JP4680387B2 - ジスルフィド含有標的ベクターの部位特異的標識化 - Google Patents
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Description
【０００１】
［発明の背景］
＜発明の分野＞
本発明は、ジスルフィド結合を含有する疾患標的薬剤と、放射標識化標的薬剤と、これらの方法を使用して産生される薬剤接合体とにチオール含有リンカーを導入するための方法に関する。また、本発明は、診断用または治療用の放射標識化標的薬剤、あるいは薬剤を担体する標的薬剤の使用法に関する。
【０００２】
＜関連技術の説明＞
ハロアセテート、マレイン酸イミド、活性化スルホニル基などの反応基に対するチオール基の特異性のため、また、還元過テクネシウム酸塩や過レニウム酸塩などの還元金属種、それに亜鉛、銅、水銀、カドミウム、プラチナ、パラジウム、鉛、ビスマスなどのある種のチオ親和性金属に対するチオール基の特異性のため、遊離チオールは特定の標的薬剤に対して、さまざまな種を付着させることに関してユニークな化学的部位をもたらす。しかし、多くのタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドに関する面倒な問題としては、それらの構造保全には欠かせないジスルフィド結合の存在である。チオール基のその固有の反応性ゆえに、ジスルフィド混合物の形成の可能性と、標的抗原あるいは受容体にタンパク質、ポリペプチド、ペプチドが結合できなくなることを伴う、こうしたジスルフィド結合の破損につながる。
【０００３】
より小さな断片は、完全なIgGあるいはより大きなタンパク質よりも、より速く標的に接近し、またクリアする（除去される）ので、サブFab'断片、一本鎖抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ポリペプチドおよびペプチドに加えて、抗体断片は、放射線イメージング用および放射線治療用同位元素のin vivoでの標的化には有益である。例えば、放射標識抗体断片は、完全な(手を加えない）IgGよりも速く標的に対して治療用あるいはイメージング用同位元素の線量を送達し、またクリアランスが速いことにより、非標識組織に対する放射能線量を最小限にすることができる。急速な標的化はとくに、Tc−99m（t1/2＝6時間）あるいはRe−188（t1/2＝17時間）などの半減期が短い同位元素では重要である。TcおよびReの陽イオンはチオ含有リガンドには強力に結合するが、しかし、抗体あるいは抗体断片に対するこれらリガンドの接合体にはいくつか難しい問題が存在しうる。
【０００４】
F(ab')2断片のような二価抗体断片は、二価結合領域が抗原に対するタンパク質の親和性を増加させるため、Fab'断片に比べて標的としての総量（total targeting)が増加して然るべきである。F(ab')2断片は、チオール含有部分が複合するとき、その後の両方で遊離チオールによる還元に対しては感受性がある1つ以上のスルフィド結合により結合される2つのFab'断片から成っている。したがって、抗体上でのジスルフィドと、リガンド上の遊離チオールとの相互作用を最小限にするために、その後に、脱保護となる保護チオールを使用するか、あるいは低チオール濃度と親水性チオールを使用するかのいずれかによって、そのタンパク質に対してチオール含有リガンドを接合させることが必要である。
【０００５】
ターゲッティング剤上の非特定部位に対して結合まはた接合するときに起こる可能性があるもう1つの問題は、その結合（接合）が抗体の抗原結合領域あるいはペプチド／ポリペプチドの受容体結合領域に、あるいはその近くに結合されることがあり、それが抗体あるいはペプチドの抗体あるいは受容体に対する結合親和性を減少またはなくす可能性があることである。過ヨウ素酸により酸化された炭水化物部位（アルデヒドとケトン）に対するハプテンの接合は、部位特異的に接合体を形成する1つの方法である。炭水化物領域は、タンパク質あるいはペプチド上の特異的な部位のなかに遺伝子工学的に処理して入れることができ、したがって、例えば、その抗原に対する抗体断片の結合に干渉することがないF(ab')2断片上の部位に炭水化物を置くことが可能である。
【０００６】
ある種のIgGの軽鎖上にある炭水化物残基の存在が立証されている。こうした残基は、ペプシンあるいはパパイン消化作用の後に、それぞれF(ab')2およびF(ab)2上に残こる。このように、こうした残基は、ハプテン付着に関する、マスクされた潜在的で部位特異的な化学的結合部位を示す。さらに、ある種のマウス抗体が、同じ抗体のヒト化された相補性決定領域バージョン（humanized complementarity determining region version)を産生するように、遺伝子工学的に処理し直され、一方、同時に、抗体の抗原結合部位からは遠位の位置にあるグリコシル化部位が遺伝子工学的に処理されている。これにより、軽鎖あるいは重鎖上にあるCH1ドメインと可変領域の中のそのタンパク質内の所望された位置に炭水化物を挿入することが可能である。
【０００７】
放射標識の生体分布が抗体断片の生体分布を反映するように、in vitroおよびin vivoにて十分に安定している接合体も必要である。抗体に対する接合体の結合あるいは接合体への放射性同位元素の付着が不安定であれば、その場合には、その標的に到達する放射性同位元素の実質的な減少がみられることがある。そのタンパク質から分離する放射性同位元素は、バックグラウンド放射能に影響を与える可能性があり、それがさらにターゲッティングを困難にさせる。
【０００８】
放射線画像および放射線治療の用途のチオ親和性金属イオンによって、容易に放射能標識することができる、あるいは標的化された化学療法のための薬剤により置換することができるチオール含有ジスルフィド結合ターゲッティングベクターを作成する必要性が引き続き存在している。
【０００９】
［発明の概要］
本発明の1つの目的は、標的タンパク質のジスルフィド結合を切断することなく、チオール含有リガンドと、ジスルフィド含有標的タンパク質、ポリペプチド、およびペプチド、例えば、二価抗体断片および（sv）2とチオール含有リガンドとの接合体を提供することである。
【００１０】
本発明のもう1つの目的は、さらにある種の放射性同位元素あるいは化学療法薬剤を付着させる特異的化学的結合部位として、ジスルフィド含有タンパク質あるいはペプチドに付着させる置換チオール基を使用することである。
【００１１】
本発明のもう1つの目的は、in vitroとin vivoにて安定している放射標識タンパク質を提供することである。
【００１２】
さらにもう1つの目的は、疾患の放射線診断、放射線治療および化学療法用途に安定的に置換されたジスルフィド含有タンパク質、ポリペプチド、ペプチドを使用するための方法を提供することである。
【００１３】
これらとそのほかの目的は、その生物学的活性を維持するのに必要である少なくとも1つのジスルフィド結合を含有し、またヒドラゾンあるいはヒドラジン結合を介して、そこに結合される少なくとも1つのチオール含有部分を有するタンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドの診断あるいは治療目的の接合体を産生し、また、そのジスルフィド結合の実質的な切断をすることなく、そのタンパク質、ポリペプチド、ペプチドの安定した診断あるいは治療用途の接合体を形成するために、前もって形成するかあるいはその場（ｉｎ ｓｉｔｕ）で生成されるかのいずれかによって、そのタンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドを、チオール反応性の診断用あるいは治療用薬剤と接触させる方法を提供することにより達成される。
【００１４】
前述の方法においては、ヒドラゾンあるいはヒドラジン結合によりタンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドに結合されるチオール含有部分は、式HS−Q− NHNH2のチオール−ヒドラジンと、アルデヒドあるいはケトン基も含有するジスルフィド結合含有タンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドを反応させることにより結合されるが、その式では、Qは、アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、ペプチド、およびそれらを組み合わせたものを含むグループから選択された結合部分であり、また、任意選択的に、結果的に生じるヒドラゾンをヒドラジンに還元する。
【００１５】
接合体における診断用あるいは治療用薬剤は、チオール結合の陽イオン放射線同位元素であり、あるいはチオール結合リンカーを含む薬剤誘導体でありうる。
【００１６】
1つの好適な実施態様では、そのタンパク質は、その部分的に酸化されている炭水化物部分が、チオール含有部分に対してヒドラゾンあるいはヒドラジン結合により結合されるグリコシル化二価抗体の断片である。
【００１７】
前述の方法にしたがって放射標識に影響を与える予め成形された安定キットもまた提供される。
【００１８】
［詳細な説明］
本発明者らは、カルボニル官能基、例えば、タンパク質の過ヨウ素酸酸化炭水化物部分を介して、接合体あるいは標識過程の間のFab'へのF（ab'）2の還元などいった活性に関連した構造および／または高次構造を維持するジスルフィド結合を還元することなく、チオール含有ペプチドリンカーあるいはリガンドをジスルフィド含有タンパク質あるいはジスルフィド含有ペプチド、例えば、F(ab')2に接合あるいは結合させるための方法を開発した。ジスルフィド結合含有タンパク質へのリンカーあるいはリガンドの付着が安定していて、またリガンドへの放射標識、例えば、Tc−99mの付着がin vitroおよびin vivoにて安定している接合体が産生された。グリコシル化F（ab'）2断片の場合、Tc−99m標識ペプチドキレート剤の好適な具体例は、I−125標識F(ab')2あるいはTc−99m標識Fab'よりも、腫瘍に対して注射された供与薬物を高割合で送達した。
【００１９】
驚くべきことに、本発明者らは、酸化炭水化物部分により抗体に対する薬剤およびキレート核種分子の接合体に通常的に使用されるアシルヒドラジドがin vitroであっても非常に不安定であることを見出した。これは、Tc−99mの放射標識接合体IMP 126−LL2−F(ab')2とIMP 140−LL2− F(ab')2についての安定性実験で示された。LL2は、米国特許第5,789,554号に記載されている抗CD−22モノクローナル抗体(mab)である。
IMP 126 Ac−D−Lys (TscG−Cys−)−D−Asp−D−Ala−Gly−NHNH2
IMP 140 Ac−D−Asp−Lys (TscG−Cys−)−D−Asp−D−Lys−D−Asp−NHNH2
TscGは、H2NCSNHN = CHC (O)−チオセミカルバゾニルグリオキシルの略記である。
【００２０】
Tc−99m標識ペプチドは、時間をかけて溶液中に貯蓄されるときに、そのタンパク質から解離する。標識ペプチドのin vitroでの喪失は、粒径排除HPLC（高性能液体クロマトグラフィ）および逆相HPLCによりモニターされた。アシルヒドラジド結合の安定性は、アシルヒドラジドに隣接するアミノ酸を変えることによりある程度まで調節することができた。ペプチドIMP 126は、IMP−140よりもLL2 F(ab')2へのより安定した（まだ不安定ではあるが）結合を形成した。すなわち、おそらくアスパラギン酸残基が、標識ペプチドの解離を触媒したものである。
【００２１】
例えば、酸化された炭水化物といったカルボニル官能基との反応についてアシルヒドラジドよりも、ヒドラジン(例えば、IMP 155)を使用することにより、タンパク質へのペプチドの結合を安定化させることが、可能である。一夜in vitroにてインキュベーション後、標識ペプチドに関しては検出可能な喪失はなかった。
【００２２】
IMP 155 H2NHN−CH2−CO−D−Asp-D-Lys(TscG−Cys−)−D−Asp−D−Lys−NH2 驚くべきことに、遊離チオール含有ペプチドは、ヒンジ領域ジスルフィドのを有意に還元することもなく接合あるいは結合することができた。
【００２３】
一貫したペプチドローディングが、その接合体に使用されるペプチド／抗体比（100:1、50:1、10:1）の範囲にわたって観察された（約3.8〜4.3ペプチド／LL2 F(ab')2断片）。
【００２４】
抗体接合体は単一バイアルキットのなかに製剤化されて入れられ、また室温でTc −99mにより標識された。
【００２５】
Tc−99m標識接合体は、酸化炭水化物に付着されるペプチド上に部位特異的に標識された。これは、酸化ステップの間、過ヨウ素酸が加えられなかった以外は、LL2 F(ab')2は接合体のためのプロセスをすべて通過されられた対照実験において当初に示された。対照はTc−99mグルコヘプトン酸塩により処置され、またたった6％のTc −99m標識タンパク質のみが形成されたことがITLCにより測定されたが、一方、同じ条件下でIMP 155−LL2 F(ab')a標識されたものは、標識抗体断片のかなりの分量を産生した（70〜80％）。Tc−99mが、ペプチドに付着したというそのほかの証拠は、IMP 155のように、同じTc−99mリガンドを使用した標識化アシルヒドラジドペプチドは、粒径排除および逆相HPLC分析により示されているように、Tc−99m標識ペプチドとしてそのタンパク質から解離した活性を有していた。 ペプチドが酸化炭水化物に付着する証拠は、過ヨウ素酸酸化LL2 F(ab')2との接合体が遊離チオール（UVにより測定された2〜3チオール／LL2 F(ab')2）を含有するタンパク質を産生し、また非酸化抗体との接合体が遊離チオールをまったく含有しないタンパク質を産生することである。
