JP4689664B2 - 生物学的に活性なペプチドvapeehptllteaplnpk誘導体 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、短いペプチドおよびその使用に関する。特に、本発明は生物学的活性を持つ短いペプチドに関する。
ペプチドは、病気の治療用に、および医薬組成物として当該分野で知られている。例えば、米国特許第6,191,113号は平滑筋細胞の成長についての阻害活性を有し、従って、アテローム性動脈硬化症、血管形成術後の再狭窄、血管移植後の管腔狭窄、および平滑筋肉腫のような平滑筋細胞の成長に関連する病理学的疾患を予防および治療するのに有用なペプチドを開示する。米国特許第6,184,208号は、上皮成長ゾーンおよび毛髪成長の重量獲得活性のような生理学的プロセスを変調することが見出されたもう1つのペプチドを開示する。さらに、PCT出願WO 03/006492および米国特許出願第10/237,405号は、ある種のペプチドおよびそれらの医薬組成物が生物学的に活性であって、免疫応答を変調できることを示唆する。
本発明の1つの態様は、生物学的活性を含むことが見出された、18アミノ酸−含有ペプチドCMS−010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)(配列番号1)から誘導されたペプチドに関し、ここに、該ペプチドはペプチドCMS−010の配列を含まない。テスト目的では、これらのペプチドの試料はL−アミノ酸で化学的に合成した。本発明のさらなる態様は、配列番号2ないし31から選択される配列を含み、実質的にそれよりなり、またはそれよりなる単離されたまたは精製されたペプチドを含み、ここに、該ペプチドはペプチドCMS−010(配列番号1)の配列を含まない。もう1つの態様は配列番号2ないし31から選択されるペプチドを含む実質的に純粋なペプチドに関し、ここに、該ペプチドはペプチドCMS−010の配列を含まない。
I.緒言
配列VAPEEHPTLLTEAPLNPKを有するペプチドCMS−010(配列番号1)は、生物学的免疫−調節活性を有することが見出され(米国特許出願第10/178,684号)、ヒト使用のための治療的潜在能力を有する。本発明は、生物学的活性を有するCMS−010の断片および誘導体に関する。特別な実施形態において、本発明は、その配列が配列番号2ないし31として与えられる断片および誘導体を含む。いくつかの実施形態において、断片は置換および/またはさらなる分子基を有するか、またはVAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS−010)の機能的誘導体であり得る。CMS−010断片および誘導体の使用は細胞および組織の調整を含む。CMS−010断片および誘導体は医薬製剤および栄養補強剤に配合することができる。
10のペプチド断片の配列から排除された他の実施形態において、アミノ酸は元の配列において相互に隣接しないが、むしろ、短縮された変種ペプチドに残るアミノ酸によって元の配列中の相互から分離される。3以上のアミノ酸がCMS−010のペプチド断片から排除される追加の実施形態において、元のペプチド断片配列から排除されたいくつかのアミノ酸は相互に隣接し、他方、元の配列から排除された1つまたは複数のアミノ酸は、排除される元の配列からのいずれの他のアミノ酸にも隣接しない。本発明の追加の実施形態において、リンカー/スペーサー配列をペプチドに挿入して、変種を形成することができるが、該変種は本実験で用いる元のペプチドとしてのそれらの活性部位を依然として保有する。これらはやはりペプチドの変種と考えられる。本明細書中で用いるペプチドアナログは、天然アミノ酸構造を模倣するアミノ酸分子を有するペプチド、例えば、異なる骨格構造、D−アミノ酸置換を持つアナログを含む。さらなる実施例として、ペプチドを合成するのに用いられるアミノ酸はそれらのL光学異性形であるが、D−形態で置換された配列におけるアミノ酸の1つまたは複数を持つペプチドは同様な生物学的活性を有することができる。特許請求の範囲で用いる用語「機能的誘導体」は、ペプチドの断片、変種、アナログまたは化学的誘導体を含むことを意味する。
って知られた他の送達形態である。処方は経口投与することもでき、経口摂取後にペプチドの胃での消化を妨げるように用いることができる担体、または当該分野で公知のいずれかの他の担体(例えば、リポソームのような経皮送達用の担体)を含有することができる。
ないし31およびその機能的誘導体から選択される配列を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなるペプチド(ここに、該ペプチドはCMS−010の配列を含まない)より実質的になるか否かを容易に決定することができる。
前記ペプチドに基づく遺伝子治療は、これらのペプチドの1つをコードする核酸配列を設計することによって行われる。該核酸は化学的に合成し、プロモーターに操作可能に連結させ、発現ベクターにクローン化することができる。次いで、発現ベクターは、ヒト細胞における発現についての遺伝子治療の形態でヒト身体に投与される。本明細書中で用いる用語「遺伝子ベクター」はこれらの発現ベクターを含む。遺伝子治療で用いることができるベクターはアデノ−関連ウイルス(Mizuno,M.et al.(1998).
