JP4714745B2 - 検体の電気化学分析の改良方法 - Google Patents

Description

発明の技術分野

本発明は検体の電気化学的検出のための改良方法に関する。

発明の背景

国際公開WO00/011473には、検体の電気化学検出用電位差センサー電極を用いて複合体試料中の検体（例えば抗原）の電気化学分析の方法が記載されている。これらの方法に用いられるセンサー電極は一般的に導電性ポリマー（例、ポリピロール）で被覆された導電性電極からなる。検出すべき検体に選択的に結合できる受容体分子が導電性ポリマーに固定化または吸着され所望の検体の検出が可能となる。検出は、検体および電気化学検出を容易にする標識成分を含み、センサー電極の表面で受容体分子に結合した特異的な複合体を介して達成される。

一般的に、国際公開WO00/011473の検出方法は以下に要約される多くの工程を含む。
（ａ）導電性ポリマー被覆と興味のある検体に特異な固定化または吸着した受容体を有するセンサー電極を準備し、
（ｂ）センサー電極を、所望の検体が標識成分も含む複合体を形成するためにセンサー表面に固定化または吸着した受容体に結合するように試料に浸漬することにより処理し、
（ｃ）センサー電極を試料から取り出し、引き続いて、両極を適当な不活性測定緩衝液に浸漬したときの処理されたセンサー電極と参照電極との電位差を監視し、引き続いて、
（ｄ）電気化学的に活性であるもの以外は別の緩衝液にさらして、このように標識成分の電気化学的活性を促進したのち、センサー電極と参照電極との電位差を監視する。

国際公開WO03/019171には、電位差センサー電極の製造の改良方法およびこれらのセンサー電極を用いて電気化学検出の改良方法も記載されている。しかしながら、国際公開WO03/019171に記載の電気化学検出の改良方法はまだ、両極を適当な不活性測定緩液に浸漬したときの処理されたセンサー電極と参照電極との電位差の最初の測定に頼り、標識成分の電気化学的活性を促進する別の緩衝液にさらしてのち、センサー電極と参照電極との電位差を引き続き監視することに頼っている。
国際公開WO00/011473 国際公開WO03/019171

本発明者らは電気化学検出の単純化された方法を開発した。その方法は、その方法が与えられた検体を検出するのに用いられるたびに実施される標識成分の電気化学的活性を促進する緩衝液にさらす前に、両極を適当な不活性測定緩衝液に浸漬したときの処理されたセンサー電極と参照電極との電位差を測定する別工程が不要である。

発明の概要

本発明によれば、試料中の検体の電気化学検出の方法を提供するものであって、
（ａ）導電性ポリマー層で被覆された導電性電極からなるセンサー電極を準備し、
（ｂ）センサー電極を検体の存在を試験する試料を含む溶液に、導電性ポリマー層上で検体および電気化学的に活性な標識成分を含む電気化学的に活性な検体複合体（analyte complex）を形成できる条件下で接触させ、
（ｃ）センサー電極と電気化学的に活性な複合体を、電気化学的に活性な検体複合体の電気化学的活性を促進する電気化学的に活性な測定溶液に接触させ、
（ｄ）所定の保持電位を誘導するため、電流をセンサー電極に印加し、
（ｅ）電流を取り除き、センサー電極を開路静止電位に戻して、
（ｆ）試料に存在する検体量の指標として、
（ｉ）保持電位と開路静止電位との差、
（ｉｉ）センサー電極が保持電位から開路静止電位に戻る速度、
（ｉｉｉ）所定の保持電位にセンサー電極を保持するのに必要な電流量、のひとつ以上のパラメーターを測定することを特徴とする方法。

本発明の方法は例えば国際公開WO00/11473および国際公開WO03/019171に記載される方法を単純化したものであり、１つの不活性な緩衝液中と標識成分の電気化学的活性を促進する第二の緩衝液中でのセンサー電極と参照電極との電位差を測定する別工程が不要である。したがって、別個の不活性測定溶液を準備する必要がなく、追加の流体および／またはセンサー電極を不活性な測定溶液から活性な測定溶液に移すための電極操作工程が不要である。

発明の詳細な説明

本発明の方法は導電性ポリマーの層で被覆されたセンサー電極を活用する。これらのセンサー電極の基本特性および導電性ポリマーの層で導電性電極を被覆することにより電極の製造の好適な方法は以下より十分に説明されるが、出願人による公開された国際公開WO00/11473およびWO03/019171について、それらの内容を本明細書の一部を構成するものとしてその全体を援用する。

センサー電極は実質的に伝導性または半伝導性層からなるいかなる適当な電極でよい。適当な電極には、例えば金および他の貴金属電極などの水溶性媒体で安定な金属性または準金属伝導性を有する標準電位差電極を含む。センサー電極は電気化学的に被覆され、好ましくは、少なくとも１つの主表面の一部に導電性ポリマー、例えば、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリフランおよびポリアニリンなどの層で被覆される。ポリマーの薄層が導電性電極上に、製造者によればモノマー、極性溶媒および背景電解質を含む溶液から電気化学的合成により堆積されるが、それらは当業者に公知である（国際公開WO00/11473およびWO98/37409を参照）。ピロールは好適なモノマーであるが、チオフェン、フランまたはアニリンのような他のモノマーも使用してよい。２種以上のこれらのモノマーを併用して、伝導性共重合ポリマーを製造してもよい。

