JP4690787B2 - 微生物検知チップ及び微生物検知システム並びに微生物検知方法 - Google Patents
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Description
(1)前記捕集材収納部は、微生物を含む大気を取り入れる開口面を有する浅い凹部で形成されると共に、その開口面に対向する底部に前記捕集材を収納し、前記開口面は前記捕集材に微生物が付着された状態でシール材により封止されていること。
(2)前記(1)において、前記試薬保管槽から前記捕集材収納部に試薬が送液される状態における前記捕集材収納部の上部が外部に開口する空気穴に連通されていること。
(3)前記捕集材収納部は前記基板の中央部に配置され、前記複数の試薬保管槽は前記捕集材収納部の周囲を取り囲むように配置されていること。
(4)前記(3)において、前記複数の試薬保管槽は、細長い微細流路で形成され、それぞれの一側が前記捕集材収納部に接続されると共に、それぞれの他側が外部との接続口になるチップポートに接続されていること。
(5)細菌芽胞を形成した細菌の遺伝子を検知用として用いられるものであり、前記試薬保管槽は、発芽促進剤を保管する試薬保管槽と、細胞壁破壊液を保管する試薬保管槽と、カオトロピックイオンを保管する試薬保管槽とを有すること。
(6)前記基板および前記捕集材を焼却可能な素材で形成されていること。
(1)前記捕集機と前記分析装置とは兼用して構成されていること。
(2)前記捕集機は、大気を導入するためのノズルと、このノズルの出口側に設けられた捕集室と、前記捕集チップを着脱する機構と、捕集室に導かれた空気を上記ノズルと反対側に排気するための排気部とを有するものであり、前記ノズル孔の内径は4〜15mmの範囲内にあること。
(3)前記分析チップが前記分析装置に縦置きに設置されること
(4)前記捕集チップの複数の試薬保管槽は、それぞれの一側が前記捕集材収納部に接続されると共に、それぞれの他側が外部との接続口になる複数のチップポートに接続され、前記分析装置は、前記捕集チップの各チップポートに接続される複数の流路を有する分析装置基板と、前記分析装置基板の複数の流路から前記捕集チップの各チップポートに流体をバルブを介して選択的に供給する流体供給機構とを備えていること。
(5)前記(4)において、前記分析チップの複数の試薬保管槽は外部との接続口になるチップポートに接続され、前記分析装置基板は前記分析チップの各チップポートに接続される複数の流路を有し、流体供給機構は前記分析装置基板の複数の流路から前記分析チップの各チップポートに流体をバルブを介して選択的に供給するように構成されていること。
(1)細菌芽胞を形成した細菌の遺伝子を検知を行うものであり、第1の微生物検知チップにおける前処理は発芽促進剤を保管する工程と細胞壁の溶解を行う工程とからなり、第2の微生物検知チップにおける後処理は細胞壁が溶解された遺伝子を遺伝子結合担体に結合させる工程と遺伝子−遺伝子結合担体結合物を洗浄する工程と遺伝子を遺伝子結合担体から溶離する工程と溶離した遺伝子を検出する工程とからなること。
[第1実施形態]
本発明の第1実施形態を図1から図14を用いて説明する。本発明の第1実施形態として、芽胞を形成した細菌を大気中から捕集し、芽胞を処理した後に細菌から遺伝子を抽出し、ポリメラーゼ連鎖反応により遺伝子を増幅させることで、対象の細菌が存在するか否かを検出する例を説明する。ここで、芽胞を形成する細菌とは、バチルス属菌、クロストリディウム属菌等の細菌であることができる。
(細菌検知の流れ)
第1実施形態の細菌の検知方法は、大きく分けて、細菌を捕集する工程と、細菌芽胞に発芽促進剤を添加して細菌芽胞を発芽させる工程と、発芽した細菌から遺伝子を抽出する工程と、遺伝子を増幅・検出する工程と、からなっている。ここで、遺伝子の抽出は、一般的に知られる固相抽出法により行う。固相抽出法とは、まず固体表面に遺伝子を特異的に結合させ,次に他物質と区別して遺伝子のみを水溶液に溶離させることで抽出する方法である。