Jpn J Cancer Res 89,76−80)、LNSXベクター(Miller,A.D.et al.(1993)Methods Enzymol 217,581−599)およびレンチウイルス(Goldman,M.J.et al.(1997)Hum Gene Ther 8,2261−2268)を含む。
るのに適合される発現ベクターであり得る。そのような発現ベクターの実施例は、各々、Casasに対する米国特許第6,100,388号、およびBelliniに対する米国特許第5,728,571号で見出すことができる。これらの書類は、ここに明示的に引用してその全体を援用する。当該ペプチドを投与すべき宿主生物の健康に対して有害でない生物における本発明のペプチドの発現を容易とするいずれの発現ベクターを用いることもできると認識される。
の機能的誘導体をコードする配列を含む。多数の核酸配列のいずれか1つを用いて、縮重コドン系に基づいてこれらのペプチドおよびそれらの誘導体をコードさせることができる。
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本発明の生物学的に活性なペプチドは他の生物学的に効果的なまたは有用な分子にコンジュゲートして、さらなる効果または用途を提供し、またはそれらの治療的効果を増強させることができる。多くの潜在的コンジュゲーティング分子、それらの生物学的効果およびペプチドへの分子のコンジュゲーションのための方法は当該分野で知られている。他の候補コンジュゲーションパートナーでは、本ペプチドをそれにコンジュゲートさせるための化学反応は、過度な実験無くして当業者によって推測できる。効果的分子を以下に記載する。どのようにして本発明による種々のペプチドをそれらの効果的な分子にコンジュゲートできるか、および得られたコンジュゲーション産物の生物学的特性の特別な実施例が記載される。本発明の他のペプチドを同様な反応においてコンジュゲートすることもできる。
et al.,Biochem.Pharmacol.,61(4):459,2001)、抗−癌化学療法剤である5−フルオロ−2−デオキシウリジン(FUdR)をラクトサミン化ポリ−L−リシンにコンジュゲートして、該化合物を肝臓に標的化し、肝臓ミクロ転移を治療した。薬物は、FUdRおよび標的化分子の間の結合を切断する肝臓細胞によって選択的に摂取される。次いで、遊離FUdRの一部は肝臓細胞を出て、局所化された治療濃度の抗−癌剤が作り出される。この濃度は、肝臓に浸潤した転移性細胞に対する薬理学的活性が十分である。該薬物は肝臓で選択的に濃縮されるため、コンジュゲートした薬物の用量は遊離した未コンジュゲーテッド化合物の最小薬理学的活性用量よりも有
意に小さくできる。この戦略は本発明のペプチドのいずれでも利用することができる。例えば、ラクトサミン化ポリ−L−リシンの、配列番号2ないし31およびその機能的誘導体から選択された配列を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなるペプチド(ここに、該ペプチドはCMS−010の配列を含まない)へのコンジュゲーションは、肝臓細胞に関与する細胞増殖性障害を治療または予防するのに必要な用量を有意に低下できた。
et al.,Chem.Biol.,7(7):453,2000)。本発明のペプチドをペプチドホルモン受容体のアナログにコンジュゲートさせるためのHuang et al.の技術を用い、アゴニストは、高レベルのその特定のペプチドホルモン受容体を発現する細胞を特異的に標的化する処置を作り出すであろう。このアプローチは、いずれかの数のペプチドホルモン受容体を過剰発現する標的細胞に適合させることができる。薬物を特定の組織型に標的化するもう1つの実施例において、ポリ(L−アスパラギン酸)を担体分子として用いて、薬物送達を特異的に結腸細胞に標的化した(Leopold
et al.,J.Pharmacokinet.Biopharm.,23(4):397、1995)。
るに加えて、血液−脳関門を含む内皮細胞を特異的に標的化するように設計された。血液脳関門を含めた、身体全体の内皮細胞膜は、配列特異性、およびそれらの表面に提示される膜−結合エンドペプチダーゼの濃度に関して不均一である。分子の設計はこの特徴を利用して、担体分子およびその輸送体の標的化を可能とする。該分子は、その遊離末端が、血液脳関門のエンドペプチダーゼと優先的に相互作用するであろうジペプチドArg−Proでキャップされた3つの脂肪酸鎖を含有する。次いで、親油性遊離酸鎖によって、荷電ペプチド薬物分子の輸送が可能とされる。かくして、ジペプチド−キャップドトリグリセリド分子は標的化、および血液脳関門を横切っての輸送を共に可能とする。
et al.は、ペプチド薬物を胆汁酸にカップリングさせるための手法を記載する。該化合物の経口送達に続いてのコンジュゲートした分子についての吸収速度は、ペプチド
単独と比較して有意に増強される(J.Biol.Chem.,269(14):10621,1994)。Toth et al.(J.Med.Chem.,42(19):4010,1999)は、吸収速度を増大させ、かつ抗−癌ペプチドのその活性部位への送達を増強させるための、抗−腫瘍特性を持つペプチド薬物のリポアミノ酸(LAA)またはリポ多糖(LS)へのコンジュゲーションを記載する。それらの研究において、強い抗−増殖性特性を示すが、損なわれたファルマコキネティックスを有するソマトスタチンの誘導体をLAAまたはLSいずれかにコンジュゲートさせる。得られたコンジュゲート薬物は皮膚および腸上皮を横切る吸収プロフィールを改良し、腫瘍細胞に対して依然として活性でありつつ、分化に対する抵抗性を増加させた。これらの技術は、本発明のペプチドのいずれかとのコンジュゲーションで非常に有用であろう。腸上皮を横切る分子の吸収速度を増加させることによって、ペプチドのより多くを血流に送達し、治療すべき個体に対してその効果を発揮させることができる。
Rel.,70:193,2001)。PEGへのコンジュゲーションを通じて、rhEGFは、未コンジュゲーテッド遊離rhEGFと比較して、PLGAとのミセル形成の間に、水溶性凝集体への形成に対して、および水−有機相界面への吸着に対して抵抗性となった。コンジュゲートされたホルモンでの処方の薬物動態が改良され、遊離ホルモンとよりも長く継続し、より定常的であって、かつ総じてより大きな薬物活性を示し、これは、研究者が推測するには、PEGにコンジュゲートしたホルモンの増強された物理的安定性によるものである。同様な戦略を使用して、本発明のポリペプチドのいずれかの維持放出処方を作成できよう。例えば、以下の実施例1で見られるように、VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS−010)の特定の断片および誘導体は優れた抗−増殖性および免疫調節効果を呈する。PEGをこのペプチドにコンジュゲートさせ、コンジュゲートさせた薬物をPLGAマイクロスフィアに取り込むことによって、VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS−010)の断片および誘導体の抗−増殖性および免疫−調節効果はより長く継続でき、より安定であり得る。というのは、薬物の用量は、それがそのPEGコンジュゲートから放出されるにつれ、より均一であり、感染の部位へのペプチド薬物のより一定な送達を確実とする。