好適な補助電解質はドデシル硫酸ナトリウムであるが、他の電解質を使用してもよい。この電解質はドーピング剤としても働く。脱イオン水が極性溶媒として使用されるのが好ましい。

一般的に、電気化学重合溶液はモノマー水溶液と補助電解液とからなる。しかしながら、重合溶液に他の成分、例えば、生物学的受容体用またはセンサー表面の化学修飾用の結合剤（linker）として使用できる特異的な官能基を提供する成分が添加されてもよい（国際公開WO00/11473およびWO98/37409を参照）。

電気化学重合は典型的に、被覆されるセンサー電極、補助電極および参照電極からなる３つの電極セルで実施される。適当な組合せが従来技術に記載されている（国際公開WO00/11473およびそこでの引用を参照）。多重センサー電極が１つの電気接点で一組に結合ができる。センサー機能する電極の全配列が単一の重合反応中で被覆されてもよい。これが単一補助電極、または１対のセンサー機能する電極および参照電極あたり１つの補助電極を用いてもよい。例えば、各対のセンサー機能する電極および参照電極（例えば、電流滴定法）に関連する第三の対極を含む配列が補助電極として第三の対極を用いて被覆されてもよい。さらなる配置において、参照電極を重合工程用の補助（対）電極として用いてもよい。参照電極は重合用の補助電極として機能するように操作されてもよく、例えば、銀／塩化銀電極によって銀／塩化銀の比率が重合用補助電極として機能するように一時的に変更され、重合後に参照電極として機能するように戻されてもよい。

当業者に公知のように、導電性ポリマーはポリマーの構造および／または伝導特性を修飾するために電気化学的合成の段階でしはしばドーピングされる。イオン交換を行う容易さとイオン平衡が溶液に浸漬された導電性ポリマーを達成する速さは、電着段階で導入されるドーパント陰イオンの寸法に実質的に依存する。ドーパント陰イオンのイオン半径が大きいほど、イオン交換がより容易に生じ、平衡状態により速く到達する。このことは、溶液のイオン組成の変動に応じて「金属電極導電性ポリマー」系の電位の値および変化速度に直接に連動している。応答のタイプ（陰イオン、陽イオン、レドックス）およびその速度が重合中に決定できる。

典型的なドーパント陰イオンはサルフェート（ＳＯ₄ ^2-）であり、ポリマー鎖上の正荷電を中和して、重合プロセス中に取り入れられる。サルフェートはイオン交換で容易には放出されないのでポリマーの構造を維持するのに役立つ。

レドックスおよびｐＨに感度の高いセンサー用に、塩を使用するのが好ましいが、その陰イオンは電気化学重合溶液を準備するとき背景電解質として大きなイオン半径を有する。この場合、イオン応答は最小化され、レドックスまたはｐＨ応答が優位にあり、電位差応答はポリマー膜と周囲の溶液との間の電子交換によってもたらされる。

陰イオンが大きなイオン半径を有する適当な塩として、ドデシル硫酸ナトリウムおよび硫酸デキストランが含まれる。電気化学重合溶液中のこれらの塩の濃度は試験のタイプによって変化するが、０．０００１から０．０５Ｍの範囲である。

レドックス応答はドーパントイオンをポリマーに取り入れることにより増加できるが、それによって、センサーにレドックス状態の追加的な変化を与える周囲の溶液における変化によりレドックス状態を変化させることができる。ドーパントは溶液成分の１つが酸化されると還元された形であるべきで、逆の場合も同様である。Ｋ₃［Ｆｅ（ＣＮ）₆］／Ｋ₄［Ｆｅ（ＣＮ）₆］は両方の場合の１つの例として与えられる。電気化学重合溶液中のこれらの電解質濃度は試験の特定の要求に合わせて、０．００１から０．１Ｍの範囲で変化させることができる。

導電性ポリマー被覆電極の表面は検体の特異な結合用の生体分子（本明細書で「受容体」ともいう）または生体分子用またはセンサー表面の化学的修飾用の結合剤またはアダプターとして用いることができる他の官能基または分子で被覆することによりさらに修飾ができる（国際公開WO00/11473、WO98/37409およびWO96/02001を参照）。

生体分子は例えば、供試の検体と特異的に結合できる受容体分子は固相被覆の公知の技術を用いてセンサーに固定化することができる。生体分子は重合反応の間に導電性ポリマーに取り入れられる、あるいはポリマー被覆の後、別途修飾工程で被覆されたセンサー機能する電極の表面に吸着できる、またはポリマー被覆に共有結合的に結合できる（国際公開WO00/11473、WO98/37409およびWO96/02001を参照）。

