JP4694504B2 - 新規プロテアソームモジュレーター - Google Patents
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Description
(X0)x0-(X1)x1-(X2)x2-X3-(X4)x4-X5-X6-(X7)x7-(X8)x8-(X9)x9 (I)
ここで、x0、x1、x2、x4、x7、x8およびx9は、独立して0または1に等しい整数をそれぞれ表す;
X0は、式(II)に対応するものから選択される基を表す:
n=1であれば、X0はアミノアシル鎖上にグラフトしたビオチニル基を表す;
n=0であれば、X0はアシル鎖HY-CO-を表す;
X1およびX3は、その側鎖に少なくとも1つのヒドロキシル官能基をそれぞれ含むL体もしくはD体の天然アミノ酸もしくは合成アミノ酸をそれぞれ表す。X1およびX3は、それらが同じもしくは異なっていてもよく、例えばトレオニンおよびセリンから選択することができる;
X2は、例えばバリン、ロイシンまたはイソロイシンのようなアルキル側鎖を含むものから選択することができるL型もしくはD型の天然アミノ酸もしくは合成アミノ酸を表す;
X4は、例えばフェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンのような芳香族側鎖を含むものから選択することができるL型もしくはD型の天然アミノ酸もしくは合成アミノ酸を表す;X4はまた、p-ベンゾイルフェニルアラニンのような光活性反応性基を含む芳香族アミノ酸でもあり得る;
X5は、以下のものから選択されるL型もしくはD型のアミノ酸を表す:正帯電アミノ酸(例、リシン、アルギニンまたはヒスチジン)、負帯電アミノ酸(例、アスパラギン酸またはグルタミン酸)、アミド官能基を有するアミノ酸(例、アスパラギンまたはグルタミン);
X6は、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンまたはアラニンから選択され得るL型もしくはD型のアミノ酸を表す;X6はまた、p-ベンゾイルフェニルアラニンのような光活性反応性基を含む芳香族アミノ酸でもあり得る;X6はまた、リシンでもあり得る;
X7は、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、アスパラギンまたはアルギニンから選択され得るL型もしくはD型のアミノ酸を表す;
X8は、プロリン、バリン、イソロイシンおよびアスパラギン酸から選択され得るL型もしくはD型のアミノ酸を表す;
X9は、セリン、アラニン、リシン、アルギニンおよびトリプトファンから選択され得るL型もしくはD型のアミノ酸を表す;
qi-i+1(i=1,・・・8)で示される2つの連続したアミノ酸Xi-Xi+1の間の結合は、ペプチド基
エステル CO-O
チオエステル CO-S
ケトメチレン CO-CH2
N-メチルアミド CO-N(Me)
逆アミド NH-CO
Z/Eビニレン CH=CH
エチレン CH2-CH2
メチレンチオ CH2-S
メチレンオキシ CH2-O
チオアミド CS-NH
メチレンアミノ CH2-NH
ケトメチレンアミノ CO-CH2-NH
ヒドラジノ CO-NH-NH
カルボニルヒドラゾン CO-NH-N=
N-アミノ CO-N(NH2)
上記のアミノ酸Xi(i=1,・・・9)は、Ci(i=1,・・・9)で示されるそれらのα-炭素の修飾を含むことができ、アミノ酸の側鎖Rを有する。その修飾は、以下の式
・x0は1に等しく、
あるいは
・結合qi-i+1(i=1,・・・8)の内の1つは、擬似ペプチド結合であり、
あるいは
・Ci(i=1,・・・9)の内の1つは、上記の修飾の内の1つを含む。
・N-末端におけるビオチニル鎖もしくはアシル鎖、
・または修飾されたペプチド結合
・または修飾α-炭素を含むアミノ酸の存在。
・N-末端におけるアシル基および1つ以上の擬似ペプチド結合
・N-末端におけるビオチニル基およびペプチド鎖の中のp-ベンゾイルフェニルアラニン基
・修飾α-炭素を含む擬似ペプチド結合およびアミノ酸
・N-末端アシル基およびβ-アミノ酸もしくはγ-アミノ酸。
・nが1のとき、好ましくは、Yは1から8個の炭素原子を含み、例えば、Yは-CpH2p-を表し、pは1、2、3、4、5、6、7もしくは8であり得る;