PG−TXLは、遊離パクリタキセルと比較した優れた抗−腫瘍活性を有するように見え、これは、薬物が薬物動態学特性を有し、作用の優れた方法でさえあり得ることを示唆する。しかしながら、研究者は、PG−TXLが、遊離薬物と同一の作用メカニズムによってその効果を奏し、微小管サブユニットの重合を乱すことによって細胞周期阻止を誘導することを見出した。エビデンスは、コンジュゲートした薬物の優れた抗−腫瘍活性がコンジュゲートからの遊離薬物の連続的かつ定常的放出から生起し、遊離ペプチドの当量と比較してより長時間その治療濃度を維持することを示唆する。感染と戦う特性を持つ本発明のペプチドへのポリ(L−グルタミン酸)テイルの付加は、同様に、それらの特性を増強させ得るであろう。
ーション技術のいずれも、配列番号2ないし31およびその機能的誘導体から選択される配列を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなるペプチド(ここに、該ペプチドがCMS−010の配列を含まない)で用いることもできる。例えば、研究者らは、抗癌薬物ジフルオロメチルオルニチン(DFMO)を取り、それを標的化目的でペプチドにコンジュゲートした。DFMOは種々の腫瘍細胞型を殺すにおいて効果的な高度に細胞傷害性剤である。しかしながら、それは身体から迅速に排出されるため、その治療価値は制限される。この研究において、DFMOは、αメラノトロピンの特定の断片、およびヒトメラノーマ細胞系上のメラノトロピン受容体に優先的に結合することが示された2つのアミノ酸置換を含有する該断片のアナログにコンジュゲートされた(Suli−Vargha
et al.,J.Pharm.Sci.,86:997,1997)。アミノペプチダーゼによるペプチド断片からのDFMOの遊離を容易とするために、薬物は該ペプチドのN−末端にコンジュゲートされた。研究者らは、コンジュゲートされた薬物が未コンジュゲッテッド薬物単独よりもメラノーマ細胞を殺傷するにおいてより効果的であることを見出した。
イド療法の中断の間に、またはデキサメタゾンを用いる療法の引き続いての再開の間に患者に与えられた。患者は、ペプチドホルモンが同時デキサメタゾン治療の間に認められた場合にのみ、利尿およびナトリウム排出の増加に伴ってhANPに応答した。グルココルチコイド療法の中断の間でのhANPでの処置は効果を有しなかった。同時ステロイドホルモン投与の効果は、ペプチドの活性を増強することもできる。Zhu et al.(Acta Pharm.Sinica,28:166,1993)からの報告において、鎮痛剤ペプチドキオトルフィン(KTP)の活性は、ペプチド単独の作用と比較して、短いリンカーセグメントを介するヒドロコルチゾンへのコンジュゲーションによって有意に増強された。ヒドロコルチゾン単独の投与では効果は観察されなかった。
背景
VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS−010)の配列内では、いくつかのアミノ酸は他のものよりも生物学的活性につき非常に重要であり得ると予測された。本発明のいくつかの実施形態において、VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS−010)内の活性な部位/複数部位を見出すことによって、ペプチドの活性に寄与しない配列中のアミノ酸は、生物学的活性分子をより短くすることができるように除去することができる。ペプチドの異なる活性部位の組換えを行って、修飾された生物学的活性を有する新しいペプチド分子を得ることもできる。生物学的活性ペプチド分子の短縮化は、生物学的および経済的重要性双方を有することができる。より短い配列を有することによって、ペプチドの生物学的特性を修飾し、そのような修飾が、修飾された生物学的半減期、受容体親和性、または副作用プロフィールのような潜在的治療的利点を有することができる。また、より短いペプチドは生成するのがより安価であり、生成コストを低減させることができる。
イン・ビトロにおいてConAによって誘導されたマウスT−リンパ球形質転換に対するペプチドの効果
1.1.材料
1.1.1.ペプチド
関連する全てのアミノ酸はL形のものであった:CS Bio Co.,USA
1.1.2 対照および他の試薬
生理食塩水:OTSUKA Pharmaceutical Co.,Ltd,PR China。RPMI−1640培養基および胎児ウシ血清(FBS):Gibcol Co.,USA。MTTおよびConA:Sigma Co.,USA
1.2 動物
BALB/cマウス(H−2d,SPF,6ないし8週齢、体重18ないし22g:Military Medical Academy of Science,PR China。
健康なマウスから脾臓を無菌的に摘出し、注射針を用いて10%FBS RPMI−1640溶液に手動により分散させた。分散させた細胞懸濁液をさらに100−ゲージ150μm直径ステンレス鋼シーブを通してさらに篩った。脾臓細胞懸濁液を4×106/mLの密度に調製し、100μL/ウェルにて96−ウェル細胞培養プレートにアリコートした。ペプチドを純なRPMI−1640に溶解させた。グループ分けの設計を以下に掲げる。
ConA対照群:100μL RPMI−1640+75μL脾臓細胞懸濁液+25μL ConA作用溶液
陰性対照群:125μL RPMI−1640+75μL脾臓細胞懸濁液
ウェル中のConAの最終濃度は5μg/mLであった。ウェル中のペプチドの最終濃度は80μg/mL、16μg/mL、3.2μg/mL、0.64μg/mL、および0.128μg/mLであった。各ペプチド群が3つの平行ウェル、および対照群のための8または12のウェルを含んだ。細胞を37℃、5%CO2にて68時間インキュベートした。MTT方法を用いて、ELISAリーダーにて630nmで参照した各ウェルのOD570nmの数値を得た。
CMS−010.26、CMS−010.32およびCMS−010.105は、適当な濃度において、ConA陽性対照と比較して統計学的有意性をもって(P<0.05)、イン・ビトロにてConAによって誘導されたマウスT−リンパ球形質転換を抑制することができることが見出された。