詳細な実施形態において、生体分子はさらに分子または全細胞にも特異な結合の相互作用を介してセンサーの表面に付着させることができる「アダプター分子」であってもよい。適切なアダプター分子を選択して、全範囲の異なる受容体分子に結合できるアダプター分子を含む「普遍的な」センサー機能する電極を製造することも可能である。供試の検体に対する特異性は、適切な特異性のアダプター分子受容体に単純に結合することによって「普遍的な」センサー機能する電極上に与えられる。

アビジンやストレプトアビジンなどのタンパク質はアダプター分子として好ましく使用される。本発明者によって実施された調査によれば、導電性ポリマー膜に固定化されたアビジンやストレプトアビジンは延長された期間（少なくとも１年、多分それより長く）その本来の性質を保持し、ビオチン共役の受容体と結合するためこの期間を通して用いることができる。広範囲の異なる分子にビオチンの共役を可能とする技術は当業者に公知である。したがって、固定化アビジンやストレプトアビジンを有するセンサー機能する電極は、適切なビオチニル化した受容体をビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジン結合相互作用を介して結合するだけで特定の検体に対して、容易に特異性を付与できる。

アビジンおよびストレプトアビジンは好適なアダプター分子であるが、別のアダプター分子、例えばタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、レクチンおよびＦＩＴＣを使用することは本発明の範囲内にある。アダプター分子の一体化によって、他の生体分子または全細胞をセンサー機能する電極の表面に、例えばタンパク質Ａ／抗体、タンパク質Ｇ／抗体、ＦＩＴＣ／抗ＦＩＴＣまたはレクチン／糖の結合相互作用を介して、付着させることが可能となる。生体分子は別の方法としてポリマーを被覆したセンサー表面に直接吸着または共有結合的に結合してもよい。

本発明の方法を実施するために、まず、センサー電極が、検体が存在するか試験される試料を含む溶液に接触させられる。本明細書で使用される用語「試料」は検体の存在を試験するために望まれるいかなる物質もその範囲に含み、限定されないが例えば、全血、血清、血漿、尿、リンパ液、脳脊髄液、腹水、胸水または***などの生体液を含み、廃液、化学産業の廃棄物、飲食物産業で使用または生産された物質、例えばミルクまたは上記のいかなる希釈物または抽出物などの環境流体を含む。試料は溶液、固体物質の抽出物も含んでよい。あるタイプの試料は、希釈などのさらに処理することなく直接試験できるものと理解されよう。そのような試料も「検体の存在を調べる試験の試料を含む溶液」とみなされる。検体の存在を調べる試験の試料を含む溶液も本明細書では「試験溶液」と称する。

センサー電極と検体の存在を試験される試料を含む溶液との接触はセンサー電極をその溶液に全部または部分的に浸漬することで達成される。この実施形態において、溶液は適当な容器、例えば、マイクロタイタープレートのウエル（well）、微小遠心分離管またはセンサー電極あるいはセンサー電極を含む電極組合品を収容するのに適当な寸法のいかなる他の容器、に都合よく置かれてもよい。別の方法として、接触は１滴の溶液をセンサー電極の表面に垂らすことにより達成されてもよい。試験溶液の体積は、センサー機能する電極の幾何学的寸法により変わるが、一般的に５から２００μｌとなろう。

センサー電極は試料を含む溶液と十分な時間およびセンサー電極の表面に、より具体的にはセンサー電極の導電性ポリマー層上に、特異的電気化学的に活性な検体複合体を形成する条件下で接触される。センサー電極と試験溶液との接触時間は、本発明を制限しない例示として、連続的混合の有無によらず１５〜４０℃で３〜３０分が典型的である。電気化学的に活性な検体複合体は少なくとも試験される検体および電気化学的に活性な標識成分を含んでいなければならない。したがって、センサー電極の表面でのこの複合体の形成は試料中の検体の濃度に直接的または間接的に比例する。

検体複合体は、電気化学的に活性な標識成分が導電性ポリマーに物理的に近くに保持されるように、センサー電極の導電性ポリマー層に、あるいは層上に形成される。したがって、標識成分は導電性ポリマーのレドックス特性に直接または間接的に効果を及ぼして、この効果が試料中の検体量の目安を与える。なぜなら、検体と標識成分との化学量論量からなる複合体の形成は試料中の検体濃度に直接的または間接的に比例するからである。よって、導電性ポリマー被覆はセンサーの変換要素に有効であり、即ち、導電性ポリマーのレドックス状態は検体濃度に関係する化学信号を測定可能な電気信号に変換する変換器としての役割を果たす。

電気化学的に活性な標識成分は、センサー電極の導電層のレドックス特性に直接または間接的に効果を及ぼすいかなる標識であってもよい。

好適な実施形態において、電気化学的に活性な標識成分は以下の特性を有する荷電標識でもよい。
ａ）電気化学的に活性な測定溶液のｐＨで正味荷電を担持し、および
ｂ）この荷電の大きさは、所定の保持電位がセンサー電極に誘導されるときに変化し、それによって、その好適な荷電状態に関して粒子を正または負に荷電する。

