JP4679730B2 - Fibrinogen preparation with excellent solubility - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、医療用医薬品の分野に関し、詳細には組織接着剤の構成成分であるフィブリノゲン及びフィブリノゲン製剤に関し、さらに詳細には溶解性に優れたフィブリノゲン製剤及びそれを用いる組織接着剤に関する。
【０００２】
【従来技術及び発明が解決しようとする問題点】
臨床医療用の組織接着剤には、タンパク質成分からなる天然型接着剤のフィブリン接着剤及びゼラチン系糊などがあり、広く使用されてきている（Biomedical Perspectives, Vol.6, No.1, pp9-72, 1997年「特集・生体接着剤」参照）。なかでも最もよく用いられているのがフィブリン接着剤である。フィブリン接着剤はフィブリンの膠着性を利用したものであり、生体内でゲル化して接着作用を発揮する。フィブリン接着剤の用途は、止血、創傷部位の閉鎖、神経、腱、血管や組織などの接着または縫合補強、肺におけるエアリークの閉鎖など広範にわたっている。また、フィブリノゲン製剤は、例えば敗血症における汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）のような血液凝固因子の消費状態の改善や先天性及び後天性のフィブリノゲン欠乏症における補充療法の目的で静脈投与製剤として臨床的に使用されることもあり、血液中のフィブリノゲン濃度を高めることによって重篤な出血を阻止する。
【０００３】
フィブリノゲンを含有する組織接着剤の製造方法は知られている（特公昭６３−４０５４６号参照）。該公報に記載された方法では、フィブリノゲンは血液凝固第XIII因子（第XIII因子）や場合によってはアルブミンなどとともに凍結乾燥され、凍結乾燥されたフィブリノゲンもしくはフィブリノゲンを高い割合で含有する血漿タンパク質混合物の凍結乾燥物は、使用に際して通常室温などに温められた後に溶解液で再構成される。凍結乾燥物は、室温などに高められた温度において徐々に再溶解する。
【０００４】
現在、臨床上使用されているフィブリノゲン製剤及びこれを用いる組織接着剤は、一般に凍結乾燥品である。すなわち、フィブリノゲン溶液をバイアルに充填後、凍結乾燥し、必要に応じてウィルス不活化工程として加熱処理が施されたものである。このようにして調製されたフィブリノゲン製剤は、充填時の溶液の嵩をそのまま残した塊状(ケーキ状)の形態をしている。また、実際に臨床場面で使用するに際しては、この塊状(ケーキ状)の形態のフィブリノゲン製剤を溶解する必要があるが、そのための溶解液として、注射用蒸留水、注射用生理食塩水、緩衝液などや所定のフィブリン接着剤調製用の溶解液などが用いられている。
【０００５】
このように、フィブリノゲン製剤を実際にフィブリン接着剤として使用するには、まず溶解液で溶解する必要があるが、さらにフィブリン接着剤として十分な接着作用を得るためには調製するフィブリノゲン溶液を一定濃度以上の高濃度とする必要がある。しかしながら、従来のフィブリノゲン製剤は上記のように塊状(ケーキ状)の形態であるため、特に高濃度のフィブリノゲン溶液を得ようとすると、フィブリノゲン自体の溶解性がもともと低いことからフィブリノゲンの溶解に長時間（通常、室温で５〜１５分程度、貯蔵温度である４℃では３０分以上）を要し、そのため緊急を要する外科手術での使用には適しないという問題があった。
【０００６】
このような長時間を要するフィブリノゲンの溶解時間を短縮するため、溶解補助剤を添加して溶解性向上を試みた報告がある（特開平２−０３６８７２号、特開平８−１５１３３０号参照）。具体的な溶解補助剤としては、界面活性剤、アルブミン、アミノ酸、糖類などが開示されている。しかしながら、この方法においても溶解操作には依然として３〜６分近くを要しており、しかも、この溶解時間は室温で操作した場合に要する時間である。冷所保存された状態のままのフィブリノゲンを溶解補助剤を用いて溶解した場合にどの程度の溶解時間を要するかは定かではないが、上記溶解時間に比べて長時間を要することが予想される。一般に、通常のフィブリノゲン製剤及び組織接着剤と溶解液とは冷所環境下で保存されているため、使用に際しての溶解作業は室温に戻した後に実施される。すなわち、溶解補助剤を用いた方法では溶解操作自体に要する時間は上記のように３〜６分近くに短縮されたが、フィブリノゲン製剤もしくは組織接着剤が冷所保存であるため、室温に戻すための時間としてさらに３０分程度を考慮しなければならない。
【０００７】
また、フィブリノゲン溶液を低温氷結して安定性を高めようとする方法（特公昭６３−４０５４７号）や、溶媒に着目し種々のフィブリノゲン溶解促進剤を添加したフィブリノゲン溶液を凍結状態で保存し、用時に融解して使用する方法（特開昭５７−１４９２２９号）も報告されている。しかしながら、これら凍結製剤では、凍結乾燥製剤に比較して使用時の利便性は向上したものの、用時融解に際して時間を有するうえ、凍結状態で流通・保存するための設備を必要とする点でなお問題を有する。
このような状況下、外科手術等の臨床場面に十分に対応しうる、溶解性の向上したフィブリノゲン製剤の開発が望まれていた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、外科手術等の臨床場面に十分に対応しうる、溶解性の向上したフィブリノゲン製剤を開発すべく鋭意検討した結果、凍結乾燥したケーキ状の塊を粉末化することにより、十分な接着作用に必要な高濃度であってもフィブリノゲンの溶解性が著しく向上することを見出し、本発明を完成するに至った。とりわけ、予期しないことに、凍結乾燥したケーキ状の塊を粉末化することにより、フィブリノゲンの室温での溶解性が向上するのみならず、冷所保存状態の低温での溶解性も室温と同程度であることが見出された。それゆえ、実際の使用に際しては、冷所貯蔵状態から取り出した後に室温に戻すことなく溶解操作を開始でき、その結果、冷所保存状態から溶解を経て実際に組織接着剤等として使用するまでの時間が著しく短縮される（約１０分）。
【０００９】
本発明により凍結乾燥したケーキ状のフィブリノゲン塊を粉末化することにより、溶解時の温度やその容量に左右されることなく短時間のうちに完全に溶解することが可能となる。
通常、溶解性の劣る製剤は溶解液注入後から継子と呼ばれるダマを形成しやすい。これは、その製剤の持つ疎水性の強度に依存していると考えられ、溶媒が速やかにその製剤全体に行き渡らないこと及びそれにより主剤の周囲のみに溶媒が集まってしまうために、溶解時間の遅延を引き起こすものと考えられる。したがって、溶媒が製剤全体に均一に分散するためには製剤を粉末化することが有効である。粉末化された製剤は、溶媒への接触面積が増大するが、その均一分散性を維持するために溶解時に激しい振盪を加えることによって速やかに溶解することが可能となる。