【００２６】
Tc−99m標識IMP 155−LL2 F (ab')2接合体はin vitroおよびin vivoにて安定していた。
【００２７】
Tc−99m標識抗体は、ラモス腫瘍を有するマウスにおいて24時間で腫瘍標的化を示した（以下の例3と4を参照）。二価抗体断片は、ヨウ素酸化LL2− F(ab')2あるいはTc−99m−Fab'よりもその腫瘍に対して高い投与量を送達した。
【００２８】
前述の実験結果から、本方法は、抗体あるいは抗体断片の酸化炭水化物部分に対して部位特異的に安定した結合で、チオールリガンド担体ペプチドの導入を可能にしていることが示されている。本方法は、いずれのアルデヒドあるいはケトン含有タンパク質、ポリペプチド、ペプチドに適用することができる。従来の諸方法は、遊離チオールを産生するために、後になって脱保護されなければならない保護チオールを導入している。これらのリンカーはしばしば、不安定な結合であることがわかったアシルヒドラジドにより酸化炭水化物基に付着する。本方法により産生されたこの遊離チオール接合体は、薬剤、抗体、抗体断片、タンパク質、糖タンパク質、DNA、RNA、PNA、金属錯体、放射標識種（画像および治療）、酵素、毒素、また糖類などのほかの部分に対して接合体を形成するのに使用することができる。
【００２９】
こうした断片が存在する炭水化物は、チオール結合放射性金属により後に放射標識することができるチオール含有キレート剤などのハプテンを付着させるのに使用することができる。近接のジオールを含有した炭水化物、過ヨウ素酸などの薬剤によりアルデヒドおよびケトン機能を産生するために酸化することができ、またチオール含有、ヒドラジン含有ハプテンと混合され、一般的には、接合体を実現するために、HS−Q−NHNH2として表わされる。任意選択的に、タンパク質炭水化物に対してそのハプテンを結合させる形成ヒドラゾンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合を危険に曝すことなく、チオール−ハプテン接合体を産生するよう、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤により還元することができる。
【００３０】
チオール含有ヒドラジン含有部分HS−Q−NHNH2は、構造に関しては広範な範囲を有する。基であるQには以下のものが含まれる。すなわち、直鎖あるいは分岐鎖C2-30アルキレン基を含むアルキレン基、C5-8シクロアルキレイン基、C6-30縮合あるいは結合アリール基、任意選択的に、フェニレン、ナフチレン、フリレン、ベンゾフリレン、ピリジレン、プリニレン、ピペリジレンなどに限定されることはないが、それらを含む芳香環の1つあるいはそれ以上における1つから8つのヘテロ原子から組み込まれる。長さ1〜20個のアミノ酸あるいはアミノ酸類似体のペプチドおよび／またはペプチジル類似体、好適にはそこでは1個あるいはそれ以上のアミノ酸はシステインであり、そのチオール官能基および末端セリンあるいはスレオニンに関しては、酸化されてアルデヒドになり、ヒドラジンと反応し、またヒドラジニル置換基を形成するために還元される。前述の構造成分の組み合わせもまた、基Qを構築するのに使用することができる。さらに、前述の成分は、ハロゲン、ヒドロキシルあるいはアルコキシル基に限定されるわけではないが、それらを含み、保護されたヒドロキシル基、カルボキシル基、およびカルボキシルエステル基、アルキル基、シアノ基、第一級、第二級、第三級アミノ基を含み、保護されたアミノ基、アミド、ウレタン、尿素、ニトロ基などを含む、接合反応に干渉しない1個あるいはそれ以上の置換基を有している。本出願で開示されているペプチドは、この目的に適しているペプチドの例である。
【００３１】
Qにより示される構造は、従来の方法により容易に合成することができる。多くの脂肪族および芳香族の単一、複数あるいは縮合環化合物は市販されていて入手が可能であり、さらなる緻密な構造に適当あるいは適応可能な置換基を備えている。1個あるいは2個のカルボニル成分を有する環化合物では、例えば、アルデヒド、ケトン、カルボキシル酸あるいはエステル、およびアミドを試薬カタログのなかに見出すことができる。ヒドロキシル、ハロアルキル基、ヒドロキシル、アミン、シアノ基、イソシアノ酸エステルなどといったほかの置換基は、さらなる緻密な構造のための操作に関して、そういったものあるいは形質転換されたものとして、使用することができる。グリコキシルエステル、糖誘導体、α-ハロアシル化合物、例えば、α-ブロモアセチルエステル、酸塩化物などの小さなリンカーシントンは、ヒドラジンとの反応のために遊離あるいはマスクされたカルボニル基を導入するのに有用であり、HS −Q−NHNH2のヒドラジン官能基を産生するために例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元が後に続くが、あるいは硫化物ナトリウムあるいはHS−Q−NHNH2のチオール機能を産生するためヒドロ硫化物との反応のためにアルキルハロゲン化物基を導入するのに有用である。ペプチドは、システインを組み込むことによりチオール官能基を導入することができる。
【００３２】
発生期アルデヒドとケトン残基を、分子生物学の標準的な方法を使用して、標的ベクターのなかに導入する方法もまた使用することが可能である。例えば、ポリペプチドは、N末端セリンあるいはスレオニン部分により構築することができ、それはその後に、N末端カルボニル基を生成するために、特異的に酸化される。こうした誘導体はその後に、チオール含有ハプテンの付着のための特定の化学的「結合部位」（chemical "handle")を構成する。
【００３３】
IMP 155などといった好適なリガンドを有するペプチドは、ヒドラジン、いくつかの親水性D−アミノ酸および金属結合リガンドを含有しているため、有利である。ヒドラジンは、グリコシル化抗体あるいは抗体断片上の炭水化物の酸化部分上にアルデヒドあるいはケトンへのヒドラジン結合を形成するのに使用される。そのリガンドは、診断用画像同位元素Tc−99mにより安定したTc(V)オキソ錯体を形成する。いずれかの理論に束縛されることを善しとはしないが、ジスルフィド交換あるいは混合ジスルフィド形成が、抗体に対する遊離チオール含有ペプチドの接合時には最小化されるよう、親水性アミノ酸がペプチドを十分に親水性にすると見受けられる。そのペプチドの親水性の性質は、それが加えられるときに、Tc−99mと反応できるタンパク質の表面で接合されるペプチドを維持しておくべきである。1つの好適な実施態様では、D−アミノ酸は、注射後金属錯体ペプチドの代謝を最小にするのに使用される。そのペプチドは親水性であり、細胞を逃れるいずれかの標識ペプチドは急速に腎から***されるので、タンパク質が分解される場合には、親水性金属含有ペプチドが代謝されないよう、D−アミノ酸注射が実施される。
【００３４】
［実施例］
以下の例は、本発明の方法と組成を説明するものであるが、しかし、制限するものではない。当業者であれば、多くのほかのペプチド、抗体断片、およびリガンドが、そうした説明されたものの代わりに使用してもよく、それでも依然として本発明の範囲内にあることは理解されることであろう。
【００３５】
[例１：標識F(ab')2の調整]
N α− Boc − N β− Boc −ヒドラジン酢酸
500 mL Parrボトルが、グリオキシル酸一水和物18.00 g (1.96 x 10-1モル)、t-ブチルカルバゼイト25.84 g (1.95 x 10-1モル)（butylcarbazate）、10%の炭素上のパラジウム0.72 g、メタノール100 mL、ジオキサン50 mLで飽和させ、またその後に、水素雰囲気下で(50 PSI:50pounds per square:3.4×105Pa)、Parr水素添加装置上に置かれた。反応混合液は室温で振とうさせ、50 PSI（3.4×105Pa)での圧力を維持するため、水素圧力は数回補正された。反応が進むにつれて、沈殿物が形成された。反応は、3時間後に停止され、またメタノールの追加の100 mLが、その後に50 PSI水素圧力下に置かれ、21時間振とうされた混合液に加えられた。Parrボトルの内容物はメタノール400 mLのなかで溶解され、またセライトによりろ過された。濾液は、白い固形産物の36.4 g (98.1%)を産出するため、真空下で濃縮された。この粗産物14 g (7.37 x 10-1モル)は、ジオキサン130 mLと1 M NaOH80 mLを含有する溶液のなかで溶解され、また氷槽のなかで冷却された。ジ−t−ブチルジカルボン酸、17.76 g (8.14 x 10-1モル、110 M%)が加えられ、またその溶液は室温までゆっくりと温め、また18時間かき混ぜられた。反応物は減圧下でロータリーエバポレーター上で濃縮され、1Mクエン酸150 mLで混合された。混合液はその後にエチル酢酸の2 x 150 mLずつにより抽出された。有機抽出物が組み合わされて、飽和塩化ナトリウム溶液100 mLで洗浄され、硫酸ナトリウム上で乾燥され、減圧下で、ゆっくりと結晶化される油として、その産物の21.0 g (98%)を得るため、ろ過され、また濃縮された。
【００３６】
ペプチド合成
ペプチドIMP 155(H2NHN−CH2−CO−D−Asp-D-Lys(TscG−Cys−)−D−Asp−D−Lys−NH2)が、Advanced ChemTech 348マルチプルペプチドシンセサイザー上のFmocをベースとする固相合成法により合成された。ペプチドは、0.05 mmol / ウェルスケール（４８ウェル合成ブロック）上のRinkアミド樹脂を使用して合成された。反復結合プロセスは次のとおりである。すなわち、Fmoc切断である。
【００３７】
樹脂はDMF中の25％ピペリジンの1.5 mLで、4分間渦巻き状に混合される。ブロックはその後に排水され、またその樹脂はDMF中の25％ピペリジンの1.5 mLで、15分間渦巻き状に混合される。
【００３８】
Fmoc 切断後洗浄
その樹脂はNMP、イソプロパノール、NMP、イソプロパノール、および4回のNMPの1.5 mLずつによって洗浄された。樹脂はその液体が排水される前に、すくなくとも1分間は洗浄溶液のそれぞれにより渦巻き状に混合された。
【００３９】
結合
保護されたアミノ酸は0.5 M HOBtを含むNMP(0.5 M)のなかで溶解される。システム液であるNMP(300μL)がその樹脂に加えられ、その後に、ジイソプロピルカルボジイミド溶液（600μL、NMP中に0.5M樹脂に対して6等量）混合物は室温にて渦巻き状に1時間混合され、またその後に上述のように洗浄された。全プロセスが各アミノ酸の付加に対して反復される。
【００４０】
IMP 155
【化１】
【００４１】
LL2 F(ab') 2 の過ヨウ素酸酸化
マウスLL2 F(ab')2 (4 mg / mL)の炭水化物部分は、pH 5.3で暗所にて1時間、0℃で15 mM NaIO4により酸化された。グリセロール／水溶液（1:1）がその後に加えられ（2.5 mL抗体溶液に対して50μL）、またその溶液が暗所にて0℃で15分間インキュベートされた。酸化抗体はその後に、pH 5.3の酢酸緩衝生理食塩水（ABS、50mM酢酸）にてSephadex G50−80ゲルスピンカラムにより精製された。
【００４２】
接合条件
ぺプチド、IMP 155は、隔壁密封真空バイアル中の適当なペプチド量に抗体溶液を加えることにより、室温にて2時間、酢酸緩衝生理食塩水のなかで、pH 5.3で、100：1というペプチド／抗体モル比で、過ヨウ素酸酸化LL2 F(ab')2断片（4 mg / mL、LL2 F(ab')2）に接合された。接合体抗体断片は、接合時の終わりに結合していない過剰ペプチドを取り除くために、Sephadex G 50-80ゲルスピンカラム（pH 5.3 ABS）により2回精製された。MALDI質量分析による接合体の分析からは、平均4つのペプチドが抗体断片毎に接合されたことが示された。
【００４３】
サンプル MALDI データ MH+
LL2 F(ab')2 103514
酸化LL2 F(ab')2 103168
IMP 155−LL2 F(ab')2接合体 106240
【００４４】
キット製剤化に使用される溶液
α D −グルコヘプトン酸ナトリウム／酢酸緩衝液：
緩衝液は、α−D−グルコヘプトン酸ナトリウム塩200 mMと酢酸ナトリウム塩21 mMをpH 5.3で含有する溶液を作ることにより作成された。この溶液は、キット形成に使用される100 / 10.5 mM (グルコヘプトン酸／酢酸)溶液となるよう、部分は水で希釈された。
SnCl 2 :
バルクSnCl2溶液が、200 mg / mLという濃度で、6 M HClで、スズ金属を溶解することにより作成された。第一スズ200 mg / mLの分割量をグルコヘプトン酸緩衝液で100倍に希釈することにより第一スズ溶液2 mg / mL作成された。
ショ糖溶液：
1 Mショ糖溶液がキット付加用に作成された。
【００４５】
キット製剤化
精製接合体溶液は、pH 7.3、0.1 Mリン酸緩衝Sephadex G 50−80ゲルスピンカラム(A mg / mL LL2 F (ab')2を通された。接合体1 mg(250μL)は、SnCl2 (6.25μL) 12.5μg、α−D−グルコヘプトン酸ナトリウム塩（グルコヘプトン酸緩衝液11.7μL＋第一スズ溶液のなかのその緩衝液）446μg、それにショ糖（55.6μL）19 mgを加えた総体積およそ0.3 mLと混合された。その混合物は即座に凍結され、凍結乾燥され、また真空下で隔壁密封された。
【００４６】