適当な荷電された標識は、その荷電の大きさが、一定のｐＨでの測定溶液のイオン強度の変化、または一定イオン強度でのｐＨの変化に対応して変化することよっても特徴づけられる。この効果はセンサー電極で所定の固定電位を誘導することにより模倣することができ、それによりその好適な荷電状態に関して正または負に荷電する。したがって、本発明の方法において、２つの別個の測定溶液、即ち、不活性な測定緩衝液および一定のイオン強度でのｐＨまたは一定のｐＨでのイオン強度に関してその測定緩衝液と異なる第二の緩衝液、においてセンサー電極対参照電極の電位を測定する必要がない。その代りに、標識成分を「不活性」から「活性」緩衝液に移す効果は所定の電位の誘導によって模倣される。所定の電位が印加されると、荷電標識上の荷電の大きさが導電性ポリマー層のレドックス特性に検出可能な効果を有するように変化する。

好適な荷電された標識は限定されないが、金、フェロセンまたはラテックス微小球が挙げられる。

本発明の更なる好適な実施形態において、電気化学的に活性な標識成分は酵素標識であってもよい。好適な酵素標識は基質を生成物に変換するいかなる酵素でよく、それによって酵素の作用がセンサー電極の導電性ポリマーのレドックス組成に直接的または間接的に影響する。

一実施形態において、その酵素はセンサー電極の導電性ポリマー被覆のレドックス組成に検出できない効果を有する基質を導電性ポリマー被覆のレドックス組成に直接的または間接的に影響することのできる生成物に変換し得る。

さらなる実施形態において、その酵素はセンサー電極の導電性ポリマー被覆のレドックス組成に直接的または間接的に影響することのできる基質を導電性ポリマー被覆のレドックス組成に検出できない効果を有する生成物に変換し得る。

酵素生成物または基質がセンサー電極の導電性ポリマー被覆のレドックス組成に直接的または間接的に影響することができるのは、導電性ポリマーの化学組成および／または導電性ポリマー層の表面近くの測定溶液中のｐＨおよび／またはイオン強度の変化によるものである。

好適な酵素標識は限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ウレアーゼ、カタラーゼおよびブドウ糖酸化酵素を含む。

さらに好適な実施形態において、標識成分はマルチサブユニット酵素複合体または多酵素カスケード（cascade）を構成または一部を形成してよい。例えば、酵素標識はセンサー電極の導電性ポリマー被覆のレドックス組成に検出できない効果を有する基質を第二の酵素用の基質である生成物、即ち、センサー電極の導電性ポリマー被覆のレドックス組成に直接的または間接的に影響する第二の生成物を生成する第二の酵素の作用による生成物に変換でき得る。第二の酵素はまた電気化学的に活性な検体複合体の部分を形成、またはセンサー電極の導電性ポリマーに別個に関係してもよい。別の方法として、第一の酵素がセンサー電極の導電性ポリマー層と別個に関係してもよく、またはバルク溶液中にさえ存在するかもしれず、電気化学的に活性な検体複合体の部分を形成する第二の酵素と関係してもよい。

電気化学的に活性な検体複合体の形成は診断分析開発の当業者に理解されるであろう多くのやり方で実施できるが、これらは、とりわけ異質および同質のすべての形、以下にさらに詳細に説明する競合的分析およびサンドイッチ分析を含む。

本発明の方法は広範囲の検体用定量分析を実施するために修正してもよい。特に、その方法はサンドイッチ形式または競合的形式で電気化学的結合分析を実施するために用いてもよい。

典型的なサンドイッチ分析には興味のある検体に特異性を有する「捕捉」受容体を必要とする。その受容体は興味のある検体に特異的に結合できる実質的にいかなる特異な結合剤であってよい。適当な受容体は限定されないが、自然に生じるまたは組み換え型生物学的結合剤、例えば、抗体または抗体の破片、例えばＦ（ａｂ’）₂破片、ＳｃＡｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖ破片など、核酸、レクチン、すべてのタイプのリガンド結合受容体、例えばホルモン受容体、サイトカイン受容体など、核酸結合タンパク質およびアプタマーを含む。

捕捉受容体は典型的にセンサー電極の表面に固定化されており、例えば、ポリマー被覆電極の表面に吸着またはポリマー被覆に取り入れられてもよい。センサー電極が使用されるとき、試料中に存在するいかなる検体は固定化された捕捉受容体に結合するであろう。結合された検体の電気化学検出には捕捉剤に結合する場所から空間的に異なった場所で検体に結合できる二次的受容体が必要である。二次的受容体は典型的には荷電または酵素標識のような標識成分と共役しており、本明細書で説明したように電気化学検出が可能となる。この実施形態において、センサー電極の導電性ポリマー層上に結合された「電気化学的に活性な検体複合体」とは捕捉受容体、検体，二次的受容体および標識成分の複合体である。