イン・ビボにおけるマウスT−リンパ球形質転換およびNK細胞活性に対するペプチドの効果
2.1 材料
2.1.1 ペプチド
関連する全てのアミノ酸はL形のものであった:CS Bio Co.,USA
2.1.2 対照および他の試薬
サイクロスポリンA:Novartis Pharma AG.,Switzerland。生理食塩水:OTSUKA Pharmaceutical Co.Ltd,PR
China。RPMI−1640培養基および胎児ウシ血清(FBS):GIBCOL,USA。MTTおよびConA:Sigma Co.,USA
2.1.3 動物
BALB/cマウス(H−2d、SPF、6ないし8週齢、体重18ないし22g、50%雌および50%雄):Military Medical Academy of Science,PR China。
2.2.1 動物のグループ分けおよび投与
全ての動物は2つのペプチド群(200μg/kg/日および50μg/kg/日)、サイクロスポリンA群(10mg/kg/日)および生理食塩水群(0.5mL/日)にランダム化した。各群は10匹のマウスを含み、そこでは、半分が雌であって半分が雄であった。全てのテスト物質を0.5mL生理食塩水に溶解させ、1日1回20日間、腹腔内投与した。T−リンパ球形質転換およびNK細胞活性を、最後の注射直後の日に調べた。
最後のテスト物質投与の後の日に、マウスを頸部脱臼によって犠牲にした。脾臓を無菌的に摘出し、注射針を用いて10%FBS RPMI−1640溶液に手動で分散させた。分散させて細胞懸濁液を、さらに、100ゲージ150μm直径のステンレス鋼シールを通して篩い、4×106/mLに調製した。細胞懸濁液を、以下の設計にて、96ウェル細胞培養プレート、100μL/ウェルに摂取した。
対照ウェル:100μL細胞懸濁液+100μL RPMI−1640
4つのアッセイおよび4つの対照ウェルを各動物につき設定した。プレートを37℃、5%CO2にて68時間インキュベートした。次いで、MTTを加え、プレートを、ELISAリーダーにて、630nmにおいて参照するOD570nmで読んだ。刺激指数SI(%)=(アッセイウェルOD/対照ウェルOD)×100%
2.2.3 NK細胞活性に対するペプチドの効果[3−5]
YAC−1標的細胞を対数期までもってゆき、1×105/mLの密度に調製した。マウス脾臓細胞を前記セクション2.2.2に調製し、4×106/mLの密度に調製し、エフェクター細胞として用いた。細胞懸濁液を96ウェル細胞培養プレートに以下のように摂取した:
エフェクター細胞ウェル:100μL脾臓細胞懸濁液+100μL RPMI−1640
アッセイウェル:100μL脾臓細胞懸濁液+100μL YAC−1細胞懸濁液
標的細胞ウェル:100μL YAC−1細胞懸濁液+100μL RPMI−1640
3つのアッセイウェルおよび3つのエフェクター細胞ウェルを各動物につき設計し、12の標的細胞ウェルを細胞培養プレート当たり設定した。プレートを37℃、5%CO2にて4時間インキュベートし、次いで、MTTを加え、プレートを、ELISAリーダーにて、630nmにて参照するOD570nmで読んだ。NK細胞活性(%)=1−[(アッセイウェルOD−エフェクター細胞ウェルOD)/標的細胞ウェルOD]×100%
2.3 結果
2.3.1 T−リンパ球形質転換の実験
適当な用量において、CMS−010.04、CMS−010.12、CMS−010.14、CMS−010.24、CMS−010.25、CMS−010.26、およびCMS−010.28は、生理食塩水対照と比較して統計学的に有意性をもって(P<0.05)、イン・ビボにてマウスT−リンパ球形質転換を抑制することが判明した。
イン・ビボにおけるマウス抗体形成に対するペプチドの効果
3.1 材料
3.1.1 ペプチド
関係する全てのアミノ酸はL形のものであった:CS Bio Co.,USA。
サイクロスポリンA:Novartis Pharma AG.,Switzerland。生理食塩水:OTSUKA Pharmaceutical Co.Ltd.,PR China。
3.1.3 動物
BALB/cマウス(H−2d、SPF、6ないし8週齢、体重18ないし22g、50%雌および50%雄):Military Medical Academy of Science,PR China。
3.2.1 動物のグループ分けおよびテスト物質の投与
マウスを3つの群:ペプチド(200μg/kg/日)、サイクロスポリンA(10mg/kg/日)、および生理食塩水(0.5mL)にランダム化した。各群は12匹のマウス、6匹の雌および6匹の雄を含んだ。テスト物質を0.5mLの生理食塩水に溶解させ、20連続日の間、1日当たり1回腹腔内適用した。
ヒツジ赤血球細胞(SRBC)を生理食塩水で2%(v/v)に再懸濁させ、0.2mLの再懸濁させた細胞溶液をテスト物質投与から16日に各マウスに腹腔内適用した。最後のテスト物質投与後の日に、血液を内眼角から収集し、血清滲出のために1時間室温に放置した。10分間の200gにおける遠心の後、ノーマル生理食塩水で血清を200倍希釈した。
適当な用量におけるCMC 010.26は、生理食塩水対照群と比較して統計学的有意性をもって(P<0.05)、イン・ビボにてマウス抗体形成を抑制することが判明した。
イン・ビボにおけるKMマウス−移植S180肉腫細胞の成長速度に対するペプチドの効果
4.1 材料
4.1.1 ペプチド
全ての関与するアミノ酸はL形のものであった:CS Bio Co.,USA
4.1.2 対照および他の試薬
生理食塩水:OTSUKA Pharmaceutical Co.Ltd.,PR China。アドリアマイシン:Zhejiang Haizheng Pharmaceutical Co.,Ltd.,PR China。
健康な雌KMマウス(SPF、6ないし8週齢、体重18ないし22g):Military Medical Academy of Science,PR China。
4.2.1 動物のグループ分け、テスト物質の投与および腫瘍細胞の移植[8]
S180肉腫細胞を6ないし8日間でKMマウスに腹腔内移植し、腹水液を無菌的に収集した。細胞の濃度を10%FBS RPMI−1640でmL当たり1×107に調整し、肉腫担持マウスモデルを開発するために、0.2mLの細胞懸濁液をアームピットを通して各KMマウスに注射した。S180肉腫細胞を移植したマウスを5つの群:ペプチド(2つの群:50μg/kg/日および10μg/kg/日)、アドリアマイシン(2mg/kg/日)、シクロホスファミド(40mg/kg/日)、および生理食塩水(0.5mL/日)にランダム化した。テスト物質の腹腔内注射は腫瘍移植直後の日に開始し、20連続日の間、1日当たり1回継続した。