キット標識条件
キットの含量は生理食塩水0.4 mLで溶解され、またその溶液は、生理食塩水（0.4 mL）のなかでNa99m−TcO4を加える前に、5分間そのままにしておかれた。Bio-Sil粒径排除カラムについてのHPLC分析は、その活性のものの96％がタンパク質に付着しており、また活性のものの4％が小さな分子重量物質として存在していたことを示していた。
【００４７】
[例２：BALB/cマウスにおけるTc−99m標識IMP 155−LL2 F (ab')2接合体、生体分布および血清分析in vivo安定性]
【００４８】
Tc − 99m 標識および精製
LL2−F (ab')2接合体はTc−99mグルコヘプトン酸塩と交換することにより、室温にて次のように標識された。すなわち、GlucoscanTM (DuPont)グルコヘプトン酸塩標識キットが、2 mL中の30 mCi Tc− 99mで標識された。Tc−99m グルコヘプトン酸塩0.6 mLが、例1に記載されているIMP 155−LL2−F(ab')2接合体キットバイアル（1 mg接合体とショ糖を含有）に加えられた。そのバイアルは30分間室温でインキュベートされた。標識された物質は、その後に続けて2回、 3 mL Sephadex G 50 − 80スピンカラム（pH 7.3、0.1 M PBS）により精製された。産物は、生理食塩水で希釈されて、5 mCi / mLにして空の滅菌バイアルのなかに入れられた。
【００４９】
生体分布研究
9匹のBALB/cマウスが精製されたTc−99m−LL2 F(ab')2接合体の100μL(500μCi)を注射された。動物は、1時間、4時間、24時間の各時点につき3匹の動物が麻酔され、また犠牲にされた。分析用の血清もまた1時間、4時間、24時間で回収された。血清サンプルは分離後に凍結され、また粒径排除HPLCカラム上でのHPLC分析（Bio−Sil SEC 250、粒径排除HPLCカラム、300 mm x 7.8 mm）の少し前に解凍された。以下の組織と器官が回収されまた計測された。すなわち、血液、肝臓、腎臓、脾臓、肺臓、胃、小腸、大腸、筋肉、尿である。
【００５０】
血清サンプルのHPLC分析では、血清における活性がすべての時点で、主としてTc−99m−IMP 155−LL2 F(ab')2にあった。
【００５１】
【表１】
【００５２】
[例３：ラモス腫瘍を有するヌードマウスにおけるTc−99m−IMP 155−LL2 F(ab')2とI−125標識LL2 F(ab')2の比較]
【００５３】
Tc − 99m 標識
IMP 155−LL2-F(ab')2キットは、生理食塩水0.3 mLのなかで5 mCi 99m−TcO4 - により標識された。キットは室温で30分間インキュベートされ、その後に生理食塩水により0.75 mLに希釈され、また、2回続けてpH 5.3の酢酸緩衝生理食塩水3 mLでSephadex G 50−80スピンカラムにより精製された。
【００５４】
I − 125 標識
抗体断片LL2−F(ab')2の23.3μL(5.15 mg / mL)が0.5 M、pH 7.5リン酸緩衝液50μLと混合され、また2.5 mCi I−125を含有するバイアルに加えられた。クロラミン−Tの溶液、12μL（PBS2 mL中に0.0034 g）が加えられ、また、それがメタ重亜硫酸塩ナトリウムの溶液20μL (10 mL中に0.0254 g)によって反応を止める前に、室温にて3分間その反応が進むことが許容された。
【００５５】
混合標識
I−125 LL2−F(ab')2が、3 mLのなかに1.6 mCiを含有した溶液のなかに入れられた。I−125 LL2−F(ab')2と、Tc−99m LL2 F(ab')2が、25 μCi Tc−99mに対して5μCi I−125の比率で混合された。最終的な混合溶液は、2.0 mLの溶液のなかに、220 μCi I−125 LL2−F(ab')2 と1.04 mCi Tc−99m IMP 155−LL2−F(ab')2を含有するものとなった。
【００５６】
生体分布
同様のサイズの腫瘍を有する5匹のラモス腫瘍を有するヌードマウスの1群が時点毎に使用された。各動物は、予め混合された溶液（5μCi I−125および25μCi Tc−99m）50μLを注射された。動物は1時間、4時間、24時間の時点で、麻酔され、また頚部脱臼により犠牲にされた。以下の組織と器官が回収され、また計測された。すなわち、腫瘍、血液、筋肉、肝臓、腎臓、脾臓、胃である。
【００５７】
【表２】
【００５８】
【表３】
【００５９】
[例４：Tc−99m LL2−Fab'とTc−99m IMP 155−LL2−F(ab')2との比較]
【００６０】
IMP 155 − LL2 − F(ab') 2 接合体の Tc − 99m 標識
IMP 155−LL2−F(ab')2キットは、生理食塩水0.3 mLのなかで5 mCi 99m−TcO4 -により標識された。キットは室温で30分間インキュベートされ、その後に生理食塩水により0.75 mLに希釈され、また、2回続けてpH 5.3の酢酸緩衝生理食塩水3 mLで、Sephadex G 50−80スピンカラムにより精製された。サンプルを生理食塩水で500μCi / mLに希釈した。
【００６１】
Tc − 99m LL2 − Fab' 標識：
LL2−Fab'キット（LymphoscanTM − Immunomedics社、Morris Plains市, ニュージャージー州）が、凍結乾燥キットに加えて、0.1 mLの5 mCi Tc−99mにより室温で放射標識された。分割量（1.55 mCi）50μLが取り除かれ、また生理食塩水により3 mL(500μCi / mL)に希釈された。
【００６２】
生体分布
同様のサイズの腫瘍を有する5匹のラモス腫瘍を有するヌードマウスの1群が時点毎に使用された。各動物は、標識抗体断片（25μCi Tc−99m）50μLを注射された。動物は4時間、24時間の時点で、麻酔され、また頚部脱臼により犠牲にされた。以下の組織と器官が回収され、また計測された。すなわち、腫瘍、血液、筋肉、肝臓、腎臓、脾臓、胃である。腫瘍対正常臓器の比率を各臓器で挙げている。
【００６３】
Tc − 99m LL2 − Fab' と Tc − 99m − IMP 155 − LL2 − F(ab') 2 接合体の比較
【表４】
【００６４】
【表５】
【００６５】
[例５：In vitroでの安定性研究]
Tc−99m標識接合体の安定性が、Tc−99m−グルコヘプトン酸塩で交換することにより、その接合体を標識することによりスクリーニングされ、その後に非結合小さな分子量Tc−99m種のすべてを取り除いて2回続けてSephadex G 50−80 ゲルカラムにより標識タンパク質の精製が行われた。精製された物質はその後にITLC(0.1 M クエン酸、pH 5)、粒径排除HPLCおよび逆相HPLCによりにより分析された。
【００６６】
異なる接合体の安定性が、24時間にわたって室温での粒径排除緩衝液あるいは標識緩衝液でのインキュベーションにより、1 mMのシステインで24時間にわたって37℃にて対抗量により、また24時間にわたって37℃にて血清中でインキュベートすることにより、評価された。
【００６７】
分析方法
ITLC ：
ITLCストリップは標識溶液の分割量（0.2μCi）により斑点がつけられ、pH 5の0.1 Mクエン酸緩衝液により溶出された。標識タンパク質は、元のままで残るが、99m−TcO4‐ とTc−99m−グルコヘプトン酸塩は溶出されそのストリップまで上がる。
【００６８】
粒径排除 HPLC ：
Bio−Rad Bio−Sil SEC 250、粒径排除HPLCカラム（300 mm x 7.8 mm）はpH 6.8で、0.02％アジ化ナトリウムを含有する0.2 Mリン酸緩衝液を1 mL / 分で溶出された。
【００６９】
【表６】
【００７０】
逆相 HPLC:
逆相HPLCは、Waters Radial−Pak、C−18、Nova −Pak（4μ、100 x 8 mm）カラム上で実施された。カラムは2つの緩衝液を使用して勾配をつけて溶出された（緩衝液A、0.1%分割量TFA; 緩衝液B 90%アセトニトリル、10%水、0.1%TFA）。
【００７１】
勾配は次のようであった。すなわち、流速3 mL/分100%緩衝液Aから、100%緩衝液Bを10分間にわたって、流速5 mL /分。逆相HPLC法はTc − 99m 標識小さな分子量種の性質を同定するのに有用であった。安定した、Tc − 99m標識タンパク質は、逆相HPLC上ではうまく溶出しなかった。
【００７２】
【表７】
【００７３】
Tc − 99m − IMP 126 − LL2 − F(ab') 2
標識されたIMP 155−LL2−F(ab')2に類似させて作成された粗い標識タンパク質は、pH 7.3の0.1 Mリン酸緩衝液でSephadex G 50−80 ゲルカラム上で精製された。1分割量が除去され、また生理食塩水で5倍に希釈された。生理食塩水は37℃で1時間インキュベートされた。粒径排除HPLC分析では、活性のおよそ5％が1時間後にはそのタンパク質から解離した。
【００７４】
37℃にてPH 7.3で、1 mMシステインを含有する0.1 Mリン酸緩衝液でのTc−99m−IMP 126−LL2−F(ab')2の1.5時間のインキュベーションの結果は、標識タンパク質の31％が減少してTc−99m−IMP 126−Fab'断片になった。Tc−99m−IMP 126−LL2−F(ab')2の56%がそのまま残り、また活性の12％が、Tc−99mシステインなどの低分子量種に変換された。
【００７５】
37℃での新鮮ヒト血清の中で10倍に希釈されたTc−99m−IMP 126−LL2−F(ab')2の21時間のインキュベーションの結果は、活性の34％が低分子量種として喪失した。活性のほぼ同じパーセンテージ（20％）の3つのTc−99m標識タンパク質が存在した。ピークは凝集体、Tc−99m−IMP 126−LL2−F(ab')2、Tc−99m−IMP 126−LL2−Fab'によるものであると考えられる。
【００７６】
Tc − 99m − IMP 140 − LL2 − F(ab') 2
標識IMP 155−LL2−F(ab')2に類似させて作成された標識ペプチドは精製され、また一夜pH 7.3で0.1 Mリン酸緩衝液のなかに貯蔵された。粒径排除HPLC分析では、活性のおよそ30％が24時間後にそのタンパク質から解離したことが示された。逆相HPLC分析では、小さな分子量種を標識したTc−99mのバルクはそのタンパク質を加水分解したTc−99m 標識ペプチドとして存在した。その抗体に対するアシルヒドラゾン結合は不安定であったというのが結論であった。
【００７７】
Tc − 99m − IMP 155 − LL2 − F(ab') 2
標識ペプチドは精製され、また一夜pH 7.3で0.1 Mリン酸緩衝液のなかに貯蔵された。粒径排除HPLC分析では、5％未満が室温にて24時間後に小さな分子量種に分解したことが示された。
【００７８】
1.5時間37℃にてpH 7.3で、1 mMシステインを含有する0.1 Mリン酸緩衝液でのTc−99m−IMP 155−LL2−F(ab')2のインキュベーションの結果は、標識タンパク質のバルク（61.5％）が減少してTc−99m−IMP 155−Fab'断片になった。Tc−99m−IMP 155−LL2−F(ab')2の8%がそのまま残り、また活性の30％が、Tc−99mシステインなどの低分子量種に変換された。
【００７９】
21時間37℃で新鮮ヒト血清の中で10倍に希釈されたTc−99m−IMP 155−LL2−F(ab')2をインキュベーションした結果、活性の10％が低分子量種として喪失した。活性のほぼ同じパーセンテージ（20％）の3つのTc − 99m標識タンパク質が存在した。ピークは凝集体（38％）、Tc−99m−IMP 155−LL2−F(ab')2(42％)、Tc−99m−IMP 155−LL2−Fab'（9％）によるものであると考えられる。凝集体形成は、酸素に対する曝露によって起こったジスルフィド形成による人為的現象である。
【００８０】
[例６：凝集体形成]
接合体のためのプロセスの間に形成されるある種のタンパク質の凝集体（2〜10％）はUVに存在する高い分子量ピークにより示される粒径排除HPLCにより分析されるときのタンパク質のTc−99m標識である。凝集体は、もう1つの接合体のチオールとの1つの接合体であるペプチド接合体の間にあるジスルフィド形成によるものであると考えられる。その凝集体は過剰システインによる処置で姿を消した。ある種の凝集体形成はin vitroでの安定性研究時に血清の中で観察されている。これはまた、ジスルフィド形成によるものであると考えられる。新鮮血清では、熟成血清よりも凝集体がより少ないことが示されており、また血清へのシステインの付加は形成される凝集体の量を大幅に減らした。In vivoの血清サンプルでは、ある種の凝集体形成が示されたが、しかし、活性のバルクはTc−99m−IMP 155−LL2−F(ab')2として存在した。
【００８１】
[例７：酸化LL2−F(ab')2上のペプチドローディング]
IMP 155の接合は上述のように実施され、また抗体濃縮は280 nmで分割量のUV吸収量により測定された。チオール含量はエルマンの測定法を使用して測定され、分割量でのチオール濃度は、抗体上でのチオールローディングを得るためにUVにより測定される抗体含量に相関していた。UV測定方法は、そのタンパク質含量を求めるのに使用された波長での有意な吸収率をそのペプチドが有しており、したがってそのタンパク質含量に関して人工的な高度な数値を与えるため、不正確であったことが後になって判明した。その分析はその後に、そのタンパク質へ付着したペプチドの数を正確に求めるために、マトリックス補助レーザー脱着電離（MALDI）質量分析に切り換えた。以下の表中のその結果では、ペプチドローディングは、接合時に使用された抗体に対するペプチドの比率の範囲全体にわたって一致をみた。上述された酸化と接合条件を使用した場合、そこにローディングされて加えられたのは平均で抗体当り4個のペプチドであった。