【００１０】
なお、造粒操作を施して粉末化を行うことは、抗生剤などでは一般的な方法であるが、血漿タンパク質を製剤化した製品の中では粉末剤（顆粒剤もしくは細粒剤）の剤型を採用しているのはトロンビン製剤のみである。トロンビンは分子量６,０００の軽鎖と分子量３１,０００の重鎖がジスルフィド結合で結合したタンパク質であり、タンパク質を形作るペプチド鎖の構成は比較的単純であり分子量も小さい。しかしながら、本発明による粉末化の対象であるフィブリノゲンは、α鎖、β鎖、γ鎖という３種類のペプチドそれぞれ２本ずつからなる計６本のペプチド鎖がジスルフィド結合により結びついた立体構造を形成する分子量３４０,０００のタンパク質であり、上記トロンビンに比べて立体構造がはるかに複雑であり、分子量も大きい。このように複雑な構造と大きな分子量を有するフィブリノゲン分子は物理的衝撃に弱く、容易にその立体構造が破壊されることが予想される。一方、血漿タンパク質でフィブリノゲンと同様に複雑な構造を有する免疫グロブリン製剤では、凍結乾燥ケーキ品を粉末化すると抗補体価の上昇が観察され、製剤として好ましくない変化が生じることが確認されている。このように、血漿タンパク質製剤での粉末化は、トロンビン製剤等のごく限られた製剤のみしか例がなく、フィブリノゲンのように複雑な構造を有する血漿タンパク質に対する粉末化は当業者の予期するところではなかった。
【００１１】
フィブリノゲンを粉末化する方法としては、（１）凍結乾燥塊を封入した製品容器に物理的負荷（好ましくは振盪）を加え容器内で粉体を調製する方法、（２）凍結乾燥塊を解砕機に投入し、プロペラの物理的負荷などにより粉体を調製する方法、及び（３）液状の試料から直接粉末を調製する方法などが挙げられる。これら粉末化法のうち、（１）に示した方法（とりわけ振盪法）が、▲１▼無菌性を維持できること、▲２▼得られた粉末を容器に再充填する必要がないこと、▲３▼容器に充填するフィブリノゲン粉末の量を均一に保持できること、及び▲４▼容器内の陰圧化処理へ容易に対応できることなどの理由から好適な方法である。
とりわけ、振盪法の利点は、▲１▼試料の凍結乾燥によるタンパク質の安定化、▲２▼容器の封栓（好ましくは陰圧下での）、及び▲３▼容器内での無菌性を保持した状態で振盪機を用いた振幅運動によりケーキ形状にある凍結乾燥塊を粉末状へと緩やかに処理する、といった一連の工程をタンパク質の変性を伴うことなく実施できる点にある。
【００１２】
一方、上記（２）及び（３）に示す粉末化法は、血漿タンパク質の中でも特に高分子かつ複雑な構造を有するフィブリノゲンの場合はタンパク質の変性が懸念されるため好ましくない。とりわけ、（３）に示す粉末化法のように液状試料から直接粉末を調製すると、試料中の水分を除去するに際して薬液は高温にさらされるため、タンパク質が変性することが考えられる。また、（２）のプロペラの物理的負荷を加える方法もフィブリノゲンタンパク質の構造を物理的に破壊するおそれがあるので好ましくない。
【００１３】
これに対して、（１）に示す粉末化法は、凍結乾燥後に容器を未開封のままで粉末化処理を施すものであり、上記のようなタンパク質の変性が最も少なく、本発明において最も好ましい。粉末化処理のための物理的負荷としては、容器の振動・振幅運動の繰返しによる凍結乾燥塊の破砕（振盪法）や超音波処理による破砕が挙げられるが、振盪法が好ましい。このような振盪法によれば、（２）に示す粉末化法におけるプロペラなどによる大きな物理的負担を回避することができる。
【００１４】
振盪法を行うに際しては、所望する容器に充填した凍結乾燥塊の試料を容器ごとに振盪機にセットし振盪させることにより、凍結乾燥塊自身の容器内での振幅による往復運動を行うことで凍結乾燥塊を徐々に崩壊させ、粉末試料を調製する。具体的には、フラスコや試験管などを振盪する際に用いる往復式振盪機に、凍結乾燥処理を施した封栓済みの容器をセットし、数十ｍｍ程度の振幅、より好適には４０ｍｍ程度の振幅、及び１分間当たり１００〜３００回程度、通常２００回程度の振盪速度で数時間、より好適には約３〜約１２時間、通常５時間程度の振盪処理を施すことで容器内の凍結乾燥塊を解砕し、粉末試料を得ることができる。当該振盪処理は、タンパク質の安定性を考慮して、変性を生じないように室温以下の温度で実施するのが好ましく、また、前記の振盪処理の振幅、振盪速度及び振盪時間等の各種条件は、対象となる製剤の容器の大小等を考慮して当業者が適宜調整することができる。
【００１５】
以上のような粉末化処理を施すことにより、フィブリノゲンの濃度として１％以上で短時間のうちに溶解することがわかった。特に組織接着剤として用いる場合、フィブリノゲンの濃度は８％と高濃度であるが、このような高濃度であっても本発明に従って粉末化すればフィブリノゲンはきわめて短時間の内に完全に溶解することが可能となる。
【００１６】
フィブリノゲンの溶解時間の短縮はまた、溶解時の温度が室温の場合のみならず、凍結乾燥塊の貯蔵温度のような低温においても同様に認められた。特に凍結乾燥品(ケーキ形状)は通常、冷所で保存されているが、これを冷所から取り出した直後に溶解させた場合、従来は３０分近くを要していたが、本発明により粉末化することにより６分以内に短縮される。
さらに、一般的には容量も溶解時間に影響を及ぼす因子であるといわれているが、本発明による粉末化フィブリノゲンでは、０.５ｍｌ〜５.０ｍｌの範囲では容量は溶解時間にほとんど影響を及ぼさないことがわかった。また、粉末化処理に伴う性状の変化については、溶解後の性状、凝固時間、凝固性タンパク質含量、血液凝固第XIII因子活性含量などに変化は認められなかった。特に溶解時間、溶解後の性状、凝固時間及び凝固性タンパク質含量は生物学的製剤基準の乾燥ヒトフィブリノゲンの溶解性試験、力価試験及び凝固性タンパク質含量試験における基準をすべて満たしており、本発明による粉末品はフィブリノゲン製剤として用いるのに適している。
【００１７】
粉末化試料（フィブリノゲン製剤）の溶解性は、試料を収容した容器内を陰圧化することによってさらに改善することができる。これは、容器内を陰圧化することで、溶解液が粉末に一層浸透しやすくなることによるものと考えられる。また、溶解後の操作として通常、シリンジによる抜き取り操作が行われるが、常圧下で溶解した場合には、振盪により形成された気泡が消失しにくいために抜き取り操作に支障をきたし、特に容量が小さくなるほど残存する気泡によって正確に抜き取ることが困難であるのに対し、陰圧化処理を施しておけば、抜き取り操作直前に常圧化させることによって気泡を消失させることができ、溶解後のシリンジ抜き取り操作が行いやすくなる。