最後のテスト物質投与後の日に、肉腫をマウスから摘出し、重量を測定した。3つの面(A、B、C)上の各肉腫の直径をノギスによって測定した。肉腫の容量は式:V=(1/6)πABCによって計算した。腫瘍成長阻害指標は式:腫瘍成長阻害因子=(対照群の腫瘍重量−処理群の腫瘍重量)/対照群の腫瘍重量×100%によって計算した。
適当な用量において、CMS−010.103、CMS−010.02、CMS−010.03、CMS−010.04、CMS−010.05、CMS−010.07、CMS−010.08、CMS−010.09、CMS−010.11、CMS−010.13、CMS−010.14、CMS−010.15、CMS−010.16、CMS−0
10.17、CMS−010.18、CMS−010.19、CMS−010.20、CMS−010.21、CMS−010.22、CMS−010.23、CMS−010.24、CMS−010.25、CMS−010.27、CMS−010.29、CMS−010.31、およびCMS−010.32は、ノーマル生理食塩水対照群と比較して統計学的有意性をもって(P<0.05)、イン・ビボにてKMマウス−移植S180肉腫細胞の発生を抑制することが判明した。
ウサギにおける馬杉腎炎に対するペプチドの効果
5.1 材料
5.1.1 ペプチド
関連する全てのアミノ酸はL形のものであった:CS Bio Co.,USA。
デキサメタゾンリン酸ナトリウム注射:Tianjin Jinyao Aminophenal Ltd.,PR China。生理食塩水:OTSUKA Pharmaceutical Co.Ltd.,PR China。BCGワクチン:Beijing
Institute of Biological Products,PR China。ラノリン:Tianjin第6化学製品工場、PR China。流動パラフィン:Tianjin第6化学製品工場、PR China。血清BUNについての診断試薬:BECKMAN443350,USA。血清クレアチニンについての診断試薬:BECKMAN 443340,USA。
1匹の雄ヒツジ(8月齢):Department of Laboratory Animal,Tianjin Medical University,PR China。ウサギ(MDA、雄、2ないし2.5kg):Beijing Fuhao Breed Farm,PR China。
5.2.1 ヒツジ抗−ウサギ腎臓皮質抗血清の調製
5.2.1.1 ウサギ腎臓皮質抗原の調製
健康なウサギを耳介静脈内注射によって4mL/kg 25%ウレタンで麻酔し、全身ヘパリン化のために1250U/kgのヘパリンを静脈内注射した。ウサギ腹部を無菌的に切開し、腎臓動脈および静脈を露出させた。腎臓動脈をカテーテル処理し、腎臓静脈を切り離した。腎臓を、腎臓組織が灰色に変化するまで生理食塩水で圧注した。次いで、腎臓を切除した。腎臓皮質を摘出し、0.5容量の氷冷生理食塩水中にホモゲナイズし、次いで、−20℃にて貯蔵した。
7.5mLの腎臓皮質ホモゲネートを2.5mLのフロイントの完全アジュバントと混合した(5mg/mLのBCGワクチンと共に、1:5の比率の流動パラフィンに対するラノリン)。完全な乳化の後、抗原を5つの異なる背側位置において、位置当たり1mL、2週間ごとに1回、合計3ラウンドの注射にてヒツジに抗原を注射した。4番目の免疫化で出発し、5gの腎臓皮質を1容量の生理食塩水でホモゲナイズし、ヒツジの5つの位置に、位置当たり1mL、2週間毎に1回筋肉内注射した。ヒツジ抗−ウサギ腎臓皮質抗体の力価を、2週間後のベースで二重免疫拡散によってモニターした。力価が1:32に到達すると、ヒツジ抗血清を頚動脈から収集した。ヒツジ抗血清を等容量のウサギ赤血球細胞と混合し、抗−ウサギ赤血球細胞抗体の除去のために4℃にて12時間置いた。次いで、抗血清を遠心によって収集し、56℃に置いて、補体およびプロテアーゼを不活化し
た。抗血清を−20℃で貯蔵した。
22匹の健康なウサギを5つの群:ペプチド(107.3μg/kg/日および58.5μg/kg/日、群当たり4匹のウサギ)、デキサメタゾン(0.1mg/kg/日、4匹のウサギ)、生理食塩水処理(1m/日、7匹のウサギ)、および正常な健康(3ウサギ)にランダム化した。ウサギにおける病気状態の確立の前に、血清BUN、クレアチニンおよび尿蛋白の24時間にわたる測定を各ウサギにつき行った。もしこれらの測定において異常性がなければ、馬杉腎炎モデルは、耳介静脈を介し、注射当たり0.5mL、30分ごとに1回の注射、ウサギ当たり合計4回の注射にて、ヒツジ抗−ウサギ腎臓皮質抗血清の静脈内注射によって、実験ウサギにおいて確立した。正常な健康(対照)ウサギ群に同様にして生理食塩水を注射した。耳介静脈を介するテスト物質の静脈内投与は、抗血清の注射後の日に開始し、1日1回、注射当たり1mLで30連続日行った。
5.2.3.1 尿蛋白の定量
尿は1週間当たり1回24時間にわたって各ウサギから収集し、蛋白質含有量はスルホサリチル酸方法によって測定した。
馬杉腎炎ウサギからのヒツジ抗−ウサギ腎臓皮質IgG抗体のクリアランスに対するペプチドの効果の観察のために、最後のテスト物質投与後の日に、窒息によってウサギを犠牲にし、ウサギ腎臓を切除し、フリーズ−エッジし、次いで、ヒツジIgGの存在について免疫蛍光染色した。各糸球体の蛍光−陽性領域をカウントした。ウサギ当たり30の糸球体を調べ、糸球体当たりの平均陽性領域を計算した。
統計学的有意性はSPSSソフトウェアのt−検定によって決定した。
CMS−010.26は、生理食塩水処理対照群と比較して統計学的有意性をもって(P<0.05)、馬杉腎炎ウサギにてイン・ビボにおいて、蛋白血症の酷さを減少させ、ヒツジ抗−ウサギ腎臓皮質抗体のクリアランスを促進できることが判明した。
イン・ビボにおけるHeymann腎炎ラットに対するペプチドの効果
6.1 材料
6.1.1 ペプチド
用いた全てのアミノ酸はL形のものであった:CS Bio Co.,USA。
デキサメタゾンリン酸ナトリウム注射:Tianjin Jinyao Aminophenal Ltd.,PR China。生理食塩水:OTSUKA Pharmaceutical Co.Ltd.,PR China。BCGワクチン:Beijing
Institute of Biological Products。ラノリン:Tianjin化学製品の第6工場、PR China。流動パラフィン:Tianjin化学製品の第6工場、PR China。血清BUNについての診断試薬:BECKMAN 443350,USA。血清クレアチニについての診断試薬:BECKMAN 443340,USA。
Wistarラット(SPF、6ないし8週齢、体重150ないし200g):Beijing Vital River Laboratory Animal Co.,Ltd.,PR China。
6.2.1 ラット腎臓ホモゲネートの調製