(検知システムの構成、動作)
第1実施形態の検知システムの構成、動作を図2を用いて説明する。図2は本発明の第1実施形態の細菌検知システムの構成を示す図である。
(捕集機の構成、動作)
図3及び図4を参照して捕集機100の構成、動作を具体的に説明する。図3は本発明の第1実施形態に係る捕集機100の透視斜視図、図4は図3の捕集機100に捕集チップ200を装着する方法を示す斜視図である。ここで、図4(a)は捕集機100の蓋部110及びチップ支持部130を開いた状態を示す図、図4(b)は図4(a)から捕集チップ200を装着して支持部130を閉じた状態を示す図である。
(捕集チップの構成、動作)
図5及び図6を参照して捕集チップ200の構成、動作を具体的に説明する。図5は本発明の第1実施形態に係る捕集チップ200の正面図、図6は図5の捕集チップ200の縦断面図である。
・生体適合性が良好である(通常のシリコンゴムは生理的に不活性である)。
・サブミクロンの精度で型の転写が可能である(硬化前は低粘度で流動性に富むため,複雑な形状の細部まで良好に浸透する)。
・低コストである(従来の汎用マイクロデバイス材料であるパイレックス(登録商標)ガラスよりも一般的に安価である)。
・焼却により容易に廃棄可能である。
(分析チップの構成、動作)
図7から図10を参照して分析チップ300を具体的に説明する。図7は本発明の第1実施形態に係る分析チップ300の正面図、図8は図7のA−A’断面図である。なお、図8は分析チップ300を縦置きにしたときの断面図である。
(分析装置の構成、動作)
図11から図13を参照して分析装置400の構成、動作を具体的に説明する。図11は本発明の第1実施形態に係る分析装置400の斜視透視図、図12は図11の分析装置400の断面構成図、図13は図11の分析装置400の基板410を示す図である。
(分析の手順)
図7、図12、および図14を参照しながら分析チップ300と分析装置400とを用いた分析の手順を説明する。図14は本発明の第1実施形態の流体ハンドリングのプロファイルを示す図である。
分析チップ300の解凍後、捕集チップ200の処理液を分析チップ300の試料注入口310に約100μL移す。(ステップ102)
そして試料注入口310にカバーをして穴を塞ぐ。カバーは、分析チップ300と同素材の薄い樹脂シートが好ましい。樹脂同士の密着性が良く、また安価であるため使い捨てに好適である。試料注入口310をカバーする工程は、手動でもよいが、分析装置400側に試料注入口310を覆う機構が備わっているとより好ましい。(ステップ103)
次に、分析装置400の前蓋401を開いて、前蓋401に設けられたチップガイドに沿って分析チップ300を分析装置400にセットした後、分析装置400の前蓋401を閉める。これにより、分析チップ300が基板410に固定され、チップポートと装置内流路402が連通する。なお、分析チップ300は横置き、縦置きいずれでも可能であるが、ここでは縦置きの場合について述べる。(ステップ104)
次に、分析装置400内のバルブ430を切り替えて試料ポート311にのみポンプ440から流体を流す(ポート311、331:開、他のポート:閉とし、図14で開を白丸、閉を黒丸で示す)。ここで使用する流体は空気や窒素など試薬と接した時に試薬の活性が損なわれない気体であればよい。試料溜め315内の試料は遺伝子抽出エリア320に移動される。試料中のカオトロピックイオンの働きにより、試料中の細菌遺伝子は、遺伝子抽出エリア320に充填された遺伝子結合担体に結合する。細菌遺伝子と遺伝子結合担体との結合を促進するために、試料が遺伝子抽出エリア320を通過する時間は10分以上が好ましい。そして、遺伝子抽出エリア320を通過した試料は廃液槽330に貯まる。送液用の気体は廃液ポート331に抜ける。なお、チップ300を縦置きにすることで、試料が廃液ポート331から漏れるのを防ぐことができる。(ステップ105)