【００８２】
【表８】
【００８３】
【表９】
【００８４】
[例８：対照実験]
接合体対照
接合体対照実験が、タンパク質チオールを生成するように抗体上のジスルフィドとペプチドを含有する遊離チオールが反応するかどうか、あるいはそのペプチドが、酸化炭水化物に対してよりも何らかの手段によりその抗体に付着するかどうかを判定するために実施された。この実験では、非酸化LL2−F(ab')2は、多くの過ヨウ素酸酸化LL2−F(ab')2と同時に、50倍過剰IMP 155で処理された。過ヨウ素酸酸化LL2−F(ab')2は、UV（MALDIでは4.3ペプチド／抗体）により求められるものとして、2.3チオール／抗体を含有する接合体を形成し、また、その非酸化LL2−F(ab')2はUVにより求められるものとして0.2チオール／抗体を含有していた。この実験では、過ヨウ素酸酸化はその抗体にそのペプチドを加えるために必要であったことが示され、チオールがペプチド上に存在し、またジスルフィド置換の産物ではなかったことが示された。
【００８５】
Tc − 99m 標識対照
対照実験は、LL2−F(ab')2の処理単位は過ヨウ素酸で処理され、また、10 mg / mLのシアノ水素化ホウ素ナトリウムが接合の2時間後に加えられ、またその接合体は生成前さらに2時間の間続けられたこと以外は、ペプチドIMP 140の100倍過剰で、上述のように接合された。そのLL2−F(ab')2は、酸化対照には過ヨウ素酸が存在していなかったことを除けば、同じ処理を受けた。その2つの抗体作成は、Tc−99mグルコヘプトン酸塩により交換されることにより標識された。接合前に過ヨウ素酸により処理された部分は、0.1 M、pH 5のクエン酸緩衝液の中で、ITLCにより示された60％標識収量を産生し、また非酸化対照では、Tc−99mの6％がそのタンパク質に結合されたことがITLCにより示された。
【００８６】
さらに、2つの金属結合リガンドを含有するペプチドIMP 171は、IMP−155に関して述べられているのと同じプロセスを使用して、LL2−F(ab')2に接合された。チオールの増加数がLL2−Fab'に対するLL2−F(ab')2の減少を引き起こす可能性があったため、このペプチドに関しては50：1あるいはそれ以下という抗体に対するペプチドの比率を使用することが必要であった。この反応は、酸化抗体に関するのと同じ処理単位で実施されたIMP 171−LL2 F(ab')2接合体（2.3チオール／抗体）に比較してチオールの数（5.3チオール／抗体）の2倍を有する1つの接合体、IMP 155−LL2−F(ab')2を産生した。
IMP−171 H2NHN−CH2CO−D−Asp−D−Lys(TscG−Cys−)−D−Asp−D−Lys−D−Lys
(TscG−Cys−)−D−Asp−D−Lys−NH2 MH+1412
【００８７】
[例９：レニウム標識]
Re − 188 に関して還元に先立つ手順を使用するレニウム標識
これらの接合体は、レニウム同位元素（主にRe−186およびRe−188）により標識される場合もあり、その場合には放射線免疫療法に有用である。過レニウム酸塩の還元には、テクネチウムの還元に関して必要であるよりもさらに多くのスズイオンが必要となる（典型的には上記の200μg / mL最終濃度）、第一スズイオンの高い値がF(ab')2断片のヒンジ領域に存在するようなため、感受性の高いジスルフィド結合を還元しないことを確実なものとするには、余分に注意することが必要である。レニウムによる放射標識時には、ジスルフィド結合還元、あるいは抗体断片接合体と混合する前に、過レニウム酸塩レニウムが還元されるのを予防するために、MAbおよびSn（II）の間の接触時間が時間的には制限されること以外はTc−99mで使用されたのと同様の手順が使用される。基質を含有するチオールリガンドの水溶液が、Lisicらの方法によりCH2Cl2のなかの188ReOCl3 (PPh3)2とその後に混合された。CH2Cl2は、その後に窒素流れの下で除去され、また2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（HPCD）の10％水溶液の0.1 mLのなかで溶解された。そのHPCD溶液はその後に、30分間室温にてインキュベートされるIMP−155−LL2 F(ab')2 (4 mg / mL)の溶液の0.5 mLと混合される。
【００８８】
[例１０：テクネチウム標識]
チオール含有オクトレオチドの Tc − 99m 標識
IMP 162 GDdDK (TscGC)Fd DFW d KTCTol MH+ 1667
ペプチドIMP 162 (0.0012 g)は、pH 5.29で10% HPCD、200mMグルコヘプトン酸塩、14 mM酢酸ナトリウム塩、12 mMアスコルビン酸を含有する水溶液の30 mLに溶解された。第一スズ溶液は、HPCDグルコヘプトン酸塩溶液の3.8 mLに、6 M HClのなかのSnCl2 200 mg / mLのうち0.2 mLを混合させることにより作成された。第一スズ／HPCD溶液の0.2 mL分割量が、ペプチド溶液に加えられ、またその溶液はその後に凍結乾燥バイアルのなかに1.5 mL分割量で0.22 μm Millex GVフィルターによりろ過された。そのバイアルは、その後、凍結され、凍結乾燥され、また真空下で密封された。
【００８９】
Tc − 99m キット標識
凍結乾燥されたキットは、1.5 mL生理食塩水のなかで20 mCi99mTcO4‐で再構成され、また10分間室温にてインキュベートされ、またその後に15分間沸騰した水槽のなかで加熱された。標識は完了し、定量分析された。
【００９０】
[例１１：薬剤接合体]
ジスルフィド含有ペプチドに対する化学療法薬剤の接合体
元のオクタペプチドに付着したN末端の付加セリン残基を有するオクトレチドの類似体が、N末端アルデヒドを生成するように、m−過ヨウ素酸ナトリウムを使用して酸化された。N末端ヒドラゾンに、セリン−オクトレオチド上に存在するすべてのアルデヒドを変換するのに十分なIMP−155ペプチドと、この中間体を反応させた。ヒドラゾンは、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用してアルキルヒドラジンに還元され、その中間体チオール付加IMP−155−ヒドラジニル−オクトレチドが精製され、後者の三硫化物基とのチオール交換を介して抗癌薬剤カリケアマイシン（calicheamicin）と結合された。生成物であるカリケアマイシン−オクトレオチドはジスルフィド−IMP 155−ペプチジル−ヒドラジンリンカーから構成される。
【００９１】
[例１２：薬剤接合体]
ジスルフィド結合含有するペプチド上のドキソルビシンの部位特異的置換
a)アルデヒド含有(scFv)2断片の作成
N末端セリンアミノ酸を有するヒト(scFv)2断片の溶液が、3 mg / mLで、4℃にて暗所で2時間、10 mMの過ヨウ素酸ナトリウムで処理される。グリセロールが過剰過ヨウ素酸塩を破壊するために20 mM最終濃度に加えられ、またその反応はさらに20分間攪拌される。N末端酸化(scFv)2は平衡化されたG−10− Sephadexのカラム上の低分子量汚染物から精製され、1 mMの EDTAを含有する、pH 5.5、アルゴン脱気0.1 M酢酸ナトリウムで実施される。生成物はさらなる反応の前に5 mg / mLに濃縮される。
【００９２】
b) チオール付加(scFv)2断片の作成
a)におけるように得られたN末端アルデヒド− (scFv)2中間体は、新たに作成された、20:1というモル過剰にあるp−(2−チオエチル)−フェニルヒドラジン（TEPH）のDMSO溶液で処理され、その反応は4℃にて2時間攪拌される。ヒドラゾン結合を含有するその生成物TEPH−(scFv)2は平衡化されたG−10−Sephadexのカラム上での精製により得られ、またpH 6.5で、1 mM EDTAを含有するアルゴン脱気0.1 M酢酸ナトリウムにおいて実施される。任意選択的に、精製の前に、炭酸ナトリウム少量を加えて、5.5から7.0に当初の反応混合物のpH調節を行った後、フェニルヒドラゾンが10 mM水素化ホウ素ナトリウムの存在下で2時間反応により、フェニルヒドラジン結合に還元される。scFvモノマーへの分解が無いことを確認するために、pH 6.5で0.5 Mリン酸ナトリウムで平衡化されたBio−Sil GF−125カラム上でSE−HPLCによりその産物TEPH−(scFv)2が分析された。その産物の分割量はまた、ビシンコニン酸（BCA）法によりタンパク質濃度に関して、またチオール含量に関してはエルマン反応により、別々に分析され、またしたがって、推論によりTEPH−(scFv)2のモル毎のチオール基数が測定される。
【００９３】
c) マレイン酸イミド−ドキソルビシンに対するドキソルビシンの活性化
pH 8.3で50% DMSO/0.1 Mホウ酸ナトリウム緩衝液の5 mLのなかの塩酸ドキソルビシン溶液（10 mM）を市販されていて入手可能なクロスリンカーm−マレイドベンゾイル−N−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（MBS、Pierce化学社、ロックフォード市イリノイ州）の2倍モル過剰量で処理する。その反応混合物は、5%塩化ナトリウム溶液で20 mLに希釈される前に、室温で3時間攪拌をしてよい。その混合物は、酢酸エチルなどの実質的に水不混和性である有機溶媒の3 x 20 mLにより抽出され、また、その組み合わせ有機抽出物がpH 8.0で3 x 20 mL 0.1 M炭酸水素ナトリウム（重曹）で洗浄される。その有機溶液は、マレイン酸イミド−ドキソルビシンを得るために、無水硫酸ナトリウム上で乾燥され、ろ過され、また蒸発される。
【００９４】
ｄ) TEPH−(scFv)2へのマレイン酸イミド−ドキソルビシンの結合
4℃にてpH 6.5で1 mM EDTAを含有するアルゴン脱気0.1 M酢酸ナトリウムのなかのTEPH−(scFv)2が、DMSO中15％作成され、DMSO中のマレイン酸イミド−ドキソルビシンの（チオール含量に対して） 2培のモル過剰で処理され、急速攪拌により一部分に加えられた。攪拌は4℃にて1時間続けられ、またドキソルビシン−(scFv)2が、pH 7.5で0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝の0.9%塩化ナトリウムで平衡化されたSephadex G−10 ゲルカラムにおけるカラムクロマトグラフィにより精製される。
【００９５】
本発明の精神と範囲から離れることなく、本出願において例証され、また説明された多くのほかの種に代わりうることは、当該技術分野に熟練した者には理解されることであろう。
［発明の背景］
＜発明の分野＞
本発明は、ジスルフィド結合を含有する疾患標的薬剤と、放射標識化標的薬剤と、これらの方法を使用して産生される薬剤接合体とにチオール含有リンカーを導入するための方法に関する。また、本発明は、診断用または治療用の放射標識化標的薬剤、あるいは薬剤を担体する標的薬剤の使用法に関する。
【０００２】
＜関連技術の説明＞
ハロアセテート、マレイン酸イミド、活性化スルホニル基などの反応基に対するチオール基の特異性のため、また、還元過テクネシウム酸塩や過レニウム酸塩などの還元金属種、それに亜鉛、銅、水銀、カドミウム、プラチナ、パラジウム、鉛、ビスマスなどのある種のチオ親和性金属に対するチオール基の特異性のため、遊離チオールは特定の標的薬剤に対して、さまざまな種を付着させることに関してユニークな化学的部位をもたらす。しかし、多くのタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドに関する面倒な問題としては、それらの構造保全には欠かせないジスルフィド結合の存在である。チオール基のその固有の反応性ゆえに、ジスルフィド混合物の形成の可能性と、標的抗原あるいは受容体にタンパク質、ポリペプチド、ペプチドが結合できなくなることを伴う、こうしたジスルフィド結合の破損につながる。
【０００３】
より小さな断片は、完全なIgGあるいはより大きなタンパク質よりも、より速く標的に接近し、またクリアする（除去される）ので、サブFab'断片、一本鎖抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ポリペプチドおよびペプチドに加えて、抗体断片は、放射線イメージング用および放射線治療用同位元素のin vivoでの標的化には有益である。例えば、放射標識抗体断片は、完全な(手を加えない）IgGよりも速く標的に対して治療用あるいはイメージング用同位元素の線量を送達し、またクリアランスが速いことにより、非標識組織に対する放射能線量を最小限にすることができる。急速な標的化はとくに、Tc−99m（t1/2＝6時間）あるいはRe−188（t1/2＝17時間）などの半減期が短い同位元素では重要である。TcおよびReの陽イオンはチオ含有リガンドには強力に結合するが、しかし、抗体あるいは抗体断片に対するこれらリガンドの接合体にはいくつか難しい問題が存在しうる。
【０００４】
