をその錯体に対する検出下限とすると、Ｇｂ３Ｇ１２抗体のＣｒ（III)−ＥＤＴＡに対する検出下限は２０ｐｐｂ（４００ｎＭ）であった。
(2) Detection limit of Gb3G12 antibody The detection limit of Cr (III) -EDTA of Gb3G12 antibody was determined from the graph of FIG. Assuming that the lower limit of the range having a linear relationship between the complex concentration and the fluorescence intensity is the detection lower limit for the complex, the detection lower limit for Cr (III) -EDTA of the Gb3G12 antibody was 20 ppb (400 nM).
実施例３：抗３価クロムモノクローナル抗体を用いた６価クロムの検出
（１）６価クロムの還元
本発明の抗体を用いて規制の対象である６価クロムを測定するためには６価クロムを３価クロムに変換する必要がある。そこで、定法に従って、６価クロムの還元を行った。５００μＬの６価クロム溶液に１００μＬのｐＨ２．０希硫酸を加えてｐＨを２．０に調整した。これに還元剤である１０％亜硫酸ナトリウムを１２０μＬ等量加え、よく撹拌し、６価クロムを３価クロムに還元した。
Example 3 Detection of Hexavalent Chromium Using Anti-Trivalent Chromium Monoclonal Antibody (1) Reduction of Hexavalent Chromium In order to measure hexavalent chromium that is the subject of regulation using the antibody of the present invention, hexavalent chromium is measured. Needs to be converted to trivalent chromium. Therefore, hexavalent chromium was reduced according to a conventional method. 100 μL of pH 2.0 dilute sulfuric acid was added to 500 μL of hexavalent chromium solution to adjust the pH to 2.0. 120 μL equivalent of 10% sodium sulfite as a reducing agent was added to this, and stirred well to reduce hexavalent chromium to trivalent chromium.
（２）Ｇｂ３Ｇ１２抗体を用いた６価クロムの検出
６価クロムを３価クロムに還元後に、ＥＤＴＡを加えてＣｒ（III)−ＥＤＴＡを形成しイムノアッセイをおこなった（図２）。図２において、横軸は還元処理を行う前の６価クロム溶液の濃度を示しており、縦軸は蛍光強度の相対値を示している。蛍光強度は、ＥＤＴＡ錯体の濃度が０の時（ＥＤＴＡ錯体を抗体に加えなかった時）の蛍光強度を１００とした。曲線は各データに対する近似曲線を示す。
その結果、６価クロム原液濃度と蛍光強度の間に直線的な関係のある範囲の下限をその錯体に対する検出下限とすると、５０ｐｐｂであることが確認された。すなわち、Ｇｂ３Ｇ１２抗体が６価クロムの環境基準および排出基準の判定に利用できることが確認された（図２）。
(2) Detection of hexavalent chromium using Gb3G12 antibody After reducing hexavalent chromium to trivalent chromium, EDTA was added to form Cr (III) -EDTA, and an immunoassay was performed (FIG. 2). In FIG. 2, the horizontal axis represents the concentration of the hexavalent chromium solution before the reduction treatment, and the vertical axis represents the relative value of the fluorescence intensity. The fluorescence intensity was defined as 100 when the concentration of the EDTA complex was 0 (when the EDTA complex was not added to the antibody). A curve shows an approximate curve for each data.
As a result, when the lower limit of the range in which there is a linear relationship between the hexavalent chromium stock solution concentration and the fluorescence intensity is taken as the detection lower limit for the complex, it was confirmed to be 50 ppb. That is, it was confirmed that the Gb3G12 antibody can be used for determination of environmental standards and emission standards for hexavalent chromium (FIG. 2).