次に、分析装置400内のバルブ430を切り替えてポート311を閉じ、洗浄液Aポート341を開く。そして洗浄液Aポート341にのみポンプ440から流体を流す(ポート331、341:開、他のポート:閉)。洗浄液A保管槽340内の洗浄液A200μLは、流体によって遺伝子抽出エリア320に送液される。ここで、洗浄液Aとしては、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩化水素、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウム等のカオトロピックイオンが好ましい。この洗浄液Aにより、遺伝子抽出エリア320に残留する蛋白質が除去される。そして遺伝子抽出エリア320を通過した洗浄液Aは廃液槽330に貯まる。(ステップ106)
次に、分析装置400内のバルブ430を切り替えてポート341を閉じ、洗浄液Bポート351を開く。そして洗浄液Bポート351にのみポンプ440から流体を流す(ポート331、351:開、他のポート:閉)。洗浄液B保管槽350内の洗浄液B50μLは、流体によって遺伝子抽出エリア320に送液される。ここで洗浄液Bとしては、50%以上の高濃度エタノールや酢酸カリウム溶液が好ましい。この洗浄液Bにより、遺伝子抽出エリア320に残留するカオトロピックイオンが除去される。そして遺伝子抽出エリア320を通過した洗浄液Bは廃液槽330に貯まる。(ステップ107)
次に、分析装置400内のバルブ430を切り替えてポート331、ポート351を閉じ、遺伝子増幅試薬Aポート361および反応槽ポート391を開く。そして遺伝子増幅試薬Aポート361にのみポンプ440から流体を流す(ポート361、391:開、他のポート:閉)。遺伝子増幅試薬A保管槽370内の遺伝子増幅試薬A10μLは、流体によって反応槽390に送液される。ここで遺伝子増幅試薬Aとしては、4種類のdNTP(dATP、dCTP,dGTP、dTTP)、バッファ(TRIS塩酸、KCl、MgCl2など)、プライマなどから構成される。送液用の気体は、反応槽ポート391に抜ける。(ステップ108)
次に、分析装置400内のバルブ430を切り替えてポート361を閉じ、遺伝子増幅試薬Bポート371を開く。そして遺伝子増幅試薬Bポート371にのみポンプ440から流体を流す(ポート371、391:開、他のポート:閉)。遺伝子増幅試薬B保管槽380内の遺伝子増幅試薬B30μLは、流体によって反応槽390に送液される。ここで遺伝子増幅試薬Bとしては、DNA合成酵素(TaqDNAポリメラーゼ、TthDNAポリメラーゼ、VentDNAポリメラーゼ、サーモシーケナーゼなど)、蛍光色素(エチジウムブロマイド、SYBR GREEN(Molecular Probe製)、FAM,ROXなど)などから構成される。(ステップ109)
次に、分析装置400内のバルブ430を切り替えてポート371を閉じ、溶離液ポート381を開く。そして溶離液ポート381にのみポンプ440から流体を流す(ポート381、391:開、他のポート:閉)。溶離液保管槽360内の溶離液10μLは、流体によって遺伝子抽出エリア320に送液される。ここで溶離液としては、滅菌蒸留水、TRIS−EDTAやTRIS−アセテート等のバッファ溶液が使用可能である。この溶離液により、遺伝子抽出エリア320の遺伝子結合担体に捕獲されていた遺伝子が溶離する。溶離した遺伝子は反応槽390に送液される。(ステップ110)
以上の手順により、分析チップ300の反応槽390に細菌遺伝子と2種類の遺伝子増幅試薬が導入される。反応槽390内の細菌遺伝子を増幅・検出するために、温度制御機構415を駆動し、反応槽390の温度が下記の2種類の設定値を往復するように温度サイクルをかける。(ステップ111)