上記の分析の親和性反応は当業者に公知の標準サンドイッチ結合分析と等価である。検体のサンドイッチ形式は多価抗原の検出用に特に有用であり、その場合、試験で用いる捕捉剤および標識された二次的の受容体は、異なる空間個別的な抗原上の抗原決定基と結合する抗体が好ましい。サンドイッチ形式はまた、抗原が２つ以上の空間的に離れた同一の抗原決定基を担う場合にも用いられてよい。後者の実施形態において、試験で用いる捕捉剤および標識された二次的受容体は同一の特異性の抗体でもよい。

典型的な競合的結合分析もまた興味ある検体に対する特異性を有する「捕捉」受容体を必要とし、それはサンドイッチ分析用に説明したごとく、典型的にセンサー電極の表面に固定化される。センサー電極が試料と接触がもたされると、試料中に存在するいかなる検体も固定化された捕捉受容体と結合するであろう。捕捉剤に結合することができる競合する分子は得られる捕捉剤に結合する検体と競合する。競合する分子は例えば荷電または酵素標識のような電気化学分析を可能とする標識成分で標識される。この実施形態において、センサー電極の導電性ポリマー層上に形成された「電気化学的に活性な検体複合体」は、捕捉受容体、競合する分子および標識成分の複合体である。

競合的電気化学分析において、競合する分子は標識された検体または固定化／吸着した捕捉剤上の同じ検体結合場所に結合できる検体の標識された構造的類似体でもよい。競合する分子として標識された検体の使用は特に小さな検体分子の検出にとって好ましい。別の方法として、競合する分子は固定化／吸着した捕捉剤上の異なる場所に結合してもよい。例えば、もし固定化した捕捉剤が抗体の場合、競合する分子は抗免疫グロブリン抗体（好ましくはＦａｂ特異性）または適切な特異性の抗イディオタイプ（anti-idiotype）抗体でもよい。競合検出方法は通常、センサー電極の表面に過剰な捕捉場所があるかどうかに依存する。検体と結合しない捕捉剤は競合する分子に結合するため得られるであろう。捕捉結合場所の全数が一定に保たれると仮定すると、結合した競合する分子の量は存在する検体量に反比例するであろう。

上記の方法の親和性反応工程は当業者に公知の標準サンドイッチ分析または競合的酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）と実質的に等価である。本発明の方法は特に電気化学的ＥＬＩＳＡ分析を実施するのに適当であるが、本発明の基本的分析は他のタイプの分析、例えば、ｐＨ、イオン強度またはレドックス電位の変化に伴う、例えば別の受容体を伴う分析（例、単一鎖核酸、酵素、細胞系システムほか）、を実施するために活用できる。本発明の方法はまた、適当な酵素用の基質でもある検体用直接酵素による分析を実施するのにも用いてよい。そのような実施形態において、標識成分を構成する酵素は、追加的な受容体成分に共役されるよりもむしろ、導電性ポリマーに固定化または直接吸着されてもよい。

電気化学的に活性な検体複合体の形成後に、センサー電極は電気化学的に活性な測定溶液または電気化学的に活性な検体複合体の電気化学的活性を促進する緩衝液と接触がもたらされる。「電気化学的活性を促進する」とは、活性測定溶液が、例えば外部電流の印加および引き続く除去に応答する検体複合体の標識成分の特性または活性を変化させる条件を提供することを意味する。標識複合体の特性または活性におけるこの変化が今度はセンサー電極の導電層のレドックス特性に直接または間接的に影響を及ぼす。

例えば、検体複合体が荷電した標識成分を含む実施形態において、活性測定溶液のｐＨおよび／またはイオン強度が、荷電した標識成分の荷電の強さが外部印加電流に応答して変化するようになる。荷電標識を用いて使用される活性測定溶液のモル濃度、イオン強度およびｐＨは、標識上の荷電の大きさ／強度および極性に依存して変化してもよい。検体複合体が酵素標識成分を含む実施形態において、活性測定溶液は酵素用の基質を含んでもよい。酵素標識をもちいて使用される適当な活性測定溶液は特定の酵素に対する最適なｐＨ時の酵素活性に必要なすべての試薬を含む低いイオン強度の緩衝液であり、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼに対して、その緩衝液は０．１ｍｇ／ｍｌ ＯＰＤおよび０．０３％ｗ／ｖ過ホウ酸水素を含む５０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）でもよい。

センサー電極を電気化学的に活性な測定溶液に接触させる工程（ｃ）はいくつかの異なるやり方で達成される。１つの実施形態において、センサー電極は工程（ｂ）の試料を含む溶液から工程（ｃ）の活性測定溶液に移されてもよい。センサー電極は試料を含む溶液を保持する第一の容器または槽から活性測定溶液を保持する第二の別の容器または槽に物理的に移されてもよい。センサー電極は試料を含む溶液から取り出された後に洗浄され、いかなる非結合の検体の除去を含めて、試料溶液のいかなる痕跡も除去してから、活性測定溶液に移される。