F(ab')2断片のような二価抗体断片は、二価結合領域が抗原に対するタンパク質の親和性を増加させるため、Fab'断片に比べて標的としての総量（total targeting)が増加して然るべきである。F(ab')2断片は、チオール含有部分が複合するとき、その後の両方で遊離チオールによる還元に対しては感受性がある1つ以上のスルフィド結合により結合される2つのFab'断片から成っている。したがって、抗体上でのジスルフィドと、リガンド上の遊離チオールとの相互作用を最小限にするために、その後に、脱保護となる保護チオールを使用するか、あるいは低チオール濃度と親水性チオールを使用するかのいずれかによって、そのタンパク質に対してチオール含有リガンドを接合させることが必要である。
【０００５】
ターゲッティング剤上の非特定部位に対して結合まはた接合するときに起こる可能性があるもう1つの問題は、その結合（接合）が抗体の抗原結合領域あるいはペプチド／ポリペプチドの受容体結合領域に、あるいはその近くに結合されることがあり、それが抗体あるいはペプチドの抗体あるいは受容体に対する結合親和性を減少またはなくす可能性があることである。過ヨウ素酸により酸化された炭水化物部位（アルデヒドとケトン）に対するハプテンの接合は、部位特異的に接合体を形成する1つの方法である。炭水化物領域は、タンパク質あるいはペプチド上の特異的な部位のなかに遺伝子工学的に処理して入れることができ、したがって、例えば、その抗原に対する抗体断片の結合に干渉することがないF(ab')2断片上の部位に炭水化物を置くことが可能である。
【０００６】
ある種のIgGの軽鎖上にある炭水化物残基の存在が立証されている。こうした残基は、ペプシンあるいはパパイン消化作用の後に、それぞれF(ab')2およびF(ab)2上に残こる。このように、こうした残基は、ハプテン付着に関する、マスクされた潜在的で部位特異的な化学的結合部位を示す。さらに、ある種のマウス抗体が、同じ抗体のヒト化された相補性決定領域バージョン（humanized complementarity determining region version)を産生するように、遺伝子工学的に処理し直され、一方、同時に、抗体の抗原結合部位からは遠位の位置にあるグリコシル化部位が遺伝子工学的に処理されている。これにより、軽鎖あるいは重鎖上にあるCH1ドメインと可変領域の中のそのタンパク質内の所望された位置に炭水化物を挿入することが可能である。
【０００７】
放射標識の生体分布が抗体断片の生体分布を反映するように、in vitroおよびin vivoにて十分に安定している接合体も必要である。抗体に対する接合体の結合あるいは接合体への放射性同位元素の付着が不安定であれば、その場合には、その標的に到達する放射性同位元素の実質的な減少がみられることがある。そのタンパク質から分離する放射性同位元素は、バックグラウンド放射能に影響を与える可能性があり、それがさらにターゲッティングを困難にさせる。
【０００８】
放射線画像および放射線治療の用途のチオ親和性金属イオンによって、容易に放射能標識することができる、あるいは標的化された化学療法のための薬剤により置換することができるチオール含有ジスルフィド結合ターゲッティングベクターを作成する必要性が引き続き存在している。
【０００９】
［発明の概要］
本発明の1つの目的は、標的タンパク質のジスルフィド結合を切断することなく、チオール含有リガンドと、ジスルフィド含有標的タンパク質、ポリペプチド、およびペプチド、例えば、二価抗体断片および（sv）2とチオール含有リガンドとの接合体を提供することである。
【００１０】
本発明のもう1つの目的は、さらにある種の放射性同位元素あるいは化学療法薬剤を付着させる特異的化学的結合部位として、ジスルフィド含有タンパク質あるいはペプチドに付着させる置換チオール基を使用することである。
【００１１】
本発明のもう1つの目的は、in vitroとin vivoにて安定している放射標識タンパク質を提供することである。
【００１２】
さらにもう1つの目的は、疾患の放射線診断、放射線治療および化学療法用途に安定的に置換されたジスルフィド含有タンパク質、ポリペプチド、ペプチドを使用するための方法を提供することである。
【００１３】
これらとそのほかの目的は、その生物学的活性を維持するのに必要である少なくとも1つのジスルフィド結合を含有し、またヒドラゾンあるいはヒドラジン結合を介して、そこに結合される少なくとも1つのチオール含有部分を有するタンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドの診断あるいは治療目的の接合体を産生し、また、そのジスルフィド結合の実質的な切断をすることなく、そのタンパク質、ポリペプチド、ペプチドの安定した診断あるいは治療用途の接合体を形成するために、前もって形成するかあるいはその場（ｉｎ ｓｉｔｕ）で生成されるかのいずれかによって、そのタンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドを、チオール反応性の診断用あるいは治療用薬剤と接触させる方法を提供することにより達成される。
【００１４】
前述の方法においては、ヒドラゾンあるいはヒドラジン結合によりタンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドに結合されるチオール含有部分は、式HS−Q− NHNH2のチオール−ヒドラジンと、アルデヒドあるいはケトン基も含有するジスルフィド結合含有タンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドを反応させることにより結合されるが、その式では、Qは、アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、ペプチド、およびそれらを組み合わせたものを含むグループから選択された結合部分であり、また、任意選択的に、結果的に生じるヒドラゾンをヒドラジンに還元する。
【００１５】
接合体における診断用あるいは治療用薬剤は、チオール結合の陽イオン放射線同位元素であり、あるいはチオール結合リンカーを含む薬剤誘導体でありうる。
【００１６】
1つの好適な実施態様では、そのタンパク質は、その部分的に酸化されている炭水化物部分が、チオール含有部分に対してヒドラゾンあるいはヒドラジン結合により結合されるグリコシル化二価抗体の断片である。
【００１７】
前述の方法にしたがって放射標識に影響を与える予め成形された安定キットもまた提供される。
【００１８】
［詳細な説明］
本発明者らは、カルボニル官能基、例えば、タンパク質の過ヨウ素酸酸化炭水化物部分を介して、接合体あるいは標識過程の間のFab'へのF（ab'）2の還元などいった活性に関連した構造および／または高次構造を維持するジスルフィド結合を還元することなく、チオール含有ペプチドリンカーあるいはリガンドをジスルフィド含有タンパク質あるいはジスルフィド含有ペプチド、例えば、F(ab')2に接合あるいは結合させるための方法を開発した。ジスルフィド結合含有タンパク質へのリンカーあるいはリガンドの付着が安定していて、またリガンドへの放射標識、例えば、Tc−99mの付着がin vitroおよびin vivoにて安定している接合体が産生された。グリコシル化F（ab'）2断片の場合、Tc−99m標識ペプチドキレート剤の好適な具体例は、I−125標識F(ab')2あるいはTc−99m標識Fab'よりも、腫瘍に対して注射された供与薬物を高割合で送達した。
【００１９】
驚くべきことに、本発明者らは、酸化炭水化物部分により抗体に対する薬剤およびキレート核種分子の接合体に通常的に使用されるアシルヒドラジドがin vitroであっても非常に不安定であることを見出した。これは、Tc−99mの放射標識接合体IMP 126−LL2−F(ab')2とIMP 140−LL2− F(ab')2についての安定性実験で示された。LL2は、米国特許第5,789,554号に記載されている抗CD−22モノクローナル抗体(mab)である。
IMP 126 Ac−D−Lys (TscG−Cys−)−D−Asp−D−Ala−Gly−NHNH2
IMP 140 Ac−D−Asp−Lys (TscG−Cys−)−D−Asp−D−Lys−D−Asp−NHNH2
TscGは、H2NCSNHN = CHC (O)−チオセミカルバゾニルグリオキシルの略記である。
【００２０】
Tc−99m標識ペプチドは、時間をかけて溶液中に貯蓄されるときに、そのタンパク質から解離する。標識ペプチドのin vitroでの喪失は、粒径排除HPLC（高性能液体クロマトグラフィ）および逆相HPLCによりモニターされた。アシルヒドラジド結合の安定性は、アシルヒドラジドに隣接するアミノ酸を変えることによりある程度まで調節することができた。ペプチドIMP 126は、IMP−140よりもLL2 F(ab')2へのより安定した（まだ不安定ではあるが）結合を形成した。すなわち、おそらくアスパラギン酸残基が、標識ペプチドの解離を触媒したものである。
【００２１】
例えば、酸化された炭水化物といったカルボニル官能基との反応についてアシルヒドラジドよりも、ヒドラジン(例えば、IMP 155)を使用することにより、タンパク質へのペプチドの結合を安定化させることが、可能である。一夜in vitroにてインキュベーション後、標識ペプチドに関しては検出可能な喪失はなかった。
【００２２】
IMP 155 H2NHN−CH2−CO−D−Asp-D-Lys(TscG−Cys−)−D−Asp−D−Lys−NH2 驚くべきことに、遊離チオール含有ペプチドは、ヒンジ領域ジスルフィドのを有意に還元することもなく接合あるいは結合することができた。
【００２３】
一貫したペプチドローディングが、その接合体に使用されるペプチド／抗体比（100:1、50:1、10:1）の範囲にわたって観察された（約3.8〜4.3ペプチド／LL2 F(ab')2断片）。
【００２４】
抗体接合体は単一バイアルキットのなかに製剤化されて入れられ、また室温でTc −99mにより標識された。
【００２５】
Tc−99m標識接合体は、酸化炭水化物に付着されるペプチド上に部位特異的に標識された。これは、酸化ステップの間、過ヨウ素酸が加えられなかった以外は、LL2 F(ab')2は接合体のためのプロセスをすべて通過されられた対照実験において当初に示された。対照はTc−99mグルコヘプトン酸塩により処置され、またたった6％のTc −99m標識タンパク質のみが形成されたことがITLCにより測定されたが、一方、同じ条件下でIMP 155−LL2 F(ab')a標識されたものは、標識抗体断片のかなりの分量を産生した（70〜80％）。Tc−99mが、ペプチドに付着したというそのほかの証拠は、IMP 155のように、同じTc−99mリガンドを使用した標識化アシルヒドラジドペプチドは、粒径排除および逆相HPLC分析により示されているように、Tc−99m標識ペプチドとしてそのタンパク質から解離した活性を有していた。 ペプチドが酸化炭水化物に付着する証拠は、過ヨウ素酸酸化LL2 F(ab')2との接合体が遊離チオール（UVにより測定された2〜3チオール／LL2 F(ab')2）を含有するタンパク質を産生し、また非酸化抗体との接合体が遊離チオールをまったく含有しないタンパク質を産生することである。
【００２６】
Tc−99m標識IMP 155−LL2 F (ab')2接合体はin vitroおよびin vivoにて安定していた。
【００２７】
Tc−99m標識抗体は、ラモス腫瘍を有するマウスにおいて24時間で腫瘍標的化を示した（以下の例3と4を参照）。二価抗体断片は、ヨウ素酸化LL2− F(ab')2あるいはTc−99m−Fab'よりもその腫瘍に対して高い投与量を送達した。
【００２８】
前述の実験結果から、本方法は、抗体あるいは抗体断片の酸化炭水化物部分に対して部位特異的に安定した結合で、チオールリガンド担体ペプチドの導入を可能にしていることが示されている。本方法は、いずれのアルデヒドあるいはケトン含有タンパク質、ポリペプチド、ペプチドに適用することができる。従来の諸方法は、遊離チオールを産生するために、後になって脱保護されなければならない保護チオールを導入している。これらのリンカーはしばしば、不安定な結合であることがわかったアシルヒドラジドにより酸化炭水化物基に付着する。本方法により産生されたこの遊離チオール接合体は、薬剤、抗体、抗体断片、タンパク質、糖タンパク質、DNA、RNA、PNA、金属錯体、放射標識種（画像および治療）、酵素、毒素、また糖類などのほかの部分に対して接合体を形成するのに使用することができる。
【００２９】
こうした断片が存在する炭水化物は、チオール結合放射性金属により後に放射標識することができるチオール含有キレート剤などのハプテンを付着させるのに使用することができる。近接のジオールを含有した炭水化物、過ヨウ素酸などの薬剤によりアルデヒドおよびケトン機能を産生するために酸化することができ、またチオール含有、ヒドラジン含有ハプテンと混合され、一般的には、接合体を実現するために、HS−Q−NHNH2として表わされる。任意選択的に、タンパク質炭水化物に対してそのハプテンを結合させる形成ヒドラゾンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合を危険に曝すことなく、チオール−ハプテン接合体を産生するよう、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤により還元することができる。
【００３０】