健康なWistarラット腹部を無菌的に切開した。門静脈および下大静脈を露出した。門静脈をカテーテル処理し、下大静脈を切り離した。腎臓組織が灰色に変化するまで、腎臓を生理食塩水によって圧注した。腎臓を摘出し、腎臓皮質を担持した。次いで、腎臓皮質を氷上でホモゲナイズし、−20℃で貯蔵した。
ラノリンを1:2v/v比率で流動パラフィンと混合し、振盪しつつ70℃まで加熱し、次いで、オートクレーブ処理した。十分なBCGワクチンをラノリン/パラフィン混合物に加えて、3mg/mLのワクチン濃度を生じさせ、フロイントの完全アジュバントを形成した。腎臓皮質ホモゲネート、フロイントの完全アジュバント、および生理食塩水を乳鉢処理しつつ完全に乳化されるまで1:1:2に比率で混合した。
20匹の健康なWistarラットを2つの群:ペプチド(200μg/kg/日)および生理食塩水処理(2mL/日)にランダム化した。2mLの抗原を各ラットに、2週間ごとに1回、合計5ラウンドの注射にて、腹腔内注射した。腹腔内注射によるテスト物質の投与を第三免疫化の後の日に開始し、実験の最後まで1日当たり1回行った。
6.2.4.1 尿蛋白の定量
尿蛋白の定量はモデル確立の第3週において開始した。尿試料は2週間毎に1回24時間にわたって各ラットから収集し、スルホサリチル酸方法によって尿蛋白含有量を定量した。
SPSSソフトウェアを用いるt−検定によって試料値を比較した。
適当な用量において、CMS−010.26は、生理食塩水処理群と比較して統計学的有意性をもって(P<0.05)、イン・ビボにてHeymann腎炎ラットにおける蛋白血症の重症度を低下させることが判明した。
1.Shuyun Xu,Rulian Bian,Xiu Chen.Methodology of pharmacological experiment.People’s Health Publishing House.2002,1:1426−1428
2.Principles of Pre−clinical Research of New Drugs,People’s Republic of China.1993,7:134−135
3.Shuyun Xu,Rulian Bian,Xiu Chen.Method
ology of pharmacological experiment.People’s Health Publiching House.2002,1:1429
4.Jinsheng He,Ruizhu Li,Tingyi Zong.The
study on MTT reduction method of testing NK cell activity.China Immunology Journal.1996,1(6):356−358
5.Principles of Pre−clinical Research of New Drugs,People’s Republic of China,1993,7:128−129
6.Yuanpei Zhang,Huaide Su.Pharmacological experiment (second edition).People’s Health Publishing House.1998,137−138
7.Shuyun Xu,Rulian Bian,Xiu Chen.Methodology of pharmacological experiment.People’s Health Publishing House.2002,1:1429
8.Principles of Pre−clinical Research of New Drugs,People’s Republic of China.1993,7:137−139
9.Principles of Pre−clinical Research of New Drugs,People’s Republic of China.1993,7:96
10.Shuyun Xu,Rulian Bian,Xiu Chen.Methodology of pharmacological experiment.People’s Health Publishing House.2002,1:1227−1228
11.Principles of Pre−clinical Research of New Drugs,People’s Republic of China.1993,7:97
12.Shuyun Xu,Rulian Bian,Xiu Chen.Methodology of pharmacological experiment.People’s Health Publishing House.2002,1:1227
遺伝子工学により作成したLactobacillus細菌種を介するペプチドの送達
以下に、本発明のペプチドを前記した宿主に送達するための1つの例示的方法を提供する。CMS−010の断片(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)およびその機能的誘導体よりなる群から選択されるペプチド(ここに、該断片はCMS−010の配列を含まない)をコードするDNA配列は化学的手段によって合成され、このDNA配列は、当業者が精通した遺伝子工学の標準的技術を用いて発現ベクターに挿入される。発現ベクターはLactobacilliで機能する構成的プロモーター、DNA配列の特異的5’ないし3’向きでの導入のためのマルチプルクローニング部位、ならびに抗生物質に対する耐性を付与して(クローニング手法を助ける)選択マーカー遺伝子を含有し、シグナルペプチド配列のような、ペプチドの生成および/または分泌を助けるための他の配列を含むこともできる。そのようなベクターの実施例は、ここに引用してその全体を援用するPavlaに対する米国特許第5,592,908号によって供される。簡単に述べれば、この特許は、Lactobacillus種で機能するいくつかの公知のプロモーター、ならびに該細菌において新規なプロモーターを発見するための方法を議論し、そのいずれも、Lactobacilliにおいてペプチドを発現させるために本発明のペプチドをコードする核酸に操作可能に連結させることができる。前記引用の米国特許第5,529
,908号に記載されたLactobacillus lactisにおいて活性な16ないし35のほとんど疎水性のアミノ酸を含むペプチドのような単一ペプチドをコードする核酸は、該シグナルペプチドをコードする核酸が本発明のペプチドをコードする核酸に対して枠内にあるように、プロモーターおよび本発明のペプチドをコードする核酸の間に入れられる。
Bacillus subtilisの遺伝子工学作成形態を通じてのペプチドの送達