温度サイクル例としては、下記の程度を実施する。
「90〜95℃10〜30秒⇔65〜70℃10〜30秒」×30〜45回
好ましい一例として、以下の温度サイクルを実施する。
「94℃30秒⇔68℃30秒」×45回
温度サイクルをかけながら、光源450からの励起光を反応槽390に照射する。遺伝子は、2本鎖の内部にインターカレートした蛍光色素を有すると,吸収した光源450の光エネルギーを蛍光色素に渡す(エネルギー転移)。その結果,蛍光色素は励起こされて蛍光を発する。すなわち、試料中に目的遺伝子が存在した場合、遺伝子が増幅するに従って発する蛍光量が増加する。よって、温度サイクルの間、光検出器181により反応槽390内の蛍光量をモニタすることで、図7に示されるように、目的遺伝子の有無をリアルタイムに検出可能となる。なお、分析チップ300を分析装置400に縦置きにセットすることにより、温度サイクル中の反応物質の一部が蒸発し、蒸気が反応槽390上部に滞留しても、蛍光を検出する反応槽390の側面は蒸気によって曇らない、よって検出感度が低下しない、という長所を有する。(ステップ112)。
以上説明したように、第1実施形態によれば、捕集チップ200および分析チップ300と、捕集機100および分析装置400を組み合わせて使用することで、細菌の捕集から細菌の検出までの工程が2種類の小型のチップ200、300内で自動化される。細菌芽胞の処理や遺伝子抽出工程に人手を一切介さないため、誰でも安全に分析が可能である。さらに、チップ200、300にバルブ等の機械部品が含まれないので、使い捨て用途に好適なチップ200、300が提供できる。また、反応槽や流路を微細加工により作製し容積を微小化した結果、試薬量が削減され低コストとなるだけでなく、温度制御が迅速、混合が迅速、反応が均一といった長所が得られる。さらに、ディスポーザブルなチップ200、300に予め1検査分のみの試薬を内蔵し、チップ200、300を冷蔵・冷凍した状態でユーザーに提供することで、極めて簡便・迅速な遺伝子の検出が可能、かつ分析後に試薬と共に処分しうる分析チップを提供することができる。
[第2実施形態]
第1実施形態においては、分析チップ300内の反応槽390の個数が1個の例を示した。しかし、検査する対象が多数ある場合に対応する等の観点で、反応槽390が複数個であってもよい。その場合、検査対象の各細菌に対応したプライマが必要となるため、プライマを包含する遺伝子増幅試薬Aの保管槽も複数個必要となる。さらに、複数の反応槽390内の反応を検出するために光源450からの励起光の照射位置を反応槽390に対して切り替える必要があるが、1枚の分析チップ上で複数の細菌を同時に検査できる長所を有する。
[第3実施形態]
第1実施形態においては、捕集チップ200と分析チップ300とをセットするチップ設置部が一つの例を示した。しかし、捕集チップ200の処理と分析チップ300の処理を同時に平行して行うために、チップ設置部を2箇所設けて捕集機と分析装置とを兼用させることも可能である。捕集チップ200の処理工程では、光学検出系が不要のため、流体系、温調系を2系統にすることで2つのチップ設置部を設けることができる。装置のサイズが若干大きくなるが、捕集チップ200と分析チップ300を同時処理することで、多検体の処理時間を短縮することができる。
[第4実施形態]