チオール含有ヒドラジン含有部分HS−Q−NHNH2は、構造に関しては広範な範囲を有する。基であるQには以下のものが含まれる。すなわち、直鎖あるいは分岐鎖C2-30アルキレン基を含むアルキレン基、C5-8シクロアルキレイン基、C6-30縮合あるいは結合アリール基、任意選択的に、フェニレン、ナフチレン、フリレン、ベンゾフリレン、ピリジレン、プリニレン、ピペリジレンなどに限定されることはないが、それらを含む芳香環の1つあるいはそれ以上における1つから8つのヘテロ原子から組み込まれる。長さ1〜20個のアミノ酸あるいはアミノ酸類似体のペプチドおよび／またはペプチジル類似体、好適にはそこでは1個あるいはそれ以上のアミノ酸はシステインであり、そのチオール官能基および末端セリンあるいはスレオニンに関しては、酸化されてアルデヒドになり、ヒドラジンと反応し、またヒドラジニル置換基を形成するために還元される。前述の構造成分の組み合わせもまた、基Qを構築するのに使用することができる。さらに、前述の成分は、ハロゲン、ヒドロキシルあるいはアルコキシル基に限定されるわけではないが、それらを含み、保護されたヒドロキシル基、カルボキシル基、およびカルボキシルエステル基、アルキル基、シアノ基、第一級、第二級、第三級アミノ基を含み、保護されたアミノ基、アミド、ウレタン、尿素、ニトロ基などを含む、接合反応に干渉しない1個あるいはそれ以上の置換基を有している。本出願で開示されているペプチドは、この目的に適しているペプチドの例である。
【００３１】
Qにより示される構造は、従来の方法により容易に合成することができる。多くの脂肪族および芳香族の単一、複数あるいは縮合環化合物は市販されていて入手が可能であり、さらなる緻密な構造に適当あるいは適応可能な置換基を備えている。1個あるいは2個のカルボニル成分を有する環化合物では、例えば、アルデヒド、ケトン、カルボキシル酸あるいはエステル、およびアミドを試薬カタログのなかに見出すことができる。ヒドロキシル、ハロアルキル基、ヒドロキシル、アミン、シアノ基、イソシアノ酸エステルなどといったほかの置換基は、さらなる緻密な構造のための操作に関して、そういったものあるいは形質転換されたものとして、使用することができる。グリコキシルエステル、糖誘導体、α-ハロアシル化合物、例えば、α-ブロモアセチルエステル、酸塩化物などの小さなリンカーシントンは、ヒドラジンとの反応のために遊離あるいはマスクされたカルボニル基を導入するのに有用であり、HS −Q−NHNH2のヒドラジン官能基を産生するために例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元が後に続くが、あるいは硫化物ナトリウムあるいはHS−Q−NHNH2のチオール機能を産生するためヒドロ硫化物との反応のためにアルキルハロゲン化物基を導入するのに有用である。ペプチドは、システインを組み込むことによりチオール官能基を導入することができる。
【００３２】
発生期アルデヒドとケトン残基を、分子生物学の標準的な方法を使用して、標的ベクターのなかに導入する方法もまた使用することが可能である。例えば、ポリペプチドは、N末端セリンあるいはスレオニン部分により構築することができ、それはその後に、N末端カルボニル基を生成するために、特異的に酸化される。こうした誘導体はその後に、チオール含有ハプテンの付着のための特定の化学的「結合部位」（chemical "handle")を構成する。
【００３３】
IMP 155などといった好適なリガンドを有するペプチドは、ヒドラジン、いくつかの親水性D−アミノ酸および金属結合リガンドを含有しているため、有利である。ヒドラジンは、グリコシル化抗体あるいは抗体断片上の炭水化物の酸化部分上にアルデヒドあるいはケトンへのヒドラジン結合を形成するのに使用される。そのリガンドは、診断用画像同位元素Tc−99mにより安定したTc(V)オキソ錯体を形成する。いずれかの理論に束縛されることを善しとはしないが、ジスルフィド交換あるいは混合ジスルフィド形成が、抗体に対する遊離チオール含有ペプチドの接合時には最小化されるよう、親水性アミノ酸がペプチドを十分に親水性にすると見受けられる。そのペプチドの親水性の性質は、それが加えられるときに、Tc−99mと反応できるタンパク質の表面で接合されるペプチドを維持しておくべきである。1つの好適な実施態様では、D−アミノ酸は、注射後金属錯体ペプチドの代謝を最小にするのに使用される。そのペプチドは親水性であり、細胞を逃れるいずれかの標識ペプチドは急速に腎から***されるので、タンパク質が分解される場合には、親水性金属含有ペプチドが代謝されないよう、D−アミノ酸注射が実施される。
【００３４】
［実施例］
以下の例は、本発明の方法と組成を説明するものであるが、しかし、制限するものではない。当業者であれば、多くのほかのペプチド、抗体断片、およびリガンドが、そうした説明されたものの代わりに使用してもよく、それでも依然として本発明の範囲内にあることは理解されることであろう。
【００３５】
[例１：標識F(ab')2の調整]
N α− Boc − N β− Boc −ヒドラジン酢酸
500 mL Parrボトルが、グリオキシル酸一水和物18.00 g (1.96 x 10-1モル)、t-ブチルカルバゼイト25.84 g (1.95 x 10-1モル)（butylcarbazate）、10%の炭素上のパラジウム0.72 g、メタノール100 mL、ジオキサン50 mLで飽和させ、またその後に、水素雰囲気下で(50 PSI:50pounds per square:3.4×105Pa)、Parr水素添加装置上に置かれた。反応混合液は室温で振とうさせ、50 PSI（3.4×105Pa)での圧力を維持するため、水素圧力は数回補正された。反応が進むにつれて、沈殿物が形成された。反応は、3時間後に停止され、またメタノールの追加の100 mLが、その後に50 PSI水素圧力下に置かれ、21時間振とうされた混合液に加えられた。Parrボトルの内容物はメタノール400 mLのなかで溶解され、またセライトによりろ過された。濾液は、白い固形産物の36.4 g (98.1%)を産出するため、真空下で濃縮された。この粗産物14 g (7.37 x 10-1モル)は、ジオキサン130 mLと1 M NaOH80 mLを含有する溶液のなかで溶解され、また氷槽のなかで冷却された。ジ−t−ブチルジカルボン酸、17.76 g (8.14 x 10-1モル、110 M%)が加えられ、またその溶液は室温までゆっくりと温め、また18時間かき混ぜられた。反応物は減圧下でロータリーエバポレーター上で濃縮され、1Mクエン酸150 mLで混合された。混合液はその後にエチル酢酸の2 x 150 mLずつにより抽出された。有機抽出物が組み合わされて、飽和塩化ナトリウム溶液100 mLで洗浄され、硫酸ナトリウム上で乾燥され、減圧下で、ゆっくりと結晶化される油として、その産物の21.0 g (98%)を得るため、ろ過され、また濃縮された。
【００３６】
ペプチド合成
ペプチドIMP 155(H2NHN−CH2−CO−D−Asp-D-Lys(TscG−Cys−)−D−Asp−D−Lys−NH2)が、Advanced ChemTech 348マルチプルペプチドシンセサイザー上のFmocをベースとする固相合成法により合成された。ペプチドは、0.05 mmol / ウェルスケール（４８ウェル合成ブロック）上のRinkアミド樹脂を使用して合成された。反復結合プロセスは次のとおりである。すなわち、Fmoc切断である。
【００３７】
樹脂はDMF中の25％ピペリジンの1.5 mLで、4分間渦巻き状に混合される。ブロックはその後に排水され、またその樹脂はDMF中の25％ピペリジンの1.5 mLで、15分間渦巻き状に混合される。
【００３８】
Fmoc 切断後洗浄
その樹脂はNMP、イソプロパノール、NMP、イソプロパノール、および4回のNMPの1.5 mLずつによって洗浄された。樹脂はその液体が排水される前に、すくなくとも1分間は洗浄溶液のそれぞれにより渦巻き状に混合された。
【００３９】
結合
保護されたアミノ酸は0.5 M HOBtを含むNMP(0.5 M)のなかで溶解される。システム液であるNMP(300μL)がその樹脂に加えられ、その後に、ジイソプロピルカルボジイミド溶液（600μL、NMP中に0.5M樹脂に対して6等量）混合物は室温にて渦巻き状に1時間混合され、またその後に上述のように洗浄された。全プロセスが各アミノ酸の付加に対して反復される。
【００４０】
IMP 155
【化１】
LL2 F(ab') 2 の過ヨウ素酸酸化
マウスLL2 F(ab')2 (4 mg / mL)の炭水化物部分は、pH 5.3で暗所にて1時間、0℃で15 mM NaIO4により酸化された。グリセロール／水溶液（1:1）がその後に加えられ（2.5 mL抗体溶液に対して50μL）、またその溶液が暗所にて0℃で15分間インキュベートされた。酸化抗体はその後に、pH 5.3の酢酸緩衝生理食塩水（ABS、50mM酢酸）にてSephadex G50−80ゲルスピンカラムにより精製された。
【００４２】
接合条件
ぺプチド、IMP 155は、隔壁密封真空バイアル中の適当なペプチド量に抗体溶液を加えることにより、室温にて2時間、酢酸緩衝生理食塩水のなかで、pH 5.3で、100：1というペプチド／抗体モル比で、過ヨウ素酸酸化LL2 F(ab')2断片（4 mg / mL、LL2 F(ab')2）に接合された。接合体抗体断片は、接合時の終わりに結合していない過剰ペプチドを取り除くために、Sephadex G 50-80ゲルスピンカラム（pH 5.3 ABS）により2回精製された。MALDI質量分析による接合体の分析からは、平均4つのペプチドが抗体断片毎に接合されたことが示された。
【００４３】
サンプル MALDI データ MH+
LL2 F(ab')2 103514
酸化LL2 F(ab')2 103168
IMP 155−LL2 F(ab')2接合体 106240
【００４４】
キット製剤化に使用される溶液
α D −グルコヘプトン酸ナトリウム／酢酸緩衝液：
緩衝液は、α−D−グルコヘプトン酸ナトリウム塩200 mMと酢酸ナトリウム塩21 mMをpH 5.3で含有する溶液を作ることにより作成された。この溶液は、キット形成に使用される100 / 10.5 mM (グルコヘプトン酸／酢酸)溶液となるよう、部分は水で希釈された。
SnCl 2 :
バルクSnCl2溶液が、200 mg / mLという濃度で、6 M HClで、スズ金属を溶解することにより作成された。第一スズ200 mg / mLの分割量をグルコヘプトン酸緩衝液で100倍に希釈することにより第一スズ溶液2 mg / mL作成された。
ショ糖溶液：
1 Mショ糖溶液がキット付加用に作成された。
【００４５】
キット製剤化
精製接合体溶液は、pH 7.3、0.1 Mリン酸緩衝Sephadex G 50−80ゲルスピンカラム(A mg / mL LL2 F (ab')2を通された。接合体1 mg(250μL)は、SnCl2 (6.25μL) 12.5μg、α−D−グルコヘプトン酸ナトリウム塩（グルコヘプトン酸緩衝液11.7μL＋第一スズ溶液のなかのその緩衝液）446μg、それにショ糖（55.6μL）19 mgを加えた総体積およそ0.3 mLと混合された。その混合物は即座に凍結され、凍結乾燥され、また真空下で隔壁密封された。
【００４６】
キット標識条件
キットの含量は生理食塩水0.4 mLで溶解され、またその溶液は、生理食塩水（0.4 mL）のなかでNa99m−TcO4を加える前に、5分間そのままにしておかれた。Bio-Sil粒径排除カラムについてのHPLC分析は、その活性のものの96％がタンパク質に付着しており、また活性のものの4％が小さな分子重量物質として存在していたことを示していた。
【００４７】
[例２：BALB/cマウスにおけるTc−99m標識IMP 155−LL2 F (ab')2接合体、生体分布および血清分析in vivo安定性]
【００４８】
Tc − 99m 標識および精製
LL2−F (ab')2接合体はTc−99mグルコヘプトン酸塩と交換することにより、室温にて次のように標識された。すなわち、GlucoscanTM (DuPont)グルコヘプトン酸塩標識キットが、2 mL中の30 mCi Tc− 99mで標識された。Tc−99m グルコヘプトン酸塩0.6 mLが、例1に記載されているIMP 155−LL2−F(ab')2接合体キットバイアル（1 mg接合体とショ糖を含有）に加えられた。そのバイアルは30分間室温でインキュベートされた。標識された物質は、その後に続けて2回、 3 mL Sephadex G 50 − 80スピンカラム（pH 7.3、0.1 M PBS）により精製された。産物は、生理食塩水で希釈されて、5 mCi / mLにして空の滅菌バイアルのなかに入れられた。
【００４９】
生体分布研究
9匹のBALB/cマウスが精製されたTc−99m−LL2 F(ab')2接合体の100μL(500μCi)を注射された。動物は、1時間、4時間、24時間の各時点につき3匹の動物が麻酔され、また犠牲にされた。分析用の血清もまた1時間、4時間、24時間で回収された。血清サンプルは分離後に凍結され、また粒径排除HPLCカラム上でのHPLC分析（Bio−Sil SEC 250、粒径排除HPLCカラム、300 mm x 7.8 mm）の少し前に解凍された。以下の組織と器官が回収されまた計測された。すなわち、血液、肝臓、腎臓、脾臓、肺臓、胃、小腸、大腸、筋肉、尿である。
【００５０】
血清サンプルのHPLC分析では、血清における活性がすべての時点で、主としてTc−99m−IMP 155−LL2 F(ab')2にあった。
【００５１】
【表１】
[例３：ラモス腫瘍を有するヌードマウスにおけるTc−99m−IMP 155−LL2 F(ab')2とI−125標識LL2 F(ab')2の比較]
【００５３】
Tc − 99m 標識
IMP 155−LL2-F(ab')2キットは、生理食塩水0.3 mLのなかで5 mCi 99m−TcO4 - により標識された。キットは室温で30分間インキュベートされ、その後に生理食塩水により0.75 mLに希釈され、また、2回続けてpH 5.3の酢酸緩衝生理食塩水3 mLでSephadex G 50−80スピンカラムにより精製された。
【００５４】
I − 125 標識