・nが0のとき、好ましくは、Yは5から23個の炭素原子を含み、例えば、Yは-CpH2p-を表し、pは5〜23の範囲にある整数であり得る。
X0-X1-X2-X3-X4-X5-X6 (Ia)
ここで、X0、X1、X2、X3、X4、X5およびX6は上記と同じ定義であり、アミノ酸XiおよびXi+1(i=1,・・・5)の間の結合qi,i+1は、ペプチド結合または擬似ペプチド結合である。
X3-X5-X6-X7-X8-X9 (Ib)
ここで、X3、X5、X6、X7、X8およびX9は、上記と同じ定義であり、
・2つの連続するアミノ酸の間の結合の内の少なくとも1つは、擬似ペプチド結合であり、
あるいは
・アミノ酸の内の1つのα-炭素の内の1つは、修飾α-炭素である。
ここで、*は以下のものを表す:
・エステル結合、チオエステル結合、ケトメチレン結合、ケトメチレンアミノ結合、N-メチルアミド結合、逆アミド結合、Z/Eビニレン結合、エチレン結合、メチレンチオ結合、メチレンオキシ結合、チオアミド結合、メチレンアミド結合、ヒドラジノ結合、カルボニルヒドラゾンおよびN-アミノ結合から選択される結合
あるいは
*に隣接するアミノ酸の1つに対する置換基としてのアザ−アミノ酸の存在。
A−分子の合成
1−リポペプチド
17種のリポペプチドを合成した。それらの構造は、表Iに示される:
2−擬似ペプチド
2.1還元ペプチド
a.Fmoc-ロイシナールを調製するための手順(Douat C.、Heitz A.、Martinez J.、Fehrentz J. A.「Tetrahedron Lett.,2000,41,37-40」):この手順は、以下のスキーム1により概説される。
b.Fmoc-Leu-N(CH2-CH2)2Oの合成
Fmoc-Leu-HをDouat他(上記§a)によって記述されたようにして合成した。4.81mmol(0.53ml)のN-メチルモルホリンおよび4.81mmol(0.62ml)のイソブチルクロロホルメート(IBCF)をFmoc-Leu-OH(4.81mmol、1.7g)の無水THF溶液(10mol)に-15℃において窒素流の下で滴下して加える。溶液をマグネチックスターラープレートが付いたマグネチックバーで攪拌する。その反応媒体を15分間攪拌し、濾過し、そして無水THFによって2回洗滌する。さらに窒素下で、4.81mmol(0.42ml)のモルホリンを滴下して加え、その混合物を室温において1時間攪拌する。溶媒を回転エバポレーターにより真空下で蒸発させ、残渣を50mlの酢酸エチルに溶かし、5%のKHSO4水溶液(15ml)、5%のKHSO3水溶液(15ml)に続き脱イオン水(2×10m)で洗滌する。有機相をMgSO4で乾燥し、そして回転エバポレーターにより真空下で蒸発させた。70:30の酢酸エチル:ヘキサン混合物(Rf=0.40)で実行される溶離によるシリカカラムクロマトグラフィーを使って、粗生成物(1.88g)を精製する。生成物は、白い泡の形状である(収率69%、1.4g、3.31mmol)。
c−固体支持体上での合成
1%のジビニルベンゼン(Senn Chemicals、ディールスドルフ、スイス)で架橋したFmoc-Ser(tBu)-Wang PS樹脂を使って、擬似ヘキサペプチドを半自動シンセサイザー(CNRS、IBMC、ストラスブール、フランス)により合成する。使用した方法は、従来からのFmoc/tBuプロトコルである。ペプチド鎖の延長を、Fmoc-アミノ酸(0.75mmol)の連続カップリングにより0.5meq./gで置換された0.5gの樹脂を使って行う。アスパラギンおよびトレオニンの側鎖は、トリチル基およびtert-ブチル基で保護する。カップリング触媒は、ジメチルホルムアミド(DMF、5ml)中の2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TBTU)(0.75mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(0.75mmol)、およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)(2.25mmol)である。
d−還元結合Ψ[CH2-NH]の合成
この合成は、以下のスキーム2により概説される:
Fmoc-Pro-OHおよびFmoc-Gly-OHを連続的にカップリングし、-NH2官能基を切り離した後に、アルデヒドFmoc-Leu-OH(0.253g、0.75mmol)を反応器に加え、5mlのDMFに溶解させる。数滴の氷冷されたAcOHを反応媒体に加え、3当量のNaBH3CNを1時間かけて何回かに分けて添加する。その混合物を一晩攪拌したままの状態に置く。Fmoc基を上記の条件下で脱保護する。
2.2ヒドラジノペプチド
a−NβBoc-NβBoc-Nα-Z-ヒドラジノグリシンの調製のため手順
Boc-2N-N(Z)-CH2-COOHをN.Brosse他(N.Brosse, M.-F.Pinto, J.Bodiguel, B.Jamart-Gregoire「J.org.Chem.,2001,66,2869-2873」)によって記述される方法によって合成した。この合成経路は、下記のスキーム3で概説される:
b−固体支持体合成:
この合成は、下記のスキーム4で概説される。
末端トレオニンのカップリングの後、チオアニソール(1ml)およびEDT(0.5ml)の存在下で、ペプチドをTFA(10ml)とTFMSA(1ml)との混合物により、樹脂から切断する。Jasco875UV検出器をつないだL6200ポンプを備えている日立メルクシステムで行われる高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により、擬似ペプチドを精製する。使用した分取カラムは、Waters DELTA PAK C18(300×7.8mm i.d.、粒径:15μm、多孔率:300Å)である。溶離液は、0.1体積%のTFA(配列グレード、Sigma)の超純水溶液Aおよび0.08%のTFAと20%の水とのアセトニトリル(Carlo Erba)溶液Bから構成される。ペプチドを、50%までのA中の20%のBの勾配により、30分かけて4ml/分において溶離させる。ペプチドを手作業により回収する。溶媒を蒸発させた後、精製したペプチドを凍結乾燥し、その後に質量分析およびNMRにより同定する。
2.3 ケト−メチレンアミノペプチドΨ[CO-CH2-NH]:
a−ジメチルジオキシラン(DMD)の合成
254mlの蒸留水、192mlのアセトンおよび58gのNaHCO3を1L丸底フラスコに加える。その混合物を5℃にして、120gのOxone(登録商標)を3分ごとに少量づつ加える。酸化剤を加えるごとに、かなりの量のガスを放出させる。その添加の終了時に、冷水浴を取りはずし、そしてDMDを軽度の真空の下の冷たい壁に移すことにより回収する。溶液(0.09Mにおいて約150ml)を4Åモレキュラーシーブに-20℃において保存し、そして24時間以内に使用する。
b−DMDを用いた酸化:
グリオキサールFmoc-Leu-CHOの合成:
ジアゾFmoc-Leu-CH=N2(548mg、1.5mmol)をDMD(50ml、4.5mmol)の溶液中に溶解させることにより、直接反応させる。0℃において10分攪拌した後に、溶媒を蒸発させ、そして沈殿による分離を介して残留水を除去するために、残渣をDCM(15ml)に溶かす。溶媒を再び蒸発させる。収量は定量的である。その後の精製をすることなく、グリオキサールを直ぐに使用する。
2.4 カルボニルヒドラゾンペプチドΨ[CO-NH-N=]:
この合成経路は、以下のスキーム6で概説され、そしてLourak M.、Vanderesse R.、Vicherat A.、Jamal-Eddine J.、Marraud M.「Tetrahedron Lett., 2000,8773-8776」に従った。
DIEAの存在下でDCM中のTBTUで活性化されるエステルの形成を介して、N-Fmocロイシン(1g、2.83mmol)をtert-ブチルカルバゼート(273mg、3.11mmol)とカップリングする。脱保護された化合物を98%の収率で得る。酸性媒体中で変化しやすいBoc保護を、HClの3N酢酸エチル溶液の中で化合物を1時間攪拌することにより取り除く。次いで、塩化水素に対するトリエチルアミン(Et3N)のメタノール溶液の作用により、ヒドラジンを再び発生させる。この反応は、定量的でクリーンである。ケトンパートナーとしての市販グリシンの模倣薬であるエチルグリオキシレート(1.7g、16.64mmol)でのヒドラジンの濃縮により、カルボニルヒドラゾン結合を得る。この反応を達成するために、塩基は必要ではない。2時間の反応時間は、DCMにおいて十分である。擬似ジペプチドジエチルエステルを、酢酸エチル中の30%の石油エーテルから構成される溶離液を使ってシリカゲルで精製し、そして84%の収率を有する固体の形で回収する。