この第4実施形態は、第1実施形態と比較して、分析チップ300の底部に水晶振動子や表面弾性波素子などの圧電素子を設置した点で相違する。圧電素子は、その電極上に付着した重さを発振周波数の変化に定量的に変換することから、微量な質量変化を反応雰囲気下で連続的に測定する手法として広く利用されている。そこで、所定の予め塩基配列が既知の様々なヌクレオチドを圧電素子に固定しておく。固定方法は下記の如くが好ましい。まず、圧電素子の電極上にスパッタリング、蒸着などの方法でガラス薄膜を形成する。ガラスとしては、電極素材であるクロムやチタンと最も接着性のよいSiO2を主成分としたものが好ましい。このガラス薄膜にアミノプロピルトリメトキシシラン(APS)を添加し、120〜160℃程度でベークすると、ガラス薄膜の表面にアミノ基が固定される。ここで、電極とガラス薄膜の厚みがそれぞれ0.1〜1μmであることが好ましい。双方の厚みが1μmを超えると、圧電素子の周波数応答が悪くなるためである。さらに、アミノ基がコーティングされたガラス薄膜にヌクレオチドを塗布し、恒温恒湿槽内で37℃、湿度90%で1時間保温する。その後、UVクロスリンカーを用いて60mJ/cm2の紫外線を圧電素子に照射することで、ヌクレオチドは圧電素子に強固に固定される。
Claims (16)
- 大気中の微生物を付着して捕集する捕集材と、この捕集材を装着した板状の基板とを備えた微生物検知チップであって、
前記基板は、前記捕集材を収納した捕集材収納部と、微生物の検知処理をするための試薬を貯留した複数の試薬保管槽とを備え、
前記捕集材は、濃度が2〜5%の寒天であり、且つ40〜80%濃度のアルコール類が添加されており、
前記複数の試薬保管槽は前記捕集材収納部に接続されている
ことを特徴とする微生物検知チップ。 - 請求項1の微生物検知チップにおいて、前記捕集材収納部は、微生物を含む大気を取り入れる開口面を有する浅い凹部で形成されると共に、その開口面に対向する底部に前記捕集材を収納し、前記開口面は前記捕集材に微生物が付着された状態でシール材により封止されていることを特徴とする微生物検知チップ。
- 請求項2の微生物検知チップにおいて、前記試薬保管槽から前記捕集材収納部に試薬が送液される状態における前記捕集材収納部の上部が外部に開口する空気穴に連通されていることを特徴とする微生物検知チップ。
- 請求項1の微生物検知チップにおいて、前記捕集材収納部は前記基板の中央部に配置され、前記複数の試薬保管槽は前記捕集材収納部の周囲を取り囲むように配置されていることを特徴とする微生物検知チップ。
- 請求項4の微生物検知チップにおいて、前記複数の試薬保管槽は、細長い微細流路で形成され、それぞれの一側が前記捕集材収納部に接続されると共に、それぞれの他側が外部との接続口になるチップポートに接続されていることを特徴とする微生物検知チップ。
- 請求項1の微生物検知チップにおいて、細菌芽胞を形成した細菌の遺伝子を検知用として用いられるものであり、前記試薬保管槽は、発芽促進剤を保管する試薬保管槽と、細胞壁破壊液を保管する試薬保管槽と、カオトロピックイオンを保管する試薬保管槽とを有することを特徴とする微生物検知チップ。
- 請求項1の微生物検知チップにおいて、前記基板および前記捕集材を焼却可能な素材で構成したことを特徴とする微生物検知チップ。
- 捕集機と、捕集チップおよび分析チップからなる微生物検知チップと、分析装置とを備えた微生物検知システムであって、
前記捕集チップは、大気中の微生物を付着して捕集する捕集材と、この捕集材を装着した薄い板状の捕集チップ基板とを備え、
前記捕集材は、濃度が2〜5%の寒天であり、且つ40〜80%濃度のアルコール類が添加されており、
前記捕集チップ基板は、前記捕集材を収納した捕集材収納部と、微生物の検知前処理をするための試薬を貯留した複数の試薬保管槽とを備え、
前記捕集機は、前記捕集チップを装着した状態で、前記捕集材に大気中の微生物を衝突させて付着させるものであり、
前記分析チップは薄い板状の分析チップ基板を備え、
前記分析チップ基板は、前記捕集チップで前処理された試料を貯留する試料溜めと、微生物の検知後処理をするための試薬を貯留した複数の試薬保管槽とを備え、
前記分析装置は、前記捕集チップを設置した状態で前記捕集チップによる前処理を行わせると共に、前記分析チップを設置した状態で前記分析チップによる後処理を行わせるものである