抗体断片LL2−F(ab')2の23.3μL(5.15 mg / mL)が0.5 M、pH 7.5リン酸緩衝液50μLと混合され、また2.5 mCi I−125を含有するバイアルに加えられた。クロラミン−Tの溶液、12μL（PBS2 mL中に0.0034 g）が加えられ、また、それがメタ重亜硫酸塩ナトリウムの溶液20μL (10 mL中に0.0254 g)によって反応を止める前に、室温にて3分間その反応が進むことが許容された。
【００５５】
混合標識
I−125 LL2−F(ab')2が、3 mLのなかに1.6 mCiを含有した溶液のなかに入れられた。I−125 LL2−F(ab')2と、Tc−99m LL2 F(ab')2が、25 μCi Tc−99mに対して5μCi I−125の比率で混合された。最終的な混合溶液は、2.0 mLの溶液のなかに、220 μCi I−125 LL2−F(ab')2 と1.04 mCi Tc−99m IMP 155−LL2−F(ab')2を含有するものとなった。
【００５６】
生体分布
同様のサイズの腫瘍を有する5匹のラモス腫瘍を有するヌードマウスの1群が時点毎に使用された。各動物は、予め混合された溶液（5μCi I−125および25μCi Tc−99m）50μLを注射された。動物は1時間、4時間、24時間の時点で、麻酔され、また頚部脱臼により犠牲にされた。以下の組織と器官が回収され、また計測された。すなわち、腫瘍、血液、筋肉、肝臓、腎臓、脾臓、胃である。
【００５７】
【表２】
【表３】
[例４：Tc−99m LL2−Fab'とTc−99m IMP 155−LL2−F(ab')2との比較]
【００６０】
IMP 155 − LL2 − F(ab') 2 接合体の Tc − 99m 標識
IMP 155−LL2−F(ab')2キットは、生理食塩水0.3 mLのなかで5 mCi 99m−TcO4 -により標識された。キットは室温で30分間インキュベートされ、その後に生理食塩水により0.75 mLに希釈され、また、2回続けてpH 5.3の酢酸緩衝生理食塩水3 mLで、Sephadex G 50−80スピンカラムにより精製された。サンプルを生理食塩水で500μCi / mLに希釈した。
【００６１】
Tc − 99m LL2 − Fab' 標識：
LL2−Fab'キット（LymphoscanTM − Immunomedics社、Morris Plains市, ニュージャージー州）が、凍結乾燥キットに加えて、0.1 mLの5 mCi Tc−99mにより室温で放射標識された。分割量（1.55 mCi）50μLが取り除かれ、また生理食塩水により3 mL(500μCi / mL)に希釈された。
【００６２】
生体分布
同様のサイズの腫瘍を有する5匹のラモス腫瘍を有するヌードマウスの1群が時点毎に使用された。各動物は、標識抗体断片（25μCi Tc−99m）50μLを注射された。動物は4時間、24時間の時点で、麻酔され、また頚部脱臼により犠牲にされた。以下の組織と器官が回収され、また計測された。すなわち、腫瘍、血液、筋肉、肝臓、腎臓、脾臓、胃である。腫瘍対正常臓器の比率を各臓器で挙げている。
【００６３】
Tc − 99m LL2 − Fab' と Tc − 99m − IMP 155 − LL2 − F(ab') 2 接合体の比較
【表４】
【表５】
[例５：In vitroでの安定性研究]
Tc−99m標識接合体の安定性が、Tc−99m−グルコヘプトン酸塩で交換することにより、その接合体を標識することによりスクリーニングされ、その後に非結合小さな分子量Tc−99m種のすべてを取り除いて2回続けてSephadex G 50−80 ゲルカラムにより標識タンパク質の精製が行われた。精製された物質はその後にITLC(0.1 M クエン酸、pH 5)、粒径排除HPLCおよび逆相HPLCによりにより分析された。
【００６６】
異なる接合体の安定性が、24時間にわたって室温での粒径排除緩衝液あるいは標識緩衝液でのインキュベーションにより、1 mMのシステインで24時間にわたって37℃にて対抗量により、また24時間にわたって37℃にて血清中でインキュベートすることにより、評価された。
【００６７】
分析方法
ITLC ：
ITLCストリップは標識溶液の分割量（0.2μCi）により斑点がつけられ、pH 5の0.1 Mクエン酸緩衝液により溶出された。標識タンパク質は、元のままで残るが、99m−TcO4‐ とTc−99m−グルコヘプトン酸塩は溶出されそのストリップまで上がる。
【００６８】
粒径排除 HPLC ：
Bio−Rad Bio−Sil SEC 250、粒径排除HPLCカラム（300 mm x 7.8 mm）はpH 6.8で、0.02％アジ化ナトリウムを含有する0.2 Mリン酸緩衝液を1 mL / 分で溶出された。
【００６９】
【表６】
逆相 HPLC:
逆相HPLCは、Waters Radial−Pak、C−18、Nova −Pak（4μ、100 x 8 mm）カラム上で実施された。カラムは2つの緩衝液を使用して勾配をつけて溶出された（緩衝液A、0.1%分割量TFA; 緩衝液B 90%アセトニトリル、10%水、0.1%TFA）。
【００７１】
勾配は次のようであった。すなわち、流速3 mL/分100%緩衝液Aから、100%緩衝液Bを10分間にわたって、流速5 mL /分。逆相HPLC法はTc − 99m 標識小さな分子量種の性質を同定するのに有用であった。安定した、Tc − 99m標識タンパク質は、逆相HPLC上ではうまく溶出しなかった。
【００７２】
【表７】
Tc − 99m − IMP 126 − LL2 − F(ab') 2
標識されたIMP 155−LL2−F(ab')2に類似させて作成された粗い標識タンパク質は、pH 7.3の0.1 Mリン酸緩衝液でSephadex G 50−80 ゲルカラム上で精製された。1分割量が除去され、また生理食塩水で5倍に希釈された。生理食塩水は37℃で1時間インキュベートされた。粒径排除HPLC分析では、活性のおよそ5％が1時間後にはそのタンパク質から解離した。
【００７４】
37℃にてPH 7.3で、1 mMシステインを含有する0.1 Mリン酸緩衝液でのTc−99m−IMP 126−LL2−F(ab')2の1.5時間のインキュベーションの結果は、標識タンパク質の31％が減少してTc−99m−IMP 126−Fab'断片になった。Tc−99m−IMP 126−LL2−F(ab')2の56%がそのまま残り、また活性の12％が、Tc−99mシステインなどの低分子量種に変換された。
【００７５】
37℃での新鮮ヒト血清の中で10倍に希釈されたTc−99m−IMP 126−LL2−F(ab')2の21時間のインキュベーションの結果は、活性の34％が低分子量種として喪失した。活性のほぼ同じパーセンテージ（20％）の3つのTc−99m標識タンパク質が存在した。ピークは凝集体、Tc−99m−IMP 126−LL2−F(ab')2、Tc−99m−IMP 126−LL2−Fab'によるものであると考えられる。
【００７６】
Tc − 99m − IMP 140 − LL2 − F(ab') 2
標識IMP 155−LL2−F(ab')2に類似させて作成された標識ペプチドは精製され、また一夜pH 7.3で0.1 Mリン酸緩衝液のなかに貯蔵された。粒径排除HPLC分析では、活性のおよそ30％が24時間後にそのタンパク質から解離したことが示された。逆相HPLC分析では、小さな分子量種を標識したTc−99mのバルクはそのタンパク質を加水分解したTc−99m 標識ペプチドとして存在した。その抗体に対するアシルヒドラゾン結合は不安定であったというのが結論であった。
【００７７】
Tc − 99m − IMP 155 − LL2 − F(ab') 2
標識ペプチドは精製され、また一夜pH 7.3で0.1 Mリン酸緩衝液のなかに貯蔵された。粒径排除HPLC分析では、5％未満が室温にて24時間後に小さな分子量種に分解したことが示された。
【００７８】
1.5時間37℃にてpH 7.3で、1 mMシステインを含有する0.1 Mリン酸緩衝液でのTc−99m−IMP 155−LL2−F(ab')2のインキュベーションの結果は、標識タンパク質のバルク（61.5％）が減少してTc−99m−IMP 155−Fab'断片になった。Tc−99m−IMP 155−LL2−F(ab')2の8%がそのまま残り、また活性の30％が、Tc−99mシステインなどの低分子量種に変換された。
【００７９】
21時間37℃で新鮮ヒト血清の中で10倍に希釈されたTc−99m−IMP 155−LL2−F(ab')2をインキュベーションした結果、活性の10％が低分子量種として喪失した。活性のほぼ同じパーセンテージ（20％）の3つのTc − 99m標識タンパク質が存在した。ピークは凝集体（38％）、Tc−99m−IMP 155−LL2−F(ab')2(42％)、Tc−99m−IMP 155−LL2−Fab'（9％）によるものであると考えられる。凝集体形成は、酸素に対する曝露によって起こったジスルフィド形成による人為的現象である。
【００８０】
[例６：凝集体形成]
接合体のためのプロセスの間に形成されるある種のタンパク質の凝集体（2〜10％）はUVに存在する高い分子量ピークにより示される粒径排除HPLCにより分析されるときのタンパク質のTc−99m標識である。凝集体は、もう1つの接合体のチオールとの1つの接合体であるペプチド接合体の間にあるジスルフィド形成によるものであると考えられる。その凝集体は過剰システインによる処置で姿を消した。ある種の凝集体形成はin vitroでの安定性研究時に血清の中で観察されている。これはまた、ジスルフィド形成によるものであると考えられる。新鮮血清では、熟成血清よりも凝集体がより少ないことが示されており、また血清へのシステインの付加は形成される凝集体の量を大幅に減らした。In vivoの血清サンプルでは、ある種の凝集体形成が示されたが、しかし、活性のバルクはTc−99m−IMP 155−LL2−F(ab')2として存在した。
【００８１】
[例７：酸化LL2−F(ab')2上のペプチドローディング]
IMP 155の接合は上述のように実施され、また抗体濃縮は280 nmで分割量のUV吸収量により測定された。チオール含量はエルマンの測定法を使用して測定され、分割量でのチオール濃度は、抗体上でのチオールローディングを得るためにUVにより測定される抗体含量に相関していた。UV測定方法は、そのタンパク質含量を求めるのに使用された波長での有意な吸収率をそのペプチドが有しており、したがってそのタンパク質含量に関して人工的な高度な数値を与えるため、不正確であったことが後になって判明した。その分析はその後に、そのタンパク質へ付着したペプチドの数を正確に求めるために、マトリックス補助レーザー脱着電離（MALDI）質量分析に切り換えた。以下の表中のその結果では、ペプチドローディングは、接合時に使用された抗体に対するペプチドの比率の範囲全体にわたって一致をみた。上述された酸化と接合条件を使用した場合、そこにローディングされて加えられたのは平均で抗体当り4個のペプチドであった。
【００８２】
【表８】
【表９】
[例８：対照実験]
接合体対照
接合体対照実験が、タンパク質チオールを生成するように抗体上のジスルフィドとペプチドを含有する遊離チオールが反応するかどうか、あるいはそのペプチドが、酸化炭水化物に対してよりも何らかの手段によりその抗体に付着するかどうかを判定するために実施された。この実験では、非酸化LL2−F(ab')2は、多くの過ヨウ素酸酸化LL2−F(ab')2と同時に、50倍過剰IMP 155で処理された。過ヨウ素酸酸化LL2−F(ab')2は、UV（MALDIでは4.3ペプチド／抗体）により求められるものとして、2.3チオール／抗体を含有する接合体を形成し、また、その非酸化LL2−F(ab')2はUVにより求められるものとして0.2チオール／抗体を含有していた。この実験では、過ヨウ素酸酸化はその抗体にそのペプチドを加えるために必要であったことが示され、チオールがペプチド上に存在し、またジスルフィド置換の産物ではなかったことが示された。
【００８５】
Tc − 99m 標識対照
対照実験は、LL2−F(ab')2の処理単位は過ヨウ素酸で処理され、また、10 mg / mLのシアノ水素化ホウ素ナトリウムが接合の2時間後に加えられ、またその接合体は生成前さらに2時間の間続けられたこと以外は、ペプチドIMP 140の100倍過剰で、上述のように接合された。そのLL2−F(ab')2は、酸化対照には過ヨウ素酸が存在していなかったことを除けば、同じ処理を受けた。その2つの抗体作成は、Tc−99mグルコヘプトン酸塩により交換されることにより標識された。接合前に過ヨウ素酸により処理された部分は、0.1 M、pH 5のクエン酸緩衝液の中で、ITLCにより示された60％標識収量を産生し、また非酸化対照では、Tc−99mの6％がそのタンパク質に結合されたことがITLCにより示された。
【００８６】
さらに、2つの金属結合リガンドを含有するペプチドIMP 171は、IMP−155に関して述べられているのと同じプロセスを使用して、LL2−F(ab')2に接合された。チオールの増加数がLL2−Fab'に対するLL2−F(ab')2の減少を引き起こす可能性があったため、このペプチドに関しては50：1あるいはそれ以下という抗体に対するペプチドの比率を使用することが必要であった。この反応は、酸化抗体に関するのと同じ処理単位で実施されたIMP 171−LL2 F(ab')2接合体（2.3チオール／抗体）に比較してチオールの数（5.3チオール／抗体）の2倍を有する1つの接合体、IMP 155−LL2−F(ab')2を産生した。
IMP−171 H2NHN−CH2CO−D−Asp−D−Lys(TscG−Cys−)−D−Asp−D−Lys−D−Lys