【００１８】
本発明の振盪法により粉末化して調製したフィブリノゲン製剤（粉末品）を局方ふるいを用いて粒径別にし、その重量比から粒度分布を測定したところ、１７００μm以下の粒径が全量の９０％以上を占めていることが確認された。
医薬品における粒状製剤には顆粒剤や散剤といった分類がある。日本薬局方第１３改正の製剤総則における顆粒剤・散剤の粒度基準に基づくと、粒径の最大値は１７００μmであることが記載されている。そこで本発明者らは、医薬品分類上のこの粒度基準に基づく粒径の上限値に関して測定を行った。
【００１９】
本発明によるフィブリノゲン粉末化製剤の出発物質であるフィブリノゲンは、常法により精製されたものであってよい。たとえば冷エタノール沈殿法にグリシンによるフィブリノゲンの溶解度低下効果を組み合わせた方法（Blomback, B.及びBlomback, M., Arkiv Kemi, 10, p.415〜443, (1956)）及びグリシンを単独で使用するグリシン沈殿法（Kazal, L.A.,ら、Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 113, p.989〜994, (1963)）などを用いることができる。
出発材料のフィブリノゲンは、臨床上の生体適合性の観点から、ヒト血漿から得られたもの、もしくは遺伝子組換フィブリノゲンなどを原料として使用することが望ましい。
【００２０】
本明細書において「フィブリノゲン製剤」あるいは「フィブリノゲン粉末製剤」とは、「タンパク質成分からなる組織接着剤」、特に「フィブリノゲン及び血液凝固第XIII因子を有効成分とする主剤と、トロンビン及び塩化カルシウムで形成される補助剤からなる組織接着剤」を意味し、一般にフィブリン接着剤または、フィブリン糊として呼ばれているものを包含する。
【００２１】
なお、市販のフィブリノゲン製剤及びこれを用いる組織接着剤は、添付文書によれば「フィブリノゲンを凍結乾燥した製剤」、「フィブリノゲン末」、「フィブリノゲン凍結乾燥粉末」等と表記してあり、あたかもフィブリノゲンが粉末の性状であるかのような印象を与えるが、実際にはこれらはフィブリノゲンが高濃度であるため凍結乾燥品は粉末状ではなくケーキ形状をしている。従って、従来のフィブリノゲン製剤及び組織接着剤は、その表記に係らず実際は決して粉末ではなくケーキ形状であり、本明細書における粉末品ではないことを銘記すべきである。それゆえ、従来のフィブリノゲン製剤及び組織接着剤は本明細書においては凍結乾燥ケーキ品に相当するものである。
【００２２】
【実施例】
以下に実施例及び試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
実施例１：振盪法を利用したフィブリノゲン粉末の調製
クエン酸血漿から得られた寒冷沈殿物を可溶化し、１.５Ｍグリシン溶液を用いて沈殿させたフィブリノゲン沈殿を、０.１５Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ８.０の０.０２５Ｍクエン酸緩衝液に３７℃で溶解させた。このフィブリノゲン溶液を−２℃に冷却した後、８％（ｖ／ｖ）エタノールを添加し、沈殿を回収した。得られた沈殿を、０.０７５Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ７.０の５ｍＭクエン酸緩衝液に３７℃で溶解させた。フィブリノゲン濃度を約２％（ｗ／ｖ）に調整した後、フィブリノゲン溶液１ｍｌあたり３０単位の第ＸＩＩＩ因子を添加した。この溶液を無菌濾過し、凍結乾燥及びそれに続く乾燥加熱処理を行ってフィブリノゲン凍結乾燥品（ケーキ形状）を得た。
【００２３】
つぎに、上記で調製したフィブリノゲン凍結乾燥品（ケーキ形状）（２４０ｍｇのフィブリノゲンを含有）を容器ごと、RECIPRO SHAKER SR-II（ＴＡＩＹＯ社製）に装着し、振幅４０ｍｍ、振盪速度を２００回／分になるように調整し、往復運動の繰り返しにより５時間連続して振盪させることでケーキ形状を解砕し、粉末化フィブリノゲン製剤（２４０ｍｇのフィブリノゲンを含有）を得た。
【００２４】
試験例１：フィブリノゲン製剤の粉末化による溶解時間短縮効果
凍結乾燥処理を施した約２４０ｍｇのフィブリノゲンを含有する製剤（凍結乾燥ケーキ品）と、それをさらに実施例１に記載のようにして振盪することにより調製した粉末状のフィブリノゲン製剤（粉末品）とを注射用水で８％濃度（８０ｍｇ／ｍｌ）になるように室温下にて溶解し、その溶解時間を測定した。その結果を図１に示す。図１から明らかなように、ケーキ形状のフィブリノゲン製剤のフィブリノゲン溶解時間が約４００秒（６分４０秒）〜約６００秒（１０分）であるのに対し、本発明による粉末状のフィブリノゲン製剤では１４０秒（２分２０秒）〜約２４０秒（４分）であり、粉末化によりフィブリノゲンの溶解時間が２倍以上短縮された。
【００２５】
試験例２：フィブリノゲン溶解時間に及ぼすフィブリノゲン濃度の影響
フィブリノゲン粉末品を１、２、４、及び８％の各終濃度になるようにそれぞれ注射用水で溶解し、その溶解時間を室温で測定した。その結果を図２に示す。図２から明らかなように、フィブリノゲンの濃度が１〜８％の範囲内では粉末品の溶解時間が大きく変化することはなかった。
【００２６】
試験例３：溶解時間に及ぼす温度の影響
実施例１で調製したフィブリノゲンケーキ品（２４０ｍｇのフィブリノゲンを含有）及び粉末品（２４０ｍｇのフィブリノゲンを含有）を、冷房下（５℃）、室温及び３７℃で保存した。その後、これらフィブリノゲンケーキ品及び粉末品をそれぞれ同じ温度で保存した注射用水で各々８％濃度に溶解し、その溶解時間を測定した。その結果を図３に示す。図３から明らかなように、冷房下（５℃）ではケーキ品で約３０分であったのに対し、粉末品では約２分で溶解し、室温ではケーキ品では約４００秒（６分４０秒）〜約６００秒（１０分）であったのに対し、粉末品では約２００秒（３分２０秒）であり、３７℃ではケーキ品では約３００秒（５分）〜約７００秒（１１分４０秒）であったのに対し、粉末品では約２００秒（３分２０秒）であった。このように、冷房下（５℃）、室温及び３７℃いずれの場合にもケーキ品に比べて粉末品で溶解時間の短縮が認められたが、とりわけ冷房下（５℃）での溶解時間の短縮が顕著に認められた。
【００２７】
試験例４：溶解時間に及ぼす粉末粒子の粒径の影響