本方法の他の実施形態において、工程（ｂ）および工程（ｃ）は単一の容器または槽で、電気化学的に活性な検体複合体がセンサー電極上に形成されて後、単に過剰量の工程（ｃ）の活性測定溶液を工程（ｂ）の試料を含む溶液に添加することにより実施されてもよい。活性測定溶液の過剰な添加によりいかなる試料効果を減じ、同時に軽度に結合した複合体を除去する。この実施形態はセンサー電極が測定溶液に「移される」実施形態と同じように働く。なぜなら、測定されている効果はセンサー表面で生じ、バルク溶液中で生じるいかなる反応も導電性ポリマー被覆の表面で結合した複合体の測定にほとんどまたは何の有意な効果を有しないからである。

各種溶液用容器の使用に依存しない本方法の実施形態において、試料を含む１滴の溶液がまずセンサーの上に置かれる。試料を活性測定溶液で置き換えるのが所望されるとき、センサーは単に洗浄され、試料溶液を取り除いてそれから、１滴の活性測定溶液がセンサー上に置かれる。

センサーは活性測定溶液中に短時間置かれ（典型的には１０秒から６０秒）、それからセンサーを活性化し、センサー電極電位を所定の電位に移動するために電流が印加される。所定の電位はセンサー電極対参照電極の静止電位が、活性測定溶液に実質的に同様な組成であるが電気化学的に活性な成分のないコントロール測定溶液となる電位に関係するのが好ましい。酵素標識の場合、コントロール測定溶液は活性測定溶液と同一の組成、同一のｐＨおよび同一のイオン強度、但し酵素基質のない溶液であろう。荷電された標識の場合、コントロール測定溶液は活性測定緩衝液に対して低いイオン強度または異なるｐＨの溶液であろう。いかなる特定のセンサー系にとって、適当な値または狭い範囲の値は所定の電位に対してコントロール測定溶液中の系の静止電位を検定工程として測定することにより簡単に決定できる。選択された所定の電位は、分析方法の機能に影響を及ぼさずに静止電位の正確な測定値から実質的な範囲まで幾分変わることが理解されるであろう。特定のセンサー系に対して所定の電位の適当な値が決定または与えられると、センサーが使用されるごとにこの測定を繰り返す必要はない。

所定の保持電位を操作する電流はセンサー電極を所定の電位に適当な時間（典型的に１秒から１０秒）に保持するために維持される。電流はそれから切られて、開路電位が規定される時間の間（典型的に１秒から１８０秒）で測定される。この期間にセンサーの電位は検体複合体の電気化学的活性により、図１（ａ）、緩和状態に戻る。センサーがその緩和状態に戻るに必要な時間は測定される反応および表面で生じるその反応の濃度に依存し、これが今度は試料中に存在する検体量に依存する。

酵素標識を取り込んだ検体複合体の場合、電気化学的に活性な反応（基質の生成物への酵素による変換）がセンサー電極の表面で連続的に生じて、それゆえ、保持電流（電気的に誘導された電位）が取り除かれると電極は即座に電気化学的に誘導された静止電位に戻る。電気化学的に誘導された保持電位と電気化学的に誘導された静止電位（本明細書で開路静止電位ともいう）との差は試料中の検体濃度の指標である（注意：活性測定溶液中でこの電気化学的に誘導された静止電位の値は電気化学的に活性な成分のないコントロール緩衝液中の静止電位と異なるであろう）。

この方法を実施するに際し、検体の濃度の指標でもある他の測定がとられてもよく、指標は、与えられた所定の電位を保持するために要求される電流量、および電位が電気化学的に誘導された静止電位に戻る初期速度である。

したがって、本発明の方法は以下のパラメーターのいずれか１つまたは２つ以上のいかなる組合せの測定に基づいている。
（ｉ）保持電位と開路静止電位との差、
（ｉｉ）センサー電極が保持電位から開路静止電位に戻る速度、
（ｉｉｉ）所定の保持電位にセンサー電極を保持するに必要な電流量

パラメーター（ｉ）の測定に基づくのが最も好ましいが、パラメーター（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかまたは両方を「二次的測定」として含むことは分析の結果の信頼性を大きく改善するであろう。なぜなら、ただ１つの測定に代えて、３つの相乗的に関係した測定が使用できるからである。加えて、これらの測定のいずれか１つがセンサー電極および信号の条件が何らかの不備があるかどうかを監視し、それによって誤った結果の可能性を取り除くために使用される。

本方法はセンサーを単一の所定の電位に保持するために電流の印加だけが必要であるけれども、センサー応答を高め、参照電極が最適に平衡になるのを確実にするために別の活性化プロフィールも使用してもよい。例えば、所定の電位の上下で１つよりも多い電位に操作され、それから開路電位を測定する前に電位を設定してもよい。または、いくつかの活性化電位および／または緩和工程を、例えば図２および３に例証するように実施できる。