（３）６価クロムと３価クロムの分離
検査対象試料中に３価クロムが混入している場合には、上記の還元処理を行うと、還元処理前から存在する３価クロムと６価クロムの還元物である３価クロムの区別ができず、上記のイムノアッセイ法では、もとの液中に存在した６価クロムの定量はできない。そこで、以下の方法によって、３価クロムと６価クロムを分離する。
(i)３価クロムを含む一般的な金属イオン（例えばＦｅ２＋， Ｆｅ３＋， Ｃｕ２＋， Ｎｉ２＋， Ｚｎ２＋， Ｐｂ２＋， Ｍｇ２＋， Ｃａ２＋など）は陽イオンであるが、６価クロムは通常、クロム酸塩や二クロム酸塩といった陰イオンとして存在する。一般的に、アルカリ土類や繊維金属イオンは、キレート樹脂（例えば、三菱化学のダイヤイオンキレート樹脂）に吸着する性質を持つが、６価クロムはキレート樹脂には吸着されない。よって、３価クロムを含む一般的な金属イオンは、キレート樹脂に吸着させることにより、６価クロムを含む溶液から排除することが可能である。すなわち、検査対象試料中に３価クロムが混入していたとしても、６価クロム濃度をイムノアッセイによって判定することができる。また、キレート樹脂に吸着されたイオンは、酸により遊離するので、キレート樹脂に吸着された３価クロムの定量も可能である。
(ii)検査対象試料を等量ずつ２つ用意して、一方には還元剤を添加してからイムノアッセイを行い（Ａ）、他方には還元剤を添加しないでイムノアッセイを行う（Ｂ）ことでも、試料中の６価クロムを定量できる。この場合、（Ａ）で測定される３価クロム濃度はもともと存在していた３価クロムに６価クロムが還元されて得られた６価クロム由来の３価クロムを加えた濃度となる。（Ｂ）で測定される３価クロム濃度は、検査対象試料中にもともと存在していた３価クロム濃度である。よって、（Ａ）で得られた３価クロム濃度と（Ｂ）で得られた３価クロム濃度を比較することで、還元された３価クロム濃度と６価クロム濃度が測定可能である。
(3) Separation of hexavalent chromium and trivalent chromium When trivalent chromium is mixed in the sample to be inspected, if the above reduction treatment is performed, the trivalent chromium and hexavalent chromium existing before the reduction treatment are obtained. The trivalent chromium which is a reduced product of the above cannot be distinguished, and the above-described immunoassay method cannot quantify hexavalent chromium present in the original solution. Therefore, trivalent chromium and hexavalent chromium are separated by the following method.
(i) General metal ions including trivalent chromium (for example, Fe 2+ , Fe 3+ , Cu 2+ , Ni 2+ , Zn 2+ , Pb 2+ , Mg 2+ , Ca 2+ ) are cations, but hexavalent chromium Is usually present as an anion such as chromate or dichromate. In general, alkaline earths and fiber metal ions have a property of adsorbing to a chelate resin (for example, Mitsubishi Chemical's diamond ion chelate resin), but hexavalent chromium is not adsorbed to the chelate resin. Therefore, general metal ions containing trivalent chromium can be excluded from a solution containing hexavalent chromium by adsorbing to the chelate resin. That is, even if trivalent chromium is mixed in the sample to be examined, the hexavalent chromium concentration can be determined by immunoassay. In addition, since the ions adsorbed on the chelate resin are liberated by the acid, the trivalent chromium adsorbed on the chelate resin can be quantified.
(ii) Prepare two samples to be tested in equal amounts, add the reducing agent to one and perform the immunoassay (A), and perform the immunoassay without adding the reducing agent to the other (B) The hexavalent chromium in the sample can be quantified. In this case, the trivalent chromium concentration measured in (A) is a concentration obtained by adding trivalent chromium derived from hexavalent chromium obtained by reducing hexavalent chromium to the trivalent chromium originally present. The trivalent chromium concentration measured in (B) is the trivalent chromium concentration originally present in the test sample. Therefore, the reduced trivalent chromium concentration and hexavalent chromium concentration can be measured by comparing the trivalent chromium concentration obtained in (A) with the trivalent chromium concentration obtained in (B).
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