実施例１で得たフィブリノゲン凍結乾燥品をスパーテルで解砕した後に局方ふるい（２０００μｍ／８５０μｍ／３００μｍ／１５０μｍのふるい）を用いて粒径ごとに選別した。３ｍｌ容量の凍結乾燥品（ケーキ品）、及び同重量の粉末品をそれぞれバイアルに再充填した後に室温で注射用水により８％濃度に溶解し、その溶解時間を測定した。その結果を図４に示す。図４から明らかなように、ケーキ品では１０分近くを要したのに対して、解砕した粉末ではいずれの粒径でも２００秒（３分２０秒）前後もしくはそれ以下であった。とりわけ、粒径が２０００μｍ以上であっても１５０μｍ以下〜２０００μｍの場合と同様の溶解時間を示し、２０００μｍ以下の粒径であればいかなる粒径であっても２００秒（３分２０秒）前後で溶解することが示唆された。これらの結果から粒径が少なくとも２０００μｍ以下であれば粉末品はケーキ品よりも短時間のうちに溶解することがわかる。
【００２８】
試験例５：溶解時間に及ぼす真空度の影響
実施例１で得たフィブリノゲン粉末を陰圧（０.０５Ｔｏｒｒ以下、及び３００Ｔｏｒｒ）充填したもの、及び常圧（大気圧）充填したものを調製した。すなわち、実施例１で得たフィブリノゲン粉末を０.０５Ｔｏｒｒ以下に陰圧充填したものを調製し、ついで通気針で空気を注入して常圧（大気圧）充填したものを調製し、また３００Ｔｏｒｒ試料については、０.０５Ｔｏｒｒ以下に陰圧充填したものにバイアルの体積から３００Ｔｏｒｒとなるように空気を所定の体積だけ注入して調製した。
【００２９】
これらの陰圧試料及び常圧試料について注射用水で８％濃度に溶解し、その溶解時間を測定した。その結果を図５に示す。図５から明らかなように、０.０１Ｔｏｒｒ以下の陰圧化試料では、溶解時間が約３分、３００Ｔｏｒｒの陰圧化試料では、約２分〜約４分３０秒であるのに対して、常圧試料では約４分〜約３８０秒（６分２０秒）であった。このように少なくとも３００Ｔｏｒｒ以下に陰圧化させることによって溶解時間の短縮効果が認められた。したがって、陰圧化することも溶解性をさらに向上させる重要な因子であることがわかった。
【００３０】
試験例６：振盪粉末品の容量と溶解時間の関係
一般に容量も溶解時間に影響を及ぼす因子であるといわれているので、本発明による振盪粉末品の容量と溶解時間の関係を調べた。
各容量（０.５ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、及び５ｍｌ：それぞれフィブリノゲンを４０、８０、１６０、２４０及び４００ｍｇ含有する）のフィブリノゲン製剤（ケーキ品）を実施例１と同様にして振盪することにより粉末製剤を調製し、室温にてそれぞれの容量（０.５ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、及び５ｍｌ）の注射用水を注入し、いずれも８％濃度となるように溶解し、溶解時間の測定を行った。その結果を図６に示す。図６から明らかなように、０.５ｍｌ〜５.０ｍｌの範囲ではいずれの容量であってもほとんどが２００秒（３分２０秒）以内で溶解することがわかった。これらの結果から、粉末品の溶解時間は０.５ｍｌ〜５.０ｍｌの範囲では容量による影響をほとんど受けないことが示唆された。
【００３１】
試験例７：フィブリノゲン製剤のケーキ品及び粉末品の溶解後の性状観察
実施例１で調製したフィブリノゲン粉末品及びケーキ品（各２４０ｍｇのフィブリノゲンを含有）を、室温下で注射用水にて８％濃度に溶解し、その性状を溶解直後、及び室温で２時間放置した後に目視で観察した。その結果を表１に示す。
表１から明らかなように、溶解直後の性状及び室温で２時間放置後の性状ともに粉末品及びケーキ品での有意の違いは認められず、透明で沈殿は観察されなかった。

【００３２】
試験例８：３ロットでのフィブリノゲン製剤のケーキ品及び粉末品の溶解後の性状分析
３ロットのフィブリノゲンケーキ品（２４０ｍｇ）を実施例１に準じて調製した。さらに、それぞれのロットのケーキ品を用いて粉末品（２４０ｍｇ）を調製した。これらのケーキ品及び粉末品を、室温下で注射用水にて８％濃度に溶解し、その性状分析を行った（ｎ＝３）。なおここで、凝固時間は生物学的製剤基準の乾燥ヒトフィブリノゲンの力価試験に準じて行い、凝固性タンパク質含量（clottability）は、生物学的製剤基準一般試験法に記載されている方法に基づき、検体１ｍｌ中の総タンパク質量及び凝固性タンパク質量を測定し、総タンパク質中に占める凝固性タンパク質の純度を求めたものである。その結果を表２に示す。
【００３３】

【００３４】
表２にはｎ＝３で測定した際のそれぞれの項目の平均値±標準偏差で示してある。ケーキ品及び粉末品は３ロット共に凝固時間は２０秒以内であり、凝固性タンパク質含量（clottability）は８０％以上であった。またその他の指標として血液凝固第XIII因子の活性を測定したところ、同一ロット内の及びロット間におけるケーキ品及び粉末品の性状の違いは認められなかった。従って、粉末化処理を施すことにより溶解時間の顕著な短縮効果が認められるが、その他の性状に関しては粉末品はケーキ品と同等であり、さらに３ロットの比較においても有意な変動は認められず同等の性状であった。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によれば、フィブリノゲンを粉末化することにより溶解性が改善したフィブリノゲン製剤及びこれを用いた組織接着剤が得られる。本発明により得られるフィブリノゲン製剤及びこれを用いた組織接着剤は、従来の凍結乾燥品であるケーキ形状の組織接着剤と比べて、所望の溶解液を用いて高濃度で短時間にて溶解し得るものであり、溶解時の温度も室温のみならず冷所保存環境から３７℃までと広範囲にわたって選択が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 凍結乾燥ケーキ品及び粉末品のフィブリノゲン製剤の溶解時間を比較して示す図である。
【図２】 粉末品のフィブリノゲン製剤のタンパク濃度が溶解時間に及ぼす影響を示す図である。
【図３】 凍結乾燥ケーキ品及び粉末品のフィブリノゲン製剤における溶解時間の溶解時の温度による影響を示す図である。
【図４】 種々の粒径のフィブリノゲン粉末品の溶解時間を示す図である。
【図５】 フィブリノゲン粉末品の陰圧試料（０.０１Ｔｏｒｒ以下及び３００Ｔｏｒｒ）と常圧試料の溶解時間を比較して示す図である。
【図６】 種々の容量のフィブリノゲン粉末製剤の溶解時間を示す図である。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to the field of ethical drugs, in particular to fibrinogen and fibrinogen preparations that are constituents of tissue adhesives, and more particularly to fibrinogen preparations having excellent solubility and tissue adhesives using the same.