(TscG−Cys−)−D−Asp−D−Lys−NH2 MH+1412
【００８７】
[例９：レニウム標識]
Re − 188 に関して還元に先立つ手順を使用するレニウム標識
これらの接合体は、レニウム同位元素（主にRe−186およびRe−188）により標識される場合もあり、その場合には放射線免疫療法に有用である。過レニウム酸塩の還元には、テクネチウムの還元に関して必要であるよりもさらに多くのスズイオンが必要となる（典型的には上記の200μg / mL最終濃度）、第一スズイオンの高い値がF(ab')2断片のヒンジ領域に存在するようなため、感受性の高いジスルフィド結合を還元しないことを確実なものとするには、余分に注意することが必要である。レニウムによる放射標識時には、ジスルフィド結合還元、あるいは抗体断片接合体と混合する前に、過レニウム酸塩レニウムが還元されるのを予防するために、MAbおよびSn（II）の間の接触時間が時間的には制限されること以外はTc−99mで使用されたのと同様の手順が使用される。基質を含有するチオールリガンドの水溶液が、Lisicらの方法によりCH2Cl2のなかの188ReOCl3 (PPh3)2とその後に混合された。CH2Cl2は、その後に窒素流れの下で除去され、また2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（HPCD）の10％水溶液の0.1 mLのなかで溶解された。そのHPCD溶液はその後に、30分間室温にてインキュベートされるIMP−155−LL2 F(ab')2 (4 mg / mL)の溶液の0.5 mLと混合される。
【００８８】
[例１０：テクネチウム標識]
チオール含有オクトレオチドの Tc − 99m 標識
IMP 162 GDdDK (TscGC)Fd DFW d KTCTol MH+ 1667
ペプチドIMP 162 (0.0012 g)は、pH 5.29で10% HPCD、200mMグルコヘプトン酸塩、14 mM酢酸ナトリウム塩、12 mMアスコルビン酸を含有する水溶液の30 mLに溶解された。第一スズ溶液は、HPCDグルコヘプトン酸塩溶液の3.8 mLに、6 M HClのなかのSnCl2 200 mg / mLのうち0.2 mLを混合させることにより作成された。第一スズ／HPCD溶液の0.2 mL分割量が、ペプチド溶液に加えられ、またその溶液はその後に凍結乾燥バイアルのなかに1.5 mL分割量で0.22 μm Millex GVフィルターによりろ過された。そのバイアルは、その後、凍結され、凍結乾燥され、また真空下で密封された。
【００８９】
Tc − 99m キット標識
凍結乾燥されたキットは、1.5 mL生理食塩水のなかで20 mCi99mTcO4‐で再構成され、また10分間室温にてインキュベートされ、またその後に15分間沸騰した水槽のなかで加熱された。標識は完了し、定量分析された。
【００９０】
[例１１：薬剤接合体]
ジスルフィド含有ペプチドに対する化学療法薬剤の接合体
元のオクタペプチドに付着したN末端の付加セリン残基を有するオクトレチドの類似体が、N末端アルデヒドを生成するように、m−過ヨウ素酸ナトリウムを使用して酸化された。N末端ヒドラゾンに、セリン−オクトレオチド上に存在するすべてのアルデヒドを変換するのに十分なIMP−155ペプチドと、この中間体を反応させた。ヒドラゾンは、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用してアルキルヒドラジンに還元され、その中間体チオール付加IMP−155−ヒドラジニル−オクトレチドが精製され、後者の三硫化物基とのチオール交換を介して抗癌薬剤カリケアマイシン（calicheamicin）と結合された。生成物であるカリケアマイシン−オクトレオチドはジスルフィド−IMP 155−ペプチジル−ヒドラジンリンカーから構成される。
【００９１】
[例１２：薬剤接合体]
ジスルフィド結合含有するペプチド上のドキソルビシンの部位特異的置換
a)アルデヒド含有(scFv)2断片の作成
N末端セリンアミノ酸を有するヒト(scFv)2断片の溶液が、3 mg / mLで、4℃にて暗所で2時間、10 mMの過ヨウ素酸ナトリウムで処理される。グリセロールが過剰過ヨウ素酸塩を破壊するために20 mM最終濃度に加えられ、またその反応はさらに20分間攪拌される。N末端酸化(scFv)2は平衡化されたG−10− Sephadexのカラム上の低分子量汚染物から精製され、1 mMの EDTAを含有する、pH 5.5、アルゴン脱気0.1 M酢酸ナトリウムで実施される。生成物はさらなる反応の前に5 mg / mLに濃縮される。
【００９２】
b) チオール付加(scFv)2断片の作成
a)におけるように得られたN末端アルデヒド− (scFv)2中間体は、新たに作成された、20:1というモル過剰にあるp−(2−チオエチル)−フェニルヒドラジン（TEPH）のDMSO溶液で処理され、その反応は4℃にて2時間攪拌される。ヒドラゾン結合を含有するその生成物TEPH−(scFv)2は平衡化されたG−10−Sephadexのカラム上での精製により得られ、またpH 6.5で、1 mM EDTAを含有するアルゴン脱気0.1 M酢酸ナトリウムにおいて実施される。任意選択的に、精製の前に、炭酸ナトリウム少量を加えて、5.5から7.0に当初の反応混合物のpH調節を行った後、フェニルヒドラゾンが10 mM水素化ホウ素ナトリウムの存在下で2時間反応により、フェニルヒドラジン結合に還元される。scFvモノマーへの分解が無いことを確認するために、pH 6.5で0.5 Mリン酸ナトリウムで平衡化されたBio−Sil GF−125カラム上でSE−HPLCによりその産物TEPH−(scFv)2が分析された。その産物の分割量はまた、ビシンコニン酸（BCA）法によりタンパク質濃度に関して、またチオール含量に関してはエルマン反応により、別々に分析され、またしたがって、推論によりTEPH−(scFv)2のモル毎のチオール基数が測定される。
【００９３】
c) マレイン酸イミド−ドキソルビシンに対するドキソルビシンの活性化
pH 8.3で50% DMSO/0.1 Mホウ酸ナトリウム緩衝液の5 mLのなかの塩酸ドキソルビシン溶液（10 mM）を市販されていて入手可能なクロスリンカーm−マレイドベンゾイル−N−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（MBS、Pierce化学社、ロックフォード市イリノイ州）の2倍モル過剰量で処理する。その反応混合物は、5%塩化ナトリウム溶液で20 mLに希釈される前に、室温で3時間攪拌をしてよい。その混合物は、酢酸エチルなどの実質的に水不混和性である有機溶媒の3 x 20 mLにより抽出され、また、その組み合わせ有機抽出物がpH 8.0で3 x 20 mL 0.1 M炭酸水素ナトリウム（重曹）で洗浄される。その有機溶液は、マレイン酸イミド−ドキソルビシンを得るために、無水硫酸ナトリウム上で乾燥され、ろ過され、また蒸発される。
【００９４】
ｄ) TEPH−(scFv)2へのマレイン酸イミド−ドキソルビシンの結合
4℃にてpH 6.5で1 mM EDTAを含有するアルゴン脱気0.1 M酢酸ナトリウムのなかのTEPH−(scFv)2が、DMSO中15％作成され、DMSO中のマレイン酸イミド−ドキソルビシンの（チオール含量に対して） 2培のモル過剰で処理され、急速攪拌により一部分に加えられた。攪拌は4℃にて1時間続けられ、またドキソルビシン−(scFv)2が、pH 7.5で0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝の0.9%塩化ナトリウムで平衡化されたSephadex G−10 ゲルカラムにおけるカラムクロマトグラフィにより精製される。
【００９５】
本発明の精神と範囲から離れることなく、本出願において例証され、また説明された多くのほかの種に代わりうることは、当該技術分野に熟練した者には理解されることであろう。
Claims (17)
- タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの生物学的活性を維持するために必要である少なくとも１つのジスルフィド結合を含有するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの診断用または治療用接合体を産生する方法であって、
前記少なくとも１つのジスルフィド結合の切断なしに、前記タンパク質、前記ポリペプチドまたは前記ペプチドの安定した診断用または治療用接合体を形成するために、チオール反応性の診断用または治療用薬剤と、前記タンパク質、前記ポリペプチドまたは前記ペプチドとを接触させるステップを含み、
前記タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが、部分的に酸化された炭水化物部分がチオール含有ペプチドにヒドラゾンまたはヒドラジンを介して結合されるグリコシル化二価抗体断片であり、
前記チオール含有ペプチドが、１つ以上のＴｓｃｇ−Ｃｙｓ部分（ここで、Ｔｓｃｇはチオセミカルバゾニルグリオキシルを表す）とアルキルヒドラジン基とを含むペプチドであり、
アルデヒド基とケトン基を生成するために前記グリコシル化二価抗体断片の炭水化物部分を酸化するステップと、
１つ以上のＴｓｃｇ−Ｃｙｓ部分を含み、アルキルヒドラジン基を有する前記ペプチドと、酸化された断片上のアルデヒド基およびケトン基とを反応させるステップと、
任意選択的に、結果的に生じるヒドラゾンをヒドラジンに還元するステップと
を行うことにより、前記部分的に酸化された炭水化物部分が、前記チオール含有ペプチドに結合される、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの診断用または治療用接合体を産生する方法。 - 前記１つ以上のＴｓｃｇ−Ｃｙｓ部分とアルキルヒドラジン基とを含む前記ペプチドが、式HS−Q−NHNH2のチオール−ヒドラジンであり、ここで、Qはペプチド、並びに、アルキル基、アリール基、およびシクロアルキル基とペプチドとの組み合わせから構成されるグループから選択される結合部分であり、前記ペプチドは前記グリコシル化二価抗体断片の部分的に酸化された炭水化物部分へのヒドラゾンまたはヒドラジン結合により結合される請求項１に記載の方法。
- 前記診断用または治療用薬剤が、薬剤、抗体、抗体断片、タンパク質、糖タンパク質、DNA、RNA、PNA、金属錯体、診断用または治療用放射標識種、酵素、毒素および糖類から構成されるグループから選択される請求項１に記載の方法。
- 前記診断用または治療用薬剤が、チオール結合の陽イオン放射性同位元素である請求項１に記載の方法。
- 前記治療用薬剤が、チオール結合リンカーを含む薬剤誘導体である請求項１に記載の方法。
- 前記ペプチドが、D−アミノ酸を含む請求項１に記載の方法。
- 前記診断用または治療用放射性同位元素が、テクネチウム、レニウム、亜鉛、銅、水銀、カドミウム、プラチナ、パラジウム、鉛、ビスマスから構成されるグループから選択される1つの元素の放射性同位元素である請求項４に記載の方法。
- 前記放射性同位元素が、Tc−99m、Re−186またはRe−188である請求項７に記載の方法。
- 前記二価抗体断片が、F(ab')2またはF(ab)2断片である請求項１に記載の方法。
- 前記陽イオン放射性同位元素が、その場（ｉｎ ｓｉｔｕ）で生成される請求項４に記載の方法。
- 前記１つ以上のＴｓｃｇ−Ｃｙｓ部分とアルキルヒドラジン基とを含む前記ペプチドが、H2NHN−CH2−CO−D−Asp−D−Lys(TscG−Cys−)−D−Asp−D−Lys−NH2であり、そこではTscGはチオセミカルバゾニルグリオキシルであり、前記ペプチドは前記グリコシル化二価抗体断片の部分的に酸化された炭水化物部分へのヒドラゾンまたはヒドラジン結合により結合される請求項１に記載の方法。
- 部分的に酸化された炭水化物部分が少なくとも１つのＴｓｃｇ−Ｃｙｓ部分（ここで、Ｔｓｃｇはチオセミカルバゾニルグリオキシルを表す）とアルキルヒドラジン基とを含むペプチドへのヒドラゾンまたはヒドラジン結合を介して結合されるグリコシル化二価抗体断片を含む、放射標識されたグリコシル化二価抗体断片の産生に用いるためのキット。
- その場（ｉｎ ｓｉｔｕ）で、陽イオンテクネチウムまたはレニウム放射性同位元素を生成するために、放射性過テクネチウム酸塩または放射性過レニウム酸塩陰イオンを還元するためにさらに第一スズイオンを含む請求項１２に記載の前記キット。
- 前記ペプチドが、D−アミノ酸を含む請求項１２に記載の前記キット。
- 前記二価抗体断片が、F(ab') 2またはF(ab) 2断片である請求項１２に記載の前記キット。
- 前記Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ部分とアルキルヒドラジン基とを含む前記ペプチドが、H2NHN−CH2−CO−D−Asp−D−Lys(TscG−Cys−)−D−Asp−D−Lys−NH2であり、ここで、TscGがチオセミカルバゾニルグリオキシルであり、前記ペプチドが、前記グリコシル化二価抗体断片の部分的に酸化された炭水化物部分へのヒドラゾンまたはヒドラジン結合により結合されている請求項１４に記載の前記キット。
- 請求項１に記載の方法により産生される、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの生物学的活性を維持するのに必要である少なくとも1つのジスルフィド結合を含有するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの診断用または治療用接合体。
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