以下に、前記した宿主に本発明のペプチドを送達するためのもう1つの例示的方法を提供する。CMS−010の断片(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)およびその機能的誘導体よりなる群から選択されるペプチド(ここに、該断片はCMS−010の配列を含まない)をコードするDNA配列は化学的手段によって合成され、このDNA配列を、全ての技術が当該分野で知られている遺伝子工学の技術を介して発現ベクターに挿入する。選択された発現ベクターはE.coliおよびB.Subtilis双方で増殖でき、かつ形質転換された細菌のコロニーを選択するための抗生物質耐性遺伝子を含有する、pTZ18R(Pharmacia,Piscataway,NJ)のようなシャトルベクターを含む。このベクターは、B.subtilisのSac B遺伝子に由来するプロモーターのようなB.subtilisで活性な構成的プロモーター、ならびに細菌細胞からの発現された異種蛋白質の効果的な抽出を指令するB.subtilisで活性なシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有することができる。そのようなベ
クターの実施例は、その開示をここに引用してその全体を援用する、Fahnestockに対する米国特許第6,268,169号に開示されている。簡単に述べれば、前記で詳細を述べたように、本発明のペプチドをコードするDNAを制限酵素部位および/または他の配列にて合成して、当業者が精通した技術を介してDNAのクローニングを容易とする。E.coliへの形質転換、平板培養、選択、およびプラスミドストックを作成するためのプラスミドの増殖の後に、次いで、該プラスミドをB.subtilisに形質転換し、形質転換体を平板培養培地中で抗生物質に対する耐性に選択する。
遺伝子工学により作成されたSaccharomyces酵母種を介するペプチドの送達
以下に、前記した宿主へ本発明のペプチドを送達するためのもう1つの例示的方法を掲げる。CMS−010の断片(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)およびその機能的誘導体よりなる群から選択されるペプチド(ここに、該断片はCMS−010の配列を含まない)をコードするDNA配列を化学的手段によって合成し、このDNA配列を、全ての技術が当該分野で知られている遺伝子工学の技術を介して発現ベクターに挿入される。選択された発現ベクターは、pADH1のような構成的酵母プロモーター、酵母およびE.coli双方におけるベクターの複製用の部位、選択目的でプロトトロピーを栄養要求性酵母突然変異体に付与する遺伝子または複数遺伝子、マルチプルクローニング部位(MCS)および、所望により、単一ペプチドをコードする配列を含む、安定に維持された酵母蛋白質発現ベクターを含む。このようなベクターは商業的に入手可能であって、当該分野で良く知られているか、あるいは標準的技術を用いて容易に構築することができる。合成されたDNAの酵母ベクターへの挿入の後、E.coliへの形質転換、形質転換されたE.coliの選択された培地への平板培養、形質転換された細菌コロニーの選択、および該コロニーからの細菌の成長培養からのプラスミドDNAの調製の後、ベクターを酢酸リチウム形質転換またはエレクトロポレーションのような良く知られた技術を介してSaccharomyces cerevisiaeに形質転換する。形質転換につき選択されるSaccharomyces cerevisiaeの株は、最小培地プレート上で増殖させるためにプラスミド上の遺伝子を必要とする突然変異体栄養要求株である。形質転換された酵母コロニーは、ベクターに供された遺伝子を欠く成長培地上で酵母を平板培養することによって単離される。ベクターおよびその選択遺伝子を受領し、かつその遺伝子産物を発現している酵母のみが最小培地上でコロニーまで成長できるであろう。ペプチド分泌の確認は、ウェスターンブロットを行い、増殖基に存在するペプチドのゲル電気泳動または他の標準的技術を行うことによって得ることができる。
れている。もう1つの実施形態において、形質転換された酵母は、ヨーグルトおよびケフィールのような発酵乳製品のような食料製品の作成において、当業者に公知の技術によって用いられる。これらの食料品における生きた乳酸菌培養に関して、形質転換された酵母は少なくとも一過的に腸で集落を形成し、腸管腔を介して宿主にペプチドを提示するように働く。
ペプチドの特定の位置への標的化
以下に、身体内の特定の区画、器官、細胞型または位置へ本発明のペプチドを選択的に送達する例示的方法を供する。この場合、細胞増殖障害は、CMS−010の断片(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)およびその機能的誘導体の断片よりなる群から選択されるペプチド(ここに、該断片はCMS−010の断片を含まない)を個体の腎臓中の組織に標的化することによって治療される。例えば、CMS−010の断片(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)(ここに、該断片はCMS−010の配列を含まない)およびその機能的誘導体は、当該分野で知られた化学反応を介する共有結合によって低分子量(LMW)リソソーム、腎臓組織において特異的に濃縮される商業的に入手可能な蛋白質部位に連結される。LMWリソソームへの分子のコンジュゲーションを達成するための技術は記載されている(Folgert et al.,Br.J.Pharmacology,136:1107,2002)。蛋白質またはペプチドを相互にコンジュゲートさせるための一般的技術もまた当該分野の文献で教示される(Fischer et al.,Bioconj.Chem.,12:825,2001)。次いで、新しく作成されたコンジュゲートしたペプチド試料を、カチオン交換FPLCおよび/またはグラジエント遠心のようなクロマトグラフィー方法によって連結プロセスで用いる化学試薬から精製する。一旦精製されれば、コンジュゲートしたペプチドは腎炎細胞増殖性障害についての療法を必要とする個体に投与される。その抗−増殖性活性のため、CMS−010の断片(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)(ここに、該断片はCMS−010の配列を含まない)およびその機能的断片は、それらおよびLMWリソソームの間のリンクによって腎臓組織に優先的に標的化され、これは、腎臓の近位細管の細胞に対するLMWリソソームの親和性によって腎臓組織に選択的に濃縮される。この優先的送達は,CMS−010の断片(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)(ここに、該断片はCMS−010の配列を含まない)およびその機能的誘導体それ自体のモラー等量のそれと比較してより大きな抗−増殖性効果を可能とする。逆に、それは、あるレベルの抗−増殖性活性を達成するのに必要なペプチド薬物の量を低下することができる。