本発明の分析方法の測定工程、工程（ｄ）から（ｆ）には、センサー電極、参照電極および対極または補助電極を含む電極組立品が必要である。参照電極および対極の機能は２電極系において単一の電極で付与されてもよい。別の方法として、別個の対極および参照電極が３電極系において用いられてもよい。適当な参照電極として例えば、標準銀／塩化銀電極または塩化第一水銀電極が挙げられる。適当な対極として白金、他の貴金属または黒鉛や炭素のような他の不活性な伝導性材料からなる電極が挙げられる。

参照電極および対極は電極組立品を形成するためにセンサー電極の外に、またはセンサー電極と一体化されてもよい。

測定工程の間、電流はセンサー電極を所定の電位に保持するために対極とセンサー電極の間に印加され、すべての電極が活性測定溶液に接触したときにセンサー電極の電位が参照電極に対して測定される。したがって、電極組立品はセンサー電極の導電性ポリマー表面上の電気化学的に活性な検体複合体の形成の後しかし活性測定溶液との接触前または接触中に組立てられてもよい。例えば、センサー、対極および参照電極は活性測定溶液中に全部または部分的に浸漬され、電気化学的セルを形成するために適当な機器を介して接続されてもよい。参照電極および対極が工程（ｂ）で試料溶液と接触をもたらす必要はない。

別の実施形態において、１つ以上のセンサー電極、対極および参照電極が一体化されたセンサー組立品中に予め形成される。センサー組立品はセンサー電極を導電性ポリマー層で被覆する前に形成されてもよく、その場合、国際公開WO00/11473およびWO03/019171に記載のように、参照電極および対極はポリマー層の電気化学重合の目的のために用いてもよい。適当なセンサー組立品は国際公開WO00/11473およびWO03/019171にも記載されている。最終のセンサー組立品の多くの異なる配置は可能であり、例えば「計深棒（dipstick）」タイプセンサー、一体化した電気化学センサーを含むマルチウエル（multiwell）プレート（国際公開WO03/081253に記載）および電気化学センサーを一体化する側方流動装置（国際公開WO2004/010143に記載）が含まれる。

本発明は以下の限定されない実験例を参照してさらに理解されよう。

別段に規定がない限り、すべての材料および試薬、および製造の方法は国際公開WO00/11473およびWO03/019171にも記載されている。

固定化／吸着したストレプトアビジンでポリピロール膜被覆されたセンサー電極を、国際公開WO00/11473またはWO03/019171にも記載されている電気化学的被覆技術を用いて準備する。

ストレプトアビジンで被覆されたセンサーを０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で洗浄して、各センサーを連続的に２５０μｌ緩衝液で満たされたマイクロタイタープレートの３つのウエルに入れる（センサーは次の工程の間この緩衝液に保存できる）。

ビオチニル化した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）での以下の濃度で準備する。ＱＣ用に使用する正規の濃度は、０．０，０．０５，０．１，０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｎｇ／ｍｌである（異なる濃度が他の実験で求められるかもしれない）。

各ＨＲＰビオチン濃度の２００μｌをマイクロタイタープレートの１つのウエルに入れる。

ウエル当たり１つのセンサーをいれる。各センサーの作用面積は溶液中に完全に浸漬しなければならない。

ビオチニル化したＨＲＰ濃度でセンサーを室温で１５分間培養する。

センサーを０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で洗浄する。
注意：この工程の後、センサーは洗浄緩衝液中に１〜２時間保存できる。

測定にセンサーを固定電位で準備できる定電位電解装置（例、オートラボ（autolab））を用い、それから開路電位を測定する。

センサーを０．１ｍｇ／ｍｌのＯ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）および０．０３％ｗ／ｖ過ホウ酸水素を含む５０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）に入れる。

センサーを１０秒間、−１３０ｍＶにして、６０秒間、開路電位を測定する。図４に結果を示す。

本発明に係る測定の方法の概略図であり、電位が所定の電位ｙに操作され、その後スイッチが切られ、開路電位が最終電位ｚに到達するまで時間周期（ｔ）で測定される。Δｚｙが測定され、電流および速度が測定される。 図１の測定の方法の概略図であるが、ただし所定の電位ｙに到達前に電位波形、および最終測定工程を有する。 本発明に係る測定の方法の概略図であり、最終測定工程前に４つの操作電位および開放電位サイクルを含む。 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の使用に基づいて、本発明の方法を用いる分析結果を示している。各種濃度のＨＲＰにさらされた後のセンサー電極応答（電位単位ｍＶ）が、−１３０ｍＶの保持電位にして後、測定された。開路電位が６０秒間測定された。

Claims (19)