ことを特徴とする微生物検知システム。 - 請求項8に記載された微生物検知システムにおいて、前記捕集機と前記分析装置とは兼用して構成されていることを特徴とする微生物検知システム。
- 請求項8に記載された微生物検知システムにおいて、前記捕集機は、大気を導入するためのノズルと、このノズルの出口側に設けられた捕集室と、前記捕集チップを着脱する機構と、捕集室に導かれた空気を上記ノズルと反対側に排気するための排気部とを有するものであり、前記ノズル孔の内径は4〜15mmの範囲内にあることを特徴とする微生物検知システム。
- 請求項8に記載された微生物検知システムにおいて、前記分析チップが前記分析装置に縦置きに設置されることを特徴とする微生物検知システム。
- 請求項8に記載された微生物検知システムにおいて、前記捕集チップの複数の試薬保管槽は、それぞれの一側が前記捕集材収納部に接続されると共に、それぞれの他側が外部との接続口になる複数のチップポートに接続され、前記分析装置は、前記捕集チップの各チップポートに接続される複数の流路を有する分析装置基板と、前記分析装置基板の複数の流路から前記捕集チップの各チップポートに流体をバルブを介して選択的に供給する流体供給機構とを備えていることを特徴とする微生物検知システム。
- 請求項12に記載された微生物検知システムにおいて、前記分析チップの複数の試薬保管槽は外部との接続口になるチップポートに接続され、前記分析装置基板は前記分析チップの各チップポートに接続される複数の流路を有し、流体供給機構は前記分析装置基板の複数の流路から前記分析チップの各チップポートに流体をバルブを介して選択的に供給するように構成されていることを特徴とする微生物検知システム。
- 濃度が2〜5%の寒天であり且つ40〜80%濃度のアルコール類が添加されている捕集材を収納した捕集材収納部と微生物の検知処理をするための試薬を貯留した複数の試薬保管槽とを備えた微生物検知チップを捕集機に装着して、前記捕集機の送風機構を動作することにより前記捕集材に大気中の微生物を衝突させて付着させ、
微生物を付着された前記微生物検知チップを分析装置に装着して、この分析装置の送液機構を動作させて前記微生物検知チップの複数の試薬保管槽内の試薬を前記捕集材に順次供給することにより微生物検知処理を行う
ことを特徴とする微生物検知方法。 - 濃度が2〜5%の寒天であり且つ40〜80%濃度のアルコール類が添加されている捕集材を収納した捕集材収納部と微生物の検知前処理をするための試薬を貯留した複数の試薬保管槽とを備えた第1の微生物検知チップを捕集機に装着して、前記捕集機の送風機構を動作することにより前記捕集材に大気中の微生物を衝突させて付着させ、
微生物を付着された前記第1の微生物検知チップを分析装置に装着して、この分析装置の送液機構を動作させて前記第1の微生物検知チップの複数の試薬保管槽内の試薬を前記捕集材に順次供給することにより微生物検知前処理を行い、
試料溜めと検知後処理をするための試薬を貯留した複数の試薬保管槽と反応槽とを備えた第2の微生物検知チップを前記試料溜めに前記検知前処理をした試料を充填した状態で分析装置に装着して、この分析装置の送液機構を動作させて前記第2の微生物検知チップの試料溜めの試料および複数の試薬保管槽内の試薬を前記反応槽に順次供給することにより微生物検知後処理を行う
ことを特徴とする微生物検知方法。 - 請求項15の微生物検知方法において、細菌芽胞を形成した細菌の遺伝子を検知を行うものであり、第1の微生物検知チップにおける前処理は発芽促進剤を保管する工程と細胞壁の溶解を行う工程とからなり、第2の微生物検知チップにおける後処理は細胞壁が溶解された遺伝子を遺伝子結合担体に結合させる工程と遺伝子−遺伝子結合担体結合物を洗浄する工程と遺伝子を遺伝子結合担体から溶離する工程と溶離した遺伝子を検出する工程とからなることを特徴とする微生物検知方法。
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