[0002]
[Problems to be solved by the prior art and the invention]
Tissue adhesives for clinical medicine include natural adhesive fibrin adhesives composed of protein components and gelatin glues, which have been widely used (Biomedical Perspectives, Vol.6, No.1, pp9-). 72, 1997, see Special Feature: Bioadhesives). Of these, fibrin adhesives are the most commonly used. A fibrin adhesive utilizes the adhesiveness of fibrin and gels in vivo to exert an adhesive action. Fibrin adhesives have a wide range of uses such as hemostasis, wound site closure, nerve or tendon adhesion or suture reinforcement of blood vessels and tissues, and air leak closure in the lung. In addition, fibrinogen preparations are clinically used as intravenous preparations for the purpose of improving the state of consumption of blood coagulation factors such as generalized intravascular coagulation syndrome (DIC) in sepsis and replacement therapy in congenital and acquired fibrinogen deficiencies. It is sometimes used and prevents severe bleeding by increasing the fibrinogen concentration in the blood.
[0003]
A method for producing a tissue adhesive containing fibrinogen is known (see Japanese Patent Publication No. 63-40546). In the method described in the publication, fibrinogen is freeze-dried together with blood coagulation factor XIII (factor XIII) and possibly albumin, etc., and freeze-dried fibrinogen or a plasma protein mixture containing a high proportion of fibrinogen is frozen. The dried product is usually reconstituted with a solution after being warmed to room temperature or the like for use. The lyophilizate gradually re-dissolves at an elevated temperature such as room temperature.
[0004]
Currently, fibrinogen preparations used clinically and tissue adhesives using the same are generally freeze-dried products. That is, a fibrinogen solution is filled in a vial, freeze-dried, and heat-treated as a virus inactivation step if necessary. The fibrinogen preparation thus prepared is in the form of a lump (cake) that retains the bulk of the solution at the time of filling. In addition, when actually used in clinical situations, it is necessary to dissolve the fibrinogen preparation in the form of a cake (cake), but as a solution for that, distilled water for injection, physiological saline for injection, buffer solution Or a solution for preparing a predetermined fibrin adhesive is used.
[0005]
Thus, in order to actually use a fibrinogen preparation as a fibrin adhesive, it must first be dissolved with a dissolving solution, but in order to obtain a sufficient adhesive action as a fibrin adhesive, the fibrinogen solution to be prepared has a certain concentration. It is necessary to make the concentration higher than that. However, since the conventional fibrinogen preparation is in the form of a lump (cake) as described above, especially when trying to obtain a highly concentrated fibrinogen solution, the solubility of fibrinogen itself is originally low, so it takes a long time to dissolve fibrinogen. (Normally about 5 to 15 minutes at room temperature and 30 minutes or more at 4 ° C. which is the storage temperature), and therefore, there is a problem that it is not suitable for use in an emergency surgical operation.
[0006]
In order to shorten the dissolution time of fibrinogen which requires such a long time, there has been a report of trying to improve solubility by adding a solubilizing agent (see JP-A-2-036872 and JP-A-8-151330). Specific examples of solubilizers include surfactants, albumin, amino acids, and saccharides. However, even in this method, the dissolution operation still requires nearly 3 to 6 minutes, and this dissolution time is the time required when operating at room temperature. It is not certain how long it will take to dissolve fibrinogen that has been stored in a cold place using a solubilizing agent, but it is expected that it will take a longer time than the above dissolution time. . In general, normal fibrinogen preparations and tissue adhesives and dissolving solutions are stored in a cold environment, so that the dissolving operation for use is performed after returning to room temperature. That is, in the method using a solubilizing agent, the time required for the dissolving operation itself has been shortened to nearly 3 to 6 minutes as described above, but since the fibrinogen preparation or tissue adhesive is stored in a cold place, it is returned to room temperature. In addition, about 30 minutes should be taken into consideration.
[0007]
In addition, a method of freezing the fibrinogen solution at low temperature (Japanese Patent Publication No. Sho 63-40547) or a fibrinogen solution containing various fibrinogen dissolution promoters in a frozen state is stored for use. A method of melting and using occasionally (Japanese Patent Laid-Open No. 57-149229) has also been reported. However, these frozen preparations have improved convenience during use compared to lyophilized preparations, but still require time for melting at the time of use and the need for equipment for distribution and storage in the frozen state. Have a problem.
Under such circumstances, it has been desired to develop a fibrinogen preparation with improved solubility that can sufficiently cope with clinical situations such as surgery.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
Therefore, as a result of intensive studies to develop a fibrinogen preparation with improved solubility that can sufficiently cope with clinical situations such as surgery, the present inventors have pulverized a freeze-dried cake-like lump. The inventors have found that the solubility of fibrinogen is remarkably improved even at a high concentration necessary for sufficient adhesion, and have completed the present invention. In particular, unexpectedly, pulverizing freeze-dried cake-like mass not only improves the solubility of fibrinogen at room temperature, but also has the same low-temperature solubility in cold storage conditions as room temperature. It was found that Therefore, in actual use, the dissolution operation can be started without returning to room temperature after taking out from the cold storage state, and as a result, from the cold storage state through dissolution to the actual use as a tissue adhesive, etc. Time is significantly reduced (about 10 minutes).
[0009]
By pulverizing the cake-like fibrinogen mass freeze-dried according to the present invention, the cake-like fibrinogen mass can be completely dissolved in a short period of time without being affected by the temperature at the time of dissolution or its capacity.
Usually, preparations with poor solubility tend to form lumps called steplings after injection of the solution. This is considered to be dependent on the hydrophobic strength of the preparation, and the solvent does not spread quickly throughout the preparation and as a result, the solvent is collected only around the main agent, so the dissolution time is reduced. It is thought to cause a delay. Therefore, in order for the solvent to be uniformly dispersed throughout the preparation, it is effective to powder the preparation. Although the powdered formulation has an increased contact area with the solvent, it can be dissolved quickly by vigorous shaking during dissolution in order to maintain its uniform dispersibility.