1. 試料中の検体の電気化学検出方法であって、
   （ａ）導電性ポリマー層で被覆された導電性電極からなるセンサー電極を準備し、
   （ｂ）センサー電極を検体の存在を試験する試料を含む溶液に、導電性ポリマー層上で検体および電気化学的に活性な標識成分を含む電気化学的に活性な検体複合体を形成できる条件下で接触させ、
   （ｃ）センサー電極と電気化学的に活性な検体複合体を、電気化学的に活性な検体複合体の電気化学的活性を促進する電気化学的に活性な測定溶液に接触させ、
   （ｄ）所定の保持電位を誘導するため、電流をセンサー電極に印加し、
   （ｅ）電流を取り除き、センサー電極を開路静止電位に戻して、
   （ｆ）試料に存在する検体量の指標として、
   （ｉ）保持電位と開路静止電位との差、
   （ｉｉ）センサー電極が保持電位から開路静止電位に戻る速度、
   （ｉｉｉ）所定の保持電位にセンサー電極を保持するに必要な電流量、の一つ以上のパラメーターを測定することを特徴とする電気化学検出方法。
2. 工程（ｄ）において、定電流は、センサー電極が単一の所定保持電位を保持するように印加されることを特徴とする、請求項１に記載の電気化学検出方法。
3. 工程（ｄ）において、センサー電極が、所定の保持電位の前に１つ以上の異なる電気的誘導電位および／または開路電位に保持されるように電流を変化させることを特徴とする、請求項１に記載の電気化学検出方法。
4. 工程（ｃ）が、センサー電極を工程（ｂ）の試料を含む溶液から工程（ｃ）の測定溶液に移動させることによって実施されることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の電気化学検出方法。
5. 工程（ｃ）が、工程（ｃ）の測定溶液を過剰に工程（ｂ）の試料を含む溶液に加えることによって実施されることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の電気化学検出方法。
6. 電気化学的に活性な検体複合体の電気化学的に活性な標識成分が、基質を生成物に変換できる酵素を含み、酵素の活動がセンサー電極の導電性ポリマー被覆のレドックス組成に直接影響することを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の電気化学検出方法。
7. 酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ウレアーゼ、カタラーゼまたはブドウ糖酸化酵素であることを特徴とする、請求項６に記載の電気化学検出方法。
8. 酵素が、センサー電極の導電性ポリマー層のレドックス組成に検知できる効果がない基質を導電性ポリマー層のレドックス組成に直接的または間接的に影響を与える生産物に変換できることを特徴とする、請求項６に記載の電気化学検出方法。
9. 酵素が、センサー電極の導電性ポリマー層のレドックス組成に直接的または間接的に影響を与える基質を導電性ポリマー層のレドックス組成に検知できる効果がない生成物に変換できることを特徴とする、請求項６に記載の電気化学検出方法。
10. 酵素が、センサー電極の導電性ポリマー被覆のレドックス組成に検知できる効果がない基質を第２の酵素用基質である生成物に変換でき、第２の酵素活動が第２の生成物を生じさせ、その生成がセンサー電極の導電性ポリマー被覆のレドックス組成に直接的または間接的に影響を与えることを特徴とする、請求項６に記載の電気化学検出方法。
11. 電気化学的に活性な検体複合体の電気化学的に活性な標識成分が、以下の性質を有する荷電標識である請求項１乃至５のいずれか一項に記載の電気化学検出方法。
    ａ）電気化学的に活性な測定溶液のｐＨで正味荷電を持ち、および
    ｂ）この荷電の大きさが所定の保持電位がセンサー電極に誘導されるときに変化し、それによってその好ましい荷電状態に対して正または負に粒子を荷電する。
12. 荷電標識が金、フェロセンまたはラテックス微小球であることを特徴とする、請求項１１に記載の電気化学検出方法。
13. センサー電極の導電性ポリマー層が、試料中に検出される所望の検体に定量的に結合することのできる固定化または吸着した捕捉受容体を有することを特徴とする、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の電気化学検出方法。
14. 工程（ｂ）における電気化学的に活性な検体複合体の形成が
    （ｂｌ）センサー電極を試料を含む溶液に、検体が固定化または吸着した捕捉受容体に結合するように接触させ、
    （ｂ２）センサー電極を捕捉受容体と結合できる場所から空間的に異なる場所で検体と結合することのできる二次的受容体を含む溶液と接触させ、当該二次的受容体が標識成分と共役している、ことによって実施されることを特徴とする、請求項１３に記載の電気化学検出方法。
15. 工程（ｂ）における電気化学的に活性な検体複合体の形成が、
    （ｂｌ）センサー電極を試料を含む溶液に、検体が固定化または吸着した捕捉受容体に結合するように接触させ、
    （ｂ２）センサー電極を捕捉受容体と結合できる競合する分子を含む溶液に接触させ、当該競合する分子が標識成分と共役している、ことによって実施されることを特徴とする、請求項１３に記載の電気化学検出方法。
16. 工程（ｂ１）と工程（ｂ２）が、センサー電極を標識成分と共役する二次的受容体または競合する分子が加えられた試料を含む溶液に接触させることにより、同時に実施されることを特徴とする、請求項１４または請求項１５に記載の電気化学検出方法。
17. 試料がミルクであることを特徴とする請求項１乃至1６のいずれか一項に記載の電気化学検出方法。
18. 試料が生体液であることを特徴とする、請求項１乃至１６のいずれか一項に記載の電気化学検出方法。
19. 生体液が全血、血清、リンパ液、尿、唾液、腹水、胸水、脳脊髄液または***であることを特徴とする、請求項１８に記載の電気化学検出方法。

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