ペプチドのその活性な部位への送達の増強
以下に、神経活性ペプチドの脳への送達を増加させる例示的方法を掲げる。脳のニューロンによって発現される受容体に対するその効果を発揮する本発明のペプチドは当業者に知られた科学的方法によって合成される。別法として、前記例で詳細を記載したように、それは作成された微生物によって発現させ、そのような生物の培養から回収することができる。純粋な形態で一旦得られれば、該ペプチドを一連の有機化学反応で利用して、ペプチドに結合したトリグリセライドエステルコンジュゲーテッド部位を作り出す。コンジュゲーテッド部位はペプチドの末端カルボキシル炭素とのアミド結合を介して本発明のペプチドに連結された第四級置換炭素中心よりなる。第四級炭素中心に結合した他の3つの基は、16炭素脂肪酸鎖への炭素エステル結合よりなる。脂肪酸鎖それ自体は、該鎖をより親水性とし、それらを血液−脳関門内皮細胞膜に特異的に標的化する、ペプチドマスクとして知られた、末端ジペプチド基で終了する。この合成のための手法は、Patel et al.,Bioconjugate Chem.,8(3):434,1997に詳細に説明されており、これは、当業者が精通した共通の試薬および機器を利用する。
酵素分解に対して耐性であるペプチド処方の作成
以下に、消化管の表面に,および表面に沿って見出されるプロテアーゼおよびペプチダーゼの活性に対して耐性である経口投与用の生物学的に活性なペプチドの処方を作り出す例示的方法を掲げる。この実施例において、CMS−010の断片(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)およびその機能的誘導体よりなる群から選択されるペプチド(ここに、該断片はCMS−010の配列を含まない)を、患者への経口投与用の医薬処方を作成するのに利用する。Larionova et al.,(Int.J.Pharma.,189:171,1999)に記載されているように、該ペプチドは可溶性澱粉およびプロテアーゼ阻害剤であるアプロチニン、すなわち、種々の管腔内に分泌されたおよび刷子縁膜−結合プロテアーゼの強力な阻害剤とでのミクロ粒子の作成で用いる。簡単に述べれば、可溶性澱粉、該プロテアーゼ阻害剤アプロチミンおよび本発明のペプチドを水性緩衝液に溶解させる。可溶性澱粉、アプロチニン、およびペプチドの比率は当業者が精通した実験的方法によって決定される;例えば、Larionova et al.はイン・ビトロ刺激消化アッセイを利用して、彼らの実験で用いた蛋白質についての最も効果的な比率および調製条件を決定した。水性溶液は、5%Span−80、ノニオン界面活性剤を含有するシクロヘキサン中で機械的攪拌下で乳化される(1:3比率,v/v)。クロロホルム中の塩化テレフタロイル溶液をエマルジョンに加え、攪拌を30分間継続し、その間に、澱粉分子はアプロチニンおよびペプチドと架橋する。そのプロセスで作成されたミクロ粒子を、順次、シクロヘキサン、2%v/vTween85洗剤を含む95%エタノール溶液、95%エタノール溶液および水で洗浄する。ミクロ粒子を水に再懸濁し、凍結乾燥する。凍結乾燥した乾燥物は治療を必要とする個体への蛍光送達のためにゼラチンカプセルに入れることができる。
有するもう1つのアミノ酸によって置き換えられたV、A、P、E、H、L、A、N、KまたはTのいずれか1つ)を有するものを含む。CMS−010のペプチド断片VAPEEHPTLLTEAPLNPK)(ここに、該断片はCMS−010の配列を含まない)およびその機能的誘導体の同等ペプチドのもう1つの実施例は、同一生物学的活性を保有する、1または1アミノ酸より長いもののような、わずかにより長いペプチドである。さらに、CMS−010の断片は、(ここに、該断片はCMS−010の配列を含まない)およびその機能的誘導体の医学的適用についての前記した病気または障害は細胞増殖性および免疫学的障害および/または病気を特異的に引用するが、これらの医学的適用は非限定的例のみとして用いられ、特許請求の範囲の範囲を限定するように用いるべきではない。いずれかの免疫および/または細胞増殖性障害および/または病気を持つ正常な個人または患者の免疫系を変調するための、健康食品補充物として用いられるもののような、CMS−010の断片VAPEEHPTLLTEAPLNPK)(ここに、該断片はCMS−010の配列を含まない)およびその機能的誘導体の多の可能な/意図した使用があるのは明瞭である。いずれのそのような使用も本発明の範囲内に入る。
Claims (13)
- 配列番号24のアミノ酸配列よりなる実質的に純粋なペプチド。
- 配列番号24のアミノ酸配列よりなる実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物。
- 該ペプチドの投与の効果が細胞増殖の抑制、腫瘍成長の抑制、および免疫系の変調よりなる群から選択される効果を含む請求項2に記載の医薬組成物。
- 該細胞増殖がイン・ビボでの肉腫細胞の発生である請求項3に記載の医薬組成物。
- 免疫系の該変調がイン・ビボでのT−リンパ球形質転換、イン・ビトロにおけるConAによるT−リンパ球形質転換、およびNK細胞増強よりなる群から選択される変調である請求項3に記載の医薬組成物。
- 配列番号24のアミノ酸配列よりなるペプチドを供し、次いで、該ペプチドを医薬上許容される担体と混合することを含む、医薬組成物の製法。
- ヒト病気の効果を低下させるための医薬組成物の製造における配列番号24のアミノ酸配列よりなる実質的に純粋なペプチドの使用。
- 該ヒト病気は細胞増殖性障害および免疫学的障害よりなる群から選択される状態である、請求項7に記載の実質的に純粋なペプチドの使用。
- 該細胞増殖性障害が癌、肉腫および腫瘍よりなる群から選択される状態である、請求項8に記載の実質的に純粋なペプチドの使用。
- 免疫系の変調のための医薬組成物の製造における配列番号24のアミノ酸配列よりなる実質的に純粋なペプチドの使用。
- 該変調がイン・ビボでのT−リンパ球形質転換、イン・ビトロにおけるConAによるT−リンパ球形質転換、およびNK細胞増強よりなる群から選択される、請求項10に記載の実質的に純粋なペプチドの使用。
- 栄養補給物の製造における実質的に純粋なペプチドの使用であって、該ペプチドは配列番号24のアミノ酸配列よりなる、該使用。
- 配列番号24のアミノ酸配列よりなるペプチドの増強された誘導体を含む分子であって、該増強された誘導体は該ペプチドに操作可能に連結された増強分子を含み、該増強分子は該ペプチドの治療的有効性を増強させることを特徴とする該分子。
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