[0010]
It should be noted that powdering by granulating is a common method for antibiotics, but among products in which plasma protein is formulated, the dosage form of powder (granules or fine granules) Only the thrombin preparation is adopted. Thrombin is a protein in which a light chain with a molecular weight of 6,000 and a heavy chain with a molecular weight of 31,000 are linked by a disulfide bond, and the structure of the peptide chain forming the protein is relatively simple and has a small molecular weight. However, fibrinogen, which is the object of pulverization according to the present invention, forms a three-dimensional structure in which a total of six peptide chains consisting of two each of three types of peptides, α chain, β chain, and γ chain, are linked by disulfide bonds. It is a protein with a molecular weight of 340,000, has a much more complicated three-dimensional structure than the thrombin, and has a large molecular weight. Such a fibrinogen molecule having a complicated structure and a large molecular weight is weak against physical impact, and it is expected that the three-dimensional structure is easily destroyed. On the other hand, in an immunoglobulin preparation having a complex structure similar to fibrinogen in plasma protein, an increase in anti-complement value is observed when a freeze-dried cake product is powdered, and it has been confirmed that an undesirable change occurs as a preparation. . As described above, powdered plasma protein preparations are only examples of limited preparations such as thrombin preparations, and those skilled in the art expect powdering of plasma proteins having a complex structure such as fibrinogen. There wasn't.
[0011]
As a method of powdering fibrinogen, (1) a method in which a physical load (preferably shaking) is applied to a product container enclosing a freeze-dried mass to prepare powder in the container, and (2) a freeze-dried mass is disintegrated. And a method of preparing a powder by a physical load of a propeller, and (3) a method of preparing a powder directly from a liquid sample. Among these powdering methods, the method shown in (1) (especially the shaking method) can maintain (1) sterility, (2) it is not necessary to refill the obtained powder into a container, (3) (2) This method is suitable for the reason that the amount of fibrinogen powder to be filled in the container can be kept uniform and (4) it can easily cope with the negative pressure treatment in the container.
In particular, the advantages of the shaking method were (1) protein stabilization by freeze-drying of the sample, (2) container closure (preferably under negative pressure), and (3) sterility in the container was maintained. In this state, it is possible to carry out a series of steps such as gently processing a freeze-dried lump in the form of a cake into a powder by an amplitude motion using a shaker without accompanying protein denaturation.
[0012]
On the other hand, the powdering methods shown in the above (2) and (3) are not preferable in the case of fibrinogen having a high molecular structure and a complicated structure among plasma proteins because there is a concern about protein denaturation. In particular, when a powder is prepared directly from a liquid sample as in the powdering method shown in (3), the chemical solution is exposed to a high temperature when water in the sample is removed, so that it is conceivable that the protein is denatured. Further, the method (2) of applying a physical load of the propeller is not preferable because the structure of the fibrinogen protein may be physically destroyed.
[0013]
On the other hand, the pulverization method shown in (1) is one in which the pulverization treatment is performed with the container unopened after lyophilization, and the protein denaturation as described above is the least and is most preferable in the present invention. . Examples of the physical load for the powdering treatment include crushing of a freeze-dried lump (shaking method) by repeated vibration and amplitude movement of the container and crushing by ultrasonic treatment, but the shaking method is preferable. According to such a shaking method, a large physical burden due to a propeller or the like in the powdering method shown in (2) can be avoided.
[0014]
When performing the shaking method, the sample of the lyophilized lump filled in the desired container is set in a shaker for each container and shaken, so that the freeze-dried lump itself is frozen by reciprocating with the amplitude in the container. Disintegrate the dry mass gradually and prepare a powder sample. Specifically, a reciprocating shaker used for shaking a flask, a test tube or the like is set with a sealed container that has been freeze-dried, and has an amplitude of about several tens of millimeters, more preferably about 40 mm. And freezing in the container by performing a shaking treatment at a shaking speed of about 100 to 300 times per minute, usually about 200 times for several hours, more preferably about 3 to about 12 hours, usually about 5 hours. The dried mass can be crushed to obtain a powder sample. In consideration of protein stability, the shaking treatment is preferably carried out at a temperature below room temperature so as not to cause denaturation, and various conditions such as the amplitude, shaking speed and shaking time of the shaking treatment are as follows. Those skilled in the art can appropriately adjust the size of the container of the target preparation.
[0015]
It was found that by performing the powdering treatment as described above, the fibrinogen concentration was 1% or more and dissolved in a short time. Particularly when used as a tissue adhesive, the concentration of fibrinogen is as high as 8%. Even at such a high concentration, fibrinogen dissolves completely within a very short time if powdered according to the present invention. Is possible.
[0016]
Shortening of the fibrinogen dissolution time was also observed not only when the temperature at dissolution was room temperature, but also at low temperatures such as the storage temperature of the lyophilized mass. In particular, the freeze-dried product (cake shape) is usually stored in a cold place, but when it is dissolved immediately after taking it out of the cold place, it took about 30 minutes in the past. It will be shortened within 6 minutes.
Furthermore, it is generally said that the volume is also a factor affecting the dissolution time. However, in the powdered fibrinogen according to the present invention, the volume hardly affects the dissolution time in the range of 0.5 ml to 5.0 ml. I knew it was n’t there. As for changes in properties associated with the powdering treatment, no changes were observed in properties after dissolution, clotting time, clotting protein content, blood coagulation factor XIII activity content, and the like. In particular, dissolution time, properties after dissolution, clotting time, and clotting protein content satisfy all the criteria in the solubility test, titer test, and clotting protein content test of dry human fibrinogen on the basis of biologics. Is suitable for use as a fibrinogen preparation.
[0017]
The solubility of the powdered sample (fibrinogen preparation) can be further improved by applying a negative pressure in the container containing the sample. This is considered to be due to the fact that the negative pressure inside the container makes it easier for the solution to penetrate into the powder. In addition, extraction operation with a syringe is usually performed as an operation after dissolution. However, when dissolution is performed under normal pressure, bubbles formed by shaking are difficult to disappear, which hinders the extraction operation. While it is difficult to extract accurately due to the remaining bubbles, if the negative pressure treatment is applied, the bubbles can be eliminated by making the pressure normal just before the extraction operation, and the syringe after dissolution is extracted. Easy to operate.
[0018]
The fibrinogen preparation (powder product) prepared by pulverization by the shaking method of the present invention was classified according to particle size using a pharmacopoeia sieve, and the particle size distribution was measured from the weight ratio. The particle size of 1700 μm or less was 90% of the total amount. It was confirmed that it occupied the above.
Granules in pharmaceuticals have classifications such as granules and powders. It is described that the maximum value of the particle size is 1700 μm based on the particle size standard of granules and powders in the General Rules for Preparations of the 13th revision of the Japanese Pharmacopoeia. Therefore, the present inventors made a measurement on the upper limit value of the particle size based on this particle size standard in the pharmaceutical classification.