合成が完了した時点で、カルボニルヒドラゾン擬似ペプチドを通常のプロトコルに従って樹脂から切断する。
3.ビオチニル化ペプチドおよび/またはp-ベンゾイルフェニルアラニン基を有するペプチド
Biot-Ava-TVT-Bpa-KFの合成
Fmoc-Phe-Wang樹脂(500mg)を5mlのDMFに溶かす。DMF中の5mlの20%ピペリジンを3回使った脱保護工程の後、5mlのDMFに溶かしたFmoc-Lys(Boc)-OH(513mg、3当量)を、TBTU(351mg、3当量)、BtOH(168mg、3当量)およびDIEA(0.6ml、9当量)の存在下で添加する。40分の攪拌の後、TNBSAの存在下で、メタノール中の樹脂ビーズのサンプルに関してテストを行う。テストが陰性(ビーズの白い着色の観察)となってから、脱保護工程を開始する。次に、アミノ吉草酸Fmoc-Ava-OHが得られるまで、Bpa(492.4mg、3当量)を順に加えるなどする。Fmoc基の脱保護の後、ビオチン(Bachem、スイス)(268mg、3当量)をDIEA(0.6 ml、3当量)の存在下で最終的に加える。攪拌を一晩続ける。5×5mlのDCMによって樹脂をすすいだ後に、樹脂を真空下で乾燥する。ペプチドおよびその樹脂は、0.75gのフェノール、0.5mlのチオアニソール、0.5mlの浸透水、0.25mlのEDTおよび10mlのTFAを含んでいる混合物と反応させる。混合物の添加を氷浴中で0℃において行った場合、攪拌は室温において1時間30分継続した。ペプチドは、氷冷したEt2Oの添加により沈殿し、そして樹脂を濾過により取り除く。焼結ガラスに残存しているペプチドを、氷冷Et2Oを満たした丸底フラスコにTFAを使って溶解させる。次いで、それを濃縮し、凍結乾燥する。
B−生物活性
1.酵素
ゼノパス(Xenopus laevis)26Sプロテアソームを以下で記述されたプロトコルに従って精製した:GLICKMAN and COUX(2001)「Current Protocols in Protein Science, Suppl. 24, Wiley, New York, pp. 21.5.1-21.5.17.」。
2.基質
Bachem社(Voisins-le-Bretonneux、フランス)から提供された蛍光発生基質Suc-LLVY-amc(CT-L)、Z-LLE-βNA(PA)およびBoc-LRR-amc(T-L)を使って、ペプチド活性を決定した。
3.装置
酵素活性はBioliseによって制御されたBMG Fluostarマルチウエルプレートリーダー蛍光計を使って測定した。この装置は、ペルティエ効果サーモスタットデバイスを備えている。
4.プロテアソームの活性の測定
酵母26Sプロテアソームおよびゼノパス26Sプロテアソームのペプチド活性ならびに酵母20Sプロテアソームのペプチド活性(潜伏もしくは活性化状態)を表IIに掲げた条件の下で決定した。
5.阻害効果の検出および考察
観察される化合物を緩衝液(ペプチド、擬似ペプチド)またはDMSO(リポペプチド、光活性化ペプチド)に溶かした。インヒビターの存在下で、酵素を対応する緩衝液(表II)の中でプレインキュベート(30℃において15分)する。インヒビターをDMSO(リポペプチド、光活性化可能ペプチド)に溶かした場合、インヒビターのないコントロールは、インヒビター(3.5%、v/v)を用いるアッセイと同一の量のDMSOを含んでいる。基質を添加することで、反応を開始させる。それを30℃において連続的に30分間モニターする。インヒビターを用いるアッセイの初期速度(実験点から計算される)をコントロールの初期速度と比較する。少なくとも2つの独立したテストの平均を計算することにより、提示された結果を得た。変動は、10%未満である。
5.1−反応速度分析
IC50パラメータは、50%の酵素活性の損失を生じさせるインヒビターの濃度と一致する。
a.IC50パラメータの測定
濃度を増加させたインヒビターの存在下で、酵素をプレインキュベートする。基質を添加することで、反応を開始させる(「阻害効果の検出および考察」のパラグラフを参照)。%阻害は、方程式1から計算する。