[0019]
Fibrinogen, which is the starting material of the fibrinogen powdered preparation according to the present invention, may be purified by a conventional method. For example, the cold ethanol precipitation method combined with the effect of reducing the solubility of fibrinogen by glycine (Blomback, B. and Blomback, M., Arkiv Kemi, 10, p.415-443, (1956)) and glycine alone The glycine precipitation method (Kazal, LA, et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 113, p. 989-994, (1963)) and the like can be used.
From the viewpoint of clinical biocompatibility, the starting material fibrinogen is preferably obtained from human plasma or genetically modified fibrinogen as a raw material.
[0020]
In the present specification, “fibrinogen preparation” or “fibrinogen powder preparation” means “tissue adhesive composed of protein components”, in particular, “main ingredient containing fibrinogen and blood coagulation factor XIII as active ingredients, thrombin and calcium chloride” The term “tissue adhesive composed of an auxiliary agent” means a fibrin adhesive or a fibrin glue.
[0021]
According to the package insert, commercially available fibrinogen preparations and tissue adhesives using the same are indicated as “forms freeze-dried fibrinogen”, “fibrinogen powder”, “fibrinogen freeze-dried powder”, etc. Although it gives an impression as if it were the properties of a powder, in fact, these lyophilized products are not in the form of a powder but in the form of a cake due to the high concentration of fibrinogen. Therefore, it should be noted that conventional fibrinogen formulations and tissue adhesives are in fact in the form of cakes, not powders, and not powdered products, regardless of their notation. Therefore, conventional fibrinogen formulations and tissue adhesives herein correspond to lyophilized cake products.
[0022]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples and test examples, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1 : Preparation of fibrinogen powder using shaking method
The fibrinogen precipitate solubilized from the cold precipitate obtained from citrated plasma and precipitated using a 1.5 M glycine solution was added to a 0.025 M citrate buffer at pH 8.0 containing 0.15 M sodium chloride. It was dissolved at ° C. After cooling this fibrinogen solution to −2 ° C., 8% (v / v) ethanol was added to recover the precipitate. The resulting precipitate was dissolved at 37 ° C. in 5 mM citrate buffer pH 7.0 containing 0.075 M sodium chloride. After adjusting the fibrinogen concentration to about 2% (w / v), 30 units of Factor XIII was added per ml of fibrinogen solution. This solution was aseptically filtered, freeze-dried and then dried and heat-treated to obtain a fibrinogen freeze-dried product (cake shape).
[0023]
Next, the fibrinogen freeze-dried product (cake shape) prepared above (containing 240 mg of fibrinogen) is attached to the RECIPRO SHAKER SR-II (manufactured by TAIYO) together with the container, and the amplitude is 40 mm and the shaking speed is 200 times / minute. The cake shape was crushed by continuously shaking for 5 hours by repeating reciprocating motion to obtain a powdered fibrinogen preparation (containing 240 mg of fibrinogen).
[0024]
Test example 1 : Shortening of dissolution time by pulverizing fibrinogen preparation
A preparation (lyophilized cake product) containing about 240 mg of fibrinogen subjected to lyophilization treatment, and a powdered fibrinogen formulation (powder product) prepared by shaking it as described in Example 1 Was dissolved in water for injection to a concentration of 8% (80 mg / ml) at room temperature, and the dissolution time was measured. The result is shown in FIG. As apparent from FIG. 1, the fibrinogen dissolution time of the cake-shaped fibrinogen preparation is about 400 seconds (6 minutes 40 seconds) to about 600 seconds (10 minutes), whereas in the powdered fibrinogen preparation according to the present invention, It was 140 seconds (2 minutes and 20 seconds) to about 240 seconds (4 minutes), and the dissolution time of fibrinogen was shortened more than twice by powdering.
[0025]
Test example 2 : Effect of fibrinogen concentration on fibrinogen dissolution time
The fibrinogen powder product was dissolved in water for injection to a final concentration of 1, 2, 4, and 8%, and the dissolution time was measured at room temperature. The result is shown in FIG. As is clear from FIG. 2, the dissolution time of the powder product did not change significantly when the fibrinogen concentration was in the range of 1 to 8%.
[0026]
Test example 3 : Effect of temperature on dissolution time
The fibrinogen cake product (containing 240 mg fibrinogen) and the powder product (containing 240 mg fibrinogen) prepared in Example 1 were stored at room temperature and 37 ° C. under cooling (5 ° C.). Then, these fibrinogen cake products and powder products were each dissolved to 8% concentration with water for injection stored at the same temperature, and the dissolution time was measured. The result is shown in FIG. As apparent from FIG. 3, the cake product was about 30 minutes under cooling (5 ° C.), whereas the powder product was dissolved in about 2 minutes, and at room temperature, the cake product was about 400 seconds (6 minutes 40 minutes). Second) to about 600 seconds (10 minutes), compared to about 200 seconds (3 minutes and 20 seconds) for powder products, and about 300 seconds (5 minutes) to about 700 seconds (37 seconds) for cake products. 11 minutes and 40 seconds), while it was about 200 seconds (3 minutes and 20 seconds) in the powder product. As described above, shortening of the dissolution time was observed in the powdered product compared to the cake product in both cases of room temperature and 37 ° C under cooling (5 ° C). The shortening was noticeable.
[0027]
Test example 4 : Effect of powder particle size on dissolution time
The fibrinogen freeze-dried product obtained in Example 1 was crushed with a spatula and then sorted according to particle size using a pharmacologic sieve (2000 μm / 850 μm / 300 μm / 150 μm sieve). A lyophilized product (cake product) having a volume of 3 ml and a powder product having the same weight were refilled into vials, respectively, dissolved in water at 8% concentration at room temperature, and the dissolution time was measured. The result is shown in FIG. As is apparent from FIG. 4, the cake product took nearly 10 minutes, whereas the crushed powder had a particle size of about 200 seconds (3 minutes 20 seconds) or less. In particular, even when the particle size is 2000 μm or more, the dissolution time is the same as that of 150 μm or less to 2000 μm, and any particle size of 2000 μm or less is about 200 seconds (3 minutes and 20 seconds). It was suggested to dissolve. From these results, it can be seen that if the particle size is at least 2000 μm or less, the powder product dissolves in a shorter time than the cake product.
[0028]
Test Example 5 : Effect of vacuum on dissolution time
The fibrinogen powder obtained in Example 1 was filled with negative pressure (0.05 Torr or less and 300 Torr) and normal pressure (atmospheric pressure). That is, a fibrinogen powder obtained in Example 1 filled with a negative pressure of 0.05 Torr or less was prepared, and then filled with air with a vent needle to prepare a normal pressure (atmospheric pressure) filling, and a 300 Torr sample. Was prepared by injecting a predetermined volume of air from a vial volume to 300 Torr into a negative pressure filled to 0.05 Torr or less.
[0029]
These negative pressure samples and normal pressure samples were dissolved in water for injection to a concentration of 8%, and the dissolution time was measured. The result is shown in FIG. As is clear from FIG. 5, the negative pressure sample of 0.01 Torr or less has a dissolution time of about 3 minutes, and the negative pressure sample of 300 Torr has a time of about 2 minutes to about 4 minutes 30 seconds. In the normal pressure sample, it was about 4 minutes to about 380 seconds (6 minutes and 20 seconds). Thus, the effect of shortening the dissolution time was recognized by applying a negative pressure to at least 300 Torr or less. Therefore, it was found that negative pressure is also an important factor for further improving the solubility.
[0030]
Test Example 6 ： Relationship between shaking powder volume and dissolution time
Since it is generally said that the volume is also a factor affecting the dissolution time, the relationship between the volume of the shake powder product according to the present invention and the dissolution time was examined.
By shaking each volume (0.5 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, and 5 ml: containing fibrinogen 40, 80, 160, 240 and 400 mg, respectively) fibrinogen preparation (cake product) in the same manner as in Example 1. Prepare a powder formulation, inject each volume of water for injection (0.5 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, and 5 ml) at room temperature, dissolve all to 8% concentration, and measure the dissolution time. went. The result is shown in FIG. As is clear from FIG. 6, it was found that most of the volume was dissolved within 200 seconds (3 minutes and 20 seconds) in the range of 0.5 ml to 5.0 ml. From these results, it was suggested that the dissolution time of the powder product was hardly affected by the volume in the range of 0.5 ml to 5.0 ml.
[0031]
Test Example 7 : Properties observation after dissolution of cake and powder of fibrinogen preparation
The fibrinogen powder product and cake product (containing 240 mg of fibrinogen each) prepared in Example 1 were dissolved at a concentration of 8% in water for injection at room temperature, and the properties were immediately dissolved and after standing at room temperature for 2 hours. It was observed visually. The results are shown in Table 1.
As is clear from Table 1, there was no significant difference between the powdered product and the cake product immediately after dissolution and the property after standing for 2 hours at room temperature, and it was transparent and no precipitation was observed.

[0032]
Test Example 8 : Properties analysis after dissolution of cake and powder of fibrinogen preparation in 3 lots
Three lots of fibrinogen cake (240 mg) were prepared according to Example 1. Further, a powder product (240 mg) was prepared using each lot of cake products. These cake products and powder products were dissolved at a concentration of 8% with water for injection at room temperature, and their properties were analyzed (n = 3). Here, the clotting time is determined according to the titer test of dry human fibrinogen based on the biological preparation standard, and the clotting protein content (clottability) is based on the method described in the general test method of biological preparation standard. The total amount of protein and the amount of coagulable protein in 1 ml of the sample were measured, and the purity of the coagulable protein in the total protein was determined. The results are shown in Table 2.
[0033]

[0034]
Table 2 shows the average value ± standard deviation of each item when measured at n = 3. In all three cakes and powders, the coagulation time was within 20 seconds, and the coagulable protein content (clottability) was 80% or more. Further, when the activity of blood coagulation factor XIII was measured as another index, no difference in the properties of cake products and powder products within the same lot and between lots was observed. Therefore, a significant shortening effect of the dissolution time is recognized by performing the powdering treatment, but with respect to other properties, the powder product is equivalent to the cake product, and no significant fluctuation is observed even in the comparison of 3 lots. The properties were equivalent.
[0035]
【The invention's effect】
According to the present invention, a fibrinogen preparation having improved solubility by powdering fibrinogen and a tissue adhesive using the same can be obtained. The fibrinogen preparation obtained by the present invention and the tissue adhesive using the same dissolve in a high concentration and in a short time using a desired solution compared to a cake-shaped tissue adhesive which is a conventional freeze-dried product. The temperature at the time of melting can be selected over a wide range from a cold storage environment to 37 ° C.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a diagram comparing the dissolution times of freeze-dried cake products and powdered fibrinogen formulations.
FIG. 2 is a graph showing the effect of protein concentration of a powdered fibrinogen preparation on dissolution time.
FIG. 3 is a graph showing the influence of dissolution time on dissolution time in freeze-dried cake products and powdered fibrinogen formulations.
FIG. 4 is a graph showing dissolution times of fibrinogen powder products having various particle sizes.
FIG. 5 is a diagram comparing the dissolution time of a negative pressure sample (less than 0.01 Torr and 300 Torr) and a normal pressure sample of a fibrinogen powder product.
FIG. 6 shows dissolution times for various volumes of fibrinogen powder formulations.

Claims (5)

振盪法またはスパーテルによる解砕により粉末化したフィブリノゲンを含む溶解性に優れ短時間のうちに溶解するフィブリノゲン製剤であって、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの要件を 満たすことを特徴とするフィブリノゲン製剤：
（ａ）冷所から３７℃の温度域にて溶解した場合、１％以上のフィブリノゲン濃度で１０分以内に完全に溶解すること、
（ｂ）溶解直後の性状が肉眼的に沈殿を認めない透明もしくはわずかに混濁した溶液であり、溶解後に室温で２時間放置したときにゼラチン化または沈殿物を認めないこと、または
（ｃ）総タンパク質量の８０％以上が凝固性タンパク質であること。 A fibrinogen preparation which dissolves in a short time excellent solubility by crushing by shaking method or spatula containing a powder phased fibrinogen, any of the following requirements (a) ~ (c) Fibrinogen preparation, characterized in that it be less than:
(A) When dissolved in a temperature range of 37 ° C. from a cold place, completely dissolve within 10 minutes at a fibrinogen concentration of 1% or more,
(B) A transparent or slightly turbid solution with no visible macroscopic precipitation immediately after dissolution, and no gelatinization or precipitation when left at room temperature for 2 hours after dissolution, or (c) total 80 % or more of the protein amount is a coagulable protein . 組織接着剤として用いられる請求項１に記載のフィブリノゲン製剤。  The fibrinogen preparation according to claim 1, which is used as a tissue adhesive. 全量の９０重量％以上が１７００μｍ以下の粒径である請求項１または２に記載のフィブリノゲン製剤。  The fibrinogen preparation according to claim 1 or 2, wherein 90% by weight or more of the total amount has a particle size of 1700 µm or less. フィブリノゲン粉末を充填した容器が陰圧化処理を施されている請求項１〜３のいずれかに記載のフィブリノゲン製剤。  The fibrinogen preparation according to any one of claims 1 to 3, wherein a container filled with fibrinogen powder is subjected to negative pressure treatment. 陰圧化処理により容器内の圧力が少なくとも３００Ｔｏｒｒ以下である請求項４に記載のフィブリノゲン製剤。  The fibrinogen preparation according to claim 4, wherein the pressure in the container is at least 300 Torr or less by the negative pressure treatment.

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