インヒビターの濃度の関数としてのV0/Vi比の変化の曲線を追跡することにより、阻害のメカニズムを決定する。
・厳密な競合阻害
酵素の単一部位を伴う阻害の場合、インヒビターの濃度の関数としてのV0/Vi比の変化は、方程式4で規定される直線(図1a)となる。
阻害が酵素の2つの異なる部位を伴う場合、インヒビターの濃度の関数としてのV0/Vi比の変化は、図1cの反応スキームに従って、方程式6で規定される放物線(図1b)を形成する。
6.1 ペプチド
比較の目的のために、活性化20SプロテアソームのCT-L活性およびポスト−酸活性のインヒビターである種々のペプチドを調べた。例示のためには、ペプチドTVTFKF(CT-L活性:IC50=229μM、PA活性:IC50=210μM)およびTITYKF(CT-L活性:IC50=260μM、PA活性:IC50=336μM)を挙げることができる。それらは、プロテアソームの活性部位および調節部位の両方に作用する(放物線型反応速度)。
6.2 リポペプチド
いくつかのリポペプチドは、活性化20SプロテアソームのCT-L活性のインヒビターである。
・与えられた配列のペプチドに対し、阻害効果は、一般に炭素鎖の長さに非常に敏感である。そのことは、阻害効果の正確な調節を、単にこのパラメータを調節することにより得ることができることを示唆している。したがって、親油性脂肪族鎖は、対応するペプチドの阻害効果を補強することが明らかに可能である。
6.2 擬似ペプチド
次のペプチドを合成した:
TNLGPS
次いで、TNLGPS配列を一連の擬似ペプチドの合成の出発点として使用した。
TNL-Ψ[CH2-NH]-GPS (1)
Ac-TNL-Ψ[CH2-NH]-GPS (2)
対応する擬似ペプチドTNL-Ψ[CH2-NH]-GPS(1)は、活性化20Sプロテアソームのインヒビターのように作用する。この擬似ペプチドに対するIC50の評価値は380μMであるが、ペプチドTLNGPSは、1750μMのIC50でプロテアソームを阻害する(その加水分解が無視できる実験条件の下でのテスト)。反応速度分析は、擬似ペプチド1が触媒部位および調節部位と反応することを示している。
6.3 ビオチニル化ペプチドおよび/またはp-ベンゾイルフェニルアラニン基を有するペプチド
このカテゴリーは、下記の分子で例示される:
Biot-Ava-TVT-Bpa-KF (3) IC50=32μM。
7.プロテアソーム活性化効果:
7.1 活性化効果の検出および定量化
調べる化合物を緩衝液またはDMSOに溶解させる。テストする分子の存在下で、酵素を対応する緩衝液中でプレインキュベート(30℃において15分)する。分子をDMSOに溶かした場合、コントロール(テストされる追加の分子を含まない)は、アッセイ(3.5%、v/v)と同一の量のDMSOを含んでいる。基質を添加することで、反応を開始させる。それを30℃において連続的に30分間モニターする。少なくとも2つの独立したアッセイの平均を計算することにより、提示された結果を得た。活性化は、テスト分子で処理された後の、100%より大きい活性によって特徴づけられる。変動は、10%未満である。結果は、コントロールの初期速度V0に対する、テスト化合物の存在下での初期速度Vaの比に等しい活性化ファクターfaによって表される。
7.2 結果
いくつかのペプチドおよびリポペプチドは、潜伏する20SプロテアソームのCT-L活性および/またはT-L活性のアクティベーターである。
Claims (2)
- 式TNL*GPSの分子:
ここで、*は、以下のものを表す:
エステル結合、チオエステル結合、ケトメチレン結合、ケトメチレンアミノ結合、N-メチルアミド結合、逆アミド結合、Z/Eビニレン結合、エチレン結合、メチレンチオ結合、メチレンオキシ結合、チオアミド結合、メチレンアミノ結合、ヒドラジノ結合、カルボニルヒドラゾン結合およびN-アミノ結合から選択される結合、
または、
*に隣接するアミノ酸の1つに対する置換基としてのアザ−アミノ酸の存在であり、
前記アミノ酸は、L体またはD体である。 - そのC-末端および/またはN-末端において、その生体利用性を促進する他の分子とカップリングした請求項1に記載の分子を含むことを特徴とする分子。
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